JP4199115B2 - Preincubation assay using single-stranded nucleic acid oligomers - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイ法、詳しくは、一本鎖の核酸オリゴマーを使用した核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイ法に関する。
背景技術
核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイは、酵素反応が進行する適当な条件（例えば、バッファー条件、反応温度等）を定めて、核酸合成酵素、核酸合成酵素の基質、その他酵素反応に必要なもの（例えば、金属イオン等）と被検物質を混和し、酵素反応を進行させ、反応終了後、何らかの手段により測定または算出される酵素活性を、被検物質非存在時の酵素活性と比較することにより達成される。
例えば、核酸合成酵素、標識等された基質、テンプレート、プライマー、金属イオン、被検物質を同時にまたは順次混合し、核酸合成酵素反応を進行させる。標識された基質は、反応産物に取り込まれる（インコーポレーション）。反応終了後、反応産物に取り込まれた標識された基質の量を測定し、それにより計算される酵素活性を、被検物質非存在時の酵素活性と比較することにより達成される。
しかし、このようなアッセイの結果、被験物質が核酸合成酵素の活性化作用または阻害作用を有しているということがわかっても、その被験物質がその被験物質の構造や特性に基づいて、核酸合成酵素に対し非特異的に作用または結合し、擬陽性を示している場合もある。そのため、アッセイの結果データが陽性であることを示す場合は、更に別のアッセイ法で真の核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤であることを確認する必要があるが、別のアッセイ法が複雑な工程を必要とし、一次アッセイには不適当な場合もある。
近年、ハイスループットスクリーニング（以下、ＨＴＳという。）は、医薬品開発の初期段階において、重要な位置を占めている。ＨＴＳによって、一度に数百〜数万の化合物のアッセイを行うことができるが、いかにして莫大なデータを解析するかが大きな問題となっている。
特許文献１にはプライマーを加えないＨＣＶのアッセイ法の可能性についての記載はあるが、プレインキュベーションについては、開示されていない。
一方、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素に関して、テンプレートとプライマーの存在下でプレインキュベーションすると、酵素活性が上昇することが非特許文献１に開示されている。しかし、上記文献は単に酵素の性質を開示しているに過ぎず、酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイ、一本鎖の核酸オリゴマーを使用したアッセイについては、全く開示されていない。
また、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素に関して、３’末端が自らのプライマーとなり得る一本鎖の核酸オリゴマーをテンプレートとして使用した場合、プライマーの非存在下で酵素反応が進行することが非特許文献２に開示されている。しかし、プレインキュベーションについては、全く開示されていない。
特許文献 １：国際公開第９６／３７６１９号
非特許文献１：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００），８１，７５９−７６７
非特許文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，９１３４−９１４３
発明の開示
ＨＴＳの結果得られるデータから、いかに有用な情報を得るか、即ち、いかにノイズ（擬陽性）をなくすかが重要であり、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のノイズが少ないアッセイ法の開発が求められている。
本発明者は、プレインキュベーションアッセイ法、即ち、被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションし、その後、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイをすることにより、アッセイの結果得られるデータからノイズが減少することを見出した。
すなわち、本発明は、
（１）被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションする工程を含むことを特徴とする核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイ法、
に関する。
さらに詳しくは以下（２）〜（１７）に関する。
（２）以下の工程；
（ａ）被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションする工程、
（ｂ）該インキュベーションした溶液と、被検物質および該核酸合成酵素の基質を混合し、該核酸合成酵素と被験物質および該核酸合成酵素の基質を接触させ、該核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
（ｃ）該インキュベーションした溶液と、該核酸合成酵素の基質を混合し、被検物質の非存在下で、該核酸合成酵素と該核酸合成酵素の基質を接触させ、該核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
（ｄ）（ｂ）及び（ｃ）の工程で測定された該核酸合成酵素の基質の反応産物への各取り込みを比較する工程、
を含むことを特徴とする上記（１）記載のアッセイ法、
（３）ウイルス核酸合成酵素の阻害剤のアッセイ法である上記（１）または（２）記載のアッセイ法、
（４）該ウイルス核酸合成酵素が、ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素である上記（３）記載のアッセイ法、
（５）該ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素が、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素である上記（３）記載のアッセイ法、
（６）該一本鎖の核酸オリゴマーが、３’末端部分に自己相補的核酸配列を有するものである上記（４）または（５）記載のアッセイ法、
（７）該一本鎖の核酸オリゴマーが、ｐｏｌｙ（Ａ）の３’末端部分に自己相補的核酸配列を有するものである上記（６）記載のアッセイ法、
（８）該基質が、３Ｈ−ＵＴＰまたは３２Ｐ−ＵＴＰである上記（７）記載のアッセイ法、
（９）該金属イオンがＭｇ２＋またはＭｎ２＋である上記（１）〜（８）のいずれかに記載のアッセイ法、
（１０）該インキュベーションを０．５時間以上行うことを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載のアッセイ法、
（１１）該インキュベーションを２０℃〜４０℃で行うことを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のアッセイ法、
（１２）上記（３）記載のアッセイ法により得られる物質とウイルス核酸合成酵素を接触させることによる、ウイルス核酸合成酵素の阻害方法、
（１３）上記（３）記載のアッセイ法により得られる物質とウイルスを接触させることによる、ウイルスの複製の阻害方法、
（１４）該ウイルスがフラビウイルス科に属するウイルスである上記（１２）または（１３）記載の方法、
（１５）該ウイルスがＨＣＶである上記（１２）または（１３）記載の方法、
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のアッセイ法により得られる核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤、
（１７）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のアッセイ法により得られる核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物、
に関する。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイに関する技術である。本明細書中、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイは、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤であることが知られていない被検物質を評価するアッセイ、すなわち第１次アッセイ、及び、既に核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤であることが知られている被検物質を評価するアッセイ、すなわち再評価アッセイを包含する。本発明のアッセイは、これらのすべてのアッセイに使用することができる。例えば、核酸合成酵素を活性化または阻害する物質の同定に使用することができる。特に、核酸合成酵素を阻害する物質の同定に使用することができ、例えば、ウイルスの核酸合成酵素を阻害する物質の同定、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を阻害する物質の同定、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を阻害する物質の同定等に使用することができる。
本発明は、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイにおいて、酵素反応を開始させる前にインキュベーションすることを特徴とする。すなわち、被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションすることを特徴とする。本明細書中、該インキュベーションをプレインキュベーションとも表現する。詳しくは、被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、プレインキュベーションの効果が現れる温度で、プレインキュベーションの効果の現れる時間、核酸合成酵素、３’末端が自らのプライマーとなり得る一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションすることを意味する。
該インキュベーションの温度、すなわちプレインキュベーションの効果が現れる温度としては、具体的には、約１５℃〜約５０℃、特には、２０℃〜４０℃、さらには、２０〜３０℃でインキュベーションするのが好ましい。
該インキュベーションの時間、すなわちプレインキュベーションの効果の現れる時間としては、約１５分以上、特には、０．５時間以上、さらには１時間以上が好ましく、約１５分〜１２時間、０．５〜３時間、特に１〜２時間インキュベーションするのが好ましい。
被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションすることによって、酵素反応が進行しやすい状態が形成されると考えられる。
「被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下」とは、被検物質および核酸合成酵素の基質を含まない条件でインキュベーションすることを意味する。例えば、核酸合成酵素の基質以外の酵素反応に必須なもの（例えば、金属イオン等）を酵素と共にインキュベーションすればいい。
「核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液」とは、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを少なくとも含み、それら以外に被検物質および核酸合成酵素の基質以外のものを含んでいてもよい溶液等が挙げられる。例えば、高分子化合物、低分子化合物、金属イオン、ハロゲンイオン、アミノ酸、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド等を含んでいてもよい。
本発明のアッセイは、核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイであり、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーを使用する核酸伸長合成反応に関するアッセイである。
「３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマー」とは、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖のテンプレートＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。すなわち、３’末端部分が、自己の相補的な部分とハイブリダイズし、ループ構造を形成することができる一本鎖の核酸オリゴマーを意味する。なお、酵素反応に際し３’末端部分が自らのプライマーとして機能する一本鎖の核酸オリゴマーであれば、溶液中ではループを形成せず一本鎖として存在していても、ループを形成していてもよい。好ましくは、溶液中ではループを形成せず一本鎖として存在している一本鎖の核酸オリゴマーである。例えば、ハイブリダイズする部分の相補的な結合が、ＧとＣの水素結合やｄＧとｄＣの水素結合によるものよりも、ＡとＵの水素結合、ｄＡとｄＴの水素結合によるものが好ましい。例えば、３’末端部分にＡＵの繰り返し配列を有するものなどが好ましい。
一本鎖の核酸オリゴマーとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマー、
ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）、ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）の３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマー、
ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）などのホモポリマー（例えば、合成された核酸ポリマー）の３’末端部分に、それぞれｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＡ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＧ）などが付加された一本鎖のＤＮＡオリゴマー（例えば、ＤＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などのホモポリマーの３’末端部分に、それぞれｏｌｉｇｏ（Ｕ）、ｏｌｉｇｏ（Ａ）、ｏｌｉｇｏ（Ｃ）、ｏｌｉｇｏ（Ｇ）などが付加された一本鎖のＲＮＡオリゴマー（例えば、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）などのホモポリマー（例えば、合成された核酸ポリマー）の３’末端部分に、それぞれｏｌｉｇｏ（Ｕ）、ｏｌｉｇｏ（Ａ）、ｏｌｉｇｏ（Ｃ）、ｏｌｉｇｏ（Ｇ）などが付加された一本鎖の核酸オリゴマー（例えば、ＤＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などのホモポリマーの３’末端部分に、それぞれｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＡ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）、ｏｌｉｇｏ（ｄＧ）などが付加された一本鎖の核酸オリゴマー（例えば、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）などのホモポリマーの３’末端部分に、ｄＡｄＴまたはｄＣｄＧの繰り返し配列が付加された一本鎖のＤＮＡオリゴマー（例えば、ＤＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などのホモポリマーの３’末端部分に、ＡＵまたはＣＧの繰り返し配列が付加された一本鎖のＲＮＡオリゴマー（例えば、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）などのホモポリマーの３’末端部分に、ＡＵまたはＣＧの繰り返し配列が付加された一本鎖の核酸オリゴマー（例えば、ＤＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の場合）、
ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などのホモポリマーの３’末端部分に、ｄＡｄＴまたはｄＣｄＧの繰り返し配列が付加された一本鎖の核酸オリゴマー（例えば、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素の場合）、
各種の塩基が混在したヘテロポリマー（例えば、天然に存在する核酸ポリマー、合成された核酸ポリマー等）の３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマー、
各種の塩基が混在したヘテロポリマー（例えば、天然に存在する核酸ポリマー、合成された核酸ポリマー等）の３’末端部分に、ｄＡｄＴ、ｄＣｄＧ、ＡＵまたはＣＧの繰り返し配列が付加された一本鎖の核酸オリゴマー。
ここで、自己相補的核酸配列とは、３’末端部分がループ構造（例えば、ヘアピンループ）を形成し、自己の相補的な部分とハイブリダイズすることができる配列を意味する。
なお、ホモポリマーの５’末端部分は、他の核酸が付加されていてもよい。例えば、ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を使用する場合、一本鎖の核酸オリゴマーとしては、３’末端部分にＡＵの繰り返し配列を有するものなどが好ましい。特に、ｐｏｌｙ（Ａ）の３’末端部分にＡＵの繰り返し配列を有するものが好ましい。
一本鎖の核酸オリゴマーの長さは、特に制限がなく、核酸合成酵素の種類によって適宜選択すればよい。例えば、約８塩基〜約１０００塩基、約５０塩基〜約８００塩基、約１００塩基〜約５００塩基の長さの一本鎖の核酸オリゴマーを使用することができる。
一本鎖の核酸オリゴマーにおいて、自己の相補的な部分とハイブリダイズする塩基対の数は、２以上、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜５である。
金属イオンとしては、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋等が挙げられる。核酸合成酵素においては、一般的には、Ｍｇ２＋が必須のものが多い。
被検物質とは、アッセイに使用される物質を意味し、低分子化合物のみならず、ポリペプチドのようなタンパク質も含まれる。
酵素反応は、プレインキュベーション後、核酸合成酵素を含む溶液に、核酸合成酵素の基質を加えることによって開始される。
従来法（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．１５，ｎｏ．１，ｐｐ１２−２２，１９９６）では、酵素反応を約２２℃で行なう必要があり、それ以上の温度で行なうと核酸合成酵素が失活し、それ以下の温度で行なうと核酸合成酵素の働きが鈍くなる。
プレインキュベーションアッセイ法は、従来法と異なり、核酸合成酵素反応を約１０℃〜約４０℃で行うことができる。特に、約２０℃〜約４０℃で行なうことができる。そのため、ヒトに存在する核酸合成酵素やヒトに感染するウイルスの核酸合成酵素等を使用したアッセイにおいては、ヒトの体温（特に３７℃）と同一の温度で行うことができ、非常に有用である。また、このような温度で行なうことにより、酵素活性が上昇し、その結果としてアッセイの検出感度が上昇する。
核酸合成酵素の酵素反応に対する被検物質の効果は、核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定し、比較すればよい。すなわち、１）被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションし、２）インキュベーションした溶液と、被検物質および核酸合成酵素の基質を混合し、核酸合成酵素と被検物質および核酸合成酵素の基質を接触させ、核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定し、３）インキュベーションした溶液と、核酸合成酵素の基質を混合し、被検物資の非存在下で、核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させ、核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定し、４）２）および３）の工程で得られた核酸合成酵素の基質の反応産物への各取り込みを比較することによって確認することができる。なお、インキュベーションした溶液に（被検物質および）核酸合成酵素の基質を加えても、（被検物質および）核酸合成酵素の基質に、インキュベーションした溶液を加えてもよい。すなわち、核酸合成酵素の基質と核酸合成酵素が接触すればよい。
また、「核酸合成酵素の基質を混合し、被検物質の非存在下で」とは、被検物質を混合しないことを意味し、被検物質を含まない限り、核酸合成酵素の基質以外のものを含んでいてもよい。例えば、核酸合成酵素の基質を溶解又は懸濁させるための反応液を含んでいてもよい。すなわち、被検物質存在下のデータの比較対象とするデータを作成するためのものであればよい。プレインキュベーションしていない核酸合成酵素を含む溶液と、核酸合成酵素の基質を混合し、被検物質の非存在下で、核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させた場合の核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを比較対象として使用することもできる。なお、プレインキュベーションした溶液と、核酸合成酵素の基質を混合し、被検物質の非存在下で、核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させた場合の核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを比較対象とするのが好ましい。これらの比較対象として使用するデータは、被検物質を使用するアッセイと同時に行ってもよく、別途、行ってもよい。
核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みは、標識された核酸合成酵素の基質を使用することにより測定することができる。例えば、反応産物に取り込まれた標識された核酸合成酵素の基質の量を測定すればよい。標識された核酸合成酵素の基質としては、放射標識された核酸合成酵素の基質等を使用すればよく、その場合、シンチレーションカウンター等で放射活性を測定すればいい。なお、標識された核酸合成酵素の基質等は、市販のフィルター等（例えば、ジエチルアミノエチル基を導入したフィルター等）を使用して、反応液から分離すればよい。また、ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）法にも適応できる。
低分子化合物とは、分子量１５〜１０００の有機化合物を意味し、構成原子としては、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素、沃素等が挙げられる。
ポリペプチドには、天然型ペプチドのみならず、構造修飾したペプチド（例えば、ペプチドアイソスターなど）も含まれる。
核酸合成酵素の酵素の基質としては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ等が挙げられる。特に標識されたものが好ましく、標識された核酸合成酵素の基質としては、例えば、３Ｈ−ｄＡＴＰ、３Ｈ−ｄＴＴＰ、３Ｈ−ｄＧＴＰ、３Ｈ−ｄＣＴＰ、３Ｈ−ＡＴＰ、３Ｈ−ＵＴＰ、３Ｈ−ＧＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰ、３２Ｐ−ｄＡＴＰ、３２Ｐ−ｄＴＴＰ、３２Ｐ−ｄＧＴＰ、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、３２Ｐ−ＡＴＰ、３２Ｐ−ＵＴＰ、３２Ｐ−ＧＴＰ、３２Ｐ−ＣＴＰ等が挙げられる。これらの基質は、アッセイに使用する一本鎖の核酸オリゴマーに応じて選択すればよい。
例えば、一本鎖の核酸オリゴマーとして３’末端部分が修飾されたｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ）、ｐｏｌｙ（ｄＣ）、ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）を使用する場合は、それぞれｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰを基質として使用すればよい。
また、一本鎖の核酸オリゴマーとして、各種の塩基が混在したヘテロポリマー（例えば、天然に存在する核酸ポリマー、合成された核酸ポリマー等）の３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマーを使用する場合、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを混合したもの、またはＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＧＴＰを混合したものを基質として使用すればよい。この場合、すべての基質が標識されてもよいし、いずれかが標識されていてもよい。
例えば、一本鎖の核酸オリゴマーとして、ｐｏｌｙ（Ａ）の３’末端部分にＡＵの繰り返し配列を有するものを使用する場合、該基質として３Ｈ−ＵＴＰまたは３２Ｐ−ＵＴＰを使用することができる。
「核酸合成酵素」とは、ポリヌクレオチド鎖合成酵素を意味し、例えば、ＤＮＡ合成酵素（例えば、ＤＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素）、ＲＮＡ合成酵素（例えば、ＤＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素等）が挙げられる。なお、本発明には、全長の核酸合成酵素のみならず、酵素活性を有する核酸合成酵素の欠失体、置換体、付加体も使用することができる。例えば、リコンビナントの核酸合成酵素を使用することもできる。また、反応液中で酵素となるような酵素の前駆体を使用してもよい。
核酸合成酵素としては、ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素が好ましく、さらにはＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素が好ましい。
ウイルスは特に限定されないが、例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）、インフルエンザウイルス等が挙げられる。特に、フラビウイルス属に属するウイルスが好ましく、さらにはＨＣＶが好ましい。
ウイルスの酵素としては、例えば、ＨＩＶの逆転写酵素（ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素。ＲＮａｓｅＨ活性を有するものを含む。）、ＨＣＶのＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素、ＨＢＶのＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素活性、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素活性、および／またはＲＮａｓｅＨ活性を有するもの）、ＨＴＬＶの逆転写酵素、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素などが挙げられる。
本発明はいかなる核酸合成酵素においても使用することができる。核酸合成酵素の中では、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素（例えば、ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素）が好ましく、特に、フラビウイルス科に属するウイルスのＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素が好ましい。さらには、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素が好ましい。
ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を有するウイルスとしては、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トーガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブニアウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）等のウイルス科のウイルスが挙げられる。特に、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスが好ましく、さらには、ＨＣＶが好ましい。
フラビウイルス科に属するウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ熱ウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、Ｒｏｃｉｏウイルス（Ｒｏｃｉｏ ｖｉｒｕｓ）、Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。これらのウイルスは、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を有している。また、これらのウイルスはヒトを含む哺乳動物の疾患とも関連しており、これらのウイルスのＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の阻害剤を見出すことは有用である。
また、核酸合成酵素には、単一の酵素活性を有する核酸合成酵素のみならず、複数の酵素活性を有する核酸合成酵素も含まれる。例えば、複数の酵素活性を有する核酸合成酵素としては、ＨＢＶのＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素活性、ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素活性、および／またはＲＮａｓｅＨ活性を有するもの）などが挙げられる。
また、ＨＩＶの逆転写酵素（ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成酵素阻害活性およびＲＮａｓｅＨ活性を有する）などは、それぞれの酵素活性を有する部分のみを本発明のアッセイに使用してもよいし、両方の酵素活性を有する部分を本発明のアッセイに使用してもよい。
ＨＣＶの遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）は多数存在するが、本発明においては、それらのいずれの遺伝子型を有するＨＣＶの酵素についても使用することができる。遺伝子型としては、ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｃ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ｃ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ３ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ３ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ４，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ５，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ６等が挙げられる。
ＨＣＶのＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素は、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５Ｂ）領域にコードされており、本発明においては、ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素活性を持っている酵素であれば、いかなるものも使用することができる。例えば、上記の遺伝子型（例えば、ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｃ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ｃ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ３ａ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ３ｂ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ４，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ５，ｇｅｎｏｔｙｐｅ ６）を有するＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域にコードされているＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素活性を持っている核酸合成酵素等を使用することができる。
活性化剤とは、酵素反応を活性化させる物質を意味する。核酸合成酵素の活性化剤は、核酸合成酵素の発現量や機能の低下に起因する疾患の治療に使用することができ、有用である。また、核酸合成酵素を使用して核酸伸長を行う場合に、酵素反応を効率よく行うための試薬として使用することができる。
また、阻害剤とは酵素反応を阻害する物質を意味する。特に、ウイルス核酸合成酵素の阻害剤は、ウイルスに起因する疾患の治療に使用することができ、有用である。阻害剤としては、例えば、ＩＣ５０値が１００μＭ以下、特に、１０μＭ以下、さらには、１μＭ以下の物質が好ましい。
本発明は、プレインキュベーションアッセイ法に関するものであるが、特に、莫大な数の化合物のアッセイ、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、ノイズ（擬陽性）を減少させることができ、効果的にリード化合物を選択することができる。
すなわち、本発明のアッセイ法により得られる物質と核酸合成酵素を接触させることにより、核酸合成酵素を活性化または阻害することができる。また、核酸合成酵素がウイルスの核酸合成酵素である場合は、本発明のアッセイ法により得られる物質とウイルスを接触させることにより、ウイルスの複製を活性化または阻害することができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明である「一本鎖の核酸オリゴマーを使用したプレインキュベーションアッセイ法」について、従来法との比較をしながら、以下に説明する。なお、核酸合成酵素としては、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を使用して説明するが、特に本酵素に限定する意味ではない。本発明は、核酸合成酵素であれば、種類を問わず実施することができる。特に好ましいのは、ＲＮＡ合成酵素、さらにはＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素、さらにはＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素である。
従来法
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素、テンプレートとしてのオリゴＲＮＡ（オリゴＲＮＡは、３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマーを意味する）、基質としてのＲＮＡ三リン酸、Ｍｇイオン（Ｍｇ２＋）、Ｍｎイオン（Ｍｎ２＋）、被検物質を一斉混和し、酵素反応を開始させ、基質の反応産物への取り込みを測定する。被検物質非存在下での値と比較することにより、被検物質がＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を活性化しているか、阻害しているかを知ることができる。
プレインキュベーションアッセイ法
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素、テンプレートとしてのオリゴＲＮＡ（オリゴＲＮＡは、３’末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマーを意味する）、Ｍｇイオン（Ｍｇ２＋）、Ｍｎイオン（Ｍｎ２＋）を約２５℃で約１時間から２時間プレインキュベーションした後、基質としてのＲＮＡ三リン酸、被検物質を添加し、酵素反応を開始させ、基質の反応産物への取り込みを測定する方法である。なお、上記従来法と同様に、被検物質非存在下での値と比較し、阻害百分率を算出し、阻害剤を選定することができる。具体的な手順は、後述の実施例１を参考にすればよい。
本発明の「一本鎖の核酸オリゴマーを使用したプレインキュベーションアッセイ法」は、従来法に比較して、以下の点で優れている。
▲１▼酵素活性の上昇
プレインキュベーション時間と酵素活性の比較をおこなった。具体的な手順は、試験例１に記載されている。なお、酵素活性は、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）の反応産物への取込みを測定することにより決定した。結果を図１に示す。プレインキュベーション時間が約９０分までは、徐々に酵素活性が上昇し、従来法との酵素活性の差が徐々に大きくなっていくのがわかる。また、約９０分のプレインキュベーションにより、従来法にくらべて、約８倍の酵素活性を示すことがわかる。このことにより、測定結果の検出が容易になり、阻害率の誤差も減少し、阻害剤のスクリーニングにおいて有用であると言える。なお、さらにプレインキュベーション時間を長くした場合、約９０分プレインキュベーションした場合とほぼ同等の酵素活性を示すことがわかる。
▲２▼熱安定性の上昇
プレインキュベーションの有無と酵素反応温度の関係を調べ、結果を図２に示した。図２に示すように、従来法では、酵素反応を約３７℃でおこなうと、反応時間が２時間以上になると酵素が失活し、正確な酵素活性値を測定することができない。それに対し、プレインキュベーション法では、約３７℃でも酵素反応が良好に進行し、より生体内温度に近い条件でアッセイをおこなうことができる。また、酵素反応を約２５℃でおこなうよりも、約３７℃でおこなう方が、さらに酵素活性が高くなることがわかる。従って、プレインキュベーションアッセイ法においては、約３７℃という生体温度に近い温度でアッセイすることも可能である。
▲３▼擬陽性（ノイズ）の減少
プレインキュベーションアッセイ法によって、アッセイ結果のノイズを軽減させることができる。以下に、表１、表２を使用して説明する。
表１、表２では、競合的阻害剤として、３’−デオキシウリジントリホスフェート（３’−ｄＵＴＰ）を使用している。３’−ｄＵＴＰは、核酸合成反応において基質と競合して反応産物へ取り込まれ、ＲＮＡ鎖の伸長を止めることにより、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の酵素反応を阻害することができる化合物である。化合物Ａ、Ｂは、従来法でポジティブと判定された化合物である。すなわち、これらの化合物は、プレインキュベーションしない従来法では、２０μ／ｍｌの濃度で、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を約６０％〜８０％阻害する。しかしながら、プレインキュベーションアッセイ法によると、それらの阻害率は約２０％〜３０％に低下する。一方で、化合物Ｃ（０．０３２μｇ／ｍｌ）、３’−ｄＵＴＰ（０．０８μＭ）は、プレインキュベーションアッセイ法における阻害効果の低下は認められない。以下に、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃの構造を示す。
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の調製法
ＨＣＶ感染者血漿からＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素のｃＤＮＡクローンを作製し、これを基にＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を昆虫細胞または大腸菌を使用して発現させた。細胞抽出液中のＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素は、アニオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、ｐｏｌｙ Ｕアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを使用して精製した。精製は約４℃の低温条件で実施し、酵素溶解液としてはエチレンジアミン四酢酸（１ｍＭ）、ジチオスレイトール（１０ｍＭ）、グリセロール（２０％）を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。精製酵素は、アッセイに使用するまで４℃または−２０℃にて保存した。
実施例１
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素 プレインキュベーションアッセイ法
▲１▼ トリス塩酸（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）及び塩化マグネシウム（２５ｍＭ）、塩化マンガン（２．５ｍＭ）、ジチオスレイトール（５ｍＭ）、塩化カリウム（１２５ｍＭ）を含有する緩衝液Ｉ注１）（１０．５μｌ）をポリプロピレン製容器に入れ、ここへオリゴＲＮＡ注２）水溶液（１００μｇ／ｍｌ、１０．５μｌ）と水（１８．５μｌ）を添加し、緩やかに混和した。
▲２▼ 次に、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素液（１０．５μｌ）を追加し、２５℃で６０分間のプレインキュベーションを行った。
▲３▼ ジメチルスルホキシドまたは水で溶解した被験物質（１穴当り５．２６μｌ）を分注しておいた９６穴マイクロタイタープレートに、▲２▼のプレインキュベーション済みの溶液（５０μｌ）を加えた。
▲４▼ 更に、トリス塩酸（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）及び塩化マグネシウム（２５ｍＭ）、塩化マンガン（２．５ｍＭ）、ジチオスレイトール（５ｍＭ）、塩化カリウム（１２５ｍＭ）、ＵＴＰ注３）（１μＭ、含４．９μＣｉ３Ｈ−ＵＴＰ）を含有する緩衝液ＩＩ（１０．６μｌ）と水（３９．４μｌ）の混合液（５０μｌ）を添加混和し、２５℃で６０分間 酵素反応を行った。
▲５▼ 酵素反応が６０分経過した時、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（５０ｍＭ、５０μｌ）を添加混合し、酵素反応を停止した。
▲６▼ 次にセルハーベスターを使用して、ジエチルアミノエチル基を導入したフィルター（以下、ＤＥＡＥ−フィルターマットと略す）上に▲５▼のサンプル全量を移した後、リン酸ナトリウム緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ７．０）で１０秒間のすすぎ洗いを２回と脱イオン水で１０秒間のすすぎ洗いを１回行った。
▲７▼ すすぎ終えたＤＥＡＥ−フィルターマットを９５℃で１５分間乾燥し、液体シンチレータ（１０ｍｌ）と共にサンプルバッグに入れ密封した。
▲８▼ シンチレーションカウンターで放射活性を計測した。
▲９▼ 放射活性計測値（単位；ｃｐｍ）を以下の計算式に代入して阻害率を求めた。
阻害率＝１００−（被験物質存在下の計測値−酵素非存在下の計測値）
／（被験物質非存在下の計測値−酵素非存在下の計測値）×１００
注１） ▲１▼〜▲５▼の実験材料に使用している水は全てジエチルピロカーボネートでＲＮＡ分解酵素の失活処理をしている。ジエチルピロカーボネートによる処理は、ジエチルピロカーボネート（０．１ｇ）を脱イオン水（１００ｍｌ）に溶解後３７℃で２４時間放置し、その後１２０℃で３０分間オートクレーブにかけて行った。
注２） 核酸構成が５’−ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＵＡＵ ＡＵＡ ＵＡＵ−３’で構成された単鎖のオリゴヌクレオチド。テンプレートとして使用した。５’末端のＧＧは、核酸合成反応を停止させるために配列に付加した。
注３） ウリジン三リン酸。基質として使用した。
以下に、被検物質として、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、３’−ｄＵＴＰを使用した場合の、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の阻害率を示す。なお、使用した被検物質の濃度は、以下の通りである。
化合物Ａ：２０μｇ／ｍｌ 化合物Ｂ：２０μｇ／ｍｌ
化合物Ｃ：０．０３２μｇ／ｍｌ ３’−ｄＵＴＰ：０．０８μＭ
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素アッセイ従来法
▲１▼ トリス塩酸（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）及び塩化マグネシウム（２５ｍＭ）、塩化マンガン（２．５ｍＭ）、ジチオスレイトール（５ｍＭ）、塩化カリウム（１２５ｍＭ）を含有する緩衝液注１）（１０．５μｌ）をポリプロピレン製容器に入れ、ここへオリゴＲＮＡ注２）水溶液（１００μｇ／ｍｌ、１０．５μｌ）と水（１８．５μｌ）を添加し、緩やかに混和後、氷冷した。
▲２▼ 次に、氷冷したＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素液（１０．５μｌ）を添加、混合した。
▲３▼ ジメチルスルホキシドまたは水で溶解した被験物質（１穴当り５．２６μｌ）を分注しておいた９６穴マイクロタイタープレートに、▲２▼の氷冷混合液（５０μｌ）を加えた。
▲４▼ 次に、トリス塩酸（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）及び塩化マグネシウム（２５ｍＭ）、塩化マンガン（２．５ｍＭ）、ジチオスレイトール（５ｍＭ）、塩化カリウム（１２５ｍＭ）、ＵＴＰ注３）（４．９μＭ、含１μＣｉ３Ｈ−ＵＴＰ）を含有する緩衝液（１０．６μｌ）と水（３９．４μｌ）の混合液（５０μｌ）を添加混和し、２５℃で６０分間 酵素反応を行った。
▲５▼ 酵素反応が６０分経過した時、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液（５０ｍＭ、５０μｌ）を添加混合し、酵素反応を停止した。
▲６▼ 次にセルハーベスターを使用して、ジエチルアミノエチル基を導入したフィルター（以下、ＤＥＡＥ−フィルターマットと略す）上に▲５▼のサンプル全量を移した後、リン酸ナトリウム緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ７．０）で１０秒間のすすぎ洗いを２回と脱イオン水で１０秒間のすすぎ洗いを１回行った。
▲７▼ すすぎ終えたＤＥＡＥ−フィルターマットを９５℃で１５分間乾燥し、液体シンチレータ（１０ｍｌ）と共にサンプルバッグに入れ密封した。
▲８▼ シンチレーションカウンターで放射活性を計測した。
▲９▼ 放射活性計測値（単位；ｃｐｍ）を以下の計算式に代入して阻害率を求めた。
阻害率＝１００−（被験物質存在下の計測値−酵素非存在下の計測値）
／（被験物質非存在下の計測値−酵素非存在下の計測値）×１００
注１） ▲１▼〜▲５▼の実験材料に使用している水は全てジエチルピロカーボネートでＲＮＡ分解酵素の失活処理をしている。ジエチルピロカーボネートによる処理は、ジエチルピロカーボネート（０．１ｇ）を脱イオン水（１００ｍｌ）に溶解後３７℃で２４時間放置し、その後１２０℃で３０分間オートクレーブにかけて行った。
注２） 核酸構成が５’−ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＵＡＵ ＡＵＡ ＵＡＵ−３’で構成された単鎖のオリゴヌクレオチド。テンプレートとして使用した。５’末端のＧＧは、核酸合成反応を停止させるために配列に付加した。
注３） ウリジン三リン酸。基質として使用した。
以下に、被検物質として、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物（Ｉ−１）、３’−ｄＵＴＰを使用した場合の、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の阻害率を示す。なお、使用した被検物質の濃度は、以下の通りである。
化合物Ａ：２０μｇ／ｍｌ 化合物Ｂ：２０μｇ／ｍｌ
化合物Ｃ：０．０３２μｇ／ｍｌ ３’−ｄＵＴＰ：０．０８μＭ
本発明アッセイ法の操作上の大きな特徴であるプレインキュベーションが酵素活性に及ぼす影響を調べた。なお、文中、ＲｄＲｐ酵素またはＨＣＶ ＲｄＲｐ酵素は、ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素を意味する。
緩衝液Ｉ、オリゴＲＮＡ、リコンビナントＲｄＲｐ酵素の混合液を２５℃でプレインキュベーションする時間を０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分に設定し、酵素反応条件は一律２５℃、３０分で実施した（図１）。また、被験物質の代わりには溶媒のＤＭＳＯを使用した。
この時の基質の反応産物への取り込み量を酵素活性とし比較したところ、プレインキュベーション時間が長いほど酵素活性は上昇を示し、プレインキュベーション９０分以上では酵素活性はほぼ頭打ち状態となった。酵素活性の上昇は、プレインキュベーションなし（０分）と比較して最高で８．５倍高い酵素活性を示した。
以上の結果から、酵素反応前に緩衝液Ｉ、オリゴＲＮＡ、リコンビナントＲｄＲｐ酵素をプレインキュベーションすることは、酵素活性の上昇を誘導することが判明した。
試験例２
次にプレインキュベーションが酵素の熱安定性に及ぼす影響を調べた。
酵素反応温度を２５℃と３７℃に設定し、プレインキュベーションの有無でＨＣＶ ＲｄＲｐの酵素活性の経時的変化を測定した（図２）。従来法（プレインキュベーションなし）では、酵素反応１２０分以降で３７℃での酵素反応速度が停止している。一方、プレインキュベーション法では、酵素反応６０分以降で３７℃での酵素反応速度の低下傾向は示すものの酵素反応量の増加を認め、且つ酵素反応３０分から１８０分において酵素反応量は２５℃での酵素反応と比較して２．６倍から３．０倍の高値を示した。
以上の結果から、緩衝液Ｉ、オリゴＲＮＡ、リコンビナントＲｄＲｐ酵素のプレインキュベーション処理は、酵素反応におけるＲｄＲｐの熱安定性を高めることが判明した。生体内でのＨＣＶの増殖を考える時、３７℃前後でのＲｄＲｐ酵素の安定性は必須である。このことから、プレインキュベーション処理後のＲｄＲｐの形態は、生体内のＨＣＶ ＲｄＲｐの形態に近い可能性がある。
試験例３
ＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素阻害剤のスクリーニングにおいて本発明アッセイ法が従来法と大きく異なる点として、阻害活性の乖離が挙げられる。プレインキュベーション処理を行うことにより、化合物Ａ、化合物Ｂは阻害活性の大幅な低下を示したが、化合物Ｃ、３’−ｄＵＴＰはプレインキュベーション処理を行っても阻害活性の低下は認められなかった（表１、表２）。
以上の結果から、緩衝液Ｉ、ｐｏｌｙ（Ａ）、ｏｌｉｇｏ（Ｕ）、リコンビナントＲｄＲｐ酵素のプレインキュベーション処理は、化合物の種類によってＲｄＲｐ阻害活性に大きな変動をもたらすことが判明した。
参考試験例
従来法とプレインキュベーション アッセイ法の比較を行うために、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーの代りに、テンプレートとしてｐｏｌｙ（Ａ）、プライマーとしてｏｌｉｇｏ（Ｕ）１２を使用し、化学構造の異なる数万個の化合物を被検物質として、ランダムスクリーニングを行った。
まず、化合物を１０検体ずつ混合し、混合物である被検物質の濃度を０．８３μｇ／ｍｌとして、従来法（但し、テンプレートとしてｐｏｌｙ（Ａ）、プライマーとしてｏｌｉｇｏ（Ｕ）１２を使用）に準じて、酵素阻害率を求めた。結果を図３に示す。
一方、数万個の化合物を被検物質として、化合物を５検体ずつ混合し、混合物である被検物質の濃度を４９μｇ／ｍｌとして、上記実施例１に記載されている本発明であるプレインキュベーションアッセイ法（但し、テンプレートとしてｐｏｌｙ（Ａ）、プライマーとしてｏｌｉｇｏ（Ｕ）１２を使用）に準じて、酵素阻害率を求めた。結果を図４に示す。
産業上の利用可能性
プレインキュベーションアッセイ法により、▲１▼酵素活性の上昇、▲２▼熱安定性の上昇、▲３▼ノイズの軽減を図ることができることを見出した。
【図面の簡単な説明】
図１：３０分間酵素反応を行った場合の、プレインキュベーション時間とＨＣＶＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素の酵素活性との関係を示す図である。図中、●はテンプレートとして３’末端でヘアピンループを形成するオリゴＲＮＡ、を使用した場合を表す。
図２：プレインキュベーションの有無と酵素反応温度の関係を示す図である。図中、▲はプレインキュベーション後３７℃で酵素反応を行った場合、●はプレインキュベーション後２５℃で酵素反応を行った場合、△はプレインキュベーションを行わず３７℃で酵素反応を行った場合、○はプレインキュベーションを行わず２５℃で酵素反応を行った場合のＨＣＶ ＲＮＡ依存型ＲＮＡ合成酵素反応におけるＵＭＰの反応産物への取り込みと酵素反応時間の関係を示している。
図３：従来法（テンプレート及びプライマー使用）でランダムスクリーニングを行った結果を示す図である。
図４：プレインキュベーション法（テンプレート及びプライマー使用）でランダムスクリーニングを行った結果を示す図である。Technical field
The present invention relates to a method for assaying a nucleic acid synthase activator or inhibitor, and more particularly, to a method for assaying a nucleic acid synthase activator or inhibitor using a single-stranded nucleic acid oligomer.
Background art
Nucleic acid synthase activators or inhibitors are assayed for appropriate conditions (for example, buffer conditions, reaction temperature, etc.) under which the enzyme reaction proceeds, and for nucleic acid synthase, nucleic acid synthase substrate, and other enzyme reactions. Necessary substances (for example, metal ions) are mixed with the test substance, the enzyme reaction is allowed to proceed, and after the reaction is completed, the enzyme activity measured or calculated by some means is defined as the enzyme activity in the absence of the test substance. This is achieved by comparing.
For example, a nucleic acid synthase, a labeled substrate, a template, a primer, a metal ion, and a test substance are mixed simultaneously or sequentially to advance the nucleic acid synthase reaction. The labeled substrate is incorporated into the reaction product (incorporation). After completion of the reaction, this is achieved by measuring the amount of labeled substrate incorporated into the reaction product and comparing the enzyme activity calculated thereby with the enzyme activity in the absence of the test substance.
However, even if it is found as a result of such an assay that the test substance has an activation action or an inhibition action of a nucleic acid synthase, the test substance is based on the structure and characteristics of the test substance. In some cases, it acts or binds non-specifically to the synthase, indicating false positives. Therefore, if the assay results show positive data, it is necessary to confirm that the assay is a true nucleic acid synthase activator or inhibitor in yet another assay method. It requires complex steps and may not be suitable for primary assays.
In recent years, high-throughput screening (hereinafter referred to as HTS) occupies an important position in the initial stage of drug development. HTS can assay hundreds to tens of thousands of compounds at a time, but how to analyze enormous data is a big problem.
On the other hand, Non-Patent
In addition, regarding a HCV RNA-dependent RNA synthetase, when a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end can be its own primer is used as a template, the enzyme reaction proceeds in the absence of the primer. Is disclosed. However, no preincubation is disclosed.
Patent Document 1: International Publication No. 96/37619
Non-Patent Document 1: Journal of General Virology (2000), 81, 759-767
Non-Patent Document 2: Journal of virology, 2000, 9134-9143
Disclosure of the invention
It is important how to obtain useful information from the data obtained as a result of HTS, that is, how to eliminate noise (false positives), and development of an assay method with less noise of activator or inhibitor of nucleic acid synthase. It has been demanded.
The present inventor has pre-incubation assay, that is, a single-stranded nucleic acid whose nucleic acid synthase, 3 ′ end portion can function as its own primer in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase. It was found that by incubating a solution containing oligomers and metal ions, followed by assaying for activators or inhibitors of nucleic acid synthase, the noise was reduced from the data obtained as a result of the assay.
That is, the present invention
(1) Incubating a solution containing a nucleic acid synthesizing enzyme and a single-stranded nucleic acid oligomer capable of functioning as its own primer and a metal ion in the absence of a test substance and a nucleic acid synthase substrate A method of assaying an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase, comprising the step of:
About.
More specifically, it relates to the following (2) to (17).
(2) The following steps:
(A) Incubating a solution containing a nucleic acid synthesizing enzyme and a single-stranded nucleic acid oligomer capable of functioning as its own primer and a metal ion in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase The process of
(B) The incubated solution is mixed with the test substance and the substrate of the nucleic acid synthase, the nucleic acid synthase is contacted with the test substance and the substrate of the nucleic acid synthase, and the reaction product of the substrate of the nucleic acid synthase Measuring the uptake into
(C) mixing the incubated solution with the nucleic acid synthase substrate, contacting the nucleic acid synthase with the nucleic acid synthase substrate in the absence of a test substance, Measuring uptake into reaction products,
(D) comparing each incorporation of the nucleic acid synthase substrate into the reaction product measured in the steps (b) and (c);
The assay method according to (1) above, which comprises:
(3) The assay method according to (1) or (2) above, which is an assay method for inhibitors of viral nucleic acid synthase,
(4) The assay method according to (3) above, wherein the viral nucleic acid synthase is a viral RNA-dependent RNA synthase,
(5) The assay method according to (3) above, wherein the viral RNA-dependent RNA synthetase is an HCV RNA-dependent RNA synthetase,
(6) The assay method according to (4) or (5) above, wherein the single-stranded nucleic acid oligomer has a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion,
(7) The assay method according to the above (6), wherein the single-stranded nucleic acid oligomer has a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion of poly (A),
(8) The substrate is 3 H-UTP or 32 The assay method according to (7) above, which is P-UTP,
(9) The metal ion is Mg 2+ Or Mn 2+ The assay method according to any one of the above (1) to (8),
(10) The assay method according to any one of (1) to (9) above, wherein the incubation is performed for 0.5 hour or more,
(11) The assay method according to any one of (1) to (10) above, wherein the incubation is performed at 20 ° C to 40 ° C.
(12) A method for inhibiting viral nucleic acid synthase by bringing a substance obtained by the assay method described in (3) above into contact with viral nucleic acid synthase,
(13) A method for inhibiting viral replication by contacting a virus with a substance obtained by the assay method described in (3) above,
(14) The method according to (12) or (13) above, wherein the virus belongs to the Flaviviridae family,
(15) The method according to (12) or (13) above, wherein the virus is HCV,
(16) An activator or inhibitor of a nucleic acid synthase obtained by the assay method according to any one of (1) to (11) above,
(17) A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase obtained by the assay method according to any one of (1) to (11) above,
About.
The present invention is described in detail below.
The present invention is a technique relating to an assay for an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase. In this specification, an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase is an assay for evaluating a test substance that is not known to be an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase, that is, a primary assay. And an assay for evaluating a test substance already known to be an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase, that is, a reevaluation assay. The assays of the invention can be used for all these assays. For example, it can be used to identify a substance that activates or inhibits a nucleic acid synthase. In particular, it can be used for identification of substances that inhibit nucleic acid synthase, for example, identification of substances that inhibit viral nucleic acid synthase, identification of substances that inhibit RNA-dependent RNA synthase, HCV RNA-dependent RNA It can be used for identification of substances that inhibit synthases.
The present invention is characterized in that, in the assay of an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase, incubation is performed before the enzyme reaction is initiated. That is, in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase, a solution containing a nucleic acid synthase, a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end portion can function as its own primer, and a metal ion is incubated. It is characterized by that. In this specification, this incubation is also expressed as pre-incubation. Specifically, in the absence of the test substance and the nucleic acid synthase substrate, the temperature at which the preincubation effect appears, the time at which the preincubation effect appears, the nucleic acid synthase, and the 3 ′ end can serve as its own primer. It means to incubate a solution containing strand nucleic acid oligomers and metal ions.
The incubation temperature, that is, the temperature at which the pre-incubation effect appears is specifically about 15 ° C. to about 50 ° C., particularly 20 ° C. to 40 ° C., more preferably 20 to 30 ° C. preferable.
The incubation time, that is, the time at which the pre-incubation effect appears is preferably about 15 minutes or more, particularly 0.5 hour or more, more preferably 1 hour or more, and about 15 minutes to 12 hours, 0.5 to 3 It is preferred to incubate for a time, in particular 1-2 hours.
By incubating a solution containing a single-stranded nucleic acid oligomer and a metal ion whose nucleic acid synthesizing enzyme, 3 ′ end portion can function as its own primer, in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase It is considered that a state in which the enzyme reaction easily proceeds is formed.
The phrase “in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase” means that incubation is performed under conditions that do not include the test substance and the substrate for nucleic acid synthase. For example, what is essential for an enzymatic reaction other than the substrate of the nucleic acid synthase (for example, a metal ion) may be incubated with the enzyme.
"Nucleic acid synthase, solution containing a single-stranded nucleic acid oligomer and metal ion whose 3 'end part can function as its own primer" means that a nucleic acid synthase, 3' end part functions as its own primer Examples include a solution containing at least a single-stranded nucleic acid oligomer and a metal ion that may contain a substance other than a test substance and a nucleic acid synthase substrate. For example, high molecular compounds, low molecular compounds, metal ions, halogen ions, amino acids, polypeptides, nucleic acids, polynucleotides and the like may be included.
The assay of the present invention is an assay for an activator or inhibitor of a nucleic acid synthase, and an assay for a nucleic acid extension synthesis reaction using a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end portion can function as its own primer. It is.
“Single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end portion can function as its own primer” means a single-stranded template DNA or RNA whose 3 ′ end portion can function as its own primer . That is, it means a single-stranded nucleic acid oligomer in which the 3 ′ end portion can hybridize with its own complementary portion to form a loop structure. In the case of a single-stranded nucleic acid oligomer in which the 3 ′ end portion functions as its own primer in the enzyme reaction, it does not form a loop in the solution but forms a loop even if it exists as a single strand. Also good. Preferably, it is a single-stranded nucleic acid oligomer that does not form a loop in a solution and exists as a single strand. For example, the complementary bond of the hybridizing portion is preferably a hydrogen bond of A and U or a hydrogen bond of dA and dT rather than a hydrogen bond of G and C or a hydrogen bond of dG and dC. For example, those having a AU repetitive sequence at the 3 ′ end are preferred.
Examples of single-stranded nucleic acid oligomers include the following.
A single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end,
Poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC), poly (A), poly (U), poly (G), poly (G), self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion of poly (C) A single-stranded nucleic acid oligomer having
poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC) and other homopolymers (for example, synthesized nucleic acid polymers) at the 3 ′ terminal portion, oligo (dT), oligo (dA), single-stranded DNA oligomer to which oligo (dC), oligo (dG), etc. are added (for example, in the case of DNA-dependent DNA synthase),
Poly (A), poly (U), poly (G), poly (C) and the like at the 3 ′ end portion of the homopolymer, oligo (U), oligo (A), oligo (C), oligo (G), respectively. A single-stranded RNA oligomer to which is added (for example, in the case of RNA-dependent RNA synthetase),
Poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC) and other homopolymers (for example, synthesized nucleic acid polymers) have 3 ′ terminal portions, respectively, oligo (U), oligo (A), single-stranded nucleic acid oligomer to which oligo (C), oligo (G) and the like are added (for example, in the case of DNA-dependent RNA synthetase),
Poly (A), poly (U), poly (G), poly (C) and other homopolymers at the 3 ′ terminal portion are oligo (dT), oligo (dA), oligo (dC), and oligo (dG), respectively. A single-stranded nucleic acid oligomer to which is added (for example, in the case of RNA-dependent DNA synthase),
A single-stranded DNA oligomer (for example, DNA) in which a repeating sequence of dAdT or dCdG is added to the 3 ′ terminal portion of a homopolymer such as poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC) Dependent DNA synthase)
Single-stranded RNA oligomer (for example, RNA) in which a repeating sequence of AU or CG is added to the 3 ′ end portion of a homopolymer such as poly (A), poly (U), poly (G), poly (C) Dependent RNA synthase)
Single-stranded nucleic acid oligomer (for example, DNA) in which a AU or CG repetitive sequence is added to the 3 ′ end portion of a homopolymer such as poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC) Dependent RNA synthase)
Single-stranded nucleic acid oligomer (for example, RNA) in which a repeating sequence of dAdT or dCdG is added to the 3 ′ end portion of a homopolymer such as poly (A), poly (U), poly (G), poly (C) Dependent DNA synthase)
A single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion of a heteropolymer mixed with various bases (for example, a naturally occurring nucleic acid polymer, a synthesized nucleic acid polymer, etc.),
A single-stranded structure in which a dAdT, dCdG, AU, or CG repeat sequence is added to the 3 ′ end portion of a heteropolymer in which various bases are mixed (for example, a naturally-occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer). Nucleic acid oligomer.
Here, the self-complementary nucleic acid sequence means a sequence in which the 3 ′ terminal portion forms a loop structure (for example, a hairpin loop) and can hybridize with the self-complementary portion.
In addition, other nucleic acid may be added to the 5 ′ end portion of the homopolymer. For example, when a viral RNA-dependent RNA synthetase is used, the single-stranded nucleic acid oligomer preferably has an AU repeat sequence at the 3 ′ end portion. In particular, the poly (A) having a AU repeating sequence at the 3 ′ end portion is preferable.
The length of the single-stranded nucleic acid oligomer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the type of nucleic acid synthase. For example, a single-stranded nucleic acid oligomer having a length of about 8 bases to about 1000 bases, about 50 bases to about 800 bases, or about 100 bases to about 500 bases can be used.
In the single-stranded nucleic acid oligomer, the number of base pairs that hybridize with a complementary portion of itself is 2 or more, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5.
Examples of metal ions include Mg 2+ , Mn 2+ , Na + , K + Etc. In nucleic acid synthase, in general, Mg 2+ Is essential.
The test substance means a substance used in the assay, and includes not only low molecular weight compounds but also proteins such as polypeptides.
The enzymatic reaction is initiated after the preincubation by adding a nucleic acid synthase substrate to a solution containing the nucleic acid synthase.
In the conventional method (The EMBO Journal vol. 15, no. 1, pp 12-22, 1996), it is necessary to carry out the enzyme reaction at about 22 ° C., and if it is performed at a temperature higher than that, the nucleic acid synthase is inactivated. When performed at the following temperatures, the function of the nucleic acid synthase becomes dull.
In the preincubation assay, unlike the conventional method, the nucleic acid synthase reaction can be performed at about 10 ° C to about 40 ° C. In particular, it can be carried out at about 20 ° C to about 40 ° C. Therefore, in assays using nucleic acid synthase existing in humans or nucleic acid synthase of viruses that infect humans, it can be performed at the same temperature as human body temperature (particularly 37 ° C.) and is very useful. . In addition, by carrying out at such a temperature, the enzyme activity increases, and as a result, the detection sensitivity of the assay increases.
The effect of the test substance on the enzymatic reaction of the nucleic acid synthase may be measured by comparing the incorporation of the nucleic acid synthase substrate into the reaction product. That is, 1) a solution containing a single-stranded nucleic acid oligomer and a metal ion whose 3 ′ terminal portion can function as its own primer in the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase Incubate, 2) Mix the incubated solution with the test substance and nucleic acid synthase substrate, contact the nucleic acid synthase with the test substance and nucleic acid synthase substrate, and convert the nucleic acid synthase substrate to the reaction product. Incorporation was measured, and 3) the incubated solution and the nucleic acid synthase substrate were mixed, and in the absence of the test substance, the nucleic acid synthase and the nucleic acid synthase substrate were contacted to react with the nucleic acid synthase substrate. Confirmation by measuring incorporation into the product and comparing each incorporation into the reaction product of the substrate of the nucleic acid synthase obtained in steps 4) 2) and 3) Can. It should be noted that either the (test substance) and the nucleic acid synthase substrate may be added to the incubated solution, or the incubated solution may be added to the (test substance) and nucleic acid synthase substrate. That is, the nucleic acid synthase substrate may be in contact with the nucleic acid synthase substrate.
Further, “mixing a nucleic acid synthase substrate and in the absence of a test substance” means that the test substance is not mixed. Unless the test substance is contained, a substance other than the nucleic acid synthase substrate is used. Things may be included. For example, a reaction solution for dissolving or suspending a nucleic acid synthase substrate may be included. In other words, any data may be used as long as it is for creating data to be compared with data in the presence of the test substance. A solution containing a nucleic acid synthase that has not been pre-incubated is mixed with a nucleic acid synthase substrate, and the nucleic acid synthase is contacted with the nucleic acid synthase substrate in the absence of the test substance. Incorporation of the substrate into the reaction product can also be used as a comparison target. The reaction product of the substrate of the nucleic acid synthase when the preincubated solution and the substrate of the nucleic acid synthase are mixed and the nucleic acid synthase and the substrate of the nucleic acid synthase are brought into contact in the absence of the test substance. It is preferable to take up The data used as the comparison target may be performed simultaneously with the assay using the test substance or may be performed separately.
The incorporation of a nucleic acid synthase substrate into the reaction product can be measured by using a labeled nucleic acid synthase substrate. For example, the amount of the labeled nucleic acid synthase substrate incorporated into the reaction product may be measured. As a labeled nucleic acid synthase substrate, a radiolabeled nucleic acid synthase substrate or the like may be used. In that case, the radioactivity may be measured with a scintillation counter or the like. The labeled nucleic acid synthase substrate and the like may be separated from the reaction solution using a commercially available filter or the like (for example, a filter having a diethylaminoethyl group introduced). Further, it can be applied to a SPA (Scintillation proximity assay) method.
The low molecular compound means an organic compound having a molecular weight of 15 to 1000, and the constituent atoms include hydrogen, lithium, boron, carbon, nitrogen, oxygen, fluorine, sodium, magnesium, manganese, aluminum, sulfur, chlorine, potassium, Examples include calcium, iron, barium, bromine, and iodine.
Polypeptides include not only naturally occurring peptides but also structurally modified peptides (eg, peptide isosteres).
Examples of the enzyme substrate of the nucleic acid synthase include dATP, dTTP, dGTP, dCTP, ATP, UTP, GTP, and CTP. Particularly, a labeled one is preferable, and as a substrate of the labeled nucleic acid synthase, for example, 3 H-dATP, 3 H-dTTP, 3 H-dGTP, 3 H-dCTP, 3 H-ATP, 3 H-UTP, 3 H-GTP, 3 H-CTP, 32 P-dATP, 32 P-dTTP, 32 P-dGTP, 32 P-dCTP, 32 P-ATP, 32 P-UTP, 32 P-GTP, 32 P-CTP etc. are mentioned. These substrates may be selected according to the single-stranded nucleic acid oligomer used in the assay.
For example, poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC), poly (A), poly (U), poly (G) modified at the 3 ′ end as a single-stranded nucleic acid oligomer ), Poly (C), dTTP, dATP, dCTP, dGTP, UTP, ATP, CTP, and GTP may be used as substrates, respectively.
In addition, as a single-stranded nucleic acid oligomer, one having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion of a heteropolymer mixed with various bases (for example, a naturally occurring nucleic acid polymer, a synthesized nucleic acid polymer, etc.) When a strand nucleic acid oligomer is used, a mixture of dTTP, dATP, dCTP and dGTP, or a mixture of UTP, ATP, CTP and GTP may be used as a substrate. In this case, all the substrates may be labeled, or any of them may be labeled.
For example, when a single-stranded nucleic acid oligomer having a AU repeat sequence at the 3 ′ end of poly (A) is used as the substrate 3 H-UTP or 32 P-UTP can be used.
“Nucleic acid synthase” means a polynucleotide chain synthase, for example, DNA synthase (eg, DNA-dependent DNA synthase, RNA-dependent DNA synthase), RNA synthase (eg, DNA-dependent RNA) Synthetic enzymes, RNA-dependent RNA synthetases, etc.). In the present invention, not only a full-length nucleic acid synthase but also a deletion, substitution or addition of a nucleic acid synthase having an enzyme activity can be used. For example, a recombinant nucleic acid synthase can be used. Moreover, you may use the precursor of the enzyme which becomes an enzyme in a reaction liquid.
As the nucleic acid synthase, viral RNA-dependent RNA synthase is preferable, and HCV RNA-dependent RNA synthase is more preferable.
The virus is not particularly limited, and examples thereof include HIV (human immunodeficiency virus), HCV (hepatitis C virus), HBV (hepatitis B virus), HTLV (human T cell leukemia virus), influenza virus and the like. In particular, viruses belonging to the genus Flavivirus are preferable, and HCV is more preferable.
Examples of viral enzymes include HIV reverse transcriptase (including RNA-dependent DNA synthase, including RNase H activity), HCV RNA-dependent RNA synthase, and HBV DNA synthase (DNA-dependent DNA). Synthetic enzyme activity, RNA-dependent DNA synthetase activity, and / or RNaseH activity), HTLV reverse transcriptase, influenza virus RNA-dependent RNA synthetase, and the like.
The present invention can be used in any nucleic acid synthase. Among the nucleic acid synthetases, RNA-dependent RNA synthetases (for example, viral RNA-dependent RNA synthetases) are preferable, and RNA-dependent RNA synthetases of viruses belonging to the Flaviviridae family are particularly preferable. Furthermore, HCV RNA-dependent RNA synthetase is preferable.
Examples of viruses having RNA-dependent RNA synthetase include Picoraviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Coronaviridae Viridae such as Viridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, etc. In particular, Flaviviridae virus is preferable, and HCV is more preferable.
Viruses belonging to the Flaviviridae family include hepatitis C virus, yellow fever virus, dengue virus, Japan encephalitis virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus, West Nile fever virus. examples include fevers virus, St. Louis encephalitis virus, Rocio virus, Murray Valley encephalitis virus, and the like. These viruses have RNA-dependent RNA synthetase. These viruses are also associated with diseases of mammals including humans, and it is useful to find inhibitors of RNA-dependent RNA synthetase of these viruses.
The nucleic acid synthase includes not only a nucleic acid synthase having a single enzyme activity but also a nucleic acid synthase having a plurality of enzyme activities. For example, examples of the nucleic acid synthase having a plurality of enzyme activities include HBV DNA synthase (having DNA-dependent DNA synthase activity, RNA-dependent DNA synthase activity, and / or RNase H activity).
Further, HIV reverse transcriptase (having RNA-dependent DNA synthase inhibitory activity and RNase H activity) may be used in the assay of the present invention only for the portion having the respective enzyme activity, or both enzyme activities. A moiety having a may be used in an assay of the invention.
Although there are many HCV genotypes (Genotype), in the present invention, HCV enzymes having any of these genotypes can be used. Genotype 1a, genotype 1b, genotype 1c, genotype 2a, genotype 2b, genotype 2a, genotype 3a, genotype 3b, genotype 3b, genotype 3b, genotype 3b
The RNA-dependent RNA synthetase of HCV is encoded by NS5B (Nonstructural Protein 5B) region of HCV, and any enzyme having RNA-dependent RNA synthetase activity is used in the present invention. can do. For example, the above genotypes (for example, genotype 1a, genotype 1b, genotype 1c, genotype 2a, genotype 2b, genotype 2a, genotype 3a, genotype 3a, genotype 3a, genotype 3a, genotype 3a, The nucleic acid synthetase etc. which have the RNA-dependent RNA synthetase activity currently used can be used.
An activator means a substance that activates an enzymatic reaction. The activator of a nucleic acid synthase can be used for the treatment of a disease caused by a decrease in the expression level or function of a nucleic acid synthase and is useful. Further, when nucleic acid elongation is performed using a nucleic acid synthase, it can be used as a reagent for efficiently performing an enzyme reaction.
Moreover, an inhibitor means the substance which inhibits an enzyme reaction. In particular, inhibitors of viral nucleic acid synthase can be used for the treatment of diseases caused by viruses and are useful. Examples of inhibitors include IC 50 A substance having a value of 100 μM or less, particularly 10 μM or less, and more preferably 1 μM or less is preferred.
The present invention relates to preincubation assays, but is particularly useful in assays for a vast number of compounds, particularly high throughput screening (HTS). By carrying out the present invention, noise (false positives) can be reduced, and lead compounds can be effectively selected.
That is, the nucleic acid synthase can be activated or inhibited by contacting the substance obtained by the assay method of the present invention with the nucleic acid synthase. When the nucleic acid synthase is a viral nucleic acid synthase, viral replication can be activated or inhibited by contacting the virus with a substance obtained by the assay method of the present invention.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The “preincubation assay method using a single-stranded nucleic acid oligomer” according to the present invention will be described below while comparing with a conventional method. The nucleic acid synthase will be described using HCV RNA-dependent RNA synthase, but is not particularly limited to this enzyme. The present invention can be carried out regardless of the type of nucleic acid synthase. Particularly preferred are RNA synthetases, further RNA-dependent RNA synthetases, and further HCV RNA-dependent RNA synthetases.
Conventional method
HCV RNA-dependent RNA synthetase, oligo RNA as a template (oligo RNA means a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end), RNA triphosphate as a substrate, Mg Ion (Mg 2+ ), Mn ion (Mn 2+ ), Test substances are mixed together, the enzyme reaction is started, and the incorporation of the substrate into the reaction product is measured. By comparing with the value in the absence of the test substance, it can be known whether the test substance activates or inhibits the HCV RNA-dependent RNA synthase.
Preincubation assay
HCV RNA-dependent RNA synthetase, oligo RNA as a template (oligo RNA means a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end), Mg ion (Mg 2+ ), Mn ion (Mn 2+ ) Is pre-incubated at about 25 ° C. for about 1 to 2 hours, RNA triphosphate as a substrate and a test substance are added, the enzyme reaction is started, and the incorporation of the substrate into the reaction product is measured. is there. As in the conventional method, the inhibitor percentage can be selected by comparing the value in the absence of the test substance and calculating the inhibition percentage. The specific procedure may be referred to Example 1 described later.
The “preincubation assay method using a single-stranded nucleic acid oligomer” of the present invention is superior to the conventional method in the following points.
(1) Increase in enzyme activity
The preincubation time and enzyme activity were compared. A specific procedure is described in Test Example 1. The enzyme activity was determined by measuring the incorporation of uridine monophosphate (UMP) into the reaction product. The results are shown in FIG. It can be seen that the enzyme activity gradually increases until the preincubation time is about 90 minutes, and the difference in enzyme activity from the conventional method gradually increases. In addition, it can be seen that the preincubation of about 90 minutes shows about 8 times the enzyme activity as compared with the conventional method. This facilitates detection of the measurement result, reduces the error in the inhibition rate, and can be said to be useful in screening for inhibitors. It can be seen that when the preincubation time is further increased, the enzyme activity is almost the same as when preincubated for about 90 minutes.
(2) Increase in thermal stability
The relationship between the presence or absence of preincubation and the enzyme reaction temperature was examined, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, in the conventional method, when the enzyme reaction is performed at about 37 ° C., the enzyme is deactivated when the reaction time is 2 hours or longer, and an accurate enzyme activity value cannot be measured. On the other hand, in the preincubation method, the enzyme reaction proceeds well even at about 37 ° C., and the assay can be performed under conditions closer to the in-vivo temperature. It can also be seen that the enzyme activity is higher when the enzyme reaction is carried out at about 37 ° C than when the enzyme reaction is carried out at about 25 ° C. Therefore, in the preincubation assay method, it is possible to assay at a temperature close to the biological temperature of about 37 ° C.
(3) Reduction of false positives (noise)
Preincubation assays can reduce assay noise. Below, it demonstrates using Table 1 and Table 2. FIG.
In Tables 1 and 2, 3′-deoxyuridine triphosphate (3′-dUTP) is used as a competitive inhibitor. 3′-dUTP is a compound capable of inhibiting the enzymatic reaction of HCV RNA-dependent RNA synthase by competing with a substrate in a nucleic acid synthesis reaction and incorporated into a reaction product to stop RNA chain elongation. Compounds A and B are compounds determined as positive by the conventional method. That is, these compounds inhibit HCV RNA-dependent RNA synthetase by about 60% to 80% at a concentration of 20 μ / ml in the conventional method without preincubation. However, according to the preincubation assay, their inhibition rate is reduced to about 20-30%. On the other hand, Compound C (0.032 μg / ml), 3′-dUTP (0.08 μM) does not show a decrease in the inhibitory effect in the preincubation assay. The structures of Compound A, Compound B, and Compound C are shown below.
Preparation method of HCV RNA-dependent RNA synthetase
A cDNA clone of HCV RNA-dependent RNA synthetase was prepared from the plasma of an HCV-infected person, and HCV RNA-dependent RNA synthetase was expressed using insect cells or E. coli based on this. The HCV RNA-dependent RNA synthetase in the cell extract was purified using anion exchange chromatography, heparin affinity chromatography, poly U affinity chromatography, cation exchange chromatography, gel filtration chromatography and the like. The purification was performed at a low temperature of about 4 ° C., and Tris buffer (pH 7.5) containing ethylenediaminetetraacetic acid (1 mM), dithiothreitol (10 mM), and glycerol (20%) was used as the enzyme solution. The purified enzyme was stored at 4 ° C. or −20 ° C. until used in the assay.
Example 1
HCV RNA-dependent RNA synthase preincubation assay
(1) Buffer I containing Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) and magnesium chloride (25 mM), manganese chloride (2.5 mM), dithiothreitol (5 mM), potassium chloride (125 mM) Note 1) (10.5 μl) is placed in a polypropylene container, and then oligo RNA Note 2) Aqueous solution (100 μg / ml, 10.5 μl) and water (18.5 μl) were added and gently mixed.
(2) Next, an HCV RNA-dependent RNA synthetase solution (10.5 μl) was added, and preincubation was performed at 25 ° C. for 60 minutes.
(3) The pre-incubated solution (50 μl) of (2) was added to a 96-well microtiter plate into which a test substance dissolved in dimethyl sulfoxide or water (5.26 μl per well) had been dispensed.
(4) Further, Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) and magnesium chloride (25 mM), manganese chloride (2.5 mM), dithiothreitol (5 mM), potassium chloride (125 mM), UTP Note 3) (1 μM, including 4.9 μCi 3 A mixed solution (50 μl) of buffer II (10.6 μl) containing H-UTP) and water (39.4 μl) was added and mixed, and an enzyme reaction was performed at 25 ° C. for 60 minutes.
(5) When 60 minutes of the enzyme reaction passed, an aqueous solution of disodium ethylenediaminetetraacetate (50 mM, 50 μl) was added and mixed to stop the enzyme reaction.
(6) Next, using a cell harvester, the whole amount of the sample (5) was transferred onto a filter (hereinafter abbreviated as DEAE-filter mat) into which a diethylaminoethyl group was introduced, and then sodium phosphate buffer (0. 25M, pH 7.0) twice for 10 seconds and once for 10 seconds with deionized water.
(7) The rinsed DEAE-filter mat was dried at 95 ° C. for 15 minutes, sealed in a sample bag together with a liquid scintillator (10 ml).
(8) Radioactivity was measured with a scintillation counter.
(9) The inhibition rate was determined by substituting the measured radioactivity (unit: cpm) into the following formula.
Inhibition rate = 100− (measured value in the presence of test substance−measured value in the absence of enzyme)
/ (Measured value in the absence of test substance−Measured value in the absence of enzyme) × 100
Note 1) All the water used in the experimental materials (1) to (5) has been subjected to inactivation treatment of RNase with diethyl pyrocarbonate. The treatment with diethyl pyrocarbonate was carried out by dissolving diethyl pyrocarbonate (0.1 g) in deionized water (100 ml), leaving it at 37 ° C. for 24 hours, and then autoclaving at 120 ° C. for 30 minutes.
Note 2) A single-stranded oligonucleotide having a nucleic acid composition of 5′-GGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA UAU AUA UAU-3 ′. Used as a template. A GG at the 5 ′ end was added to the sequence to stop the nucleic acid synthesis reaction.
Note 3) Uridine triphosphate. Used as substrate.
The inhibition rate of HCV RNA-dependent RNA synthetase when Compound A, Compound B, Compound C, 3′-dUTP is used as the test substance is shown below. The concentration of the test substance used is as follows.
Compound A: 20 μg / ml Compound B: 20 μg / ml
Compound C: 0.032 μg /
HCV RNA-dependent RNA synthetase assay Conventional method
(1) Buffer containing tris-HCl (100 mM, pH 7.5) and magnesium chloride (25 mM), manganese chloride (2.5 mM), dithiothreitol (5 mM), potassium chloride (125 mM) Note 1) (10.5 μl) is placed in a polypropylene container, and then oligo RNA Note 2) An aqueous solution (100 μg / ml, 10.5 μl) and water (18.5 μl) were added, mixed gently, and then ice-cooled.
(2) Next, ice-cooled HCV RNA-dependent RNA synthetase solution (10.5 μl) was added and mixed.
(3) The ice-cooled mixed solution (50 μl) of (2) was added to a 96-well microtiter plate into which a test substance (5.26 μl per well) dissolved in dimethyl sulfoxide or water was dispensed.
(4) Next, Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) and magnesium chloride (25 mM), manganese chloride (2.5 mM), dithiothreitol (5 mM), potassium chloride (125 mM), UTP Note 3) (4.9 μM, including 1 μCi 3 A mixed solution (50 μl) of a buffer solution (10.6 μl) containing H-UTP) and water (39.4 μl) was added and mixed, and an enzyme reaction was performed at 25 ° C. for 60 minutes.
(5) When 60 minutes of the enzyme reaction passed, an aqueous solution of disodium ethylenediaminetetraacetate (50 mM, 50 μl) was added and mixed to stop the enzyme reaction.
(6) Next, using a cell harvester, the whole amount of the sample in (5) was transferred onto a filter (hereinafter abbreviated as DEAE-filter mat) into which a diethylaminoethyl group was introduced, and then sodium phosphate buffer (0. 25M, pH 7.0) twice for 10 seconds and once for 10 seconds with deionized water.
(7) The rinsed DEAE-filter mat was dried at 95 ° C. for 15 minutes, sealed in a sample bag together with a liquid scintillator (10 ml).
(8) Radioactivity was measured with a scintillation counter.
(9) The inhibition rate was determined by substituting the measured radioactivity (unit: cpm) into the following formula.
Inhibition rate = 100− (measured value in the presence of test substance−measured value in the absence of enzyme)
/ (Measured value in the absence of test substance−Measured value in the absence of enzyme) × 100
Note 1) All the water used in the experimental materials (1) to (5) has been subjected to inactivation treatment of RNase with diethyl pyrocarbonate. The treatment with diethyl pyrocarbonate was carried out by dissolving diethyl pyrocarbonate (0.1 g) in deionized water (100 ml), leaving it at 37 ° C. for 24 hours, and then autoclaving at 120 ° C. for 30 minutes.
Note 2) A single-stranded oligonucleotide having a nucleic acid composition of 5′-GGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA UAU AUA UAU-3 ′. Used as a template. A GG at the 5 ′ end was added to the sequence to stop the nucleic acid synthesis reaction.
Note 3) Uridine triphosphate. Used as substrate.
The inhibition rates of HCV RNA-dependent RNA synthetase when Compound A, Compound B, Compound (I-1), 3′-dUTP are used as test substances are shown below. The concentration of the test substance used is as follows.
Compound A: 20 μg / ml Compound B: 20 μg / ml
Compound C: 0.032 μg /
The influence of preincubation, which is a major operational feature of the assay method of the present invention, on enzyme activity was examined. In the text, RdRp enzyme or HCV RdRp enzyme means HCV RNA-dependent RNA synthetase.
The time for preincubating the mixture of Buffer I, Oligo RNA and Recombinant RdRp Enzyme at 25 ° C was set to 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120 minutes. The test was performed uniformly at 25 ° C. for 30 minutes (FIG. 1). Further, DMSO as a solvent was used in place of the test substance.
When the amount of the substrate incorporated into the reaction product at this time was compared with the enzyme activity, the enzyme activity increased as the preincubation time increased, and the enzyme activity almost reached its peak after 90 minutes of preincubation. The increase in enzyme activity showed up to 8.5 times higher enzyme activity compared to no preincubation (0 min).
From the above results, it was found that preincubation of buffer I, oligo RNA, and recombinant RdRp enzyme before the enzyme reaction induces an increase in enzyme activity.
Test example 2
Next, the effect of preincubation on the thermostability of the enzyme was examined.
The enzyme reaction temperature was set to 25 ° C. and 37 ° C., and the change over time in the enzyme activity of HCV RdRp was measured with and without preincubation (FIG. 2). In the conventional method (without preincubation), the enzyme reaction rate at 37 ° C. stops after 120 minutes of the enzyme reaction. On the other hand, in the pre-incubation method, although the enzyme reaction rate decreased at 37 ° C. after 60 minutes of enzyme reaction, an increase in the amount of enzyme reaction was observed, and the enzyme reaction amount at 25 ° C. from 30 minutes to 180 minutes. The value was 2.6 to 3.0 times higher than the enzymatic reaction.
From the above results, it was found that preincubation treatment of buffer I, oligo RNA, and recombinant RdRp enzyme increases the thermal stability of RdRp in the enzyme reaction. When considering the growth of HCV in vivo, the stability of the RdRp enzyme at around 37 ° C. is essential. From this, the form of RdRp after the preincubation treatment may be close to the form of HCV RdRp in vivo.
Test example 3
In screening for HCV RNA-dependent RNA synthetase inhibitors, the assay method of the present invention is greatly different from the conventional method in that the inhibitory activity is different. By performing the preincubation treatment, Compound A and Compound B showed a significant decrease in inhibitory activity, but Compound C and 3′-dUTP did not show a decrease in inhibitory activity even after preincubation treatment ( Table 1, Table 2).
From the above results, it was found that the pre-incubation treatment of buffer I, poly (A), oligo (U), and recombinant RdRp enzyme significantly changes RdRp inhibitory activity depending on the type of compound.
Reference test examples
In order to compare the conventional method with the pre-incubation assay method, instead of a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end can function as its own primer, poly (A) as a template and oligo (U ) 12 And tens of thousands of compounds with different chemical structures were used as test substances, and random screening was performed.
First, 10 samples of each compound were mixed, and the concentration of the test substance as a mixture was adjusted to 0.83 μg / ml, and the conventional method (however, poly (A) as a template and oligo (U) as a primer) 12 The enzyme inhibition rate was determined according to The results are shown in FIG.
On the other hand, the pre-incubation according to the present invention described in Example 1 above, wherein tens of thousands of compounds are used as test substances, 5 compounds are mixed, and the concentration of the test substance as a mixture is 49 μg / ml. Assay method (however, poly (A) as a template and oligo (U) as a primer) 12 The enzyme inhibition rate was determined according to The results are shown in FIG.
Industrial applicability
It has been found that (1) increased enzyme activity, (2) increased thermal stability, and (3) reduced noise can be achieved by the preincubation assay.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the preincubation time and the enzyme activity of an HCV RNA-dependent RNA synthase when an enzyme reaction is performed for 30 minutes. In the figure, ● represents the case where oligo RNA that forms a hairpin loop at the 3 ′ end is used as a template.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the presence or absence of preincubation and the enzyme reaction temperature. In the figure, ▲ indicates an enzyme reaction at 37 ° C after preincubation, ● indicates an enzyme reaction at 25 ° C after preincubation, △ indicates an enzyme reaction at 37 ° C without preincubation, The circles indicate the relationship between the incorporation of UMP into the reaction product and the enzyme reaction time in the HCV RNA-dependent RNA synthetase reaction when the enzyme reaction is performed at 25 ° C. without preincubation.
FIG. 3 is a diagram showing the results of random screening performed by a conventional method (using a template and primers).
FIG. 4 is a diagram showing the results of random screening by a preincubation method (using a template and primers).
Claims (7)
（ａ）被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、HCV RNA 依存型 RNA合成酵素、３’末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液をインキュベーションする工程、
（ｂ）該インキュベーションした溶液と、被検物質および該核酸合成酵素の基質を混合し、該HCV RNA 依存型 RNA合成酵素と被験物質および該核酸合成酵素の基質を接触させ、該核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
（ｃ）該インキュベーションした溶液と、該核酸合成酵素の基質を混合し、被検物質の非存在下で、該HCV RNA 依存型 RNA合成酵素と該核酸合成酵素の基質を接触させ、該核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
（ｄ）（ｂ）及び（ｃ）の工程で測定された該核酸合成酵素の基質の反応産物への各取り込みを比較する工程、
を含むことを特徴とするHCV RNA 依存型 RNA 合成酵素の活性化剤または阻害剤のアッセイ法。The following steps:
(A) In the absence of a test substance and a substrate for nucleic acid synthase, an HCV RNA- dependent RNA synthase, a single-stranded nucleic acid oligomer and a metal ion whose 3 ′ end can function as its own primer Incubating a solution comprising:
(B) mixing the incubated solution with a test substance and a substrate for the nucleic acid synthase, bringing the HCV RNA- dependent RNA synthase into contact with the test substance and the substrate for the nucleic acid synthase; Measuring the incorporation of the substrate into the reaction product,
(C) mixing the incubated solution and the nucleic acid synthase substrate, contacting the HCV RNA- dependent RNA synthase and the nucleic acid synthase substrate in the absence of the test substance, Measuring the incorporation of the enzyme substrate into the reaction product,
(D) comparing each incorporation of the nucleic acid synthase substrate into the reaction product measured in the steps (b) and (c);
A method for assaying an activator or inhibitor of HCV RNA- dependent RNA synthase , comprising:
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