JP4175075B2 - Method for producing fatty acid coenzyme A using luminescent enzyme - Google Patents

Description

（ここで、ＡＭＰはアデノシンモノリン酸、ＰＰｉはピロリン酸である。）
現在まで、脂肪酸ＣｏＡの生成を触媒するＡＴＰ依存型の酵素には、脂肪酸炭素鎖長要求性が異なる４種の酵素がある。短鎖基質に特異性を有するアセチルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 1）、中鎖基質に特異性を有するブチリルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 2）、長鎖基質に特異性を有するアシルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 3）と炭素鎖２２以上の極長鎖脂肪酸に基質特異性を示す極長鎖アシルＣｏＡシンテターゼである。しかし、上述の４酵素は、一般的な酵素ではないため入手が困難であり、当然大量生産もされていない。
このように、脂肪酸ＣｏＡを酵素を用いて合成することは容易ではない。そのため、簡易に安価で安定して脂肪酸ＣｏＡが供給されることが所望されている。
【０００３】
一方、発光酵素であるルシフェラーゼは酸化還元酵素（EC1. 13. 12. 7）に分類され、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下に、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、その反応は次で表される。
ルシフェリン + ATP ＋ O₂ → オキシルシフェリン + AMP + PPi + CO₂ + 光ルシフェラーゼは、これまで、鞘翅目（Coleoptera）のホタル科（Lampyridae）、ホタルモドキ科(Drilidae)、フェンゴデス科(Phengodidae)、ヒカリコメツキ科(Elateridae)に属する甲虫類から分離され同定されている。代表的なものは、ホタル由来のルシフェラーゼであり、北アメリカ産のホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼおよび日本産のゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼは遺伝子工学的に生産され、それぞれプロメガ社およびキッコーマン株式会社から販売されている。ルシフェラーゼは、食品工場等の汚染度をＡＴＰの量として測定する試薬として広く応用されている。また、研究試薬あるいはアミューズメント発光材料としても用いられている。
【０００４】
近年、ルシフェラーゼの遺伝子単離、組換えルシフェラーゼの発現、精製系が確立したことから、ルシフェラーゼの一次構造から三次構造まで決定され、その発光機序も解明されている(非特許文献１参照)。
ホタルルシフェラーゼによる発光反応が時間経過とともに、低下（阻害）すること、その発光阻害がＣｏＡを添加することにより、解除されることは古くから知られている（非特許文献２参照）。
１９８９年にはホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、植物由来のクマル酸−ＣｏＡ合成酵素のそれと弱い相同性(３４％)があることが報告されている（非特許文献３参照）。
１９９０年には、ラットの長鎖脂肪酸ＣｏＡ合成酵素とルシフェラーゼのアミノ酸配列の類似性が報告されている（非特許文献４参照）。
１９９１年、Ｔｏｈは、ＡＴＰおよびＣｏＡの関与する各種酵素と、ルシフェラーゼの構造比較を行い、部分的に相同性の高いアミノ酸配列と酵素の反応様式から、ＡＴＰおよびＣｏＡの関与する領域の存在を示唆している。(非特許文献５参照)。
このようにルシフェラーゼの部分的高次構造のモチーフと似ているものの報告がなされているが、ルシフェラーゼが脂肪酸とＣｏＡとの結合を触媒する脂肪酸ＣｏＡ合成酵素である事実はこれまで報告されていない。
現在までに単離されている鞘翅目由来のルシフェラーゼ遺伝子は、１２種以上になり、それらの遺伝子より推定されるルシフェラーゼ間での一次構造の相同性は５０〜９０％と幅があることが報告されている(非特許文献６参照)。
【０００５】
【特許文献１】
特開平６−３２１９７３号公報（第３頁３欄）
【非特許文献１】
Conti, E. 等、Structure(1996) 4:287-298
【非特許文献２】
Airth, R. L. 等、 Biochem. Biophys. Acta (1958) 27：519-532
【非特許文献３】
Schroder, J.、 Nucleic Acids Res. (1989) 17：460
【非特許文献４】
Suzuki, H 等、J. Biol. Chem. (1990) 265：8681-8685
【非特許文献５】
Toh, H.、 Protein Seq Data Anal. (1991) 4：111-117
【非特許文献６】
Ye. L. 等、Biochem. Biophys. Acta (1997) 1339：39-52
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高純度の脂肪酸ＣｏＡを簡易に安価で合成し、安定して供給する製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ホタルルシフェラーゼは、脂肪酸とＣｏＡの結合を触媒し、脂肪酸ＣｏＡ合成能を有することを見い出し、本発明を完成した。すなわち、ルシフェラーゼがＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下において脂肪酸とＣｏＡとの反応を触媒し脂肪酸ＣｏＡの生成を促進することを応用して脂肪酸ＣｏＡを製造するものである。
【０００８】
したがって、本発明は、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下でルシフェリンを基質として発光能を有する酵素を触媒として用い、ＣｏＡおよび炭素数６以上の脂肪酸を、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下で反応させることを特徴とする脂肪酸ＣｏＡの製造方法である。
本発明で用いる脂肪酸は、炭素数が６以上であり、炭素数６〜２４のものが好ましい。特に炭素数１６〜２０の脂肪酸の場合には極めて高い変換率で脂肪酸ＣｏＡとすることができる。炭素数が１６〜２０の脂肪酸の内でも、不飽和結合を有するオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸の場合の変換率が特に高い。化学合成法によってこれらの不飽和脂肪酸ＣｏＡを製造する場合には、製造過程で不飽和結合が酸化されるため収率が低いが、本方法によれば極めて高収率で製造することができる。
【０００９】
本製造法において使用される酵素は、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下でルシフェリンを基質として発光能を有するルシフェラーゼである。そのルシフェラーゼとして、ホタル科(Lampyridae)に属するPhotinus pyralis、Luciola cruciata、Luciola lateralis、Luciola mingrelica、Photuris pennsylvanica、Pyrocoelia miyako、Pyrocoelia rufa、Hotaria parvula、Hotaria unmunsana、Lampyris nocticula由来のもの、ヒカリコメツキ科（Elateridae）に属する Pyrophorus plagiophthalamus由来のもの、フェンゴデス科（Phengodidae）に属するPhrixothrix vivianii、Phrixothrix hirtus由来のものものが知られている。それらの遺伝子は単離され、アミノ酸配列も知られている。それを表１に示した。
【００１０】
【表１】

【００１１】
ホタル（Photinus pyralis）に由来するルシフェラーゼ、およびゲンジボタル（Luciola cruciata）に由来するルシフェラーゼは、市場から自由に入手できる点で好ましい。ルシフェラーゼは天然のルシフェラーゼであっても、組換ルシフェラーゼであってもよい。
【００１２】
本発明の脂肪酸ＣｏＡの生成反応機構を図１に模式的に示した。ルシフェラーゼは、マグネシウムイオンの存在下で、脂肪酸とＡＴＰと反応し、活性な
[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
となり、この複合体とＣｏＡが反応して脂肪酸ＣｏＡが生成し、ルシフェラーゼが再生される。
【００１３】
ルシフェラーゼの発光反応の機序を図２で示した。ルシフェラーゼは、マグネシウムイオンの存在下で、ルシフェリンとＡＴＰと反応し、活性な
[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
となり、これが酸化されて発光し、オキシルシフェリンが生成し、ルシフェラーゼが再生される。
【００１４】
脂肪酸ＣｏＡ生成反応で、[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
が生成する点は、ルシフェラーゼの発光反応で[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]が生成する点と類似している。しかし、前者の複合体はＣｏＡと反応して脂肪酸ＣｏＡを形成し、ルシフェラーゼが再生するのに対し、後者の複合体は酸化されてオキシルシフェリンを形成し、ルシフェラーゼが再生する点で全く相違している。
【００１５】
本発明の脂肪酸ＣｏＡ生成反応は、脂肪酸を基質として[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する全ての酵素によって触媒される。また、ルシフェリンを基質として[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する酵素は、脂肪酸を基質として[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する。したがって、ルシフェリンを基質として発光能を有する酵素であれば、その由来を問わず、本発明の脂肪酸ＣｏＡの生成を触媒する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ルシフェリンを基質として発光能を有する酵素を用いて、ＡＴＰ、マグネシウムイオンの存在下で脂肪酸とＣｏＡより脂肪酸ＣｏＡを合成する方法である。反応は通常の化学反応と同様に行うことができ、反応条件等は適宜変更することができる。
一般的には、反応容器に脂肪酸、ＡＴＰ、ＣｏＡおよびマグネシウム塩を入れる。ここにトリスバッファーを加えpＨを調整する。反応温度まで昇温または冷却したのち、ルシフェラーゼを添加することで反応を開始させる。反応は反応停止剤を添加することで終了させる。
本発明における脂肪酸は、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、炭素数が６以上のものであり炭素数の上限はないが、炭素数が２４以下であることが好ましい。不飽和脂肪酸の二重結合の数に制限はないが、二重結合が１〜４であることが好ましい。三重結合をもつ不飽和脂肪酸であってもよい。適当な飽和脂肪酸を例示すれば、ヘキサン酸（カプロン酸）、オクタン酸（カプリル酸）、デカン酸（カプリン酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸（マルガリン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、エイコサン酸（アラキン酸）、ドコサン酸（ベヘン酸）、テトラコサン酸（リグノセリン酸）等である。分枝鎖飽和脂肪酸の例としては、１４−エチルヘキサデカン酸、２−ブチルテトラデカン酸、１７−メチルオクタデカン酸等が挙げられる。不飽和脂肪酸の例としては、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、ビスホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等である。
【００１７】
反応温度はルシフェラーゼが酵素活性を示す温度であればよく、２０〜４０℃であることが好ましい。反応溶液のpＨは、ルシフェラーゼが酵素活性を示す範囲であれば特に制限されるものではない。反応溶液のpＨは、好ましくは６.５〜９.０の範囲、より好ましくは７.０〜８.０の範囲である。
反応は、バッチ法であっても連続反応であってもよい。反応時間は温度、pＨ、原料の配合割合等によって適宜選択することが出来る。
【００１８】
反応原料の割合は、自由に調節できる。ＡＴＰおよびＣｏＡは、ルシフェラーゼに対し通常１００倍モル以上添加することが好ましい。脂肪酸のモル濃度はルシフェラーゼのモル濃度の５０倍以下とすることが望ましい。
【００１９】
反応生成物は定法によって分離精製することができる。生成物が脂肪酸ＣｏＡであることは、公知の方法により脂肪酸ＣｏＡの標準品と比較することにより確認できる。例えば薄層クロマトグラフにより行うことができる。本発明方法は副生物の産生が極めて少ないので、未反応原料を分離することによって目的物を簡単に精製することができる。
【００２０】
脂肪酸ＣｏＡの合成をホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼおよびゲンジボタル（Luciola cruciata）由来ルシフェラーゼを代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１ ホタルルシフェラーゼの基質特異性の確認
ホタルルシフェラーゼによる新規酵素反応の基質特異性を、有機酸である酢酸、プロピオン酸およびヘキサン酸、長鎖脂肪酸類であるパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、芳香族カルボン酸であるクマル酸、カフェイン酸、フェルラ酸を基質とし、薄層クロマト法（ＴＬＣ法）により確認した。
具体的には、ホタルルシフェラーゼによる反応に使用されるＡＴＰの³²Ｐラベル体を用い、³²ＰラベルＡＴＰより生成する³²ＰラベルＡＭＰをＴＬＣにより分離を行い、ラジオアイソトープである³²Ｐを検出することにより、反応をモニターした。
反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を２０μLとし、０.３３μCiの[α-³²Ｐ]ＡＴＰ(3000Ci／mmol、５０mMトリシンバッファー(Tricine-buffer)１０mCi／mL：NEN Life Science Products社製)と１.２６μgのホタル（Photinus pyralis）由来の組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、それぞれの最終濃度が１００μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。基質には酢酸（和光純薬社製）、ｎ−プロピオン酸（和光純薬社製）、ｎ−ヘキサン酸（和光純薬社製）、ｐ−クマル酸（シグマ社製）、カフェイン酸（シグマ社製）、フェルラ酸（東京化成工業社製）、パルミチン酸（和光純薬社製）、オレイン酸（和光純薬社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）、アラキドン酸（ナトリウム塩、シグマ社製）を使用し、各最終濃度が１０μMとなるように反応系に加えた。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で３０分保温した。反応後、反応液の１μLを薄層（ＴＬＣ）プレート（Silica gel 60 Ｆ₂₅₄、メルク社製）に供し、風乾により反応停止を行った。ＴＬＣプレートを展開溶媒として一回目に１,４−ジオキサン：５０mM酢酸＝４:１を用いて展開し、４０℃ホットプレート上で乾燥する。次に、展開プレートを展開溶媒１,４−ジオキサン：２５％アンモニア水：水＝３：２：１を用いて一回目の展開と同じ高さまで展開する。風乾したＴＬＣプレートをバイオイメージングプレート（フジフィルム社製）にて３０分間露光し、反応によりアデノシントリリン酸（³²Ｐ−ＡＴＰ）から生成するアデノシンモノリン酸（³²Ｐ−ＡＭＰ）についてラジオアイソトープ³²Ｐ由来の画像を取得する。その画像解析には解析装置ＢＡＳ−２５００(フジフィルム社製)を用いた。生成するＡＭＰのＲｆ値（＝０.５１）は、ＡＭＰ標品（オリエンタル酵母社製）を同一ＴＬＣ条件にて展開し、ＵＶランプによりその蛍光で確認する。このＴＬＣ条件では、ＡＴＰおよびＡＤＰのＲｆ値は、それぞれ０.０７と０.１７であり、ＡＭＰと分離可能である。
その結果、短鎖カルボン酸であるプロピオン酸、芳香族カルボン酸であるクマル酸、カフェイン酸およびフェルラ酸からは、アデノシンモノリン酸（³²Ｐ−ＡＭＰ）の生成は、顕著には検出されず、検出限界以下であった。短鎖カルボン酸であるヘキサン酸および長鎖脂肪酸であるオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸を基質とした場合のみ、アデノシンモノリン酸（³²Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。
その生成比率を比較すると、以下のとおりであった。
【表２】

すなわち、ホタルルシフェラーゼは、炭素数６以上の脂肪酸を基質として、マグネシウムイオンの存在下において、ＡＴＰ、ＣｏＡを用いた酵素反応を触媒する能力があることが、初めて明らかとなった。
一方、上記変換反応系において、ＣｏＡあるいは基質、マグネシウムイオンを添加しない条件での反応も行った。その結果、ルシフェラーゼ、ＣｏＡ、マグネシウムイオンおよび基質である炭素数６以上の脂肪酸の存在した場合にのみアデノシンモノリン酸（³²Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。すなわち、後述するように、ホタルルシフェラーゼによる長鎖脂肪酸のＣｏＡ化変換反応には、ＡＴＰ、マグネシウムイオンとＣｏＡが必須であることが明らかとなった。
また、ＡＴＰに変えて、グアノシントリリン酸（ＧＴＰ）、チアミントリリン酸（ＴＴＰ）、シチジントリリン酸（ＣＴＰ）、イノシントリリン酸（ＩＴＰ）、ウリジントリリン酸（ＵＴＰ）を用いた場合にはこの反応が進行しないことを確認した。
【００２２】
実施例２ 長鎖脂肪酸−¹⁴Ｃラベル体を用いた長鎖脂肪酸ＣｏＡの同定
¹⁴Ｃラベル体を用いて、オレイン酸ＣｏＡの同定を行った。
オレイン酸−¹⁴Ｃラベル体([１−¹⁴Ｃ]オレイン酸、１９７μCi／mg、トルエン溶液１００μCi／mL、アマシャムファルマシア社製)１８μLはアルゴンガス下で溶媒を除去後、１０.８mM ＮａＯＨ溶液６μLと水１８１.５μLを加えナトリウム塩としたものを使用した。酵素反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を２０μLとし、上記オレイン酸−¹⁴Ｃラベル体溶液２μLと１.２７μgのホタル組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、それぞれの最終濃度が２５０μM アデノシントリリン酸(東京化成社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で６０分行なった。反応の停止には２０μLのエタノールを添加し撹拌することで行なった。
反応停止後、反応液の２μLをＴＬＣプレート（Silica gel 60 Ｆ₂₅₄、メルク社製）に供した。風乾の後、プレートを展開溶媒として１,４−ジオキサン：２５％アンモニア水：水＝３：２：０.５を用いて展開を行った。４０℃ホットプレート上で乾燥後、ＴＬＣプレートをバイオイメージングプレート（フジフィルム社製）にて５０時間露光し、ラジオアイソトープ¹⁴Ｃ由来の画像を取得し、その画像解析にはＢＡＳ−２５００(フジフィルム社製)を用いた。ルシフェラーゼとの反応の結果生成するオレイン酸ＣｏＡの確認は、オレイン酸ＣｏＡ標品（シグマ社製）を同一のＴＬＣ条件で展開し、ＵＶランプにより検出し、Ｒｆ値（０．５０）が同じであることで行った。その結果、脂肪酸のカルボキシル基のみへの反応が起きていることが明らかとなった。
また、ルシフェラーゼによるオレイン酸ＣｏＡ生成の必須因子確認のため、上記反応系においてルシフェラーゼ、ＡＴＰ、ＣｏＡまたは塩化マグネシウムを添加しない条件で同一反応を行った。反応生成物をＴＬＣにかけ、¹⁴Ｃ−オレイン酸ＣｏＡの生成量を測定した結果を表３に示す。
【表３】

ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、ＣｏＡ、マグネシウムイオンおよび基質であるオレイン酸の存在した基本反応の場合にのみオレイン酸ＣｏＡの生成を確認した。すなわち、ホタルルシフェラーゼによる長鎖脂肪酸のＣｏＡ化変換反応には、ＡＴＰ、マグネシウムイオンとＣｏＡが必須であることが明らかとなった。この前述の³²ＰラベルＡＴＰをもちいた実験結果と合致する。
【００２３】
実施例３ ＨＰＬＣによる脂肪酸ＣｏＡの分離法
基質である脂肪酸は、パルミチン酸（ナトリウム塩、関東化学社製）、オレイン酸（ナトリウム塩、アルドリッチ社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）、アラキドン酸（ナトリウム塩、シグマ社製）を用いた。
酵素反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を４００μLとし、６.９１nmoleの各々の脂肪酸である基質と２５.４μgのホタル組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、最終濃度が２５０μM アデノシントリリン酸(東京化成工業社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で６０分行なった。
反応の停止は２６６.４μLのアセトニトリルを添加し撹拌することで行なった。反応停止後、反応液は遠心分離後（１０,０００回転、５分）、上清の５００μLをＨＰＬＣにインジェクトし、分離後、生成脂肪酸−ＣｏＡを分取し質量分析を行なった。
ＨＰＬＣの分析条件は、日本分光社製のJasco 1500 systemを用いた。カラムは資生堂社製のCapcell Pac C18 (4.6 × 150 mm)を使用した。検出には日本分光の多波長検出器 (MD-2010 plus)を用いた。溶出溶媒系は、アセトニトリルと２５mMリン酸二水素カリウム水溶液系を使用した。溶媒の流速は０.８mL／分で、溶出はアセトニトリル濃度４０％で５分間流したあと、７０％までのリニアグラディエントを１２分かけて行ない、その後７０％で８分流した。
開示した本クロマト条件では、それぞれの脂肪酸の溶出時間（分）は、パルミチン酸ＣｏＡ１９.１分、オレイン酸ＣｏＡ１８.４分、リノール酸ＣｏＡ１７.１分、リノレン酸ＣｏＡ１４.８分、アラキドン酸ＣｏＡ１６.２分であり、それぞれの脂肪酸ＣｏＡとも分離可能であった。すなわち、未反応脂肪酸、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、ＣｏＡ、ルシフェラーゼおよび脂肪酸ＣｏＡは完全に分離することが可能である。
溶出ピーク面積から生成脂肪酸ＣｏＡ量を決定し、脂肪酸からの変換効率を算出すると、それぞれパルミチン酸ＣｏＡ２７.８％、オレイン酸ＣｏＡ６６.７％、リノール酸ＣｏＡ９０.６％、リノレン酸ＣｏＡ９８.０％、アラキドン酸ＣｏＡ９８％以上であった。
【００２４】
実施例４ ＨＰＬＣで分離された脂肪酸ＣｏＡの質量分析
溶出主要ピークが脂肪酸ＣｏＡであることを再確認するため、それぞれの溶出主要ピークを、直接マススペクトル分析に供した。
マススペクトル分析には、MALDI-TOF-MS(AutoFLEX、ブルカー・ダルトニクス社製)を使用した。イオン化のためのマトリックスは、飽和３−ヒドロキシピコリン酸（アルドリッチ社製）を用い、リフレクターモードでネガティブ測定を行なった。
測定結果から、パルミチン酸ＣｏＡ、オレイン酸ＣｏＡ、リノール酸ＣｏＡ、リノレン酸ＣｏＡ、アラキドン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］^-は、それぞれ１００４.３４、１０３０.３５、１０２８.３４、１０２６.３２、１０５２.３４であり、実測値は、１００４.７７、１０３０.３９、１０２８.４２、１０２６.３９、１０５２.３８であった。すなわち、理論測定質量値と実測値が、ほぼ完全に一致することより、ホタルルシフェラーゼ反応により脂肪酸から生成した化合物は、脂肪酸ＣｏＡであることが明らかとなった。
また、この質量分析から、脂肪酸ＣｏＡ以外の分子種が検出されないことにより、ＨＰＬＣ分離画分の脂肪酸ＣｏＡの純度は、９８％以上と確認された。このことは、本反応では副生物が極めて少なく、目的とする脂肪酸ＣｏＡを高純度で製造できることの証拠である。
【００２５】
実施例５ 脂肪酸ＣｏＡ製造最適化条件
１）ルシフェラーゼと脂肪酸濃度比の決定。
最適な酵素と基質濃度比を決定するために、ルシフェラーゼ濃度を一定にし、オレイン酸の濃度変化に伴うオレイン酸ＣｏＡの生成量を、前述のＨＰＬＣ条件で測定した。反応系の最終濃度は、０.２μMのルシフェラーゼ、２５０μMのＡＴＰ、２５０μMのＣｏＡ、５mM ＭｇＣｌ₂ を含む５００μlの１００mMトリスバッファー(pＨ７.８)中において、オレイン酸の最終濃度を０.１、１、３、１０、３０、１００μMにし、３０℃で３０分反応させ、３３３μMのアセトニトリル（最終濃度４０％）を加え、反応を終了させる。反応液の５０μlをＨＰＬＣで分析し、生成したオレイン酸ＣｏＡのピーク面積をもとめた。その結果を表４に示した。
【表４】

表から分かるように、オレイン酸濃度が１０μM以上になると、生成するオレイン酸ＣｏＡが減少する。このことから、最適な反応条件として、オレイン酸のモル濃度をルシフェラーゼのモル濃度の５０倍以下とすることが望ましい。
一方、ＡＴＰおよびＣｏＡを高濃度としても生成するオレイン酸ＣｏＡの生成量に影響がなかった。通常の場合、酵素のモル濃度の１００倍以上のＡＴＰおよびＣｏＡを添加すれば十分であった。
２）反応時間
１）の上記反応条件で、オレイン酸の濃度を１０μMとして、反応時間につい
て検討した。その結果を表５に示した。
【表５】

この結果から、反応時間６０分までは、時間とともに直線的に反応が進行するが、１２０分以降は減少の傾向にある。すなわち、３０℃においては、反応時間６０分が最も適している。
【００２６】
実施例６ ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼの使用例
実施例１〜５で用いたホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼにかえて、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼを用いて、同様の実験を行った。反応条件は、実施例１、実施例２および実施例５より明らかとなったものを用いた。
実施例６−１ ＴＬＣ法による³²Ｐ−ＡＭＰの検出
実施例１に記載の反応条件で、それぞれの基質を用いて反応後、ＴＬＣ法によりアデノシンモノリン酸（³²Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。その生成比率は表６に示すとおりであった。
【表６】

脂肪酸の炭素鎖の長さおよび不飽和度が増加するにつれて、生成量が多いことが明らかとなった。この傾向は、ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼと同じである。
また、同時にホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを用いて、リノレン酸を基質とした反応を行い、³²Ｐ−ＡＭＰの生成活性を比較した。ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを１００％とした場合、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼによる変換割合は、９７.４％であった。すなわち、ルシフェラーゼが由来する種の相違によって、³²Ｐ−ＡＭＰ生成能力の差が殆ど無いことから、脂肪酸変換効率もほぼ同じであることが明らかとなった。
【００２７】
実施例６−２ 質量分析法による脂肪酸ＣｏＡの同定
反応基質として適している長鎖脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸を、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、マグネシウムイオンの存在下でＣｏＡと反応させた。反応生成物をＨＰＬＣにかけ、それぞれの脂肪酸ＣｏＡを分取して質量分析法で同定した。脂肪酸ＣｏＡの合成および精製条件は実施例３と、質量分析法は実施例４と同じである。
すなわち、酵素反応系には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用い、反応系の全量を４００μLとし、６.９１nmoleのオレイン酸（アルドリッチ社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）またはアラキドン酸（シグマ社製）と２５.４μgのゲンジボタル（Luciola cruciata）由来の組換えルシフェラーゼ（比活性：６ｍ units／mg、和光純薬社製）、最終濃度が２５０μMアデノシントリリン酸(東京化成工業社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、反応は３０℃で６０分行なった。反応の停止は、２６６.４μLのアセトニトリルを添加し撹拌することで行なった。反応停止後、反応液を遠心分離（１０,０００回転、５分）し、上清の５００μLを実施例３記載の条件でＨＰＬＣ処理した。クロマト上の１８.４分にオレイン酸ＣｏＡ、１７.１分にリノール酸ＣｏＡ、１４.８分にリノレン酸ＣｏＡ、１６.２分にアラキドン酸ＣｏＡの主ピークを検出した。主ピーク生成画分の脂肪酸ＣｏＡを分取し実施例４記載の質量分析を行なった。 その結果、オレイン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］^-は、１０３０.３５であり、測定値は、１０３０.３８であった。リノール酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］^-は、１０２８.３４であり、測定値は、１０２８.３９であった。リノレン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］^-は、１０２６.３２であり、測定値は、１０２６.４１であった。アラキドン酸ＣｏＡの理論測定質量値は、１０５２.３４であり、測定値は、１０５２.４２であった。測定実測値が、ほぼ完全に一致することからオレイン酸ＣｏＡ、リノール酸ＣｏＡ、リノレン酸ＣｏＡおよびアラキドン酸ＣｏＡと確認した。すなわち、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼにより、オレイン酸から生成した化合物はオレイン酸ＣｏＡであり、リノール酸から生成した化合物はリノール酸ＣｏＡであり、リノレン酸から生成した化合物はリノレン酸ＣｏＡであり、アラキドン酸から生成した化合物はアラキドン酸ＣｏＡであった。この結果から、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼは、ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼと同様に、長鎖脂肪酸ＣｏＡの合成能力があることが明らかとなった。
【００２８】
ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを用いた場合とゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼを用いた場合の質量分析結果（実施例４および６）と、ＨＰＬＣの保持時間（実施例３および６）を表７に示した。
【表７】

ＮＤ＝ 測定未実施
保持時間は、実施例３と６で相違しなかった。
【００２９】
【発明の効果】
ルシフェラーゼを触媒として飽和及び不飽和脂肪酸とＣｏＡを反応させることにより、純度の高い脂肪酸ＣｏＡを高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ルシフェラーゼを触媒とした脂肪酸ＣｏＡの反応の模式図である。
【図２】ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼによる発光反応の模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing fatty acid coenzyme A (hereinafter referred to as “fatty acid CoA”) from a fatty acid and coenzyme A (hereinafter referred to as “CoA”) using a luminescent enzyme. Specifically, this is a method for producing fatty acid CoA by reacting a fatty acid with CoA in the presence of adenosine triphosphate (hereinafter referred to as “ATP”) and magnesium ion using luciferase, which is a luminescent enzyme, as a catalyst.
[0002]
[Prior art]
The fatty acid CoA is a compound in which a fatty acid (R-COOH) is ester-bonded to the -SH group of CoA.
R-CO-S-CoA
It is represented by Since fatty acid CoA plays an important role in the in vivo fatty acid synthesis system, it is essential for the study of fatty acid metabolism. Fatty acid CoA is produced by chemical synthesis and enzymatic methods.
In the chemical synthesis method, a fatty acid is activated as N-hydroxysuccinimide ester and reacted with CoA. However, in the case of a fatty acid having 18 or more carbon atoms, the reaction with hydrophilic CoA does not proceed sufficiently due to its hydrophobicity (see Patent Document 1). As a result, fatty acid CoA having a longer carbon chain is more expensive.
On the other hand, fatty acid CoA synthase catalyzes the reaction between fatty acid and CoA in the presence of ATP and magnesium ions. The reaction is
[Chemical 1]

(Here, AMP is adenosine monophosphate and PPi is pyrophosphate.)
To date, there are four types of ATP-dependent enzymes that catalyze the production of fatty acid CoA with different fatty acid carbon chain length requirements. Acetyl CoA synthetase with specificity for short-chain substrates (EC6. 2. 1. 1), Butyryl CoA synthetase with specificity for medium-chain substrates (EC6. 2. 1. 2), Specificity for long-chain substrates Acyl CoA synthetase (EC6.2.1.3) and a very long chain acyl CoA synthetase exhibiting substrate specificity for very long chain fatty acids having 22 or more carbon chains. However, the above-mentioned four enzymes are difficult to obtain because they are not general enzymes, and naturally they are not mass-produced.
Thus, it is not easy to synthesize fatty acid CoA using an enzyme. Therefore, it is desired that fatty acid CoA is easily and inexpensively and stably supplied.
[0003]
On the other hand, luciferases that are luminescent enzymes are classified as oxidoreductases (EC1. 13. 12.7), and are enzymes that catalyze luminescent reactions using luciferin as a luminescent substrate in the presence of ATP, magnesium ions, and oxygen. The reaction is expressed as:
Luciferin + ATP + O ₂ → Oxyluciferin + AMP + PPi + CO ₂ + Photoluciferase has been isolated and identified from the Coleoptera firefly (Lampyridae), firefly (Drilidae), Phengodidae, and Elateridae beetles . A typical example is firefly-derived luciferase. Luciferase from North American firefly (Photinus pyralis) and Japanese luciferase from Luciola cruciata are produced by genetic engineering, respectively, Promega and Kikkoman It is sold by the corporation. Luciferase is widely applied as a reagent for measuring the degree of contamination of food factories as the amount of ATP. It is also used as a research reagent or amusement luminescent material.
[0004]
In recent years, gene isolation of luciferase, expression of recombinant luciferase, and purification systems have been established, so the primary structure to the tertiary structure of luciferase have been determined, and the luminescence mechanism has been elucidated (see Non-Patent Document 1).
It has long been known that the luminescence reaction by firefly luciferase decreases (inhibits) over time, and that the inhibition of luminescence is canceled by adding CoA (see Non-Patent Document 2).
In 1989, it has been reported that the amino acid sequence of firefly luciferase has weak homology (34%) with that of plant-derived coumarate-CoA synthase (see Non-Patent Document 3).
In 1990, the similarity of the amino acid sequences of rat long-chain fatty acid CoA synthase and luciferase was reported (see Non-Patent Document 4).
In 1991, Toh compared the structures of various enzymes involving ATP and CoA with luciferase, suggesting the existence of a region involving ATP and CoA from the partially homologous amino acid sequence and the reaction pattern of the enzyme. is doing. (Refer nonpatent literature 5).
Thus, although the thing similar to the motif of the partial higher-order structure of luciferase has been reported, the fact that luciferase is a fatty acid CoA synthetase which catalyzes the coupling | bonding of a fatty acid and CoA has not been reported until now.
There are more than 12 luciferase genes derived from Coleoptera isolated so far, and it is reported that the homology of the primary structure between luciferases deduced from these genes varies from 50 to 90%. (See Non-Patent Document 6).
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-6-321973 (page 3, column 3)
[Non-Patent Document 1]
Conti, E. et al., Structure (1996) 4: 287-298
[Non-Patent Document 2]
Airth, RL et al., Biochem. Biophys. Acta (1958) 27: 519-532
[Non-Patent Document 3]
Schroder, J., Nucleic Acids Res. (1989) 17: 460
[Non-Patent Document 4]
Suzuki, H et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 8681-8685
[Non-Patent Document 5]
Toh, H., Protein Seq Data Anal. (1991) 4: 111-117
[Non-Patent Document 6]
Ye. L. et al., Biochem. Biophys. Acta (1997) 1339: 39-52
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a production method in which high-purity fatty acid CoA is simply and inexpensively synthesized and stably supplied.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The inventors have found that firefly luciferase catalyzes the binding of fatty acid and CoA and has the ability to synthesize fatty acid CoA, thereby completing the present invention. That is, fatty acid CoA is produced by applying luciferase to catalyze the reaction between fatty acid and CoA in the presence of ATP and magnesium ions to promote the production of fatty acid CoA.
[0008]
Therefore, the present invention uses CoA and a fatty acid having 6 or more carbon atoms in the presence of ATP and magnesium ions using luciferin as a substrate and a luminescent enzyme as a catalyst in the presence of ATP, magnesium ions and oxygen. This is a method for producing fatty acid CoA.
The fatty acid used in the present invention has 6 or more carbon atoms and preferably has 6 to 24 carbon atoms. In particular, in the case of a fatty acid having 16 to 20 carbon atoms, the fatty acid CoA can be obtained with an extremely high conversion rate. Among fatty acids having 16 to 20 carbon atoms, the conversion rate is particularly high in the case of oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid having an unsaturated bond. When these unsaturated fatty acid CoA is produced by a chemical synthesis method, the yield is low because the unsaturated bond is oxidized in the production process, but according to this method, it can be produced at a very high yield.
[0009]
The enzyme used in this production method is a luciferase having luminescence ability using luciferin as a substrate in the presence of ATP, magnesium ions and oxygen. As its luciferase, Photinus pyralis, Luciola cruciata, Luciola lateralis, Luciola mingrelica, Photuris pennsylvanica, Pyrocoelia miyako, Pyrocoelia rufa, Hotaria parvula, Hotaria unmunsana, Lampularisae belonging to the family Lampyridae The thing derived from Pyrophorus plagiophthalamus which belongs to Phenophedidae (Phengodidae) and the thing derived from Phrixothrix vivianii and Phrixothrix hirtus belonging to Phenodidae are known. Their genes have been isolated and their amino acid sequences are also known. It is shown in Table 1.
[0010]
[Table 1]

[0011]
Luciferase derived from firefly (Photinus pyralis) and luciferase derived from Luciola cruciata are preferable in that they can be obtained freely from the market. The luciferase may be a natural luciferase or a recombinant luciferase.
[0012]
The reaction mechanism of fatty acid CoA of the present invention is schematically shown in FIG. Luciferase reacts with fatty acids and ATP in the presence of magnesium ions, and is active
[Luciferase: R-CO-O-AMP complex]
Then, this complex and CoA react to produce fatty acid CoA, and luciferase is regenerated.
[0013]
The mechanism of the luminescence reaction of luciferase is shown in FIG. Luciferase reacts with luciferin and ATP in the presence of magnesium ions and is active.
[Luciferase: Luciferin-CO-O-AMP complex]
It is oxidized and emits light, producing oxyluciferin and regenerating luciferase.
[0014]
In the fatty acid CoA production reaction, [luciferase: R-CO-O-AMP complex]
Is generated in a similar manner to that [luciferase: luciferin-CO-O-AMP complex] is generated by the luminescence reaction of luciferase. However, the former complex reacts with CoA to form fatty acid CoA, and luciferase regenerates, whereas the latter complex is oxidized to form oxyluciferin and regenerates luciferase. Yes.
[0015]
The fatty acid CoA production reaction of the present invention is catalyzed by all enzymes that produce [luciferase: R-CO-O-AMP complex] using fatty acid as a substrate. In addition, an enzyme that generates [luciferase: luciferin-CO-O-AMP complex] using luciferin as a substrate generates [luciferase: R-CO-O-AMP complex] using fatty acid as a substrate. Therefore, any enzyme having luminescence ability using luciferin as a substrate catalyzes the production of fatty acid CoA of the present invention regardless of its origin.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a method for synthesizing fatty acid CoA from fatty acid and CoA in the presence of ATP and magnesium ions using an enzyme having luminescence ability using luciferin as a substrate. The reaction can be carried out in the same manner as a normal chemical reaction, and the reaction conditions and the like can be appropriately changed.
Generally, a fatty acid, ATP, CoA and magnesium salt are placed in a reaction vessel. Tris buffer is added here and pH is adjusted. After raising or cooling to the reaction temperature, the reaction is started by adding luciferase. The reaction is terminated by adding a reaction terminator.
The fatty acid in the present invention may be a linear fatty acid or a branched fatty acid, and may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid. The fatty acid has 6 or more carbon atoms and has no upper limit, but preferably has 24 or less carbon atoms. Although there is no restriction | limiting in the number of the double bonds of an unsaturated fatty acid, it is preferable that a double bond is 1-4. It may be an unsaturated fatty acid having a triple bond. Examples of suitable saturated fatty acids are hexanoic acid (caproic acid), octanoic acid (caprylic acid), decanoic acid (capric acid), dodecanoic acid (lauric acid), tetradecanoic acid (myristic acid), hexadecanoic acid (palmitic acid) Heptadecanoic acid (margaric acid), octadecanoic acid (stearic acid), eicosanoic acid (arachidic acid), docosanoic acid (behenic acid), tetracosanoic acid (lignoceric acid), and the like. Examples of branched chain saturated fatty acids include 14-ethylhexadecanoic acid, 2-butyltetradecanoic acid, 17-methyloctadecanoic acid and the like. Examples of unsaturated fatty acids are palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, gamma-linolenic acid, bishomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid, stearolic acid and the like.
[0017]
The reaction temperature may be any temperature at which luciferase exhibits enzyme activity, and is preferably 20 to 40 ° C. The pH of the reaction solution is not particularly limited as long as luciferase exhibits enzyme activity. The pH of the reaction solution is preferably in the range of 6.5 to 9.0, more preferably in the range of 7.0 to 8.0.
The reaction may be a batch method or a continuous reaction. The reaction time can be appropriately selected depending on temperature, pH, blending ratio of raw materials and the like.
[0018]
The ratio of the reaction raw material can be freely adjusted. ATP and CoA are preferably added in an amount of usually 100-fold mol or more with respect to luciferase. The molar concentration of the fatty acid is desirably 50 times or less the molar concentration of luciferase.
[0019]
The reaction product can be separated and purified by a conventional method. It can confirm that a product is fatty acid CoA by comparing with the standard product of fatty acid CoA by a well-known method. For example, it can be performed by thin layer chromatography. Since the method of the present invention produces very little by-products, the target product can be easily purified by separating unreacted raw materials.
[0020]
The synthesis of the fatty acid CoA is exemplified by firefly (Photinus pyralis) -derived luciferase and genjibotaru (Luciola cruciata) -derived luciferase, and the present invention will be described by way of examples. However, the present invention is not limited to the following examples. .
[0021]
【Example】
Example 1 Confirmation of substrate specificity of firefly luciferase
The substrate specificity of the novel enzymatic reaction by firefly luciferase is determined with organic acids such as acetic acid, propionic acid and hexanoic acid, and long-chain fatty acids such as palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, and aromatic carboxylic acid. A certain coumaric acid, caffeic acid, and ferulic acid were used as a substrate and confirmed by thin layer chromatography (TLC method).
Specifically, ATP used for the reaction by firefly luciferase ³² Using a P label body, ³² Generate from P-label ATP ³² P-label AMP is separated by TLC and is a radioisotope ³² The reaction was monitored by detecting P.
A 1.5 mL Eppendorf tube was used for the reaction. The total volume of the reaction system is 20 μL, and 0.33 μCi of [α- ³² P] ATP (3000 Ci / mmol, 50 mM Tricine-buffer 10 mCi / mL: manufactured by NEN Life Science Products) and 1.26 μg of firefly (Photinus pyralis) -derived recombinant luciferase (QuantiLum Recombinant Luciferase, manufactured by Promega) ), And each final concentration contains 100 μM coenzyme A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 5 mM magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 100 mM Tris buffer (pH 7.8, manufactured by Nacalai Tesque). As a substrate, acetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), n-propionic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), n-hexanoic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), p-coumaric acid (manufactured by Sigma), caffeic acid ( Sigma), ferulic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), palmitic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), oleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), linolenic acid (Nippon Oils and Fats) And arachidonic acid (sodium salt, manufactured by Sigma) were added to the reaction system such that each final concentration was 10 μM. The enzyme reaction was started by adding luciferase and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 1 μL of the reaction solution was added to a thin layer (TLC) plate (Silica gel 60 F ₂₅₄ And the reaction was stopped by air drying. The TLC plate is first developed with 1,4-dioxane: 50 mM acetic acid = 4: 1 as a developing solvent and dried on a 40 ° C. hot plate. Next, the development plate is developed to the same height as the first development using a development solvent 1,4-dioxane: 25% aqueous ammonia: water = 3: 2: 1. An air-dried TLC plate was exposed to a bioimaging plate (Fuji Film) for 30 minutes, and adenosine triphosphate (by reaction) ³² Adenosine monophosphate (P-ATP) ³² Radioisotope for P-AMP) ³² Acquire an image derived from P. For the image analysis, an analysis apparatus BAS-2500 (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) was used. The Rf value (= 0.51) of AMP to be generated is confirmed by developing the AMP sample (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) under the same TLC conditions and using its UV fluorescence. Under this TLC condition, the Rf values of ATP and ADP are 0.07 and 0.17, respectively, and can be separated from AMP.
As a result, propionic acid, a short-chain carboxylic acid, coumaric acid, caffeic acid, and ferulic acid, aromatic carboxylic acids, adenosine monophosphate ( ³² The production of (P-AMP) was not significantly detected and was below the detection limit. Only when the short-chain carboxylic acid hexanoic acid and the long-chain fatty acids oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid are used as substrates, adenosine monophosphate ( ³² P-AMP) was confirmed.
The production ratios were compared as follows.
[Table 2]

That is, it became clear for the first time that firefly luciferase has the ability to catalyze an enzymatic reaction using ATP and CoA in the presence of magnesium ions using a fatty acid having 6 or more carbon atoms as a substrate.
On the other hand, in the above conversion reaction system, a reaction was also carried out under the condition that CoA or a substrate or magnesium ion was not added. As a result, adenosine monophosphate (only when luciferase, CoA, magnesium ion and a fatty acid having 6 or more carbon atoms as a substrate exist) ³² P-AMP) was confirmed. That is, as will be described later, it has become clear that ATP, magnesium ions and CoA are essential for the CoA conversion reaction of long-chain fatty acids by firefly luciferase.
When guanosine triphosphate (GTP), thiamine triphosphate (TTP), cytidine triphosphate (CTP), inosine triphosphate (ITP), or uridine triphosphate (UTP) is used instead of ATP, It was confirmed that it did not progress.
[0022]
Example 2 Long-Chain Fatty Acid ¹⁴ Identification of long-chain fatty acid CoA using C-label
¹⁴ The oleic acid CoA was identified using the C-labeled body.
Oleic acid ¹⁴ C label ([1- ¹⁴ C] oleic acid, 197 μCi / mg, toluene solution 100 μCi / mL, manufactured by Amersham Pharmacia) 18 μL was obtained by removing the solvent under argon gas, and adding 6 μL of 10.8 mM NaOH solution and 181.5 μL of water to form a sodium salt. used. A 1.5 mL Eppendorf tube was used for the enzyme reaction. The total volume of the reaction system was 20 μL, and the oleic acid- ¹⁴ C-labeled body solution 2 μL and 1.27 μg firefly recombinant luciferase (QuantiLum Recombinant Luciferase, Promega), final concentrations of 250 μM adenosine triphosphate (Tokyo Kasei), 250 μM coenzyme A (Wako Pure Chemicals) 5 mM magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 100 mM Tris buffer (pH 7.8, manufactured by Nacalai Tesque) are included. The enzyme reaction was started by adding luciferase and was performed at 30 ° C. for 60 minutes. The reaction was stopped by adding 20 μL of ethanol and stirring.
After stopping the reaction, 2 μL of the reaction solution was added to a TLC plate (Silica gel 60 F ₂₅₄ , Manufactured by Merck). After air drying, the plate was developed using 1,4-dioxane: 25% aqueous ammonia: water = 3: 2: 0.5 as a developing solvent. After drying on a 40 ° C. hot plate, the TLC plate is exposed to a bioimaging plate (manufactured by Fujifilm) for 50 hours, and a radioisotope ¹⁴ An image derived from C was obtained, and BAS-2500 (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) was used for the image analysis. Confirmation of the oleic acid CoA produced as a result of the reaction with luciferase is that the oleic acid CoA preparation (manufactured by Sigma) is developed under the same TLC conditions, detected by a UV lamp, and the Rf value (0.50) is the same. I went there. As a result, it became clear that the reaction to only the carboxyl group of the fatty acid occurred.
In addition, in order to confirm the essential factors for oleate CoA production by luciferase, the same reaction was performed in the above reaction system under the condition that luciferase, ATP, CoA or magnesium chloride was not added. The reaction product is subjected to TLC, ¹⁴ Table 3 shows the results of measuring the amount of C-oleic acid CoA produced.
[Table 3]

The production of oleic acid CoA was confirmed only in the basic reaction in the presence of luciferase, ATP, CoA, magnesium ions and the substrate oleic acid. That is, it has been clarified that ATP, magnesium ion and CoA are essential for the CoA conversion reaction of long-chain fatty acids by firefly luciferase. This earlier ³² It agrees with the experimental results using P-label ATP.
[0023]
Example 3 Separation of fatty acid CoA by HPLC
Fatty acids that are substrates are palmitic acid (sodium salt, manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), oleic acid (sodium salt, manufactured by Aldrich), linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), linolenic acid (manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), arachidonic acid (Sodium salt, manufactured by Sigma) was used.
A 1.5 mL Eppendorf tube was used for the enzyme reaction. The total volume of the reaction system is 400 μL, each 6.91 nmole fatty acid substrate and 25.4 μg firefly recombinant luciferase (QuantiLum Recombinant Luciferase, Promega), final concentration 250 μM adenosine triphosphate (Tokyo Chemical Industry) ), 250 μM Coenzyme A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 mM magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 mM Tris buffer (pH 7.8, manufactured by Nacalai Tesque). The enzyme reaction was started by adding luciferase and was performed at 30 ° C. for 60 minutes.
The reaction was stopped by adding 266.4 μL of acetonitrile and stirring. After stopping the reaction, the reaction solution was centrifuged (10,000 rpm, 5 minutes), 500 μL of the supernatant was injected into HPLC, and after separation, the produced fatty acid-CoA was fractionated and subjected to mass spectrometry.
As the analysis conditions for HPLC, Jasco 1500 system manufactured by JASCO Corporation was used. As the column, Capcell Pac C18 (4.6 × 150 mm) manufactured by Shiseido Co., Ltd. was used. A JASCO multi-wavelength detector (MD-2010 plus) was used for detection. As an elution solvent system, acetonitrile and a 25 mM potassium dihydrogen phosphate aqueous solution system were used. The flow rate of the solvent was 0.8 mL / min, and elution was carried out at an acetonitrile concentration of 40% for 5 minutes, followed by a linear gradient up to 70% over 12 minutes, and then at 70% for 8 minutes.
Under the present chromatographic conditions disclosed, the elution time (minutes) of each fatty acid was as follows: palmitic acid CoA 19.1 minutes, oleic acid CoA 18.4 minutes, linoleic acid CoA 17.1 minutes, linolenic acid CoA 14.8 minutes, arachidonic acid CoA 16. It was 2 minutes and could be separated from each fatty acid CoA. That is, unreacted fatty acid, ATP, magnesium ion, CoA, luciferase and fatty acid CoA can be completely separated.
When the amount of fatty acid CoA produced was determined from the elution peak area and the conversion efficiency from fatty acid was calculated, palmitic acid CoA 27.8%, oleic acid CoA 66.7%, linoleic acid CoA 90.6%, linolenic acid CoA 98.0%, Arachidonic acid CoA was 98% or more.
[0024]
Example 4 Mass Spectrometry of Fatty Acid CoA Separated by HPLC
In order to reconfirm that the eluted main peak was fatty acid CoA, each eluted main peak was directly subjected to mass spectral analysis.
For mass spectrum analysis, MALDI-TOF-MS (AutoFLEX, Bruker Daltonics) was used. Saturated 3-hydroxypicolinic acid (manufactured by Aldrich) was used as a matrix for ionization, and negative measurement was performed in the reflector mode.
From the measurement results, theoretical measured mass values [M−H] of palmitic acid CoA, oleic acid CoA, linoleic acid CoA, linolenic acid CoA, and arachidonic acid CoA ^- Are 1004.34, 1030.35, 1028.34, 1026.32, and 1052.34, respectively, and the actual measurement values are 1004.77, 1030.39, 1028.22, 10226.39, and 1052.38. It was. That is, since the theoretically measured mass value and the actually measured value almost completely coincided with each other, it was clarified that the compound produced from the fatty acid by the firefly luciferase reaction was fatty acid CoA.
Moreover, from this mass spectrometry, since the molecular species other than fatty acid CoA was not detected, the purity of fatty acid CoA in the HPLC separation fraction was confirmed to be 98% or more. This is evidence that by-products in this reaction are very few and the target fatty acid CoA can be produced with high purity.
[0025]
Example 5 Fatty acid CoA production optimization conditions
1) Determination of luciferase and fatty acid concentration ratio.
In order to determine the optimum enzyme / substrate concentration ratio, the luciferase concentration was kept constant, and the production amount of oleic acid CoA accompanying the change in oleic acid concentration was measured under the aforementioned HPLC conditions. The final concentration of the reaction system was 0.2 μM luciferase, 250 μM ATP, 250 μM CoA, 5 mM MgCl. ₂ The final concentration of oleic acid is adjusted to 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 μM in 500 μl of 100 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 333 μM of acetonitrile (final concentration). 40%) is added to complete the reaction. 50 μl of the reaction solution was analyzed by HPLC, and the peak area of the produced oleic acid CoA was determined. The results are shown in Table 4.
[Table 4]

As can be seen from the table, when the oleic acid concentration is 10 μM or more, the produced oleic acid CoA decreases. From this, it is desirable that the molar concentration of oleic acid is 50 times or less the molar concentration of luciferase as the optimal reaction conditions.
On the other hand, there was no effect on the amount of oleic acid CoA produced even when ATP and CoA were used at high concentrations. In normal cases, it was sufficient to add ATP and CoA more than 100 times the molar concentration of the enzyme.
2) Reaction time
Under the above reaction conditions in 1), the concentration of oleic acid is 10 μM and the reaction time is
And examined. The results are shown in Table 5.
[Table 5]

From this result, the reaction proceeds linearly with time until a reaction time of 60 minutes, but tends to decrease after 120 minutes. That is, at 30 ° C., a reaction time of 60 minutes is most suitable.
[0026]
Example 6 Usage example of Luciola cruciata-derived luciferase
A similar experiment was conducted using luciferase derived from Luciola cruciata in place of the luciferase derived from firefly (Photinus pyralis) used in Examples 1-5. As the reaction conditions, those clarified from Example 1, Example 2 and Example 5 were used.
Example 6-1 According to TLC method ³² Detection of P-AMP
After the reaction with each substrate under the reaction conditions described in Example 1, adenosine monophosphate (by TLC method) ³² P-AMP) was confirmed. The production ratio was as shown in Table 6.
[Table 6]

As the carbon chain length and the degree of unsaturation of the fatty acid increased, it was revealed that the amount of production increased. This tendency is the same as the luciferase derived from firefly (Photinus pyralis).
At the same time, using luciferase derived from firefly (Photinus pyralis), a reaction using linolenic acid as a substrate, ³² The production activity of P-AMP was compared. When the luciferase derived from firefly (Photinus pyralis) was taken as 100%, the conversion ratio by luciferase derived from Luciola cruciata was 97.4%. That is, depending on the species from which the luciferase is derived, ³² Since there was almost no difference in P-AMP production ability, it became clear that the fatty acid conversion efficiency was almost the same.
[0027]
Example 6-2 Identification of fatty acid CoA by mass spectrometry
Oleic acid, linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid, which are suitable long-chain fatty acids as reaction substrates, were reacted with CoA in the presence of luciferase, ATP, and magnesium ions. The reaction product was subjected to HPLC, and each fatty acid CoA was fractionated and identified by mass spectrometry. The synthesis and purification conditions for fatty acid CoA are the same as in Example 3, and the mass spectrometry is the same as in Example 4.
That is, a 1.5 mL Eppendorf tube was used for the enzyme reaction system, the total volume of the reaction system was 400 μL, 6.91 nmole of oleic acid (Aldrich), linoleic acid (Wako Pure Chemical Industries), linolenic acid (Japan) Yushi) or arachidonic acid (Sigma) and 25.4 μg of recombinant luciferase derived from Luciola cruciata (specific activity: 6 m units / mg, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), final concentration of 250 μM adenosine triphosphate (Manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 250 μM coenzyme A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 mM magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 mM Tris buffer (pH 7.8, manufactured by Nacalai Tesque). The enzyme reaction was started by adding luciferase, and the reaction was performed at 30 ° C. for 60 minutes. The reaction was stopped by adding 266.4 μL of acetonitrile and stirring. After stopping the reaction, the reaction solution was centrifuged (10,000 rpm, 5 minutes), and 500 μL of the supernatant was subjected to HPLC treatment under the conditions described in Example 3. On the chromatogram, main peaks of oleic acid CoA at 18.4 minutes, linoleic acid CoA at 17.1 minutes, linolenic acid CoA at 14.8 minutes, and arachidonic acid CoA at 16.2 minutes were detected. Fatty acid CoA of the main peak production fraction was collected and subjected to mass spectrometry as described in Example 4. As a result, the theoretical measurement mass value of oleic acid CoA [MH] ^- Was 1030.35 and the measured value was 1030.38. Theoretical measurement mass value of linoleic acid CoA [MH] ^- Was 1028.34 and the measured value was 1028.39. Theoretical measurement mass value of linolenic acid CoA [MH] ^- Was 1026.32, and the measured value was 1026.41. The theoretical measured mass value of arachidonic acid CoA was 1052.34, and the measured value was 1052.42. Since the measured values almost completely coincided with each other, it was confirmed to be oleic acid CoA, linoleic acid CoA, linolenic acid CoA and arachidonic acid CoA. That is, the compound produced from oleic acid by Luciola cruciata-derived luciferase is oleic acid CoA, the compound produced from linoleic acid is linoleic acid CoA, and the compound produced from linolenic acid is linolenic acid CoA. The compound produced from arachidonic acid was arachidonic acid CoA. From this result, it was clarified that Luciola cruciata-derived luciferase has the ability to synthesize long-chain fatty acid CoA, similar to firefly (Photinus pyralis) -derived luciferase.
[0028]
The results of mass spectrometry (Examples 4 and 6) and the HPLC retention time (Examples 3 and 6) when luciferase derived from firefly (Photinus pyralis) and luciferase derived from Luciola cruciata are used. It is shown in Table 7.
[Table 7]

ND = not measured
The holding time was not different between Examples 3 and 6.
[0029]
【The invention's effect】
By reacting saturated and unsaturated fatty acids with CoA using luciferase as a catalyst, highly pure fatty acid CoA can be produced in high yield.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a reaction of fatty acid CoA using luciferase as a catalyst.
FIG. 2 is a schematic diagram of a luminescence reaction by luciferase using luciferin as a substrate.

Claims (9)

A method for producing fatty acid coenzyme A, comprising reacting coenzyme A with a fatty acid having 6 or more carbon atoms in the presence of adenosine triphosphate and magnesium ion, using luciferin as a substrate and a luminescent enzyme as a catalyst. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 1, wherein the fatty acid is a fatty acid having 6 to 24 carbon atoms. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 2, wherein the fatty acid is a fatty acid having 16 to 20 carbon atoms. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 3, wherein the fatty acid is an unsaturated fatty acid. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 4, wherein the fatty acid is linoleic acid. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 4, wherein the fatty acid is linolenic acid. The method for producing fatty acid coenzyme A according to claim 4, wherein the fatty acid is arachidonic acid. The method for producing fatty acid coenzyme A according to any one of claims 1 to 7, wherein luciferase derived from firefly (Photinus pyralis) is used as a catalyst. The method for producing fatty acid coenzyme A according to any one of claims 1 to 7, wherein luciferase derived from Luciola cruciata is used as a catalyst.

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