JP4177702B2

JP4177702B2 - Adsorbent for blood purification and IgA nephropathy treatment system using the same

Info

Publication number: JP4177702B2
Application number: JP2003124036A
Authority: JP
Inventors: 啓一宮本; 信介の村
Original assignee: 株式会社三重ティーエルオー
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: JP2004321682A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液・体液中の免疫グロブリンA１（IgA１）の中でも特に糖鎖異常型のIgA1を吸着する血液浄化用吸着材、およびそれを用いたIgA腎症治療方法に関する。本発明は、IgA腎症患者血液中から糖鎖異常型IgA１あるいは糖鎖異常型IgA１と細胞性フィブロネクチンの複合体等を、強制的かつ選択的に除去し、IgA1の血液濃度を適正値に調節・維持することにより、IgA腎症の病態を改善させる用途に好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
日本国内では、毎年新規に３万人程の慢性腎不全患者が人工透析治療（維持透析治療）を導入し、多くの場合は死亡するまで透析治療が必要となる（毎年の死亡数は新規人工透析治療導入患者の約半数程度とされる）。即ち、透析治療の必要な腎不全患者総数は年々増加する一方で、臓器移植治療以外には根治的治療が無いのが現状である。しかしながら、生体組織の移植には、免疫拒絶、ドナー不足および生体適合性不全などの多くの重要な社会的・技術的な問題があり大幅な進展は望めない。近年では、この慢性腎不全に陥る患者の３５％以上はIgA腎症が原因であることが知られている。
【０００３】
IgA腎症とは、慢性糸球体腎炎の一種で、腎糸球体メサンギウム領域へ免疫グロブリンタンパクA（IgA）が沈着する疾患である。特にIgA腎症患者血液中のIgA濃度は健常者（通常1mg/ml程度）より高値で、この状態が長年に渡り続くことでIgAが腎臓の糸球体に沈着し、そのため腎臓機能が消失するとされる（Conley, M.E.ら(1980)、Journal of Clinical Investigation、66巻、1432頁）。IgA腎症は１９６９年Bergerらにより提唱された疾患概念であるが、その後３０年以上を経た現在でも本疾患の成因は不明のままである。また臨床的にも蛋白尿、血尿以外には臨床症状に乏しく、病気の進行に気づきにくい疾患でもあり、診断方法も腎生検による方法以外は一般的な方法が無いため、その発見が遅れる場合が多い。
【０００４】
従来より、IgA腎症に対して行われている治療法には、糸球体における抗炎症のための副腎皮質ステロイド剤を用いる方法がある。病初期にステロイド剤治療を開始した場合は、その長期間使用の効果で慢性腎不全への進行を回避することが期待されるが、そのような早期治療が実施できる症例は少ない。しかも、ステロイド剤は副作用が甚大で、多くの患者は何らかの副作用を避けることができない。以上から、ステロイド剤以外のより確実で副作用の少ないIgA腎症の治療方法が望まれていた。
【０００５】
IgAはIgA1とIgA2と呼ばれる２つのサブタイプに分類され、IgA1のヒンジ部と呼ばれる領域に５つの酸素結合型糖鎖が結合していると報告されている（ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、第２４９巻、７２７０−７２８１頁、１９７４年）。一方、IgA2のヒンジ部には、この酸素結合型糖鎖は存在しないことも知られている。
最近、こうしたIgA１の糖鎖の異常が、IgA腎症の原因と関係しているとの興味深い報告がなされた（Iwase, Hitooら(1999)、Trends in Glycosience and Glycotechnology 11巻、 113頁）。特に正常型のIgA１には、通常ヒンジ部にシアル酸-ガラクトース・1-3結合Nアセチルガラクトースの糖鎖が存在するが、IgA腎症患者血液中のIgA1は、その先端分子であるシアル酸が存在しないアシアロ型の割合が高いとされる（Iwase, Hitooら(1996)、Journal of Biochemistry、120巻、 92頁）。また、こうした糖鎖異常型のIgA1同士は結合しやすい性質を有していることも報告されている。加えて、CederholmらはIgA腎症患者血液中には「IgA-フィブロネクチン複合体」が存在することを提案した（Proceedings of the National Academy of Sciences, 85巻、4865-4868頁、1988）。特に該発見はIgA腎症患者の糸球体組織にIgA1以外にもフィブロネクチンが多く沈着する病態を説明できる重要な発見になった。
【０００６】
現在までに、こうしたIgA1の糖鎖異常に関する知見あるいは「IgA-フィブロネクチン複合体」の発見を利用したIgA腎症の診断方法が開発されてきた。例えば田中、錦戸、比企らによるIgA腎症患者血漿中のIgA1のヒンジ部の糖鎖結合数が非IgA腎症患者血漿中のIgA1より多いことを利用したIgA腎症の診断方法（特開平１０−１１１２９１）の発明、比企、田中、錦戸らによるIgA1分子間の結合能の差を検出することによるIgA腎症の診断方法（特開平９−３１１１３２）の発明、更にはCederholmらによる「IgA-フィブロネクチン複合体」の分子間の親和性を利用して複合体量を測定することによるIgA腎症の診断方法および診断キットの発明がある（特許番号２５９２１２１号）。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１０−１１１２９１号公報
【特許文献２】
特開平９−３１１１３２号公報
【特許文献３】
特許番号２５９２１２１号公報
【０００８】
しかしながらこれらの発明は、ＩｇＡ腎症の診断方法およびその診断キットを提供するものであり、ＩｇＡ腎症の治療方法や治療システムを提供するものではなかった。
また該公報等における発明の実施例として血清・血液および体液中からＩｇＡ１を分離する材料として、レクチンの一種である「ジャカリン」をアガロースに固定したジャカリン−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いており、その分離方法は、Ｒｏｑｕｅ−Ｂａｒｒｅｒｉａらの「ジャカリン」を用いる方法（ジャーナルオブイムノロジー、第１３４巻、１７４０−１７４３頁、１９８５年）に基づいている。
【０００９】
ところで、「ジャカリン」は糖鎖異常型ＩｇＡ１や「糖鎖異常型ＩｇＡ１−細胞性フィブロネクチン複合体」のみならず糖鎖正常型ＩｇＡ１にも結合する事が知られている。加えてＩｇＡ２に対する親和性は全く無いと考えられている。即ち、上記の公知の方法では、ＩｇＡ腎症血液中の糖鎖正常型ＩｇＡ１以外のＩｇＡ成分（すなわち糖鎖異常型ＩｇＡ１や「糖鎖異常型ＩｇＡ１−フィブロネクチン複合体」あるいはＩｇＡ２）を選択的に結合させ除去することは不可能である。
ここで、糖鎖異常型ＩｇＡ１あるいは「糖鎖異常型ＩｇＡ１−細胞性フィブロネクチン」が血液中に高濃度で存在する理由としては、糖鎖異常型ＩｇＡ１が体内で分解調節を受けにくいためか、あるいは異常産生されるためかの何れかであると考えられている。しかしながら、患者血液中での濃度バランスの崩れた糖鎖異常型ＩｇＡ１を血液中から強制的に除去することで、腎糸球体への沈着とそれに引き続いて起きる病態の進行を阻止するという治療方法の着想はこれまでになく、またそのために用いる血液浄化用吸着材や治療システムも無かった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＩｇＡ腎症の治療方法として、ＩｇＡ腎症患者血液中の糖鎖異常型ＩｇＡ１及び／又は糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体及び／又はＩｇＡ２濃度を、血液浄化用吸着材を用いて適正値に戻すことにより、腎糸球体にこれらの分子が沈着する病態を改善する治療に用いる血液浄化用吸着材及びその治療システムの提供にある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
IgA腎症に対するIgAの関与については、上述したように糖鎖異常型IgA１あるいは「糖鎖異常型IgA１-フィブロネクチン」が、IgA腎症患者血液中に高濃度で存在することで、腎糸球体に沈着し、それが原因となり糸球体腎炎を引き起こすと考えられる。また発明者らは炎症性疾患の血液中で複合体化しやすいフィブロネクチンは、通常は血液中には殆ど存在しない「細胞性フィブロネクチン」である可能性が高いことを発見した（IgA1との複合体を「糖鎖異常型IgA１-細胞性フィブロネクチン」と呼ぶ）。「細胞性フィブロネクチン」と通常血漿中に存在するフィブロネクチンの大きな違いは分子量にあり、血漿フィブロネクチンは分子量約４５万であるが、「細胞性フィブロネクチン」分子にはエキストラドメイン構造と呼ばれる分子量約１０，０００のモジュール構造が、更に多く含まれるのが特徴である。
【００１２】
本発明者は、上述の本発明者による発見に基づいて、血液中のIgA濃度を調節することで、病気の進行を制御することを目的とする血液浄化用吸着材を提供するために鋭意研究を重ねた結果、ジャカリン及び／又はその誘導体が水不溶性担体に固定化された材料が好適であることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、１番目の発明は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）腎症患者血液中の、糖鎖異常型ＩｇＡ１及び／又は糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体及び／又はＩｇＡ２の吸着材がジャカリン及び／又はその誘導体で構成され、且つ該ジャカリン及び／又はその誘導体が水不溶性担体に固定化された構造体を有し、前記水不溶性担体がセルロース、ジェラン、硫酸化ジェラン、ジャカリンの何れかであることを特徴とする血液浄化用吸着材の提供にある。
次に２番目の発明は、前記のジャカリンにおいて、その分子数が２〜６からなるジャカリン複合体であって且つその分子量が１００〜３００ＫＤａであることを特徴とする血液浄化用吸着材の提供にある。
次に３番目の発明は、前記のジャカリン誘導体が、ジャカリン複合体を４５℃以上１００℃以下の温度で熱処理して得られる熱処理ジャカリン分解物であって、その分子量が１〜２０ＫＤａであることを特徴とする血液浄化用吸着材の提供にある。
次に４番目の発明は、一番目の発明における水不溶性担体が粒径１００〜５００μｍの粒子であることを特徴とする血液浄化用吸着材の提供にある。
次に５番目の発明は、一番目の発明における水不溶性担体が繊維径１００〜５００μｍの範囲の繊維状構造物であることを特徴とする血液浄化用吸着材の提供にある。
次に６番目の発明は、前記の血液浄化用吸着材を用いて、ＩｇＡ腎症患者の体外において、該患者の血液から糖鎖異常型ＩｇＡ１及び／又は糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体及び／又はＩｇＡ２を除去することを特徴とするＩｇＡ腎症治療システムの提供にある。
次に７番目の発明は、請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の血液浄化用吸着材を用いるＩｇＡ腎症治療システムであって、
ＩｇＡ腎症患者の体外に取出した血液をまず細胞成分と血漿成分に分離する。このうち前記血漿成分のみを前記血液浄化用吸着剤に接触させ、前記血漿成分中に含まれる前記糖鎖異常型ＩｇＡ１、前記糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体、及び前記ＩｇＡ２を強制的に除去し血漿成分を浄化する。その後浄化された血漿成分と、前記細胞成分とを再度を合せＩｇＡ腎症患者の体内に戻すことを特徴とするＩｇＡ腎症治療システムの提供にある。
次に８番目の発明は、請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の血液浄化用吸着材を用いるＩｇＡ腎症治療システムであって、
血漿分離カラムと、血液浄化用吸着材充填カラムと、ポンプと、で構成される。
各構成物のうち、血漿分離カラムは患者の体内より取出す血液を血漿成分と細胞成分に分離する。また、血液浄化用吸着材充填カラムは分離された血漿成分中から前記糖鎖異常型ＩｇＡ１と、前記糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体、及び前記ＩｇＡ２を吸着除去して浄化し、処理血漿成分とする。
また、ポンプは前記ＩｇＡ腎症患者から取り出された血液を前記血漿分離カラムに供給し、且つ、前記処理血漿成分と前記細胞成分とを合わせ患者体内に循環させる機能を有する。
【００１４】
【本発明の実施の形態】
以下に本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１５】
本発明に使用する「ジャカリン」とは桑科の果実であるジャックフルーツ（Artocarpus heterophyllus）の種子に含まれる植物レクチンの一種であり、抽出・精製して得られるものである。果実は特に限定されるものではないが、おもにジャックフルーツがその名前の由来であることからも、最も多く含まれ、また抽出も容易である。通常、「ジャカリン」はジャックフルーツの種子から抽出されるタンパク質の５０％以上を占めているとされる（Kabirら、Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, １６巻、１５３頁、１９９３）。
【００１６】
一般にレクチン類は特定の糖鎖構造を認識するタンパク質として知られ、特に植物のレクチンには、動物タンパクを特異的に認識できる特殊な性質を有しているものが多く知られている。「ジャカリン」はIgAの糖鎖を認識するレクチンとして知られ、その認識糖鎖は１種類に限定されないが、酸素結合型で正常型IgA1の糖鎖構造であるシアル酸ガラクトース1-3結合Nアセチルガラクトース、あるいはガラクトース1-3結合Nアセチルガラクトース（異常型糖鎖）が親和性が高い構造として知られている。（S. KabirらJournal of Immunological Methods ２１２巻、１９３−２１１頁、１９９８年）
ヒト血清タンパク質の中で酸素結合型の糖鎖、すなわちタンパク質分子中のアミノ酸であるセリンまたはトレオニンの水酸基に結合しているガラクトース1-3結合Nアセチルガラクトース糖鎖を持つものは少なく、そのほとんどはアスパラギンのアミノ基に結合するN結合型である。IgA１分子は正常型・異常型の何れも酸素結合型の糖鎖を有しており、「ジャカリン」に特異的に認識され結合すると考えられている。
【００１７】
ところで、「ジャカリン」は４つのα鎖と呼ばれる分子量約１５ＫDaのサブユニット構造と４つのβ鎖と呼ばれる分子量約２．１ＫDaから成り立つ分子量約６５ＫDaの糖タンパク質である。本発明における「ジャカリン」の形態は、こうした「ジャカリン」１分子でその分子量が２０〜１００ＫＤａのものでも良いが、より効果的な構造としては、ジャックフルーツの種子から低温で抽出することにより得られる複合体（「ジャカリン」が約２〜６分子且つ分子量が１００〜３００KDaで構成され、これを「ジャカリン複合体」と呼ぶ）、又はこの抽出した「ジャカリン複合体」を４５℃〜１００℃の温度で熱処理をすることにより、分子量約１〜２０ＫDa以下に分解した物（これを「熱処理ジャカリン分解物」と呼ぶ）の２つの形態であるほうがより望ましい。その理由は、ジャカリンは熱処理することで、糖鎖異常型IgA1に対する結合性が向上し、また複合体化することでIgA2に対する結合親和性が向上することを本発明者が発見したためである。
【００１８】
次に、本発明の血液浄化用吸着材は、これら「ジャカリン複合体」もしくは「熱処理ジャカリン分解物」あるいは「ジャカリン」を、水不溶性担体に導入することにより完成される。本発明に用いられる水不溶性担体の材料は、セルロース、デキストラン、ジェラン、キトサン、酢酸セルロース、硫酸化ジェランである多糖類、またはゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ジャカリン、アルブミンであるタンパク質などが好適に用いられる。
また、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンなどの合成高分子材料を適用することも容易である。
【００１９】
ここで、該血液浄化用吸着剤を水不溶性担体に導入する方法は、材料表面の官能基であるアミノ基、カルボキシル基、水酸基などを利用した共有結合で行われ、固定化させる方法は公知の方法により行うことができる。導入方法の例として、水溶性カルボジイミドを用いて担体表面のアミノ基とジャカリンのカルボキシル基を縮合させる方法、あるいは担体表面のカルボキシル基とジャカリンのアミノ基を縮合させる方法などがある。その他、ジャカリンの糖鎖異常型IgA1に対する結合性を失わせない方法であれば、その結合方法は特に限定されるものではない。
【００２０】
本発明の材料の形状は、粒子状、膜状、中空糸状あるいは繊維状などの形態を用いることができるが、特に粒子状あるいは繊維状が好ましく用いられ、その粒径あるいは繊維径は１０〜５０００μmが望ましく、より好ましくは１００乃至５００μmである。粒径あるいは繊維径サイズがこの値より大きい場合は、血液あるいは血漿分離膜により赤血球、白血球、血小板等を分離した血漿との接触面積が小さいため、吸着効率が著しく悪く、またサイズが小さい場合には血球あるいは血漿蛋白の目詰まりによる結合量の低下が引き起こされるからである。担体素材に関しては、多孔質で水分を内部に保持できる形態であれば、上述したような素材での使用が可能と思われるが、多孔のサイズが０．１〜５０μmの間で、好ましくは１〜５μmであるのが望ましい。理由は、この値より小さい場合は、糖鎖異常型IgA1の吸着材料内部への拡散速度が遅いために、吸着材料内部に結合しにくく、大きすぎる場合には、内部の実効表面積が小さいために結合サイトが軽減し、やはり結合しにくい状況になるためである。
【００２１】
なお本発明の血液浄化用吸着材は「ジャカリン複合体」、「熱処理ジャカリン分解物」あるいは「ジャカリン」の何れかに加えて、第３成分を含有するものであってもよい。該第３成分として、硫酸化ジェラン、硫酸化セルロース、硫酸化カルボキシメチルセルロース、ヘパリンなどの硫酸エステルを有する多糖類を含むのがより好ましい。その理由は、これらの材料を本発明の血液浄化用吸着材に含有させることにより、「糖鎖異常型IgA１細胞性フィブロネクチン複合体」を、より吸着材料に結合させやすくすることができるためである。
【００２２】
本発明の血液浄化用吸着剤が用いられる血液浄化システムは、通常の血液浄化システムの範疇では血漿吸着方法が最適である。これは血液細胞がレクチン蛋白と直接接触する場合に惹起される未知の影響を避けるため、血液中の細胞成分と血漿成分を分離した後、血漿成分から糖鎖異常型IgA１を強制的に除去する方法が好適であるためである。図１にその血液浄化システムの概念図を示す。腕あるいは患部から血液を体外に循環させ、血漿分離器（カラム1）で細胞成分と血漿成分に分けた後に、本発明品の血液浄化用吸着材の充填されたカラム（カラム2）で糖鎖異常型IgA1あるいは「糖鎖異常型IgA1-細胞性フィブロネクチン複合体」を吸着させ、吸着しなかった血漿成分は再度細胞成分とあわせて患者体内へ戻し循環させる。該システムは、カラム、ポンプ、各種生体状態監視装置（血圧、血流、脈拍、抗凝固剤量、ジャカリン溶出量等）から構成される。
【００２３】
ａ．測定方法
血漿中の総IgAおよびIgA1濃度は、ELISA法を用いて定量した。
１次抗体原液に総IgA測定用としてはGoat anti-human IgA (フナコシ社製)、IgA1測定用としてGoat anti-human IgA１ (フナコシ社製)、また２次抗体原液にGoat anti-human IgA HRP conjugated (フナコシ社製)を用い、濃度決定のための標準溶液にはHuman serum Calibrator (IgA)(フナコシ社製)を用い、２５０ng/ml−７ng/mlの範囲で７サンプル調製し用いた。
１次抗体溶液として抗体原液１００μｌを０．０５MのNaCO₃−HCl 緩衝液(pH9.6)10mlに溶解し希釈した後、９６穴ELISA用イムノプレート（ナルジェン・ヌンク社製）に100μｌずつ添加し９０分静置する。その後溶液を除去し、０．１４M NaCl、０．０５％ Tween２０を含む０．０５M Tris-HCl (pH8)緩衝液で洗浄し、自然乾燥させ測定用ELISAプレートとした。
測定する血漿試料は０．１４M NaCl、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む０．０５M Tris-HCl (pH8) 緩衝液を用いて１／２００００あるいは１／５００００に希釈し、測定用プレートの穴に１００μl加え、６０分間浸透させる。同時に別な穴に７種類の標準溶液をそれぞれ加える。浸透後、溶液を除去し０．１４M NaCl、０．０５％ Tween２０を含む０．０５M Tris-HCl (pH8)緩衝液で数回洗浄し、次に１／１００希釈した２次抗体溶液を２００μlずつ穴に加え更に６０分間浸透させる。２次抗体溶液を除去し、洗浄後、クエン酸緩衝液１２mlに対しOPD錠（和光純薬社製）を１錠およびH₂O₂を5μl加えた溶液を、100μlずつ穴に加え１０分間静置して発色させた後、更に１Ｎ硫酸水溶液を100μlずつ穴に加え発色を停止させ、４５０nmでの吸光度をプレートリーダー（バイオラッド社製）にて測定し、標準試料から作製した校正曲線に照らして濃度を算出した。総IgAおよびIgA1濃度は１次抗体溶液を変えることにより、それぞれについて測定した。
またIgA2濃度は、総IgAおよびIgA1の測定値を用いて、IgA2＝総IgA−IgA1の算出式より求めた。
【００２４】
次に、血漿中の総フィブロネクチンおよび細胞性フィブロネクチン濃度はELISA法で定量した。
１次抗体原液に総フィブロネクチン(tFN)測定用としてmouse anti-human FN (１１７抗体：宝酒造社製)、細胞性FN測定用としてmouse anti-human EDA(+)FN (０１抗体：大塚アッセイ)、また２次抗体原液にmouse anti-human FN HRP conjugated を用い、濃度決定のための標準溶液には血漿由来FN、及び細胞培養液由来のFN（細胞性フィブロネクチン）を用い、５０００ng/ml〜７８ng/mlの範囲で４サンプル調製し用いた。抗体と標準溶液の違い以外は、（１）に準じたELISA法で行い濃度を算出した。
【００２５】
ｂ．IgA腎症患者および健常者血漿中の総IgA、IgA１、総フィブロネクチンおよび細胞性フィブロネクチン濃度の測定
クエン酸採血したIgA腎症患者血漿（n=48）および非IgA患者（健常者）血漿（n=6）の血漿総IgA、IgA１、総フィブロネクチンおよび細胞性フィブロネクチン濃度をELISA法にて測定した。結果を表１および表２に示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】
【表２】

【００２８】
IgA１／総IgA＝0.46以上かつ細胞性フィブロネクチン／総フィブロネクチン＝6.6 (×10^-4)以上のIgA腎症患者数は、測定数の７０％にあたる３４人であった。すなわちIgA1比率の高い血漿では細胞性フィブロネクチンの比率も高いことがわかる。以上の結果から「IgA-細胞性フィブロネクチン複合体」の存在の可能性が大いに示唆される事が分かる。
【００２９】
ｃ．IgA腎症患者の腎糸球体組織中の細胞性フィブロネクチン染色
IgA腎症患者に対して行われた腎生検より糸球体組織切片を作製し、蛍光免疫染色を行った。方法は公知の方法により行った。染色には１次抗体としてmouse anti-human EDA(+)FN (０１抗体：抗細胞性フィブロネクチン抗体)、２次抗体にmouse anti-human FN FITC conjugated を用いた。結果を図２及び図３に示す。図２中で白く明るく見える箇所がFITCによる蛍光が検出された箇所で、即ち細胞性フィブロネクチンが存在していることを表している。図３は１次抗体処理無しの染色（コントロール）であり、細胞性フィブロネクチン以外の部分で検出されていないことを確認した。図２より患者糸球体組織中には細胞性フィブロネクチンが多く沈着していることがわかった。
【００３０】
ｄ．「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」の調製
ジャックフルーツの種子（種子1つの大きさが、長軸方向3.5cm、短軸方向2cm）を果肉から分離し、種子を覆う皮の部分を除き、フードプロセッサー等で細かく粉砕する。トリス−塩酸緩衝溶液（pH=7）を加えて、4℃で24時間撹拌しジャカリン粗精製溶液を得る。不溶部分を濾過により除き、次に遠心分離（３，０００rpm、３０分）し、上澄み部分のみを回収した。更に０．４５μｍの孔サイズのメンブレンフィルターで濾過し、溶液を再生セルロース系透析膜からなるチューブにいれ（除去分子量６，０００以下）、脱イオン水に対して４８時間以上透析を行い、その後凍結乾燥して「ジャカリン複合体」を得た。
乾燥した「ジャカリン複合体」２００mgに対し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を２０g加え、脱イオン水１００mlに溶解し、０．４５μｍの孔サイズのメンブレンフィルターで濾過する。濾液を１００℃にて１０分間処理し、再度４℃に冷却し凍結乾燥することで「熱処理ジャカリン分解物」を得た。
【００３１】
ｅ．電気泳動による「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」の同定
上記のようにして得られた「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」の分子量を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて測定した。方法は公知の方法で行った。
具体的条件として、「ジャカリン複合体」に対しては７．５％(w/w) ポリアクリルアミドゲル、「熱処理ジャカリン分解物」に対しては１５％(w/w) ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。タンパク質バンドはクマシーブリリアントブルー染色により行った。また分子量マーカー（バイオラット社製）からの相対移動度より「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」の分子量を算出した。電気泳動結果から算出した分子量を表３に示す。
【００３２】
【表３】

【００３３】
ｆ．「ジャカリン複合体」固定化粒子の作製
「ジャカリン複合体」１００mg、SDS１gを０．１NのNaH2PO4−NaOH緩衝液 (pH５) １０mlに溶解させ、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）２mg、水溶性カルボジイミド（WSCD）４．５mgを加え２時間攪拌する。この溶液にアミノセルロファイン（チッソ社製：平均粒径１００〜５００μｍ）２．５mlを加え、２ＭのNaOH水溶液にてpH８に合わせ、更に２時間攪拌する。反応終了後、脱イオン水および生理食塩水にて洗浄し、「ジャカリン複合体」固定化粒子とした。
【００３４】
ｇ．「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子の作製
「熱処理ジャカリン分解物」１００mg、SDS１gを０．１NのNaH2PO4−NaOH 緩衝液 (pH5) １０mlに溶解させ、NHS２mg、WSCD４．５mgを加え２時間攪拌する。この溶液にアミノセルロファイン（チッソ社製：平均粒径１００〜５００μｍ）２．５mlを加え、２Ｍ NaOH水溶液にてpH８に合わせ、更に２時間攪拌する。反応終了後、脱イオン水および生理食塩水にて洗浄し、「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子とした。
【００３５】
ｈ．IgA腎症患者、健常者血漿中のIgA１と「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子との親和性測定
クエン酸採血したIgA腎症患者血漿および健常者血漿を用いて、「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子と各血漿中のIgA１との親和性の測定は、結合定数の算出をすることで評価した。
クエン酸採血したIgA腎症患者および健常者血漿1ml（４〜７種類程度の濃度になるようにあらかじめ希釈したものを用意した）に対して、上記で作製した「ジャカリン複合体」（または「熱処理ジャカリン分解物」）固定化粒子を０．２５ml加えて、室温にて１時間攪拌させる。吸着実験後は３，０００rpmにて１分間遠心分離した上澄みを測定検液とする。
IgA１の初期濃度をＣa、上澄み濃度をＣa’とし、それぞれの濃度をELISA法にて測定した値を用いて、結合定数ＫＬ（M^-1）を以下のScatchardプロット解析から算出した。その結果を表４に示す。
（Ｃa−Ｃa’）／Ｃa’＝（１／ＫＬ）×（Ｃa−Ｃa’）＋Ｈo／ＫＬ
※Ｈoは結合サイト濃度（M）で、ＫＬは値が小さいほど親和性が大きいことを表す。
【００３６】
【表４】

【００３７】
以上の結果より、２つの事を明らかにした。すなわち、IgA腎症患者 IgA1は健常者 IgA1よりも「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子に対する親和性が大きい。もう一つの点は「ジャカリン複合体」よりも「熱処理ジャカリン分解物」のほうが各IgA1に対する親和性が大きい。即ち、これらの結果は糖鎖異常型IgA1を「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子が認識していることを示している。
【００３８】
ｉ．「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子による吸着除去実験
「ジャカリン複合体」および「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子 0.1mlとIgA1腎症患者血漿1mlを、2ml プラスチックチューブ内で混合して、３時間インキュベートし血液中の蛋白質を吸着させた後、遠心分離（３，０００rpm、２分）し、上澄み部分の血漿を回収した。血漿中のIgA1、IgA２および細胞性フィブロネクチンの吸着除去率は、吸着実験前後の溶液濃度の測定値から、以下の式にて算出した。なおIgA2の濃度はIgA2=総IgA-IgA1より算出したうえで吸着除去率を算出した。結果を表５に示す。
吸着除去率（％）＝[初期蛋白濃度−上澄み血漿中の蛋白濃度] ／初期蛋白濃度
【００３９】
【表５】

▲１▼は「ジャカリン複合体」固定化粒子による除去率を、▲２▼は「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子による除去率を示す。
【００４０】
以上の結果より「ジャカリン複合体」固定化粒子はIgA2を、「熱処理ジャカリン分解物」固定化粒子はIgA1を選択的に吸着除去する材料であることがわかる。また細胞性フィブロネクチンの除去結果には「糖鎖異常型IgA1-細胞性フィブロネクチン複合体」の除去効果が含まれている。
【００４１】
【発明の効果】
上述の説明から明らかなように、本発明の血液浄化吸着材を組み込む治療システムを用いることにより、ＩｇＡ腎症患者の糖鎖異常型ＩｇＡ１、「糖鎖異常型ＩｇＡ１と細胞性フィブロネクチンの複合体」及びＩｇＡ２を選択的に除去し、ＩｇＡ腎症患者の病態を改善させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における血液浄化用吸着剤を用いた、IgA腎症患者の血液浄化システムを示す概念図である。
【図２】 IgA腎症患者の糸球体組織片に蛍光免疫染色を行い、細胞性フィブロネクチンが存在することを示す図である。
【図３】糸球体組織片に細胞性フィブロネクチンが存在しないことを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an adsorbent for blood purification that specifically adsorbs an abnormal sugar chain type IgA1 among immunoglobulin A1 (IgA1) in blood and body fluid, and an IgA nephropathy treatment method using the same. The present invention forcibly and selectively removes abnormal sugar chain type IgA1 or a complex of abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin from the blood of patients with IgA nephropathy, and adjusts the blood concentration of IgA1 to an appropriate value. -It is suitably used for the purpose of improving the pathology of IgA nephropathy by maintaining.
[0002]
[Prior art]
In Japan, about 30,000 new chronic renal failure patients introduce artificial dialysis treatment (maintenance dialysis treatment) every year, and in many cases dialysis treatment is necessary until death (the number of deaths every year is new artificial dialysis treatment). About half of the patients introduced with dialysis treatment). That is, the total number of renal failure patients requiring dialysis treatment is increasing year by year, but there is currently no radical treatment other than organ transplantation treatment. However, transplantation of living tissue has many important social and technical problems such as immune rejection, donor shortage and biocompatibility failure, and cannot make significant progress. In recent years, it is known that over 35% of patients with this chronic renal failure are caused by IgA nephropathy.
[0003]
IgA nephropathy is a type of chronic glomerulonephritis in which immunoglobulin protein A (IgA) is deposited in the glomerular mesangial region. In particular, IgA concentration in the blood of patients with IgA nephropathy is higher than that in healthy subjects (usually about 1 mg / ml), and this condition continues for many years, causing IgA to deposit in the glomeruli of the kidneys, and thus kidney function is lost. (Conley, ME et al. (1980), Journal of Clinical Investigation, 66, 1432). IgA nephropathy is a disease concept proposed by Berger et al. In 1969, but the cause of this disease remains unknown even after 30 years. In addition to proteinuria and hematuria clinically, there are few clinical symptoms and it is difficult to notice the progression of the disease, and there is no general diagnosis method other than the method by renal biopsy, so the discovery is delayed There are many.
[0004]
Conventionally, treatment methods for IgA nephropathy include a method using a corticosteroid for anti-inflammation in the glomerulus. When steroid treatment is started in the early stage of the disease, it is expected to avoid progression to chronic renal failure due to the effect of long-term use, but there are few cases where such early treatment can be performed. Moreover, the side effects of steroids are so great that many patients cannot avoid some side effects. From the above, there has been a demand for a more reliable method for treating IgA nephropathy with less side effects than steroids.
[0005]
IgA is classified into two subtypes called IgA1 and IgA2, and it has been reported that five oxygen-binding sugar chains are bound to a region called the hinge part of IgA1 (Journal of Biological Chemistry, Vol. 249). 7270-7281, 1974). On the other hand, it is also known that this oxygen-binding sugar chain does not exist in the hinge part of IgA2.
Recently, an interesting report has been made that such an abnormality in the sugar chain of IgA1 is associated with the cause of IgA nephropathy (Iwase, Hitoo et al. (1999), Trends in Glycosience and Glycotechnology 11, 113). In particular, normal type IgA1 usually has a sugar chain of sialic acid-galactose and 1-3-linked N-acetylgalactose at the hinge, but IgA1 in the blood of patients with IgA nephropathy has its leading molecule, sialic acid. The proportion of asialo forms that do not exist is considered to be high (Iwase, Hitoo et al. (1996), Journal of Biochemistry, 120, 92). It has also been reported that such sugar chain abnormal types of IgA1 have the property of being easily bound to each other. In addition, Cederholm et al. Proposed that “IgA-fibronectin complex” exists in the blood of patients with IgA nephropathy (Proceedings of the National Academy of Sciences, 85, 4865-4868, 1988). In particular, this discovery has become an important discovery that can explain the pathological condition in which fibronectin is deposited in a large amount other than IgA1 in the glomerular tissue of IgA nephropathy patients.
[0006]
To date, methods for diagnosing IgA nephropathy have been developed based on the knowledge about the sugar chain abnormality of IgA1 or the discovery of “IgA-fibronectin complex”. For example, a diagnostic method for IgA nephropathy using the fact that the number of sugar chain bonds in the hinge part of IgA1 in IgA nephropathy patient plasma is higher than IgA1 in non-IgA nephropathy patient plasma by Tanaka, Nishikido, and Hiki et al. -11291), the invention of the diagnosis method of IgA nephropathy by detecting the difference in binding ability between IgA1 molecules by Hiki, Tanaka, Nishikido et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 9-311132), and further, “IgA− by Cederholm et al. There is an invention of a diagnostic method and a diagnostic kit for IgA nephropathy by measuring the amount of the complex using the affinity between molecules of the “fibronectin complex” (Patent No. 2592121).
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-111291
[Patent Document 2]
JP-A-9-311132
[Patent Document 3]
Japanese Patent No. 2592121
[0008]
However, these inventions provide a diagnostic method of IgA nephropathy and a diagnostic kit thereof, and a method of treating IgA nephropathyAnd treatment systemDid not provide.
In addition, as an example of the invention in the publication, etc., as a material for separating IgA1 from serum, blood and body fluid, jakarin-agarose (Vector) in which “jacarin” which is a kind of lectin is fixed to agarose is used. The separation method is based on the method using “Jakarin” by Roque-Barreria et al. (Journal of Immunology, 134, 1740-1743, 1985).
[0009]
By the way, “Jakarin” is an abnormal sugar chain type IgA1 or “abnormal sugar chain type IgA1-CellularIt is known to bind not only to “fibronectin complex” but also to normal sugar chain type IgA1. In addition, it is believed that there is no affinity for IgA2. That is, in the above known method, an IgA component other than normal sugar chain IgA1 (ie, abnormal sugar chain type IgA1, “abnormal sugar chain type IgA1-fibronectin complex” or IgA2) in IgA nephropathy blood is selectively used. It is impossible to combine and remove.
Here, the reason why the abnormal sugar chain type IgA1 or “abnormal sugar chain type IgA1-cellular fibronectin” is present in the blood at a high concentration is because the abnormal sugar chain type IgA1 is difficult to undergo degradation regulation in the body, or This is considered to be due to abnormal production. However, the treatment method of preventing the deposition of the glomeruli and the subsequent progression of the disease state by forcibly removing the abnormal sugar chain type IgA1 in the blood of the patient from the blood is removed. The idea has never been seen before, and the adsorbent for blood purification used for that purposeAnd treatment systemThere was also no.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to treat blood sugar purification by using abnormal sugar chain type IgA1 and / or a complex of abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin and / or IgA2 concentration in the blood of an IgA nephropathy patient. The adsorbent for blood purification used for the treatment to improve the pathological condition in which these molecules are deposited on the glomeruli by returning to an appropriate value using the adsorbent for the blood and the treatment thereofsystemIs in the provision of.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
Regarding IgA's involvement in IgA nephropathy, as described above, abnormal sugar chain type IgA1 or "abnormal sugar chain type IgA1-fibronectin" is present in the glomeruli due to the presence of high concentrations in the blood of IgA nephropathy patients. It is thought to deposit and cause glomerulonephritis. The inventors have also found that fibronectin, which is likely to be complexed in the blood of inflammatory diseases, is likely to be “cellular fibronectin”, which is usually not present in blood (a complex with IgA1). This is called “glycan abnormal type IgA1-cellular fibronectin”). The major difference between “cellular fibronectin” and fibronectin that is usually present in plasma is in molecular weight, and plasma fibronectin has a molecular weight of about 450,000. The module structure is further included.
[0012]
Based on the discovery by the present inventor described above, the present inventor has intensively studied to provide an adsorbent for blood purification aimed at controlling the progression of disease by adjusting the IgA concentration in blood. As a result, it was found that a material in which jacarin and / or a derivative thereof was immobilized on a water-insoluble carrier was suitable, and the present invention was completed.
[0013]
That is, according to the first invention, an adsorbent of an abnormal sugar chain type IgA1 and / or an abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin and / or an adsorbent of IgA2 in the blood of an immunoglobulin A (IgA) nephropathy patient is jacalin. And / or a derivative thereof, and a structure in which the jacalin and / or the derivative thereof are immobilized on a water-insoluble carrierAnd the water-insoluble carrier is any one of cellulose, gellan, sulfated gellan, and jacarin.
Next, a second invention provides a blood purification adsorbent characterized in that the jacalin is a jacalin complex having 2 to 6 molecules and a molecular weight of 100 to 300 KDa. is there.
Next, a third aspect of the present invention is that the jacalin derivative is a heat-treated jacalin decomposition product obtained by heat-treating the jacalin complex at a temperature of 45 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, and has a molecular weight of 1 to 20 KDa. The feature is to provide an adsorbent for blood purification.
Next, a fourth invention is to provide an adsorbent for blood purification, wherein the water-insoluble carrier in the first invention is a particle having a particle size of 100 to 500 μm.
Next, a fifth invention provides an adsorbent for blood purification, wherein the water-insoluble carrier in the first invention is a fibrous structure having a fiber diameter of 100 to 500 μm.The
NextIn6According to a third aspect of the present invention, there is provided an abnormal sugar chain type IgA1 and / or a complex of abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin from the blood of the patient using the above-mentioned adsorbent for blood purification outside the body of an IgA nephropathy patient. IgA nephropathy treatment characterized by removing IgA2systemIs in the provision of.
Next, the seventh invention is an IgA nephropathy treatment system using the adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 to 5,
The blood taken out from the body of the IgA nephropathy patient is first separated into a cellular component and a plasma component. Among them, only the plasma component is brought into contact with the blood purification adsorbent, and the sugar chain abnormal type IgA1, the complex of sugar chain abnormal type IgA1 and cellular fibronectin, and the IgA2 contained in the plasma component are forcibly forced. To remove plasma and purify plasma components. Then purified plasma components and,The present invention provides an IgA nephropathy treatment system, which is combined with the cell components again and returned to the body of an IgA nephropathy patient..
Next, an eighth invention is an IgA nephropathy treatment system using the adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 to 5,
It comprises a plasma separation column, a blood purification adsorbent-packed column, and a pump.
Among the components, the plasma separation column separates blood taken from the patient's body into plasma components and cell components. The blood purification adsorbent packed column adsorbs and removes the abnormal sugar chain type IgA1, the complex of abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin, and the IgA2 from the separated plasma component, Treated as plasma component.
The pump has a function of supplying blood taken from the IgA nephropathy patient to the plasma separation column and circulating the processed plasma component and the cell component together in the patient body..
[0014]
[Embodiments of the Invention]
Embodiments of the present invention will be described in detail below, but the technical scope of the present invention is not limited by the following embodiments, and various modifications can be made without changing the gist thereof. Can do. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.
[0015]
“Jakarin” used in the present invention is a kind of plant lectin contained in the seeds of jackfruit (Artocarpus heterophyllus), which is a fruit of the mulberry family, and is obtained by extraction and purification. The fruit is not particularly limited, but is mainly contained in Jack fruit because it is derived from its name, and it is easy to extract. Usually, “jacarin” is said to account for 50% or more of the protein extracted from the seeds of jackfruit (Kabir et al., Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 16, 153, 1993).
[0016]
In general, lectins are known as proteins that recognize a specific sugar chain structure. In particular, many lectins in plants have special properties that can specifically recognize animal proteins. “Jakarin” is known as a lectin that recognizes the sugar chain of IgA, and its recognition sugar chain is not limited to one, but it is an oxygen-linked and normal-type IgA1 sugar chain structure: galactose 1-3 linked N-acetyl sialic acid Galactose or galactose 1-3 linked N-acetylgalactose (abnormal sugar chain) is known as a structure with high affinity. (S. Kabir et al. Journal of Immunological Methods 212, 193-211, 1998)
There are few human serum proteins that have an oxygen-binding sugar chain, that is, a galactose 1-3 linked N-acetylgalactose sugar chain that is bound to the hydroxyl group of serine or threonine, which is an amino acid in the protein molecule. N-linked type that binds to the amino group of asparagine. The IgA1 molecule has an oxygen-linked sugar chain, both normal and abnormal, and is thought to specifically recognize and bind to “jacarin”.
[0017]
By the way, “Jakarin” is a glycoprotein with a molecular weight of about 65 KDa composed of a subunit structure with a molecular weight of about 15 KDa called four α chains and a molecular weight of about 2.1 KDa called four β chains. The form of “jacarin” in the present invention may be one molecule of such “jacarin” having a molecular weight of 20 to 100 KDa, but a more effective structure can be obtained by extraction from jackfruit seeds at low temperature. The complex (“Jakarin” is composed of about 2 to 6 molecules and has a molecular weight of 100 to 300 KDa, which is called “Jakarin complex”), or this extracted “Jakarin complex” is at a temperature of 45 ° C. to 100 ° C. It is more desirable to have two forms of a product decomposed to a molecular weight of about 1 to 20 KDa or less by heat treatment (referred to as “heat-treated jacarin decomposition product”). The reason is that the present inventor has found that jacalin is heat-treated to improve the binding property to abnormal sugar chain type IgA1 and to be complexed to improve the binding affinity to IgA2.
[0018]
Next, the adsorbent for blood purification of the present invention is completed by introducing these “jacarin complex” or “heat-treated jacarin degradation product” or “jacarin” into a water-insoluble carrier. The material of the water-insoluble carrier used in the present invention is a polysaccharide that is cellulose, dextran, gellan, chitosan, cellulose acetate, sulfated gellan, or a protein that is gelatin, collagen, elastin, jacarin, albuminEtc. are preferably used.
Synthetic polymer materials such as polystyrene, polyacrylic acid, polyacrylamide, polyisopropylacrylamide, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyvinyl alcohol, polyethylene, etc.It is also easy to apply.
[0019]
Here, the method for introducing the blood purification adsorbent into the water-insoluble carrier is carried out by covalent bonding utilizing amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, etc. which are functional groups on the surface of the material, and a method for immobilization is known. It can be done by a method. Examples of the introduction method include a method of condensing the amino group on the support surface with the carboxyl group of jacarin using water-soluble carbodiimide, or a method of condensing the carboxyl group on the support surface with the amino group of jacarin. In addition, the binding method is not particularly limited as long as it does not lose the binding property of jacarin to abnormal sugar chain type IgA1.
[0020]
The shape of the material of the present invention can be in the form of particles, membranes, hollow fibers or fibers, but particles or fibers are particularly preferred, and the particle diameter or fiber diameter is 10 to 5000 μm. Is desirable, more preferably 100 to 500 μm. If the particle size or fiber size is larger than this value, the contact area with plasma from which red blood cells, white blood cells, platelets, etc. are separated by blood or plasma separation membrane is small, so the adsorption efficiency is remarkably bad and the size is small. This is because the amount of binding is reduced due to clogging of blood cells or plasma proteins. As for the carrier material, it is possible to use the material as described above as long as it is porous and can retain moisture inside, but the pore size is 0.1 to 50 μm, preferably 1 It is desirable to be ˜5 μm. The reason is that if it is smaller than this value, the diffusion rate of abnormal sugar chain type IgA1 into the adsorbent material is slow, so it is difficult to bind inside the adsorbent material, and if it is too large, the internal effective surface area is small. This is because the binding sites are reduced and it becomes difficult to bond.
[0021]
The adsorbent for blood purification of the present invention may contain a third component in addition to any of “jacarin complex”, “heat-treated jacarin degradation product”, and “jacarin”. More preferably, the third component includes a polysaccharide having a sulfate ester such as sulfated gellan, sulfated cellulose, sulfated carboxymethylcellulose, and heparin. The reason is that by incorporating these materials into the adsorbent for blood purification according to the present invention, it is possible to make it easier to bind the “abnormal sugar chain type IgA1 cellular fibronectin complex” to the adsorbent material. .
[0022]
In the blood purification system using the adsorbent for blood purification of the present invention, the plasma adsorption method is optimal in the category of a normal blood purification system. In order to avoid unknown effects caused when blood cells come into direct contact with lectin proteins, the cell component and plasma component in the blood are separated, and the abnormal glycan IgA1 is forcibly removed from the plasma component. This is because the method is preferable. FIG. 1 shows a conceptual diagram of the blood purification system. Blood is circulated out of the body from the arm or affected area, separated into cell components and plasma components by a plasma separator (column 1), and then sugar chains are added to the column (column 2) filled with the blood purification adsorbent of the present invention. Abnormal type IgA1 or “glycan abnormal type IgA1-cellular fibronectin complex” is adsorbed, and the plasma component that has not been adsorbed is recirculated together with the cell component into the patient. The system includes a column, a pump, and various biological state monitoring devices (blood pressure, blood flow, pulse, anticoagulant amount, jacalin elution amount, etc.).
[0023]
a. Measuring method
Total IgA and IgA1 concentrations in plasma were quantified using an ELISA method.
Goat anti-human IgA (manufactured by Funakoshi) for total IgA measurement in primary antibody stock solution, Goat anti-human IgA1 (manufactured by Funakoshi) for IgA1 measurement, and Goat anti-human IgA HRP conjugated in secondary antibody stock solution (Manufactured by Funakoshi) was used, and human serum Calibrator (IgA) (manufactured by Funakoshi) was used as a standard solution for concentration determination, and 7 samples were prepared and used in the range of 250 ng / ml-7 ng / ml.
As a primary antibody solution, add 100 μl of antibody stock solution to 0.05M NaCO_ThreeAfter dissolving and diluting in 10 ml of HCl buffer (pH 9.6), add 100 μl each to a 96-well ELISA immunoplate (manufactured by Nalgen Nunk) and let stand for 90 minutes. Thereafter, the solution was removed, washed with 0.05 M Tris-HCl (pH 8) buffer containing 0.14 M NaCl and 0.05% Tween 20, and air-dried to obtain an ELISA plate for measurement.
The plasma sample to be measured is diluted to 1/20000 or 1 / 50,000 using 0.05M Tris-HCl (pH8) buffer containing 0.14M NaCl and 1% bovine serum albumin (BSA). 100 μl is added and allowed to permeate for 60 minutes. At the same time, add each of the seven standard solutions in separate holes. After infiltration, the solution was removed, washed several times with 0.05 M Tris-HCl (pH 8) buffer containing 0.14 M NaCl and 0.05% Tween 20, and then 200 μl each of the secondary antibody solution diluted 1/100. Allow to penetrate for an additional 60 minutes in addition to the hole. After removing the secondary antibody solution and washing, one OPD tablet (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and H for 12 ml of citrate buffer.₂O₂After adding 5 μl of the solution, add 100 μl each to the well and let stand for 10 minutes for color development. Further, add 100 μl of 1N sulfuric acid aqueous solution to each hole to stop the color development, and measure the absorbance at 450 nm with a plate reader (manufactured by Bio-Rad). The concentration was calculated in the light of a calibration curve prepared from a standard sample. Total IgA and IgA1 concentrations were measured for each by changing the primary antibody solution.
Further, the IgA2 concentration was determined from the calculation formula of IgA2 = total IgA−IgA1 using the measured values of total IgA and IgA1.
[0024]
Next, total fibronectin and cellular fibronectin concentrations in plasma were quantified by ELISA.
In the primary antibody stock solution, mouse anti-human FN (117 antibody: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for measuring total fibronectin (tFN), mouse anti-human EDA (+) FN (01 antibody: Otsuka assay) for measuring cellular FN, In addition, mouse anti-human FN HRP conjugated was used as the secondary antibody stock solution, plasma-derived FN and cell culture medium-derived FN (cellular fibronectin) were used as the standard solution for concentration determination, and 5000 ng / ml to 78 ng / ml. Four samples were prepared and used in the ml range. Except for the difference between the antibody and the standard solution, the concentration was calculated by ELISA according to (1).
[0025]
b. Measurement of total IgA, IgA1, total fibronectin and cellular fibronectin levels in plasma of IgA nephropathy patients and healthy subjects
Plasma total IgA, IgA1, total fibronectin and cellular fibronectin concentrations of IgA nephropathy patient plasma (n = 48) and non-IgA patient (healthy) plasma (n = 6) collected by citric acid were measured by ELISA. The results are shown in Tables 1 and 2.
[0026]
[Table 1]

[0027]
[Table 2]

[0028]
IgA1 / total IgA = 0.46 or more and cellular fibronectin / total fibronectin = 6.6 (× 10^-Four) The number of patients with IgA nephropathy was 34, which is 70% of the number of measurements. That is, it can be seen that the plasma fibronectin ratio is high in plasma with a high IgA1 ratio. From the above results, it can be seen that the existence of “IgA-cellular fibronectin complex” is greatly suggested.
[0029]
c. Cellular fibronectin staining in the glomerular tissue of patients with IgA nephropathy
Glomerular tissue sections were prepared from renal biopsy performed on IgA nephropathy patients and fluorescent immunostaining was performed. The method was performed by a known method. For staining, mouse anti-human EDA (+) FN (01 antibody: anti-cellular fibronectin antibody) was used as the primary antibody, and mouse anti-human FN FITC conjugated was used as the secondary antibody. The results are shown in FIGS. In FIG. 2, the portion that appears white and bright is the portion where fluorescence by FITC is detected, that is, the presence of cellular fibronectin. FIG. 3 shows staining (control) without treatment with the primary antibody, and it was confirmed that it was not detected in parts other than cellular fibronectin. FIG. 2 shows that a large amount of cellular fibronectin is deposited in the patient's glomerular tissue.
[0030]
d. Preparation of “jacarin complex” and “heat-treated jacarin degradation product”
Jack fruit seeds (one seed is 3.5 cm in the long axis direction and 2 cm in the short axis direction) are separated from the pulp, and the skin covering the seeds is removed and ground finely with a food processor or the like. A tris-hydrochloric acid buffer solution (pH = 7) is added and stirred at 4 ° C. for 24 hours to obtain a crude jacalin solution. The insoluble part was removed by filtration, followed by centrifugation (3,000 rpm, 30 minutes), and only the supernatant part was recovered. Further, the solution is filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm, and the solution is put into a tube made of a regenerated cellulose dialysis membrane (removed molecular weight 6,000 or less), dialyzed against deionized water for 48 hours or more, and then frozen. It was dried to obtain a “jacarin complex”.
To 200 mg of the dried “jacarin complex”, 20 g of sodium dodecyl sulfate (SDS) is added, dissolved in 100 ml of deionized water, and filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 μm. The filtrate was treated at 100 ° C. for 10 minutes, cooled again to 4 ° C. and freeze-dried to obtain a “heat-treated jacarin degradation product”.
[0031]
e. Identification of "jacarin complex" and "heat-treated jacarin degradation product" by electrophoresis
The molecular weights of the “jacarin complex” and “heat-treated jakarin degradation product” obtained as described above were measured using SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The method was performed by a known method.
As specific conditions, 7.5% (w / w) polyacrylamide gel was used for “jacarin complex” and 15% (w / w) polyacrylamide gel was used for “heat-treated jacarin degradation product”. went. Protein bands were performed by Coomassie Brilliant Blue staining. The molecular weights of “jacarin complex” and “heat-treated jacarin degradation product” were calculated from relative mobility from molecular weight markers (manufactured by Biorat). Table 3 shows the molecular weights calculated from the electrophoresis results.
[0032]
[Table 3]

[0033]
f. Preparation of “Jakarin complex” immobilized particles
"Jakarin complex" 100mg and SDS 1g are dissolved in 10ml of 0.1N NaH2PO4-NaOH buffer (pH5), 2mg of N-hydroxysuccinimide (NHS) and 4.5mg of water-soluble carbodiimide (WSCD) are added and stirred for 2 hours. . To this solution, 2.5 ml of aminocellulofine (manufactured by Chisso Corporation: average particle size 100 to 500 μm) is added, adjusted to pH 8 with 2M NaOH aqueous solution, and further stirred for 2 hours. After completion of the reaction, the mixture was washed with deionized water and physiological saline to obtain “jacarin complex” immobilized particles.
[0034]
g. Preparation of immobilized particles of heat-treated jakarin degradation products
100 mg of “heat-treated jacarin degradation product” and 1 g of SDS are dissolved in 10 ml of 0.1N NaH 2 PO 4 -NaOH buffer (pH 5), and 2 mg of NHS and 4.5 mg of WSCD are added and stirred for 2 hours. To this solution, 2.5 ml of aminocellulofine (manufactured by Chisso Corporation: average particle size 100 to 500 μm) is added, adjusted to pH 8 with 2M NaOH aqueous solution, and further stirred for 2 hours. After completion of the reaction, the product was washed with deionized water and physiological saline to obtain “heat treated jakarin degradation product” immobilized particles.
[0035]
h. Measurement of the affinity between IgA1 in IgA nephropathy patients and healthy subjects and immobilized particles of "jacarin complex" and "heat-treated jacarin degradation product"
Using the plasma of IgA nephropathy patients collected from citrated blood and the plasma of healthy volunteers, the affinity of “Jakarin complex” and “heat-treated jakarin degradation product” immobilized particles and IgA1 in each plasma can be measured by calculating the binding constant. We evaluated by doing.
Cigarated blood collected from IgA nephropathy patients and healthy subjects 1 ml (prepared previously diluted so as to have a concentration of about 4 to 7 types) “jacarin complex” (or “heat treatment” Jakarin degradation product ") 0.25 ml of immobilized particles is added and stirred at room temperature for 1 hour. After the adsorption experiment, the supernatant obtained by centrifugation at 3,000 rpm for 1 minute is used as a measurement test solution.
The initial concentration of IgA1 is Ca, the supernatant concentration is Ca ', and the values measured by ELISA are used to determine the binding constant KL (M^-1) Was calculated from the following Scatchard plot analysis. The results are shown in Table 4.
(Ca−Ca ′) / Ca ′ = (1 / KL) × (Ca−Ca ′) + Ho / KL
* Ho is the binding site concentration (M), and KL indicates that the smaller the value, the greater the affinity.
[0036]
[Table 4]

[0037]
From the above results, two things were clarified. That is, IgA nephropathy patient IgA1 has a greater affinity for “jacarin complex” and “heat-treated jakarin degradation product” immobilized particles than healthy subject IgA1. Another point is that the “heat-treated jacarin degradation product” has a higher affinity for each IgA1 than the “jacarin complex”. In other words, these results indicate that the “heat-treated jakarin degradation product” immobilized particles recognize the abnormal sugar chain type IgA1.
[0038]
i. Adsorption removal experiment with immobilized particles of "Jakarin complex" and "Heat-treated jakarin degradation product"
“Jakarin complex” and “heat-treated jacarin degradation product” immobilized particles 0.1 ml and IgA1 nephropathy patient plasma 1 ml are mixed in a 2 ml plastic tube and incubated for 3 hours to adsorb proteins in the blood, and then centrifuged. After separation (3,000 rpm, 2 minutes), the supernatant plasma was collected. The adsorption and removal rates of IgA1, IgA2 and cellular fibronectin in plasma were calculated from the measured values of the solution concentration before and after the adsorption experiment by the following formula. The concentration of IgA2 was calculated from IgA2 = total IgA-IgA1, and then the adsorption removal rate was calculated. The results are shown in Table 5.
Adsorption removal rate (%) = [initial protein concentration-protein concentration in supernatant plasma] / initial protein concentration
[0039]
[Table 5]

(1) indicates the removal rate by the “jacarin complex” immobilized particles, and (2) indicates the removal rate by the “heat treated jakarin degradation product” immobilized particles.
[0040]
From the above results, it can be seen that the “jacarin complex” immobilized particles are materials that selectively adsorb and remove IgA2, and the “heat treated jakarin degradation products” immobilized particles are selectively adsorbed and removed. The removal results of cellular fibronectin include the removal effect of “glycan abnormal type IgA1-cellular fibronectin complex”.
[0041]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, the blood purification adsorbent of the present invention.Incorporating a treatment systemBy using it, it is possible to selectively remove abnormal sugar chain type IgA1, “complex of abnormal sugar chain type IgA1 and cellular fibronectin” and IgA2 of IgA nephropathy patients, and improve the pathology of IgA nephropathy patients. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram showing a blood purification system for an IgA nephropathy patient using an adsorbent for blood purification according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the presence of cellular fibronectin by fluorescent immunostaining of glomerular tissue pieces of IgA nephropathy patients.
FIG. 3 shows that cellular fibronectin is not present in glomerular tissue pieces.

Claims

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy patient blood, a adsorbent of the complex and / or IgA2 carbohydrate aberrant IgA1 and / or a sugar chain aberrant IgA1 and cellular fibronectin, adsorbing material Jacalin and / or it consists of a derivative thereof, and having the Jacalin and / or structure that its derivative is immobilized on a water-insoluble carrier,
The adsorbent for blood purification, wherein the water-insoluble carrier is any one of cellulose, gellan, sulfated gellan and jacarin .

2. The blood purification adsorption according to claim 1, wherein the jacalin and / or a derivative thereof is a jacalin complex having 2 to 6 molecules of jacarin, the molecular weight of which is 100 to 300 KDa. Wood.

The jacalin and / or derivative thereof is a heat-treated jacarin decomposition product obtained by heat-treating a jacalin complex at a temperature of 45 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, and has a molecular weight of 1 to 20 KDa. The adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 and 2.

The adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 to 3, wherein the water-insoluble carrier according to claim 1 is a particle having a particle size of 100 to 500 µm.

The adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 to 3, wherein the water-insoluble carrier according to claim 1 is a fibrous structure having a fiber diameter of 100 to 500 µm. .

Using the adsorbent for blood purification according to any one of claims 1 to 5, an abnormal sugar chain type IgA1 and / or abnormal sugar chain type IgA1 and cells from the blood of the patient outside the body of an IgA nephropathy patient IgA nephropathy treatment system characterized by removing complex of sex fibronectin and / or IgA2.

An IgA nephropathy treatment system using the blood purification adsorbent according to any one of claims 1 to 5,
After the IgA nephropathy treatment system separates blood into cell components and plasma components ,
The plasma component is brought into contact with the blood purification adsorbent, the plasma component into the sugar chain aberrant included IgA1, the sugar chain aberrant IgA1 and complexes of cellular fibronectin, and forcibly removing said IgA2 Said later plasma component ;
The IgA nephropathy treatment system characterized by combining the said cell component .

An IgA nephropathy treatment system using the blood purification adsorbent according to any one of claims 1 to 5,
It is composed of a plasma separation column, an adsorbent packed column for blood purification, and a pump.
The plasma separation column separates blood taken from the affected area of the patient into plasma components and cell components ,
The blood purification adsorbent packed column adsorbs and removes the abnormal glycan type IgA 1, the abnormal glycan type IgA1 and cellular fibronectin complex, and the IgA2 from the plasma component to obtain a treated plasma component ;
The IgA nephropathy treatment system, wherein the pump supplies blood taken from the IgA nephropathy patient to the plasma separation column and circulates the treated plasma component and the cell component in the patient body. .