JP4198387B2

JP4198387B2 - Protein or peptide production method in cell-free protein synthesis system, and protein or peptide produced using the same

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Publication number: JP4198387B2
Application number: JP2002133209A
Authority: JP
Inventors: 直己杉本
Original assignee: I.S.T. CORPORATION
Current assignee: I.S.T. CORPORATION
Priority date: 2002-05-08
Filing date: 2002-05-08
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2022-05-08
Also published as: JP2003325174A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法、およびそれを用いて製造したタンパク質またはペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学の進歩により、目的タンパク質を大量に合成する方法として、形質転換体を用いた方法が一般的になってきている。このような形質転換体を用いた合成方法としては、例えば、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをプラスミドに連結し、この組換え体を大腸菌に導入して大量培養する方法があげられる。しかしながら、このような方法は、例えば、▲１▼時間や手間がかかり、▲２▼発現産物に毒性がある場合に、大腸菌の生育低下に伴なってタンパク質の収率が低下する、▲２▼合成されたタンパク質の不溶化が起こり易い等の欠点も問題となっており、全てのタンパク質合成に適用することは困難であった。
【０００３】
このような従来の細胞系を用いた合成方法の問題を克服する新たなタンパク質合成方法として、近年、試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成系（生体外タンパク質合成系とも呼ばれる）が開発されている。この方法は、目的タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）等を加えて、生体のタンパク質合成系つまりセントラルドグマを試験管内で再現しようとするものであり、前述のような細胞系における問題を解消し、例えば、生細胞では生産できないタンパク質を合成できる等の利点がある。
【０００４】
現在、このような無細胞タンパク質合成方法について、より一層高い収率および優れた再現性でタンパク質を合成できることが望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、さらにタンパク質またはペプチドの合成効率に優れる無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法の提供である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法は、無細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系において、ＤＮＡから１以上のｍＲＮＡを転写し、前記ｍＲＮＡから、翻訳して目的タンパク質若しくは目的ペプチドを合成するタンパク質またはペプチドの製造方法であって、前記ＤＮＡは、前記目的タンパク質若しくは目的ペプチドのコード配列と相補的配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼ反応により、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写することを特徴とする。
【０００７】
前述のように、無細胞タンパク質合成系では、生細胞を用いたタンパク質合成に比べてタンパク質の合成収率が低いという問題があったため、これらの問題を回避すべく、近年では、ｍＲＮＡからタンパク質合成を行う翻訳工程を効率良く行なうための改良がなされていた。しかしながら、本発明者らは、従来とは全く異なり、前記翻訳工程ではなくＤＮＡからｍＲＮＡの転写工程に着目した。つまり、翻訳工程の効率を向上するのではなく、ｍＲＮＡの転写効率を向上させることによってＲＮＡの発現量を増加させ、これによってタンパク質の発現量を増加するべく鋭意研究を行なったのである。そして、前述のように前記ＤＮＡを鋳型として転写したｍＲＮＡは、一つのｍＲＮＡに、前記ＤＮＡに対する相補的配列を複数有するため、このようなｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に用いれば、効率よく目的タンパク質やペプチドを発現できることを見出したのである。つまり、例えば、通常のプラスミド等の転写によって得られるｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを一回転写すると一旦転写が終了するため、得られる複数のＲＮＡは、それぞれ、ＤＮＡに対する相補的配列を１つだけ有するものとなるが、これに対して、本発明における前記ｍＲＮＡは、図１に示すように、例えば、ＤＮＡを鋳型(同図において（−）鎖)として、転写が連続して行われて合成されるため、前記ＤＮＡに対する相補的配列（＋）を複数有するｍＲＮＡ（同図においてポリ（＋）鎖）となる。このように、本発明のｍＲＮＡが前記ＤＮＡに対する相補的配列を複数有することに起因して、必然的にタンパク質の合成量も増加するのである。したがって、本発明のｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に用いれば、短時間でタンパク質合成の効率を向上することも可能になる。また、本発明の無細胞タンパク質合成系における製造方法は、生命体が用いている遺伝暗号（コドン−アンチコドン）を使用するため、短鎖のオリゴペプチドから、生体内で重要な遺伝子調節を行っているタンパク質等、様々なタンパク質の合成に適用可能である。さらに、前述のようなタンパク質の翻訳工程の効率向上に着目した従来の方法と組み合わせることによって、より一層タンパク質合成効率の向上を図る事も可能となる。前述の図１に示すように、ＤＮＡの相補的配列が連続したＲＮＡを転写する方法を、ローリング・シンクロナイゼーション法という。
【０００８】
なお、本発明において、前記ＤＮＡから１つ以上のｍＲＮＡが転写されてもよく、各々のｍＲＮＡが前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写していればよい。
【０００９】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましい。環状ｓｓＤＮＡであれば、前述のようにＲＮＡポリメラーゼ反応によって、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写することが容易だからである。
【００１０】
また、前記一つのｍＲＮＡには、前述のように前記ＤＮＡの相補配列が複数転写されるが、得られるｍＲＮＡは、前記ＤＮＡに対して相補的な配列を少なくとも２つ以上有していればよい。また、前記ｍＲＮＡにおける前記相補的配列の数の上限は、特に制限されず、例えば、ｍＲＮＡ合成における反応時間やＤＮＡの配列等に応じて変化すると考えられる。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡの塩基数は、３０〜１０００ｎｔの範囲であることが好ましい。
【００１２】
本発明の製造方法において、例えば、無細胞タンパク質合成系として大腸菌等の細菌由来の系を使用する場合、前記細菌由来のリボゾームがｍＲＮＡの開始を認識してタンパク質合成を確実に行うために、前記ＤＮＡは、ＳＤ配列に相補的な配列を有することが好ましい。
【００１３】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）およびポリ（Ｔ）からなる群から選択された少なくとも一つの配列を有することが好ましく、この中でも好ましくはポリ（Ｔ）配列である。ＤＮＡとして環状ｓｓＤＮＡを使用する場合、例えば、このような配列を有するｓｓＤＮＡを用いれば、環化を容易に行って前記環状ｓｓＤＮＡを調製できるからである。また、これらの配列の塩基数は、例えば、５〜５０ｎｔの範囲であることが好ましい。
【００１４】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、プロモーター配列を有していてもよく、前記プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、tacプロモーター、lac UV5プロモーター、taqプロモーター等がある。
【００１５】
本発明の製造方法において、前記ｍＲＮＡは予め別途調製してもよいが、例えば、前記ｍＲＮＡの転写と、目的タンパク質合成または目的ペプチド合成とを、同じ反応系で行うことが好ましい。このようにしてｍＲＮＡを合成すれば、そのままタンパク質等の合成を行なうことができるため、迅速かつ簡便に目的タンパク質等の製造を行うことができる。
【００１６】
次に、本発明のタンパク質またはペプチドは、前記本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法により製造したタンパク質またはペプチドである。前述のような方法によれば、優れた効率でタンパク質を合成できるため、得られたペプチドやタンパク質を各種用途に供することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えば、目的タンパク質のコード配列と相補的配列を有する環状ｓｓＤＮＡを調製し、これを鋳型として無細胞タンパク質合成系において、ｍＲＮＡ合成（転写）およびタンパク質合成（翻訳）させることによって行うことができる。以下に本発明の製造方法の一例を示す。
【００１８】
（１）鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの作製
転写の鋳型となる環状ｓｓＤＮＡは、例えば、前駆体となる直鎖状ｓｓＤＮＡを準備し、これを環化することによって調製できる。この環状ｓｓＤＮＡは、ｍＲＮＡ合成の鋳型となるため、所望のｍＲＮＡと相補的配列となるように設計する。
【００１９】
前記直鎖状ｓｓＤＮＡの長さは、環化に影響がなければ特に制限されず、例えば、３０〜１０００ｎｔの範囲が適当である。
【００２０】
そして、前記直鎖状ｓｓＤＮＡは、例えば、少なくとも発現させる目的タンパク質のコード領域の塩基配列（開始コドンおよび終結コドンを含む）に相補的な配列を有していればよい。前記コード領域に相補的な配列の長さは、目的タンパク質のアミノ酸残基数により異なり、適宜決定できる。
【００２１】
前記コード領域に相補的な配列は、例えば、従来公知のクローニング方法等によって自然界より単離してもよいし、既に公知となっているアミノ酸配列や塩基配列の情報を基に化学的に合成してもよい。前記配列情報に関しては、各種文献だけでなく、例えば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により管理されている「ジェンバンク」等の各種データーベースを利用することもできる。
【００２２】
前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、さらに、前記コード領域に相補的な配列の他に、ｓｓＤＮＡの環状化を容易にする配列を含むことが好ましい。このような配列としては、例えば、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｃ）配列およびポリ（Ｔ）配列のように同じ塩基から構成されたポリマー配列等があげられる。なお、これらの配列の存在によって、ｓｓＤＮＡが環状化し易くなることのメカニズムは不明である。
【００２３】
これらの配列の中でも、より好ましくは前記同じ塩基から構成されたポリマーであり、特に好ましくはポリ（Ｔ）配列である。例えば、ポリ（Ｔ）配列のように同じ塩基から構成されていれば、ｓｓＤＮＡを容易に環状化できるだけでなく、環状ｓｓＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列の連続転写に影響を与えることもない。つまり、前記環状ｓｓＤＮＡの転写により合成された、前記ポリ（Ｔ）配列に相補的なｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの二次構造に対する影響が非常に少なく、例えば、ステムループ構造を形成し難いため、ステムループ構造による転写終結の問題等が起こらない。そのため、前記環状ｓｓＤＮＡの転写が一回ごとに終結せず、連続的に行われ、前記環状ｓｓＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を複数有する長鎖のｍＲＮＡを形成できるのである。この長鎖ｍＲＮＡは、転写の回数（ｎ）だけ、前記ポリヌクレオチド配列（Ｘ）が連なった構造［（Ｘ）_n］となる。
【００２４】
前記ｓｓＤＮＡの環状化を容易にするポリ（Ｔ）等の配列の長さは、特に制限されないが、例えば、５〜５０ｎｔの範囲が適当である。
【００２５】
さらに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー等の転写効率に関与する配列や、Shine-Dalgano(ＳＤ)配列に相補的な配列等を有してもよい。これらの配列は、例えば、目的のタンパク質の種類や、後述する無細胞タンパク質合成系の種類等に応じて適宜決定できる。
【００２６】
前記プロモーターの種類としては、Ｔ７プロモーター、tacプロモーター、lac UV5プロモーター、taqプロモーター等が好ましく、これらの中でも特にＴ７プロモーターが好ましい。
【００２７】
一方、転写反応のＲＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｔ７ポリメラーゼや、E.coli ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合には、プロモーターがなくても転写を開始できることから、プロモーター配列を含まなくともよく、特にこのような環状ｓｓＤＮＡの場合は、プロモーター配列を有していない方が、転写効率に優れ好ましい。
【００２８】
具体的には、無細胞タンパク質合成を、大腸菌等の細菌の無細胞抽出液を用いて行う場合、直鎖状ｓｓＤＮＡが、例えば、タンパク質のコード領域に相補的な配列の３’側下流に、前記ＳＤ配列に相補的な配列を有することが好ましい。これは、大腸菌等の細菌において翻訳が始まる際、リボソームが、ｍＲＮＡの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側上流にあるＳＤ配列と塩基対相互作用することによって、前記開始コドン（ＡＵＧ）を認識する必要があるためである。このＳＤ配列に相補的な配列は、特に制限されず、従来公知のＳＤ配列をもとに設定できる。
【００２９】
また、この直鎖状ｓｓＤＮＡは、後述するように、その３’末端と５’末端とをライゲーションさせて環状化を行うが、環状ｓｓＤＮＡのどの配列部分を前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端に設定するかは特に制限されない。具体例としては、例えば、図２に示すように、ＳＤ配列の相補配列の一部を直鎖状ｓｓＤＮＡの３’末端とし、残りの部分を５’末端として、後述するライゲーションによって完全にＳＤ配列に相補的な配列となるように設定してもよい。
【００３０】
このような直鎖状ｓｓＤＮＡは、例えば、従来公知の化学合成法等によって合成し、その５’末端をリン酸化して調製することができる。また、例えば、末端をビオチン化したプライマーと、リン酸化したプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ビオチン−アビジン相互作用を用いて二本鎖を一本鎖にすることによって、直鎖状ｓｓＤＮＡを調製することもできる。
【００３１】
つぎに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの環化は、例えば、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端をＤＮＡリガーゼで結合することによって行うことができる。
【００３２】
前記ＤＮＡリガーゼは、特に制限されないが、例えば、T4 DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、Pfu DNAリガーゼ等があげられ、これらの中でもT4 DNAリガーゼが好ましい。
【００３３】
前記DNAリガーゼによるライゲーション反応は、例えば、split DNAの存在下で行うことが好ましい。本発明において、前記split DNAとは、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの連結領域の数十塩基と二重鎖を形成できる相補的な配列からなるＤＮＡをいう。
【００３４】
split DNAを用いたライゲーション方法の一例を図３に基づいて説明する。同図（ａ）に示すように、直鎖状ｓｓＤＮＡを、その両端の塩基配列に相補的な配列を併せ持つsplit DNAの存在下で反応させる。すると、同図（ｂ）に示すように、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両端と前記split DNAとが塩基対を形成し、この塩基対によって直鎖状ｓｓＤＮＡの環化状態が保持される。つまり、前記split DNAが、直鎖状ｓｓＤＮＡの環化のアダプターとしての役割を果たす。そして、同図（ｃ）に示すように、前記split DNAによって環化が保持された状態で、ＤＮＡリガーゼにより前記直鎖状ｓｓDNAの両末端がライゲーションされる。
【００３５】
前記split DNAの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜４０ｎｔの範囲が適当である。
【００３６】
前記ライゲーション反応の条件は、使用するＤＮＡリガーゼの種類や直鎖状ｓｓＤＮＡの濃度等に応じて適宜決定できるが、例えば、0.1〜10μM 直鎖状ssDNA、0.3〜30μM split DNA、20mM NaCl、1〜15mM MgCl₂、10mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）、10μM ATP、0.33U/μL DNA リガーゼおよび2.5mM Tris-HCl（pH7.5）を含む反応溶液において、通常、温度２５℃で１〜１２時間で反応させればよい。また、前記反応溶液は、市販の製品を使用してもよい。なお、split DNAの濃度は、直鎖状ｓｓＤＮＡ濃度よりも高濃度であることが好ましい。
【００３７】
このように、split DNAを用いて環状ｓｓＤＮＡを作成した場合、前記図３（ｃ）に示すように部分的に二本鎖を含むこととなるが、例えば、これを変性アクリルアミドゲル電気泳動に供して精製することによって、前記split DNAを除去した環状ｓｓＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
（２）環状ｓｓＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成
前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として、無細胞抽出液を含む反応溶液を用いた無細胞タンパク質合成系において目的タンパク質の合成を行う。このように無細胞タンパク質合成系において、鋳型としてＤＮＡを使用する場合には、同じ反応系においてｍＲＮＡ合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）が行われる。なお、前記環状ｓｓＤＮＡからｍＲＮＡを予め合成しておき、このｍＲＮＡを鋳型として、無細胞タンパク質合成系に供することもできるが、これについては後述する。
【００３９】
前記無細胞抽出液としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の抽出液が使用でき、これらの抽出液は、例えば、材料に応じ従来公知の方法によって調製できる。具体的に、大腸菌の無細胞抽出液は、例えば、Ellmanらの方法（Methods Enzymol.202:301-336（1991））の方法によって調製できる。
【００４０】
前記反応溶液は、前記無細胞抽出液および鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの他に、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質を構成する各種アミノ酸、各種緩衝剤、ATP、GTP、CTPおよびUTP等のエネルギー源、クレアチンリン酸、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンキナーゼおよびピルビン酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール(DTT)、スペルミンおよびスペルミジン等の安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を添加することが好ましい。また、これらの添加量は、使用する鋳型の環状ｓｓＤＮＡの量等に応じて適宜決定できる。
【００４１】
前記ＲＮＡポリメラーゼの種類は特に制限されず、例えば、鋳型ｓｓＤＮＡにおけるプロモーターの種類に応じて適宜決定してもよい。具体的には、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、E.coli ＲＮＡポリメラーゼ等が使用できる。
【００４２】
また、このような無細胞タンパク質合成には、市販の無細胞タンパク質合成キットを使用することもできる。具体的には、例えば、商品名E.coli S30 Extract system(プロメガ社製)、E.coli T7 S30 Extract（プロメガ社製）、PROTEIN script-Pro(Ambion社製）等が使用できる。これらのキットは、それらの使用方法に準じた条件で使用できる。
【００４３】
タンパク質合成の反応条件は、特に制限されず、使用する無細胞抽出液や目的のタンパク質の種類等に応じて適宜決定できる。
【００４４】
このような方法によれば、前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型とするｍＲＮＡ合成と、前記ｍＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成とが、並行して同じ無細胞タンパク質合成系において進行する。
【００４５】
前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用すれば、前述のように、前記環状ｓｓＤＮＡに相補的なポリヌクレオチドが連続して転写され、前記ポリヌクレオチドを複数含む長鎖のｍＲＮＡを得ることができる。このように、１分子の環状ｓｓＤＮＡから前記ポリヌクレオチド配列を複数含むｍＲＮＡが合成されるため、鋳型ＤＮＡを一回転写する度にＲＮＡポリメラーゼが解離して転写が終結する従来の方法に比べて、極めて短時間で効率よく、複数の前記ポリヌクレオチド配列を合成できる。そして、このように目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を多く含むｍＲＮＡが合成されることによって、それだけタンパク質合成の鋳型が増加することになるため、タンパク質の合成効率も向上するのである。
【００４６】
このようにして合成された目的のタンパク質は、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィー等の従来公知の方法によって精製すればよい。
【００４７】
また、前述のように、前記ｍＲＮＡ合成工程（転写工程）およびペプチド合成工程（翻訳工程）を同じ無細胞タンパク質合成系において同時に行うのではなく、予め調製したｍＲＮＡを鋳型として、無細胞タンパク質合成系において目的タンパク質を合成してもよい。
【００４８】
この場合は、ｍＲＮＡ合成は、前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として、前述のようなＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によって行うことができる。
【００４９】
前記反応には、ＲＮＡポリメラーゼ以外に、通常、各種ＮＴＰ（ATP、GTP、CTP、UTP）、ＲＮａｓｅインヒビター、各種緩衝剤等を必要とする。また、反応条件は、使用するＲＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜決定できるが、例えば、ｐＨ７．０〜８．５の範囲、温度３７℃、時間１〜１２時間の範囲が好ましい。
【００５０】
得られたｍＲＮＡを含む反応物は、例えば、そのまま次の工程に供してもよいし、各種カラムで精製してから使用してもよい。
【００５１】
そして、得られた前記ｍＲＮＡを鋳型として、前述の無細胞タンパク質合成を行う。なお、使用する無細胞抽出物や条件等は同様である。
【００５２】
【実施例】
（実施例１）
（Ｈｉｓ）₆のコード配列と相補的な配列を有する環状ｓｓＤＮＡを調製し、無細胞タンパク質合成系において（Ｈｉｓ）₆の合成を行った。
【００５３】
（１）環状ｓｓＤＮＡの作製
（直鎖状ｓｓＤＮＡの作製）
環状化させる直鎖状ｓｓＤＮＡとして、配列番号１に示す配列（5'-CTGTTTCCT(T)₂₀CTA(ATG)₆CATAG-3'）（55nt）を設計し、これをＤＮＡ自動合成機（商品名ＤＮＡシンセサイザーModel391：アブライドバイオシステムズ社製）を用いたホスホロアミダイト法によって固相合成し、その５’末端をリン酸化用ホスホロアミダイト試薬（商品名化学リン酸化試薬：Glen Reseach社製）によってリン酸化した。なお、配列番号１において、５’末端の5'-CTGTTTCCTおよび３’末端のAG-3'が、ＳＤ配列の相補配列であり、CTA(ATG)₆CATが、終始コドンおよび開始コドンを含むコード配列の相補配列である。
【００５４】
（直鎖状ｓｓＤＮＡの環状化）
まず、5× ligation buffer （75mM MgCl₂、100mM NaCl、125mM Tris-HC1(pH77.5)）に、１μＭの前記環状化させるssDNAおよび３μＭのsplint DNA（配列番号２：5'-AGGAAACAGCTATGCATC-3'）を添加して、反応溶液を調製した。なお、反応溶液におけるMgCl₂、NaClおよびTris-HC1の終濃度は、15mM MgCl₂、20mM NaCl、25mM Tris-HC1である。そして、この反応溶液を９０℃で１０分間インキュベートした後、2時間かけて前記反応溶液の温度を室温まで戻した。つぎに、前記反応溶液に、最終濃度が10ｍM DTTおよび100μM ATPとなるように、1M DTTおよび100mM ATPを添加し、さらに、最終濃度がO.33units／μLとなるようにT₄ DNA リガーゼ(400U／μL：New England Biolabs社製)を添加して、２５℃で１２時間、ライゲーション反応を行った。このsplit DNAおよびＤＮＡリガーゼを用いた環状ｓｓＤＮＡの生成反応を図４に示す。
【００５５】
（環状ｓｓＤＮＡの精製）
前記反応溶液を、透析チューブ(MWCO 1000：商品名Spectra-Por、Spectrum社製)を用いて透析し、透析後の溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、15% 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、環状ｓｓＤＮＡ、直鎖状ｓｓＤＮＡ、splint DNA とを電気泳動により分離した。目的の環状ｓｓＤＮＡ画分のゲルを切り出し、これを細かく砕き、さらに０．２ＮＮａＣｌ５〜１０ｍＬを添加して、２５℃で１２時間シェイクし、環状ｓｓＤＮＡを抽出した。その後、フィルターを用いて前記ゲル断片を除去し、得られた溶液を再度前記透析チューブを用いて１２時間透析した後、透析溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、７Ｍ尿素を含む１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、図５の電気泳動図に示すように、直鎖状ｓｓＤＮＡ（レーン１）が環化されたことによって、環状ｓｓＤＮＡ（レーン２）が生成されていることが確認できた。
【００５６】
（２）ペプチドの発現
調製した前記環状ssDNAを鋳型として転写・翻訳を行い、（Ｈｉｓ）₆ペプチドを発現させた。無細胞タンパク質合成システム系としては、以下に示す組成の市販品：商品名E.coli S30 Extract system(Promega)を使用し、その使用方法に準じて反応（３７℃、２時間）を行った。
【００５７】

【００５８】
なお、環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用した場合に、これに相補的なポリヌクレオチド配列を複数有する長鎖のｍＲＮＡが形成されるか否かを別途確認した。これは、まず、前記環状ｓｓＤＮＡについて、E.coli ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応（３７℃、３時間）を行い、得られた転写産物を、２％未変性アガロースゲル電気泳動に供した。前記反応液の組成は、環状ｓｓＤＮＡ１μＭ、５０ＵＲＮＡポリメラーゼ、５００μM ＮＴＰｓ、１２．５U/mL ＲＮａｓｅ阻害剤（プロメガ社製）とした。電気泳動の結果、図６に示すように、転写産物のＲＮＡは、アガロースゲルのウェル付近に止まったことから、約1000nt以上の長鎖ｍＲＮＡが得られたことが確認できた（レーン２の矢印）。なお、同図においてレーン１は、分子量マーカー（726、427、311、249bp）である。
【００５９】
また、比較例１として、前記環状ｓｓＤＮＡの代りに、（Ｈｉｓ）₆をコードする塩基配列を含むdsDNAを鋳型とした以外は、前記環状ssDNAと同様にしてペプチド発現を行った。この比較例のｄｓＤＮＡの配列は、配列番号３のセンス鎖を持つ、以下の配列となるように設計し、自動合成機により化学合成した。なお、アンチセンス鎖における 3'-dTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGGCCGAGCATATTACACACCTTの配列は、E.coli taq promoter配列である。
【００６０】
【化１】

【００６１】
（３）合成ペプチドの精製
目的のペプチドを、前記無細胞タンパク質合成系における反応生成物からニッケルキレートカラム(商品名HiTrap Chelating: Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。まず、前記カラムを１ｍＭＮｉ²⁺を含むＰＢＳ(Phosphate-bufferd saline：pH7.4)により平衡化した。そして、前記反応溶液２５μＬを前記ＰＢＳで計１ｍＬにボリュームアップして、平衡化した前記カラムにアプライし、さらに１０ｍＬの前記ＰＢＳを流した後、200mM イミダゾール溶液で溶出を行った。溶出液は１ｍＬのフラクションごとに回収した。各フラクションごとに透析チューブ（ＭＷＣＯ500：商品名Spectra-Pro：Spectrum社製）を用いて透析を行い、この透析液を必要に応じて凍結乾燥した。
【００６２】
（４）合成ペプチドの確認
合成ペプチドとして目的の（Ｈｉｓ）₆が合成されているか否かを、商品名MALDI-TOF mass spectrometer（商品名Voyager：PerSeptive社製）を用いたマススペクトル（ＭＳ）によって確認した。ＭＳに使用するペプチド用マトリックスは、α-cyano-4-hydroxyclannamic acids(αCHCA：MW189.17)１０ｍｇに、アセトニトリル５００μＬ、水４９７μＬおよび０．１％ＴＦＡ３μＬを添加して調製した。合成ペプチドのサンプルは、約１０μmol／Ｌの濃度となるように調製した。そして、調製したサンプルと前記マトリックスとを１：４（体積比）の割合で混合して、測定に供した。なお、コントロールとしては、化学合成品である標品（Ｈｉｓ）₆を使用した。
【００６３】
これらの結果を図７に示す。同図はペプチドのマススペクトルであり、同図（Ａ）が実施例の結果、同図（Ｂ）がコントロールの結果をそれぞれ示す。
【００６４】
（５）合成ペプチド発現量の確認
公知のオルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）法によって、合成ペプチドの発現量を確認した。ＯＰＡ法は、試料に水を添加して１０μＬとし、これに下記ＯＰＡ試薬１００μＬを混合して、室温で１５分放置後、さらに０．５ＭＮａＣｌ１ｍＬを混合して、その蛍光を測定した。測定条件は、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４０〜４５５ｎｍとした。
【００６５】
（ＯＰＡ試薬）
ＯＰＡ１２０ｍｇをエタノール１．５ｍＬに溶解し、１．０Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．４）１００ｍＬに加え、さらに、３０重量％Ｂｒｉｊ３５を０．６ｍＬ添加した。そして、使用３０分前までに、前記混合液１ｍＬあたり３μＬの２−メルカプトエタノールを添加して、ＯＰＡ試薬を調製した。
【００６６】
これらの結果を図８に示す。同図は、合成ペプチドの発現量を蛍光強度で表わしたグラフである。
【００６７】
実施例１における合成ペプチドは、前記図７（Ａ）のマススペクトルに示すように、前記図７（Ｂ）のコントロール（Ｈｉｓ）₆のピーク（m/z 882.76）と同様のピーク（m/z 882.98）を示している。このことから、実施例において環状ｓｓDNAを使用することによって、（Ｈｉｓ）₆を合成できることが確認された。また、図７（Ａ）においては、前記（Ｈｉｓ）₆のピーク以外に、二つのピークが見られるが、これらはそれぞれ（Ｈｉｓ）₅（m/z 768.88）および（Ｈｉｓ）₆Ｍｅｔ（m/z 1052.24）を示していると考えられる。
【００６８】
なお、実施例１における無細胞タンパク質合成により得られた合成ペプチド（Ｈｉｓ）₆およびコントロールの化学合成ペプチド（Ｈｉｓ）₆の化学式を以下に示す。
【００６９】
【化２】

【００７０】
そして、実施例１において得られたペプチド（Ｈｉｓ）₆の発現量として、蛍光強度を測定した結果、前記図８に示すように、dsDNAを用いた比較例に比べて、環状ssDNAを用いた実施例１によれば、非常に高い蛍光強度が得られた。具体的には、Fraction１において比較例の約４０倍、Ｆraction２において比較例１の約４０倍の蛍光強度を示しており、前記蛍光強度は、ペプチドの発現量と相関関係にあることからも、極めて優れた発現量でペプチドが合成されたといえる。このことから、実施例１における環状ssDNAによれば、ペプチドの発現量を増加でき、効率よくペプチド合成が行えることいえる。
【００７１】
【発明の効果】
このように、本発明の製造方法によれば、前記ＤＮＡを鋳型として転写したｍＲＮＡが、前記ＤＮＡに対して相補的な配列を複数有するｍＲＮＡであるため、効率よく目的タンパク質やペプチドを発現することができる。このような方法によれば、迅速かつ簡便に所望のタンパク質やペプチドを合成することができる。
【００７２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造方法における、環状ｓｓＤＮＡからｍＲＮＡの転写工程を示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態において、環状ｓｓＤＮＡの前駆体となる直鎖状ｓｓＤＮＡの末端配列の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態において、直鎖状ｓｓＤＮＡを環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の一実施例において、直鎖状ｓｓＤＮＡを環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程を示す概略図である。
【図５】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡの生成を確認した電気泳動図である。
【図６】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの電気泳動図である。
【図７】前記実施例における合成したペプチドのマススペクトルであって、同図（Ａ）は、実施例のマススペクトル、同図（Ｂ）はコントロールのマススペクトルを示す。
【図８】前記実施例における合成ペプチドの発現量を蛍光強度で示したグラフである。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for producing a protein or peptide in a cell-free protein synthesis system, and a protein or peptide produced using the method.
[0002]
[Prior art]
Due to advances in genetic engineering, methods using transformants have become common as methods for synthesizing target proteins in large quantities. Examples of the synthesis method using such a transformant include a method in which DNA encoding the amino acid sequence of the target protein is linked to a plasmid, the recombinant is introduced into Escherichia coli and cultured in large quantities. However, in such a method, for example, (1) it takes time and labor, and (2) when the expression product is toxic, the yield of the protein decreases with the growth of E. coli. (2) There are also problems such as the insolubilization of the synthesized protein easily occurring, and it has been difficult to apply to all protein synthesis.
[0003]
As a new protein synthesis method that overcomes the problems of such conventional cell system synthesis methods, in recent years, there has been a so-called cell-free protein synthesis system (also called in vitro protein synthesis system) that synthesizes proteins in vitro. Has been developed. In this method, template DNA encoding the target protein, RNA polymerase, ATP (adenosine triphosphate), etc. are added to reproduce the biological protein synthesis system, that is, the central dogma in a test tube. There are advantages such as the ability to synthesize proteins that cannot be produced in living cells.
[0004]
At present, it is desired that such a cell-free protein synthesis method can synthesize proteins with a higher yield and excellent reproducibility.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a protein or peptide in a cell-free protein synthesis system that is further excellent in protein or peptide synthesis efficiency.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the method for producing a protein or peptide of the present invention transcribes one or more mRNAs from DNA in a cell-free protein synthesis system including a cell-free extract, and translates the mRNA for translation. A method for producing a protein or peptide for synthesizing a protein or a target peptide, wherein the DNA has a sequence complementary to the coding sequence of the target protein or target peptide, and the RNA is subjected to RNA polymerase reaction to convert the DNA into one mRNA. A plurality of complementary sequences are transcribed.
[0007]
As described above, the cell-free protein synthesis system has a problem that the protein synthesis yield is low compared to protein synthesis using living cells. In recent years, protein synthesis from mRNA has been attempted to avoid these problems. Improvements have been made to efficiently perform the translation process. However, the present inventors have completely focused on the transcription process of DNA to mRNA, not the translation process, which is completely different from the conventional one. In other words, instead of improving the efficiency of the translation process, intensive research was conducted to increase the expression level of RNA by increasing the transcription efficiency of mRNA, thereby increasing the expression level of protein. Since the mRNA transcribed using the DNA as a template as described above has a plurality of complementary sequences to the DNA in one mRNA, if such mRNA is used in a cell-free protein synthesis system, the target protein can be efficiently obtained. And found that the peptide can be expressed. In other words, for example, mRNA obtained by transcription of a normal plasmid or the like once completes transcription once the template DNA is transcribed, so that each of the obtained RNAs has only one complementary sequence to the DNA. On the other hand, as shown in FIG. 1, the mRNA in the present invention is synthesized, for example, by continuously performing transcription using DNA as a template ((-) strand in the figure). Therefore, it becomes mRNA having a plurality of complementary sequences (+) to the DNA (poly (+) chain in the figure). Thus, the amount of protein synthesis inevitably increases because the mRNA of the present invention has a plurality of complementary sequences to the DNA. Therefore, if the mRNA of the present invention is used in a cell-free protein synthesis system, the efficiency of protein synthesis can be improved in a short time. In addition, since the production method in the cell-free protein synthesis system of the present invention uses the genetic code (codon-anticodon) used by living organisms, important gene regulation is performed in vivo from short-chain oligopeptides. It can be applied to the synthesis of various proteins such as existing proteins. Furthermore, the protein synthesis efficiency can be further improved by combining with the conventional method focusing on the efficiency improvement of the protein translation process as described above. As shown in FIG. 1 described above, a method of transcribing RNA in which a complementary sequence of DNA is continuous is called a rolling synchronization method.
[0008]
In the present invention, one or more mRNAs may be transcribed from the DNA as long as each mRNA transcribes a plurality of complementary sequences of the DNA.
[0009]
In the production method of the present invention, the DNA is preferably circular single-stranded DNA (ssDNA). This is because a circular ssDNA can easily transcribe a plurality of complementary sequences of the DNA into one mRNA by the RNA polymerase reaction as described above.
[0010]
In addition, as described above, a plurality of complementary sequences of the DNA are transcribed into the one mRNA, but the obtained mRNA may have at least two or more sequences complementary to the DNA. . Further, the upper limit of the number of the complementary sequences in the mRNA is not particularly limited, and is considered to vary depending on, for example, the reaction time in mRNA synthesis, the DNA sequence, and the like.
[0011]
In the production method of the present invention, the number of bases of the DNA is preferably in the range of 30 to 1000 nt.
[0012]
In the production method of the present invention, for example, when a system derived from bacteria such as Escherichia coli is used as a cell-free protein synthesis system, the bacteria-derived ribosome recognizes the start of mRNA and reliably performs protein synthesis. The DNA preferably has a sequence complementary to the SD sequence.
[0013]
In the production method of the present invention, the DNA preferably has at least one sequence selected from the group consisting of poly (A), poly (C) and poly (T), and among these, poly (T) is preferable. Is an array. This is because when circular ssDNA is used as the DNA, for example, if ssDNA having such a sequence is used, the circular ssDNA can be prepared by easily performing cyclization. Moreover, it is preferable that the base number of these arrangement | sequences is the range of 5-50 nt, for example.
[0014]
In the production method of the present invention, the DNA may have a promoter sequence, and examples of the promoter include a T7 promoter, a tac promoter, a lac UV5 promoter, a taq promoter, and the like.
[0015]
In the production method of the present invention, the mRNA may be prepared separately in advance. For example, it is preferable to perform the transcription of the mRNA and target protein synthesis or target peptide synthesis in the same reaction system. By synthesizing mRNA in this way, the protein and the like can be synthesized as they are, and therefore the target protein and the like can be produced quickly and easily.
[0016]
Next, the protein or peptide of the present invention is a protein or peptide produced by the method for producing a protein or peptide of the present invention. According to the method as described above, since the protein can be synthesized with excellent efficiency, the obtained peptide or protein can be used for various applications.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is carried out, for example, by preparing circular ssDNA having a sequence complementary to the coding sequence of the target protein, and using this as a template for mRNA synthesis (transcription) and protein synthesis (translation) in a cell-free protein synthesis system. Can do. An example of the production method of the present invention is shown below.
[0018]
(1) Preparation of circular ssDNA as template
The circular ssDNA serving as a transcription template can be prepared, for example, by preparing a linear ssDNA serving as a precursor and cyclizing it. Since this circular ssDNA serves as a template for mRNA synthesis, it is designed to have a complementary sequence to the desired mRNA.
[0019]
The length of the linear ssDNA is not particularly limited as long as it does not affect the cyclization. For example, a range of 30 to 1000 nt is appropriate.
[0020]
The linear ssDNA only needs to have a sequence complementary to at least the base sequence (including the initiation codon and termination codon) of the coding region of the target protein to be expressed. The length of the sequence complementary to the coding region varies depending on the number of amino acid residues of the target protein and can be determined as appropriate.
[0021]
The sequence complementary to the coding region may be isolated from nature by, for example, a conventionally known cloning method, or may be chemically synthesized based on already known amino acid sequence or base sequence information. Also good. For the sequence information, not only various documents but also various databases such as “Genbank” managed by the National Institutes of Health (NIH) can be used.
[0022]
The sequence of the linear ssDNA preferably further includes a sequence that facilitates circularization of the ssDNA in addition to a sequence complementary to the coding region. Examples of such a sequence include a polymer sequence composed of the same base such as a poly (A) sequence, a poly (C) sequence and a poly (T) sequence. The mechanism by which the presence of these sequences facilitates circularization of ssDNA is unknown.
[0023]
Among these sequences, a polymer composed of the same base is more preferable, and a poly (T) sequence is particularly preferable. For example, if they are composed of the same base as in a poly (T) sequence, ssDNA can be easily circularized and does not affect the continuous transcription of a polynucleotide sequence complementary to the circular ssDNA. That is, the poly (A) sequence in the mRNA complementary to the poly (T) sequence synthesized by transcription of the circular ssDNA has very little influence on the secondary structure of the mRNA. Since it is difficult to form, the problem of termination of transcription due to the stem loop structure does not occur. Therefore, the transcription of the circular ssDNA is not terminated every time and is continuously performed, and a long mRNA having a plurality of polynucleotide sequences complementary to the circular ssDNA sequence can be formed. This long mRNA has a structure in which the polynucleotide sequence (X) is linked by the number of times of transcription (n) [(X) _n ].
[0024]
The length of a sequence such as poly (T) that facilitates the circularization of the ssDNA is not particularly limited, but for example, a range of 5 to 50 nt is appropriate.
[0025]
Furthermore, the sequence of the linear ssDNA may have, for example, a sequence involved in transcription efficiency such as a promoter and an enhancer, a sequence complementary to the Shine-Dalgano (SD) sequence, and the like. These sequences can be appropriately determined according to, for example, the type of the target protein, the type of a cell-free protein synthesis system described below, and the like.
[0026]
As the type of the promoter, T7 promoter, tac promoter, lac UV5 promoter, taq promoter and the like are preferable, and among these, T7 promoter is particularly preferable.
[0027]
On the other hand, for example, when T7 polymerase or E. coli RNA polymerase is used as the RNA polymerase for the transcription reaction, transcription can be started without a promoter, so that it is not necessary to include a promoter sequence. In the case of circular ssDNA, it is preferable to have no promoter sequence because of excellent transcription efficiency.
[0028]
Specifically, when cell-free protein synthesis is performed using a cell-free extract of bacteria such as Escherichia coli, the linear ssDNA is, for example, 3 ′ downstream of a sequence complementary to the protein coding region, It preferably has a sequence complementary to the SD sequence. This is because, when translation begins in bacteria such as E. coli, the ribosome recognizes the start codon (AUG) by base-pairing interaction with the SD sequence 5 ′ upstream of the start codon (AUG) of mRNA. This is necessary. The sequence complementary to this SD sequence is not particularly limited, and can be set based on a conventionally known SD sequence.
[0029]
Further, as will be described later, this linear ssDNA is circularized by ligating its 3 'end and 5' end. Which sequence portion of the circular ssDNA is set at both ends of the linear ssDNA. There is no particular limitation on whether to do it. As a specific example, as shown in FIG. 2, for example, a part of the complementary sequence of the SD sequence is the 3 ′ end of the linear ssDNA and the remaining portion is the 5 ′ end, and the SD sequence is completely obtained by ligation described later. May be set so as to be a complementary sequence.
[0030]
Such a linear ssDNA can be prepared by, for example, synthesis by a conventionally known chemical synthesis method or the like and phosphorylating the 5 ′ end. In addition, for example, linear ssDNA is prepared by performing PCR using a biotinylated primer and a phosphorylated primer and making the double strand into a single strand using biotin-avidin interaction. You can also
[0031]
Next, cyclization of the linear ssDNA can be performed, for example, by joining both ends of the linear ssDNA with DNA ligase.
[0032]
The DNA ligase is not particularly limited, and examples thereof include T4 DNA ligase, E. coli DNA ligase, Pfu DNA ligase, etc. Among these, T4 DNA ligase is preferable.
[0033]
The ligation reaction with the DNA ligase is preferably performed in the presence of split DNA, for example. In the present invention, the split DNA refers to a DNA having a complementary sequence capable of forming a double strand with several tens of bases in the linking region of the linear ssDNA.
[0034]
An example of a ligation method using split DNA will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 5A, linear ssDNA is reacted in the presence of split DNA having sequences complementary to the base sequences at both ends thereof. Then, as shown in FIG. 5B, both ends of the linear ssDNA and the split DNA form a base pair, and the circular state of the linear ssDNA is maintained by this base pair. That is, the split DNA serves as an adapter for cyclization of linear ssDNA. Then, as shown in FIG. 5C, both ends of the linear ssDNA are ligated by DNA ligase in a state where cyclization is maintained by the split DNA.
[0035]
Although the length of the split DNA is not particularly limited, for example, a range of 10 to 40 nt is appropriate.
[0036]
The conditions for the ligation reaction can be appropriately determined according to the type of DNA ligase used, the concentration of linear ssDNA, etc., for example, 0.1 to 10 μM linear ssDNA, 0.3 to 30 μM split DNA, 20 mM NaCl, 1 to 15 mM MgCl ₂ In a reaction solution containing 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 μM ATP, 0.33 U / μL DNA ligase and 2.5 mM Tris-HCl (pH 7.5), the reaction is usually performed at a temperature of 25 ° C. for 1 to 12 hours. Good. The reaction solution may be a commercially available product. The split DNA concentration is preferably higher than the linear ssDNA concentration.
[0037]
Thus, when a circular ssDNA is prepared using split DNA, it partially contains double strands as shown in FIG. 3 (c). For example, this is subjected to denaturing acrylamide gel electrophoresis. The circular ssDNA from which the split DNA has been removed can be obtained by purification.
[0038]
(2) Cell-free protein synthesis using circular ssDNA
Using the circular ssDNA as a template, the target protein is synthesized in a cell-free protein synthesis system using a reaction solution containing a cell-free extract. Thus, in the cell-free protein synthesis system, when DNA is used as a template, mRNA synthesis (transcription) and protein synthesis (translation) are performed in the same reaction system. In addition, mRNA can be synthesized in advance from the circular ssDNA, and this mRNA can be used as a template for a cell-free protein synthesis system, which will be described later.
[0039]
The cell-free extract is not particularly limited, and for example, extract of Escherichia coli, wheat germ, rabbit reticulocyte and the like can be used, and these extracts can be prepared by a conventionally known method according to the material, for example. Specifically, a cell-free extract of Escherichia coli can be prepared, for example, by the method of Ellman et al. (Methods Enzymol. 202: 301-336 (1991)).
[0040]
In addition to the cell-free extract and the circular ssDNA serving as a template, the reaction solution includes, for example, RNA polymerase, various amino acids constituting proteins, various buffering agents, energy sources such as ATP, GTP, CTP, and UTP, creatine phosphorus It is preferable to add an ATP regeneration system such as acid, phosphoenolpyruvate, creatine kinase and pyruvate kinase, a stabilizer such as dithiothreitol (DTT), spermine and spermidine, an RNase inhibitor and the like. Moreover, these addition amounts can be appropriately determined according to the amount of the circular ssDNA of the template to be used.
[0041]
The type of the RNA polymerase is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the type of promoter in the template ssDNA, for example. Specifically, for example, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, E. coli RNA polymerase and the like can be used.
[0042]
For such cell-free protein synthesis, a commercially available cell-free protein synthesis kit can also be used. Specifically, for example, E.coli S30 Extract system (manufactured by Promega), E.coli T7 S30 Extract (manufactured by Promega), PROTEIN script-Pro (manufactured by Ambion) and the like can be used. These kits can be used under conditions according to their usage.
[0043]
The reaction conditions for protein synthesis are not particularly limited and can be appropriately determined according to the cell-free extract to be used, the type of the target protein, and the like.
[0044]
According to such a method, mRNA synthesis using the circular ssDNA as a template and protein synthesis using the mRNA as a template proceed in parallel in the same cell-free protein synthesis system.
[0045]
When the circular ssDNA is used as a template, as described above, a polynucleotide complementary to the circular ssDNA is continuously transcribed, and a long mRNA containing a plurality of the polynucleotides can be obtained. Thus, since mRNA containing a plurality of the polynucleotide sequences is synthesized from one molecule of circular ssDNA, compared to the conventional method in which RNA polymerase dissociates and transcription ends each time the template DNA is transcribed once, A plurality of the polynucleotide sequences can be synthesized efficiently in an extremely short time. Since mRNA containing a large amount of a polynucleotide sequence encoding the target protein is synthesized in this way, the protein synthesis template is increased accordingly, and the protein synthesis efficiency is also improved.
[0046]
The target protein synthesized in this manner may be purified by a conventionally known method such as affinity column chromatography.
[0047]
In addition, as described above, the mRNA synthesis step (transcription step) and the peptide synthesis step (translation step) are not performed simultaneously in the same cell-free protein synthesis system, but a cell-free protein synthesis system using pre-prepared mRNA as a template. The target protein may be synthesized.
[0048]
In this case, mRNA synthesis can be performed by the transcription reaction with RNA polymerase as described above using the circular ssDNA as a template.
[0049]
In addition to RNA polymerase, the reaction usually requires various NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP), RNase inhibitors, various buffers, and the like. Moreover, although reaction conditions can be suitably determined according to the kind etc. of RNA polymerase to be used, the range of pH 7.0-8.5, temperature 37 degreeC, and time 1-12 hours is preferable, for example.
[0050]
The obtained reaction product containing mRNA may be used for the next step as it is, or may be used after being purified by various columns.
[0051]
Then, the aforementioned cell-free protein synthesis is performed using the obtained mRNA as a template. The cell-free extract and conditions used are the same.
[0052]
【Example】
(Example 1)
(His) ₆ To prepare a circular ssDNA having a sequence complementary to the coding sequence of (ii) in a cell-free protein synthesis system (His) ₆ Was synthesized.
[0053]
(1) Preparation of circular ssDNA
(Production of linear ssDNA)
As a linear ssDNA to be circularized, the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5′-CTGTTTCCT (T) ₂₀ CTA (ATG) ₆ CATAG-3 ') (55nt) was designed, and this was solid-phase synthesized by the phosphoramidite method using an automatic DNA synthesizer (trade name DNA synthesizer Model 391: manufactured by Abride Biosystems). Phosphorylation was carried out using a phosphoramidite reagent for phosphorylation (trade name chemical phosphorylation reagent: manufactured by Glen Reseach). In SEQ ID NO: 1, 5′-CTGTTTCCT at the 5 ′ end and AG-3 ′ at the 3 ′ end are complementary sequences of the SD sequence, and CTA (ATG) ₆ CAT is the complementary sequence of the coding sequence including the stop codon and start codon.
[0054]
(Circularization of linear ssDNA)
First, 5 × ligation buffer (75mM MgCl ₂ , 100 mM NaCl, 125 mM Tris-HC1 (pH 77.5)), 1 μM of the ssDNA to be circularized and 3 μM splint DNA (SEQ ID NO: 2: 5′-AGGAAACAGCTATGCATC-3 ′) were added to prepare a reaction solution. did. In addition, MgCl in the reaction solution ₂ The final concentration of NaCl and Tris-HC1 is 15 mM MgCl ₂ 20 mM NaCl, 25 mM Tris-HC1. And after incubating this reaction solution at 90 degreeC for 10 minute (s), the temperature of the said reaction solution was returned to room temperature over 2 hours. Next, 1 M DTT and 100 mM ATP are added to the reaction solution so that the final concentration is 10 mM DTT and 100 μM ATP, and further, T is added so that the final concentration is O.33 units / μL. _Four DNA ligase (400 U / μL: New England Biolabs) was added, and ligation reaction was performed at 25 ° C. for 12 hours. FIG. 4 shows a reaction for producing circular ssDNA using split DNA and DNA ligase.
[0055]
(Purification of circular ssDNA)
The reaction solution was dialyzed using a dialysis tube (MWCO 1000: trade name Spectra-Por, manufactured by Spectrum), and the dialyzed solution was lyophilized. This lyophilized product was suspended in a 7M urea aqueous solution, applied to a 15% denatured polyacrylamide gel, and circular ssDNA, linear ssDNA, and splint DNA were separated by electrophoresis. A gel of the target circular ssDNA fraction was cut out, pulverized, further added with 5-10 mL of 0.2N NaCl, shaken at 25 ° C. for 12 hours, and circular ssDNA was extracted. Then, the gel fragment was removed using a filter, and the resulting solution was dialyzed again using the dialysis tube for 12 hours, and then the dialysis solution was freeze-dried. This lyophilized product was suspended in a 7M urea aqueous solution and subjected to 15% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis containing 7M urea. As a result, as shown in the electrophoretic diagram of FIG. 5, it was confirmed that circular ssDNA (lane 2) was generated by cyclization of linear ssDNA (lane 1).
[0056]
(2) Peptide expression
Transcription / translation using the prepared circular ssDNA as a template, (His) ₆ Peptides were expressed. As the cell-free protein synthesis system, a commercial product having the following composition: E. coli S30 Extract system (Promega) was used, and the reaction (37 ° C., 2 hours) was performed according to the method of use.
[0057]

[0058]
In addition, when circular ssDNA was used as a template, it was separately confirmed whether a long mRNA having a plurality of polynucleotide sequences complementary to this was formed. First, the circular ssDNA was subjected to a transcription reaction (37 ° C., 3 hours) using E. coli RNA polymerase, and the obtained transcription product was subjected to 2% native agarose gel electrophoresis. The composition of the reaction solution was cyclic ssDNA 1 μM, 50 U RNA polymerase, 500 μM NTPs, 12.5 U / mL RNase inhibitor (Promega). As a result of the electrophoresis, as shown in FIG. 6, since the RNA of the transcript stopped near the well of the agarose gel, it was confirmed that a long mRNA of about 1000 nt or more was obtained (arrow in lane 2). ). In the figure, lane 1 is a molecular weight marker (726, 427, 311, 249 bp).
[0059]
Further, as Comparative Example 1, instead of the circular ssDNA, (His) ₆ Peptide expression was carried out in the same manner as in the circular ssDNA except that dsDNA containing a nucleotide sequence encoding was used as a template. The dsDNA sequence of this comparative example was designed to have the following sequence having the sense strand of SEQ ID NO: 3, and was chemically synthesized by an automatic synthesizer. The sequence of 3′-dTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGGCCGAGCATATTACACACCTT in the antisense strand is an E. coli taq promoter sequence.
[0060]
[Chemical 1]

[0061]
(3) Purification of synthetic peptide
The target peptide was purified from the reaction product in the cell-free protein synthesis system using a nickel chelate column (trade name HiTrap Chelating: Amersham Pharmacia Biotech). First, the column is 1 mM Ni ²⁺ The solution was equilibrated with PBS (Phosphate-buffered saline: pH 7.4). Then, 25 μL of the reaction solution was volumed up to 1 mL in total with the PBS, applied to the equilibrated column, and further 10 mL of PBS was flowed, followed by elution with a 200 mM imidazole solution. The eluate was collected for each 1 mL fraction. Each fraction was dialyzed using a dialysis tube (MWCO500: trade name Spectra-Pro: manufactured by Spectrum), and this dialysate was freeze-dried as necessary.
[0062]
(4) Confirmation of synthetic peptide
The target (His) as a synthetic peptide ₆ It was confirmed by mass spectrum (MS) using a trade name MALDI-TOF mass spectrometer (trade name Voyager: manufactured by PerSeptive). The matrix for peptide used for MS was prepared by adding 500 μL of acetonitrile, 497 μL of water and 3 μL of 0.1% TFA to 10 mg of α-cyano-4-hydroxyclannamic acids (αCHCA: MW189.17). Synthetic peptide samples were prepared to a concentration of about 10 μmol / L. And the prepared sample and the said matrix were mixed in the ratio of 1: 4 (volume ratio), and it used for the measurement. As a control, a chemically synthesized standard (His) ₆ It was used.
[0063]
These results are shown in FIG. The figure shows the mass spectrum of the peptide, where FIG. (A) shows the results of the example and FIG. (B) shows the results of the control.
[0064]
(5) Confirmation of synthetic peptide expression level
The expression level of the synthetic peptide was confirmed by a known ortho-phthalaldehyde (OPA) method. In the OPA method, water was added to a sample to make 10 μL, 100 μL of the following OPA reagent was mixed therewith, left at room temperature for 15 minutes, and further 1 mL of 0.5 M NaCl was mixed to measure the fluorescence. The measurement conditions were an excitation wavelength of 340 nm and a fluorescence wavelength of 440 to 455 nm.
[0065]
(OPA reagent)
120 mg of OPA was dissolved in 1.5 mL of ethanol, added to 100 mL of 1.0 M potassium borate buffer (pH 10.4), and 0.6 mL of 30 wt% Brij35 was further added. Then, 30 minutes before use, 3 μL of 2-mercaptoethanol was added per 1 mL of the mixed solution to prepare an OPA reagent.
[0066]
These results are shown in FIG. The figure is a graph showing the expression level of the synthetic peptide in terms of fluorescence intensity.
[0067]
As shown in the mass spectrum of FIG. 7 (A), the synthetic peptide in Example 1 is the control (His) of FIG. 7 (B). ₆ The same peak (m / z 882.98) as that of (m / z 882.76) is shown. From this, by using circular ssDNA in the examples, (His) ₆ It was confirmed that can be synthesized. In FIG. 7A, the (His) ₆ In addition to the peaks of, there are two peaks, each of which is (His) _Five (M / z 768.88) and (His) ₆ This is considered to indicate Met (m / z 1052.24).
[0068]
In addition, the synthetic peptide (His) obtained by the cell-free protein synthesis in Example 1 ₆ And control chemically synthesized peptides (His) ₆ The chemical formula of is shown below.
[0069]
[Chemical 2]

[0070]
And the peptide (His) obtained in Example 1 ₆ As a result of measuring the fluorescence intensity as the expression level of Example 1, as shown in FIG. 8, according to Example 1 using circular ssDNA, a very high fluorescence intensity was obtained as compared with the comparative example using dsDNA. It was. Specifically, the fluorescence intensity is about 40 times that of Comparative Example in Fraction 1 and about 40 times that of Comparative Example 1 in Fraction 2, and the fluorescence intensity is correlated with the expression level of the peptide. It can be said that the peptide was synthesized with an excellent expression level. From this, it can be said that according to the circular ssDNA in Example 1, the expression level of the peptide can be increased and the peptide synthesis can be performed efficiently.
[0071]
【The invention's effect】
Thus, according to the production method of the present invention, since the mRNA transcribed using the DNA as a template is mRNA having a plurality of sequences complementary to the DNA, the target protein or peptide can be efficiently expressed. Can do. According to such a method, a desired protein or peptide can be synthesized quickly and easily.
[0072]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a step of transcription of mRNA from circular ssDNA in the production method of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a terminal sequence of linear ssDNA that is a precursor of circular ssDNA in an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic view showing an example of a step of preparing circular ssDNA by cyclizing linear ssDNA in an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a schematic view showing a step of preparing circular ssDNA by cyclizing linear ssDNA in one example of the present invention.
FIG. 5 is an electrophoretogram confirming the generation of circular ssDNA in the example.
FIG. 6 is an electrophoretogram of mRNA transcribed from circular ssDNA in the Example.
7A and 7B are mass spectra of the peptides synthesized in the examples, where FIG. 7A shows the mass spectrum of the example and FIG. 7B shows the control mass spectrum.
FIG. 8 is a graph showing the expression level of the synthetic peptide in the above example in terms of fluorescence intensity.

Claims

In a cell-free protein synthesis system containing a cell-free extract, a method for producing a protein or peptide that transcribes one or more mRNAs from a template DNA and translates the mRNA to synthesize a target protein or target peptide,
The cell-free extract is a cell-free extract of bacteria,
The template DNA has a sequence complementary to the coding sequence of the target protein or target peptide, a sequence complementary to the SD sequence, and a base sequence of poly dT, poly dC, or poly dA in the range of 5 to 50 nt. Single-stranded DNA ,
A production method comprising transferring a plurality of complementary sequences of the template DNA to one mRNA by RNA polymerase reaction .

The method according to claim 1, wherein the number of bases of the template DNA is in the range of 30 to 1000 nt.

The production method according to claim 1 or 2, wherein the template DNA has at least one promoter sequence selected from the group consisting of T7, tac, lacUV5, and taq.