JP4196318B2 - Selective separation medium for E. coli and separation method - Google Patents
Selective separation medium for E. coli and separation method Download PDFInfo
- Publication number
- JP4196318B2 JP4196318B2 JP2002075166A JP2002075166A JP4196318B2 JP 4196318 B2 JP4196318 B2 JP 4196318B2 JP 2002075166 A JP2002075166 A JP 2002075166A JP 2002075166 A JP2002075166 A JP 2002075166A JP 4196318 B2 JP4196318 B2 JP 4196318B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- escherichia coli
- coli
- growth
- selective
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は大腸菌、特に三類感染症原因菌である腸管出血性大腸菌O157の選択分離培地に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
大腸菌による感染症の治療においては、その感染症の原因菌を同定し、その原因物質に適合した処置を迅速に行うことが重要である。腸管出血性大腸菌のうち特に血清型O157は、米国、カナダおよびヨーロッパにおいて多くの食中毒の原因となっている。我が国においても、1996年の大規模食中毒を境に、各種食材(特に牛肉)がこれらの食中毒に関与している。
この大腸菌は血液様の下痢を特徴とする出血性大腸炎を引起し、非常に重篤な腎臓の合併症(溶血性尿毒症)に進む恐れがあるため、主要な公衆衛生の課題となっている。特に腸管出血性大腸菌O157は食品従事者を中心とした保菌者検索(糞便検査)や食品品質検査に力を入れて行われている。
【0003】
腸管出血性大腸菌O157の感染が疑われる場合または保菌者を検索する場合、確定診断のために糞便材料などを検査材料とし腸管出血性大腸菌O157の分離を行なう必要がある。この際必要となるのが腸管出血性大腸菌O157選択分離培地である。選択分離培地とは、できる限り標的微生物のみ生育できるように工夫された培地の総称であり、糞便材料のように多種の腸内細菌を多量に含む可能性のある検査材料を用いる場合には、特に選択性能は重要である。一般的には、共存する微生物に対して抑制的に作用し、標的微生物の生育に影響を与えない物質を選択物質として添加した培地を選択分離培地として利用する。
【0004】
たとえば、食品検体や糞便検体には腸管出血性大腸菌O157以外の多くの微生物が含まれており、これらのなかから腸管出血性大腸菌O157を分離培養するためには、選択分離培地を用いなければならない。従来技術の分離培地または選択分離培地は以下の通りである
【0005】
(1)分離培地
▲1▼SMAC(Sorbitol MacConkey)寒天培地
グラム陰性且つソルビトール非発酵性もしくは遅発酵性であるすべての微生物の検査に利用される。選択性が低いため抗生物質を添加する場合もあるが、ソルビトール非発酵菌もしくは遅発酵菌による偽陽性を排除できない。鑑別試薬としてフルオロゲン(fluorogenic)化合物もしくは色原体(chromogenic)化合物を添加することにより、β−グルクロニダーゼを産生する微生物(本質的に典型的な大腸菌)を除去することができる。
患者から分離した腸管出血性大腸菌O157のほとんどは24時間たってもソルビトールを発酵しない。又、β−グルクロニダーゼ活性を持たない。これらの性質を利用し、臨床もしくは食物検体中における腸管出血性大腸菌O157のスクリーニングは、一次分離用培地としてソルビトール・マッコンキー寒天培地(SMAC)が用いられている。
ソルビトール非発酵性もしくは遅発酵性の、疑わしいコロニー(無色〜白色)を目視的に観察し、疑わしいコロニーを生化学的および血清学的検査により腸管出血性大腸菌O157と確認する。
【0006】
▲2▼ MUG加SMAC寒天培地
ソルビトール陰性、β−グルクロニダーゼ陰性のコロニーを明らかにするための培地である。β−グルクロニダーゼ活性の確認用としてMUG(4−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド)が添加される。
【0007】
▲3▼ BCIG加SMAC寒天培地
ソルビトール陰性、β−グルクロニダーゼ陰性のコロニーを明らかにするための培地である。β−グルクロニダーゼ活性の確認用としてBCIG(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシル−D−β−グルクロニド)が添加される。
【0008】
▲4▼ フルオロカルト大腸菌O157:H7寒天培地(商品名:関東化学(株))ソルビトール陰性、MUG陰性およびH2S陰性のコロニーを明らかにするための、ソルビトール、MUGおよびチオ硫酸ナトリウム含有培地である。
【0009】
(2)選択分離培地
CT−SMAC寒天培地
2種類の阻害剤(セフィキシムおよび亜テルル酸カリウム)を含有する、SMAC由来の培地である。これらの阻害剤はソルビトールを発酵しない多くの微生物、例えばプロテウス属、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、プロビデンシア属、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)等の発育を阻止するので、培地をより選択的なものにする。
【0010】
しかしながら前記(1)の分離培地は、腸管出血性大腸菌O157が他の共存微生物に比べ、保菌者糞便中および食品検体中に少量しか存在せずかつ類似の性状を示す偽陽性菌が多く含まれるため、感度および特異性が悪いという問題点があった。
【0011】
また、前記(2)の選択分離培地は、腸管出血性大腸菌O157以外のソルビトール非発酵菌および遅発酵菌、特に緑膿菌が高率に分離されてくる。それ故、このような選択分離培地から腸管出血性大腸菌O157を疑うコロニーを鑑別するのは熟練された技術が必要とされるため、コロニー性状から腸管出血性大腸菌O157の有無を判断することは困難となり、その後の同定試験の結果を待たざるを得ないという問題点があった。
【0012】
さらに、特開2000−342249の培地では、緑膿菌の発育を抑制することができず、緑膿菌による汚染が高い場合には、目的とする腸管出血性大腸菌O157が分離できない。また、腸管出血性大腸菌O157の発育阻害が認められるため、偽陰性が高く出る傾向にあった。
【0013】
一方、従来の腸管出血性大腸菌O157の検出は一般的には以下のような方法で行われている。
(1)食品検体の場合
検体を前培養培地ノボビオシン加mECブイヨンで42℃で18〜24時間前培養する。この前培養液の一部を腸管出血性大腸菌O157選択分離培地または分離培地に塗抹し、37℃、18〜24時間培養し、平板培地上のコロニーを観察する。さらに平板培地上の腸管出血性大腸菌O157と思われるコロニーを釣菌し、腸管出血性大腸菌O157同定キットや生化学性状検査用鑑別培地に接種し、37℃、18〜24時間培養し同定する。またこれらのコロニーや増菌液を用いて、抗血清による免疫学的試験やPCR法も行われている。
【0014】
(2)糞便検体の場合
糞便検体の一部を直接、腸管出血性大腸菌O157選択分離培地または分離培地に塗抹し、37℃、18〜24時間培養し、平板培地上のコロニーを観察する。さらに平板培地上の腸管出血性大腸菌O157と思われるコロニーを釣菌し、腸管出血性大腸菌O157同定キットや生化学性状検査用鑑別培地に接種し、37℃、18〜24時間培養し同定する。またこれらのコロニーを用いて、抗血清による免疫学的試験やPCR法も行われている。
かかる方法では、検査工程に分離培地もしくは選択分離培地を用いた分離培養という操作が必要なため、前述のごとく腸管出血性大腸菌O157に類似したコロニーを識別するのは困難である。特に緑膿菌が類似コロニーとして分離され、その後の同定試験の結果を待たなければならないという問題点があった。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、上記問題を解決し、糞便をはじめとする種々の検体中の大腸菌、特に腸管出血性大腸菌O157を感度良く、特異的かつ簡便に検出できる培地および分離方法を提供することにある。
【0016】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、基本培地に選択剤を含有させることにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0021】
さらに、本発明は、前記培地のためのキットに関する。
【0022】
またさらに、本発明は、対象とする大腸菌の生育を抑制せずかつシュウドモナス属細菌の生育を抑制する選択剤を含む培地で試料を培養し、シュウドモナス属細菌の生育を抑制し大腸菌を選択的に分離することを特徴とする、大腸菌の選択分離方法であって、試料が糞便であること、大腸菌が腸管出血性大腸菌O157であること、および選択剤がセフィキシム、亜テルル酸塩およびセフスロジンであることを特徴とする、大腸菌の選択分離方法に関する。
【0023】
したがって、本発明によれば、偽陽性菌の混在による取りこぼしを回避することができ(高感度かつ特異的)、かつ大腸菌、特に腸管出血性大腸菌O157同定キットや生化学性状検査用鑑別培地に接種し同定する費用の削減に大きく貢献でき、さらには操作の手間および時間を削減でき、実用上意義深いものと言える。
【0024】
【発明の実施の形態】
本発明における対象とする大腸菌は、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌など種々の大腸菌に適用することができるが、食中毒の原因菌とされている腸管出血性大腸菌O157が好適に用いられる。
【0025】
本発明の選択剤で生育が抑制されるシュウドモナス属細菌は、Psedomonas.aeruginosa(緑膿菌)、P.fluorescens、P.cepacia、など種々の菌種があるが、腸管出血性大腸菌O157を選択的に分離する場合、緑膿菌の生育が好適に抑制される。
【0026】
本発明による培地は、対象とする大腸菌が感度よく生育する組成の培地であればいずれでもよい。具体的には、CT−SMAC寒天培地、SMAC培地、MUG加SMAC寒天培地培地、BCIG加SMAC寒天培地、フルオロカルト大腸菌O157:H7寒天培地(商品名:関東化学(株))、これらの培地に改変を加えたもの、例えば糖類を改変するなどした培地などが用いられる。中でも他の共存微生物の生育を抑制できるCT−SMAC寒天培地が好ましい。これらの培地は、培養に影響を与えないものであれば、寒天状、粉末状または液状のいずれの状態にも用いられる。
【0027】
本発明に用いられる選択分離培地の調製方法は、前記基本培地に精製水を加えて一定量とし、高圧滅菌後、冷却し、一定量の添加剤を添加することにより調製できる。具体的には、例えばSMAC寒天培地51.5gを精製水で1000mLとし、121℃で15分間滅菌する。滅菌後、約50℃に冷却し、セフィキシム0.05mg/L、亜テルル酸カリウム2.5mg/L、セフスロジン5mg/Lの濃度になるように添加して調製できる。
【0028】
本発明に用いられる選択剤は、セフィキシム、亜テルル酸塩およびシュウドモナス属の生育を抑制し、大腸菌の生育を抑制しない抗生物質を含むものをいい、対象とする大腸菌の分離、培養に悪影響を与えないものであれば、他に何を含んでいてもよい。
【0029】
また、選択剤で用いられる亜テルル酸塩は、アルカリ金属やアルカリ土類金属の塩、たとえば、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩などが用いられる。使用勝手の観点からカリウム塩が好適に用いられる。その濃度は、対象とする大腸菌の分離、培養に影響を与えない濃度であればよく、好ましくは0.5〜5mg/L、より好ましくは1〜3mg/L、さらに好ましくは2〜2.5mg/Lである。
【0030】
選択剤で用いられるセフィキシムの濃度は、対象とする大腸菌の分離に影響を与えない濃度であればよく、好ましくは0.01〜0.19mg/L、より好ましくは0.03〜0.10mg/Lである。
【0031】
CT−SMAC寒天培地のように、セフィキシム、亜テルル酸塩を既に含んでいる基本培地にあっては、対象とする大腸菌の分離、培養に影響を与えなければ、本発明による選択剤を加えてもよく、抗生物質のみを加えてもよい。一方、SMAC寒天培地のように、セフィキシムおよび亜テルル酸塩を含まない基本培地にあっては、本発明による選択剤を加えることにより選択的に対象とする大腸菌のみを分離することができる。
【0032】
本発明に用いられる抗生物質は、対象とする微生物の生育を抑制せず、シュウドモナス属細菌の生育を抑制するものであれば何れでも良く、セフスロジン、セフトリアキソン、セフピラミド、セフォタキシム、セフタジジム、セフピミゾール、セフチゾキシム、セフメノキシムなどのセフェム系、ノボビオシン、バンコマイシン類などのテトラサイクリン系、ピペラシリン、カルベニシリンなどのペニシリン系などが用いられる。対象とする大腸菌が腸管出血性大腸菌O157であれば、緑膿菌の生育をほぼ完全に抑制するセフスロジンまたはノボビオシンが好ましく、より好ましくはセフスロジンが用いられる。これらの抗生物質は塩の形で用いることもできる。また、使用する抗生物質は、単独でもよく、複数を組み合わせてもよい。
【0033】
選択剤として用いられる抗生物質の濃度は、シュウドモナス属細菌の生育を抑制する濃度であればよく、セフスロジンの場合、0.5〜100mg/Lが好ましく、より好ましくは0.78〜50mg/L、さらに好ましくは1.56〜25mg/Lである。また、ノボビオシンの場合、好ましくは5〜50mg/L、より好ましくは15〜30mg/L、さらに好ましくは20〜25mg/Lである。
【0034】
本発明による微生物の分離方法は、糞便を始めとする生体由来試料、食品由来試料、それら試料の増菌培養液などを前記のごとく調整した選択分離培地へ白金耳等を用いて塗抹し、35℃〜37℃で18〜24時間培養することにより目的とする微生物を分離することができる。
【0035】
また、本発明を実施するための試薬及び器材を携帯可能なキットの形態にしておくことは利便性の点で好ましい。このキットに、大腸菌を選択的に分離する試薬、例えば、選択剤、基礎培地、などの他、便検体摂取に必要な採便容器や採便棒、食品検査等の増菌培養に必要なストマック袋や増菌培地、また分離培養に必要な白金耳を持ち運び可能な容器に収納したものは、作業の簡便化および効率化の面においてさらに好ましい。さらに、選択剤、たとえばセフスロジン、セフィキシム、亜テルル酸塩の三剤のみを持ち運び可能な容器に収納したものも作業の簡便化、効率化の面で好ましい。
【0036】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例1〕
培地の作成
SMAC寒天培地(51.5g)に精製水を加え全量を1000mLとし、高圧滅菌(121℃、15分間)にかけた。約50℃に冷却し、以下に示す組成の本培地A添加試薬、本培地B添加試薬および対象となるCTを既定量添加した。試薬を良く混和し、シャーレに18mLずつ分注し、平板を作成した。
【0037】
本培地の基本組成(培地1000mLあたり)
ペプトン(20g)、ソルビトール(10g)、胆汁酸塩(1.5g)、塩化ナトリウム(5g)、ニュートラルレッド(0.03g)、クリスタルバイオレット(0.001g)、寒天(15g)、pH=7.1±0.1
【0038】
本培地Aの添加試薬(培地1000mLあたり)
亜テルル酸カリウム(2.5mg)、セフィキシム(0.05mg)、セフスロジン(5mg)
【0039】
本培地Bの添加試薬(培地1000mLあたり)
亜テルル酸カリウム(2.5mg)、セフィキシム(0.05mg)、ノボビオシン(20mg)
【0040】
対象となるCT添加試薬(培地1000mLあたり)
亜テルル酸カリウム(2.5mg)、セフィキシム(0.05mg)
【0041】
〔実施例2〕
腸管出血性大腸菌O157発育支持能結果
試験菌株懸濁液の希釈率を変え、各培地における腸管出血性大腸菌O157発育支持能を比較した。試験方法は、以下のように行った。
各種試験菌株をトリプトンソーヤ寒天培地(商品名:関東化学株式会社)に前培養(35℃、一夜培養)し、得られた集落を滅菌生理食塩水に懸濁させる。各試験菌株懸濁液を10−7まで10倍段階希釈し、各希釈系列を評価培地へ滴下(20μL)し培養する(35℃、18〜24時間)。
【0042】
結果を表1に示す。表1は各培地における試験菌株懸濁液の各希釈倍率における発育菌数、色及びコロニーのサイズを示している。発育菌数の計測ができない場合は、++(一部コロニー融合のため計測不可)および+++(ほとんどコロニー融合のため計測不可)で表記した。表1より、培地Aおよび培地Bは、培地CTと比較して同等かそれ以上に腸管出血性大腸菌O157が発育することが分った。また、コロニーサイズも同等であった。
【0043】
【表1】
【0044】
〔実施例3〕
代表腸内細菌発育阻害能結果
実施例1で調製した培地を用い、代表的な腸内細菌の発育阻害能を比較した。試験方法は、実施例2と同様に行った。結果を表2に示す。表2は、各培地における試験菌株懸濁液の各希釈倍率における発育菌数、色及びコロニーのサイズを示している。
表2より、培地A、培地BともにCT添加培地と同様に各種腸内細菌の発育を抑制することが分った。
【0045】
【表2】
【0046】
〔実施例4〕
緑膿菌発育阻害能結果
実施例1で調製した培地を用い、緑膿菌の発育阻害能を比較した。試験方法は、実施例2と同様に行った。表3は、各培地における緑膿菌の試験菌株懸濁液の各希釈倍率における発育菌数、色及びコロニーのサイズを示している。発育菌数の計測ができない場合は、++(一部コロニー融合のため計測不可)および+++(ほとんどコロニー融合のため計測不可)で表記した。発育コロニーが微小のため計測できないものは、「±」で示した。
表3より、培地Aはいずれの希釈倍率においても緑膿菌の発育が抑制されることがわかった。また、培地Bでは、希釈倍率10−4で緑膿菌の発育を完全に抑制できることがわかった。したがって、CT培地と比較して、目的とする大腸菌O157を選択的に分離することができた。
【0047】
【表3】
【0048】
〔実施例5〕
腸管出血性大腸菌O157の分離例
成人便1gに対して103−104CFUになるように腸管出血性大腸菌O157を接種し、滅菌生理食塩水を用いて10倍希釈して擬似的に陽性便を作成する。10μLを採取して本発明培地に直接塗抹接種し、35℃で18時間培養した。本発明培地では腸管出血性大腸菌O157と推定されるコロニーが純培養状に生育した。これらのコロニーを釣菌し、大腸菌O157検出キット「UNI」(商品名:関東化学(株))を用いて免疫学的にO157抗原を調べたところ、全て陽性であることが確認された。
【0049】
【発明の効果】
以上のように本発明は、大腸菌、特に腸管出血性大腸菌O157を特異的、高感度かつ簡便に分離することができ、他の偽陽性菌の試験に要していた試薬類の費用、操作の手間および時間を削減できる。また、保菌者検索や汚染された食材や食品を的確に検出でき、食品の安全性および検査費用削減に大きく貢献できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a selective separation medium for Escherichia coli, particularly enterohemorrhagic Escherichia coli O157, which is a causative bacterium of the third class of infectious diseases.
[0002]
[Prior art]
In the treatment of infectious diseases caused by Escherichia coli, it is important to identify the causative bacteria of the infectious diseases and to quickly carry out treatment suitable for the causative substances. Among enterohemorrhagic E. coli, serotype O157, in particular, is responsible for many food poisonings in the United States, Canada and Europe. In Japan as well, various food ingredients (particularly beef) are involved in these food poisonings since the large-scale food poisoning in 1996.
This Escherichia coli causes hemorrhagic colitis characterized by bloody diarrhea and can lead to very severe renal complications (hemolytic uremic disease), which is a major public health challenge Yes. In particular, enterohemorrhagic Escherichia coli O157 is carried out with emphasis on carrier search (fecal inspection) and food quality inspection mainly by food workers.
[0003]
When infection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 is suspected or when searching for carriers, it is necessary to separate intestinal hemorrhagic Escherichia coli O157 using fecal material or the like as a test material for a definitive diagnosis. In this case, the enterohemorrhagic Escherichia coli O157 selective separation medium is required. The selective separation medium is a general term for media devised so that only the target microorganism can grow as much as possible. When using a test material that may contain a large amount of various intestinal bacteria such as fecal material, Selection performance is particularly important. In general, a selective medium is used as a selective separation medium in which a substance that acts as a selective substance and acts on the microorganisms that coexist and does not affect the growth of the target microorganism is added.
[0004]
For example, food samples and fecal samples contain many microorganisms other than enterohemorrhagic Escherichia coli O157, and in order to separate and culture enterohemorrhagic Escherichia coli O157 from these, a selective separation medium must be used. . Prior art separation media or selective separation media are as follows:
(1) Separation medium {circle around (1)} SMAC (Sorbitol MacConkey) agar medium It is used for testing all microorganisms that are gram-negative and non-fermentable or slow-fermentable with sorbitol. Antibiotics may be added due to low selectivity, but false positives due to non-sorbitol or slow-fermenting bacteria cannot be excluded. By adding a fluorogenic compound or a chromogenic compound as a differentiation reagent, microorganisms (essentially typical E. coli) producing β-glucuronidase can be removed.
Most of the enterohemorrhagic E. coli O157 isolated from the patient does not ferment sorbitol after 24 hours. Moreover, it does not have β-glucuronidase activity. Utilizing these properties, screening of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 in clinical or food specimens uses sorbitol / Macconkey agar (SMAC) as the primary separation medium.
The sorbitol non-fermentable or slow fermentable suspicious colonies (colorless to white) are visually observed, and the suspicious colonies are confirmed as enterohemorrhagic Escherichia coli O157 by biochemical and serological tests.
[0006]
(2) MUG-added SMAC agar medium A medium for clarifying sorbitol-negative and β-glucuronidase-negative colonies. MUG (4-methylumbelliferyl-β-glucuronide) is added for confirmation of β-glucuronidase activity.
[0007]
(3) BCIG-added SMAC agar medium It is a medium for clarifying sorbitol negative and β-glucuronidase negative colonies. BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-D-β-glucuronide) is added for confirmation of β-glucuronidase activity.
[0008]
(4) Fluorocult E. coli O157: H7 agar medium (trade name: Kanto Chemical Co., Inc.) In a medium containing sorbitol, MUG and sodium thiosulfate to reveal sorbitol negative, MUG negative and H 2 S negative colonies is there.
[0009]
(2) Selective separation medium CT-SMAC agar medium A SMAC-derived medium containing two types of inhibitors (cefixime and potassium tellurite). These inhibitors prevent the growth of many microorganisms that do not ferment sorbitol, such as Proteus, Morganella morganii, Providencia, Hafnia albei, etc., so that the medium is more selective To.
[0010]
However, the separation medium of (1) contains a large number of false-positive bacteria that have a small amount of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 in carrier feces and food samples as compared with other coexisting microorganisms and show similar properties. Therefore, there is a problem that sensitivity and specificity are poor.
[0011]
In the selective separation medium (2), sorbitol non-fermenting bacteria and slow-fermenting bacteria other than enterohemorrhagic Escherichia coli O157, particularly Pseudomonas aeruginosa, are separated at a high rate. Therefore, it is difficult to determine the presence or absence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 from the colony properties because it is necessary to use a skillful technique to distinguish colonies suspected to enterenterohemorrhagic Escherichia coli O157 from such a selective separation medium. Therefore, there was a problem that the result of the subsequent identification test had to be waited.
[0012]
Furthermore, in the culture medium of JP 2000-342249, the growth of Pseudomonas aeruginosa cannot be suppressed, and when the contamination with Pseudomonas aeruginosa is high, the target enterohemorrhagic Escherichia coli O157 cannot be separated. Moreover, since growth inhibition of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 was observed, false negatives tended to be high.
[0013]
On the other hand, conventional detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 is generally performed by the following method.
(1) In the case of a food sample The sample is pre-cultured at 42 ° C. for 18 to 24 hours in a preculture medium novobiocin-added mEC broth. A portion of this preculture is smeared on the enterohemorrhagic Escherichia coli O157 selective separation medium or separation medium, cultured at 37 ° C. for 18-24 hours, and colonies on the plate medium are observed. Further, colonies that appear to be enterohemorrhagic Escherichia coli O157 on a flat plate medium are picked and inoculated into an enterohemorrhagic Escherichia coli O157 identification kit or a differential culture medium for biochemical property inspection, and cultured and identified at 37 ° C. for 18 to 24 hours. In addition, immunological tests using antiserum and PCR methods have been performed using these colonies and enrichment solutions.
[0014]
(2) In the case of stool specimen A part of the stool specimen is directly smeared on the enterohemorrhagic Escherichia coli O157 selective separation medium or separation medium, cultured at 37 ° C for 18-24 hours, and colonies on the plate medium are observed. Further, colonies that appear to be enterohemorrhagic Escherichia coli O157 on a flat plate medium are picked and inoculated into an enterohemorrhagic Escherichia coli O157 identification kit or a differential culture medium for biochemical property inspection, and cultured and identified at 37 ° C. for 18 to 24 hours. In addition, immunological tests using antiserum and PCR methods are also performed using these colonies.
In such a method, since an operation of separation culture using a separation medium or a selective separation medium is required for the inspection process, it is difficult to identify colonies similar to enterohemorrhagic Escherichia coli O157 as described above. In particular, there was a problem that Pseudomonas aeruginosa was isolated as a similar colony and had to wait for the result of the subsequent identification test.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to solve the above problems and provide a medium and a separation method that can detect Escherichia coli in various samples including stool, particularly enterohemorrhagic Escherichia coli O157 with high sensitivity, in a specific and simple manner. There is.
[0016]
[Means for Solving the Invention]
The present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by including a selective agent in the basic medium while advancing intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have completed the present invention.
[0021]
Furthermore, the present invention relates to a kit for the medium.
[0022]
Furthermore, the present invention provides a method for cultivating a sample in a medium containing a selective agent that does not inhibit the growth of the target Escherichia coli and inhibits the growth of Pseudomonas bacteria, A method for selective separation of Escherichia coli, characterized in that the sample is stool, Escherichia coli is enterohemorrhagic Escherichia coli O157, and the selective agents are cefixime, tellurite and cefsulosin The present invention relates to a method for selective separation of E. coli.
[0023]
Therefore, according to the present invention, it is possible to avoid spillage due to the mixture of false positive bacteria (high sensitivity and specificity), and inoculate Escherichia coli, particularly enterohemorrhagic Escherichia coli O157 identification kit and differential culture medium for biochemical property inspection. Therefore, it can greatly contribute to the reduction of the cost of identification, and further, it can reduce the labor and time of operation, which can be said to be significant in practical use.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The target Escherichia coli in the present invention can be applied to various Escherichia coli such as enterohemorrhagic Escherichia coli, enterotoxigenic Escherichia coli, intestinal invasive Escherichia coli, enteropathogenic Escherichia coli, intestinal agglutinating Escherichia coli, and the cause of food poisoning Enterohemorrhagic Escherichia coli O157, which is considered to be a bacterium, is preferably used.
[0025]
Pseudomonas bacteria whose growth is suppressed by the selective agent of the present invention are Psedomonas. aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), P. aeruginosa. fluorescens, P.M. Although there are various bacterial species such as cepacia, growth of Pseudomonas aeruginosa is suitably suppressed when the enterohemorrhagic Escherichia coli O157 is selectively separated.
[0026]
The medium according to the present invention may be any medium as long as the target Escherichia coli grows with high sensitivity. Specifically, CT-SMAC agar medium, SMAC medium, MUG-added SMAC agar medium, BCIG-added SMAC agar medium, fluorocult E. coli O157: H7 agar medium (trade name: Kanto Chemical Co., Ltd.), A medium with modification, for example, a medium modified with sugar or the like is used. Among these, a CT-SMAC agar medium that can suppress the growth of other coexisting microorganisms is preferable. These media can be used in any state of agar, powder or liquid as long as they do not affect the culture.
[0027]
The method for preparing the selective separation medium used in the present invention can be prepared by adding purified water to the basal medium to make a constant amount, cooling after autoclaving, and adding a constant amount of additives. Specifically, for example, 51.5 g of SMAC agar medium is made up to 1000 mL with purified water and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. After sterilization, it can be prepared by cooling to about 50 ° C. and adding to a concentration of cefixime 0.05 mg / L, potassium tellurite 2.5 mg / L, and cefsulodin 5 mg / L.
[0028]
The selective agent used in the present invention refers to a substance containing an antibiotic that inhibits the growth of cefixime, tellurite and Pseudomonas and does not inhibit the growth of E. coli, and has an adverse effect on the isolation and culture of the target E. coli. Anything else may be included as long as it is not.
[0029]
As the tellurite used as the selective agent, alkali metal or alkaline earth metal salts such as potassium salt, calcium salt, sodium salt, magnesium salt and the like are used. A potassium salt is preferably used from the viewpoint of ease of use. The concentration may be any concentration that does not affect the isolation and culture of the target E. coli, preferably 0.5 to 5 mg / L, more preferably 1 to 3 mg / L, and even more preferably 2 to 2.5 mg. / L.
[0030]
The concentration of cefixime used in the selection agent may be any concentration that does not affect the separation of the target Escherichia coli, preferably 0.01 to 0.19 mg / L, more preferably 0.03 to 0.10 mg / L. L.
[0031]
In the case of a basic medium that already contains cefixime and tellurite, such as CT-SMAC agar medium, the selective agent according to the present invention can be added if it does not affect the isolation and culture of the target E. coli. You may add only antibiotics. On the other hand, in a basic medium that does not contain cefixime and tellurite, such as SMAC agar medium, only the target Escherichia coli can be selectively separated by adding the selective agent according to the present invention.
[0032]
Antibiotics used in the present invention may be any antibiotics that do not inhibit the growth of the target microorganism, and inhibit the growth of Pseudomonas bacteria, such as cefsulosin, ceftriaxone, cefpyramide, cefotaxime, ceftazidime, cefpimizole, Cephems such as ceftizoxime and cefmenoxime, tetracyclines such as novobiocin and vancomycin, and penicillins such as piperacillin and carbenicillin are used. If the target Escherichia coli is enterohemorrhagic Escherichia coli O157, cefsulodin or novobiocin that suppresses the growth of Pseudomonas aeruginosa almost completely is preferable, and cefsulosin is more preferably used. These antibiotics can also be used in the form of salts. Moreover, the antibiotics to be used may be used alone or in combination.
[0033]
The concentration of the antibiotic used as the selection agent may be any concentration that suppresses the growth of Pseudomonas bacteria, and in the case of cefrosin, it is preferably 0.5 to 100 mg / L, more preferably 0.78 to 50 mg / L, More preferably, it is 1.56-25 mg / L. In the case of novobiocin, it is preferably 5 to 50 mg / L, more preferably 15 to 30 mg / L, and still more preferably 20 to 25 mg / L.
[0034]
In the method for separating microorganisms according to the present invention, a biologically-derived sample including stool, a food-derived sample, an enrichment culture solution of these samples and the like are smeared onto the selective separation medium prepared as described above using a platinum loop or the like, 35 The target microorganism can be isolated by culturing at a temperature of from 37 to 37 ° C. for 18 to 24 hours.
[0035]
In addition, it is preferable in terms of convenience that the reagents and equipment for carrying out the present invention are in the form of a portable kit. In this kit, in addition to reagents for selectively separating E. coli, for example, selective agents, basal media, etc., a stomac necessary for enrichment culture such as stool collection containers and stool collection rods necessary for stool specimen intake, food inspection A bag, an enrichment medium, or a platinum ear necessary for separation culture stored in a portable container is more preferable in terms of simplification of work and efficiency. In addition, a selective agent such as cefsulodin, cefixime, and tellurite containing only three agents in a portable container is also preferable in terms of simplification and efficiency.
[0036]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to this.
[Example 1]
Preparation of medium Purified water was added to SMAC agar medium (51.5 g) to make a total volume of 1000 mL, followed by high-pressure sterilization (121 ° C., 15 minutes). After cooling to about 50 ° C., a predetermined amount of the present medium A-added reagent, the present medium B-added reagent, and the target CT having the following composition were added. The reagent was mixed well, and 18 mL each was dispensed into a petri dish to prepare a flat plate.
[0037]
Basic composition of this medium (per 1000 mL of medium)
Peptone (20 g), sorbitol (10 g), bile salt (1.5 g), sodium chloride (5 g), neutral red (0.03 g), crystal violet (0.001 g), agar (15 g), pH = 7. 1 ± 0.1
[0038]
Reagent added to medium A (per 1000 mL of medium)
Potassium tellurite (2.5 mg), cefixime (0.05 mg), cefsulodin (5 mg)
[0039]
Reagent added to medium B (per 1000 mL of medium)
Potassium tellurite (2.5 mg), cefixime (0.05 mg), novobiocin (20 mg)
[0040]
Target CT additive reagent (per 1000 mL of medium)
Potassium tellurite (2.5 mg), cefixime (0.05 mg)
[0041]
[Example 2]
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157 growth support ability result The dilution ratio of the test strain suspension was changed, and the enterohemorrhagic Escherichia coli O157 growth support ability in each medium was compared. The test method was performed as follows.
Various test strains are precultured (35 ° C., overnight) on tryptone soya agar medium (trade name: Kanto Chemical Co., Inc.), and the resulting colonies are suspended in sterile physiological saline. Each test strain suspension is serially diluted to 10 −7 , and each dilution series is added dropwise (20 μL) to the evaluation medium and cultured (35 ° C., 18 to 24 hours).
[0042]
The results are shown in Table 1. Table 1 shows the number of growing bacteria, color, and colony size at each dilution rate of the test strain suspension in each medium. When the number of viable bacteria could not be measured, it was expressed in ++ (not measurable due to partial colony fusion) and ++++ (mostly not measurable due to colony fusion). From Table 1, it was found that intestinal hemorrhagic Escherichia coli O157 develops in medium A and medium B as compared with medium CT or higher. The colony size was also equivalent.
[0043]
[Table 1]
[0044]
Example 3
Results of inhibition of growth of representative intestinal bacteria Using the culture medium prepared in Example 1, the growth inhibition of representative enteric bacteria was compared. The test method was the same as in Example 2. The results are shown in Table 2. Table 2 shows the number of growing bacteria, color, and colony size at each dilution rate of the test strain suspension in each medium.
From Table 2, it was found that both medium A and medium B inhibit the growth of various intestinal bacteria in the same manner as the medium supplemented with CT.
[0045]
[Table 2]
[0046]
Example 4
Results of inhibition of growth of Pseudomonas aeruginosa Using the medium prepared in Example 1, the growth inhibition of Pseudomonas aeruginosa was compared. The test method was the same as in Example 2. Table 3 shows the number of viable bacteria, color and colony size at each dilution rate of the test strain suspension of Pseudomonas aeruginosa in each medium. When the number of viable bacteria could not be measured, it was expressed in ++ (not measurable due to partial colony fusion) and ++++ (mostly not measurable due to colony fusion). Those that cannot be measured due to small growth colonies are indicated by “±”.
From Table 3, it was found that growth of Pseudomonas aeruginosa was suppressed at medium A at any dilution rate. Moreover, in the culture medium B, it turned out that the growth of Pseudomonas aeruginosa can be completely suppressed by dilution factor 10-4 . Therefore, the target Escherichia coli O157 could be selectively separated as compared with the CT medium.
[0047]
[Table 3]
[0048]
Example 5
Example of Isolation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157 Intestinal hemorrhagic Escherichia coli O157 is inoculated to 10 3 -10 4 CFU per 1 g of adult stool, diluted 10-fold with sterile physiological saline, and pseudo positive stool Create 10 μL was collected, smeared directly on the medium of the present invention, and cultured at 35 ° C. for 18 hours. In the culture medium of the present invention, a colony presumed to be enterohemorrhagic Escherichia coli O157 grew in a pure culture state. These colonies were picked and immunologically examined for O157 antigen using an E. coli O157 detection kit “UNI” (trade name: Kanto Chemical Co., Inc.), all were confirmed to be positive.
[0049]
【The invention's effect】
As described above, the present invention can isolate Escherichia coli, particularly enterohemorrhagic Escherichia coli O157 specifically, highly sensitively and easily, and the cost and operation of reagents required for testing other false-positive bacteria. Save time and effort. In addition, searching for carriers and accurately detecting contaminated foods and foods can greatly contribute to food safety and cost reduction.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002075166A JP4196318B2 (en) | 2002-02-13 | 2002-02-13 | Selective separation medium for E. coli and separation method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002075166A JP4196318B2 (en) | 2002-02-13 | 2002-02-13 | Selective separation medium for E. coli and separation method |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003235545A JP2003235545A (en) | 2003-08-26 |
JP2003235545A5 JP2003235545A5 (en) | 2005-08-11 |
JP4196318B2 true JP4196318B2 (en) | 2008-12-17 |
Family
ID=27785184
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002075166A Expired - Lifetime JP4196318B2 (en) | 2002-02-13 | 2002-02-13 | Selective separation medium for E. coli and separation method |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4196318B2 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5354564B2 (en) * | 2008-03-24 | 2013-11-27 | 静岡県 | Medium for simultaneous detection of E. coli O26 and O157 and detection method thereof |
JP5726410B2 (en) * | 2008-09-01 | 2015-06-03 | 栄研化学株式会社 | Medium for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli and detection method |
-
2002
- 2002-02-13 JP JP2002075166A patent/JP4196318B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2003235545A (en) | 2003-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ng et al. | The laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae | |
DK175229B1 (en) | For a wanted microbe specific medium for detecting the presence or absence of a wanted microbe as well as a method for detecting the presence or absence of a wanted microbe in an environmental sample or a ...... | |
Merlino et al. | Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species | |
EP0871854B1 (en) | Medium for detecting enterococci in a sample | |
Tortorello et al. | Antibody-direct epifluorescent filter technique for rapid, direct enumeration of Escherichia coli O157: H7 in beef | |
Okrend et al. | Use of 5-Bromo-4-Chloro-3-lndoxyl-β-D-Glucuronide in MacConkey Sorbitol Agar to Aid in the Isolation of Escherichia coli 0157: H7 from Ground Beef | |
AU2003283484C1 (en) | Method for detecting and counting micro-organisms in a sample | |
CA2027536C (en) | Method for determination of e.coli in water | |
Blood et al. | Media for ‘total’Enterobacteriaceae, coliforms and Escherichia coli | |
Ottaviani et al. | Occurrence and characterization of Aeromonas spp. in mussels from the Adriatic Sea | |
EP2344663A2 (en) | Reaction medium for staphylococcus aureus bacteria | |
JP6810518B2 (en) | A long-term storage medium for culturing obligately anaerobic or microaerobic bacteria in an aerobic environment and a method for detecting obligately anaerobic or microaerobic bacteria using the same medium. | |
WO1992017607A1 (en) | Salmonella-selective plating medium | |
Owen et al. | A comparison of strains of King's group IIb of Flavobacterium with Flavobacterium meningosepticum | |
AU2006263725B2 (en) | Reaction medium for Vibrio bacteria | |
WO1996014432A2 (en) | Medium for detecting target microbes in a sample | |
JP4196318B2 (en) | Selective separation medium for E. coli and separation method | |
Özkalp | Isolation and identification of Salmonellas from different samples | |
Ewing | Isolation and Identification of Salmonella [and] Shigella | |
JP3380956B2 (en) | Staphylococcus aureus detection medium | |
JP2020089309A (en) | Medium for detecting or enriching clostridium perfringens and method for detecting or enriching the same | |
Kudaer et al. | Molecular Epidemiology genes detection of Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates from the Adult Patients with Comorbidities in Baghdad hospitals | |
JP7229474B2 (en) | Semi-solid selection medium | |
Farber | Potential use of membrane filters and a fluoregenic reagent-based solid medium for the enumeration of Escherichia coli in foods | |
Ryser et al. | Conventional methods to detect and isolate Listeria monocytogenes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050118 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070529 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070727 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071022 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080318 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080417 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20080717 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080819 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080918 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4196318 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121010 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131010 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |