JP4189494B2 - Nitrophenol compound degrading enzyme gene - Google Patents
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Description
本発明は、ニトロフェノール類化合物分解酵素をコードする遺伝子、またはその遺伝子がコードする酵素の製造方法に関する。本発明はまた、上記遺伝子から得られる酵素によるフェノール類化合物の分解方法に関する。 The present invention relates to a gene encoding a nitrophenol compound-decomposing enzyme or a method for producing an enzyme encoded by the gene. The present invention also relates to a method for decomposing a phenol compound by an enzyme obtained from the above gene.
ニトロ化芳香族化合物は工業的には薬品の原料として、染料として、またトリニトロトルエン(TNT)のように爆薬として生産・使用され、さらに農業的にはパラチオンに代表される農薬(殺虫剤)として広く使われてきたが、近年、他の難分解性芳香族化合物と同様に環境汚染物質として問題となっている。特に4-ニトロフェノールは農薬として使われたパラチオン、メチルパラチオンから環境中で比較的容易に酸化されて生成し、土壌中などに広く残存している事が示されている。このような汚染環境の浄化、あるいは工業廃液などの浄化にはこれらの化合物を分解できる微生物を活用することが期待されている。 Nitrated aromatic compounds are industrially produced and used as raw materials for chemicals, as dyes, and as explosives such as trinitrotoluene (TNT), and as agricultural chemicals (insecticides) represented by parathion. Although it has been widely used, in recent years it has become a problem as an environmental pollutant like other persistent organic compounds. In particular, 4-nitrophenol is produced from parathion and methylparathion, which are used as agricultural chemicals, by being oxidized relatively easily in the environment, and has been shown to remain widely in soil. It is expected that microorganisms capable of decomposing these compounds will be utilized for purification of such polluted environments or industrial waste liquids.
微生物を用いた汚染環境修復技術、いわゆるバイオレメディエーションは、環境低負荷型の浄化技術として注目されている。ニトロフェノール類化合物の微生物分解は、4-ニトロフェノールを中心に研究されており、これまでに4-ニトロフェノールの分解あるいは資化能を有するいくつかの細菌が既に報告されている(例えば、Kadiyala,
V. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64: 2479-2484; Jain, R. K. et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 3030-3032; Chauhan, A. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2000. 270: 733-740; Chauhan, A. et al., J. Appl.
Microbiol. 2000. 88: 764-772; Leung, K. T. et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999.
173: 247-253; Takeo, M. et al., J. Biosci. Bioeng. 2003. 95: 139-145; 及びSpain,
J. C. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57: 812-819参照)。
Pollution environment repair technology using microorganisms, so-called bioremediation, has attracted attention as a low environmental load purification technology. Microbial degradation of nitrophenol compounds has been studied mainly with 4-nitrophenol, and several bacteria having the ability to degrade or assimilate 4-nitrophenol have been reported so far (for example, Kadiyala ,
V. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64: 2479-2484; Jain, RK et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 3030-3032; Chauhan, A. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2000. 270: 733-740; Chauhan, A. et al., J. Appl.
Microbiol. 2000. 88: 764-772; Leung, KT et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999.
173: 247-253; Takeo, M. et al., J. Biosci. Bioeng. 2003. 95: 139-145; and Spain,
JC et al., Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57: 812-819).
これまでに図1に示すような二つの経路での4-ニトロフェノール分解が報告されている(化合物名:A, 4-Nitrophenol (4-NP);
B, Benzoquinone; C, Hydroquinone; D, Hydroxymuconic semialdehyde; E,
4-Nitrocatechol (4-NCA); F, 1,2,4-Trihydroxybenzene (Hydroxyquinol, HQ); G,
Maleylacetate (MA); H, beta-Ketoadipate)。図1の経路の上側に示した化合物ABCD-GHを経由する分解経路は、Pseudomonas,
Burkholderia属細菌などの主にグラム陰性細菌で、また下側に示した化合物AEF-GHを経由する分解経路はBacillus, Arthrobacter属細菌などの主にグラム陽性細菌で示されている。しかしこれらの報告のいずれにおいても代謝経路の決定、あるいは一部の代謝酵素の精製と解析にとどまっており、遺伝子レベルでの4-ニトロフェノールの分解酵素、分解経路の解析は報告されていない。従って微生物あるいは微生物由来の酵素、組換え微生物などを4-ニトロフェノールの効率的な分解に用いるには、その代謝に関わる遺伝子を単離・解析し、応用することが強く期待される。
B, Benzoquinone; C, Hydroquinone; D, Hydroxymuconic semialdehyde; E,
4-Nitrocatechol (4-NCA); F, 1,2,4-Trihydroxybenzene (Hydroxyquinol, HQ); G,
Maleylacetate (MA); H, beta-Ketoadipate). The degradation pathway via compound ABCD-GH shown above the pathway in FIG. 1 is Pseudomonas,
The degradation pathway via the compound AEF-GH shown mainly in gram-positive bacteria such as Bacillus and Arthrobacter is shown mainly in gram-negative bacteria such as Burkholderia bacteria. However, in any of these reports, determination of metabolic pathways or purification and analysis of some metabolic enzymes is limited, and analysis of 4-nitrophenol degrading enzymes and degradation pathways at the gene level has not been reported. Therefore, in order to use microorganisms, microorganism-derived enzymes, recombinant microorganisms, etc. for efficient degradation of 4-nitrophenol, it is strongly expected to isolate, analyze and apply genes involved in their metabolism.
本発明は、新規な4-ニトロフェノール分解酵素をコードする遺伝子、およびこの遺伝子が発現する酵素を用いた4-ニトロフェノールの分解方法を提供することを目的とする。また、本発明は上記遺伝子のスクリーニング方法を提供することも目的とする。 It is an object of the present invention to provide a gene encoding a novel 4-nitrophenol degrading enzyme and a method for degrading 4-nitrophenol using an enzyme expressed by this gene. Another object of the present invention is to provide a screening method for the above gene.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、4-ニトロフェノール資化性菌から新規なニトロフェノールの分解に関与する酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、これらの遺伝子がコードする酵素が多種のニトロフェノール類化合物等に対して分解性を示すという知見を得て、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors succeeded in isolating a gene encoding an enzyme involved in the degradation of a novel nitrophenol from 4-nitrophenol-utilizing bacteria. The present invention was completed by obtaining the knowledge that the enzyme encoded by this gene is degradable to various nitrophenol compounds and the like. That is, the present invention is as follows.
（1）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質
(1) A gene encoding the following protein (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having reductase activity
（2）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである（1）記載の遺伝子。 (2) The gene according to (1), wherein the protein is a reductase component of nitrophenol monooxygenase.
（3）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(3) A gene encoding the following protein (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
(b) a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having oxygenase activity
（4）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキゲナーゼコンポーネントである（3）記載の遺伝子。 (4) The gene according to (3), wherein the protein is an oxygenase component of nitrophenol monooxygenase.
（5）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
(5) A gene encoding the following protein (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
(b) a protein having a hydroxyquinol dioxygenase activity, comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
（6）以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(6) A gene comprising the following DNA (c) or (d):
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(d) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having reductase activity
（7）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである（6）記載の遺伝子。 (7) The gene according to (6), wherein the protein is a reductase component of nitrophenol monooxygenase.
（8）以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号3に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号3に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(8) A gene comprising the following DNA (c) or (d):
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
(d) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encodes a protein having oxygenase activity
（9）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネントである（8）記載の遺伝子。 (9) The gene according to (8), wherein the protein is an oxygenase component of nitrophenol monooxygenase.
（10） 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号5に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号5に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(10) A gene comprising the following DNA (c) or (d):
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5
(d) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and has hydroxyquinol dioxygenase activity DNA
（11）上記（1）〜（10）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むベクター。 (11) A vector comprising at least one gene selected from the genes described in (1) to (10) above.
（12）上記（11）記載のベクターを含む形質転換体。 (12) A transformant comprising the vector according to (11) above.
（13）以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質との複合体からなるモノオキシゲナーゼ酵素。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつレダクターゼ活性を有するタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
(13) A monooxygenase enzyme comprising a complex of the following protein (a) and protein (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a reductase activity
(b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having oxygenase activity .
（14）(a)のタンパク質が、該タンパク質以外のレダクターゼ活性を有するタンパク質により置換されたものである、（13）記載の酵素。 (14) The enzyme according to (13), wherein the protein of (a) is substituted with a protein having reductase activity other than the protein.
（15）配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなるハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素。 (15) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and hydroxyquinol dioxygenase A hydroxyquinol dioxygenase enzyme comprising an active protein.
（16）上記（12）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からモノオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、モノオキシゲナーゼ酵素の製造方法。 (16) A method for producing a monooxygenase enzyme, comprising culturing the transformant according to (12) above and collecting the monooxygenase enzyme from the obtained culture.
（17）上記（12）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素の製造方法。 (17) A method for producing a hydroxyquinol dioxygenase enzyme, comprising culturing the transformant according to (12) and collecting a hydroxyquinol dioxygenase enzyme from the obtained culture.
（18）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（13）若しくは（14）に記載の酵素とフェノール/カテコール類化合物とを接触させることを特徴とする、フェノール又はカテコール類化合物の分解方法。 (18) Decomposition of phenol or catechol compound characterized by contacting the transformant according to (12) and / or the enzyme described in (13) or (14) with a phenol / catechol compound. Method.
（19）フェノール又はカテコール類化合物が、ニトロフェノール、クロロフェノール、ニトロカテコール及びクロロカテコールからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物であることを特徴とする、（18）に記載の方法。 (19) The method according to (18), wherein the phenol or catechol compound is one or more compounds selected from the group consisting of nitrophenol, chlorophenol, nitrocatechol and chlorocatechol.
（20）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（15）に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素とハイドロキシキノールとを接触させることを特徴とする、ハイドロキシキノールの分解方法。 (20) A method for decomposing hydroxyquinol, comprising contacting the transformant according to (12) and / or the hydroxyquinol dioxygenase enzyme according to (15) and hydroxyquinol.
（21）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（13）若しくは（14）に記載の酵素を含有することを特徴とするフェノール又はカテコール類化合物の分解剤。 (21) A phenol or catechol compound decomposing agent comprising the transformant according to (12) and / or the enzyme according to (13) or (14).
（22）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（15）に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を含有することを特徴とするハイドロキシキノール分解剤。 (22) A hydroxyquinol decomposing agent comprising the transformant according to (12) and / or the hydroxyquinol dioxygenase enzyme according to (15).
（23）配列番号7に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号8に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット。 (23) including a primer consisting of at least 12 consecutive base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of at least 12 consecutive base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 Primer set.
（24）配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列若しくはそれらの相補配列及び/又は配列番号2、4若しくは6に示されるアミノ酸配列に基づいて設計されるプライマーであって、ニトロフェノール、ニトロカテコール及びハイドロキシキノール代謝遺伝子の全部又は一部を増幅することができるプライマーを含むプライマーセット。 (24) A primer designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or a complementary sequence thereof and / or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, comprising nitrophenol, nitro A primer set comprising primers capable of amplifying all or part of catechol and hydroxyquinol metabolic genes.
（25）ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAを鋳型として、（23）又は（24）記載のプライマーセットを用いて前記総DNAを増幅することを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。 (25) A nitrophenol, wherein the total DNA obtained from a nitrophenol-degrading or assimilating bacterium is used as a template to amplify the total DNA using the primer set according to (23) or (24) , A screening method for nitrocatechol or hydroxyquinol metabolic genes.
（26）配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列又はその相補配列のうち少なくとも一部の配列を含むプローブを用いて、ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAに対しハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。 (26) For a total DNA obtained from a nitrophenol-degrading or assimilating bacterium using a probe comprising at least a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or a complementary sequence thereof A screening method for a nitrophenol, nitrocatechol or hydroxyquinol metabolic gene, which comprises performing hybridization.
本発明により新規のニトロフェノール分解酵素をコードする遺伝子が提供される。これらの遺伝子がコードする酵素は、フェノール類化合物を分解することができるため、ニトロフェノールなどで汚染された環境や工業廃液のバイオレメディエーションとして有用である。 The present invention provides a gene encoding a novel nitrophenol degrading enzyme. Enzymes encoded by these genes are capable of degrading phenolic compounds, and are useful for bioremediation of environments contaminated with nitrophenol and industrial waste liquids.
以下に本発明を詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.
１．ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ及びハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子
本発明者は、新規な4-Nitrophenol(4-ニトロフェノール、以下「4-NP」とも示す)代謝系遺伝子を単離するため、まずその中間代謝物であると考えられるHydroxyquinol(ハイドロキシキノール、以下「HQ」とも示す)の代謝遺伝子、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子の検索を行った。対象とする微生物として4-NP分解能を有するRhodococcus
opacus (ロドコッカス オパカス) SAO101を用いた。本菌株はジベンゾフラン/ジベンゾ-パラ-ダイオキシン分解菌として単離されたものである。
1. Nitrophenol Monooxygenase and Hydroxyquinol Dioxygenase Genes The present inventor first isolated a novel 4-Nitrophenol (4-nitrophenol, hereinafter also referred to as “4-NP”) metabolic gene. Hydroxyquinol (hydroxyquinol, hereinafter also referred to as “HQ”) metabolic gene and hydroxyquinol dioxygenase gene considered to be present were searched. Rhodococcus with 4-NP resolution as the target microorganism
opacus (Rodococcus opacus) SAO101 was used. This strain was isolated as a dibenzofuran / dibenzo-para-dioxin degrading bacterium.
ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子を単離するため、これまでに報告されている他菌株の相当遺伝子に保存されている配列を元にPCR プライマーを設計し、PCRクローニングを行った。その結果、既知のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子と相同性を有する新規の遺伝子断片の単離に成功した。またここでSAO101株から得られた遺伝子断片をプローブに用いることによって、SAO101の遺伝子ライブラリーよりその周辺領域をクローニングした。 In order to isolate the hydroxyquinol dioxygenase gene, PCR primers were designed based on the sequences conserved in the corresponding genes of other strains reported so far, and PCR cloning was performed. As a result, a novel gene fragment having homology with a known hydroxyquinol dioxygenase gene was successfully isolated. In addition, by using the gene fragment obtained from the SAO101 strain as a probe, the peripheral region was cloned from the SAO101 gene library.
この領域の塩基配列約3.5 kbを解析したところ、各種オキシゲナーゼのレダクターゼ(フラビンレダクターゼ)、クロロフェノールモノオキシゲナーゼ、およびハイドロキシキノールジオキシゲナーゼの各遺伝子と相同性を有する3つのオープンリーディングフレーム(ORF、それぞれORF1、ORF2、ORF3とした)が認められた。 Analysis of the base sequence of about 3.5 kb in this region revealed that three open reading frames (ORF, ORF1 and ORF1 each having homology with various oxygenase reductases (flavin reductases), chlorophenol monooxygenase, and hydroxyquinol dioxygenase genes. , ORF2, and ORF3).
本発明者はこれらの遺伝子が4-NPにより転写誘導され、単一の転写単位であることを証明した。さらにSAO101株のORF2、ORF3各遺伝子を不活化した遺伝子破壊株をそれぞれ構築し、4-NP分解・資化能を失うことを証明した。これらの結果からORF1-3の遺伝子がそれぞれニトロフェノールモノオキシゲナーゼ(以下「NPMO」とも示す)のレダクターゼコンポーネント(以下「NPMO・Red」とも示す)、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネント(以下「NPMO・Ox」とも示す)、及びハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(以下「HQDO」とも示す)をコードする遺伝子と同定し、nitrophenol
catabolismの略を用い、それぞれnpcB、npcA、npcCと命名した。またこれらの遺伝子、酵素がSAO101株の4-NP代謝において非常に重要な役割を果たし、さらに今後の4-NPの微生物分解に有用である可能性を示した。以下に本発明の遺伝子について説明する。
The inventor has proved that these genes are transcriptionally induced by 4-NP and are a single transcription unit. Furthermore, we constructed gene-disrupted strains in which the ORF2 and ORF3 genes of SAO101 were inactivated, and proved that they lost 4-NP degradation and assimilation ability. From these results, the genes of ORF1-3 are nitrophenol monooxygenase (hereinafter also referred to as `` NPMO '') reductase component (hereinafter also referred to as `` NPMO / Red ''), nitrophenol monooxygenase oxygenase component (hereinafter referred to as `` NPMO "and also shown), and also shows the hydro Kishiki Nord dioxygenase (hereinafter" HQDO ") identifying the genes encoding, n itro p henol
The abbreviation for c atabolism was used to name npcB, npcA, and npcC, respectively. In addition, these genes and enzymes play a very important role in the 4-NP metabolism of SAO101 strain, and it is possible that they will be useful for the future microbial degradation of 4-NP. The gene of the present invention will be described below.
配列番号1にNPMO・Red遺伝子の塩基配列を、配列番号2にNPMO・Redのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、レダクターゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。レダクターゼ活性とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート(NADPH)存在下で酸化還元反応を触媒する活性を指す。この活性はオキシゲナーゼとともに発現させ、基質に酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。 SEQ ID NO: 1 exemplifies the nucleotide sequence of the NPMO • Red gene, and SEQ ID NO: 2 exemplifies the amino acid sequence of NPMO • Red. However, as long as the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has reductase activity, a plurality of, preferably one or several amino acids may be deleted, substituted, or added in the amino acid sequence. Good. The reductase activity refers to the activity of catalyzing the redox reaction in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). This activity can be confirmed by observing the activity of expressing with oxygenase and adding oxygen to the substrate.
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。 For example, 1-10, preferably 1-5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1-10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably 1- Five amino acids may be added, or a protein in which 1-10, preferably 1-5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids is also included in the protein of the present invention. included.
配列番号3にNPMO・Ox遺伝子の塩基配列を、配列番号4にNPMO・Oxのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、NPMO・Oxとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。オキシゲナーゼ活性とは、基質との結合及び酸素添加反応を触媒する活性を持つものを指す。この機能はレダクターゼとともに発現させ、基質に酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。 SEQ ID NO: 3 exemplifies the nucleotide sequence of the NPMO • Ox gene, and SEQ ID NO: 4 exemplifies the amino acid sequence of NPMO • Ox. However, as long as the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has a function as NPMO · Ox, mutations such as deletion, substitution, addition, etc. in a plurality of the amino acid sequence, preferably one or several amino acids May occur. The oxygenase activity refers to an activity having an activity of catalyzing a binding to a substrate and an oxygen addition reaction. This function can be confirmed by observing the activity of expressing with reductase and adding oxygen to the substrate.
例えば、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号4に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。配列番号5にHQDO遺伝子の塩基配列を、配列番号6にHQDOのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。HQDO活性とは、HQに酸素を添加、環開裂を起こし、Maleylacetate(マレイルアセテート、以下「MA」とも示す)に変換する活性を持つものを指す(hydroxyquinol
1,2-dioxygenase)。この機能は基質と反応させ、生じるマレイルアセテートを検出することによって確認することができる。
For example, 1-10, preferably 1-5, amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 may be deleted, and 1-10, preferably 1--1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. 5 amino acids may be added, or 1-10, preferably 1-5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted with other amino acids in the protein of the present invention. included. SEQ ID NO: 5 exemplifies the base sequence of the HQDO gene, and SEQ ID NO: 6 exemplifies the amino acid sequence of HQDO. However, as long as the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 has a function as a hydroxyquinol dioxygenase, a plurality of amino acid sequences in the amino acid sequence, preferably one or several amino acids are deleted, substituted, added, etc. Mutations may occur. HQDO activity refers to the one that has the activity of adding oxygen to HQ, causing ring cleavage, and converting to maleylacetate (maleyl acetate, also referred to as `` MA '') (hydroxyquinol)
1,2-dioxygenase). This function can be confirmed by reacting with the substrate and detecting the resulting maleyl acetate.
例えば、配列番号6に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号6に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。 For example, 1-10, preferably 1-5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 may be deleted, and 1-10 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, preferably 1- Five amino acids may be added, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in which 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids are substituted with other amino acids is also included in the protein of the present invention. included.
上記遺伝子は、他の4-NP分解能を持つ細菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。遺伝子への変異の導入法は限定されないが、市販の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan-K
(TAKARA社製)やMutan-G (TAKARA社製))などを用いることができる。
The gene can be prepared from DNA prepared from other bacteria having 4-NP resolution by PCR using primers designed based on the base sequence of the gene. In addition, mutants of the gene of the present invention having the above functions or activities can be synthesized by site-directed mutagenesis. The method for introducing a mutation into a gene is not limited, but a mutation introduction kit using a commercially available site-directed mutagenesis method (for example, Mutan-K
(TAKARA) or Mutan-G (TAKARA)) can be used.
これらの変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が酵素活性を有するか否かは、変異タンパク質を4-NPまたはHQと反応させることによって、上記のような機能、活性を測定することにより確認することができる。さらに、上記塩基配列からなるDNAの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のNPMOもしくはHQDO遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 Whether or not the recombinant protein produced by these mutated genes has enzyme activity is confirmed by measuring the above functions and activities by reacting the mutated protein with 4-NP or HQ. be able to. Furthermore, a gene that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to all or a part of the DNA consisting of the above base sequence and encodes a protein having the respective function or activity is also an NPMO of the present invention. Or it is contained in the HQDO gene. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed . However, and several factors such as temperature and salt concentration are considered as factors that affect the stringency of hybridization, can achieve similar stringency by appropriately selecting these factors by those skilled in the art is there.
２．NPMO・Red、NPMO・Ox、及びHQDO酵素
本発明は、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼの機能を有するタンパク質等でもある。
2. NPMO • Red, NPMO • Ox, and HQDO enzyme The present invention is also a protein having a function of nitrophenol monooxygenase.
本発明のNPMO・RedまたNPMO・Ox酵素は図1に示したA-E(4-NPから 4-Nitrocatechol (4-ニトロカテコール、以下「4-NCA」とも示す))の反応、さらにE-F(4-NCAからHQ)の反応を触媒する酸化酵素(ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ)である。 The NPMO • Red or NPMO • Ox enzyme of the present invention is a reaction of AE (4-NP to 4-Nitrocatechol (4-nitrocatechol, hereinafter also referred to as “4-NCA”)) shown in FIG. It is an oxidase (nitrophenol monooxygenase) that catalyzes the reaction of NCA to HQ).
レダクターゼはNADH、NADPHなどの存在下で酸化還元反応を触媒し、オキシゲナーゼは実際に基質と反応しレダクターゼと共に酸素添加を触媒する。芳香環の酸化酵素の電子伝達コンポーネントが他の酸化酵素の電子伝達コンポーネントと置換可能である例やその可能性を示す論文はすでに報告されており(Larkin,
M. J., et al., J. Bacteriol. 1999. 181: 6200-6204; Treadway, S. L. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 1999. 51: 786-793; Kitagawa, W. et al., J. Bacteriol. 2002.
184: 509-518など参照)、このオキシゲナーゼと反応するような置換可能なレダクターゼが存在すれば、このNPMO・Oxと共にNPMOとして機能しうる。
Reductase catalyzes the redox reaction in the presence of NADH, NADPH, etc., and oxygenase actually reacts with the substrate to catalyze oxygenation with the reductase. There have already been reports of cases where the electron transfer component of an aromatic ring oxidase can be replaced with the electron transfer component of another oxidase, and papers showing its potential (Larkin,
MJ, et al., J. Bacteriol. 1999. 181: 6200-6204; Treadway, SL et al., Appl.
Environ. Microbiol. 1999. 51: 786-793; Kitagawa, W. et al., J. Bacteriol. 2002.
184: 509-518, etc.), if there is a replaceable reductase that reacts with this oxygenase, it can function as NPMO with this NPMO • Ox.
また本発明のHQDO酵素は図1に示したF-G(HQからMA)の反応を触媒する酸化酵素である。 The HQDO enzyme of the present invention is an oxidase that catalyzes the reaction of FG (HQ to MA) shown in FIG.
３．NPMO遺伝子およびHQDO遺伝子を含むベクターと宿主
本発明のベクターは、適当なベクターにNPMO・Red、NPMO・Ox遺伝子および/もしくはHQDO遺伝子を連結することにより得られる。
3. Vector containing NPMO gene and HQDO gene and host The vector of the present invention can be obtained by linking NPMO • Red, NPMO • Ox gene and / or HQDO gene to an appropriate vector.
本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。 The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, such as a plasmid, a cosmid, or a bacteriophage. Further, the host such as Escherichia coli and actinomycetes is not limited as long as the vector functions.
ベクター中に導入する上記組み合わせの遺伝子の方向及び順序は、それぞれの遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。この場合、NPMO遺伝子はレダクターゼ及びオキシゲナーゼ遺伝子の2種類を連結する必要があるが、その順序は任意でよく、方向も任意である。さらに、レダクターゼとしての活性を有する限り、この該遺伝子の代わりに他のレダクターゼをコードする遺伝子が連結されてもよく、またこれらの遺伝子は必ずしも隣接していなくてよい。また必ずしも同一のベクター上に連結する必要もなく、活性が得られるかぎり異なるベクターにおいて同時に発現、または別個に発現したものを混合するなど、遺伝子を連結するベクターの種類や数、またその形式は限定されない。 The direction and order of the genes of the above combination to be introduced into the vector may be arbitrarily selected and sequenced as long as each gene is expressed and the expressed protein can function as an enzyme. In this case, the NPMO gene needs to link two types of reductase and oxygenase genes, but the order may be arbitrary and the direction may also be arbitrary. Furthermore, as long as it has activity as a reductase, a gene encoding another reductase may be linked in place of this gene, and these genes do not necessarily have to be adjacent. In addition, it is not always necessary to link them on the same vector, and as long as the activity is obtained, the types and number of vectors to which the genes are linked and their formats are limited. Not.
４．本発明のベクターを含む形質転換体:
本発明においては、上記ベクターを含む形質転換体として、天然にNPMO遺伝子およびHQDO遺伝子をコードするDNAを含む微生物と、人為的に上記作製したベクターを導入した微生物が包含される。天然にNPMO遺伝子およびHQDO遺伝子をコードするDNAの導入に適する微生物は、ロドコッカス
オパカスSAO101株やロドコッカス オパカスYTK32株などが挙げられるがこれらに限定されない。
4). Transformant containing the vector of the present invention:
In the present invention, a transformant containing the above vector includes a microorganism that naturally contains DNA encoding the NPMO gene and the HQDO gene, and a microorganism into which the above prepared vector has been artificially introduced. Examples of microorganisms suitable for introduction of DNA encoding NPMO gene and HQDO gene naturally include Rhodococcus opacus SAO101 strain and Rhodococcus opacus YTK32 strain, but are not limited thereto.
上記作製したベクターを導入した微生物は、公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの形質転換手法により作製することができる。形質転換に使用する宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。またベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮し用いることによって、高いニトロフェノール及びハイドロキシキノール分解活性を持つ微生物を作製することが可能である。以下にNPMO・Red遺伝子、NPMO・Ox遺伝子、およびハHQDO遺伝子を高発現プラスミドベクターに組み込み、大腸菌に導入し、発現させた例を示す。高発現プラスミドベクターとしては、T7プロモーターを有するベクターがあるが、pET17bベクター(Novagen社)が好ましい。 Microorganisms into which the above-described vector has been introduced can be produced by a transformation technique such as a known electroporation method, protoplast method, calcium chloride method (spheroplast method). The host microorganism used for transformation is not particularly limited as long as it can express the gene of the present invention. In addition, microorganisms having high nitrophenol and hydroxyquinol degrading activity can be produced by considering combinations of vectors, hosts, induction substrates that induce high expression, promoters, operators, enhancers, and the like. The following shows an example in which the NPMO • Red gene, NPMO • Ox gene, and haHQDO gene are incorporated into a high expression plasmid vector, introduced into E. coli, and expressed. As a high expression plasmid vector, there is a vector having a T7 promoter, and a pET17b vector (Novagen) is preferable.
SAO101株より単離したnpcA、npcB、npcC遺伝子をPCRを用いて増幅し、それぞれpET17bベクター(Novagen社)に導入した。pET17bベクターは開始コドンとするATGとその上流にリボソームビンディングサイト(以下「RBS」とも示す)、さらに上流にT7プロモーターを含むもので、用いる遺伝子をその開始コドンと読み枠に合わせて導入することにより、他菌株からの遺伝子でも効率的な発現が期待できるものである。構築したプラスミドを宿主と
上記のように作製した大腸菌を培養し、IPTGで誘導発現させ、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析(SDS-PAGE)によって、その菌体の破砕抽出物の遠心分離後の上清にそれぞれの遺伝子の発現産物と認識されるタンパク質が高率に発現しうる。 Escherichia coli prepared as described above is cultured, inducibly expressed with IPTG, and each gene is transferred to the supernatant after centrifugation of the disrupted extract of the cells by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis (SDS-PAGE). Proteins recognized as expression products can be expressed at a high rate.
この例に限らず宿主やベクター、発現制御系などをうまく機能する様に組み合わせ用いることによって、NPMO・Red遺伝子、NPMO・Ox遺伝子、およびHQDO遺伝子を高発現する微生物の作製が可能である。 In addition to this example, a microorganism that highly expresses NPMO • Red gene, NPMO • Ox gene, and HQDO gene can be produced by using a host, a vector, an expression control system, etc. in combination so as to function well.
５．NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO酵素の製造方法
本発明において、目的のNPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
5. NPMO • Red, NPMO • Ox and HQDO enzyme production method
In the present invention, the target NPMO • Red, NPMO • Ox, and HQDO enzymes can be obtained by culturing the microorganism having the gene encoding it and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. The method of culturing the microorganism of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing microorganisms. As a medium for culturing microorganisms such as actinomycetes and bacteria, any medium that contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and that can efficiently culture microorganisms can be used. Any of synthetic media may be used.
上記で示した組み換え大腸菌の場合は当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてIPTGなどの誘導物質を加えることにより、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜抗生物質を加えたLB培地(1.0%
ペプトン、0.5% 乾燥酵母エキス、0.5% NaClから成る)で37℃、8-12時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいLB培地に容量比1-5%植菌、37℃、2-4時間本培養し、IPTGを加えさらに30℃で2-4時間培養する。
In the case of the recombinant Escherichia coli shown above, it is cultured in a nutrient medium usually used in this research field, and if necessary, an inducer such as IPTG is added to highly express the enzyme in a nutrient medium in which Escherichia coli can grow. be able to. Under normal culture conditions, LB medium (1.0%
Peptone, 0.5% dry yeast extract, 0.5% NaCl) and precultured at 37 ° C for 8-12 hours. Incubate for 2-4 hours at ℃, add IPTG, and incubate at 30 ℃ for 2-4 hours.
天然に本発明のタンパク質を有する微生物の場合、たとえばSAO101株の様な4-NPで酵素の誘導が起こる場合は、カタボライトリプレッションによる栄養培地中での該酵素の発現抑制などを考慮に入れ、炭素源を含まない合成無機塩培地に4-NPを加えた培地で培養することによって酵素の発現を行うことができる。4-NPなどの酵素の発現を引き起こす物質のみでは良好に細胞が増殖しない場合、十分な量の酵素が得られない場合がある。このような場合はいったんその微生物の増殖性が良い栄養培地で十分に培養し、増殖した菌体を無機塩培地やリン酸緩衝液、滅菌水などで洗浄した後、合成無機塩培地またはリン酸、トリスなど各種緩衝液に4-ニトロフェノールを加えた培地等に再懸濁、培養(休止菌体での反応)することによって酵素の発現を行うことができる。通常に行う例としてLB培地で30℃、1-2日培養し十分増殖させた後、滅菌水で菌体を洗浄、4-NPを加えた無機塩培地または各種緩衝液に再懸濁し、30℃で3-6時間培養する。 In the case of a microorganism naturally having the protein of the present invention, for example, when induction of an enzyme occurs in 4-NP such as SAO101 strain, taking into account the suppression of the expression of the enzyme in a nutrient medium by catabolite repression, The enzyme can be expressed by culturing in a medium in which 4-NP is added to a synthetic inorganic salt medium not containing a carbon source. If cells do not grow well with only substances that cause the expression of an enzyme such as 4-NP, a sufficient amount of enzyme may not be obtained. In such a case, after culturing sufficiently in a nutrient medium with good growth of the microorganism and washing the grown cells with an inorganic salt medium, phosphate buffer, sterilized water, etc., the synthetic inorganic salt medium or phosphate The enzyme can be expressed by resuspending and culturing (reaction with resting cells) in a medium such as Tris in which 4-nitrophenol is added to various buffers. As a typical example, after culturing in LB medium at 30 ° C. for 1-2 days, the cells are washed with sterilized water, resuspended in an inorganic salt medium or various buffers containing 4-NP, and 30 Incubate at 3 ° C for 3-6 hours.
培養後、目的の酵素のタンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。目的のタンパク質が得られたか否かは、SDS-PAGE等により確認することができる。 When the protein of the target enzyme is produced in the cells or cells after the culture, the protein is extracted by disrupting the cells or cells. When the target protein is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, The target protein can be isolated and purified from Whether or not the target protein has been obtained can be confirmed by SDS-PAGE or the like.
６．フェノール類化合物等の分解方法:
本発明のフェノール/カテコール類化合物の分解方法は、上記の微生物及び/又は酵素を利用して行うことを特徴とするものであり、具体的には、上記微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び/又は上記単離した酵素とフェノール/カテコール類化合物とを接触させる方法である。本発明において、分解対象となるフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールとしては、限定されるものではないが、4-NP、4-NCA、2,4-Dichlorophenol(2,4-ジクロロフェノール、以下「2,4-DCP」とも示す)、2,4,6-Trichlorophenol(2,4,6-トリクロロフェノール、以下「2,4,6-TCP」とも示す)、HQなどである。これらの例のうち本発明においてはHQを除いたすべてがNPMOの、HQはHQDOの直接の分解対象になるが、酵素と反応する基質はその活性を示す限り限定するものではない。
6). Decomposition methods such as phenolic compounds:
The method for decomposing a phenol / catechol compound of the present invention is characterized in that it is carried out using the above-mentioned microorganism and / or enzyme, specifically, a cultured cell or a resting cell of the above-mentioned microorganism, and / Or a method of contacting the isolated enzyme with a phenol / catechol compound. In the present invention, the phenol / catechol compounds to be decomposed and hydroxyquinol are not limited, but include 4-NP, 4-NCA, 2,4-dichlorophenol (2,4-dichlorophenol, hereinafter “ 2,4,6-Trichlorophenol (hereinafter also referred to as “2,4,6-TCP”), HQ, and the like. Of these examples, in the present invention, all except HQ are NPMO, and HQ is a target for direct degradation of HQDO, but the substrate that reacts with the enzyme is not limited as long as it shows its activity.
培養菌体又は休止菌体は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤とする。緩衝液としては種々の緩衝液を使用でき、また緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌懸濁液の濃度は、600ナノメートルの濁度で1-2が好適であり、必要に応じて増減できる。また、本方法においては、NPMO、およびHQDO酵素を利用することも可能である。上述のように単離・精製したNPMO、およびHQDO酵素を、適当な緩衝液、水等に懸濁して調製した酵素懸濁液としてフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤とする。上記菌懸濁液又は酵素懸濁液としてのフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤は、界面活性剤等その他の成分を含有してもよい。 Cultured cells or resting cells are made into a phenol / catechol compound or a hydroxyquinol decomposing agent as a cell suspension prepared by suspending in an appropriate buffer. Various buffers can be used as the buffer, and water, a medium, or the like can be used instead of the buffer. The concentration of the bacterial suspension is preferably 1-2 at a turbidity of 600 nanometers, and can be increased or decreased as necessary. In this method, NPMO and HQDO enzymes can be used. An enzyme suspension prepared by suspending the NPMO and HQDO enzymes isolated and purified as described above in an appropriate buffer solution, water, or the like is used as a phenol / catechol compound or a hydroxyquinol decomposing agent. The phenol / catechol compounds and the hydroxyquinol decomposing agent as the bacterial suspension or enzyme suspension may contain other components such as a surfactant.
上記フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤は、散布、混合又は浸漬等により、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールを分解させる対象となるサンプルに作用させることができる。対象となるサンプルとしては、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールに汚染されたものであればどのようなものであってもよく、例えば限定するものではないが、ニトロフェノール、クロロフェノール類化合物に汚染された土壌・底質等、またニトロフェノール、クロロフェノール類化合物を排出する施設の汚染部位、材料、貯蔵設備等が挙げられる。 The phenol / catechol compound and the hydroxyquinol decomposing agent can be applied to a sample to be decomposed by spraying, mixing, or dipping. The target sample may be any sample contaminated with phenol / catechol compounds or hydroxyquinol, such as, but not limited to, nitrophenol and chlorophenol compounds. Soil, sediment, etc., and contaminated sites, materials, storage facilities, etc. of facilities that discharge nitrophenol and chlorophenol compounds.
分解剤が作用する条件を選択し、分解剤を作用させた後、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールの分解率の測定は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、ガスクロマトグラフィー/質量スペクトル分析(GC/MS)などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。 After selecting the conditions under which the decomposing agent acts, the degradation rate of phenol / catechol compounds and hydroxyquinol can be measured using high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), gas chromatography. It can be performed using, for example, chromatography / mass spectrum analysis (GC / MS). Further, other analysis methods may be used together as necessary.
７．プライマーセット
本発明において、新規なHQDO遺伝子を単離するために設計したプライマーセットを以下に示す。
7). Primer set
In the present invention, primer sets designed to isolate a novel HQDO gene are shown below.
BT-F190
: 5’-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3’ (配列番号7)
BT-R706
: 5’-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3’ (配列番号8)
BT-F190
: 5'-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
BT-R706
: 5'-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3 '(SEQ ID NO: 8)
上記プライマーセットは、数種の既知HQDOのアミノ酸配列をアライメントすることにより設計した。本発明者は、このプライマーセットを用いることにより、4-NP分解性ロドコッカス属細菌2種から新規のHQDO遺伝子断片(約550
bp)を増幅することができた。従って、上記プライマーセットは新規なHQDO遺伝子のスクリーニングに利用可能である。本発明においては、配列番号7に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号8に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを組み合わせて用いることができる。
The primer set was designed by aligning several known HQDO amino acid sequences. By using this primer set, the present inventor has obtained a novel HQDO gene fragment (about 550%) from two 4-NP-degrading Rhodococcus bacteria.
bp) could be amplified. Therefore, the above primer set can be used for screening a novel HQDO gene. In the present invention, a primer consisting of at least 12 consecutive base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a primer consisting of at least 12 consecutive base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. Can be used in combination.
８．ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ等のスクリーニング方法:
配列番号1、3又は5に示される塩基配列とその相補配列、また配列番号2、4又は6に示されるアミノ酸配列の情報を利用して、本発明の遺伝子のすべてまたは一部を増幅するプライマーセットを設計することができる。このようにして設計されたPCRプライマーは、4-NP分解性・資化性を示す生物の全DNAを鋳型としてPCRすることにより、NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO遺伝子のスクリーニングに用いることができる。また土壌や河川、活性汚泥、工業廃液などから直接抽出したDNAもしくはRNAを鋳型として用いることにより本発明の遺伝子の存在や発現を診断することができる。例としてHQDO遺伝子(SAO101株のnpcC)の一部を増幅するプライマーセットを示す。
8). Screening methods such as nitrophenol monooxygenase:
Primer that amplifies all or part of the gene of the present invention using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 and its complementary sequence, or the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 You can design the set. PCR primers designed in this way can be used for screening NPMO • Red, NPMO • Ox and HQDO genes by PCR using the whole DNA of organisms exhibiting 4-NP degradability and assimilation. it can. In addition, the presence or expression of the gene of the present invention can be diagnosed by using DNA or RNA directly extracted from soil, rivers, activated sludge, industrial waste liquid or the like as a template. As an example, a primer set for amplifying a part of the HQDO gene (npcC of SAO101 strain) is shown.
HQD-F
: 5’-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3’（配列番号9）
HQD-R
: 5’-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3’（配列番号10）
このプライマーセットを用いることにより約570-bpのHQDO遺伝子の一部を増幅することができる。また次にNPMO・Ox遺伝子(SAO101株のnpcAの一部を増幅するプライマーセットを示す。
HQD-F
: 5'-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 9)
HQD-R
: 5'-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 10)
By using this primer set, a part of the HQDO gene of about 570-bp can be amplified. Next, a primer set for amplifying a part of npcA of NPMO • Ox gene (SAO101 strain) is shown.
RTpheA1F : 5’-CGCCTACCACGAATTCTGG-3’（配列番号11）
RTpheA1R : 5’-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3’（配列番号12）
このプライマーセットを用いることにより約580-bpのNPMO・Ox遺伝子の一部を増幅することができる。
RTpheA1F: 5'-CGCCTACCACGAATTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 11)
RTpheA1R: 5'-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3 '(SEQ ID NO: 12)
By using this primer set, a part of the 580-bp NPMO · Ox gene can be amplified.
さらに本発明の遺伝子の塩基配列のすべてまたは一部をプローブとして用いることにより4-NP分解性・資化性を示す生物の全DNAを対象にしたサザンブロット解析などのハイブリダイゼーションを行い、NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO遺伝子のスクリーニングに用いることができる。プローブとして用いるDNAはPCRで増幅したものや制限酵素で遺伝子の一部を切り出して調製したものなどが利用できる。例としては上記に示したHQDO遺伝子を増幅するプライマーで増幅したDNAをDIG標識(DIGキット、Roche社)し、4-NP分解性を示すロドコッカスYTK32などから抽出した全DNAを対象にサザン解析し、該遺伝子のスクリーニングを行うことができる。ここで用いられるプライマーセットやプローブは本発明の遺伝子DNA配列の一部を含み、特異的なPCR増幅や特異的なハイブリダイゼーションが行える限りその塩基配列は特に限定されるものではない。
（実施例）
Furthermore, by using all or part of the base sequence of the gene of the present invention as a probe, hybridization such as Southern blot analysis was performed on all DNA of organisms exhibiting 4-NP degradability and assimilation, and NPMO It can be used for screening of Red, NPMO · Ox and HQDO genes. As the DNA used as a probe, one amplified by PCR, one prepared by excising a part of a gene with a restriction enzyme, or the like can be used. As an example, the DNA amplified with the primer that amplifies the HQDO gene shown above is DIG-labeled (DIG kit, Roche), and Southern analysis is performed on all DNA extracted from Rhodococcus YTK32 that exhibits 4-NP degradability. The gene can be screened. The primer set and probe used here include a part of the gene DNA sequence of the present invention, and the base sequence is not particularly limited as long as specific PCR amplification and specific hybridization can be performed.
(Example)
培養培地としては、LB培地上を用いて、37℃もしくは30℃にて培養した。組換えプラスミド選択のために、必要に応じAmpicilin(アンピシリン)、Chloramphenicol
(クロラムフェニコール)、Kanamycin (カナマイシン)、IPTG及び5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
(X-gal)をそれぞれ最終濃度が100 μg/ml、30 μg/ml、50 μg/ml、1 mM及び40 μg/mlとなるように培地に添加して使用した。固形培地に関しては、1.6%寒天粉末を添加した。ロドコッカス属細菌用の培地も大腸菌と同様にLB培地を使用し、無機培地(最少培地)としてW培地(´1 solution と´100 solutionを99:1で混合し調製:
×1 solution; 0.85 g KH2PO4, 4.9 g Na2HPO4・12H2O,
0.5g (NH4)2SO4 /990ml water: ´100 solution; 10 g MgSO4・7H2O, 0.5 g FeSO4・7H2O,
100 ml S.S.S. /1l water: S.S.S. (Stock Salt Solution); 10.75 g MgO, 2 g CaCO3,
4.5 g FeSO4・7H2O, 1.44 g ZnSO4・7H2O,
1.12 g MnSO4・4H2O, 0.25 g CuSO4・5H2O, 0.28 g
CoSO4・7H2O, 0.06 g H3BO3, 51.3 ml
conc. HCl /l water)を使用し、30℃で培養した。
The culture medium was cultured at 37 ° C. or 30 ° C. using LB medium. Ampicilin, Chloramphenicol as necessary for selection of recombinant plasmids
(Chloramphenicol), Kanamycin (kanamycin), IPTG and 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
(X-gal) was added to the medium and used at final concentrations of 100 μg / ml, 30 μg / ml, 50 μg / ml, 1 mM and 40 μg / ml, respectively. For solid media, 1.6% agar powder was added. As for the medium for Rhodococcus bacteria, LB medium is used as in E. coli, and W medium ('1 solution and' 100 solution is mixed at 99: 1) as an inorganic medium (minimum medium):
× 1 solution; 0.85 g KH 2 PO 4 , 4.9 g Na 2 HPO 4・ 12H 2 O,
0.5g (NH 4 ) 2 SO 4 / 990ml water: ´100 solution; 10 g MgSO 4・ 7H 2 O, 0.5 g FeSO 4・ 7H 2 O,
100 ml SSS / 1l water: SSS (Stock Salt Solution); 10.75 g MgO, 2 g CaCO 3 ,
4.5 g FeSO 4・ 7H 2 O, 1.44 g ZnSO 4・ 7H 2 O,
1.12 g MnSO 4・ 4H 2 O, 0.25 g CuSO4 ・ 5H 2 O, 0.28 g
CoSO 4・ 7H 2 O, 0.06 g H 3 BO 3 , 51.3 ml
conc. HCl / l water) and culturing at 30 ° C.
遺伝子工学用試薬、キット、装置としてTAKARA社のLigation Kit, 各種制限酵素、EASY TRAP(アガロースゲルからのDNA抽出)、Taq DNA
polymerase、Pyrobest DNA Polymerase、Thermal Cycler TP3000、TOYOBO社のReverTra Ace -a-(Reverse transcriptase)、Ligation
High、Blunting Kit、Cosmo Bio社のMupid (電気泳動装置)、Qiagen社のQIAquick PCR Purification
Kit、QIAprep Spin Miniprep Kit (プラスミドDNA精製)、RNeasy Mini Kit (RNA抽出・精製)、QIAquick
Gel Extraction Kit (アガロースゲルからのDNA抽出)、Novagen社のpT7Blue-T vector、pET17b vector、Roche
Diagnostics社のDIG DNA Labeling and Detection Kit、PCR DIG Probe Synthesis Kit (以上2つサザンハイブリダイゼーション用試薬キット)、Bio-Rad
Laboratories社のGene Pulser II system (エレクトロポレーションシステム)、Model 785 Vacuum Blotter
(DNAブロッティング機器)、Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis System (SDS-PAGE機器)、Beckman
Coulter社のCEQ2000 DNA Analysis System (DNA塩基配列解析装置)、TOMY SEIKO社のUR-200P (超音波破砕装置)、Waters社のAlliance
2690 system (HPLC装置)、SHIMADZU社のGC-17A、GCMS-QP5050 (以上2つGC-MS装置)
等を用いた。
TAKARA Ligation Kit, various restriction enzymes, EASY TRAP (DNA extraction from agarose gel), Taq DNA
polymerase, Pyrobest DNA Polymerase, Thermal Cycler TP3000, TOYOBO ReverTra Ace -a- (Reverse transcriptase), Ligation
High, Blunting Kit, Cosmo Bio's Mupid (electrophoresis device), Qiagen's QIAquick PCR Purification
Kit, QIAprep Spin Miniprep Kit (plasmid DNA purification), RNeasy Mini Kit (RNA extraction / purification), QIAquick
Gel Extraction Kit (DNA extraction from agarose gel), Novagen pT7Blue-T vector, pET17b vector, Roche
Diagnostics DIG DNA Labeling and Detection Kit, PCR DIG Probe Synthesis Kit (two Southern hybridization reagent kits), Bio-Rad
Laboratories Gene Pulser II system, Model 785 Vacuum Blotter
(DNA blotting equipment), Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis System (SDS-PAGE equipment), Beckman
Coulter's CEQ2000 DNA Analysis System (DNA sequence analyzer), TOMY SEIKO's UR-200P (ultrasonic crusher), Waters Alliance
2690 system (HPLC equipment), SHIMADZU GC-17A, GCMS-QP5050 (more than two GC-MS equipment)
Etc. were used.
遺伝子解析ソフトウェアとしてSoftware Development社のGENETYX、Intelligenetics社のGeneWorks、さらにオンラインでCLUSTAL
W (多重配列解析、DNA Data Bank of Japan)、BLAST (相同性検索、National Center for
Biotechnology Information)を使用した。
Genetic analysis software GENETYX from Software Development, GeneWorks from Intelligents, and CLUSTAL online
W (Multiple Sequence Analysis, DNA Data Bank of Japan), BLAST (Homology Search, National Center for
Biotechnology Information) was used.
ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(HQDO)遺伝子断片のPCR増幅
本実施例では、4-NP資化性ロドコッカス属細菌より4-NP代謝系遺伝子を得るため、まずその中間代謝物と考えられるHQの代謝酵素遺伝子、HQDO遺伝子をターゲットとしたPCRを試みた。これは4-NPを直接基質とする酵素遺伝子はこれまで報告がないため、代謝遺伝子の報告例がある中間体のHQの酵素遺伝子をターゲットとしたものである。これまでにHQのジオキシゲナーゼ(hydroxyquinol
1,2-dioxygenase)遺伝子として報告されている Burkholderia piketti のhadC, Burkholderia cepacia
AC1100のtftH, Sphingomonas wittichii RW1のdxnFの遺伝子配列を基に下記のプライマーセットを設計した。
PCR amplification of hydroxyquinol dioxygenase (HQDO) gene fragment In this example, in order to obtain a 4-NP metabolic gene from a 4-NP-utilizing Rhodococcus bacterium, an HQ metabolizing enzyme gene considered to be an intermediate metabolite first. We attempted PCR targeting the HQDO gene. Since no enzyme gene with 4-NP as a direct substrate has been reported so far, it targets the HQ enzyme gene of an intermediate with a report of metabolic genes. To date, HQ dioxygenase (hydroxyquinol)
Burkholderia piketti hadC, Burkholderia cepacia reported as 1,2-dioxygenase) gene
The following primer sets were designed based on the gene sequence of tftH of AC1100 and dxnF of Sphingomonas wittichii RW1.
BT-F190
: 5’-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3’ (配列番号7)
BT-R706 : 5’-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3’ (配列番号8)
BT-F190
: 5'-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
BT-R706: 5'-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3 '(SEQ ID NO: 8)
このプライマーセットを用いて本研究室で所持している4-NP分解菌Rhodococcus opacus SAO101 (ロドコッカス・オパカスSAO101)の全DNAを鋳型にPCRを行った
(94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、72℃ 1 minを30サイクル)。その結果約550 bpの増幅断片を得、pT7Blue-T vectorを用いてTA-クローニングを行った。このDNAの塩基配列を決定し、推定アミノ酸配列において相同性検索を行ったところ、既知のHQDOとの相同性が認められた。最も高い相同性が認められたのはArthrobacter
sp. BA-5-17のORF2(hydroxyquinol 1,2-dioxygenase)の一部で約80%を示した。またダイオキシン分解菌であるSphingomonas
wittichii RW1のDxnFの一部と約45%の相同性を示した。このプライマーセットでは同じくロドコッカス属細菌のYTK32株からも同様の増幅DNA断片を得ることに成功している。
この遺伝子が4-NP代謝に関わる可能性を調べるためReverse transcription-PCR (RT-PCR)を行った。RT-PCR はReverTra
Ace -α-を用い、操作はこのプロトコールに従った。SAO101株をLB培養し、菌体を増やした後、1 mMの4-NPを加えたW培地に植え換え3時間培養した菌体から全RNAを抽出し、それを鋳型にRT-PCRを行った。またコントロールとしてLB培養した菌体からも全RNAを抽出し、鋳型とした。その結果LB培養した菌体ではこの遺伝子は転写されておらず(もしくは検出限界下の転写量)、4-NP培養した菌体では大量に転写されていることが明らかになった。
Using this primer set, PCR was performed using the total DNA of the 4-NP-degrading bacterium Rhodococcus opacus SAO101 (Rhodococcus opacus SAO101) as a template.
(94 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 1 minute at 72 ° C). As a result, an amplified fragment of about 550 bp was obtained, and TA-cloning was performed using pT7Blue-T vector. When the nucleotide sequence of this DNA was determined and homology search was performed on the deduced amino acid sequence, homology with known HQDO was found. The highest homology was found in Arthrobacter
About 80% of a part of ORF2 (
It showed about 45% homology with a part of wittichii RW1 DxnF. This primer set has also succeeded in obtaining a similar amplified DNA fragment from the YTK32 strain of the genus Rhodococcus.
Reverse transcription-PCR (RT-PCR) was performed to examine the possibility that this gene is involved in 4-NP metabolism. RT-PCR is ReverTra
The procedure followed this protocol using Ace-α-. After LB culture of SAO101 strain and increasing the number of cells, total RNA was extracted from cells cultured for 3 hours after replanting in W medium supplemented with 1 mM 4-NP, and RT-PCR was performed using it as a template It was. As a control, total RNA was also extracted from LB cultured cells and used as a template. As a result, it was clarified that this gene was not transcribed in LB-cultured cells (or a transcription amount below the detection limit), and that in 4-NP-cultured cells, it was transcribed in large amounts.
HQDO遺伝子周辺領域の取得
実施例1で得られた遺伝子断片をもとにこのDNAの周辺領域のクローニングを試みた。コスミドで作製したSAO101ゲノムの遺伝子ライブラリーを持つ大腸菌に対して上記遺伝子断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーハイブリダイゼーションの方法はDIG
DNA Labeling and Detection Kitに従った。その結果ハイブリダイゼーションのシグナルの強いポジティブクローンの取得に成功し、プローブに使用した配列を含むコスミドの塩基配列の一部、約3.5
kbを決定した。この領域から3つの推定ORFが認められ、ORF1、2、3とした(遺伝子構成は図2を参照)。これらのORFの推定アミノ酸配列をもとに相同性検索を行い、最も高い相同性が認められたものはORF1がChelatobacter
heintzii ATCC29600のNtaB (nitrilotriacetate monooxygenase component B)と約37%、
ORF2がRalstonia eutropha JMP134のTcpA (2,4,6-trichlorophenol monooxygenase)と約44%、ORF3がArthrobacter
sp. BA-5-17の ORF2 (hydroxyquinol 1,2-dioxygenase)と約74%をそれぞれ示した。また表1にも相同性検索した結果を示す。
Followed DNA Labeling and Detection Kit. As a result, a positive clone with a strong hybridization signal was successfully obtained, and a portion of the cosmid base sequence including the sequence used for the probe, about 3.5
kb was determined. Three putative ORFs were recognized from this region, and they were designated as ORF1, 2, and 3 (see FIG. 2 for gene structure). A homology search based on the deduced amino acid sequences of these ORFs, and the one with the highest homology was ORF1 was Chelotobacter
about 37% with NtaB (nitrilotriacetate monooxygenase component B) of heintzii ATCC29600,
ORF2 is Ralstonia eutropha JMP134 TcpA (2,4,6-trichlorophenol monooxygenase) and about 44%, ORF3 is Arthrobacter
ORF2 (
ORF1、2、3の塩基配列をそれぞれ実施例文末の配列番号1、3、5に、またそれぞれの推定アミノ酸配列を配列番号2、4、6に示した。 The base sequences of ORF1, 2, and 3 are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, respectively, and the deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOS: 2, 4, and 6, respectively.
これらの遺伝子ORFについて4-NP培養時での転写誘導とその転写単位を調べるため4-NP培養した菌体から抽出したRNAを鋳型に、下記の様に設計したプライマーセットA-Eを用いRT-PCRを行った。また設計したプライマーセットの部位とRT-PCRの結果を図2に示す。 RT-PCR using the primer set AE designed as follows, using RNA extracted from 4-NP cultured cells as a template to examine the transcriptional induction and the transcription unit of these gene ORFs during 4-NP culture Went. Fig. 2 shows the designed primer set sites and RT-PCR results.
プライマーセットA: ORF1内部409 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-TCGGACACTTCGCAAGTGG-3’（配列番号13）
Reverse; 5’-CGGTAGTACGACAGTGGATTGC-3’（配列番号14）
プライマーセットB: ORF2内部583 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-CGCCTACCACGAATTCTGG-3’（配列番号15）
Reverse; 5’-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3’（配列番号16）
プライマーセットC: ORF3内部567 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3’（配列番号17）
Reverse; 5’-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3’（配列番号18）
プライマーセットD: ORF1とORF2をスパンする領域388 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-GCAATCCACTGTCGTACTACCG-3’（配列番号19）
Reverse; 5’-CCAGAATTCGTGGTAGGCG-3’（配列番号20）
プライマーセットE: ORF2とORF3をスパンする領域1,122 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-TTCAGCACATCGGCAATCC-3’（配列番号21）
Reverse; 5’-GAGAGCAGGATGAACTCCTGG-3’（配列番号22）
RT-PCRを行った結果すべてのプライマーセットにおいて予測されるサイズのDNA断片の増幅が確認された。これらのことからSAO101株のORF1-3が単一の転写単位で、4-NP培養時に誘導的に転写される事が示された。
Primer set A: Primer set that amplifies ORF1 internal 409 bp
Forward; 5'-TCGGACACTTCGCAAGTGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
Reverse; 5'-CGGTAGTACGACAGTGGATTGC-3 '(SEQ ID NO: 14)
Primer set B: Primer set that amplifies ORF2 internal 583 bp
Forward; 5'-CGCCTACCACGAATTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 15)
Reverse; 5'-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3 '(SEQ ID NO: 16)
Primer set C: Primer set that amplifies 567 bp inside ORF3
Forward; 5'-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 17)
Reverse; 5'-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 18)
Primer set D: A primer set that amplifies the
Forward; 5'-GCAATCCACTGTCGTACTACCG-3 '(SEQ ID NO: 19)
Reverse; 5'-CCAGAATTCGTGGTAGGCG-3 '(SEQ ID NO: 20)
Primer set E: Primer set that amplifies 1,122 bp spanning ORF2 and ORF3
Forward; 5'-TTCAGCACATCGGCAATCC-3 '(SEQ ID NO: 21)
Reverse; 5'-GAGAGCAGGATGAACTCCTGG-3 '(SEQ ID NO: 22)
As a result of RT-PCR, amplification of DNA fragments of the expected size was confirmed in all primer sets. These results indicate that ORF1-3 of SAO101 strain is a single transcription unit and is inducibly transcribed during 4-NP culture.
表1に示したように、ORF2は JMP134株の2,4,6-Trichlorophenol (2,4,6-トリクロロフェノール、以下「2,4,6-TCP」とも示す)
代謝に関わる2,4,6-トリクロロフェノールモノオキシゲナーゼ、TcpAと相同性を示し、ORF3は同じく JMP134株のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ、TcpCと相同性を示した。4-NPの推定代謝経路(図1、下部経路)はこのJMP134株の2,4,6-TCP代謝経路(図3、Louie,
T. M. et al., J. Bacteriol. 2002. 184: 3492-3500)と類似しており、また上記のようにSAO101株のORF1-3が4-NPで誘導的に転写されていることから、実際にORF1、2、3が4-NPの代謝にニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネント(NPMO・Red)、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネント(NPMO・Ox)、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(HQDO)として関わる可能性が考えられたため、これらの遺伝子をnitrophenol
catabolism遺伝子、ORF1をnpcB、ORF2をnpcA、ORF3をnpcCと名付け、さらなる解析に用いた。
As shown in Table 1, ORF2 is
It showed homology with 2,4,6-trichlorophenol monooxygenase and TcpA involved in metabolism, and ORF3 also showed homology with hydroxyquinol dioxygenase and TcpC of the JMP134 strain. The estimated metabolic pathway of 4-NP (Fig. 1, lower pathway) is the 2,4,6-TCP metabolic pathway of this JMP134 strain (Fig. 3, Louie,
TM et al., J. Bacteriol. 2002. 184: 3492-3500) and, as mentioned above, the ORF1-3 of SAO101 strain is inducibly transcribed with 4-NP. ORF1, 2, and 3 may be involved in 4-NP metabolism as nitrophenol monooxygenase reductase component (NPMO • Red), nitrophenol monooxygenase oxygenase component (NPMO • Ox), and hydroxyquinol dioxygenase (HQDO) It was thought that these genes were transferred to n itro p henol
c Atabolism gene, ORF1 was named npcB, ORF2 was named npcA, and ORF3 was named npcC and used for further analysis.
SAO101株でのnpc遺伝子の機能の解明
本実施例においてはSAO101株におけるnpc遺伝子の機能を明らかにするためnpcA、npcCの遺伝子破壊株を作製しその解析を行った。本発明者は遺伝子破壊株の作製のため、ロドコッカス属細菌で実績のあるシングルクロスオーバーによる遺伝子破壊法(Kitagawa,
W. et al., J. Bacteriol. 2001. 183: 6598-6606)を試み、それぞれの遺伝子破壊株を得ることに成功した。これらの株を4-NP培養した結果、npcA、npcCの双方の遺伝子破壊株において4-NPの資化性を完全に失っており、これらの遺伝子がSAO101株において4-NP代謝に重要な役割を果たす遺伝子であることが示された。
Elucidation of the function of the npc gene in the SAO101 strain In this example, in order to clarify the function of the npc gene in the SAO101 strain, npcA and npcC gene-disrupted strains were prepared and analyzed. The present inventor used a single crossover gene disruption method (Kitagawa,
W. et al., J. Bacteriol. 2001. 183: 6598-6606) and succeeded in obtaining each gene-disrupted strain. As a result of 4-NP culture of these strains, 4-NP assimilation was completely lost in both the npcA and npcC gene-disrupted strains, and these genes play an important role in 4-NP metabolism in the SAO101 strain. It was shown to be a gene that fulfills
大腸菌で発現させた酵素によるnpc遺伝子の機能の解明
本実施例では遺伝子破壊株で認められたnpc遺伝子の機能をさらに確認するため、高発現した大腸菌の粗酵素を用い、その機能の解析を行った。まずnpcB、npcA、npcCのそれぞれの遺伝子を大腸菌で用いられる高発現プラスミドベクター、pET17bに導入した。このベクターはT7プロモーターとリボソーム結合部位(RBS)、それに続く開始コドンATGを有しており、導入する遺伝子の開始コドンとベクター上の開始コドンを融合させるようにクローニングする事によって、その遺伝子の高い発現を期待する事ができる。本発明者はこれら3つの遺伝子npcB、npcA、npcCを別個にベクターの開始コドンATGと合わせて導入し、3つのプラスミドpETnpcB、pETnpcA、pETnpcCをそれぞれ構築した。
Elucidation of the function of the npc gene by the enzyme expressed in E. coli In this example, in order to further confirm the function of the npc gene found in the gene-disrupted strain, the function of the highly expressed E. coli crude enzyme was analyzed. It was. First, each gene of npcB, npcA and npcC was introduced into a high expression plasmid vector used in E. coli, pET17b. This vector has a T7 promoter, a ribosome binding site (RBS), followed by an initiation codon ATG. By cloning so that the initiation codon of the gene to be introduced and the initiation codon on the vector are fused, We can expect expression. The inventor introduced these three genes npcB, npcA, and npcC separately together with the vector start codon ATG, and constructed three plasmids pETnpcB, pETnpcA, and pETnpcC, respectively.
1) 組み換え大腸菌を3 ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
2) 新しい40 mlのLB培地に種菌として前培養液を0.4-2 ml植菌しOD600が0.5-0.6になるまで37℃で2-4時間培養した。
3) OD600が0.5-0.6に達した時点で最終濃度1 mMになるようにIPTGを加え、培養温度を30℃に変え、さらに3時間培養した。
4)
菌液を50 ml容量の遠心チューブに入れ6,000 rpmで5分遠心、集菌し、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)で菌体を洗浄し、2 mlのGPME
bufferに再懸濁 した (GPME buffer; 10% glycerol, 2.5 mM 2-mercaptoethanolを含む50 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.2)。
5)
超音波破砕機で細胞を破砕、エッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 min遠心分離を行い、上清を得て、これを粗酵素抽出液とした。
6)
GMPE bufferに最終濃度10 μM FAD、2 mM NADH、および200 μMの反応基質(4-NPなど)を加えた酵素反応液を調製。
7) 酵素反応液 と粗酵素抽出液を1:1の割合で混合し、30℃で撹拌しながら反応させた。
以下8)9)はHPLC分析用サンプル調製、10)11)12)はGC-MS分析用サンプル調製。
8) 反応溶液中から1、2、3、5、10分の間隔で100 μlのサンプルを抜き取り、等量のメタノールと混合して反応を停止させた。
9) 各サンプルをエッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 分間遠心分離を行い、上清をさらに孔経0.22μmのフィルターに通し、HPLC分析用のサンプルとした。
10) 反応溶液中から3、10分の時点で500μlのサンプルを抜き取り、直ちに飽和量のNaClと1/50容量(10μl)の濃塩酸を加え反応を停止し、3分間ボルテックスミキサーで撹拌した。
11) 等量の酢酸エチルを加え、10分間ボルテックスミキサーで撹拌した後、15,000 rpmで10分間遠心分離を行い、酢酸エチル層(上層)のみをガラスのバイアルに移した。
12) 窒素ガス吹きつけによってガラスバイアル中の酢酸エチルを気化し、トリメチルシリル化剤(B0911;東京化成工業)を加えてボルテックスミキサーで撹拌、GC-MSサンプルとした。
1) Recombinant E. coli was inoculated into 3 ml LB medium and pre-cultured by shaking overnight at 37 ° C.
2) Inoculated 0.4-2 ml of pre-cultured solution as a seed in a new 40 ml LB medium and cultured at 37 ° C. for 2-4 hours until OD 600 was 0.5-0.6.
3) When OD 600 reached 0.5-0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, the culture temperature was changed to 30 ° C., and the culture was further continued for 3 hours.
Four)
Place the bacterial solution in a 50 ml centrifuge tube, centrifuge at 6,000 rpm for 5 minutes, collect the cells, wash the cells with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), and add 2 ml of GPME.
It was resuspended in a buffer (GPME buffer; 50 mM potassium phosphate buffer containing 10% glycerol, 2.5 mM 2-mercaptoethanol, pH 7.2).
Five)
Cells were crushed with an ultrasonic crusher, placed in an Eppendorf tube, centrifuged at 15,000 rpm for 30 min to obtain a supernatant, and this was used as a crude enzyme extract.
6)
Prepare an enzyme reaction solution by adding GMPE buffer to a final concentration of 10 μM FAD, 2 mM NADH, and 200 μM reaction substrate (4-NP, etc.).
7) The enzyme reaction solution and the crude enzyme extract were mixed at a ratio of 1: 1, and reacted at 30 ° C. with stirring.
8) 9) below is the sample preparation for HPLC analysis, 10) 11) 12) is the sample preparation for GC-MS analysis.
8) 100 μl samples were withdrawn from the reaction solution at intervals of 1, 2, 3, 5, and 10 minutes and mixed with an equal amount of methanol to stop the reaction.
9) Each sample was placed in an Eppendorf tube and centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was further passed through a filter with a pore size of 0.22 μm to obtain a sample for HPLC analysis.
10) At 3 and 10 minutes from the reaction solution, 500 μl of a sample was withdrawn, and immediately a saturated amount of NaCl and 1/50 volume (10 μl) of concentrated hydrochloric acid were added to stop the reaction, followed by stirring with a vortex mixer for 3 minutes.
11) After adding an equal amount of ethyl acetate and stirring with a vortex mixer for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and only the ethyl acetate layer (upper layer) was transferred to a glass vial.
12) Nitrogen gas was blown to vaporize ethyl acetate in the glass vial, a trimethylsilylating agent (B0911; Tokyo Chemical Industry) was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer to obtain a GC-MS sample.
HPLC分析条件 (Waters社 Alliance 2690 system)
固定相カラム; 内径6 mm長さ15 cm、粒径5μmオクタデシルシリカ充填
移動相; アセトニトリル : 水0.1%酢酸 = 1 : 1、流速2 ml/min
GC-MS分析条件 (SHIMADZU社 GC-17A、GC-MS-QP5050)
カラム; Agilent Technologies社 DB-5、内径0.25 mm、長さ30 m
温度設定; 50℃ 2分保持後30℃/minで250℃まで上昇、250℃で5分保持
HPLC analysis conditions (Waters Alliance 2690 system)
Stationary phase column; ID 6 mm long 15 cm, particle size 5 μm octadecyl silica packed mobile phase; acetonitrile: water 0.1% acetic acid = 1: 1, flow
GC-MS analysis conditions (SHIMADZU GC-17A, GC-MS-QP5050)
Column; Agilent Technologies DB-5, 0.25 mm ID, 30 m length
Temperature setting: 50 ° C Hold for 2 minutes, then increase to 250 ° C at 30 ° C / min, hold at 250 ° C for 5 minutes
まず上記の様に調製した粗酵素液をSDS-PAGEで分析し、目的遺伝子の発現の有無を調べた。その結果図4のレーン2、3に示すpETnpcB、pETnpcAの各プラスミドを持つ大腸菌粗酵素液で、コントロールのレーン1と比較して強く発現している特異的なバンドが認められた。NpcB、NpcAの推定分子量はそれぞれ20.1
kDa、60.0 kDaであるが、これら特異的バンドはほぼ同じサイズに位置していたことから、これらがnpcB、npcAの発現産物であることが強く示唆された。
First, the crude enzyme solution prepared as described above was analyzed by SDS-PAGE to examine whether the target gene was expressed. As a result, specific bands that were strongly expressed as compared to control
Although these specific bands were located at almost the same size, it was strongly suggested that these were the expression products of npcB and npcA.
次に4-NP、4-NCAに対する酵素活性を測定した。HPLC分析の結果pETnpcB、pETnpcA双方の粗酵素抽出液に4-NP、4-NCAを変換する活性がないことが示された。しかしpETnpcB、pETnpcAの粗酵素液を等量混合し、この混合粗酵素液を活性測定に用い、HPLC分析したところ、4-NP、4-NCAのピークが減少しており、これらの基質に対する酵素活性が認められた。続いて2、4-DCP、2,4,6-TCPの変換活性も認められた。それぞれの基質に対する活性比は4-NPと4-NCAがほぼ同様に高く、続いて2、4-DCP、2,4,6-TCPであった。また2,4-Dinitrophenol(2,4-ジニトロフェノール)に対する活性は認められなかった。HPLCを用いて基質の減少を指標にした活性測定の結果を表2に示す。
また4-NPと4-NCA変換活性が得られたサンプルについてGC-MS分析を行ったところ、双方ともわずかな量のHQが検出された。上記の通りHQは水相では非常に不安定であるため、4-NPや4-NCAの変換量と量的な相関については不明であった。これらの結果、npcB、npcAの発現産物であるNpcB、NpcAの双方が4-NPを4-NCA経由でHQに変換する4-ニトロフェノール/4-ニトロカテコールモノオキシゲナーゼとして機能し、双方ともその活性に必須である事が示された。 In addition, GC-MS analysis was performed on samples that had 4-NP and 4-NCA conversion activity, and a small amount of HQ was detected in both samples. As described above, HQ is very unstable in the aqueous phase, so the amount of 4-NP and 4-NCA converted and the quantitative correlation were unknown. As a result, both NpcB and npcA expression products NpcB and NpcA function as 4-nitrophenol / 4-nitrocatechol monooxygenase that converts 4-NP to HQ via 4-NCA, both of which are active. It was shown that it is essential.
続いてHQDO酵素遺伝子と考えているnpcCを導入したプラスミドpETnpcCをもつ大腸菌の粗酵素抽出液を以下のように調製し、その活性を試験した。
1) 組み換え大腸菌を3 ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
2) 新しい40 mlのLB培地に種菌として前培養液を0.4-2 ml植菌しOD600が0.5-0.6になるまで37℃で2-4時間培養した。
3) OD600が0.5-0.6に達した時点で最終濃度1 mMになるようにIPTGを加え、培養温度を30℃に変え、さらに3時間培養した。
4)
菌液を50 ml容量の遠心チューブに入れ6,000 rpmで5分遠心、集菌し、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)で菌体を洗浄し、2 mlのbufferAに再懸濁した
(bufferA; 10% glycerol, 7.5% n-propanol, 1 mM 2-mercaptoethanolを含む25 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.5)。
5)
超音波破砕機で細胞を破砕、エッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 min遠心分離により上清を得て、これを粗酵素抽出液とした。
6)
0.5 mM FeSO4, 1 mM HQを含む10 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.2を調製し、酵素反応液とした。
7)
酵素反応液 と適宜bufferAで希釈した粗酵素抽出液を9:1の割合で混合し、30℃で撹拌しながら反応させた。
以下サンプル調製と分析条件はnpcB、npcAで行ったものと同様に行った。
Subsequently, a crude enzyme extract of Escherichia coli having a plasmid pETnpcC into which npcC, which is considered to be an HQDO enzyme gene, was prepared as follows, and its activity was tested.
1) Recombinant E. coli was inoculated into 3 ml LB medium and pre-cultured by shaking overnight at 37 ° C.
2) Inoculated 0.4-2 ml of pre-cultured solution as a seed in a new 40 ml LB medium and cultured at 37 ° C. for 2-4 hours until OD 600 was 0.5-0.6.
3) When OD 600 reached 0.5-0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, the culture temperature was changed to 30 ° C., and the culture was further continued for 3 hours.
Four)
The bacterial solution is placed in a 50 ml centrifuge tube, centrifuged at 6,000 rpm for 5 minutes, collected, washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), and resuspended in 2 ml bufferA.
(bufferA; 25 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 10% glycerol, 7.5% n-propanol, 1 mM 2-mercaptoethanol).
Five)
Cells were crushed with an ultrasonic crusher, placed in an Eppendorf tube, and centrifuged at 15,000 rpm for 30 min to obtain a supernatant, which was used as a crude enzyme extract.
6)
A 10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.2 containing 0.5 mM FeSO4 and 1 mM HQ was prepared and used as an enzyme reaction solution.
7)
The enzyme reaction solution and the crude enzyme extract diluted appropriately with buffer A were mixed at a ratio of 9: 1 and reacted at 30 ° C. with stirring.
The sample preparation and analysis conditions were the same as those performed with npcB and npcA.
npcB、npcAと同様に粗酵素抽出液をSDS-PAGEで分析し、目的遺伝子の発現の有無を調べた。図4のレーン4に示すように特異的に強く発現しているタンパク質のバンドが認められた。NpcCの推定分子量は33.2
kDaであるが、この特異的バンドはほぼ同じサイズに位置していたことから、これがnpcCの発現産物であることが強く示唆された。
The crude enzyme extract was analyzed by SDS-PAGE in the same manner as npcB and npcA, and the presence or absence of expression of the target gene was examined. As shown in
Although it was kDa, this specific band was located at approximately the same size, strongly suggesting that this was an expression product of npcC.
次にHQに対する酵素活性を測定した。前述のようにHQは水溶液中で非常に不安定であり、ネガティブコントロールでもHQの減少が見られたことから、粗酵素抽出液での基質の減少による反応速度を計算することはできなかった。また反応産物をHPLCで検出することはできなかった。しかし5分、10分後の酵素反応溶液についてGC-MS分析を行ったところ極微量のMAが検出された。MAはHQがHQDOによる環開裂を受けて生成されるものであり、HQの減少が見られたネガティブコントロールでは検出されなかった事から、HQが酵素反応によってMAに変換されたことが示された。これらの結果からnpcCの発現産物であるNpcCがHQDOとして機能することが確認された。 Next, enzyme activity against HQ was measured. As described above, HQ was very unstable in an aqueous solution, and a decrease in HQ was observed even in the negative control. Therefore, the reaction rate due to the decrease in substrate in the crude enzyme extract could not be calculated. The reaction product could not be detected by HPLC. However, a trace amount of MA was detected when GC-MS analysis was performed on the enzyme reaction solution after 5 and 10 minutes. MA was generated by HQ undergoing ring cleavage by HQDO and was not detected in the negative control where HQ was reduced, indicating that HQ was converted to MA by an enzymatic reaction. . From these results, it was confirmed that NpcC, which is an expression product of npcC, functions as HQDO.
以上、SAO101株の遺伝子破壊株と大腸菌で発現させた酵素遺伝子の結果からSAO101株の4-NPの代謝系の一部と関連する酵素遺伝子ついて図5にように推定した。すなわち4-NPをnpcB、npcAの両遺伝子産物、NPMOが4-NCAを経由してHQへ変換し、そのHQをnpcCの遺伝子産物、HQDOがMAに変換するというものである。 Based on the results of the gene-disrupted strain of SAO101 strain and the enzyme gene expressed in Escherichia coli, the enzyme genes related to a part of the 4-NP metabolic system of SAO101 strain were estimated as shown in FIG. That is, 4-NP is converted to HQ via both npcB and npcA gene products and NPMO via 4-NCA, and HQ is converted to npcC gene product and HQDO to MA.
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号10：プライマー
配列番号11：プライマー
配列番号12：プライマー
配列番号13：プライマー
配列番号14：プライマー
配列番号15：プライマー
配列番号16：プライマー
配列番号17：プライマー
配列番号18：プライマー
配列番号19：プライマー
配列番号20：プライマー
配列番号21：プライマー
配列番号22：プライマー
Sequence number 7: Primer Sequence number 8: Primer Sequence number 9: Primer Sequence number 10: Primer Sequence number 11: Primer Sequence number 12: Primer Sequence number 13: Primer Sequence number 14: Primer Sequence number 15: Primer Sequence number 16: Primer Sequence number 17: Primer Sequence number 18: Primer Sequence number 19: Primer Sequence number 20: Primer Sequence number 21: Primer Sequence number 22: Primer
Claims (21)
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質。 A gene encoding the following protein (a) or (b) ;
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having reductase activity .
(a) 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。 A gene encoding the following protein (a) or (b) ;
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
(b) a protein having an oxygenase activity, comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 ;
(c) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 A gene comprising the following DNA (c) or (d) :
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(d) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions having a sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and encodes a protein having reductase activity DNA.
(c) 配列番号３に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 A gene comprising the following DNA (c) or (d) :
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
(d) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions having a sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and encodes a protein having an oxygenase activity DNA.
(c) 配列番号５に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号５に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 The vector according to claim 9, further comprising a gene comprising the following DNA (c) or (d) :
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5
(d) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions having a sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and encodes a protein having a hydro Kishiki Nord dioxygenase activity DNA.
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。 A monooxygenase enzyme comprising a complex of the following protein (a) and protein (b) ;
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and has reductase activity protein
(b) a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and has oxygenase activity protein.
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