JP4165698B2 - Reagent for amylase activity measurement, measurement method, and apparatus - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアミラーゼ活性の測定に使用する試薬に関し、特に、被験者の唾液中のアミラーゼ活性の測定のための試薬、その試薬をつかったアミラーゼ活性の測定方法及びそのための測定用装置に関する。さらには、測定した唾液アミラーゼ活性値より、被験者のストレスを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
アミラーゼ（酵素番号EC3.2.1.1）は膵・唾液腺などで分泌され、主に唾液腺・膵に分布し、その他にも筋肉・卵巣・卵管などに存在していることが知られており、組織から逸脱したアミラーゼが血中や尿中に存在していることも知られている。一部の膵臓・唾液腺、腎・肝機能障害、腫瘍などの疾患においては、血清中や尿中・膵液中のアミラーゼ値が高値を示すことが知られている。
これらのアミラーゼ活性の測定方法としては、修飾オリゴ糖基質を用いた酵素法などが知られており、分光光度計や自動分析機などを用いてその吸光度変化から測定を行っていた。
【０００３】
近年の研究より、唾液アミラーゼ活性値が、被験者のストレスと相関しているとの報告がされており〔医用電子と生体工学 39（3）, p234-239（2001）、山口昌樹 他〕、唾液試料中のアミラーゼ活性値を測定する方法が望まれている。
しかしながら、従来の自動分析機などを用いた測定は、測定装置が高価であり、測定にも様々な準備が必要であり、測定自体にも数10分かかるという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の課題は、唾液などの生物学的試料中に存在するアミラーゼ活性をより簡便に短時間に測定する手段を提供するものであり、そのための試薬、測定方法、測定用装置、加えてこれらを利用した被験者のストレスを測定する方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決する方法及び手段】
本発明者らは、修飾オリゴ糖基質を用いた酵素法において、オリゴ糖基質を支持体に担持するという手段を導入し、支持体上でアミラーゼ反応を行わせ、色判別センサーで発色を読みとることにより、数10秒という短時間で簡便にアミラーゼ活性を測定することが可能であることを見いだし、本発明に至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
「１．アミラーゼ測定用試薬を、採取された唾液と接触させ、遊離する修飾物質を測定することを特徴とするアミラーゼ活性の測定方法であって、
前記アミラーゼ測定用試薬は、試薬保持部と、前記試薬保持部に担持された基質である修飾オリゴ糖と競合阻害剤を備え、
前記修飾オリゴ糖は、
Ｇ２〜７から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されており、
色原体が、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）から選ばれるいずれか１であり、
前記競合阻害剤は、
マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれるいずれか１であり、
（１）前記採取された唾液を、前記試薬保持部に接触させることにより発色させ、
（２）発光手段から前記試薬保持部に直接光を照射し、
（３）前記試薬保持部からの反射光を測定する
ことを特徴とするアミラーゼ活性測定方法。
２．前記アミラーゼ測定用試薬は、
さらに、唾液を含浸する先端部を備えたものであって、
採取された唾液を含浸した前記先端部と、前記試薬保持部とを接触させることを特徴とする前項１に記載のアミラーゼ活性測定方法。
３．前記試薬保持部は、細長い板状紙片であり、
前記細長い板状紙片の中央部に折り目が形成されており、
前記試薬保持部が前記細長い板状紙片の一端側に載置され、
前記先端部は前記細長い板状紙片の他端側に形成したものであり、
前記細長い板状紙片を折り目にて折りたたむことにより、前記先端部と前記試薬保持部が接触することを特徴とする前項２に記載のアミラーゼ活性測定方法。
４．試薬保持部が、水不溶性の有機又は無機担体である前項１〜３の何れかに記載のアミラーゼ活性測定方法。
５．試薬保持部が、薄膜である前項１〜４の何れかに記載のアミラーゼ活性測定方法。
６．薄膜の厚さが、１００〜５００μｍである前項５に記載のアミラーゼ活性測定方法。
７．薄膜が、白色である前項５または６に記載のアミラーゼ活性測定方法。
８．修飾オリゴ糖の支持体である試薬保持部への担持量が、修飾オリゴ糖基質を２〜５００ｍｍｏｌ／Ｌを含有する溶液中に支持体を約１〜５分間含浸させてえられる相当量である前項１〜７の何れか一に記載のアミラーゼ活性測定方法。
９．修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる前項１〜８の何れか一に記載のアミラーゼ活性測定方法；
２−クロロ−４−ニトロフェノール−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトサイド（以下 ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ６−ＣＮＰ、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ、Ｇ７−ＰＮＰ。
１０．前記試薬保持部は、Ｇａｌ−Ｇ２−ＣＮＰを含む（但し、α−グルコシダーゼは含まない）ことを特徴とする前項１〜８の何れか一に記載のアミラーゼ活性測定方法。
１１．発光手段が発光ダイオード、レーザ、ハロゲンランプ、タングステンランプから選ばれる前項１〜１０の何れかに記載の測定方法。
１２．反射光を計測する角度が０〜４５度、測定対象との距離が１０〜３０ｍｍ、スポット径が１〜５ｍｍである前項１〜１１の何れか一に記載の測定方法。
１３．前項１〜１２の何れか一に記載の測定方法によって人唾液中のアミラーゼ活性を測定することを含む、被験者のストレスレベルの検定方法。」からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明においてアミラーゼとは、主にヒト唾液腺や膵腺より分泌されるα−アミラーゼが代表的である。アミラーゼはデンプン、アミロースなどの多糖類を加水分解する分子量54,000〜62,000の消化酵素である。唾液中のアミラーゼ活性値は、体調による変動や、個人差が非常に大きい事が知られている。正常値は数万IU/L程度であるが、体調や、体質によっては、健常人においても10万IU/Lを越える事があることが知られている。
【０００８】
本発明において使用されるアミラーゼ活性測定のための基質は、修飾オリゴ糖が使用される。修飾とは、オリゴ糖の末端、還元末端に識別標識化合物が結合されていることを意味し、アミラーゼ又は共役酵素によって遊離されうる。修飾オリゴ糖の糖数はＧ２〜Ｇ７であり、好ましくはＧ２〜Ｇ５である。修飾化合物は、色原体といわれるものが一般的に使用でき、好適な基としては、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）が例示される。このような色原体で修飾されたオリゴ糖の具体例としては、２−クロロ−４−ニトロフェノール−４-Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシルマルトサイド（以下 ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェニル−マルトペンタオース）、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェニル−マルトペンタオース）、Ｇ６−ＣＮＰ（２−クロロ−ｐ−ニトロフェニルマルトテトラオース）、Ｇ７−ＰＮＰがあげられる。このうち、特に、アミラーゼによる加水分解時の切断箇所が１箇所に限定されるＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰやＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰなどが好ましい。
【０００９】
修飾オリゴ糖を一般式で表すと以下となる。
【化１】
式中のR1、R2はそれぞれ水素原子あるいは保護基を意味する。保護基は格別限定されるものではないが、例えば、非置換または置換の低級アルキル基、低級アルコキシル基またはフェニル基、アジド基、ハロゲン原子、N-モノアルキルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールスルホニルオキシ基またはアルキルオキシ基、α-グルコシル基、α-マルトシル基、β−ガラクトシル基であり、R1、R2は互いに架橋していてもよく、該架橋基にはさらに置換基を有していてもよい。R3はシグナル発生基、例えば光学的にシグナルを検出可能な基（好適には発色性芳香族基）であり、nは0〜5である。上記式では-OR3は、還元性末端グルコースの１位にβ-結合したものであるが、α-結合したものであってもよい。
【００１１】
本発明のアミラーゼ測定用試薬は、基質が支持体に担持されている状態である。支持体に担持とは、水不溶性の有機又は無機担体に基質と競合阻害剤が固定化又はトラップされている状態をいう。そして支持体の形状は、薄膜が好適であり、厚さ１００〜５００μｍ、好ましくは１５０〜４００μｍである。薄膜は、一般的に遊離する修飾物質の発色を色判別センサーで測定することから、光の乱反射が制御されたものが好ましく、膜表面が出来る限り均一なものが良い。薄膜は白色が好ましい。薄膜の材質は、紙、ニトロセルロース、ナイロン、多孔性ガラス等が好適に例示されるがこれに限定されず、本発明で定義する基質を効率的に担持又は保持できるものであれば広く利用可能である。
【００１２】
修飾オリゴ糖の支持体への担持量は、一定に調節されることが好ましい。簡便な方法としては、修飾オリゴ糖基質を２〜５００ｍｍｏｌ／Ｌを含有する溶液中に支持体を約１〜５分間含浸させ、それを乾燥させて得る方法があり、これによりえられる相当量が例示される。
【００１３】
本発明の測定方法における測定は、基質の修飾物質であるＣＮＰやＰＮＰ等の色原体の遊離による、試料支持体の発色による吸光度変化を量的にとらえアミラーゼ活性を決定する。例えば、ＣＮＰは４０５ｎｍの吸光度で測定する。通常は、大過剰のアミラーゼの作用のみによって、この色原体の遊離は可能であるが、所望により、アミラーゼの加水分解反応後に、アミラーゼとα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ等によって色原体を遊離させる反応を含んだ共役酵素法が用いられることもある。この場合は、追加の酵素を試薬として添加する手段の導入が必要となる。さらに、所望により、反応の促進のために、公知のα-アミラーゼの活性化剤を用いてもよい。
【００１４】
本発明の測定方法における反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃である。反応時間は、１〜１０数分で十分であるが、基質および所望により使用される共役酵素の種類に依存する。
【００１５】
発色による変化の測定は、色判別センサーが好適に利用される。支持体による発色の変化は反射光又は透過光によって測定することが便宜である。光源としての発光手段は発光ダイオード、レーザ、ハロゲンランプ、タングステンランプ等が好適に選ばれるがこれに限定されるものではない。反射光を計測する場合には角度が０〜４５度好ましくは１０〜３５度より好ましくは１５〜３０度、測定対象との距離が１０〜３０ｍｍ好ましくは１５〜２５ｍｍより好ましくは１８〜２２ｍｍ、試料スポット径が１〜５ｍｍ好ましくは２〜４ｍｍより好ましくは２．５〜３．５ｍｍの条件を満足する測定装置が好適に用いられる。本発明装置と試薬の概念を図３に示した。
【００１６】
かくして提供される本発明の試薬を利用したアミラーゼの測定方法は、生物学的試料として、高濃度にアミラーゼを含有する試料に適している。例えば、唾液、血液、尿等がサンプルになりうるが、唾液がもっとも好ましい。
【００１７】
人唾液中のアミラーゼ活性を簡便に測定することを可能とする本発明は、被験者のストレスレベルの検定方法のための簡便・効果的な手段を可能とする。具体的には、被験者の安静時に採取した唾液中のα-アミラーゼ活性を測定し、その活性値を記録、記憶して基準値とする。その後に被験者の任意の状態におけるα-アミラーゼ活性を測定し、安静時に記録、記憶した基準値と比較する。基準値より酵素活性が大きければ、不快なストレス(distress)を受けていると判定し、小さければ、快適なストレス(eustress)を受けていると判定できる。また、基準値との差が大きいほど、受けているストレスも大きく、身体または精神に受けているストレスの程度も判定できる。
【００１８】
また、連続してα-アミラーゼ活性を測定することにより経時的なストレスの変化を捉えることができる。不快なストレスを受けると唾液中のα-アミラーゼ活性が上昇する。この際の正の時間勾配の大きさによってストレスの大きさの程度を判定することができる。逆に快適なストレスを受けている場合はα-アミラーゼの酵素活性が低下するので、負の時間勾配として現れ、同様にその大きさの程度も判定できる。
【００１９】
更には経時的にα-アミラーゼ活性を測定し、測定時間内に加えられた任意のストレスによる酵素活性変化を捉え、ストレス負荷前の値（基準値）に戻るまでの時間・変化の大きさからストレスの大きさの程度を判定することができる。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、基質である修飾オリゴ糖を支持体に担持する酵素法によるアミラーゼ測定法に関する限り全て本発明の技術思想に包含される。
【００２１】
【実施例１】
試薬▲１▼（試験紙）の調製
14 mmol/LのGal-G2-CNP、700 mmol/LのKSCNを溶解した溶液に、Advantec Filter Paper 514A（東洋濾紙社）を3分間含浸させた後に乾燥させた。この試験紙を7mmｘ7mmに切断した。
【００２２】
【実施例２】
以下の調製方法で基質と競合阻害剤を支持体に担持させた試薬（試験紙）を調製した。
70 mmol/LのGal-G2-CNP、3.5 mol/LのKSCN、1 mol/Lのマルトテトラオースをバッファーに溶解した溶液に、Advantec Filter Paper 514A（東洋濾紙社）を3分間含浸させた後に乾燥させた。この試験紙を7mmｘ7mmに切断した。
【００２３】
【実施例３】
以下の調製方法で基質と競合阻害剤を支持体に担持させた試薬（試験紙）を調製した。
140 mmol/LのGal-G2-CNP、7 mol/LのKSCN、0.5 mol/Lのマルトペンタオースをバッファーに溶解した溶液に、Advantec Filter Paper 514A（東洋濾紙社）を3分間含浸させた後に乾燥させた。この試験紙を7mmｘ7mmに切断した。
【００２４】
【試験例１】
以下の処理により、実施例１の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
1. 健常人より唾液試料を採取したa〜eの5試料のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定用試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドII（ニプロ株式会社）で測定した。エスパ・アミラーゼ・リキッドIIは、Gal-G2-CNPを用いた酵素法によるアミラーゼ測定用試薬であり、2000IU/Lまでのアミラーゼを測定できる。測定には自動分析装置7170（日立）を用いた。検体eは測定限界を超えるため、そのままでは測定できなかったので、各試料を1%(W/V)BSA（牛血清アルブミンの１%(W/V)生理食塩水溶液を意味する。以下同様）で10倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表１に示した。
【００２５】
【表１】
2. KEYENCE社の色判別センサーCZ-V1を、反射光の角度22.5°、測定対象との距離20mm、スポット径 2mmとなるように調節した。測定にはCモードを用いた。装置図は図３に示した。
【００２７】
3. 試薬▲１▼を用いて1.の試料のアミラーゼ活性値の測定を行った。測定には2.で調節した装置を用いた。試薬▲１▼に3μLの試料を滴下し、反応前と反応1分後の装置の測定値の差を計測した。結果は表２に示した。
【００２８】
【表２】
エスパ・アミラーゼ・リキッドIIによる測定結果と、試薬▲１▼による測定結果の相関は図１に示した。r=0.98となり高い相関が示された。試薬▲１▼の測定値を44倍すれば、従来法とほぼ等しい値となる。つまり、本発明試薬は、直接試料中のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００３０】
【試験例２】
以下の処理により、実施例２の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
1. 健常人より唾液試料を採取した試料fを1%(W/V)BSAで0.2, 0.4, 0.6, 0.8倍に希釈した。
2. 上記試料、および陰性対照試料（生理食塩水）のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定用試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドII（ニプロ株式会社）で測定した。測定には自動分析装置7170（日立）を用いた。そのままでは測定限界を超えるため測定できないので、各試料を1%(W/V)BSAで10倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表３に示した。
【００３１】
【表３】
3. 実施例１で用いた試薬▲１▼を用いて各試料のアミラーゼ活性値の測定を行った。測定には実施例１で用いた装置を用いた。試薬▲１▼に3μLの試料を滴下し、反応前と反応1分後のセンサーの測定値の差を計測した。結果は表４に示した。
【００３３】
【表４】
エスパ・アミラーゼ・リキッドIIによる10倍希釈試料の測定結果と、試薬▲１▼による測定結果の相関は図２に示した。r=0.99となり高い直線性が示された。
試薬▲１▼の測定値を43倍すれば、従来法とほぼ等しい値となる。つまり本発明試薬は、直接試料中のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００３５】
【実施例４】
次に、上記測定方法を利用したストレス測定装置の構成例について説明する。
図４に測定装置の外観構成を示す。測定装置本体１には、その中央部に開口２が形成されていると共に、その左側側面に電源スイッチ３が配されている。また、測定装置本体１の前面には、表示パネル４、操作ボタン部５およびスロット形成部６が配されており、さらにスロット形成部６には、測定用試薬８を挿入するためのスロット７が形成されている。
なお、測定用試薬８は細長い板状紙片によって形成されており、その中央部に、試薬を折り曲げるための折り目が形成されている。この折り目によって測定用試薬を折り畳むと、その先端部が、測定用試薬８の試薬保持部に接触する。かかる測定用試薬８の試薬保持部は、唾液との反応前は、白色である。唾液と反応した後は、ストレス度合に応じて所定の色が濃く発色される。上記測定例では、この発色は黄色である。上記シグナル発生基によっては、その他の色の発色とすることも可能である。
ストレス測定を行う場合には、実際の測定操作に先立って、まず、ゼロ点調整のための初期操作が、以下の手順に従って行われる。まず、電源スイッチ３を操作して電源を導通させた後、基準紙（白色）をスロット７に挿入する。しかる後、操作ボタン部５のゼロ点調節用ボタンを操作する。これにより、内部のストレス判別センサによって基準紙の色判別がなされ、その判別結果が初期値として内部メモリに設定される。初期値の設定が完了すると、表示パネル４にその旨の表示がなされる。しかる後、基準紙をスロット７から抜きとり、これにより、初期操作が完了する。
ストレス測定は、以下のようにして行われる。まず、測定用試薬８の先端部を舐めて唾液を含浸させた後、測定用試薬８を折り目に沿って折り畳む。次に、試薬保持部の位置を一定時間だけ指で挟み、唾液を試薬保持部に含浸させる。しかる後、折り畳まれた測定用試薬８を元の位置に戻し、試薬保持部が図４の左側を向くようにして、先端部からスロット７に挿入する。かかる挿入により、試薬保持部の色判別が内部のストレス判別センサによって行われる。この色判別結果は、上記基準紙による初期設定値と比較される。そして、その比較結果に応じてストレス値が算出され、これが表示パネル４上に表示される。
次に、上記測定装置の具体的構成例について、図５〜図７を参照して説明する。
まず、図５に、測定装置の内部構造を示す。なお、図５（ａ）は、上記図４に示す測定装置の上蓋とスロット形成部６とを取り外した状態の上面図、同図（ｂ）は、その正面図である。
図において、１１は電源供給用のバッテリ、１２は上蓋を保持するための鉤部、１３はストレス判別センサ、１４はストレス判別センサ１３の光カップリング端子と光ヘッド１５とを光学的に連結する光ファイバ、１５は上記測定用試薬８の試薬保持部に光（例えば発光手段は発光ダイオード、レーザ、ハロゲンランプ、タングステンランプから選ばれる）を照射すると共にその反射光を受光する光ヘッドである。
１６は測定装置本体１の基部に形成された扇形状の凹部、１７は螺子１８を支軸として凹部１６に回動可能に配された支持板、１９は支持板１７に形成された案内溝、２０は支持板１７の回動端を上方から押えるようにして凹部１６に嵌着された押え板、２１は押え板２０に形成された目盛り、２２は押え板２０に形成された案内溝、２３は支持板１７を所定の目盛り位置に固定するための螺子である。
２４は支持板１７の案内溝１９に沿って摺動する光ヘッド保持板、２５は光ヘッド保持板２４を所定の位置に固定するための螺子、２６はスロット形成部６を案内するためのガイド板、２７はスロット形成部６を装着位置に保持するためにガイド板２６に形成された円柱状の突起である。
電源スイッチ３をＯＮにすると、バッテリ１１の電源がストレス判別センサ１３に供給され、ストレス判別センサ１３から光が出射される。この光は光ファイバ１４を介して光ヘッド１５に供給され、光ヘッド１５の先端部から出射される。かかる光は、上記の如くしてスロット６から挿入された測定用試薬の試薬保持部に照射される。かかる光は、試薬保持部にて吸収、散乱ないし反射され、その反射光の一部が、光ヘッド１５の光軸を逆行して光ヘッド１５に受光される。このようにして受光された光は、光ファイバ１４を介してストレス判別センサ１３に伝送される。ストレス判別センサ１３はかかる反射光の強度を、後述の如くして分析・演算処理し、これによりストレス値を算出する。
図６に、上記スロット形成部６の構造を示す。スロット形成部６の正面に形成されたスロット７の背面側にはガイド６１が形成されている。このガイド６１は、同図の上面図に示すように、途中から所定の曲率にてカーブするように形成されている。よって、測定用試薬８をスロット７からガイド６１の終端まで挿入すると、測定用試薬８はこのカーブに従って撓み、その復元力によって、ガイド６１内の底部に圧接される。これにより、測定用試薬８はその面に垂直な方向および前後左右方向に変位することなく、ガイド６１底部の所定の位置に位置決めされる。
図６の左側面図に示すように、ガイド６１には切欠き６２が形成されている。かかる切欠き６２は、測定用試薬８をガイド６１の終端まで挿入したときに、試薬保持部が位置付けられる位置の近傍に形成されている。かかる切欠き６２により、光ヘッド１５からの光をガイドにて遮光することなく試薬保持部に導くことができる。また、ガイド６１には、上記カーブ位置のやや手前からガイド終端に到るまで、背板６３が固着されている。この背板６３は、上記カーブによって生じる測定用試薬８の復元力に抗して、測定用試薬８の先端を上記カーブに沿ってガイド終端まで導くためのものである。
また、スロット形成部６の背面には、先端部に鉤部を有する１対の突出部６４が形成されている。かかる突出部６４はスロット形成部６を測定装置本体１に装着する際のガイドおよび抜け止めとして機能する。スロット形成部６を測定装置本体１に装着する場合には、同図の上面図に示す突出部と外壁との間の隙間に図５のガイド板２６が挿入されるようにして、スロット形成部６を測定装置本体１の前面から押し進める。すると、突出部６４の先端がガイド板２６の突起２７に当接し、一対の突出部６４が撓んで押し広げられる。そして、スロット形成部６が装着位置まで押し進められると、これら一対の突出部６４が元の位置に弾性復帰し、その先端に形成された鉤部とガイド板２６の突起２７とが係合する。これにより、スロット形成部６の脱落が防止され、よって、スロット形成部６が測定装置本体１に装着される。
図６の右側面図および背面図に示す窪み６４は、スロット形成部６を測定装置本体１から取り外す際に、指掛かりとして機能するものである。スロット形成部６を測定装置本体１から取り外す場合には、この窪み６５に指を引っ掛けて、スロット形成部６を前方に引っ張る。これにより、上記突出部６４先端の鉤部とガイド板２６の突起２７との係合が解除され、スロット形成部６を測定装置本体１から取り外すことができる。
なお、上記図５に示した構成中、凹部１６〜螺子２５の構成は、光ヘッド１５の光軸の測定用試薬８に対する傾斜角度（光の入射角度）の調整と、光ヘッド１５と測定用試薬８との間の距離および測定用試薬８上の光のスポット径の調整とを行うための調整機構として機能するものである。
上記の如くしてスロット形成６を測定装置本体１の装着した後、測定用試薬８をスロット６から挿入すると、測定用試薬８の試薬保持部は光ヘッド１５の光軸上に位置するように位置付けられると共に、測定用試薬８はガイド板２６に並行となるように位置付けられる。したがって、支持板１７を回動させると、測定用試薬８に対する光ヘッド１５の光軸の角度（光の入射角度）を変化させることができ、また、光ヘッド保持板２４を案内溝１９に沿って摺動させると、光ヘッド１５と測定用試薬８との間の距離および測定用試薬８上における光のスポット径を変化させることができる。
ストレス測定の際には、かかる調整機構によって、測定動作が最適となるよう、上記傾斜角度、距離およびスポット径を適宜調節するのが好ましい。あるいは、測定用試薬毎に好ましい設定値が異なる場合には、測定用試薬を変更する際に、適宜、上記調整を行う必要がある。
次に、上記ストレス判別センサ１３の構成例について図７を参照して説明する。なお、図中、１０１〜１１０は光学系の構成例、２０１〜２１１は回路系の構成例である。
図において、１０１は赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）の光を出射する半導体レーザ、１０２は出射された光を並行光に変換するコリメータレンズ、１０３は上記３つの光（Ｒ、Ｇ、Ｂ）の光軸を一致させるミラー素子、１０４は上記光を光カップリング素子１０５の入射口に収束させる集束レンズ、１０５は上記光ファイバ１４の一端に接続され上記光を光ファイバ１４に入射せしめる光カップリング素子である。
１０６は測定用試薬８からの反射光を導く光ファイバーの端部に接続された光カップリング素子、１０７は光カップリング素子１０６から出射された上記反射光を並行光にする収束レンズ、１０８は反射鏡、１０９は上記反射光を光検出器１１０上に収束させる収束レンズ、１１０は収束された反射光の強度に応じた電気信号を出力する光検出器である。
２０１は半導体レーザ１０１を駆動するレーザ駆動回路、２０２は上記表示パネル４を含むと共にコントローラ２０４によって算出されたストレス値に応じた表示を出力するディスプレイ部、２０３は上記操作ボタン部５を含むと共に操作ボタンに応じた指令をコントローラ２０４に入力する操作入力部である。
２０４は各部を制御すると共に比較演算部２０８からの比較演算結果および温度センサ２０９からの温度情報やＲＯＭ２１０からの統計情報に基づいてストレス値（ストレスの度合）を算出するコントローラである。かかるコントローラ２０４は内部に時計回路を有しており、測定用試薬８が挿入された後の経過時間をかかる時計回路によって計測する。なお、測定用試薬８が挿入されたことの検出処理および時計回路による計時動作の詳細については後述する。
２０５は光検出器１１０からのアナログ電気信号を増幅および波形整形すると共に所定のサンプリング周期にてアナログ電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換部、２０６は一定期間の間にＡ／Ｄ変換回路２０５から供給されたサンプリング値を平均化して当該期間の平均値を算出する平均化部、２０７は上記基準紙（白色）をスロット６に挿入した際に平均化部２０６にて算出された平均値を基準値として保持する基準値メモリ、２０８はストレス測定時に平均化部２０６にて算出された平均値と基準値メモリ２０７に保持された基準値とを比較し、両者の差を算出する比較演算部である。
２０９は測定用試薬８の挿入部近傍に配され（図５、図６では省略）、当該挿入部位近傍の温度を検出してその検出結果をコントローラ２０４に供給する温度センサ、２１０は比較演算部２０８からの比較演算結果とストレス値との換算テーブルや、温度情報によって当該換算テーブルのストレス値を補正するための補正テーブル、あるいは反応時間に対する上記比較演算結果の推移に関する情報等の統計データを保持するＲＯＭ（Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ−Ｍｅｍｏｒｙ）、２１１はストレス値の測定履歴を記憶するメモリである。
次に、かかるストレス判別センサ１３の動作について説明する。
まず、上記初期操作（ゼロ点調整）の際の動作について説明する。上記初期操作において、基準紙（白色）がスロット６から挿入された後、初期設定用のボタンが操作されると、半導体レーザ１０１のうち、半導体レーザ（Ｒ）が一定時間Ｔだけ駆動され、赤色の光（Ｒ）が出射される。かかる光（Ｒ）は、コリメータレンズ１０２から光カップリング素子１０５までの光学系および上記図５の光ファイバー１４、光ヘッド１５を介して基準紙に照射される。しかして、基準紙に光（Ｒ）が照射されると、当該光（Ｒ）は基準紙によって散乱、反射され、その一部が、上記光ヘッド１５および光ファイバ１４の光路を逆行し、光カップリング素子１６から出射される。そして、収束レンズ１０７から集束レンズ１０９の光学系を介して光検出器１１０上に収束される。
かかる反射光を受光した光検出器１１０はその強度に応じた電気信号をＡ／Ｄ変換部２０５に送る。Ａ／Ｄ変換部２０５は上記期間Ｔの間、当該電気信号のサンプリングを繰り返し、これを平均化部２０６に送る。平均化部２０６は当該サンプリング値を期間Ｔにて平均化し、その算出結果を基準値メモリ２０７に送る。基準値メモリ２０７は、当該平均値を光（Ｒ）に対する基準値として保持する。これにより、光（Ｒ）に対する初期値の設定が完了する。
このようにして光（Ｒ）に対する基準値が保持されると、次に、半導体レーザ（Ｇ）が一定期間Ｔだけ駆動され、緑色の光（Ｇ）が出射される。そして、上記と同様にして光（Ｇ）の反射光が光検出器１１０に受光され、その強度に応じた電気信号が出力される。かかる電気信号は、上記と同様にして処理され、これにより基準値メモリ２０７に、光（Ｇ）に対する基準値が保持される。これにより、光（Ｇ）に対する初期値の設定が完了する。さらにその後、半導体レーザ（Ｂ）が一定期間Ｔだけ駆動され、上記と同様にして、光（Ｇ）に対する基準値が基準値メモリ２０７に保持される。これにより、全ての光に対する初期設定が完了する。
次に、ストレス測定時の動作について説明する。
上記初期設定動作が終了すると、レーザ駆動部２０１は、上記期間Ｔずつ、半導体レーザ（Ｒ）（Ｇ）（Ｂ）を順番に繰り返し駆動するよう、半導体レーザ１０１を駆動する。すなわち、半導体レーザ１０１からは、３Ｔの繰り返し周期にて、各色の光が出射される。かかる状態（測定待機状態）において、上記各色の光は上記図６に示すスロット形成部６のガイド６１に対して照射される。しかしながら、光が照射されるガイド６１の部位（図６の切欠き６２近傍部分）のガイド底部には背板６３が配されていないため、これら光はガイド６１によって反射されず、したがって、その反射光が図７の光検出器１１０に収束されることはない。よって、Ａ／Ｄ変換部２０５からコントローラ２０４に供給されるサンプリング値は、その値がゼロ近傍となっている。
しかる後、測定用試薬８がスロット６から挿入されると、上記各色の光が測定用試薬の先端部によって反射され、光センサ１１に反射光が収束される。これにより、Ａ／Ｄ変換部２０５からコントローラ２０４に供給されるサンプリング値の内容が、ゼロから一定の値に立ち上がる。コントローラ２０４は、かかるサンプリング値の立ち上がりによって測定用試薬の挿入を検出し、以下、ストレス測定動作を行うべく、各部を制御する。
レーザ駆動回路２０１に対しては、上記と同様、期間Ｔずつ各色の光を繰り返し出射せしめる。これら各色の光は、測定用試薬８の試薬保持部にて吸収、散乱、反射され、その反射光の各期間Ｔにおける強度平均値が、比較演算部２０８にて当該色の基準値と比較される。そして、その色の光の比較演算結果が、順次、コントローラ２０４に供給される。
たとえば、上記測定用試薬８の挿入がコントローラ２０４にて検出された後に到来する上記期間ＴをＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、…とし、そのタイミング期間に出射される光の色をＲ→Ｇ→Ｂ→Ｒ…、その際の反射光強度の平均値をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、…、その比較演算結果をＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、…とすると、Ｔ１期間では平均値Ａ１と光（Ｒ）の基準値とが比較され、その差がＤ１としてコントローラ２０４に出力される。同様に、Ｔ２期間では平均値Ａ２と光（Ｇ）の基準値とが比較され、その差がＤ２としてコントローラ２０４に出力され、Ｔ３期間では平均値Ａ３と光（Ｂ）の基準値とが比較され、その差がＤ３としてコントローラ２０４に出力される。
コントローラ２０４は、このようにして送られてくる一連の比較演算結果Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、…と、温度センサ２０９からの温度情報およびＲＯＭ２１０中のストレス変換テーブルおよび補正テーブル（温度、経過時間）に基づいて、ストレス値を算出する。具体的には、上記ＲＯＭ２１０に記憶されている補正テーブルおよび統計データを参照し、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、…の各タイミングにおける温度および反応経過時間に基づいて、参照すべきストレス補正値を決定する。そして、当該比較演算結果（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、…）に対応するストレス値を変換テーブルから読み出し、これに上記補正値を加減算して、各タイミングのストレス値を算出する。そして、算出したストレス値を、一定期間（たとえば、Ｔ１〜Ｔ９９）にて平均化処理し、当該平均化したストレス値を、当該測定における最終ストレス値として決定する。
たとえば、１組のＲ、Ｇ、Ｂの光に対する比較演算結果とストレス値との関係が換算テーブルとして上記ＲＯＭ２１０に記憶されている場合、比較演算結果Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３の組み合わせに対するストレス値を換算テーブルから読み出す。そして、このストレス値に上記ストレス補正値を加減算して、期間Ｔ１〜Ｔ３に対するストレス値Ｓ１を算出する。ここで、上記ストレス補正値を決定するためのタイミングは、たとえば、中間のＴ２のタイミングとする。同様に、期間Ｔ４〜Ｔ６、Ｔ７〜Ｔ９、…、Ｔ９７〜Ｔ９９のストレス値Ｓ２、Ｓ３、…、Ｓ３３を算出する。そして、Ｓ１〜Ｓ３３のストレス値を平均化処理し、これを当該測定における最終ストレス値とする。
あるいは、比較演算結果をそのままストレス値として採用する場合には、Ｄ１〜Ｄ３を加算してストレス値を算出し、これに上記ストレス補正値を加減算して、期間Ｔ１〜Ｔ３に対するストレス値Ｓ１を算出する。同様に、期間Ｔ４〜Ｔ６、Ｔ７〜Ｔ９、…、Ｔ９７〜Ｔ９９のストレス値Ｓ２、Ｓ３、…、Ｓ３３を算出し、これらＳ１〜Ｓ３３のストレス値を平均化処理し、これを当該測定におけるストレス値とする。かかる場合には、上記変換テーブルは不要となる。ただし、上記演算を行うための処理プロセスをＲＯＭ２１０に記憶させておく必要がある。なお、演算処理は、上記Ｄ１〜Ｄ３の加算の他、測定用試薬の発色の度合を判別するための種々の演算処理を採用できる。
このようにして決定されたストレス値は、ディスプレイ部２０２に表示される。また同時に、個人の測定履歴としてメモリ２１１に記録される。なお、メモリ２１１に記憶された測定履歴は、操作入力部２０３を操作することにより適宜読み出してディスプレイ２０２上に表示することができる。
ディスプレイ部２０２に表示されるストレス値は、具体的な数値として表示される形態の他、ストレス値を一定の数値範囲毎に区分して、該当区分毎に、漫画（静止画または動画）や文字によって表示するようにしても良い。
次に、上記ストレス測定装置の種々の変形例について図面を参照して説明する。
【００３６】
【実施例５】
図８は、光ヘッド１５の変形例である。本実施例では、上記光ヘッド１５に代えて、対向型の光ヘッド１１１を配してある。すなわち、出射光の光軸と反射光の光軸とを整合させると共に、両光軸の測定用試薬８に対する傾き角度が一致するように光ヘッド１１１の出射端と入射端とを配してある。これにより、測定用試薬８からの反射光をより多く光検出器１１０に導くことができ、よって、比較演算部２０８からの演算出力をよりダイナミックにすることができる。よって、ストレス判別精度をより向上させることができる。
【００３７】
【実施例６】
図９は、上記メモリ２１１の変形例である。本実施例では、上記メモリ２１１に代えて、メモリカードインタフェース２１２とメモリカード２１３を配してある。上記ストレス測定履歴は、メモリカードインタフェース２１２を介してメモリカード２１３に記憶される。かかるメモリカード２１３は、着脱自在である。よって、測定者毎にメモリカード２１３を保持することにより、測定履歴を各人のみで管理することができるようになる。また、１つのストレス測定装置を複数人で使用することができるようになる。
【００３８】
【実施例７】
図１０は、さらにパーソナルコンピュータ（パソコン）転送用のインタフェース２１４を配した実施例である。同図は、測定履歴記憶用の媒体としてメモリカード２１３を利用した例を示してあるが、図８のように装置内のメモリに測定履歴を記憶するような場合にも適用可能である。メモリカード２１３またはメモリ２１１に記憶されている測定履歴は、インタフェース２１４を介してパソコンに転送できる。これにより、パソコン上で転送履歴を加工処理したり、測定履歴をメールに添付して医療機関等に送信することが可能となる。なお、パソコンへのインタフェースを配する代わりに、電話通信等の通信手段を配するようにしても良い。
【００３９】
【実施例８】
図１１および図１２は、半導体レーザ１０１の変形例である。図１１の実施例では、半導体レーザ１０１から赤色と青色の光のみが出射される。また、図１２の実施例では、半導体レーザ１０１から青色の光のみが出射される。これらは、唾液との反応により測定用試薬が黄色に発色する場合に用いて好適なものである。黄色に発色する場合、青色光は測定用試薬によって吸収され易く、よって青色光に対する比較演算結果に大きな変化が現れる。よって、青色光のみ、あるいは青色光と赤色光の組み合わせや、青色光と緑色光との組み合わせによっても、ストレス度合を比較的精度良く算出できる。ただし、測定用試薬の発色が黄色である場合に、赤色光と緑色光のみを利用すると、ストレス度合の判別精度が低下してしまう。これらの光は測定用試薬による吸収が小さいため、比較演算結果がダイナミックに変化しないためである。よって、３色のうち１色または２色の光を用いる場合には、測定用試薬の発色の補色となる光を含む用に組み合わせ等を設定するのが好ましい。
以上、本発明に係る種々の実施形態につき説明したが、本発明はかかる実施の形態に限定されるものではない。たとえば、上記実施例ではディスプレイ部２０２の表示パネルにてストレス度合を視覚的に出力するようにしたが、これに代えて、またはこれと共に、音声によるストレス度合の表示や、プリントアウトによる表示も採用できる。
この他、本発明の実施の形態は、本発明の技術的思想の範囲内において、適宜、種々の変更が可能である。
【００４０】
【発明の効果】
上記したごとく本発明によれば、基質である修飾オリゴ糖を支持体に担持させた酵素法によるアミラーゼ測定用試薬を提供し、この試薬を使ってアミラーゼ活性を測定すれば、きわめて簡便に迅速に効果的にアミラーゼ活性を測定可能であり、その結果、その場で短時間に被検者のストレスを判定する技術を確立することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エスパ・アミラーゼ・リキッドIIによる測定結果と、試薬▲１▼による測定結果の相関を示す。
【図２】 エスパ・アミラーゼ・リキッドIIによる１０倍希釈試料の測定結果と、試薬▲１▼による測定結果の相関を示す。
【図３】 本発明の測定用装置と試薬の概念図を示す。
【図４】 実施の形態に係るストレス測定装置の概観を示す図
【図５】 実施の形態に係るストレス測定装置の内部構造を示す図
【図６】 実施の形態に係るスロット保持部の構成を示す図
【図７】 実施の形態に係るストレス判別センサの一の構成例を示す図
【図８】 実施の形態に係るストレス判別センサの他の構成例を示す図
【図９】 実施の形態に係るストレス判別センサの他の構成例を示す図
【図１０】 実施の形態に係るストレス判別センサの他の構成例を示す図
【図１１】 実施の形態に係るストレス判別センサの他の構成例を示す図
【図１２】 実施の形態に係るストレス判別センサの他の構成例を示す図
【符号の説明】
１ 測定装置本体
６ スロット形成部
７ スロット
８ 測定用試薬
１３ ストレス判別センサ
１５ 光ヘッド
１７ 支持板
２０ 押え板
２４ 光ヘッド保持板
２６ ガイド板
２７ 突起
６１ ガイド
６４ 突出部
１０１ 半導体レーザ
１１０ 光検出器
２０１ レーザ駆動部
２０４ コントローラ
２０８ 比較演算部
２０９ 温度センサ
２１０ ＲＯＭ
２１１ メモリ
１１１ 光ヘッド
２１３ メモリカード[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reagent used for measuring amylase activity, and more particularly to a reagent for measuring amylase activity in the saliva of a subject, a method for measuring amylase activity using the reagent, and a measuring apparatus therefor. Furthermore, it is related with the method of measuring a test subject's stress from the measured salivary amylase activity value.
[0002]
[Prior art]
Amylase (enzyme number EC3.2.1.1) is secreted in the pancreas, salivary gland, etc., is mainly distributed in the salivary gland, pancreas, and is also known to exist in muscles, ovaries, fallopian tubes, etc. It is also known that amylase deviating from the tissue exists in blood and urine. In some diseases such as pancreas / salivary gland, renal / liver dysfunction, tumor, etc., it is known that amylase levels in serum, urine / pancreatic juice are high.
As a method for measuring these amylase activities, an enzyme method using a modified oligosaccharide substrate is known, and the measurement was performed from the change in absorbance using a spectrophotometer or an automatic analyzer.
[0003]
Recent studies have reported that salivary amylase activity correlates with subject stress (medical electronics and biotechnology 39 (3), p234-239 (2001), Masaki Yamaguchi et al.), Saliva A method for measuring the amylase activity value in a sample is desired.
However, the measurement using a conventional automatic analyzer has a problem that the measurement apparatus is expensive, various preparations are required for the measurement, and the measurement itself takes several tens of minutes.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a means for measuring amylase activity present in a biological sample such as saliva more simply and in a short time, and a reagent, a measuring method, a measuring device for that purpose, in addition to these It is intended to provide a method for measuring the stress of a subject using the.
[0005]
[Method and means for solving the problem]
In the enzyme method using a modified oligosaccharide substrate, the present inventors introduce means for supporting the oligosaccharide substrate on a support, cause the amylase reaction to be carried out on the support, and read the color by a color discrimination sensor. Thus, it was found that amylase activity can be easily measured in a short time of several tens of seconds, and the present invention has been achieved.
[0006]
That is, the present invention
“1. A method for measuring amylase activity, which comprises contacting a reagent for measuring amylase with collected saliva and measuring a released modifying substance,
The amylase measurement reagent comprises a reagent holding part, a modified oligosaccharide that is a substrate carried on the reagent holding part, and a competitive inhibitor,
The modified oligosaccharide is
An oligosaccharide selected from G2-7, wherein the reducing end is modified with a chromogen,
The chromogen is any one selected from 4-nitrophenol (PNP), 2-chloro-4-nitrophenol (CNP), and 2,4-dichlorophenol (Cl2P),
The competitive inhibitor is
Any one selected from maltotetraose and maltopentaose,
(1) The collected saliva is colored by bringing it into contact with the reagent holder,
(2) irradiating light directly from the light emitting means to the reagent holding unit;
(3) Measure reflected light from the reagent holder
A method for measuring amylase activity.
2. The amylase measurement reagent is:
Furthermore, it is provided with a tip part that impregnates saliva,
2. The method for measuring amylase activity according to item 1 above, wherein the tip portion impregnated with the collected saliva and the reagent holding portion are brought into contact with each other.
3. The reagent holding part is an elongated plate-shaped paper piece,
A fold is formed at the center of the elongated plate-shaped paper piece,
The reagent holding part is placed on one end side of the elongated plate-like paper piece,
The tip portion is formed on the other end side of the elongated sheet-like paper piece,
3. The method for measuring amylase activity according to
4). 4. The method for measuring amylase activity according to any one of items 1 to 3, wherein the reagent holding part is a water-insoluble organic or inorganic carrier.
5. 5. The method for measuring amylase activity according to any one of items 1 to 4, wherein the reagent holding part is a thin film.
6). 6. The method for measuring amylase activity according to 5 above, wherein the thin film has a thickness of 100 to 500 μm.
7). 7. The method for measuring amylase activity according to 5 or 6 above, wherein the thin film is white.
8). The amount of the modified oligosaccharide supported on the reagent holding part is a considerable amount obtained by impregnating the support in a solution containing 2 to 500 mmol / L of the modified oligosaccharide substrate for about 1 to 5 minutes. 8. The method for measuring amylase activity according to any one of 1 to 7 above.
9. The method for measuring amylase activity according to any one of 1 to 8 above, wherein the modified oligosaccharide is selected from the following:
2-Chloro-4-nitrophenol-4-O-β-D-galactopyranosyl maltoside (hereinafter GAL-G2-CNP), GAL-G4-CNP, GAL-G5-CNP, G5-CNP, G6- CNP, G7-CNP, G5-PNP, G7-PNP.
10. 9. The method for measuring amylase activity according to any one of 1 to 8 above, wherein the reagent holding part contains Gal-G2-CNP (however, α-glucosidase is not included).
11. 11. The measuring method according to any one of items 1 to 10, wherein the light emitting means is selected from a light emitting diode, a laser, a halogen lamp, and a tungsten lamp.
12 12. The measuring method according to any one of 1 to 11 above, wherein the angle at which the reflected light is measured is 0 to 45 degrees, the distance to the measurement target is 10 to 30 mm, and the spot diameter is 1 to 5 mm.
13. 13. A test method for a subject's stress level, comprising measuring amylase activity in human saliva by the measurement method according to any one of items 1 to 12 above. It consists of.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, amylase is typically α-amylase secreted mainly from human salivary gland or pancreatic gland. Amylase is a digestive enzyme having a molecular weight of 54,000-62,000 that hydrolyzes polysaccharides such as starch and amylose. It is known that the amylase activity value in saliva varies greatly depending on physical condition and varies greatly among individuals. The normal value is about tens of thousands of IU / L, but it is known that even a healthy person may exceed 100,000 IU / L depending on the physical condition and constitution.
[0008]
A modified oligosaccharide is used as a substrate for measuring amylase activity in the present invention. The term “modification” means that an identification labeling compound is bound to the terminal or reducing terminal of the oligosaccharide and can be released by amylase or a conjugate enzyme. The number of sugars of the modified oligosaccharide is G2 to G7, preferably G2 to G5. As the modifying compound, what is called a chromogen can generally be used, and suitable groups include 4-nitrophenol (PNP), 2-chloro-4-nitrophenol (CNP), 2,4-dichlorophenol ( Cl 2 P) is exemplified. Specific examples of the oligosaccharide modified with such a chromogen include 2-chloro-4-nitrophenol-4-O-β-D-galactopyranosyl maltoside (hereinafter referred to as GAL-G2-CNP), GAL-G4-CNP, GAL-G5-CNP, G5-CNP (2-chloro-4-nitrophenyl-maltopentaose), G7-CNP, G5-PNP (p-nitrophenyl-maltopentaose), G6- Examples thereof include CNP (2-chloro-p-nitrophenyl maltotetraose) and G7-PNP. Of these, GAL-G2-CNP, GAL-G4-CNP, and the like, in which the cleavage site during hydrolysis with amylase is limited to one site, are particularly preferable.
[0009]
The modified oligosaccharide is represented by the following general formula.
[Chemical 1]
R in the formula 1 , R 2 Each represents a hydrogen atom or a protecting group. Although the protective group is not particularly limited, for example, an unsubstituted or substituted lower alkyl group, lower alkoxyl group or phenyl group, azide group, halogen atom, N-monoalkylcarbamoyloxy group, alkyl or arylsulfonyloxy group Or an alkyloxy group, α-glucosyl group, α-maltosyl group, β-galactosyl group, R 1 , R 2 May be cross-linked with each other, and the cross-linking group may further have a substituent. R Three Is a signal generating group, for example, a group capable of optically detecting a signal (preferably a chromogenic aromatic group), and n is 0-5. -OR in the above formula Three Is β-bonded to the 1-position of the reducing terminal glucose, but may be α-bonded.
[0011]
The reagent for measuring amylase of the present invention is in a state where a substrate is supported on a support. The support on the support means a state in which a substrate and a competitive inhibitor are immobilized or trapped on a water-insoluble organic or inorganic carrier. The support is preferably a thin film having a thickness of 100 to 500 μm, preferably 150 to 400 μm. In general, the thin film is preferably one in which diffuse reflection of light is controlled, and the surface of the film is as uniform as possible because the color of the modifying substance that is liberated is measured by a color discrimination sensor. The thin film is preferably white. The material of the thin film is preferably exemplified by paper, nitrocellulose, nylon, porous glass and the like, but is not limited thereto, and can be widely used as long as it can efficiently support or hold the substrate defined in the present invention. It is.
[0012]
The amount of the modified oligosaccharide supported on the support is preferably adjusted to be constant. As a simple method, there is a method obtained by impregnating a support with a modified oligosaccharide substrate in a solution containing 2 to 500 mmol / L for about 1 to 5 minutes and drying it. Illustrated.
[0013]
In the measurement method of the present invention, the amylase activity is determined by quantitatively capturing the change in absorbance due to the color development of the sample support due to the liberation of chromogens such as CNP and PNP which are substrate modifiers. For example, CNP is measured at an absorbance of 405 nm. Normally, this chromogen can be released only by the action of a large excess of amylase, but if desired, the chromogen is released by amylase and α-glucosidase, β-glucosidase, etc. after hydrolysis of amylase. In some cases, a coupled enzyme method including a reaction to be performed is used. In this case, it is necessary to introduce means for adding an additional enzyme as a reagent. Furthermore, if desired, a known α-amylase activator may be used to promote the reaction.
[0014]
Although the reaction temperature in the measuring method of this invention is not specifically limited, Preferably it is about 25-40 degreeC. A reaction time of 1 to several tens of minutes is sufficient, but depends on the type of substrate and, if desired, the conjugated enzyme.
[0015]
A color discriminating sensor is preferably used for measuring changes due to color development. It is convenient to measure the color change due to the support by reflected light or transmitted light. The light emitting means as the light source is preferably selected from a light emitting diode, a laser, a halogen lamp, a tungsten lamp and the like, but is not limited thereto. In the case of measuring reflected light, the angle is 0 to 45 degrees, preferably 10 to 35 degrees, more preferably 15 to 30 degrees, and the distance to the measurement object is 10 to 30 mm, preferably 15 to 25 mm, more preferably 18 to 22 mm. A measuring device that satisfies the condition that the spot diameter is 1 to 5 mm, preferably 2 to 4 mm, more preferably 2.5 to 3.5 mm is suitably used. The concept of the device of the present invention and the reagent is shown in FIG.
[0016]
The amylase measurement method using the reagent of the present invention thus provided is suitable as a biological sample for a sample containing amylase at a high concentration. For example, saliva, blood, urine, etc. can be samples, but saliva is most preferred.
[0017]
The present invention that enables easy measurement of amylase activity in human saliva enables a simple and effective means for a test method for a subject's stress level. Specifically, the α-amylase activity in saliva collected when the subject is resting is measured, and the activity value is recorded and stored as a reference value. Thereafter, the α-amylase activity in any state of the subject is measured and compared with a reference value recorded and stored at rest. If the enzyme activity is larger than the reference value, it can be determined that it is subjected to unpleasant stress (distress), and if it is smaller, it can be determined that it is subjected to comfortable stress (eustress). Further, the greater the difference from the reference value, the greater the stress received, and the degree of stress applied to the body or spirit can be determined.
[0018]
Moreover, the change in stress over time can be captured by continuously measuring α-amylase activity. When unpleasant stress is applied, α-amylase activity in saliva increases. The magnitude of the stress can be determined based on the magnitude of the positive time gradient at this time. On the other hand, when comfortable stress is applied, the enzyme activity of α-amylase decreases, so that it appears as a negative time gradient, and the degree of the magnitude can be determined in the same manner.
[0019]
Furthermore, the α-amylase activity is measured over time, the change in enzyme activity due to any stress applied within the measurement time is captured, and the amount of time and change until it returns to the value before stress loading (reference value) The degree of the magnitude of stress can be determined.
[0020]
【Example】
The present invention will be described in detail below with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples. As far as the method for measuring amylase by an enzymatic method in which a modified oligosaccharide as a substrate is supported on a support, Included in the technical idea.
[0021]
[Example 1]
Preparation of reagent (1) (test paper)
A solution in which 14 mmol / L Gal-G2-CNP and 700 mmol / L KSCN were dissolved was impregnated with Advantec Filter Paper 514A (Toyo Roshi Kaisha) for 3 minutes and then dried. This test paper was cut into 7 mm × 7 mm.
[0022]
[Example 2]
A reagent (test paper) having a substrate and a competitive inhibitor supported on a support was prepared by the following preparation method.
After impregnating Advantec Filter Paper 514A (Toyo Roshi Kaisha) for 3 minutes in a solution of 70 mmol / L Gal-G2-CNP, 3.5 mol / L KSCN and 1 mol / L maltotetraose in a buffer Dried. This test paper was cut into 7 mm × 7 mm.
[0023]
[Example 3]
A reagent (test paper) having a substrate and a competitive inhibitor supported on a support was prepared by the following preparation method.
After impregnating Advantec Filter Paper 514A (Toyo Roshi Kaisha) for 3 minutes in a solution of 140 mmol / L Gal-G2-CNP, 7 mol / L KSCN and 0.5 mol / L maltopentaose in a buffer Dried. This test paper was cut into 7 mm × 7 mm.
[0024]
[Test Example 1]
The amylase activity was measured using the reagent of Example 1 by the following treatment.
1. The amylase activity values of 5 samples a to e obtained by collecting saliva samples from healthy subjects were measured with the reagent for measuring amylase Espa-Amylase Liquid II (Nipro Corporation). Espa amylase liquid II is a reagent for measuring amylase by an enzymatic method using Gal-G2-CNP, and can measure amylase up to 2000 IU / L. An automatic analyzer 7170 (Hitachi) was used for the measurement. Since sample e exceeded the measurement limit and could not be measured as it was, each sample was treated with 1% (W / V) BSA (meaning 1% (W / V) physiological saline solution of bovine serum albumin, and so on). A 10-fold diluted solution was measured instead. The measurement results are shown in Table 1.
[0025]
[Table 1]
2. The KEYENCE color discrimination sensor CZ-V1 was adjusted so that the reflected light angle was 22.5 °, the distance to the measurement target was 20 mm, and the spot diameter was 2 mm. C mode was used for the measurement. The apparatus diagram is shown in FIG.
[0027]
3. Using the reagent (1), the amylase activity value of the sample of 1. was measured. The apparatus adjusted in 2 was used for the measurement. A 3 μL sample was dropped into the reagent (1), and the difference between the measured values of the apparatus before and after 1 minute of the reaction was measured. The results are shown in Table 2.
[0028]
[Table 2]
FIG. 1 shows the correlation between the measurement results obtained with Espa amylase liquid II and the measurement results obtained with reagent (1). r = 0.98, indicating a high correlation. If the measured value of reagent (1) is multiplied by 44, the value is almost equal to that of the conventional method. That is, it was shown that the reagent of the present invention can directly measure the amylase activity value in the sample.
[0030]
[Test Example 2]
The amylase activity was measured using the reagent of Example 2 by the following treatment.
1. Saliva samples collected from healthy individuals were diluted 0.2, 0.4, 0.6, and 0.8 times with 1% (W / V) BSA.
2. The amylase activity value of the above sample and the negative control sample (saline) was measured with the reagent for measuring amylase Espa-Amylase Liquid II (Nipro Corporation). An automatic analyzer 7170 (Hitachi) was used for the measurement. Since it could not be measured because it exceeded the measurement limit as it was, each sample diluted 10 times with 1% (W / V) BSA was measured instead. The measurement results are shown in Table 3.
[0031]
[Table 3]
3. Using the reagent (1) used in Example 1, the amylase activity value of each sample was measured. The apparatus used in Example 1 was used for the measurement. A 3 μL sample was dropped into the reagent (1), and the difference between the measured values of the sensor before and after 1 minute of the reaction was measured. The results are shown in Table 4.
[0033]
[Table 4]
FIG. 2 shows the correlation between the measurement result of the 10-fold diluted sample by Espa amylase liquid II and the measurement result by the reagent (1). r = 0.99, indicating high linearity.
If the measured value of reagent (1) is multiplied by 43, the value is almost equal to that of the conventional method. That is, it was shown that the reagent of the present invention can directly measure the amylase activity value in the sample.
[0035]
[Example 4]
Next, a configuration example of a stress measuring device using the above measuring method will be described.
FIG. 4 shows the external configuration of the measuring apparatus. The measuring device main body 1 has an
Note that the measuring
When performing stress measurement, prior to the actual measurement operation, first, an initial operation for zero point adjustment is performed according to the following procedure. First, the power switch 3 is operated to turn on the power, and then the reference paper (white) is inserted into the slot 7. Thereafter, the zero point adjustment button of the operation button unit 5 is operated. Thus, the color of the reference paper is determined by the internal stress determination sensor, and the determination result is set in the internal memory as an initial value. When the setting of the initial value is completed, the
The stress measurement is performed as follows. First, the tip of the
Next, a specific configuration example of the measurement apparatus will be described with reference to FIGS.
First, FIG. 5 shows the internal structure of the measuring apparatus. 5A is a top view of the measurement apparatus shown in FIG. 4 with the top cover and the slot forming portion 6 removed, and FIG. 5B is a front view thereof.
In the figure, 11 is a battery for supplying power, 12 is a collar for holding the upper lid, 13 is a stress discrimination sensor, 14 is an optical coupling terminal of the stress discrimination sensor 13 and the optical head 15. An optical fiber 15 is an optical head that irradiates light (for example, a light emitting means is selected from a light emitting diode, a laser, a halogen lamp, and a tungsten lamp) to the reagent holding portion of the measuring
16 is a fan-shaped recess formed in the base of the measuring apparatus main body 1, 17 is a support plate that is rotatably arranged in the recess 16 with a screw 18 as a supporting shaft, 19 is a guide groove formed in the support plate 17, Reference numeral 20 denotes a presser plate that is fitted in the recess 16 so as to press the rotation end of the support plate 17 from above, 21 is a scale formed on the presser plate 20, 22 is a guide groove formed on the presser plate 20, 23 Is a screw for fixing the support plate 17 to a predetermined scale position.
24 is an optical head holding plate that slides along the
When the power switch 3 is turned on, the power of the battery 11 is supplied to the stress determination sensor 13 and light is emitted from the stress determination sensor 13. This light is supplied to the optical head 15 via the optical fiber 14 and is emitted from the tip of the optical head 15. Such light is applied to the reagent holding part of the measuring reagent inserted from the slot 6 as described above. Such light is absorbed, scattered, or reflected by the reagent holding unit, and a part of the reflected light is received by the optical head 15 by reversing the optical axis of the optical head 15. The light received in this way is transmitted to the stress determination sensor 13 through the optical fiber 14. The stress discrimination sensor 13 analyzes and calculates the intensity of the reflected light as described later, thereby calculating a stress value.
FIG. 6 shows the structure of the slot forming portion 6. A guide 61 is formed on the back side of the slot 7 formed in front of the slot forming portion 6. The guide 61 is formed so as to curve with a predetermined curvature from the middle, as shown in the top view of FIG. Therefore, when the measuring
As shown in the left side view of FIG. 6, a notch 62 is formed in the guide 61. The notch 62 is formed in the vicinity of the position where the reagent holding portion is positioned when the measuring
In addition, a pair of projecting portions 64 having a flange portion at the tip end portion are formed on the back surface of the slot forming portion 6. The protruding portion 64 functions as a guide and a stopper when the slot forming portion 6 is attached to the measuring apparatus main body 1. When the slot forming portion 6 is attached to the measuring apparatus main body 1, the guide plate 26 of FIG. 5 is inserted into the gap between the protruding portion and the outer wall shown in the top view of FIG. 6 is pushed forward from the front surface of the measuring apparatus main body 1. Then, the tip of the protrusion 64 comes into contact with the protrusion 27 of the guide plate 26, and the pair of protrusions 64 are bent and spread. When the slot forming portion 6 is pushed up to the mounting position, the pair of projecting portions 64 are elastically returned to their original positions, and the collar portion formed at the tip thereof is engaged with the protrusion 27 of the guide plate 26. As a result, the slot forming portion 6 is prevented from falling off, so that the slot forming portion 6 is attached to the measuring apparatus main body 1.
The recess 64 shown in the right side view and the rear view in FIG. 6 functions as a finger hook when the slot forming portion 6 is removed from the measuring apparatus main body 1. When removing the slot forming part 6 from the measuring apparatus main body 1, a finger is hooked on the recess 65 and the slot forming part 6 is pulled forward. Thereby, the engagement between the flange at the tip of the protrusion 64 and the protrusion 27 of the guide plate 26 is released, and the slot forming portion 6 can be removed from the measuring apparatus main body 1.
In the configuration shown in FIG. 5, the configuration of the recess 16 to the screw 25 is the adjustment of the tilt angle (light incident angle) of the optical axis of the optical head 15 with respect to the measuring
When the
In the stress measurement, it is preferable to appropriately adjust the tilt angle, the distance, and the spot diameter by the adjusting mechanism so that the measurement operation is optimized. Or when a preferable setting value differs for every measuring reagent, when changing a measuring reagent, it is necessary to perform the said adjustment suitably.
Next, a configuration example of the stress determination sensor 13 will be described with reference to FIG. In the figure, 101 to 110 are configuration examples of the optical system, and 201 to 211 are configuration examples of the circuit system.
In the figure, 101 is a semiconductor laser that emits red (R), green (G), and blue (B) light, 102 is a collimator lens that converts the emitted light into parallel light, and 103 is the above three lights (R). , G, B), a mirror element for matching the optical axes, 104 is a focusing lens for converging the light to the entrance of the optical coupling element 105, and 105 is connected to one end of the optical fiber 14 to transmit the light to the optical fiber 14. Is an optical coupling element that is incident on the light source.
106 is a light coupling element connected to the end of an optical fiber that guides the reflected light from the measuring
Reference numeral 201 denotes a laser driving circuit for driving the semiconductor laser 101, 202 denotes a display unit that includes the
A controller 204 controls each unit and calculates a stress value (a degree of stress) based on a comparison calculation result from the comparison calculation unit 208, temperature information from the temperature sensor 209, and statistical information from the ROM 210. The controller 204 has a clock circuit inside, and measures the elapsed time after the
Reference numeral 205 denotes an A / D converter that amplifies and shapes the analog electric signal from the photodetector 110 and converts the analog electric signal into a digital signal at a predetermined sampling period. 206 denotes an A / D conversion for a predetermined period. An averaging unit that averages the sampling values supplied from the circuit 205 to calculate an average value for the period, and 207 is an average calculated by the averaging unit 206 when the reference paper (white) is inserted into the slot 6. A reference value memory 208 that stores a value as a reference value is a comparison 208 that compares the average value calculated by the averaging unit 206 during stress measurement with the reference value stored in the reference value memory 207 and calculates the difference between the two. It is a calculation part.
Reference numeral 209 denotes a temperature sensor that is arranged near the insertion portion of the measurement reagent 8 (not shown in FIGS. 5 and 6), detects a temperature near the insertion portion, and supplies the detection result to the controller 204. Holds statistical data such as a conversion table between the comparison calculation result from 208 and the stress value, a correction table for correcting the stress value of the conversion table based on temperature information, or information on the transition of the comparison calculation result with respect to the reaction time ROM (Read-Only-Memory) 211 is a memory for storing a stress value measurement history.
Next, the operation of the stress determination sensor 13 will be described.
First, the operation during the initial operation (zero point adjustment) will be described. In the initial operation, after the reference paper (white) is inserted from the slot 6 and the initial setting button is operated, the semiconductor laser (R) of the semiconductor laser 101 is driven for a predetermined time T, and the red color is displayed. Light (R) is emitted. Such light (R) is applied to the reference paper through the optical system from the collimator lens 102 to the optical coupling element 105, the optical fiber 14 and the optical head 15 in FIG. Thus, when the reference paper is irradiated with light (R), the light (R) is scattered and reflected by the reference paper, and part of the light travels back through the optical path of the optical head 15 and the optical fiber 14, and the light. The light is emitted from the coupling element 16. Then, the light is converged on the photodetector 110 from the converging lens 107 via the optical system of the converging lens 109.
The photodetector 110 that has received the reflected light sends an electrical signal corresponding to the intensity to the A / D converter 205. The A / D conversion unit 205 repeats the sampling of the electric signal during the period T and sends it to the averaging unit 206. The averaging unit 206 averages the sampling value in the period T and sends the calculation result to the reference value memory 207. The reference value memory 207 holds the average value as a reference value for light (R). Thereby, the setting of the initial value for the light (R) is completed.
When the reference value for the light (R) is maintained in this way, the semiconductor laser (G) is then driven for a certain period T, and green light (G) is emitted. In the same manner as described above, the reflected light of the light (G) is received by the photodetector 110, and an electric signal corresponding to the intensity is output. Such an electrical signal is processed in the same manner as described above, whereby the reference value memory 207 holds the reference value for the light (G). Thereby, the setting of the initial value for the light (G) is completed. Thereafter, the semiconductor laser (B) is driven for a certain period T, and the reference value for the light (G) is held in the reference value memory 207 in the same manner as described above. Thereby, the initial setting for all the lights is completed.
Next, the operation at the time of stress measurement will be described.
When the initial setting operation is completed, the laser driving unit 201 drives the semiconductor laser 101 so as to repeatedly drive the semiconductor lasers (R), (G), and (B) in order for each period T. That is, light of each color is emitted from the semiconductor laser 101 at a repetition period of 3T. In this state (measurement standby state), the light of each color is applied to the guide 61 of the slot forming unit 6 shown in FIG. However, since the back plate 63 is not disposed at the bottom of the guide 61 (the vicinity of the notch 62 in FIG. 6) where the light is irradiated, the light is not reflected by the guide 61, and therefore the reflection thereof. The light is not focused on the photodetector 110 of FIG. Therefore, the sampling value supplied from the A / D conversion unit 205 to the controller 204 has a value near zero.
Thereafter, when the
Similarly to the above, the laser drive circuit 201 repeatedly emits light of each color for each period T. The light of each color is absorbed, scattered, and reflected by the reagent holding unit of the
For example, the period T that arrives after the insertion of the
The controller 204 sends a series of comparison calculation results D1, D2, D3, D4,..., Temperature information from the temperature sensor 209, a stress conversion table and a correction table in the ROM 210 (temperature, elapsed time). ) To calculate the stress value. Specifically, referring to the correction table and statistical data stored in the ROM 210, the stress correction value to be referred to is determined based on the temperature and reaction elapsed time at each timing of T1, T2, T3, T4,. decide. Then, the stress value corresponding to the comparison calculation result (D1, D2, D3, D4,...) Is read from the conversion table, and the correction value is added to or subtracted from this to calculate the stress value at each timing. Then, the calculated stress value is averaged over a certain period (for example, T1 to T99), and the averaged stress value is determined as the final stress value in the measurement.
For example, when the relationship between the comparison calculation result for one set of R, G, and B light and the stress value is stored in the ROM 210 as a conversion table, the stress value for the combination of the comparison calculation results D1, D2, and D3 is converted. Read from the table. The stress correction value is added to or subtracted from the stress value to calculate the stress value S1 for the periods T1 to T3. Here, the timing for determining the stress correction value is, for example, an intermediate timing T2. Similarly, stress values S2, S3,..., S33 of periods T4 to T6, T7 to T9,. And the stress value of S1-S33 is averaged, and this is made into the final stress value in the said measurement.
Alternatively, when the comparison calculation result is directly adopted as the stress value, the stress value is calculated by adding D1 to D3, and the stress correction value is added to or subtracted from this to calculate the stress value S1 for the periods T1 to T3. To do. Similarly, the stress values S2, S3,..., S33 of the periods T4 to T6, T7 to T9,..., T97 to T99 are calculated, the stress values of these S1 to S33 are averaged, and the stress values in the measurement are calculated. Value. In such a case, the conversion table is not necessary. However, the ROM 210 needs to store a processing process for performing the above calculation. In addition to the addition of D1 to D3, various arithmetic processes for determining the degree of color development of the measurement reagent can be employed as the arithmetic process.
The stress value determined in this way is displayed on the display unit 202. At the same time, it is recorded in the memory 211 as a personal measurement history. The measurement history stored in the memory 211 can be appropriately read out by operating the operation input unit 203 and displayed on the display 202.
The stress value displayed on the display unit 202 may be displayed as a specific numerical value, or the stress value may be divided into certain numerical ranges, and comics (still images or moving images) or characters may be classified for each corresponding category. May be displayed.
Next, various modifications of the stress measuring device will be described with reference to the drawings.
[0036]
[Example 5]
FIG. 8 shows a modification of the optical head 15. In this embodiment, instead of the optical head 15, a counter-type optical head 111 is provided. In other words, the optical axis of the outgoing light and the optical axis of the reflected light are aligned, and the outgoing end and the incoming end of the optical head 111 are arranged so that the inclination angles of the optical axes with respect to the measuring
[0037]
[Example 6]
FIG. 9 shows a modification of the memory 211. In this embodiment, a memory card interface 212 and a memory card 213 are provided in place of the memory 211. The stress measurement history is stored in the memory card 213 via the memory card interface 212. Such a memory card 213 is detachable. Therefore, by holding the memory card 213 for each measurer, the measurement history can be managed only by each person. In addition, a single stress measuring device can be used by a plurality of people.
[0038]
[Example 7]
FIG. 10 shows an embodiment in which an interface 214 for transferring a personal computer (personal computer) is further provided. This figure shows an example in which the memory card 213 is used as a measurement history storage medium, but the present invention can also be applied to the case where the measurement history is stored in the memory in the apparatus as shown in FIG. The measurement history stored in the memory card 213 or the memory 211 can be transferred to a personal computer via the interface 214. As a result, the transfer history can be processed on the personal computer, or the measurement history can be attached to an email and transmitted to a medical institution or the like. Instead of providing an interface to the personal computer, communication means such as telephone communication may be provided.
[0039]
[Example 8]
FIG. 11 and FIG. 12 are modifications of the semiconductor laser 101. In the embodiment of FIG. 11, only red and blue light is emitted from the semiconductor laser 101. In the embodiment of FIG. 12, only blue light is emitted from the semiconductor laser 101. These are suitable for use when the measuring reagent is colored yellow by reaction with saliva. When the color is yellow, the blue light is easily absorbed by the measuring reagent, and thus a large change appears in the comparison calculation result for the blue light. Therefore, the degree of stress can be calculated with relatively high accuracy by using only blue light, a combination of blue light and red light, or a combination of blue light and green light. However, when only the red light and the green light are used when the color of the measurement reagent is yellow, the accuracy of determining the degree of stress is lowered. This is because these light absorption by the measurement reagent is small, and the comparison calculation result does not change dynamically. Therefore, when using light of one or two colors among the three colors, it is preferable to set a combination or the like to include light that is a complementary color of the color of the measuring reagent.
Although various embodiments according to the present invention have been described above, the present invention is not limited to such embodiments. For example, in the above embodiment, the stress level is visually output on the display panel of the display unit 202. However, instead of or in addition to this, the display of the stress level by voice and the display by printout are also employed. it can.
In addition, the embodiment of the present invention can be variously modified as appropriate within the scope of the technical idea of the present invention.
[0040]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a reagent for amylase measurement by an enzyme method in which a modified oligosaccharide as a substrate is supported on a support is provided, and if amylase activity is measured using this reagent, it can be performed very simply and rapidly. The amylase activity can be measured effectively, and as a result, a technique for determining the stress of the subject in a short time on the spot could be established.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the correlation between the measurement results obtained with Espa amylase liquid II and the measurement results obtained with reagent (1).
FIG. 2 shows a correlation between a measurement result of a 10-fold diluted sample by Espa amylase liquid II and a measurement result by reagent (1).
FIG. 3 shows a conceptual diagram of the measuring apparatus and reagent of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing an overview of a stress measuring apparatus according to an embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing an internal structure of the stress measurement device according to the embodiment.
FIG. 6 is a diagram showing a configuration of a slot holding unit according to the embodiment.
FIG. 7 is a diagram showing a configuration example of a stress determination sensor according to an embodiment.
FIG. 8 is a diagram showing another configuration example of the stress determination sensor according to the embodiment.
FIG. 9 is a diagram illustrating another configuration example of the stress determination sensor according to the embodiment.
FIG. 10 is a diagram showing another configuration example of the stress determination sensor according to the embodiment.
FIG. 11 is a diagram illustrating another configuration example of the stress determination sensor according to the embodiment.
FIG. 12 is a diagram showing another configuration example of the stress determination sensor according to the embodiment.
[Explanation of symbols]
1 Measuring device body
6 Slot forming part
7 slots
8 Reagent for measurement
13 Stress discrimination sensor
15 Optical head
17 Support plate
20 Presser plate
24 Optical head holding plate
26 Guide plate
27 Protrusions
61 Guide
64 Projection
101 Semiconductor laser
110 Photodetector
201 Laser drive unit
204 controller
208 Comparison calculator
209 Temperature sensor
210 ROM
211 memory
111 optical head
213 Memory card
Claims (13)
前記アミラーゼ測定用試薬は、試薬保持部と、前記試薬保持部に担持された基質である修飾オリゴ糖と競合阻害剤を備え、
前記修飾オリゴ糖は、
Ｇ２〜７から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されており、
色原体が、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）から選ばれるいずれか１であり、
前記競合阻害剤は、
マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれるいずれか１であり、
（１）前記採取された唾液を、前記試薬保持部に接触させることにより発色させ、
（２）発光手段から前記試薬保持部に直接光を照射し、
（３）前記試薬保持部からの反射光を測定する
ことを特徴とするアミラーゼ活性測定方法。A method for measuring amylase activity, which comprises contacting a reagent for amylase measurement with collected saliva and measuring a liberated modifying substance,
The amylase measurement reagent comprises a reagent holding part, a modified oligosaccharide that is a substrate carried on the reagent holding part, and a competitive inhibitor,
The modified oligosaccharide is
An oligosaccharide selected from G2-7, wherein the reducing end is modified with a chromogen,
The chromogen is any one selected from 4-nitrophenol (PNP), 2-chloro-4-nitrophenol (CNP), and 2,4-dichlorophenol (Cl2P),
The competitive inhibitor is
Any one selected from maltotetraose and maltopentaose,
(1) The collected saliva is colored by bringing it into contact with the reagent holder,
(2) irradiating light directly from the light emitting means to the reagent holding unit;
(3) A method for measuring amylase activity, wherein reflected light from the reagent holding part is measured.
さらに、唾液を含浸する先端部を備えたものであって、
採取された唾液を含浸した前記先端部と、前記試薬保持部とを接触させることを特徴とする請求項１に記載のアミラーゼ活性測定方法。The amylase measurement reagent is:
Furthermore, it is provided with a tip part that impregnates saliva,
The method for measuring amylase activity according to claim 1, wherein the tip portion impregnated with the collected saliva is brought into contact with the reagent holding portion.
前記細長い板状紙片の中央部に折り目が形成されており、
前記試薬保持部が前記細長い板状紙片の一端側に載置され、
前記先端部は前記細長い板状紙片の他端側に形成したものであり、
前記細長い板状紙片を折り目にて折りたたむことにより、前記先端部と前記試薬保持部が接触することを特徴とする請求項２に記載のアミラーゼ活性測定方法。The reagent holding part is an elongated plate-shaped paper piece,
A fold is formed at the center of the elongated plate-shaped paper piece,
The reagent holding part is placed on one end side of the elongated plate-like paper piece,
The tip portion is formed on the other end side of the elongated sheet-like paper piece,
3. The method for measuring amylase activity according to claim 2, wherein the tip portion and the reagent holding portion come into contact with each other by folding the elongated plate-like paper piece at a crease.
２−クロロ−４−ニトロフェノール−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトサイド（以下 ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ６−ＣＮＰ、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ、Ｇ７−ＰＮＰ。The method for measuring amylase activity according to any one of claims 1 to 8, wherein the modified oligosaccharide is selected from the following:
2-Chloro-4-nitrophenol-4-O-β-D-galactopyranosyl maltoside (hereinafter GAL-G2-CNP), GAL-G4-CNP, GAL-G5-CNP, G5-CNP, G6- CNP, G7-CNP, G5-PNP, G7-PNP.
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