JP4162187B2

JP4162187B2 - Method and apparatus for quantifying pyrophosphate and nucleic acid

Info

Publication number: JP4162187B2
Application number: JP2001377229A
Authority: JP
Inventors: 美砂子遠藤; 昇丸山
Original assignee: Miyagi Prefectural Government.
Current assignee: Miyagi Prefectural Government.
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2008-10-08
Anticipated expiration: 2021-12-11
Also published as: JP2003174900A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はピロリン酸の検知・定量方法に関するものである。本発明はまた、該ピロリン酸の検知・定量方法を利用した核酸の検知・定量方法であって、詳しくはポリメラーゼ連鎖反応を含む種々の増幅方法を用いて特定核酸領域を増幅したときに生成するピロリン酸を検知・定量することにより核酸を検知・定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査または食中毒検査等の分野においては、組織、体液、便等の微量の微生物核酸を検出・定量する必要がある。また、各種研究分野では、各種疾病、医薬品等の作用で発現する特定のメッセンジャーRNA発現量を定量することが求められている。
【０００３】
迅速に病原体等の同定を行う方法としては、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法又はDNAプローブによる核酸の検出方法も行われている。
【０００４】
しかしながら、抗原抗体反応を利用した抗原検出においては、病原体の抗原部分が隠蔽されているような場合には、病原体を検出できないおそれがある。また、細菌等においては非常に多くの抗原部分を有する場合があり、特定の細菌種に固有な特定共通抗原部分を見い出すことは必ずしも容易ではない。また、検出にはある程度の数又は濃度の細菌または細胞が必要であり、細胞数等が不足することにより、病原体を検出できない場合があり、感度的にも問題がある。
【０００５】
これに対し、DNAプローブによる核酸検出方法においては、生物種固有の核酸領域を見出すことは比較的容易で、この核酸領域をクローニングし又は合成することにより、核酸プローブとして用いることができるといった利点がある。しかし、DNAプローブ法についても、鋳型となる核酸量が少ない場合は、十分な検出感度は得られない。
【０００６】
また、特定塩基配列をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法を利用した核酸の検出法（ポリメラーゼチェーンリアクション法、ＰＣＲ法）が有効な手段として汎用されている。このＰＣＲ法は、核酸分子中の特定核酸領域を試験管内で100万倍にも増幅するものである。このＰＣＲを利用することにより標的核酸の特定核酸領域を増幅された状態で検出することが可能となり、感度的には１分子の核酸から病原体を検出することも可能となっている。ＰＣＲについての詳細な説明は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号明細書に記載されている。
【０００７】
そして、この増幅された特定核酸領域の一般的な検出方法として、ＰＣＲ終了後の反応溶液をアガロース電気泳動により、分離した後染色し、バンドの大きさ（分子量）で判別する方法や、前記反応溶液をドットハイブリダイゼーション法により検出する方法が行われている。この検出方法は、細菌中のＤＮＡを直接増幅して検出できるため、検査時間が短くかつ細菌の同定が容易であるという特徴を有する。しかし複雑でかつ時間のかかる電気泳動工程は、現場での利用については不便な点が多い。
【０００８】
電気泳動を行うことなく、ＰＣＲ生成物を検出および定量する方法として、ＰＣＲ開始前の反応液に予め、ＤＮＡとインターカレートしたときのみ蛍光を発する試薬を添加し、蛍光分光光度計を使用して蛍光強度を測定することにより、増幅ＤＮＡ量を測定する方法（特開平５−２３７０００号公報）を挙げることができる。標的核酸の初期鋳型量は、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサイクル毎に測定してその変化から求めることができる。しかしこのような目的のために設計された蛍光強度を各サイクル毎に測定するための装置は高価であるという欠点を有する。またＤＮＡとインターカレートする試薬は生体にとって有害である。
【０００９】
ＤＮＡとのインターカレート試薬を用いない方法としては、（１）WO ９２／１６６５４もしくはJ. Immunol. Methods 156, 55 (1992)には、PCRによる核酸増幅過程で生成する副生成物のピロリン酸を、アデノシン三リン酸スルフリラーゼの作用でアデノシン三リン酸に導き、アデノシン三リン酸をさらにルシフェリン−ルシフェラーゼ法で発光させ、検出することによりピロリン酸を検出する方法が用いられている。
【００１０】
また、（２）特開平７−５９６００７号公報には、ピロリン酸を無機ピロフォスファターゼなどを用いて分解した生成物であるリン酸を検出することにより、標的とする遺伝子核酸を検出する方法が記載されている。
【００１１】
現状のPCR反応装置（PCR反応と同時に蛍光強度の測定を行う手段を備えた装置を含む）は、熱安定性酵素およびプライマー、その他PCR反応に必要な全ての試薬を予め密閉容器に分注し、核酸２本鎖の解離、１本鎖核酸とプライマーのアニーリング及び核酸ポリメラーゼによる相補鎖合成の３反応の繰返しを行うための、温度−循環装置である。この装置を用いることにより、他の検体の核酸に汚染されることなく、試料の標的鋳型DNAは短時間で増幅される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従来のピロリン酸の測定方法（１）は、高価な化学発光検出器を必要とし、かつ生成した発光は不安定で、瞬時に発光を失うという欠点を有する。そのため、各種核酸増幅法により生成するピロリン酸増幅量をリアルタイムに測定するには不便である。さらにピロリン酸をアデノシン三リン酸に誘導して検出するため、生体内に存在するアデノシン三リン酸がバックグラウンドとして検出される可能性が高い。またピロリン酸の測定方法（２）では、ピロリン酸の分解生成物であるリン酸の定量は公知の方法では検出感度が低く、モリブテン酸塩などの重金属イオン廃液の処理を伴うなどの欠点を有する。さらに生体、食品、培地などに多く利用させるリン酸塩がバックグラウンドとして検出されるため、実用には適さない。
【００１３】
また、従来の温度−循環装置によるPCR反応では、RNAや１本鎖DNAを鋳型として用いた場合には、非特異的増幅反応を起こしやすく、かつ耐熱性酵素といえども熱による失活を回避することは出来ない。また増幅の結果生成するピロリン酸が、増幅反応を阻害することが知られている。
【００１４】
本発明は以上のような問題点に鑑み創案されたものであり、高精度なピロリン酸の検知・定量方法を提供すること、また、該ピロリン酸の検知・定量方法を利用した各種核酸増幅法による核酸の検知・定量方法及び該方法に有用な装置を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の酵素を用いてピロリン酸を公知の方法で高感度に検出可能な物質に変換し、これを検知・定量することにより、安定且つ高精度にピロリン酸を検知・定量し得、更に該ピロリン酸の検知・定量方法が各種核酸増幅法による核酸の検知・定量に極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。更に本発明者等は、特定酵素を用いて試料−環流方式を用いた装置を使用することにより、温度−循環装置を用いてＰＣＲ反応を行った場合の上記欠点が解決されることをも見出し本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は下記構成を有する。
（１）ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸およびテトラゾリウム塩を添加する工程と、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させピロリン酸とイノシン酸をホルマザンと尿素に変換する工程と、生成するホルマザンを検知または定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知または定量方法。
【００１７】
（２）ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸を添加する工程と、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させピロリン酸とイノシン酸を過酸化水素と尿素またはスーパーオキシドと尿素に変換する工程と、生成する過酸化水素またはスーパーオキシドを検知または定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知または定量方法。
【００２１】
（３）核酸の検知または定量方法であって、試料溶液中の核酸を増幅する工程と、前記増幅後の試料溶液に含有されるピロリン酸を（１）又は（２）に記載の方法を用いて検知または定量する工程と、を含むことを特徴とする、核酸の検知または定量方法。
【００２９】
（４）（１）に記載のピロリン酸の検出または定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸とテトラゾリウム塩とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として含む試薬キット。
【００３０】
（５）（２）に記載のピロリン酸の検出または定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼと生成する過酸化水素またはスーパーオキシドを検知する試薬とを、各々単独で含有する試薬として含む試薬キット。
【００３４】
（６）標的とする核酸の検知または定量に有用な試薬キットであって、（４）又は（５）に記載の試薬キットに加え、更に核酸を増幅するために必要な試薬を含む試薬キット。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３６】
本発明により提供されるピロリン酸の検知・定量方法は、本発明者らが、各種核酸増幅手法で生成するピロリン酸の測定方法を開発する一環として開発されたものである。従って、PCR法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids法（ICAN法）、loop-mediated isothermal amplification法（LAMP法）などの各種手法を用いて増幅される核酸量の変化を、ピロリン酸量から推定しようする場合のピロリン酸の測定方法として好適である。但し、本発明のピロリン酸測定方法は、核酸増幅法により生成するピロリン酸の検知・定量方法としてのみならず、食品添加物として食品に添加される各種ピロリン酸塩の測定方法としても有効である。
【００３７】
その他に本発明の方法を利用して測定できる物質として、イノシン酸、アデノシン二リン酸、オキサロ酢酸、D-フェニルアラニン、アデニリル硫酸などを挙げることができる。
【００３８】
上述したように、ピロリン酸測定方法としては従来、ピロリン酸にアデノシン三リン酸スルフリラーゼを作用させた後、ルシフェリン−ルシフェラーゼ法を利用して、生成する発光を検出する方法や、ピロリン酸を無機ピロフォスファターゼなどを用いて分解した生成物であるリン酸を検出する方法が用いられている。本発明では、以下に詳述するように特定の酵素と試薬を組み合わせることで、ピロリン酸を安定且つ高精度に検知および定量できることを新たに見出したものである。
【００３９】
本発明により新規に提供されるピロリン酸を測定するための第１の方法は、ピロリン酸を含む測定試料に必要量のイノシン酸またはキサンチル酸と、テトラゾリウム塩とを添加し、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.2.8）およびキサンチンデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.204）／オキシダーゼ（EC 1.1.3.22）を作用させ、生成するホルマザンを測定するものである。本測定方法は、過剰のイノシン酸またはキサンチル酸と過剰のテトラゾリウム塩の存在下で酵素反応を行うとほぼ定量的に、イノシン酸を用いた場合はピロリン酸１モルから２モルのホルマザンが生成し、キサンチル酸を用いた場合はピロリン酸１モルから１モルのホルマザンが生成することを利用し開発されたものであり、定量が容易なホルマザンを公知の方法で定量することにより、ピロリン酸を高精度に定量することが可能となる。ホルマザンの測定方法の具体例としては、ホルマザンは呈色することから、分光光度計で吸光度を測定することにより定量することができる。本測定方法では、イノシン酸とキサンチル酸双方を同時に用いることもできる。イノシン酸を用いた場合の上記反応は以下のような反応式で示される。
【００４０】
【化１】

【００４１】
各試薬および酵素の添加順序は問うところではなく、いずれを先に加えてもよいし、これらを混合物として添加してもよい。
【００４２】
本方法に用いるテトラゾリウム塩は特に制限されるものではなく、例えばパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、チアゾイルブルー、ネオテトラゾリウムクロライド、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルー、テトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、チオカルバモイルニトロブルーテトラゾリウム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド等を挙げることができる。
【００４３】
例えば、パラヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを用いて、ピロリン酸を測定する場合には、通常は0.1〜100ｍＭ程度のイノシン酸、0.1〜100mM程度のパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、1〜1000mM程度の塩化カリウム、1〜1000mM程度の塩化マグネシウム、50〜5000 unit/L程度のヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、5〜500 unit/L程度のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む5〜500mM程度のトリス塩酸緩衝液（好ましくはpH 6.5〜8.0程度）を用いて、25〜37℃で10〜120分反応させた後、生成するホルマザンを547nm程度の波長で比色定量すればよい。
【００４４】
第２の方法は、ピロリン酸を含む測定試料に必要量のイノシン酸またはキサンチル酸を添加し、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.2.8）およびキサンチンデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.204）／オキシダーゼ（EC 1.1.3.22）を作用させ、生成する過酸化水素またはスーパーオキシドを測定するものである。
【００４５】
本測定方法では、イノシン酸とキサンチル酸双方を同時に用いることもできる。イノシン酸およびキサンチル酸のいずれを基質として用いた場合においても、スーパーオキシド（Ｏ_２）が一旦生成するが、適当な化学発光物質（例えばルミノールなど）と共存させることにより、生成したスーパーオキシドを過酸化水素ではなく、直接発光種に導くことができるため、化学発光強度を測定することにより、ピロリン酸量を測定することができる。一方、化学発光試薬を用いない場合にはスーパーオキシドはすみやかに過酸化水素に変換する。その場合の反応は以下の反応式で表すことができ、測定される過酸化水素量とピロリン酸量は下記反応式で示されるように、相関性があり、ピロリン酸量が測定できる。
【００４６】
【化２】

【００４７】
各試薬および酵素の添加順序は問うところではなく、いずれを先に加えてもよいし、これらを混合物として添加してもよい。
【００４８】
第２の方法を用いてピロリン酸を測定する場合には、通常は0.1〜100mＭ程度のイノシン酸、0.1〜100mM程度の酸素、1〜1000mM程度の塩化カリウム、1〜1000mM程度の塩化マグネシウム、50〜5000 unit/L程度のヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、5〜500 unit/L程度のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む5〜500mM程度のトリス塩酸緩衝液（好ましくはpH 6.5〜8.0程度）を用いて、25〜37℃で10〜120分反応させ、生成する過酸化水素を公知の方法で測定することにより、相関的にピロリン酸を定量することができる。
【００４９】
この方法は、従来のピロリン酸測定方法では満足のいく検出感度が得られなかったことから、従来法で検出感度の高い過酸化水素に誘導して検出することによりピロリン酸の検出感度を上昇させることを目的として開発されたものである。過酸化水素に誘導することの利点は検出感度が高く、かつ測定が紫外可視分光光度計などの安価で汎用性の高い装置もしくは、化学発光検出器や蛍光検出器などの高感度装置のいずれでも測定できること、過酸化水素が溶液中で安定なことが挙げられる。
【００５０】
過酸化水素の検出に関しては、試薬を用いての検出方法など数多くの従来法を用いて検出できる。その最も簡単な態様として、本測定方法では過酸化水素との１回以上の反応に応じて色シグナルを提供する試薬を用いて過酸化水素を検出する方法を用いることができる。このような方法のうちの一つは、還元型パテントブルーおよびペルオキシダーゼの存在下で、生成する青色の呈色を640nmの波長で評価するものである。
【００５１】
第３の方法は、ピロリン酸を含む測定試料に、必要量のオキサロ酢酸を添加し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ピロリン酸）（EC 4.1.1.38）を作用させ、生成する二酸化炭素を測定する方法である。該反応は以下の反応式で示される。
【００５２】
【化３】

【００５３】
上記試薬および酵素の添加順序は問うところではなく、いずれを先に加えてもよいし、これらを混合物として添加してもよい。
【００５４】
ピロリン酸を測定しようとする場合には、例えば0.1〜1000mM程度のオキサロ酢酸、1〜1000mM程度の塩化マグネシウム、0.01〜5 unit/ml程度のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ピロリン酸）を含む5〜500mM程度のトリス塩酸緩衝液（好ましくはpH 6.5〜9.0程度）を用いて、25〜37℃で10〜120分反応させればよい。生成する二酸化炭素の生成量を測定することにより、ピロリン酸を測定することができる。二酸化炭素の測定方法としては、公知の方法を用いることができる。
【００５５】
第４の方法は、ピロリン酸を含む測定試料にフェニルアラニンラセマーゼ（EC 5.1.1.11）を作用させる方法である。ピロリン酸を含む測定試料に、D-フェニルアラニン、アデノシン二リン酸を添加し、フェニルアラニンラセマーゼ（EC 5.1.1.11）を作用させ、生成するL-フェニルアラニンを測定する。該反応は以下の反応式で示される。
【００５６】
【化４】

【００５７】
各試薬および酵素の添加順序は問うところではなく、いずれを先に加えてもよいし、これらを混合物として添加してもよい。
【００５８】
基質としてD-フェニルアラニン、アデノシン二リン酸、酵素としてフェニルアラニンラセマーゼが必要であり、通常は0.1〜1000mM程度のD-フェニルアラニン、0.1〜1000mM程度のアデノシン二リン酸、0.01〜5 unit/ml程度のフェニルアラニンラセマーゼを含む5〜500mM程度のトリス塩酸緩衝液（pH 6.5〜8.0程度）を用いて、25〜37℃で10〜120分反応させればよい。生成するL-フェニルアラニンの生成量は旋光検出器を用いて測定することにより、ピロリン酸を測定することができる。
【００５９】
第５の方法は、ピロリン酸を含む測定試料にアデノシン三リン酸スルフリラーゼ（EC 2.7.7.4）を作用させる方法である。ピロリン酸を含む測定試料に基質としてアデニリル硫酸を添加し、アデノシン三リン酸スルフリラーゼ（EC 2.7.7.4）を作用させ、生成する硫酸イオンを測定する。
【００６０】
【化５】

【００６１】
各試薬および酵素の添加順序は問うところではなく、いずれを先に加えてもよいし、これらを混合物として添加してもよい。
【００６２】
ピロリン酸を測定しようとする場合には、通常は0.1〜1000mM程度のアデニリル硫酸、0.1〜100mM程度のエチレンジアミンテトラ酢酸、0.01〜1％程度の牛血清アルブミン、1〜100mM程度の酢酸マグネシウム、0.001〜1mM程度のジチオトレイトール、0.01〜5 unit/ml程度のアデノシン三リン酸スルフリラーゼを含む5〜500mM程度のトリス酢酸緩衝液（pH 6.5〜8.0程度）を用いて、25〜37℃で1〜50分反応させ、生成する硫酸イオンを公知の方法を用いて測定することにより、ピロリン酸を定量することができる。例えば、生成する硫酸イオンを塩酸酸性下で塩酸バリウムを加えて反応させ、生成した硫酸バリウムの濁りを比濁計を用いて測定することにより、ピロリン酸を測定することができる。
【００６３】
本発明のピロリン酸測定方法において用いられる試薬及び酵素は、試薬キットの構成品として供給されることが有利である。このような試薬キットの構成品は、所定の方法等に応じて適切な濃度で提供され、予め蓋付き容器に分注されていることが望ましい。本発明により提供される試薬キットに含まれる構成品は、測定試料及び測定方法等に応じて必要とされる試薬及び酵素各々を単独で含有するもの、あるいは２種以上の試薬又は酵素の混合物である。これら構成品たる試薬及び酵素は、必要な安全性及び取り扱いの簡便さの観点から適宜包装（乾式又は湿式）され得る。本試薬キットを用いて、ピロリン酸を検知する手段としては、紫外可視分光光度計、蛍光分光光度計、化学発光検出器などの高度な光学機器を用いた精密定量の他に、ピロリン酸の有無を確認するための簡易判定として、肉眼による色見本との濃淡比較もしくは写真やCCDカメラ等による呈色または蛍光、発光の濃淡によっておおよその濃度を知ることも可能である。パソコンによる色データの時間変化などにより、おおよその濃度とその時間変化から、菌の定量にも利用できる。
【００６４】
本発明のピロリン酸の検知・定量方法は各種核酸増幅法による核酸の検知・定量に極めて有用である。すなわち、ＰＣＲは勿論、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法など核酸増幅に伴いピロリン酸が同時に生成される場合に、本発明のピロリン酸の検知・定量方法を利用することにより、有害な試薬を用いることなく、高感度且つ簡便に核酸を検知・定量することが実用的なものとなった。
【００６５】
以下、核酸増幅法としてＰＣＲ法を用いた場合に本発明のピロリン酸の検知・定量方法を利用した核酸の検知・定量方法について詳しく説明する。
【００６６】
ＰＣＲ反応は以下の様に反応しピロリン酸を副生成物として遊離する。従って、ピロリン酸（ＰＰｉ）生成量は増幅DNA量に比例する。
【００６７】
【化６】

【００６８】
本発明によりウイルス等の初期鋳型核酸量を定量する場合は、ＰＣＲによって指数関数的にピロリン酸が生成することを利用する。ＰＣＲ反応生成物は、反応初期にはほぼ指数関数的増加を示し、十分なサイクル数ＰＣＲを行った場合は、初期鋳型核酸量に関係なくほぼ同じ量のＰＣＲ反応生成物が得られる。従ってＰＣＲ反応生成物がある一定量に達するサイクル数（ＣＴ）は初期鋳型核酸量と逆相関の関係にある。またこの関係が成り立つためには初期鋳型核酸量が異なっていても指数増幅期の増幅率が等しくなければならない。標的配列が同じ場合はこの関係が成立しているため、ＣＴから初期鋳型核酸量を推定することが可能である。本発明ではサイクル数を変化させてＰＣＲ反応を行い、各サイクル数におけるピロリン酸の生成量から初期鋳型核酸量を定量する方法を用いる。
【００６９】
初期鋳型核酸量の定量には、同一サンプルにおいて例えば１〜４０サイクルの範囲でサイクル数を変化させてPCR反応を行い、各サンプルの遊離ピロリン酸量を検出する工程が含まれるため、好ましくは連続的な自動化された方法で行われる。
【００７０】
従って、本発明による核酸の検知・定量方法は、核酸を含有する試料溶液を加熱して核酸を一本鎖にする加熱変性の第１の工程と、前記第１の工程で得られた一本鎖核酸に、少なくとも１つの特定塩基配列に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせることによりプライミング核酸を生成させる第２の工程と、前記第２の工程で生成したプライミング核酸に４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼを作用させ、伸長反応させてＤＮＡ相補鎖を合成するとともに、ピロリン酸を遊離させる第３の伸長反応の工程と、前記第３の工程で遊離したピロリン酸を、上記５つの核酸の検知・定量方法のうちいずれか１つの方法を用いて検知・定量する第４の工程とを具備し、試料溶液が環流することにより、前記第１、第２、第３及び第４の工程が順次複数回循環して行われるようになっている（以下、「試料−環流方式」とも言う。）ことが好ましい。
【００７１】
さらに、本発明による核酸の検知・定量方法は、前記第３の工程における伸長反応がＤＮＡポリメラーゼを固定化した反応器中で行われ、前記第４の工程におけるピロリン酸の変換が酵素を固定化した反応器中で行われることが好ましく、かかる本発明による核酸の検知・定量方法を用いれば、従来法であるルシフェリン・ルシフェラーゼ法の原理を用いて有効に核酸を検知・定量することが可能になることもまた、本発明者等により見出された。
【００７２】
すなわち、上述した本発明による核酸の検知・定量方法において、ピロリン酸を含む溶液に、ピロリン酸を定量するための試薬としてアデニリル硫酸およびルシフェリンを添加した溶液を試料溶液として用い、前記第４の工程においてピロリン酸の変換が行われる反応器に固定化される酵素としてアデノシン三リン酸スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを用いる。そして、酵素の作用によりピロリン酸が変換され、生成する物質として光を検知・定量する。本発明の試料−環流方式によれば瞬時の光の検出が可能となり、核酸を検知・定量することができる。
【００７３】
本発明のピロリン酸の検知・定量方法を用いての初期鋳型核酸量の測定は、核酸増幅法としてＰＣＲ法を用いた場合を例にとれば従来のPCR反応用の装置である温度−循環方式を用いて実施することができるが、特に上記試料−環流方式による初期鋳型核酸量の測定は、以下に詳述する本発明の試料−環流方式による装置（以下、「試料−環流装置」とも言う。）にて実施することが可能となる。
【００７４】
すなわち、核酸増幅法としてＰＣＲ反応を利用した場合の本発明の試料−環流方式による測定を行うために必要な試料−環流装置のうち、好ましい態様では、ガラスやプラスチック基盤上に、ＰＣＲ反応に必要な温度変化や酵素反応などを促す回路を微細加工し、溝に垂らした試料溶液を電気的に移動させながら、ＰＣＲ反応を順次行わせる構成となっている。より詳細には、本発明により提供される装置は、加熱変性を行う第１の処理部と、アニーリングを行う第２の処理部と、DNA伸長反応を行いピロリン酸を遊離させる第３の処理部と、前記第３の処理部で遊離したピロリン酸に特定の酵素を作用させ、該ピロリン酸を他の物質に変換する第４の処理部と、前記第４の処理部で得られた生成物を検知・定量する第５の処理部とを備え、試料溶液が前記第１ないし第５の処理部を順次複数回循環するための流路を有し、例えば電気的作用により試料溶液が前記流路を前記第１ないし第５の順に複数回循環する構成となっている。
【００７５】
更に好ましくは、前記第３の処理部がＤＮＡポリメラーゼを固定化した反応器を備え、前記第４の処理部が前記酵素を固定化した反応器を備える。
【００７６】
本発明の試料−環流装置を用いることにより、核酸の非特異的増幅を抑制することができ、かつ反応副生成物であるピロリン酸の蓄積や酵素の失活を抑制することが可能となる。
【００７７】
また、本発明のピロリン酸測定方法を用いて、核酸の有無の検出または定量を行おうとする場合に用いられる試薬及び酵素は、試薬キットの構成品として供給されることが有利である。このような試薬キットの構成品としては、上記ピロリン酸の検知・定量法法において用いられる試薬に加え、更に核酸を増幅するために必要な試薬を含む。核酸を増幅するために必要な試薬としては、プライマー類、コファクター類、ヌクレオチド−３−リン酸類等を挙げることができ、所定の方法等に応じて適切な濃度で提供される。核酸増幅に使用される試薬の最低量、および各々の適当な範囲は当該技術分野で周知である。
【００７８】
本発明によれば、色素生成による判定では、特別に検出装置を使わず、特定の核酸の存在の有無が目視で簡易に判定することも可能である。
【００７９】
【実施例】
次に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は例示のために提示するものであって、どのようにも本発明を限定することを意図するものではない。
【００８０】
[実施例１]
1mMイノシン酸、1mMパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、50 unit/Lヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、50 units/Lキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.4）１mlに既知濃度のピロリン酸溶液５μlを加え、３７℃で１０分反応させた後、５４６nmで比色定量した。そのときのピロリン酸の検量線を図１に示す。本実施例の結果から、本発明の方法を用いて精度よくピロリン酸を測定できることがわかる。
【００８１】
[実施例２]
アマシャムファルマシアバイオテク（株）のReady-To-Go PCR Breadsを用いて、PCR法による核酸の増幅を行った。PCRを行う反応溶液はキット添付のControl Lambda DNA および１組のプライマーを用いて、キット添付のプロトコールに従って調製した。そして、変性（95℃、１分）、アニーリング（55℃、１分）、DNA伸長反応（72℃、１分）のサイクルを、５、１０、１５、２０、２４、２６、２８、３０サイクル行った。反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００８２】
反応溶液の組成（PCR Breads １ビーズ中）
Control Lambda DNA １μｌ
Control Primer 1 １μｌ
Control Primer 2 １μｌ
滅菌蒸留水２２μｌ
PCR終了後、５μlの反応溶液に対して、実施例１と同様の方法を用いて、５４６nmで比色定量した。そのときの吸光度とサイクル数の関係を図２に示す。
【００８３】
本実施例の結果から、本発明の方法を用いてピロリン酸を測定することにより、ＰＣＲ反応の過程で指数関数的に生成するピロリン酸を精度よくモニターすることができた。従って、本発明は初期鋳型核酸量の定量に有効であることが示された。
【００８４】
［実施例３］
図３に本発明を利用した核酸の定量に好適な核酸定量装置の一態様を示す。
標準的な濃度のイノシン酸、テトラゾリウム塩、塩化カリウム、塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液（pH 7.4）が入った容器１から送液ポンプ２で流路を通液状態にする。
【００８５】
（１）核酸を含有する液体に、１組のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を添加し試料とする。
【００８６】
（２）試料注入口３から（１）を入れる。
【００８７】
（３）高温加熱部４（95℃）で核酸は１本鎖になる。
【００８８】
（４）低温加熱部５（55℃）で１本鎖核酸にプライマーがアニーリングする。
【００８９】
（５）中温加熱部６（72℃）内に設置されたDNAポリメラーゼを固定化したリアクター７内で１本鎖核酸は伸長し、かつピロリン酸が遊離する。
【００９０】
（６）酵素反応部８（37℃）内に設置されたヒポキサンチンホスポリボシルトランスフェラーゼ並びにキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを固定化したリアクター９内で色素（ホルマザン）が生成する。
【００９１】
（７）色素量（ホルマザン量）を可視光吸収検出器１０で検出する。
【００９２】
（８）データはパソコン１１に表示かつ蓄積される。
【００９３】
（１）から（８）を１〜４０回繰り返したのち、試料は容器１２に回収される。
【００９４】
【発明の効果】
詳述したように、本発明により、有害な試薬を用いることなく、使用する試薬も安価で高精度にピロリン酸を定量することが可能となった。更に、本発明のピロリン酸定量法を利用して、特定核酸の有無を判別できることを見出した。また、固定化酵素を用いた試料−環流方式を用いた核酸定量方法および装置を用いることにより、核酸の非特異的増幅を抑制することができ、かつ反応副生成物であるピロリン酸の蓄積や酵素の失活を抑制することを見出した。従って、従来のPCRの欠点を克服した新しい核酸増幅方法の初期鋳型核酸の定量方法およびそのための装置が、本発明により提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたピロリン酸濃度と吸光度との関係を示す図。
【図２】本発明を利用した核酸定量方法を用いて得られたサイクル数と吸光度の関係を示す図。
【図３】本発明を利用した核酸の定量に好適な核酸定量装置の一形態を示す模式図。
【符号の説明】
１，１２・・・容器、２・・・送液ポンプ、３・・・試料注入口、４・・・高温加熱部、５・・・低温加熱部、６・・・中温加熱部、７，９・・・リアクター、８・・・酵素反応部、１０・・・可視光吸収検出器、１１・・・パソコン、１２・・・分取容器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting and quantifying pyrophosphate. The present invention is also a method for detecting and quantifying nucleic acid using the method for detecting and quantifying pyrophosphate, which is specifically generated when a specific nucleic acid region is amplified using various amplification methods including a polymerase chain reaction. The present invention relates to a method for detecting and quantifying nucleic acid by detecting and quantifying pyrophosphate.
[0002]
[Prior art]
In the field of clinical examinations for infectious diseases caused by viruses, bacteria, etc. or food poisoning examinations, it is necessary to detect and quantify trace amounts of microbial nucleic acids such as tissues, body fluids and stool. Further, in various research fields, it is required to quantify the expression level of specific messenger RNA that is expressed by the action of various diseases and pharmaceuticals.
[0003]
As a method for rapidly identifying a pathogen or the like, an antigen detection method using an antigen-antibody reaction or a nucleic acid detection method using a DNA probe is also performed.
[0004]
However, in antigen detection using an antigen-antibody reaction, when the antigen part of the pathogen is concealed, the pathogen may not be detected. In addition, bacteria and the like may have a very large number of antigen parts, and it is not always easy to find a specific common antigen part unique to a specific bacterial species. In addition, a certain number or concentration of bacteria or cells are required for detection, and there are cases where pathogens cannot be detected due to the lack of the number of cells, which is problematic in terms of sensitivity.
[0005]
In contrast, in a nucleic acid detection method using a DNA probe, it is relatively easy to find a nucleic acid region unique to a biological species, and the nucleic acid region can be used as a nucleic acid probe by cloning or synthesis. is there. However, even with the DNA probe method, sufficient detection sensitivity cannot be obtained when the amount of template nucleic acid is small.
[0006]
In addition, nucleic acid detection methods (polymerase chain reaction method, PCR method) using a method of amplifying a specific base sequence with DNA polymerase are widely used as effective means. This PCR method amplifies a specific nucleic acid region in a nucleic acid molecule 1 million times in a test tube. By using this PCR, it is possible to detect a specific nucleic acid region of the target nucleic acid in an amplified state, and it is also possible to detect a pathogen from a single molecule of nucleic acid in terms of sensitivity. A detailed description of PCR is described, for example, in US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,965,188.
[0007]
As a general method for detecting the amplified specific nucleic acid region, the reaction solution after completion of PCR is separated by agarose electrophoresis and then stained and discriminated by the size of the band (molecular weight). A method of detecting a solution by a dot hybridization method has been performed. Since this detection method can directly detect and amplify DNA in bacteria, it has a feature that the test time is short and the identification of bacteria is easy. However, the complicated and time-consuming electrophoresis process is often inconvenient for on-site use.
[0008]
As a method for detecting and quantifying PCR products without performing electrophoresis, a reagent that emits fluorescence only when intercalated with DNA is added to the reaction solution before starting PCR, and a fluorescence spectrophotometer is used. A method of measuring the amount of amplified DNA (JP-A-5-237000) can be exemplified by measuring the fluorescence intensity. The initial template amount of the target nucleic acid can be determined from the change by performing PCR in the presence of an intercalating fluorescent dye and measuring the fluorescence of the reaction solution for each PCR cycle. However, an apparatus for measuring the fluorescence intensity designed for such a purpose every cycle has the disadvantage of being expensive. Also, reagents that intercalate with DNA are harmful to living organisms.
[0009]
As a method not using an intercalating reagent with DNA, (1) WO 92/16654 or J. Immunol. Methods 156, 55 (1992) describes pyrophosphate as a by-product generated in the nucleic acid amplification process by PCR. Is detected by the action of adenosine triphosphate sulfurylase to adenosine triphosphate, the adenosine triphosphate is further made to emit light by the luciferin-luciferase method, and the pyrophosphate is detected.
[0010]
In addition, (2) JP-A-7-596007 describes a method for detecting a target gene nucleic acid by detecting phosphate, which is a product obtained by decomposing pyrophosphate using inorganic pyrophosphatase or the like. Has been.
[0011]
Current PCR reactors (including those equipped with means to measure fluorescence intensity simultaneously with PCR reactions) dispense thermostable enzymes, primers, and all other reagents required for PCR reactions into sealed containers in advance. A temperature-circulation device for repeating three reactions of dissociation of nucleic acid double strand, annealing of single strand nucleic acid and primer and synthesis of complementary strand by nucleic acid polymerase. By using this apparatus, the target template DNA of the sample is amplified in a short time without being contaminated with nucleic acids of other specimens.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The conventional method (1) for measuring pyrophosphate has the disadvantage that an expensive chemiluminescence detector is required, and the generated luminescence is unstable and loses luminescence instantly. Therefore, it is inconvenient to measure the amount of pyrophosphate amplification produced by various nucleic acid amplification methods in real time. Furthermore, since pyrophosphate is detected by inducing adenosine triphosphate, there is a high possibility that adenosine triphosphate present in the living body is detected as a background. In addition, in the measurement method (2) of pyrophosphate, the determination of phosphoric acid, which is a decomposition product of pyrophosphate, has the disadvantage that the known method has low detection sensitivity and involves treatment of waste liquids of heavy metal ions such as molybdate. . Furthermore, since phosphate that is frequently used in living bodies, foods, culture media, and the like is detected as a background, it is not suitable for practical use.
[0013]
In addition, in conventional PCR reactions using temperature-circulators, when RNA or single-stranded DNA is used as a template, nonspecific amplification reactions are likely to occur, and even heat-resistant enzymes avoid inactivation due to heat. I can't do it. It is also known that pyrophosphate produced as a result of amplification inhibits the amplification reaction.
[0014]
The present invention was devised in view of the above problems, and provides a highly accurate method for detecting and quantifying pyrophosphate, and various nucleic acid amplification methods using the method for detecting and quantifying pyrophosphate. It is an object of the present invention to provide a method for detecting and quantifying a nucleic acid according to the invention and a device useful for the method.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have converted pyrophosphate into a substance that can be detected with high sensitivity by a known method using a specific enzyme, and by detecting and quantifying this, stable Moreover, it was possible to detect and quantitate pyrophosphate with high accuracy, and furthermore, the detection and quantification method of pyrophosphate was found to be extremely useful for detection and quantification of nucleic acids by various nucleic acid amplification methods, and the present invention was completed. . Furthermore, the present inventors have also found that the above-described drawbacks in the case of performing a PCR reaction using a temperature-circulation device can be solved by using a device using a sample-perfusion method with a specific enzyme. The present invention has been completed.
[0016]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) Inosine in a solution containing pyrophosphate Acid And the addition of tetrazolium salt and the action of hypoxanthine phosphoribosyltransferase and xanthine dehydrogenase / oxidase And inosinic acid Formazan And urea Detecting formazan and process to convert to Or Detecting pyrophosphoric acid, characterized by comprising a step of quantifying Or Quantitation method.
[0017]
(2) Inosine in a solution containing pyrophosphate Acid And adding pyroxanthine phosphoribosyltransferase and xanthine dehydrogenase / oxidase to act pyrophosphate And inosinic acid The hydrogen peroxide And urea Or superoxide And urea And the detection of hydrogen peroxide or superoxide that is generated Or Detecting pyrophosphoric acid, characterized by comprising a step of quantifying Or Quantitation method.
[0021]
(3) Nucleic acid detection Or A method for quantification comprising the steps of amplifying a nucleic acid in a sample solution and pyrophosphate contained in the sample solution after amplification. (1) or (2) Detection using the method described in Or And detecting the nucleic acid, characterized by comprising: Or Quantitation method.
[0029]
(4) A reagent kit useful for the method for detecting or quantifying pyrophosphate according to (1), wherein pyrophosphate, inosinate, tetrazolium salt, hypoxanthine phosphoribosyltransferase, and xanthine dehydrogenase / oxidase are each independently used. Containing reagents Including Reagent kit.
[0030]
(5) A reagent kit useful for the pyrophosphate detection or quantification method according to (2), wherein hydrogen peroxide or superoxide is produced with pyrophosphate, inosinate, hypoxanthine phosphoribosyltransferase, xanthine dehydrogenase / oxidase Reagents for detecting Including Reagent kit.
[0034]
(6) Detection of target nucleic acid Or A reagent kit useful for quantification, (4) or (5) A reagent kit further containing reagents necessary for amplifying nucleic acid in addition to the reagent kit described above.
[0035]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0036]
The method for detecting and quantifying pyrophosphate provided by the present invention was developed by the present inventors as part of developing methods for measuring pyrophosphate produced by various nucleic acid amplification techniques. Therefore, changes in the amount of nucleic acid amplified using various methods such as PCR, Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICAN), and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Therefore, it is suitable as a method for measuring pyrophosphate when estimating from the above. However, the method for measuring pyrophosphate of the present invention is effective not only as a method for detecting and quantifying pyrophosphate produced by a nucleic acid amplification method but also as a method for measuring various pyrophosphates added to foods as food additives. .
[0037]
Other substances that can be measured using the method of the present invention include inosinic acid, adenosine diphosphate, oxaloacetate, D-phenylalanine, adenylyl sulfate, and the like.
[0038]
As described above, conventionally, as a method for measuring pyrophosphate, after adenosine triphosphate sulfurylase is allowed to act on pyrophosphate, luminescence produced using luciferin-luciferase method is detected, or pyrophosphate is converted into inorganic pyrophosphate. A method of detecting phosphate, which is a product decomposed using phosphatase or the like, is used. In the present invention, it has been newly found out that pyrophosphate can be detected and quantified stably and highly accurately by combining a specific enzyme and a reagent as described in detail below.
[0039]
A first method for measuring pyrophosphate newly provided by the present invention includes adding a necessary amount of inosinic acid or xanthylic acid and a tetrazolium salt to a measurement sample containing pyrophosphoric acid, and hypoxanthine phosphoribosyltransferase. (EC 2.4.2.8) and xanthine dehydrogenase (EC 1.1.1.204) / oxidase (EC 1.1.3.22) are allowed to act and the produced formazan is measured. In this measurement method, when an enzymatic reaction is carried out in the presence of excess inosinic acid or xanthylic acid and an excess of tetrazolium salt, 1 to 2 moles of formazan of pyrophosphate is produced when inosinic acid is used. In the case of using xanthylic acid, it was developed by utilizing the formation of 1 mol of formazan from 1 mol of pyrophosphate. By quantifying formazan, which is easy to quantify by a known method, pyrophosphate is increased. It becomes possible to quantify with accuracy. As a specific example of the method for measuring formazan, since formazan is colored, it can be quantified by measuring the absorbance with a spectrophotometer. In this measurement method, both inosinic acid and xanthylic acid can be used simultaneously. The above reaction when inosinic acid is used is represented by the following reaction formula.
[0040]
[Chemical 1]

[0041]
The order of addition of each reagent and enzyme is not questioned, any of which may be added first, or these may be added as a mixture.
[0042]
The tetrazolium salt used in this method is not particularly limited. For example, paraiodonitrotetrazolium violet, thiazoyl blue, neotetrazolium chloride, nitroblue tetrazolium, tetranitroblue tetrazolium, tetrazolium blue, tetrazolium red, tetrazolium violet, thiocarbamoyl Examples thereof include nitro blue tetrazolium and triphenyltetrazolium chloride.
[0043]
For example, when measuring pyrophosphate using paraiodonitrotetrazolium violet, usually about 0.1 to 100 mM inosinic acid, about 0.1 to 100 mM paraiodonitrotetrazolium violet, about 1 to 1000 mM potassium chloride, 1 About 5 to 500 mM Tris-HCl buffer (preferably pH 6.5 to 5) containing about 1000 mM magnesium chloride, about 50 to 5000 units / L hypoxanthine phosphoribosyltransferase, and about 5 to 500 units / L xanthine dehydrogenase / oxidase. After the reaction at 25-37 ° C. for 10-120 minutes, the produced formazan may be colorimetrically determined at a wavelength of about 547 nm.
[0044]
In the second method, a necessary amount of inosinic acid or xanthylic acid is added to a measurement sample containing pyrophosphate, hypoxanthine phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8) and xanthine dehydrogenase (EC 1.1.1.204) / oxidase (EC 1.1 Measures hydrogen peroxide or superoxide produced by acting .3.22).
[0045]
In this measurement method, both inosinic acid and xanthylic acid can be used simultaneously. When either inosinic acid or xanthylic acid is used as a substrate, superoxide (O ₂ ) Once generated, but by coexisting with an appropriate chemiluminescent substance (such as luminol), the generated superoxide can be directly led to the luminescent species instead of hydrogen peroxide, so the chemiluminescence intensity is measured Thus, the amount of pyrophosphate can be measured. On the other hand, when no chemiluminescent reagent is used, superoxide is immediately converted to hydrogen peroxide. The reaction in that case can be represented by the following reaction formula, and the measured amount of hydrogen peroxide and the amount of pyrophosphate are correlated as shown by the following reaction formula, and the amount of pyrophosphate can be measured.
[0046]
[Chemical 2]

[0047]
The order of addition of each reagent and enzyme is not questioned, any of which may be added first, or these may be added as a mixture.
[0048]
When measuring pyrophosphate using the second method, usually about 0.1 to 100 mM inosinic acid, about 0.1 to 100 mM oxygen, about 1 to 1000 mM potassium chloride, about 1 to 1000 mM magnesium chloride, 50 Using about 5 to 500 mM Tris-HCl buffer (preferably about pH 6.5 to 8.0) containing about 5000 unit / L hypoxanthine phosphoribosyltransferase and about 5 to 500 unit / L xanthine dehydrogenase / oxidase, 25 By reacting at ˜37 ° C. for 10 to 120 minutes and measuring the generated hydrogen peroxide by a known method, pyrophosphate can be quantified in a correlated manner.
[0049]
In this method, satisfactory detection sensitivity could not be obtained by the conventional pyrophosphate measurement method, so that the detection sensitivity of pyrophosphate was increased by inducing detection with hydrogen peroxide having high detection sensitivity in the conventional method. It was developed for the purpose. The advantage of introducing hydrogen peroxide is high detection sensitivity, and it can be used for either inexpensive and versatile devices such as UV-visible spectrophotometers or high-sensitivity devices such as chemiluminescence detectors and fluorescence detectors. It can be measured that hydrogen peroxide is stable in solution.
[0050]
Regarding the detection of hydrogen peroxide, it can be detected using a number of conventional methods such as a detection method using a reagent. In its simplest form, this measurement method can use a method of detecting hydrogen peroxide using a reagent that provides a color signal in response to one or more reactions with hydrogen peroxide. One such method is to evaluate the blue color produced at a wavelength of 640 nm in the presence of reduced patent blue and peroxidase.
[0051]
In the third method, a necessary amount of oxaloacetate is added to a measurement sample containing pyrophosphate, phosphoenolpyruvate carboxykinase (pyrophosphate) (EC 4.1.1.38) is allowed to act, and the generated carbon dioxide is measured. Is the method. The reaction is shown by the following reaction formula.
[0052]
[Chemical 3]

[0053]
The order in which the reagents and enzymes are added is not questioned, either of which may be added first, or they may be added as a mixture.
[0054]
In the case of measuring pyrophosphate, 5 to 5 containing, for example, about 0.1 to 1000 mM oxaloacetate, about 1 to 1000 mM magnesium chloride, about 0.01 to 5 units / ml phosphoenolpyruvate carboxykinase (pyrophosphate) What is necessary is just to make it react at 25-37 degreeC for 10 to 120 minutes using about 500 mM Tris hydrochloric acid buffer (preferably about pH 6.5-9.0). By measuring the amount of carbon dioxide produced, pyrophosphate can be measured. A known method can be used as a method for measuring carbon dioxide.
[0055]
The fourth method is a method in which phenylalanine racemase (EC 5.1.1.11) is allowed to act on a measurement sample containing pyrophosphate. D-phenylalanine and adenosine diphosphate are added to a measurement sample containing pyrophosphate, and phenylalanine racemase (EC 5.1.1.11) is allowed to act on the sample to measure L-phenylalanine produced. The reaction is shown by the following reaction formula.
[0056]
[Formula 4]

[0057]
The order of addition of each reagent and enzyme is not questioned, any of which may be added first, or these may be added as a mixture.
[0058]
Requires D-phenylalanine, adenosine diphosphate as substrate, phenylalanine racemase as enzyme, usually about 0.1-1000 mM D-phenylalanine, about 0.1-1000 mM adenosine diphosphate, about 0.01-5 unit / ml phenylalanine What is necessary is just to make it react at 25-37 degreeC for 10 to 120 minutes using about 5-500 mM Tris hydrochloric acid buffer solution (pH 6.5-8.0) containing a racemase. Pyrophosphate can be measured by measuring the amount of L-phenylalanine produced using an optical rotation detector.
[0059]
The fifth method is a method in which adenosine triphosphate sulfurylase (EC 2.7.7.4) is allowed to act on a measurement sample containing pyrophosphate. Adenylyl sulfate is added as a substrate to a measurement sample containing pyrophosphate, adenosine triphosphate sulfurylase (EC 2.7.7.4) is allowed to act, and the generated sulfate ion is measured.
[0060]
[Chemical formula 5]

[0061]
The order of addition of each reagent and enzyme is not questioned, any of which may be added first, or these may be added as a mixture.
[0062]
When trying to measure pyrophosphate, usually about 0.1 to 1000 mM adenylyl sulfate, about 0.1 to 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid, about 0.01 to 1% bovine serum albumin, about 1 to 100 mM magnesium acetate, 0.001 to 1 to 50 at 25 to 37 ° C using about 5 to 500 mM Tris acetate buffer (pH 6.5 to 8.0) containing about 1 mM dithiothreitol and about 0.01 to 5 unit / ml adenosine triphosphate sulfurylase. The pyrophosphoric acid can be quantified by allowing the reaction to occur and measuring the generated sulfate ion using a known method. For example, pyrophosphate can be measured by reacting the produced sulfate ions with acidified hydrochloric acid by adding barium hydrochloride and measuring the turbidity of the produced barium sulfate using a nephelometer.
[0063]
The reagent and enzyme used in the pyrophosphate measurement method of the present invention are advantageously supplied as components of a reagent kit. It is desirable that the components of such a reagent kit are provided at an appropriate concentration according to a predetermined method or the like and dispensed in advance into a lidded container. The components included in the reagent kit provided by the present invention are those containing each of the reagents and enzymes required according to the measurement sample and the measurement method alone, or a mixture of two or more kinds of reagents or enzymes. is there. These constituent reagents and enzymes can be appropriately packaged (dry or wet) from the viewpoint of necessary safety and ease of handling. As a means of detecting pyrophosphate using this reagent kit, in addition to precise quantification using advanced optical instruments such as an ultraviolet-visible spectrophotometer, a fluorescence spectrophotometer, and a chemiluminescence detector, the presence or absence of pyrophosphate As a simple determination for confirming the color density, it is also possible to know the approximate density by comparing the density with a color sample by the naked eye, or by coloring with a photograph or a CCD camera, or the density of fluorescence or light emission. It can also be used for the quantification of bacteria from the approximate concentration and the change over time by changing the color data with a PC.
[0064]
The method for detecting and quantifying pyrophosphate of the present invention is extremely useful for detecting and quantifying nucleic acids by various nucleic acid amplification methods. That is, when pyrophosphate is generated simultaneously with nucleic acid amplification, such as PCR, LAMP method, ICAN method, etc., by using the pyrophosphate detection / quantification method of the present invention, without using harmful reagents, It has become practical to detect and quantify nucleic acids with high sensitivity and ease.
[0065]
The nucleic acid detection / quantification method using the pyrophosphate detection / quantification method of the present invention when the PCR method is used as the nucleic acid amplification method will be described in detail below.
[0066]
The PCR reaction reacts as follows to release pyrophosphate as a byproduct. Therefore, the amount of pyrophosphate (PPi) produced is proportional to the amount of amplified DNA.
[0067]
[Chemical 6]

[0068]
When the amount of initial template nucleic acid such as a virus is quantified according to the present invention, the fact that pyrophosphate is generated exponentially by PCR is used. The PCR reaction product shows an approximately exponential increase at the beginning of the reaction, and when a sufficient number of cycles of PCR is performed, almost the same amount of PCR reaction product is obtained regardless of the initial template nucleic acid amount. Therefore, the number of cycles (CT) at which a PCR reaction product reaches a certain amount is inversely related to the initial template nucleic acid amount. In order for this relationship to be established, the amplification factor in the exponential amplification period must be the same even if the amount of the initial template nucleic acid is different. Since this relationship is established when the target sequences are the same, the initial template nucleic acid amount can be estimated from CT. In the present invention, a method is used in which PCR reaction is carried out while changing the number of cycles, and the amount of initial template nucleic acid is determined from the amount of pyrophosphate produced in each number of cycles.
[0069]
The quantification of the amount of initial template nucleic acid includes a step of detecting the amount of free pyrophosphate in each sample by performing a PCR reaction by changing the number of cycles within the range of, for example, 1 to 40 cycles in the same sample. In an automated way.
[0070]
Therefore, the method for detecting and quantifying nucleic acid according to the present invention includes a first step of heat denaturation in which a nucleic acid-containing sample solution is heated to make the nucleic acid single-stranded, and the one obtained in the first step. A second step of generating a priming nucleic acid by annealing a strand nucleic acid with an oligonucleotide primer having a sequence complementary to at least one specific base sequence, and four types of priming nucleic acids generated in the second step A deoxyribonucleoside triphosphate and a DNA polymerase are reacted with each other to cause an elongation reaction to synthesize a complementary DNA strand, and at the same time, a third extension reaction step for releasing pyrophosphate, and the pyrophosphate released in the third step. And a fourth step of detecting and quantifying using any one of the above five nucleic acid detection and quantification methods, and circulating the sample solution It makes the first, second, third and fourth step is to be carried out by circulating a plurality of times in sequence (hereinafter,. - also referred to as "sample reflux method") is preferred.
[0071]
Furthermore, in the method for detecting and quantifying nucleic acid according to the present invention, the extension reaction in the third step is performed in a reactor in which DNA polymerase is immobilized, and the conversion of pyrophosphate in the fourth step immobilizes the enzyme. The nucleic acid detection / quantification method according to the present invention is preferably carried out in such a reactor, so that the nucleic acid can be detected and quantified effectively using the principle of the conventional luciferin-luciferase method. It has also been found by the present inventors.
[0072]
That is, in the nucleic acid detection and quantification method according to the present invention described above, a solution obtained by adding adenylyl sulfate and luciferin as a reagent for quantifying pyrophosphate to a solution containing pyrophosphate is used as a sample solution, and the fourth step Adenosine triphosphate sulfurylase and luciferase are used as enzymes immobilized in a reactor in which pyrophosphate conversion is performed. Then, pyrophosphate is converted by the action of the enzyme, and light is detected and quantified as a substance to be generated. According to the sample-perfusion method of the present invention, instantaneous light can be detected, and nucleic acid can be detected and quantified.
[0073]
The measurement of the initial template nucleic acid amount using the pyrophosphate detection / quantification method of the present invention is a temperature-circulation method that is a conventional apparatus for PCR reaction, taking the case of using the PCR method as a nucleic acid amplification method as an example. In particular, the measurement of the amount of initial template nucleic acid by the above-described sample-perfusion method is an apparatus according to the sample-perfusion method of the present invention described below in detail (hereinafter also referred to as “sample-perfusion device”). )).
[0074]
That is, among the sample-perfusion devices necessary for performing measurement by the sample-perfusion method of the present invention when a PCR reaction is used as a nucleic acid amplification method, in a preferred embodiment, it is necessary for the PCR reaction on a glass or plastic substrate. A circuit that facilitates a temperature change, an enzyme reaction, and the like is finely processed, and a PCR reaction is sequentially performed while the sample solution hung in the groove is electrically moved. More specifically, the apparatus provided by the present invention includes a first processing unit that performs heat denaturation, a second processing unit that performs annealing, and a third processing unit that performs a DNA elongation reaction to liberate pyrophosphate. And a fourth processing unit that causes a specific enzyme to act on pyrophosphoric acid liberated in the third processing unit and converts the pyrophosphoric acid into another substance, and a product obtained in the fourth processing unit. And a flow path through which the sample solution circulates sequentially through the first to fifth processing sections a plurality of times. For example, the sample solution flows by the electrical action. The road is circulated a plurality of times in the first to fifth order.
[0075]
More preferably, the third processing unit includes a reactor in which a DNA polymerase is immobilized, and the fourth processing unit includes a reactor in which the enzyme is immobilized.
[0076]
By using the sample-perfusion apparatus of the present invention, nonspecific amplification of nucleic acid can be suppressed, and accumulation of pyrophosphate, which is a reaction byproduct, and inactivation of an enzyme can be suppressed.
[0077]
Moreover, it is advantageous that the reagent and enzyme used when detecting or quantifying the presence or absence of nucleic acid using the pyrophosphate measurement method of the present invention are supplied as components of a reagent kit. The components of such a reagent kit include reagents necessary for amplifying nucleic acids in addition to the reagents used in the method for detecting and quantifying pyrophosphate. Examples of reagents necessary for amplifying nucleic acids include primers, cofactors, nucleotide-3-phosphates, and the like, and are provided at an appropriate concentration according to a predetermined method. The minimum amount of reagents used for nucleic acid amplification, and the appropriate ranges for each, are well known in the art.
[0078]
According to the present invention, it is also possible to easily determine visually whether or not a specific nucleic acid is present, without using a detection device, in the determination by pigment generation.
[0079]
【Example】
The invention will now be described in more detail by way of examples, which are given for the purpose of illustration and are not intended to limit the invention in any way.
[0080]
[Example 1]
In 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1 mM inosinic acid, 1 mM paraiodonitrotetrazolium violet, 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, 50 units / L hypoxanthine phosphoribosyltransferase, 50 units / L xanthine dehydrogenase / oxidase After adding 5 μl of a pyrophosphoric acid solution having a known concentration and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, colorimetric determination was performed at 546 nm. The calibration curve of pyrophosphate at that time is shown in FIG. From the results of this example, it can be seen that pyrophosphate can be measured with high accuracy using the method of the present invention.
[0081]
[Example 2]
Nucleic acids were amplified by PCR using Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. Ready-To-Go PCR Breads. A reaction solution for PCR was prepared using Control Lambda DNA attached to the kit and a set of primers according to the protocol attached to the kit. Then, cycles of denaturation (95 ° C., 1 minute), annealing (55 ° C., 1 minute), and DNA extension reaction (72 ° C., 1 minute) are performed for 5, 10, 15, 20, 24, 26, 28, 30 cycles. went. The composition of the reaction solution is as follows.
[0082]
Composition of reaction solution (in one PCR Breads bead)
Control Lambda DNA 1μl
Control Primer 1 1μl
Control Primer 2 1μl
Sterile distilled water 22 μl
After completion of PCR, a colorimetric determination was performed at 546 nm using the same method as in Example 1 for 5 μl of the reaction solution. The relationship between the absorbance at that time and the number of cycles is shown in FIG.
[0083]
From the results of this Example, it was possible to accurately monitor pyrophosphoric acid generated exponentially during the PCR reaction by measuring pyrophosphoric acid using the method of the present invention. Therefore, it was shown that the present invention is effective for quantifying the amount of initial template nucleic acid.
[0084]
[Example 3]
FIG. 3 shows the present invention. Suitable for nucleic acid quantification using 1 shows one embodiment of a nucleic acid quantification apparatus.
A flow path is made to flow through a container 1 containing a tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing standard concentrations of inosinic acid, tetrazolium salt, potassium chloride, and magnesium chloride with a liquid feed pump 2.
[0085]
(1) A set of primers, deoxyribonucleoside triphosphate, is added to a liquid containing nucleic acid to prepare a sample.
[0086]
(2) Insert (1) from the sample inlet 3.
[0087]
(3) The nucleic acid becomes a single strand in the high temperature heating section 4 (95 ° C.).
[0088]
(4) The primer anneals to the single-stranded nucleic acid in the low temperature heating section 5 (55 ° C.).
[0089]
(5) The single-stranded nucleic acid is elongated and pyrophosphate is released in the reactor 7 in which the DNA polymerase is fixed, which is installed in the intermediate temperature heating unit 6 (72 ° C.).
[0090]
(6) A dye (formazan) is produced in the reactor 9 in which hypoxanthine phospolybosyltransferase and xanthine dehydrogenase / oxidase are installed in the enzyme reaction unit 8 (37 ° C.).
[0091]
(7) The amount of dye (the amount of formazan) is detected by the visible light absorption detector 10.
[0092]
(8) The data is displayed and stored on the personal computer 11.
[0093]
After repeating (1) to (8) 1 to 40 times, the sample is collected in the container 12.
[0094]
【The invention's effect】
As described in detail, according to the present invention, it is possible to quantitate pyrophosphate with high accuracy without using a harmful reagent and also with a reagent used at low cost. Furthermore, it has been found that the presence or absence of a specific nucleic acid can be determined using the pyrophosphate quantification method of the present invention. In addition, by using a nucleic acid quantification method and apparatus using a sample-perfusion method using an immobilized enzyme, nonspecific amplification of nucleic acid can be suppressed, and accumulation of pyrophosphate, which is a reaction byproduct, It was found that enzyme deactivation was suppressed. Accordingly, the present invention provides a method for quantifying an initial template nucleic acid and a device therefor, which is a new nucleic acid amplification method that overcomes the disadvantages of conventional PCR.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between pyrophosphate concentration and absorbance obtained by using the pyrophosphate quantification method of the present invention.
FIG. 2 Used The figure which shows the relationship between the cycle number obtained using the nucleic acid quantification method, and a light absorbency.
FIG. 3 Suitable for nucleic acid quantification using The schematic diagram which shows one form of a nucleic acid quantification apparatus.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF

SYMBOLS

1,12 ... Container, 2 ... Liquid feed pump, 3 ... Sample injection port, 4 ... High temperature heating part, 5 ... Low temperature heating part, 6 ... Medium temperature heating part, 7, DESCRIPTION OF SYMBOLS 9 ... Reactor, 8 ... Enzyme reaction part, 10 ... Visible light absorption detector, 11 ... Personal computer, 12 ... Sorting container

Claims

A step of adding inosinic acid and a tetrazolium salt to a solution containing pyrophosphoric acid, a step of converting hypoxanthine phosphoribosyltransferase and xanthine dehydrogenase / oxidase to convert pyrophosphoric acid and inosinic acid into formazan and urea, and formation of formazan. And a method for detecting or quantifying pyrophosphate, comprising the step of detecting or quantifying.

Adding inosinic acid to a solution containing pyrophosphate, converting hypophosphate and inosinate to hydrogen peroxide and urea or superoxide and urea by allowing hypoxanthine phosphoribosyltransferase and xanthine dehydrogenase / oxidase to act; A method for detecting or quantifying pyrophosphate, comprising a step of detecting or quantifying hydrogen peroxide or superoxide to be produced.

A method for detecting or quantifying nucleic acid, comprising the step of amplifying nucleic acid in a sample solution and detecting or quantifying pyrophosphate contained in the sample solution after amplification using the method according to claim 1 or 2. A method for detecting or quantifying a nucleic acid.

A reagent kit useful for the method for detecting or quantifying pyrophosphate according to claim 1, wherein the reagent kit contains pyrophosphate, inosinate, tetrazolium salt, hypoxanthine phosphoribosyltransferase, and xanthine dehydrogenase / oxidase alone. and to including reagent kit.

A reagent kit useful for the pyrophosphoric acid detection or quantification method according to claim 2, which detects hydrogen peroxide or superoxide produced by pyrophosphate, inosinic acid, hypoxanthine phosphoribosyltransferase, xanthine dehydrogenase / oxidase. a reagent, each alone as a reagent containing including reagent kit.

A reagent kit useful for detection or quantification of a target nucleic acid, comprising a reagent necessary for amplifying a nucleic acid in addition to the reagent kit according to claim 4 or 5.