JP4212675B2

JP4212675B2 - Verotoxin 2 neutralizer

Info

Publication number: JP4212675B2
Application number: JP00245798A
Authority: JP
Inventors: 洋一松本; 剛木村
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1998-01-08
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2018-01-08
Also published as: JPH11199491A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベロ毒素２（以下、「ＶＴ２」ともいう。）の中和剤に関する。さらに詳しくは、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（以下、「ヒトＳＡＰ」ともいう。）、あるいはその部分ペプチドを有効成分として含有するＶＴ２の中和剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベロ毒素（ＶＴ）は大腸菌Ｏ−１５７をはじめとするベロ毒素産生性大腸菌（ＶＴＥＣ）感染症やＶＴを産生する大腸菌以外の細菌感染症の重篤化の原因となる毒素である。免疫力の弱い小児や老人では、腸内で増殖した細菌が産生するＶＴが腸管上皮細胞を死滅させて血中へと移行し、腎に傷害をおこして溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）をひきおこし、ときには脳症を誘発する（例えば、Karmali , M. ら（１９８３年）The Lancet 第１巻６１９−６２０頁、Siegler , R.（１９９４年）The Journal of Pediatrics 第１２５巻５１１−５１８頁など参照）。
【０００３】
現在かかる感染症のよい治療薬はなく、抗生物質は細菌が死滅するときに大量のＶＴを放出する場合があること、そして放出されたＶＴには無効であること等から効果が疑問視されている（例えば、Carter , A. ら（１９８７年）The New England Journal of Medicine 第３１６巻１４９６−１５００頁、Griffin , P.ら（１９８８年）Annals of Internal Medicine 第１０９巻７０５−７１２頁など参照）。
【０００４】
したがって、重篤化の原因であるＶＴを中和する薬剤は大腸菌Ｏ−１５７をはじめとするＶＴＥＣ感染症やＶＴを産生する大腸菌以外の細菌感染症の治療薬および／または予防薬として有用であると期待される。しかしながら、ＶＴには抗原性の異なるＶＴ１とＶＴ２の２種類が存在する。細菌にもＶＴ１やＶＴ２の片方だけを産生する菌、両方を産生する菌が存在し、いずれのタイプの細菌でも重篤化した報告がある。 γグロブリン製剤は、後述するように、ＶＴ１に対する中和活性は有するが、ＶＴ２に対する中和活性はほとんどなく、また現在臨床試験中のＶＴ吸着剤は、血中に移行したＶＴには無効である。
【０００５】
ＶＴ２を中和する活性を有し、血中に存在するものとしてヒト高密度リポタンパク質（ヒトＨＤＬ）が報告されている（Caprioli , A .ら（１９９４年）Recent Advances in Verocytotoxin-producing Escherichia Coli Infections ３５３−３５６頁）が、後述する参考例においてデータをもって示すように、この文献の記載内容は誤りであった。
【０００６】
一方、ヒトＳＡＰはペントラキシンファミリーに属する血漿タンパク質であって、２０４アミノ酸からなる分子量約２５０００の糖タンパク質が非共有結合により１０量体を形成したものである。アミロイド沈着物に含まれること、ＤＮＡやクロマチンに結合すること、Ｃａ⁺⁺存在下でアミロイド線維、ヘパラン硫酸、ヘパリン、フィブロネクチン、Ｃ４結合タンパク質等に結合すること、糸球体基底膜のマトリックスを形成していることが知られているが（Emsley , J .ら（１９９４年）Nature 第３６７巻３３８−３４５頁）、かかるヒトＳＡＰがＶＴ２を中和する活性を有することは知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＶＴ２を中和する薬剤を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＶＴ２を中和する薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ヒト血漿がＶＴ２を中和する活性を有すること、およびその活性の本体はγグロブリンやヒトＨＤＬではなくヒトＳＡＰであることを知見し、これを基礎に研究を続けた結果、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒト血清アミロイドＰコンポーネントを有効成分として含有する、ベロ毒素２の中和剤、およびヒト血清アミロイドＰコンポーネントの部分ペプチドを有効成分として含有する、ベロ毒素２の中和剤である。
【００１０】
ここで、「ヒト血清アミロイドＰコンポーネントの部分ペプチド」とは、ヒト血清アミロイドＰコンポーネントの一部をなす断片であって、ベロ毒素２の中和活性を保持しているものをいう。また、「中和」には、ＶＴ２の生体内における有害な作用を解消または緩和する一切の効能、作用が包含される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるヒトＳＡＰは公知のタンパク質であり、試薬としてアレクシス社等から入手可能である。
【００１２】
本発明のＶＴ２中和剤は、タンパク質製剤またはペプチド製剤であるため、注射剤として提供されることが望ましい。注射剤とするには、タンパク質またはペプチドを注射剤として調製する一般的な方法を用いればよい。
【００１３】
ヒトＳＡＰはヒトの血漿タンパク質であるため、ヒトＳＡＰまたはヒトＳＡＰ部分ペプチドは、ＶＴ２中和剤として投与されても抗原性の問題はない。したがって、本発明の薬剤は、大腸菌Ｏ−１５７をはじめとするＶＴＥＣ感染症や、ＶＴ２を産生する大腸菌以外の細菌感染症の治療薬および／または予防薬として有用である。
【００１４】
活性成分の投与量は、疾患の程度にもよるが、例えば大腸菌Ｏ−１５７感染症では成人がＨＵＳを発症する例は極めて稀であるため、健常成人の血中ＳＡＰ濃度である３０−４０μｇ／ｍｌを維持するような条件を満足するように製剤することがひとつの目安となる。もっとも、この投与量は疾患の状況により適宜加減してよい。
【００１５】
【実施例】
［実施例１］
ＶＴ中和活性の測定方法
ＶＴ１（国立小児病院・竹田先生より譲渡されたもの）５０ｐｇ／ｍｌあるいはＶＴ２（国立小児病院・竹田先生より譲渡されたもの、Yutsudo Tら、Microbial Pathogenesis 3, pp21-30, 1987 に従って精製できる）２５０あるいは５００ｐｇ／ｍｌを３０μｌに対し、検体（２倍段階希釈）を３０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応液５０μｌをヒト腎由来株化細胞であるＡＣＨＮ単層細胞（国立小児病院・竹田先生より譲渡されたもの、ＡＴＣＣより購入可能）に加え、５％二酸化炭素存在下、３７℃で１時間培養した後、細胞を洗浄し、５％二酸化炭素存在下、３７℃で４日間培養した。ニュートラルレッド溶液を終濃度０．０１４から０．０２８％になるよう加え、５％二酸化炭素存在下、３７℃で１時間培養して生細胞を染色した（Mullbacher , A .ら（１９８４年）Journal of Immunological Methods、第６８巻２０５−２１５頁）。細胞を洗浄後、５０％エタノール−１％酢酸溶液を加え、５５０ｎｍの吸光度を定量し、中和活性を以下の計算式に従って算出した。
【００１６】
【数１】

【００１７】
［参考例１］
γグロブリン製剤のＶＴ１およびＶＴ２中和活性
γグロブリン製剤（ベニロン（商標）：帝人、化学及血清療法研究所）のＶＴ１およびＶＴ２中和活性を実施例１に準じて測定した。
結果を図１に示した、γグロブリン製剤にＶＴ１中和活性は検出されたが、ＶＴ２中和活性はほとんど検出されなかった。
【００１８】
［参考例２］
ヒト血漿中のＩｇＧ画分の精製
ヒト血漿中のＩｇＧをプロテインＧカラム（プロテインＧセファロース４ＦＦ：ファルマシア社）で精製した。ヒト血漿２検体をそれぞれ５ｍｌずつプロテインＧカラム（５ｍｌ）に注入し、非吸着画分を回収した。カラムを０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）５０ｍｌで洗浄後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｎ塩酸（ｐＨ２）でＩｇＧ画分を溶出した（２．５ｍｌずつ分画し、２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分をＩｇＧ画分とした）。カラム溶出画分はゲルろ過カラム（セファデックス−Ｇ２５：ファルマシア社）で培地（ＭＥＭ：ニッスイ社）にバッファー置換した。
【００１９】
［実施例２］
ヒト血漿およびＩｇＧ画分のＶＴ２中和活性
参考例２で使用したヒト血漿２検体、および参考例２で得られたプロテインＧカラムの非吸着画分と溶出画分のＶＴ２中和活性を実施例１に準じて測定した。結果を表１に示した。ヒト血漿およびカラム非吸着画分にＶＴ２中和活性が検出されたが、カラム溶出画分（ＩｇＧ画分）には活性は検出されず、ヒト血漿中にはＩｇＧ以外のＶＴ２中和因子が存在することが示された。
【００２０】
【表１】

【００２１】
［実施例３］
ヒト血漿中のリポタンパク質の分画
ヒト血漿中のリポタンパク質を分画するために用いる比重液は以下のように調製した。塩化ナトリウム１１．４ｇとＥＤＴＡ・２ナトリウム塩０．１ｇに５００ｍｌの水と１Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌを加えて溶解後、水で１００３ｍｌとして比重液（ｄ＝１．００６）を調製した。比重液（ｄ＝１．００６）１００ｍｌに臭化ナトリウム２４．９８ｇを加えて溶解し、比重液（ｄ＝１．１８２）を調製した。比重液（ｄ＝１．００６）１００ｍｌに臭化ナトリウム７８．３２ｇを加えて溶解し、比重液（ｄ＝１．４７８）を調製した。比重液（ｄ＝１．００６）１００ｍｌに比重液（ｄ＝１．１８２）５０ｍｌを加えて混和し、比重液（ｄ＝１．０６３）を調製した。比重液（ｄ＝１．０６３）５０ｍｌに比重液（ｄ＝１．４７８）２５ｍｌを加えて混和し、比重液（ｄ＝１．２１）を調製した。
【００２２】
次に、ヒト血漿１ｍｌを比重液（ｄ＝１．１８２）０．５ｍｌに加え混和した。混合液に比重液（ｄ＝１．０６３）０．５ｍｌを上層し、４００００ｒｐｍで４０時間遠心した。上層０．５ｍｌを超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）から低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）画分として、下層０．５ｍｌをＨＤＬから超高密度リポタンパク質（ＶＨＤＬ）および血漿タンパク質画分として回収した。各画分はゲルろ過カラム（セファデックス−Ｇ２５：ファルマシア社）で培地（ＭＥＭ：ニッスイ社）にバッファー置換し、１ｍｌにして血漿中の濃度に調整した。
【００２３】
さらに、ヒト血漿４ｍｌを比重液（ｄ＝１．１８２）２ｍｌに加え混和後、さらに比重液（ｄ＝１．４７８）３ｍｌを加え混和した。混合液２．２５ｍｌに比重液（ｄ＝１．２１）０．５ｍｌを上層し、４００００ｒｐｍで４０時間遠心した。上層０．５ｍｌをＶＬＤＬからＨＤＬ画分として、下層０．５ｍｌをＶＨＤＬおよび血漿タンパク質画分として回収した。各画分はゲルろ過カラム（セファデックス−Ｇ２５：ファルマシア社）で培地（ＭＥＭ：ニッスイ社）にバッファー置換し、１ｍｌにして血漿中の濃度に調整した。
【００２４】
［実施例４］
ヒトリポタンパク質画分および市販ヒトＨＤＬのＶＴ２中和活性
実施例３で得られたＶＬＤＬからＬＤＬ画分（ｄ＜１．０６３）、ＨＤＬからＶＨＤＬおよび血漿タンパク質画分（ｄ＞１．０６３）、ＶＬＤＬからＨＤＬ画分（ｄ＜１．２１）、ＶＨＤＬおよび血漿タンパク質画分（ｄ＞１．２１）および市販ヒトＨＤＬ（１．０６３＜ｄ＜１．２１：アルファバイオケミカル社）のＶＴ２中和活性を実施例１に準じて測定した。
【００２５】
結果を表２に示した。ＶＴ２中和活性はＨＤＬからＶＨＤＬおよび血漿タンパク質画分とＶＨＤＬおよび血漿タンパク質画分に検出されたが、ＶＬＤＬからＬＤＬ画分、ＶＬＤＬからＨＤＬ画分と市販ＨＤＬには活性は検出されず、ＶＴ２中和因子はＨＤＬではなく、ＶＨＤＬあるいは血漿タンパク質であることが判明した。
【００２６】
【表２】

【００２７】
［実施例５］
ヒト血漿中のＶＴ２中和因子の精製
ヒト末梢血６０ｍｌに同量の培地（ＲＰＭＩ１６４０：ギブコ社）を混合後、遠心分離（１５００ｒｐｍ）して上清（血漿）を回収した。血漿１０２ｍｌをＣｏｎＡカラム（ＣｏｎＡセファロース、４０ｍｌ：ファルマシア社）に注入し、カラムを０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）４００ｍｌで洗浄後、０．１Ｍマンノースを含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）でＶＴ２中和因子画分を溶出した（１０ｍｌずつ分画し、２８０ｎｍにおける吸光度が高い画分をＶＴ２中和因子画分とした）。
【００２８】
溶出画分の一部である４０ｍｌをゲルろ過カラム（セファデックス−Ｇ２５：ファルマシア社）で０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にバッファー置換した後、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥセファロースＦＦ、５ｍｌ：ファルマシア社）に注入した。カラムを０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）５０ｍｌで洗浄後、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）のグラジエント溶出（５０ｍｌ×２）によりＶＴ２中和因子画分を得た。
【００２９】
溶出画分１２．５ｍｌをゲルろ過カラム（セファデックス−Ｇ２５：ファルマシア社）で０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にバッファー置換した後、ヒドロキシアパタイトカラム（ギガパイト、５ｍｌ：生化学工業）に注入した。カラムを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５５ｍｌで洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）から０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）のグラジエント溶出（５０ｍｌ×２）によりＶＴ２中和因子画分を得た。
【００３０】
溶出画分２４ｍｌを限外ろ過（ＹＭ３０膜：アミコン社）で濃縮後、ゲルろ過ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０：ファルマシア社）に注入し、ＶＴ２中和因子を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で溶出した。
【００３１】
ゲルろ過ＨＰＬＣで精製したＶＴ２中和因子をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、分子量約２５０００に単一バンドとして検出された。
【００３２】
［実施例６］
ヒト血漿中のＶＴ２中和因子のＶＴ２中和活性
実施例５で得られたＶＴ２中和因子のＶＴ２中和活性を実施例１に準じて測定した。
その結果、精製ＶＴ２中和因子にＶＴ２中和活性が確認された。
【００３３】
［実施例７］
ヒト血漿中のＶＴ２中和因子のＮ末アミノ酸配列
実施例５で得られたヒドロキシアパタイトカラム溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画後、ＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ：ミリポア社）にウエスタンブロッティングした。分子量約２５０００のバンドを切り出し、プロテインシークエンサーによりＮ末アミノ酸配列を解析した。
その結果ＶＴ２中和因子のＮ末端から１２残基までの配列はＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏであり、この配列はヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ヒトＳＡＰ）と完全に一致した。
【００３４】
［実施例８］
市販ヒトＳＡＰのＶＴ２中和活性
市販ヒトＳＡＰ（アレクシス社）のＶＴ２中和活性を実施例１に準じて測定した。
図２に結果を示した。これにより、市販ヒトＳＡＰにＶＴ２中和活性が確認された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明のベロ毒素２中和剤は、大腸菌Ｏ−１５７をはじめとするＶＴＥＣ感染症や、ＶＴ２を産生する大腸菌以外の細菌感染症の治療薬および／または予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】γグロブリン製剤のＶＴ中和活性
【図２】ヒトＳＡＰのＶＴ２中和活性[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a neutralizing agent for verotoxin 2 (hereinafter also referred to as “VT2”). More specifically, the present invention relates to a human serum amyloid P component (hereinafter also referred to as “human SAP”) or a VT2 neutralizing agent containing a partial peptide thereof as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Verotoxin (VT) is a toxin that causes seriousness of verotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) infections such as E. coli O-157 and bacterial infections other than E. coli producing VT. In children and elderly people with weak immunity, VT produced by bacteria grown in the intestine kills intestinal epithelial cells and enters the blood, causing damage to the kidney and causing hemolytic uremic syndrome (HUS). Sometimes induces encephalopathy (see, for example, Karmali, M. et al. (1983) The Lancet Vol. 1, 619-620, Siegler, R. (1994) The Journal of Pediatrics, Vol. 125, 511-518, etc.) .
[0003]
There are currently no good treatments for such infections, and antibiotics have been questioned for their effectiveness, as they may release large amounts of VT when the bacteria die, and are ineffective for released VT. (See, for example, Carter, A. et al. (1987) The New England Journal of Medicine 316: 1496-1500; Griffin, P. et al. (1988) Annals of Internal Medicine 109: 705-712). .
[0004]
Therefore, a drug that neutralizes VT, which is a cause of seriousness, is useful as a therapeutic and / or preventive drug for VTEC infections such as E. coli O-157 and bacterial infections other than E. coli that produce VT. It is expected. However, there are two types of VT, VT1 and VT2, which have different antigenicities. There are bacteria that produce only one of VT1 and VT2, and bacteria that produce both, and there are reports that all types of bacteria have become serious. As will be described later, the gamma globulin preparation has neutralizing activity against VT1, but has little neutralizing activity against VT2, and the VT adsorbent currently in clinical trial is ineffective for VT transferred to blood. .
[0005]
Human high density lipoprotein (human HDL) has been reported as having an activity of neutralizing VT2 and existing in blood (Caprioli, A. et al. (1994) Recent Advances in Verocytotoxin-producing Escherichia Coli Infections Pp. 353-356), as shown by data in a reference example to be described later, the contents described in this document were incorrect.
[0006]
On the other hand, human SAP is a plasma protein belonging to the pentraxin family, and a glycoprotein consisting of 204 amino acids and having a molecular weight of about 25,000 forms a 10-mer by noncovalent bonding. It is included in amyloid deposits, binds to DNA and chromatin, binds to amyloid fibrils, heparan sulfate, heparin, fibronectin, C4 binding protein, etc. in the presence of Ca ⁺⁺ , forms a matrix of glomerular basement membrane (Emsley, J. et al. (1994) Nature 367: 338-345), but it is not known that such human SAP has an activity to neutralize VT2.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of this invention is to provide the chemical | medical agent which neutralizes VT2.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to find a drug that neutralizes VT2, the present inventors have found that human plasma has an activity of neutralizing VT2, and that the main body of the activity is human SAP, not gamma globulin or human HDL As a result of finding out this fact and continuing research on this basis, the present invention has been achieved.
[0009]
That is, the present invention is a neutralizing agent for verotoxin 2 containing human serum amyloid P component as an active ingredient, and a neutralizing agent for verotoxin 2 containing a partial peptide of human serum amyloid P component as an active ingredient. is there.
[0010]
Here, “partial peptide of human serum amyloid P component” refers to a fragment that forms a part of human serum amyloid P component and retains the neutralizing activity of verotoxin 2. In addition, “neutralization” includes all effects and actions for eliminating or mitigating harmful effects of VT2 in vivo.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Human SAP used in the present invention is a known protein, and is available as a reagent from Alexis.
[0012]
Since the VT2 neutralizing agent of the present invention is a protein preparation or a peptide preparation, it is desirably provided as an injection. In order to obtain an injection, a general method for preparing a protein or peptide as an injection may be used.
[0013]
Since human SAP is a human plasma protein, there is no antigenic problem when human SAP or human SAP partial peptide is administered as a VT2 neutralizing agent. Therefore, the agent of the present invention is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for VTEC infections including E. coli O-157 and bacterial infections other than E. coli producing VT2.
[0014]
Although the dose of the active ingredient depends on the degree of the disease, for example, in the case of E. coli O-157 infection, since adults rarely develop HUS, the blood SAP concentration in healthy adults is 30-40 μg / One guideline is to formulate so as to satisfy the conditions for maintaining ml. However, this dose may be appropriately adjusted according to the disease state.
[0015]
【Example】
[Example 1]
Measurement method of VT neutralization activity VT1 (assigned from Prof. Takeda, National Children's Hospital) 50 pg / ml or VT2 (assigned from Prof. Takeda, National Children's Hospital, Yutsudo T et al., Microbial Pathogenesis 3 , pp21-30 The sample (2 times serial dilution) was added in an amount of 30 μl and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Add 50 μl of the reaction solution to human kidney-derived cell line ACHN monolayer cells (transferred from National Children's Hospital, Prof. Takeda, available from ATCC) and incubate at 37 ° C for 1 hour in the presence of 5% carbon dioxide. Then, the cells were washed and cultured at 37 ° C. for 4 days in the presence of 5% carbon dioxide. Neutral red solution was added to a final concentration of 0.014 to 0.028%, and cultured for 1 hour at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide to stain viable cells (Mullbacher, A. et al. (1984) Journal. of Immunological Methods, 68: 205-215). After washing the cells, a 50% ethanol-1% acetic acid solution was added, the absorbance at 550 nm was quantified, and the neutralizing activity was calculated according to the following formula.
[0016]
[Expression 1]

[0017]
[Reference Example 1]
VT1 and VT2 neutralizing activity of γ globulin preparation The VT1 and VT2 neutralizing activity of the γ globulin preparation (Benilon (trademark): Teijin, Institute of Chemical and Serum Therapy) was measured according to Example 1.
Although the VT1 neutralizing activity was detected in the γ globulin preparation shown in FIG. 1, the VT2 neutralizing activity was hardly detected.
[0018]
[Reference Example 2]
Purification of IgG fraction in human plasma IgG in human plasma was purified with a protein G column (Protein G Sepharose 4FF: Pharmacia). Two human plasma samples (5 ml each) were injected into a protein G column (5 ml), and the non-adsorbed fraction was collected. After washing the column with 50 ml of 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.2), the IgG fraction was eluted with 0.01 N hydrochloric acid (pH 2) containing 0.15 M sodium chloride (fractionated in 2.5 ml fractions). The fraction with the highest absorbance at 280 nm was defined as the IgG fraction). The column elution fraction was subjected to buffer replacement with a medium (MEM: Nissui) using a gel filtration column (Sephadex-G25: Pharmacia).
[0019]
[Example 2]
VT2 neutralization activity of human plasma and IgG fractions Two human plasma samples used in Reference Example 2, and VT2 neutralization of non-adsorbed fraction and eluted fraction of Protein G column obtained in Reference Example 2 The activity was measured according to Example 1. The results are shown in Table 1. VT2 neutralization activity was detected in human plasma and non-adsorbed fraction of column, but no activity was detected in column elution fraction (IgG fraction), and VT2 neutralizing factors other than IgG exist in human plasma Was shown to do.
[0020]
[Table 1]

[0021]
[Example 3]
Specific gravity liquid used to fractionate lipoproteins in fractions <br/> human plasma lipoproteins in human plasma were prepared as follows. 500 ml of water and 1 ml of 1N sodium hydroxide were added to 11.4 g of sodium chloride and 0.1 g of EDTA · disodium salt to dissolve, and then a specific gravity liquid (d = 1.006) was prepared as 1003 ml with water. Sodium bromide (24.98 g) was added to and dissolved in 100 ml of a specific gravity liquid (d = 1.006) to prepare a specific gravity liquid (d = 1.182). Sodium bromide (78.32 g) was added to and dissolved in 100 ml of a specific gravity liquid (d = 1.006) to prepare a specific gravity liquid (d = 1.478). 50 ml of a specific gravity liquid (d = 1.182) was added to 100 ml of a specific gravity liquid (d = 1.006) and mixed to prepare a specific gravity liquid (d = 1.063). A specific gravity liquid (d = 1.21) was prepared by adding 25 ml of a specific gravity liquid (d = 1.478) to 50 ml of a specific gravity liquid (d = 1.063) and mixing.
[0022]
Next, 1 ml of human plasma was added to 0.5 ml of a specific gravity solution (d = 1.182) and mixed. The mixed solution was overlaid with 0.5 ml of a specific gravity solution (d = 1.063) and centrifuged at 40,000 rpm for 40 hours. The upper 0.5 ml was collected as a very low density lipoprotein (VLDL) to low density lipoprotein (LDL) fraction, and the lower 0.5 ml was collected from HDL as a very high density lipoprotein (VHDL) and plasma protein fraction. Each fraction was replaced with a medium (MEM: Nissui) with a gel filtration column (Sephadex-G25: Pharmacia), and adjusted to the concentration in plasma by making 1 ml.
[0023]
Furthermore, 4 ml of human plasma was added to 2 ml of a specific gravity solution (d = 1.182) and mixed, and then 3 ml of a specific gravity solution (d = 1.478) was added and mixed. 0.55 ml of a specific gravity liquid (d = 1.21) was overlaid on 2.25 ml of the mixed liquid, and centrifuged at 40,000 rpm for 40 hours. The upper 0.5 ml was collected as HDL fraction from VLDL, and the lower 0.5 ml was collected as VHDL and plasma protein fraction. Each fraction was replaced with a medium (MEM: Nissui) with a gel filtration column (Sephadex-G25: Pharmacia), and adjusted to the concentration in plasma by making 1 ml.
[0024]
[Example 4]
VT2 neutralizing activity of human lipoprotein fraction and commercial human HDL VLDL to LDL fraction obtained in Example 3 (d <1.063), HDL to VHDL and plasma protein fraction (d> 1 0.063), VLDL to HDL fraction (d <1.21), VHDL and plasma protein fraction (d> 1.21) and commercial human HDL (1.063 <d <1.21: Alpha Biochemical) The VT2 neutralizing activity was measured according to Example 1.
[0025]
The results are shown in Table 2. VT2 neutralizing activity was detected in HDL to VHDL and plasma protein fractions and VHDL and plasma protein fractions, but no activity was detected in VLDL to LDL fraction, VLDL to HDL fraction and commercial HDL, and in VT2 It was found that the sum factor was not HDL but VHDL or plasma protein.
[0026]
[Table 2]

[0027]
[Example 5]
Purification of VT2 neutralizing factor in human plasma 60 ml of human peripheral blood was mixed with the same amount of medium (RPMI1640: Gibco), and then centrifuged (1500 rpm) to recover the supernatant (plasma). 102 ml of plasma was injected into a ConA column (ConA Sepharose, 40 ml: Pharmacia), the column was washed with 400 ml of 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.2), and then 0.01 M phosphate containing 0.1 M mannose. The VT2 neutralizing factor fraction was eluted with a buffered physiological saline (pH 7.2) (10 ml was fractionated, and the fraction having a high absorbance at 280 nm was used as the VT2 neutralizing factor fraction).
[0028]
After 40 ml of a part of the eluted fraction was replaced with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8) by a gel filtration column (Sephadex-G25: Pharmacia), anion exchange column (DEAE Sepharose FF, 5 ml: Pharmacia). After washing the column with 50 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8) containing 0.1 M sodium chloride, the column was washed with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8) containing 0.1 M sodium chloride. A VT2 neutralizing factor fraction was obtained by gradient elution (50 ml × 2) of 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8).
[0029]
After 12.5 ml of the eluted fraction was replaced with 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8) by a gel filtration column (Sephadex-G25: Pharmacia), hydroxyapatite column (Gigapite, 5 ml: Seikagaku Corporation) Injected into. After the column was washed with 55 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8), a gradient elution (50 ml × 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8) to 0.25 M phosphate buffer (pH 6.8) was performed. The VT2 neutralizing factor fraction was obtained by 2).
[0030]
24 ml of the eluted fraction was concentrated by ultrafiltration (YM30 membrane: Amicon) and then injected into gel filtration HPLC (Superose 6 HR10 / 30: Pharmacia), and VT2 neutralizing factor was added to 0.01M phosphate buffered saline ( Elution was performed at pH 7.2).
[0031]
As a result of analyzing VT2 neutralizing factor purified by gel filtration HPLC by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was detected as a single band at a molecular weight of about 25000.
[0032]
[Example 6]
VT2 neutralizing activity of VT2 neutralizing factor in human plasma The VT2 neutralizing activity of the VT2 neutralizing factor obtained in Example 5 was measured according to Example 1.
As a result, the purified VT2 neutralizing factor was confirmed to have VT2 neutralizing activity.
[0033]
[Example 7]
N-terminal amino acid sequence of VT2 neutralizing factor in human plasma After fractionating the fraction eluted with hydroxyapatite column obtained in Example 5 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, PVDF membrane (Immobilon P: Millipore) Western blotting. A band with a molecular weight of about 25000 was cut out and the N-terminal amino acid sequence was analyzed with a protein sequencer.
As a result, the sequence from the N-terminal to 12 residues of the VT2 neutralizing factor is His-Thr-Asp-Leu-Ser-Gly-Lys-Val-Phe-Val-Phe-Pro, and this sequence is human serum amyloid P Complete agreement with the component (human SAP).
[0034]
[Example 8]
VT2 neutralizing activity of commercially available human SAP The VT2 neutralizing activity of commercially available human SAP (Alexis) was measured according to Example 1.
The results are shown in FIG. Thereby, VT2 neutralization activity was confirmed by commercial human SAP.
[0035]
【The invention's effect】
The verotoxin 2 neutralizing agent of the present invention is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for VTEC infections such as E. coli O-157 and bacterial infections other than E. coli producing VT2.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 VT neutralizing activity of gamma globulin preparations FIG. 2 VT2 neutralizing activity of human SAP

Claims

A neutralizing agent for verotoxin 2 containing human serum amyloid P component as an active ingredient.