JP4177904B2

JP4177904B2 - Novel promoter and gene expression method using the promoter

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Publication number: JP4177904B2
Application number: JP18820396A
Authority: JP
Inventors: 信人小山; 英知三善; 義人井原; 淳西河; 直之谷口
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2016-06-28
Also published as: JPH09107977A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法に関する。更に詳しくは、動物細胞中で働き得る新規なプロモーターを含むＤＮＡに関するものであり、また、該プロモーターの下流にタンパク質をコードする核酸を連結して得られるＤＮＡを含有するベクターを用いるタンパク質の製造方法。更に、該プロモーターの下流に有用遺伝子を連結し、得られたＤＮＡあるいは該ＤＮＡを含有するベクターを動物細胞に導入することによる有用遺伝子の発現方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物由来の有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物宿主を用いると遺伝子が発現しなかったり、遺伝子産物である蛋白が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正しくなされない等の理由で活性を持たなかったりすることがしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞が宿主として用いられることが多く、この場合プロモーターの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻繁に用いられてきた動物細胞用プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アクチンプロモーター等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
動物細胞を宿主として有用遺伝子産物を大量に生産する場合、従来用いられてきた動物細胞用プロモーターは転写活性の点で必ずしも満足のいくものではなく、更に強力なプロモーターの開発が待ち望まれている。
従って、本発明の第１の目的は、動物細胞用のプロモーターとして強力なプロモーター活性を有するＤＮＡを提供することにある。本発明の第２の目的は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡを提供することにある。本発明の第３の目的は、本発明の組換えＤＮＡを含有するベクターを提供することにある。本発明の第４の目的は、本発明の組換えＤＮＡを有する動物細胞および該動物細胞を有する動物を提供することにある。本発明の第５の目的は、該プロモーターを用いるタンパク質の製造方法を提供することにある。本発明の第６の目的は、該プロモーターを用いる有用遺伝子の発現方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、動物細胞で高い転写効率を持つプロモーターを得る目的で鋭意研究を続けたところ、ヒトのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝子の上流に強力なプロモーターが存在することを見出した。このプロモーターを含むＤＮＡの塩基配列を決定し、該ＤＮＡを西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結してルシフェラーゼ遺伝子の発現を行わしめたところ、該プロモーターが従来知られている動物細胞用プロモーターよりも遥かに強力なプロモーターであることを確認した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【０００５】
即ち、本発明の要旨は、
（１）配列表の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択されるＤＮＡ又はその一部であって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択されるＤＮＡと６×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃でハイブリダイズすることができる１．１ｋｂもしくはこれより縮小されたＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ、
（３）０．２ｋｂ〜１．１ｋｂのＤＮＡである、前記（２）記載のＤＮＡ、
（４）前記（１）〜（３）いずれか１項に記載のＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする組換えＤＮＡ、
（５）有用遺伝子がタンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸、およびリボザイムをコードする核酸からなる群より選択される核酸であることを特徴とする前記（４）記載の組換えＤＮＡ、
（６）前記（４）又は（５）に記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
（７）ベクターがプラスミドベクター又はウイルスベクターであることを特徴とする前記（６）記載のベクター、
（８）前記（４）又は（５）に記載の組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞、
（９）前記（６）又は（７）に記載のベクターで形質転換されてなる動物細胞、
（１０）前記（８）又は（９）に記載の動物細胞を有するヒト以外の哺乳類、
（１１）前記（１）〜（３）いずれか１項に記載のＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで形質転換された動物細胞を培養し、次いで培養物から該タンパク質を採取することを特徴とする動物細胞によるタンパク質の製造方法、
（１２）前記（１）〜（３）いずれか１項に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法、
（１３）前記（１）〜（３）いずれか１項に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について詳細に説明する。
本明細書で言う「プロモーター」とは、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に限定されるものではなく、この領域以外に、発現調整のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。また本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、これは本明細書で言うプロモーターを含む領域のことを示す。
【０００７】
本明細書で言う「プロモーター活性」とは、プロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主（動物細胞）に導入した際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物を生産する能力および機能を有することを示す。
一般的に、プロモーターの下流に、定量が容易に行えるタンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連結させ、宿主に導入し、これらタンパク質の発現量を測定することでプロモーターの有無や強弱をプロモーターの活性として表す。このようにプロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主に導入した際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入した宿主においてプロモーター活性を有することになる。
【０００８】
本明細書で言う「動物細胞」としてはヒト由来の細胞が挙げられるが、本発明のプロモーターがその動物細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マグロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サメ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。
【０００９】
本明細書で言う「有用遺伝子」には、動物細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列または類似の配列を持つデコイをコードする核酸、動物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムが挙げられる。
【００１０】
動物細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸としては動物由来のものが挙げられるが、本発明においてこれは限定されるものではなく、動物細胞において発現可能であれば、細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、昆虫等の生物由来のものも本明細書で言う有用遺伝子に含まれる。
【００１１】
本明細書で言う「デコイをコードする核酸」とは、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列または類似の配列を持つＤＮＡを示し、これらを「おとり」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑制するものを言う。
本明細書で言う「リボザイム」とは、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものを言う。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計可能であり、例えば、ハンマ−ヘッド型リボザイムとしては、フェブスレター(FEBS Letter）、第２２８巻、第２２８−２３０頁（１９８８）に記載の方法が用いることができる。また、ハンマ−ヘッド型リボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本明細書で言うリボザイムに含まれる。
【００１２】
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の下流に有用遺伝子を有用遺伝子を発現可能な状態で連結することにより、有用遺伝子の発現を増強することができる。即ち、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結してなる組換えＤＮＡがベクターを介してまたはベクターを用いずに導入された動物細胞において、有用遺伝子が発現する。ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが好ましく使用される。ベクターを使用しない場合には、ＤＮＡ断片を文献記載の方法で導入できる〔Virology, 52, 456(1973), Molecular and Cellular Biology, 7, 2745(1987), Journal of the National Cancer Institute, 41, 351(1968), EMBO Journal, 1, 841(1982) 〕。
【００１３】
本発明のこのような組換えＤＮＡ断片を持つ動物細胞およびこのような動物細胞を持つ動物も本発明の範囲に含まれる。本発明により発現を増強することができる有用遺伝子としては、前記のように例えばタンパク質をコードするＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デコイをコードするポリヌクレオチド、デコイとして機能するヌクレオチド配列、リボザイムなどが挙げられる。また、本発明は目的のタンパク質を生産する方法、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片を使用する有用遺伝子の発現方法を開示している。
【００１４】
即ち、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで形質転換された動物細胞を培養し、培養物から該タンパク質を採取するタンパク質の製造方法も本発明の範囲に含まれる。同様に、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、培養することによる有用遺伝子の発現方法、あるいは該組換えＤＮＡを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、その動物細胞を培養することによる動物細胞による有用遺伝子の発現方法も本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、動物細胞用のプロモーター活性を有するものであり、配列表の配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の全部又はその一部を含むものである。即ち、本発明のＤＮＡ断片は、新規なプロモーターを含むＤＮＡ断片であり、該プロモーターを含む限り、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の中のいかなるＤＮＡ断片であってもよく、あるいは、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の一部を含むいかなるＤＮＡ断片であってもよい。例えば、特に限定されるものではないが、配列番号：２で示されるＤＮＡ断片、配列番号：３で示されるＤＮＡ断片、および配列番号：４で示されるＤＮＡ断片の全部又は一部、もしくはそれらを含有するＤＮＡ断片等が挙げられる。また、これらのＤＮＡ断片とハイブリダイズすることができるＤＮＡ断片であって、動物細胞においてプロモーター活性を有するものも、本発明のＤＮＡ断片に含まれる。
【００１６】
本発明の動物細胞用のプロモーターは次のようにして発見されたものである。
ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子は、井原ら［ジャーナルオブバイオケミストリー(Journal of Biochemistry）、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３年）］によって、胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムコスミドライブラリーから単離されているのでこれらを使用した。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンのうちＨ１５とＨ２０（特開平６−６２８６５号公報）は５’非翻訳領域を含んでおり、この領域のＤＮＡ配列は予想される開始コドンの上流８塩基対を除いて異なっている。ゲノムクローンとしてはコスミドＨｕｇ３とＨｕｇ５が得られており、そのうちＨｕｇ３はＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子のコード領域とその上流約３５ｋｂを含んでいる。
【００１７】
そこでＨ１５、Ｈ２０の各々の５’非翻訳領域をプローブとしたＨｕｇ３コスミドクローンのサザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡ塩基配列の解析等を行うことによって、Ｈ１５は開始コドンの上流約２９ｋｂ（Ｈ１５エキソン−２）と１ｋｂ（Ｈ１５エキソン−１）、またＨ２０は開始コドンの上流約２６ｋｂ（Ｈ２０エキソン−１）にエキソンを持つことが明らかとなった。また、ヒト脳由来ｍＲＮＡを鋳型としてＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子特異的なプライマーを用いて５’−ラピッドアンプリフィケーションオブｃＤＮＡエンド（ＲＡＣＥ）を行ったところ、Ｈ１５とＨ２０ではスプライシングが行われている開始コドンの上流７塩基対の部位でスプライシングが行われていないｍＲＮＡが存在することが判明した。このｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡをＨ２０４と呼ぶ。
【００１８】
これらの結果から、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子転写産物は少なくとも３種類からなることが明らかにされた。Ｈ１５、Ｈ２０、Ｈ２０４の転写に関わるプロモーターは各々Ｈ１５エキソン−２の上流域、Ｈ２０エキソン−１の上流域、および予想される翻訳開始点のゲノム上での上流域に存在すると考えられるので、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてこれらの領域を含むＤＮＡ断片のＣＯＳ１細胞におけるプロモーター活性を測定したところ、図１（図中、ボックス表示がエキソン部分で、破線がイントロン部分を示す）に示すようにＨ１５エキソン−２内部のHind III部位からＨ２０エキソン−１内部のSac II部位までを含むＨ２０上流域約３ｋｂ断片（これを含むプラスミドをｐＰＧ２０Ｂと呼ぶ）にはプロモーター活性は検出できなかった。しかし、Ｈ１５上流域のEcoR I部位からＨ１５エキソン−２内部のHind III部位の一部を含む約３ｋｂ断片（これを含むプラスミドをｐＰＧ１５と呼ぶ）およびコード域上流のSph I 部位からコード域内部のNae I 部位までを含む約１．１ｋｂ断片（これを含むプラスミドをｐＰＧ２０４−１．１と呼ぶ）、即ちＨ２０４を含む断片にはプロモーター活性があり、後者は前者よりも約１０倍、またＳＶ４０プロモーターよりも約１．５倍強い活性を有することが分かった。
【００１９】
さらに、この１．１ｋｂ断片内にはNae I 部位から約０．８ｋｂの位置にXho I 部位、約０．５ｋｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHinc II 部位があり、ｐＰＧ２０４−１．１をこれらの制限酵素のいずれか一つと、ベクターのマルチプルクローニングサイトに切断部位を持つBam HIで消化するとＧｎＴ−ＩＩＩ開始コドンを含む、０．８ｋｂ断片（断片Ａと呼ぶ）、０．５ｋｂ断片（断片Ｂと呼ぶ）、及び０．２ｋｂ断片（断片Ｃと呼ぶ）を切り出すことができる。これらの断片は上記の１．１ｋｂ断片よりもプロモーター活性が２〜３倍も強く、ＳＶ４０プロモーターよりも３〜５倍も強いプロモーター活性を有することが分かった。このようにして、本発明者らは、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子のコード域上流約０．２〜約１ｋｂを含むＤＮＡ断片が強いプロモーター活性を持つことを明らかにし、本発明に到達するに至った。以下に本発明のＤＮＡ断片の取得方法について詳細に説明する。
【００２０】
（１）動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列
ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の上流部を含むゲノムコスミドクローン、例えば井原らのコスミドクローンＨｕｇ３を制限酵素Sph I とNae I （ともに宝酒造社製）で切断し、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする領域のすぐ上流を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離する。このＤＮＡ断片は配列番号：１に示す塩基配列を有する。この断片を有用遺伝子との連結等の目的に使用しやすいようにプラスミドベクター、たとえば、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサブクローニングする。
【００２１】
サブクローニングされた１．１ｋｂSph I −Nae I 断片（ｐＨｕｇ５’−２０４）の塩基配列は、例えばジデオキシ法［プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ(Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA）、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）］によって決定可能である。一般に１．１ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を１回の反応で決定することは困難なので、適当な制限酵素でさらに細分化し、サブクローニングしてジデオキシ反応を行う方法、エクソヌクレアーゼＩＩＩで一連の欠失プラスミドを作製してからジデオキシ反応を行う方法、決定された配列をもとに順にプライマーを合成してジデオキシ反応を行う方法等を用いることができる。本発明では、制限酵素としてBst XI、Xho I 、Ssp I 、Kpn I 、Hinc II を用いて細分化し（ｐＨｕｇ５’−２０４の挿入断片の制限酵素地図を図２に示す）、サブクローニングしてジデオキシ反応を行うことによってｐＨｕｇ５’−２０４の塩基配列を配列表の配列番号：１に示すように決定した。
【００２２】
この１．１ｋｂ断片内には図２に示すようにNae I 部位から約０．８ｋｂの位置にXho I 部位、約０．５ｋｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHinc II 部位があり、ｐＨｕｇ５’−２０４をこれらの制限酵素のいずれか一つと、ベクターのマルチプルクローニングサイトに切断部位を持つBam HIで消化することにより、いずれもＧｎＴ−ＩＩＩ開始コドンを含む、配列表の配列番号：２に示す０．８ｋｂ断片（断片Ａ）、配列番号：３に示す０．５ｋｂ断片（断片Ｂ）、及び配列番号：４に示す０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を切り出すことができる。
【００２３】
（２）本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片の調製
上記のコスミドまたはプラスミドから制限酵素Sph I とNae I （ともに宝酒造社製）で消化して切り出し、あるいはさらにXho I 、Ssp I 、Hinc II 等の制限酵素で消化して切り出すのが最も容易な調製法である。その他、他の制限酵素で消化する方法、超音波処理による方法、ホスホルアミダイト法で化学合成する方法、ポリメラーゼ連鎖反応法等を利用して調製する方法等も利用できる。例えば、配列番号：１等のＤＮＡ配列から適宜プライマーを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応法により所望のＤＮＡ断片を容易に調製することができる。
【００２４】
本発明のプロモーターの塩基配列を利用するハイブリダイゼーション法により、他の細胞由来の遺伝子から本発明のプロモーターを得ることもできる。この場合は、例えば以下の方法が適用できる。まず他の細胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ³²Ｐ等で標識したプローブ（プローブとしては、配列表の配列番号：１に記載したＤＮＡ断片、またはその一部、例えば断片Ａ（配列番号：２）、断片Ｂ（配列番号：３）、または断片Ｃ（配列番号：４）等が使用できる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。
【００２５】
例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のプロモーターをコードするＤＮＡが挿入されている。
【００２６】
得られた遺伝子は、例えば次のように塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的のプロモーターであるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの場合、組換体が大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージの場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を決定することが出来る。これら培養から塩基配列決定までの基本的な操作法については、例えば、モレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual）、第２版、Ｔ．マニアティス(T. Maniatis）、第１章、第９０〜１０４頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８９年発行に記載されているとおりに行うことができる。
【００２７】
得られた遺伝子が目的のプロモーターであるかどうかは、決定された塩基配列を本発明のプロモーターと比較してその相同性から推定することができる。得られた遺伝子がプロモーターの全てを含まないと考えられる場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のプロモーターにハイブリダイズするプロモーターの全コード領域の塩基配列を決定することができる。
【００２８】
本発明の有用遺伝子の発現方法は、このようにして得られる本発明のプロモーターの下流に有用遺伝子を発現可能に連結して得られるＤＮＡ断片を動物細胞に導入し、得られた細胞を培養することを特徴とするものである。上記のようにして調製された本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片の下流に目的の有用遺伝子を発現可能に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマー法を利用することができる。ＤＮＡリガーゼにより連結する場合は、例えば両者が同一の制限酵素部位を有するときはこの制限酵素で消化した後、例えばモレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第１章、第６２頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８９年発行に記載された反応緩衝液中で両方のＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡリガーゼを加えることにより、また両者が同一の制限酵素部位を有しないときは末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平滑末端化した後上記のようにＤＮＡリガーゼで処理することにより連結する。一方、ホモポリマー法を用いる場合は、制限酵素で直鎖状にしたベクターの３’末端にターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼとｄＧＴＰによってポリＧ鎖を付加し、また、インサートＤＮＡの３’末端には同様にポリＣ鎖を付加し、これらのポリＧ鎖とポリＣ鎖をアニールさせ、例えば塩化カルシウム法により大腸菌に導入する［プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ、第７５巻、第３７２７頁（１９７８）］ことにより連結する。
【００２９】
本発明に使用できる目的の有用遺伝子としては、例えばインターロイキン１〜１２遺伝子、インターフェロンα、β、γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
上記のようにして得られる本発明のＤＮＡ断片と有用遺伝子が連結したＤＮＡ断片は動物細胞用の適当なベクターに組み込んで遺伝子発現用のプラスミドを得ることができる。かかるベクターとしては、ｐＴＭ［ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research）、１０巻、６７１５頁（１９８２）］、ｃｏｓ２０２［ジエンボジャーナル（The EMBO Journal）、第６巻、第３５５頁（１９８７）］、ｐ９１２０３（Ｂ）［サイエンス(Science）、第２２８巻、第８１０頁（１９８５）］、ＢＣＭＧＳＮｅｏ［ジャーナルオブエクスペリメンタルメディシン（Journal of Experimental Medicine）、第１７２巻、第９６９頁（１９９０）］等が挙げられる。
【００３１】
得られた遺伝子発現用のプラスミドは、リン酸カルシウム法［モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Molecular and Cellular Biology）、第７巻、第２７４５頁（１９８７）］、電気穿孔法［プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ、第８１巻、第７１６１頁（１９８４）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［メソッズインヌクレイックアシッズリサーチ（Methods in Nucleic Acids Research)、第２８３頁、カラムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行］、リポソーム法［バイオテクニークス（BioTechniques)、第６巻、第６８２頁（１９８９）］等によって適当な宿主細胞に導入することができる。かかる宿主細胞としては、ＣＯＳ１細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ−２１細胞、ＢＨＫ−２１細胞等が挙げられる。得られた形質転換細胞を適当な培地で培養することにより、目的の有用遺伝子産物を効率よく製造することができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００３３】
実施例１
井原らによって報告されているＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子［ジャーナルオブバイオケミストリー、第１１３巻、第６９２頁（１９９３）］を含むゲノム領域が挿入されたコスミドクローンＨｕｇ３を制限酵素Sph I とNae I （ともに宝酒造社製）で消化し、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから１．１ｋｂの断片を切り出し、イージートラップ（EASYTRAP^TM、宝酒造社製）を用いてＤＮＡを回収し、この断片をSph I とHinc II で消化したｐＵＣ１９とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、塩化カルシウム法によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。得られたアンピシリン耐性菌のコロニーを拾いあげて培養し、その菌体からアルカリ法によってプラスミドを調製した。ｐＵＣ１９のマルチプルクローニングサイトにはHind III部位、Sph I 部位、Hinc II 部位、Bam HI部位がこの順に互いに近接して並んでいた。プラスミドをBam HIとHind IIIで二重消化した後、アガロースゲル電気泳動において、１．１ｋｂのHind III−Bam HI断片を持つことを確認（この断片の塩基配列は配列番号：１に示される配列であった）した後、該プラスミドをプラスミドｐＨｕｇ５’−２０４とした。該プラスミドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した後、Escherichia coli XL1-Blue/pHug5'-204（工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５５３２として寄託されている）を得た。
【００３４】
次いで、ｐＨｕｇ５’−２０４をBam HIとHind IIIで消化し、１．１ｋｂ断片をアガロースゲルからイージートラップを用いて回収し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）によって末端を平滑化した。一方、プロモーターを欠いた西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ＳＶ４０エンハンサー、大腸菌の複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドであるエンハンサーベクター（東洋インキ社製）を西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子のすぐ上流に位置するSma I 部位で消化し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによって先に回収した１．１ｋｂ断片と連結した後塩化カルシウム法によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。
【００３５】
１．１ｋｂ断片の挿入の向きを調べる目的でアンピシリン耐性菌からアルカリ法でプラスミドを調製し、Xho I で消化してアガロースゲル電気泳動を行った。制限酵素地図から１．１ｋｂ断片が西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子と同じ向きに挿入されていれば０．８ｋｂ断片が、逆向きに挿入されていれば０．３ｋｂ断片が観察されると予想されるので、０．８ｋｂXho I 断片を持つプラスミドを選び出すことによってｐＰＧ２０４−１．１を得た。
【００３６】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地［１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラクト（共にディフコ社製）、０．５％ＮａＣｌ］が２００ｍｌ入った２リットル容三角フラスコにｐＰＧ２０４−１．１を保持する大腸菌を接種し、３７℃で１晩振盪培養し、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１９８７）に記載の塩化セシウム平衡密度勾配遠心法によってプラスミドを調製した。１０ｃｍペトリディッシュ１枚当たり２０μｇのｐＰＧ２０４−１．１をモレキュラーアンドセルラーバイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１９８７）に記載のリン酸カルシウム法でＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）にトランスフェクトした。
【００３７】
トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞のルシフェラーゼ活性は、ピッカジーンキット（東洋インキ社製）を用い、キットの説明書の指示に従って測定した。トランスフェクションの４８時間後にキットの細胞溶解液０．７ｍｌに細胞を懸濁し、その上清２０μｌと発光基質１００μｌを混合してただちに液体シンチレーションカウンターで発光強度を測定した。ポジティブコントロールとしてキットに含まれるコントロールベクター（ＳＶ４０プロモーター）、ネガティブコントロールとしてエンハンサーベクターでトランスフェクトした細胞を用いた。
【００３８】
その結果、本発明のＤＮＡ断片を用いたもの（ｐＰＧ２０４−１．１）は、ＳＶ４０プロモーターよりも遙かに強いプロモーター活性をもっていた。
【００３９】

【００４０】
実施例２
ｐＨｕｇ５’−２０４をXho I で消化し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼによって末端を平滑化し、更にBam HIで消化してアガロースゲル電気泳動の後、０．８ｋｂ断片（断片Ａ）をイージートラップを用いて回収した。また、ｐＨｕｇ５’−２０４をSsp I とBam HIで消化して０．５ｋｂ断片（断片Ｂ）、及びHinc II とBam HIで消化して０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を断片Ａと同様に回収した。
【００４１】
断片Ａは配列番号：１のＤＮＡ断片の第３００番目のＣから第１１１６番目のＣまでの８１７ｂｐのＤＮＡ断片であり、断片Ｂは配列番号：１のＤＮＡ断片の第５９５番目のＡから第１１１６番目のＣまでの５２２ｂｐのＤＮＡ断片であり、断片Ｃは配列番号：１のＤＮＡ断片の第９１７番目のＧから第１１１６番目のＣまでの２００ｂｐのＤＮＡ断片である。断片Ａ、断片Ｂ、または断片ＣをSma I とBam HIで消化したエンハンサーベクターと連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮＡを抽出し、Sca I とHind IIIで切断して目的の断片が挿入されていることを確認した。即ち、断片Ａが挿入されていると２．０ｋｂ、断片Ｂが挿入されていると１．７ｋｂ、断片Ｃが挿入されていると１．４ｋｂの断片が見られる。このようにして断片Ａを持つｐＰＧ２０４−０．８、断片Ｂを持つｐＰＧ２０４−０．５、及び断片Ｃを持つｐＰＧ２０４−０．２を得た。
【００４２】
ｐＰＧ２０４−０．８、ｐＰＧ２０４−０．５、及びｐＰＧ２０４−０．２を保持する大腸菌から実施例１と同様に塩化セシウム平衡密度勾配遠心法でプラスミドを調製し、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を実施例１と同様の方法で測定した。但し、発光強度はルミノメーター（ＬＢ９５０１、ベルトールド社製）で測定した。
その結果、縮小化した断片は１．１ｋｂのSph I −Nae I 断片に比べて２倍〜３倍のプロモーター活性を有していた。
【００４３】

【００４４】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ断片をプロモーターとして用いることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞において大量に発現させることができる。
【００４５】
【配列表】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ（ｐＰＧ２０４−１．１）とヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子ｃＤＮＡ（Ｈ１５、Ｈ２０等）との関係を示した概略図である。
【図２】図２は、ｐＨｕｇ５’−２０４の挿入断片の制限酵素地図を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel promoter and a gene expression method using the promoter. More specifically, the present invention relates to a DNA containing a novel promoter that can work in animal cells, and a method for producing a protein using a vector containing a DNA obtained by linking a nucleic acid encoding a protein downstream of the promoter. . Furthermore, the present invention relates to a method for expressing a useful gene by linking a useful gene downstream of the promoter and introducing the obtained DNA or a vector containing the DNA into animal cells.
[0002]
[Prior art]
When producing useful gene products derived from animals by genetic engineering, if a microbial host such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, or yeast is used, the gene will not be expressed, or the protein that is the gene product will not have the correct three-dimensional structure. Often it is not active, for example because the modification is not made correctly. In order to solve the problem, animal cells are often used as a host, and in this case, selection of a promoter greatly affects the expression efficiency. Conventionally frequently used promoters for animal cells include SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, actin promoter and the like.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
When a large amount of useful gene products are produced using animal cells as a host, conventionally used promoters for animal cells are not always satisfactory in terms of transcriptional activity, and development of stronger promoters is awaited.
Accordingly, a first object of the present invention is to provide a DNA having a strong promoter activity as a promoter for animal cells. A second object of the present invention is to provide a recombinant DNA in which a DNA having promoter activity of the present invention and a useful gene are linked in an expressible state. A third object of the present invention is to provide a vector containing the recombinant DNA of the present invention. The fourth object of the present invention is to provide an animal cell having the recombinant DNA of the present invention and an animal having the animal cell. A fifth object of the present invention is to provide a method for producing a protein using the promoter. A sixth object of the present invention is to provide a useful gene expression method using the promoter.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have conducted intensive research for the purpose of obtaining a promoter having high transcription efficiency in animal cells. As a result, a strong promoter is located upstream of the human N-acetylglucosaminyltransferase III (human GnT-III) gene. Found it to exist. When the nucleotide sequence of the DNA containing this promoter was determined and the DNA was ligated upstream of the western firefly luciferase gene to express the luciferase gene, the promoter was far more than the conventionally known promoter for animal cells. It was confirmed that it is a strong promoter. The present invention has been completed by further research based on this discovery.
[0005]
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) DNA selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or a part thereof, and having promoter activity in animal cells Having DNA,
(2) Selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing 1.1 kb or smaller DNA that can hybridize at 65 ° C. in a solution containing DNA and 6 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 100 μg / ml salmon sperm DNA, 5 × Denharz DNA having promoter activity in animal cells,
(3) The DNA according to (2), which is a DNA of 0.2 kb to 1.1 kb,
( 4 ) (1) to ( 3 A recombinant DNA characterized in that the DNA according to any one of the above and a useful gene are linked in an expressible state;
( 5 The useful gene is a nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding a protein, a nucleic acid encoding an antisense RNA, a nucleic acid encoding a decoy, and a nucleic acid encoding a ribozyme, 4 The recombinant DNA according to
( 6 ) Said ( 4 Or 5 A vector containing the recombinant DNA of
( 7 The vector is a plasmid vector or a viral vector. 6 ) The vector described,
( 8 ) Said ( 4 Or 5 An animal cell into which the recombinant DNA according to claim 1 is introduced,
( 9 ) Said ( 6 Or 7 ) Animal cells transformed with the vector according to
( 10 ) Said ( 8 Or 9 A mammal other than a human having the animal cell of
( 11 ) (1) to ( 3 ) A nucleic acid encoding a protein is linked to the downstream of the DNA of any one of the above in an expressible manner, and animal cells transformed with a vector containing the resulting recombinant DNA are cultured, and then the protein is extracted from the culture. A method for producing a protein using animal cells,
( 12 ) (1) to ( 3 A useful gene derived from an animal cell, characterized in that the useful gene is linked downstream of the DNA of any one of claims 1 so that the gene can be expressed, the resulting recombinant DNA is introduced into the animal cell, and then the animal cell is cultured. Expression method,
( 13 ) (1) to ( 3 ) Characterized in that a useful gene is linked so that it can be expressed downstream of the DNA described in any one of the above items, an animal cell is transformed with a vector containing the resulting recombinant DNA, and then the animal cell is cultured. The present invention relates to a method for expressing useful genes by animal cells.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
The “promoter” as used in the present specification is 20-30 base pairs upstream from the transcription start point (+1) and has a function of causing RNA polymerase to initiate transcription from an accurate position, or similar to the TATA box However, it is not necessarily limited to before and after these regions, and in addition to this region, a region necessary for protein other than RNA polymerase to associate for expression regulation may be included. . In the present specification, there is a case where it is described as “promoter region”, and this indicates a region containing a promoter as used herein.
[0007]
The term “promoter activity” as used herein refers to the production of a gene product of a useful gene in or outside the host when the useful gene is linked in a state that can be expressed downstream of the promoter and introduced into the host (animal cell). It has the ability and function to do.
Generally, a gene encoding a protein that can be easily quantified (reporter gene) is linked downstream of the promoter in an expressible state, introduced into a host, and the expression level of these proteins is measured to determine the presence or absence of the promoter. And the strength is expressed as promoter activity. Thus, when a useful gene is linked in a state that can be expressed downstream of the promoter and introduced into the host, and expression of the gene product of the useful gene is confirmed in the host or outside the host, the promoter is introduced in the introduced host. It will have promoter activity.
[0008]
“Animal cells” as used herein include human-derived cells, but are not particularly limited as long as the promoter of the present invention has promoter activity in the animal cells. For example, mammals other than humans (eg, mice, rats, rabbits, goats, pigs, cows, horses, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.), birds (eg, chickens, turkeys, quail, ducks, ducks, etc.), reptiles (eg, , Snakes, crocodiles, turtles, etc.), amphibians (eg, frogs, salamanders, newts, etc.), fishes (eg, horse mackerel, mackerel, sea bass, Thailand, grouper, yellowtail, tuna, salmon, trout, carp, ayu, eel, flounder) , Shark, ray, sturgeon, etc.).
[0009]
The “useful gene” referred to in the present specification encodes a nucleic acid encoding a protein that can be expressed in animal cells, an antisense DNA or antisense RNA of a gene derived from animal cells, and a binding protein of a transcription factor derived from animal cells. Examples include a nucleic acid encoding a decoy having a sequence of a gene or transcription factor binding site or a similar sequence, and a ribozyme that cleaves animal cell-derived mRNA.
[0010]
Examples of nucleic acids encoding proteins that can be expressed in animal cells include those derived from animals. However, in the present invention, this is not limited, and bacteria, yeasts, and rays can be used as long as they can be expressed in animal cells. Useful genes referred to in the present specification include those derived from microorganisms such as fungi, filamentous fungi, ascomycetes, basidiomycetes, and organisms such as plants and insects.
[0011]
The term “nucleic acid encoding decoy” as used herein refers to a gene encoding a transcription factor binding protein derived from an animal cell, or a DNA having a transcription factor binding site sequence or a similar sequence. ”Refers to those that suppress the action of transcription factors by being introduced into cells.
As used herein, “ribozyme” refers to a substance that cleaves mRNA of a specific protein and inhibits translation of the specific protein. The ribozyme can be designed from a gene sequence encoding a specific protein. For example, as a hammerhead type ribozyme, the method described in FEBS Letter, Vol. 228, pages 228-230 (1988) can be used. Can be used. In addition, not only hammer-head ribozymes, but also cleaves mRNAs of specific proteins regardless of the type of ribozymes such as hairpin ribozymes, delta ribozymes, etc., and they inhibit the translation of these specific proteins. For example, it is included in the ribozyme referred to in the present specification.
[0012]
By linking a useful gene downstream of the DNA fragment having promoter activity of the present invention in a state where the useful gene can be expressed, the expression of the useful gene can be enhanced. That is, the useful gene is expressed in animal cells into which the recombinant DNA obtained by ligating the DNA having promoter activity of the present invention and the useful gene in an expressible state is introduced via a vector or without using a vector. . As the vector, a plasmid vector or a viral vector is preferably used. When no vector is used, DNA fragments can be introduced by literature methods (Virology, 52, 456 (1973), Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987), Journal of the National Cancer Institute, 41, 351 (1968), EMBO Journal, 1, 841 (1982)].
[0013]
Animal cells having such recombinant DNA fragments of the present invention and animals having such animal cells are also within the scope of the present invention. Examples of useful genes whose expression can be enhanced according to the present invention include, as described above, for example, DNA encoding proteins, antisense DNA, antisense RNA, polynucleotides encoding decoys, nucleotide sequences functioning as decoys, ribozymes, etc. Is mentioned. In addition, the present invention discloses a method for producing a target protein and a method for expressing a useful gene using the DNA fragment having the promoter activity of the present invention.
[0014]
That is, a nucleic acid encoding a protein is linked downstream of the DNA having promoter activity of the present invention so that the protein can be expressed, and animal cells transformed with a vector containing the resulting recombinant DNA are cultured, and the protein is extracted from the culture. A method for producing a protein that collects the protein is also included in the scope of the present invention. Similarly, a method for expressing a useful gene by ligating a useful gene downstream of the DNA having promoter activity of the present invention so that the gene can be expressed, introducing the resulting recombinant DNA into animal cells, and culturing the gene, or the recombinant DNA Also included in the scope of the present invention is a method of expressing useful genes by animal cells by transforming animal cells with a vector containing, and culturing the animal cells.
[0015]
The DNA of the present invention has promoter activity for animal cells and contains all or part of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. That is, the DNA fragment of the present invention is a DNA fragment containing a novel promoter, and any DNA fragment in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be used as long as the promoter is included. Any DNA fragment containing a part of the DNA sequence represented by 1 may be used. For example, although not particularly limited, all or part of the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 2, the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 3, and the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 4, or Examples thereof include DNA fragments. In addition, DNA fragments that can hybridize with these DNA fragments and have promoter activity in animal cells are also included in the DNA fragments of the present invention.
[0016]
The promoter for animal cells of the present invention has been discovered as follows.
The human GnT-III gene was isolated from fetal liver cDNA library and genomic cosmid library by Ihara et al [Journal of Biochemistry, 113, 692-698 (1993)]. I used these. Among cDNA clones encoding the human GnT-III gene, H15 and H20 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-62865) contain a 5 ′ untranslated region, and the DNA sequence of this region is 8 bases upstream of the expected start codon. It is different except for the pair. As genomic clones, cosmids Hug3 and Hug5 have been obtained, of which Hug3 contains the coding region of the GnT-III gene and about 35 kb upstream thereof.
[0017]
Therefore, by performing Southern hybridization of Hug3 cosmid clone using 5 ′ untranslated region of each of H15 and H20 as a probe, analysis of DNA base sequence, etc., H15 is about 29 kb upstream of the start codon (H15 exon-2). It was revealed that 1 kb (H15 exon-1) and H20 have an exon about 26 kb (H20 exon-1) upstream of the start codon. In addition, when 5'-rapid amplification of cDNA end (RACE) was performed using a human brain-derived mRNA as a template and a GnT-III gene-specific primer, a start codon in which splicing is performed in H15 and H20. It was found that there was mRNA that was not spliced at a site of 7 base pairs upstream. The cDNA obtained from this mRNA is called H204.
[0018]
From these results, it was revealed that human GnT-III gene transcripts consist of at least three types. Since the promoters involved in the transcription of H15, H20, and H204 are considered to exist in the upstream region of H15 exon-2, the upstream region of H20 exon-1, and the upstream region on the genome of the predicted translation start point, respectively. When the promoter activity in COS1 cells of a DNA fragment containing these regions was measured using the firefly luciferase gene as a reporter gene, H15 as shown in FIG. 1 (in the figure, the box display indicates the exon portion and the broken line indicates the intron portion). Promoter activity could not be detected in the approximately 3 kb fragment upstream of the H20 region from the Hind III site inside exon-2 to the SacII site inside H20 exon-1 (the plasmid containing this was called pPG20B). However, from the EcoR I site upstream of the H15 region to an approximately 3 kb fragment containing a part of the Hind III site inside the H15 exon-2 (the plasmid containing this is called pPG15) and from the Sph I site upstream of the coding region to the inside of the coding region. An about 1.1 kb fragment containing up to the Nae I site (a plasmid containing this fragment is called pPG204-1.1), ie, a fragment containing H204 has promoter activity, the latter being about 10 times the former, and the SV40 promoter It was found to have about 1.5 times stronger activity.
[0019]
Further, in this 1.1 kb fragment, there is an Xho I site at a position of about 0.8 kb from the Nae I site, an Ssp I site at a position of about 0.5 kb, and a Hinc II site at a position of 0.2 kb. 1.1 is digested with any one of these restriction enzymes and Bam HI which has a cleavage site at the multiple cloning site of the vector, a 0.8 kb fragment containing the GnT-III start codon (referred to as fragment A), 0. A 5 kb fragment (referred to as fragment B) and a 0.2 kb fragment (referred to as fragment C) can be cut out. These fragments were found to have promoter activity 2-3 times stronger than the above 1.1 kb fragment and 3-5 times stronger promoter activity than the SV40 promoter. Thus, the present inventors have clarified that a DNA fragment containing about 0.2 to about 1 kb upstream of the coding region of the human GnT-III gene has a strong promoter activity, and reached the present invention. . Hereinafter, the method for obtaining a DNA fragment of the present invention will be described in detail.
[0020]
(1) Base sequence of DNA fragment having promoter activity in animal cells
A genomic cosmid clone containing the upstream part of the human GnT-III gene, for example, cosmid clone Hug3 of Ihara et al. Is cleaved with restriction enzymes Sph I and Nae I (both manufactured by Takara Shuzo), and immediately upstream of the region encoding GnT-III. The containing 1.1 kb DNA fragment is isolated. This DNA fragment has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This fragment is subcloned into a plasmid vector, for example, pUC19 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) so that it can be easily used for the purpose of ligation with a useful gene.
[0021]
The base sequence of the subcloned 1.1 kb Sph I-Nae I fragment (pHug5′-204) is, for example, the dideoxy method [Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA], 74, page 5463 (1977)]. In general, since it is difficult to determine the base sequence of a 1.1 kb DNA fragment in a single reaction, further subdividing with an appropriate restriction enzyme, subcloning and performing a dideoxy reaction, a series of deletion plasmids using exonuclease III The method of performing a dideoxy reaction after preparing the above, the method of sequentially synthesizing primers based on the determined sequence and performing the dideoxy reaction, and the like can be used. In the present invention, Bst XI, Xho I, Ssp I, Kpn I, and Hinc II are used as restriction enzymes to subdivide (the restriction enzyme map of the insert fragment of pHug5′-204 is shown in FIG. 2), and subcloning to dodeoxy reaction. Was performed to determine the base sequence of pHug5′-204 as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0022]
In this 1.1 kb fragment, as shown in FIG. 2, there is an Xho I site at about 0.8 kb from the Nae I site, an Ssp I site at about 0.5 kb, and a Hinc II site at 0.2 kb. Yes, by digesting pHug5'-204 with any one of these restriction enzymes and Bam HI which has a cleavage site at the multiple cloning site of the vector, both containing the GnT-III start codon : A 0.8 kb fragment (fragment A) shown in 2; a 0.5 kb fragment (fragment B) shown in SEQ ID NO: 3; and a 0.2 kb fragment (fragment C) shown in SEQ ID NO: 4.
[0023]
(2) Preparation of DNA fragment containing the promoter of the present invention
Digestion of the above cosmids or plasmids with restriction enzymes Sph I and Nae I (both from Takara Shuzo), or digestion with restriction enzymes such as Xho I, Ssp I, Hinc II, etc. Is the law. In addition, a digestion method using other restriction enzymes, a method using ultrasonic treatment, a chemical synthesis method using a phosphoramidite method, a method using a polymerase chain reaction method, and the like can also be used. For example, a primer can be appropriately prepared from a DNA sequence such as SEQ ID NO: 1, and a desired DNA fragment can be easily prepared by a polymerase chain reaction method.
[0024]
The promoter of the present invention can also be obtained from genes derived from other cells by a hybridization method utilizing the base sequence of the promoter of the present invention. In this case, for example, the following method can be applied. First, chromosomal DNA obtained from the gene source of another cell is connected to a plasmid or phage vector according to a conventional method and introduced into a host to prepare a library. The library is cultured on a plate, and the grown colonies or plaques are transferred to a nitrocellulose or nylon membrane, and DNA is fixed to the membrane by denaturation treatment. This membrane is pre- ³² A probe labeled with P or the like (as a probe, a DNA fragment described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a part thereof, for example, fragment A (SEQ ID NO: 2), fragment B (SEQ ID NO: 3), or fragment C (SEQ ID NO: 4 or the like can be used) is incubated, and a hybrid is formed between the DNA on the membrane and the probe.
[0025]
For example, a DNA-immobilized membrane is hybridized with a probe for 20 hours at 65 ° C. in a solution containing 6 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 100 μg / ml salmon sperm DNA, 5 × denharz. . After hybridization, nonspecific adsorption is washed away, and clones hybridized with the probe are identified by autoradiography or the like. This operation is repeated until the hybridized clone becomes single. In the thus obtained clone, DNA encoding the target promoter is inserted.
[0026]
The base sequence of the obtained gene is determined, for example, as follows, and it is confirmed whether the obtained gene is a target promoter. For the determination of the base sequence, in the case of a clone obtained by hybridization, if the recombinant is Escherichia coli, it is cultured in a test tube or the like, and the plasmid is extracted according to a conventional method. This is cleaved with a restriction enzyme, the inserted fragment is taken out, subcloned into an M13 phage vector or the like, and the base sequence is determined by the dideoxy method. When the recombinant is a phage, the base sequence can be determined basically by the same steps. For basic operations from culture to sequencing, for example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, T.W. Can be performed as described in T. Maniatis, Chapter 1, pages 90-104, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
[0027]
Whether the obtained gene is the target promoter can be estimated from its homology by comparing the determined nucleotide sequence with the promoter of the present invention. If it is considered that the obtained gene does not contain all of the promoter, a synthetic DNA primer is prepared based on the obtained gene, and a region lacking by PCR is amplified, or a fragment of the obtained gene is By further screening a DNA library or cDNA library as a probe, the base sequence of the entire coding region of the promoter that hybridizes to the promoter of the present invention can be determined.
[0028]
In the method for expressing a useful gene of the present invention, a DNA fragment obtained by linking a useful gene so that it can be expressed downstream of the promoter of the present invention thus obtained is introduced into an animal cell and the resulting cell is cultured It is characterized by this. DNA ligase or a homopolymer method can be used to link the useful gene of interest in the downstream of the DNA fragment containing the promoter of the present invention prepared as described above. In the case of ligation by DNA ligase, for example, when both have the same restriction enzyme site, after digestion with this restriction enzyme, for example, Molecular Cloning Laboratory Manual, Second Edition, T.W. Mix both DNA fragments in the reaction buffer described in Maniatis et al., Chapter 1, Page 62, Cold Spring Harbor Laboratory, Inc., 1989, and add both DNA ligases. If the restriction enzyme site is not present, the ends are blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo) and then ligated by treatment with DNA ligase as described above. On the other hand, when the homopolymer method is used, a poly G chain is added to the 3 ′ end of the vector linearized with a restriction enzyme by terminal deoxyribonucleotidyl transferase and dGTP, and the insert DNA has the same 3 ′ end. Poly C chain is added to these, and these poly G chain and poly C chain are annealed and introduced into Escherichia coli, for example, by the calcium chloride method [Proceedings of National Academy of Sciences of the USA, vol. 75, p. 3727] (1978)].
[0029]
Examples of useful genes that can be used in the present invention include interleukin 1-12 gene, interferon α, β, γ gene, tumor necrosis factor gene, colony stimulating factor gene, erythropoietin gene, transforming growth factor-β gene, immunity Examples include, but are not limited to, globulin genes, tissue plasminogen activator genes, urokinase genes, and firefly luciferase genes.
[0030]
The DNA fragment obtained by linking the DNA fragment of the present invention and a useful gene obtained as described above can be incorporated into an appropriate vector for animal cells to obtain a plasmid for gene expression. Such vectors include pTM [Nucleic Acids Research, 10, 6715 (1982)], cos 202 [The EMBO Journal, 6, 355 (1987)], p91203 (B) [Science, 228, 810 (1985)], BCMGSNeo [Journal of Experimental Medicine, 172, 969 (1990)], etc. Can be mentioned.
[0031]
The obtained plasmid for gene expression was obtained by the calcium phosphate method [Molecular and Cellular Biology, Vol. 7, p. 2745 (1987)], electroporation [Proceedings of National Academy of Sciences of USA, 81, 7161 (1984)], DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Research, page 283, edited by Column et al., CRC Press, 1991], liposome It can be introduced into an appropriate host cell by the method [BioTechniques, Vol. 6, page 682 (1989)]. Such host cells include COS1 cells, HELA cells, CHO-21 cells, BHK-21 cells and the like. By culturing the obtained transformed cells in an appropriate medium, the desired useful gene product can be efficiently produced.
[0032]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
[0033]
Example 1
The cosmid clone Hug3 inserted with the genomic region containing the GnT-III gene [Journal of Biochemistry, Vol. 113, p. 692 (1993)] reported by Ihara et al. Is used as restriction enzymes Sph I and Nae I (both Takara Shuzo). And agarose gel electrophoresis was performed. A 1.1 kb fragment was cut out from the gel and the Easy Trap (EASYTRAP ^TM DNA was collected using Takara Shuzo Co., Ltd., and this fragment was ligated with pUC19 digested with Sph I and Hinc II with T4 DNA ligase and then introduced into E. coli XL1-Blue by the calcium chloride method. The obtained colonies of ampicillin-resistant bacteria were picked up and cultured, and a plasmid was prepared from the cells by the alkali method. In the multiple cloning site of pUC19, a Hind III site, a Sph I site, a Hinc II site, and a Bam HI site were arranged close to each other in this order. After double digesting the plasmid with Bam HI and Hind III, it was confirmed by agarose gel electrophoresis that it had a 1.1 kb Hind III-Bam HI fragment (the base sequence of this fragment is the sequence shown in SEQ ID NO: 1). The plasmid was designated as plasmid pHug5′-204. After transforming Escherichia coli XL1-Blue with the plasmid, Escherichia coli XL1-Blue / pHug5'-204 (deposited as FERM BP-5532 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology) was obtained.
[0034]
Subsequently, pHug5′-204 was digested with Bam HI and Hind III, and a 1.1 kb fragment was recovered from the agarose gel using an easy trap, and in the presence of dATP, dGTP, dCTP and dTTP, T4-DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo). ) To smooth the ends. On the other hand, an enhancer vector (manufactured by Toyo Ink), which is a plasmid containing a western firefly luciferase gene lacking a promoter, SV40 enhancer, E. coli replication origin and ampicillin resistance gene, is located immediately upstream of the western firefly luciferase gene. And digested with T4-DNA ligase and ligated with the 1.1 kb fragment previously recovered, and then introduced into E. coli XL1-Blue by the calcium chloride method.
[0035]
For the purpose of examining the direction of insertion of the 1.1 kb fragment, a plasmid was prepared from an ampicillin-resistant bacterium by an alkaline method, digested with Xho I, and subjected to agarose gel electrophoresis. From the restriction enzyme map, if the 1.1 kb fragment is inserted in the same orientation as the Western firefly luciferase gene, it is expected that the 0.8 kb fragment will be observed, and if inserted in the reverse direction, the 0.3 kb fragment will be observed. PPG204-1.1 was obtained by selecting a plasmid with a 0.8 kb Xho I fragment.
[0036]
PPG204-1 in a 2 liter Erlenmeyer flask containing 200 ml of LB medium [1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract (both manufactured by Difco), 0.5% NaCl] containing 100 μg / ml ampicillin. 1. Inoculated with E. coli containing 1 and cultured overnight at 37 ° C. with shaking, and a plasmid was prepared by cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation described in Molecular and Cellular Biology, Volume 7, page 2745 (1987) . 20 μg of pPG204-1.1 per 10 cm Petri dish was transfected into COS1 cells (ATCC CRL 1650) by the calcium phosphate method described in Molecular and Cellular Biology, Volume 7, page 2745 (1987).
[0037]
The luciferase activity of the transfected COS1 cells was measured using a Picker Gene kit (manufactured by Toyo Ink) according to the instructions in the kit instructions. 48 hours after transfection, the cells were suspended in 0.7 ml of the cell lysis solution of the kit, 20 μl of the supernatant and 100 μl of the luminescent substrate were mixed, and immediately, the luminescence intensity was measured with a liquid scintillation counter. A control vector (SV40 promoter) included in the kit was used as a positive control, and cells transfected with an enhancer vector were used as a negative control.
[0038]
As a result, the one using the DNA fragment of the present invention (pPG204-1.1) had much stronger promoter activity than the SV40 promoter.
[0039]

[0040]
Example 2
pHug5′-204 was digested with Xho I, blunted with T4-DNA polymerase in the presence of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP, further digested with Bam HI, agarose gel electrophoresis, 0.8 kb fragment ( Fragment A) was recovered using an easy trap. In addition, pHug5′-204 was digested with Ssp I and Bam HI to recover a 0.5 kb fragment (fragment B), and digested with Hinc II and Bam HI to recover a 0.2 kb fragment (fragment C) in the same manner as fragment A. did.
[0041]
Fragment A is an 817 bp DNA fragment from the 300th C to the 1116th C of the DNA fragment of SEQ ID NO: 1, and fragment B is the 595th A to 1116 of the DNA fragment of SEQ ID NO: 1. The 522 bp DNA fragment up to the 1st C, and the fragment C is a 200 bp DNA fragment from the 917th G to the 1116th C of the DNA fragment of SEQ ID NO: 1. Fragment A, fragment B, or fragment C was ligated with an enhancer vector digested with Sma I and Bam HI and introduced into E. coli XL1-Blue. Plasmid DNA was extracted from the resulting ampicillin resistant strain and cut with Sca I and Hind III to confirm that the desired fragment was inserted. That is, a 2.0 kb fragment can be seen when fragment A is inserted, a 1.7 kb fragment when fragment B is inserted, and a 1.4 kb fragment when fragment C is inserted. In this way, pPG204-0.8 having fragment A, pPG204-0.5 having fragment B, and pPG204-0.2 having fragment C were obtained.
[0042]
Plasmids were prepared from E. coli harboring pPG204-0.8, pPG204-0.5, and pPG204-0.2 by cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation in the same manner as in Example 1, and COS-1 cells were transfected. . The luciferase activity of the transfected COS-1 cell extract was measured in the same manner as in Example 1. However, the emission intensity was measured with a luminometer (LB 9501, manufactured by Bertoled).
As a result, the reduced fragment had a promoter activity 2 to 3 times that of the 1.1 kb Sph I-Nae I fragment.
[0043]

[0044]
【The invention's effect】
By using the DNA fragment of the present invention as a promoter, a desired useful gene can be expressed in large amounts in animal cells.
[0045]
[Sequence Listing]

[0046]

[0047]

[0048]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the relationship between DNA containing a promoter of the present invention (pPG204-1.1) and human GnT-III gene cDNA (H15, H20, etc.).
FIG. 2 is a view showing a restriction enzyme map of an inserted fragment of pHug5′-204.

Claims

DNA selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or a part thereof, and DNA having promoter activity in animal cells.

DNA selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, 6 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 100 μg / ml salmon 1. A DNA that can be hybridized at 65 ° C. in a solution containing sperm DNA, 5 × Denharz, or a DNA that is reduced to 1.1 kb or more and has promoter activity in animal cells.

The DNA according to claim 2, which is a DNA of 0.2 kb to 1.1 kb.

Recombinant DNA, wherein the DNA according to any one of claims 1 to 3 and a useful gene are linked in an expressible state.

The group according to claim 4, wherein the useful gene is a nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding a protein, a nucleic acid encoding an antisense RNA, a nucleic acid encoding a decoy, and a nucleic acid encoding a ribozyme. Replacement DNA.

A vector containing the recombinant DNA according to claim 4 or 5 .

The vector according to claim 6, wherein the vector is a plasmid vector or a viral vector.

An animal cell into which the recombinant DNA according to claim 4 or 5 has been introduced.

An animal cell transformed with the vector according to claim 6 or 7 .

A mammal other than a human having the animal cell according to claim 8 or 9 .

A nucleic acid encoding a protein is linked downstream of the DNA according to any one of claims 1 to 3 in an expressible manner, and animal cells transformed with a vector containing the resulting recombinant DNA are cultured, and then cultured. A method for producing a protein using animal cells, which comprises collecting the protein from a product.

An animal characterized in that a useful gene is linked downstream of the DNA according to any one of claims 1 to 3 so that the gene can be expressed, the resulting recombinant DNA is introduced into an animal cell, and then the animal cell is cultured. Methods for expressing useful genes by cells.

A useful gene is linked downstream of the DNA according to any one of claims 1 to 3 so that the gene can be expressed, and an animal cell is transformed with a vector containing the resulting recombinant DNA, and then the animal cell is cultured. A useful gene expression method using animal cells characterized by the above.