JP4156108B2

JP4156108B2 - Blood analysis method

Info

Publication number: JP4156108B2
Application number: JP34269198A
Authority: JP
Inventors: 弘明三澤; 茂樹上甲
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: JP2000171461A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血液から赤血球を簡便、迅速に分離除去する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液成分を分光学的に分析するためには、妨害物質となる血液中の赤血球を除去した血漿あるいは血清を用いなければならない。従来、赤血球を分離除去するために、遠心分離法を利用して赤血球を沈降させ、上清の血漿あるいは血清を分取することが行われてきた。
【０００３】
しかし近年では、メンブレンフィルタによって赤血球を濾過することで、遠心分離器を用いることのない、簡便で小型の分析装置が普及するようになった。これは例えば血糖値の自己管理測定装置として、糖尿病患者の間に普及しており、採取した血液をメンブレンフィルタに添加して赤血球を濾過し、試薬との呈色反応を分光学的に分析するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらメンブレンフィルタを用いた赤血球の分離除去方法では、物理的に赤血球を除去するためフィルターの目詰まりが生じる。このため血液を濾過するときに血液の浸透速度が徐々に遅くなり、分析に時間がかかる問題がある。またメンブレンフィルタは吸水性あるいは保水性があるために、必要以上に多量の血液を採取しなければならないという問題もある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、基板の表面に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層した層を形成することにより、基板の表面を陰イオン交換物質によりプラスに帯電させておき、その表面に血液を展開して、マイナスに帯電している赤血球を陰イオン交換物質にイオン結合させることで、血液から赤血球を分離除去したことを特徴とするものである。
【０００６】
これによれば、化学的に赤血球を分離除去するため、目詰まりの問題は生じない。また基板へは、血液が浸透することはなく、またイオン交換物質層の保水能もメンブレンフィルタと比較にならないほど極めて小さいため、メンブレンフィルタに比べ採取する血液の量も少なくてすむ。そして分析は、赤血球が陰イオン交換物質に結合した後の血液を用いて行うが、この表面の血液を試薬領域まで導いて反応させて行うことができる。
【０００７】
ここで血液が流れやすくなるように流路を形成した基板の表面や毛細管の内壁に、陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層しておけば、血液が流れるに応じて、流れの上流側で赤血球がイオン結合するため、下流側では赤血球を分離除去することができる。この下流側に予め試薬領域を形成しておけば分析を行うことができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の請求項１に記載された発明の一実施の形態について、図１、図２を用いて説明する。
【０００９】
図１は本発明の分離除去方法の動作原理を示す概念図であり、基板となるガラス基板４には、陽イオン交換物質３と陰イオン交換物質２を交互に積層した状態を模式的に表している。ガラス基板４の表面は、予めシラン及び塩酸処理によりプラスに、陽イオン交換物質３の表面はマイナスに、陰イオン交換物質の表面はプラスに、それぞれ帯電している。そして１はガラス基板４の表面に滴下された血液の赤血球を示しており、その表面はマイナスに帯電している。
【００１０】
ここでガラス基板４の表面にプラスイオンが露出するよう化学修飾処理する方法について具体的に説明する。まずガラス基板を５パーセントの３−アミノプロピルトリエトキシルシランに浸漬した後、１規定の塩酸に浸漬することで、基板表面をプラスに帯電させる。
【００１１】
次にポリスチレンスルホン酸（以下、ＰＳＳと略す）の３ｍｇ／ｍｌ溶液中に、プラスに帯電した先のガラス基板を浸漬することで、陽イオン交換物質３であるＰＳＳの層がイオン結合により形成され、その表面はマイナスに帯電する。
【００１２】
そして最後にポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略す）の１．５ｍｇ／ｍｌ溶液中に先のガラス基板を浸漬することで、その表面に陰イオン交換物質２であるＰＥＩの層が陽イオン交換物質３の表面にイオン結合される。これにより結果的に外表面に陽イオンが露出するように、すなわち基板の外表面がプラスに帯電するように化学修飾することができる。
【００１３】
このように陽イオン交換物質および陰イオン交換物質を交互に積層して形成する理由は、基板表面を安定かつ均一にプラスに帯電することが可能となるためである。これに比べ、単にシラン処理後、塩酸に浸漬してガラス基板の表面をプラスに帯電させたり、ガラス基板に陰イオン交換物質のみを形成したものは、表面を安定かつ均一にプラスに帯電した状態を保持することができないのである。
【００１４】
ここで図１のガラス基板を用い、生理食塩液により希釈した血液中に浸漬した場合の赤血球結合能を図２に示す。図２は、１ｃｍ²当たりの赤血球の結合数を測定したものであり、顕微鏡下にてその数を計測した。比較例として、無修飾のガラス基板を比較例１、上記のシラン処理まで施したガラス基板を比較例２、さらに塩酸処理まで施したガラス基板を比較例３、ＰＳＳ処理まで施したガラス基板を比較例４として示した。
【００１５】
血液を生理食塩液により希釈して赤血球数が１ｍｌ当たり３×１０⁷個になるように調製した液３ｍｌ中にそれぞれ修飾したガラス基板を浸漬して、その赤血球結合数を測定した。
【００１６】
本実施の形態のガラス基板の場合、赤血球は基板１ｃｍ²当たりおよそ５０００個結合するのに対し、比較例１及び４においてはその１０分の１以下の結合能しかない。これはガラス基板への赤血球の物理的吸着のみの効果であり、安定性及び再現性に乏しい。また比較例２及び３において比較例１及び４と比べ若干の結合能を示しているが、これはシラン化合物のアミノ基に由来し、イオン解離の状態に左右されるため、これも安定性及び再現性に乏しい。
【００１７】
また本実施の形態で示したＰＥＩ層に再びＰＳＳ層を形成すると赤血球結合能は１０分の１以下にまで低下する。そしてこのＰＳＳ層に再度ＰＥＩ層を形成すると赤血球結合能は元に回復する。すなわちＰＥＩのプラスの電荷が、赤血球結合に決定的な役割を果たしているのである。
【００１８】
上記のように本実施の形態で示すガラス基板では、ガラス基板の表面に赤血球をイオン結合により吸着させれば、血液の上層は赤血球の分離除去された血液となるので、この状態で分光学的に分析を行うことができる。
【００１９】
（実施の形態２）
図３には、基板上に血液を移動させるための流路を形成することにより、赤血球が分離除去された血液を容易に分析できるようにした一実施の形態を示している。
【００２０】
図３の分析装置において、シリコン基板１０の表面には、半導体加工技術により毛細管状の流路１２と、分析に必要な血液を受け入れる検体導入口１１と、赤血球が分離除去された血液を保持する検体反応部１３を形成している。この献体導入口１１と検体反応部１３とは、流路１２の溝によりつながっている。
【００２１】
この検体反応部１３に酵素及び酵素反応検出試薬を点着しておく。例えば、この検体反応部にグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びＯ−ジアニシジンなどを点着しておけば、血液中のグルコースが分光学的に検出可能となる。
【００２２】
そして流路１２には上述の実施の形態１で説明したようにイオン交換物質を作成しておく。そして、これらシリコン基板１０の表面をカバーするためのガラス基板９を、陽極接合法等の方法によりシリコン基板１０の面と接着し蓋をする。なおガラス基板９には、検体導入口１１と検体反応部１３の部分を開口しておく。このような方法によれば、血液が流路１２を流れることに応じて赤血球の分離除去が容易に行え、分離された血漿や血清試料が検体反応部１３に収集されて同時に分析を行えるという利便性がある。
【００２３】
（実施の形態３）
図４は、内径５０μｍ、長さ７０ｍｍのガラス管５の内側を上述の実施の形態１のようにして化学修飾し、血液を展開したときの分離除去状態を示したものである。図において、８は滴下した血液であり、この血液８にガラス管５の下端をつけると、血液は毛細管現象によりガラス管５内を上昇していき、５０ｍｍ展開した時点で、赤血球と血漿や血清との分離を開始する。
【００２４】
７はイオン結合によりガラス管の内壁に吸着した赤血球を示しており、６は分離除去された血液を示している。この６の部分の血液を用いることで、分光分析などを行うことができる。またこの６で示す領域に反応試薬などを塗布しておけば、この領域における発色反応を容易に測定することができ便利である。
【００２５】
なお、以上の実施の形態１〜３の説明では陽イオン交換物質としてＰＳＳを用いた例で説明したが、その他、ＰＳＳの塩、ポリアニリンプロパンスルホン酸及びその塩、ポリアスパラギン酸及びその塩、ポリグルタミン酸及びその塩も同様に使用可能である。陰イオン交換物質としてＰＥＩを用いた例で説明したが、その他、ポリアリルアミン及びその塩酸塩、ポリ塩化ジメチルジアリルアンモニウム、ポリリシン及びその塩、ポリアルギニン及びその塩についても同様に実施可能である。
【００２６】
また、各イオン交換物質の濃度、積層回数、積層する基板は実施の一例であり、その濃度、積層回数及び基板を限定するものでなく、その目的に応じて改変可能である。例えば、陽イオン交換物質と陰イオン交換物質の間に酵素あるいは抗体などをサンドイッチ状に挿入させ（例えば、Biotechnology and Bioengineering vol.51 P163〜167 1996年）、血液が流路を移動している途中で酵素あるいは抗体反応をさせたり、血液中の赤血球以外の不純物を除去することも可能である。例えば、アスコルビン酸オキシダーゼあるいはビリルビンオキシダーゼを挿入させることにより血液中に混在するアスコルビン酸及びビリルビンの除去が可能となる。
【００２７】
また上記実施の形態では基板としてガラスあるいはシリコンを用いた例で説明したが、プラスチック樹脂も基板として利用可能である。
【００２８】
【発明の効果】
以上のように本発明は、基板の表面に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層して、その表面をプラスに帯電させておくことで、マイナスに帯電した赤血球を分離除去するようにしたものである。これによれば、メンブレンフィルタの目詰まりの問題や血液の量の問題はなく、イオン結合により赤血球を即座に基板の表面に吸着させて迅速に分離除去することができる。
【００２９】
またこのように陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層しておけば、安定かつ均一にその性能を維持することができ、また毛細管現象などを利用して血液を移動させるようにすれば、自動的に赤血球を分離除去して分析できるという利便性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態における赤血球の分離除去方法を示す模式図
【図２】本発明の一実施の形態におけるイオン交換物質の修飾処理を施したガラス基板の赤血球結合数を測定したグラフ
【図３】本発明の実施の形態に基づき作製可能な血液分析装置の一例を示す模式図
【図４】本発明の実施の形態における毛細管現象を利用した赤血球の分離除去方法を示す模式図
【符号の説明】
１赤血球
２陰イオン交換物質
３陽イオン交換物質
４ガラス基板
５ガラス毛細管
６血液の展開により分離した血漿あるいは血清
７ガラス管内側表面に結合した赤血球
８展開用血液検体
９ガラス基板
１０シリコン基板
１１検体導入口
１２流路
１３検体反応部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for easily and quickly separating and removing red blood cells from blood.
[0002]
[Prior art]
In order to spectroscopically analyze blood components, it is necessary to use plasma or serum from which red blood cells in the blood that are interfering substances have been removed. Conventionally, in order to separate and remove red blood cells, red blood cells have been precipitated using a centrifugal separation method, and supernatant plasma or serum has been collected.
[0003]
However, in recent years, simple and small analyzers that do not use a centrifuge have become widespread by filtering red blood cells with a membrane filter. This is widely used among diabetic patients, for example, as a self-monitoring measuring device for blood glucose level, and the collected blood is added to a membrane filter to filter red blood cells, and the color reaction with the reagent is analyzed spectroscopically. Is.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the method of separating and removing erythrocytes using a membrane filter, the filter is clogged because the erythrocytes are physically removed. For this reason, when blood is filtered, there is a problem that the blood permeation rate is gradually reduced and analysis takes time. Further, since the membrane filter has water absorption or water retention, there is a problem that a larger amount of blood must be collected than necessary.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention forms a layer in which a cation exchange material and an anion exchange material are alternately laminated on the surface of the substrate, thereby positively charging the surface of the substrate with the anion exchange material. In addition, the blood is spread on the surface, and the red blood cells that are negatively charged are ion-bonded to the anion exchange material, whereby the red blood cells are separated and removed from the blood.
[0006]
According to this, since the red blood cells are chemically separated and removed, the problem of clogging does not occur. In addition, blood does not penetrate into the substrate, and the water retention capacity of the ion exchange material layer is so small that it cannot be compared with the membrane filter, so that the amount of blood collected can be reduced compared to the membrane filter. The analysis is performed using blood after red blood cells are bound to the anion exchange material, and the blood on the surface can be guided to the reagent region and reacted.
[0007]
Here, if the cation exchange material and the anion exchange material are alternately laminated on the surface of the substrate on which the flow path is formed and the inner wall of the capillary tube so that the blood can flow easily, the blood flows as the blood flows. Since the red blood cells are ion-bonded on the upstream side, red blood cells can be separated and removed on the downstream side. If a reagent region is formed in advance on the downstream side, analysis can be performed.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, an embodiment of the invention described in claim 1 of the present invention will be described with reference to FIGS.
[0009]
FIG. 1 is a conceptual diagram showing the operating principle of the separation and removal method of the present invention, and schematically shows a state in which a cation exchange material 3 and an anion exchange material 2 are alternately laminated on a glass substrate 4 as a substrate. ing. The surface of the glass substrate 4 is previously charged positively by silane and hydrochloric acid treatment, the surface of the cation exchange material 3 is negatively charged, and the surface of the anion exchange material is positively charged. Reference numeral 1 denotes blood red blood cells dropped on the surface of the glass substrate 4, and the surface is negatively charged.
[0010]
Here, a method of chemically modifying so that positive ions are exposed on the surface of the glass substrate 4 will be specifically described. First, the glass substrate is immersed in 5 percent 3-aminopropyltriethoxylsilane, and then immersed in 1N hydrochloric acid to positively charge the substrate surface.
[0011]
Next, by immersing the positively charged glass substrate in a 3 mg / ml solution of polystyrene sulfonic acid (hereinafter abbreviated as PSS), a layer of PSS as the cation exchange material 3 is formed by ionic bonding. The surface is negatively charged.
[0012]
Finally, the glass substrate is immersed in a 1.5 mg / ml solution of polyethyleneimine (hereinafter abbreviated as PEI), so that the PEI layer as the anion exchange material 2 is formed on the surface of the cation exchange material 3. Ionically bonded to the surface of As a result, chemical modification can be performed so that cations are exposed on the outer surface, that is, the outer surface of the substrate is positively charged.
[0013]
The reason why the cation exchange material and the anion exchange material are alternately laminated as described above is that the substrate surface can be stably and uniformly positively charged. Compared to this, the surface of the glass substrate that is simply immersed in hydrochloric acid after silane treatment and positively charged or only an anion exchange material is formed on the glass substrate has a stable and uniform positively charged surface. Cannot be held.
[0014]
FIG. 2 shows red blood cell binding ability when the glass substrate of FIG. 1 is used and immersed in blood diluted with physiological saline. FIG. 2 shows the number of red blood cells bound per 1 cm ² , and the number was measured under a microscope. As a comparative example, an unmodified glass substrate was compared with Comparative Example 1, a glass substrate subjected to the above silane treatment was compared with Comparative Example 2, a glass substrate subjected to hydrochloric acid treatment was further compared with Comparative Example 3, and a glass substrate subjected to PSS treatment was compared. Shown as Example 4.
[0015]
Each modified glass substrate was immersed in 3 ml of a solution prepared by diluting blood with physiological saline so that the number of red blood cells was 3 × 10 ⁷ per ml, and the number of red blood cells bound was measured.
[0016]
In the case of the glass substrate of the present embodiment, approximately 5000 erythrocytes are bound per 1 cm ² of the substrate, whereas in Comparative Examples 1 and 4, the binding capacity is one-tenth or less. This is an effect of only physical adsorption of erythrocytes on a glass substrate, and stability and reproducibility are poor. Comparative Examples 2 and 3 show some binding ability as compared with Comparative Examples 1 and 4, but this is derived from the amino group of the silane compound and depends on the state of ion dissociation. Reproducibility is poor.
[0017]
In addition, when the PSS layer is formed again on the PEI layer shown in this embodiment, the red blood cell binding ability is reduced to 1/10 or less. When the PEI layer is formed again on this PSS layer, the red blood cell binding ability is restored to the original. That is, the positive charge of PEI plays a crucial role in red blood cell binding.
[0018]
As described above, in the glass substrate shown in the present embodiment, if red blood cells are adsorbed on the surface of the glass substrate by ion bonding, the upper layer of blood becomes blood from which red blood cells have been separated and removed. Analysis can be performed.
[0019]
(Embodiment 2)
FIG. 3 shows an embodiment in which blood from which red blood cells are separated and removed can be easily analyzed by forming a flow path for moving blood on a substrate.
[0020]
In the analysis apparatus of FIG. 3, the surface of the silicon substrate 10 holds a capillary channel 12 by a semiconductor processing technique, a sample inlet 11 for receiving blood necessary for analysis, and blood from which red blood cells have been separated and removed. A sample reaction unit 13 is formed. The donor introduction port 11 and the sample reaction unit 13 are connected by a groove in the flow path 12.
[0021]
An enzyme and an enzyme reaction detection reagent are spotted on the sample reaction unit 13. For example, if glucose oxidase, peroxidase, O-dianisidine, etc. are spotted on the specimen reaction part, glucose in blood can be detected spectroscopically.
[0022]
Then, the ion exchange material is prepared in the flow path 12 as described in the first embodiment. Then, the glass substrate 9 for covering the surface of the silicon substrate 10 is bonded to the surface of the silicon substrate 10 by a method such as anodic bonding, and the lid is covered. The glass substrate 9 is opened with the sample inlet 11 and the sample reaction part 13. According to such a method, red blood cells can be easily separated and removed as blood flows through the flow path 12, and the separated plasma or serum sample is collected in the sample reaction unit 13 and can be analyzed simultaneously. There is sex.
[0023]
(Embodiment 3)
FIG. 4 shows a state of separation and removal when the inside of the glass tube 5 having an inner diameter of 50 μm and a length of 70 mm is chemically modified as in the first embodiment and the blood is developed. In the figure, 8 is the dropped blood, and when the lower end of the glass tube 5 is attached to this blood 8, the blood rises in the glass tube 5 by capillary action, and when it is developed 50 mm, red blood cells and plasma or serum. Start separation with.
[0024]
7 indicates red blood cells adsorbed on the inner wall of the glass tube by ionic bonding, and 6 indicates blood separated and removed. Spectral analysis and the like can be performed by using the blood of these six portions. If a reaction reagent or the like is applied to the area indicated by 6, it is convenient that the color development reaction in this area can be easily measured.
[0025]
In the above description of the first to third embodiments, an example in which PSS is used as the cation exchange material has been described, but in addition, a salt of PSS, polyaniline propanesulfonic acid and its salt, polyaspartic acid and its salt, poly Glutamic acid and its salts can be used as well. Although the example using PEI as an anion exchange material has been described, other methods can be similarly applied to polyallylamine and its hydrochloride, polydimethyldiallylammonium chloride, polylysine and its salt, polyarginine and its salt.
[0026]
The concentration of each ion exchange material, the number of laminations, and the substrate to be laminated are examples of implementation, and the concentration, the number of laminations and the substrate are not limited, and can be modified according to the purpose. For example, an enzyme or an antibody is inserted in a sandwich between a cation exchange material and an anion exchange material (for example, Biotechnology and Bioengineering vol.51 P163-167 1996), and blood is moving along the flow path. It is also possible to carry out an enzyme or antibody reaction and to remove impurities other than red blood cells in the blood. For example, by inserting ascorbic acid oxidase or bilirubin oxidase, it is possible to remove ascorbic acid and bilirubin mixed in blood.
[0027]
In the above embodiment, an example in which glass or silicon is used as the substrate has been described. However, plastic resin can also be used as the substrate.
[0028]
【The invention's effect】
As described above, the present invention separates and removes negatively charged red blood cells by alternately laminating the cation exchange material and the anion exchange material on the surface of the substrate and charging the surface positively. It is what I did. According to this, there is no problem of clogging of the membrane filter and the problem of the amount of blood, and erythrocytes can be immediately adsorbed on the surface of the substrate by ionic bonding and can be quickly separated and removed.
[0029]
In addition, if the cation exchange material and the anion exchange material are alternately laminated in this way, the performance can be maintained stably and uniformly, and blood can be moved by utilizing capillary action. Then, there is a convenience that the red blood cells can be automatically separated and analyzed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for separating and removing red blood cells in an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a measurement of the number of red blood cells bound to a glass substrate subjected to a modification treatment of an ion exchange material in an embodiment of the present invention. FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of a blood analyzer that can be produced based on the embodiment of the present invention. FIG. 4 is a schematic diagram showing a method for separating and removing red blood cells using capillary action in the embodiment of the present invention. Figure [Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Red blood cell 2 Anion exchange material 3 Cation exchange material 4 Glass substrate 5 Glass capillary 6 Plasma or serum isolate | separated by the expansion | deployment of blood 7 Red blood cell 8 couple | bonded with the inner surface of a glass tube 9 Blood substrate for expansion 9 Glass substrate 10 Silicon substrate 11 Sample Inlet 12 Channel 13 Sample reaction part

Claims

The blood is spread on the substrate in a state where the cation exchange material and the anion exchange material are alternately laminated on the substrate, and the surface of the substrate is positively charged in advance, and the blood is negatively charged. A blood analysis method in which red blood cells are separated and removed from blood by ion-bonding the red blood cells to the surface of the substrate, and the separated and removed blood is optically analyzed.

A cation exchange material and an anion exchange material are alternately stacked on a substrate on which a blood channel is formed, and a substrate is provided to cover the surface of the substrate on which the channel is formed, and blood flows through the channel. The blood analysis method is such that blood is analyzed by ion-bonding red blood cells on the upstream side of the flow path and collecting blood from which the red blood cells have been separated and removed on the downstream side.

By laminating the cation exchange material and the anion exchange material alternately on the inner wall of the rod-like capillary tube, the surface of the inner wall is charged positive in advance, and the blood is moved in the capillary tube to make it negative. A blood analysis method in which charged erythrocytes are ion-bonded on the upstream side of the capillary flow to obtain blood from which erythrocytes are separated and removed on the downstream side, and the blood is analyzed.