JP4143536B2 - 電気泳動用分離媒体、および方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、化合物の電気泳動による分離および解析に関し、そしてさらに具体的には、化合物の分離のための媒体に関する。

生物学的化合物および他の化合物の解析は、多くの場合、高分子の分離から開始する。キャピラリー電気泳動は高分子の分離に有用なツールであることが証明されており、高分子のさらなる解析または単離が可能である。化合物は、大きさ、電荷、錯化剤に対する親和性などによって分離することができる。

キャピラリー電気泳動システムは、種々の利点を示す。第一に、キャピラリー電気泳動による分離に必要なサンプル容積消費が少ないので、サンプル解析の費用を軽減する。第二に、キャピラリー次元マイクロチャネルの特徴である、表面積対体積率（surface to volume ratio）が高いことによって、効率的な熱放散が可能である。キャピラリーで得られる低いジュール加熱によって、分離において、より大きい電圧を用いることが可能になる。より高い電圧を用いて、より迅速に分離させて、バンド幅（bandspreading）からの拡散を緩和させる。第三に、キャピラリー電気泳動システムは、ハイスループットサンプル処理に容易に適用可能である。ゲノム情報の急速な増加によって、核酸およびサンプルの迅速な解析の必要性は、ますます急を要するものになっている。キャピラリー電気泳動システムは、サンプル処理能力を増大させるための多重化に容易に適応させることができる。キャピラリー次元のマイクロチャネルは、マイクロチャネルのアレイ（例えば、キャピラリーアレイ電気泳動システム（CAEシステム）における一群のキャピラリーチューブ）として設計されても、または電気泳動チップ上の複数のレーンとして設計されてもよい。さらに、検出器によって別々に検出することができ多数の検出標識の使用によって、第二レベルの多重化が可能になり、さらに処理能力を増大させることができる。最後に、サンプルプールの種々の構成によって、別のレベルの多重化が可能である。

キャピラリー電気泳動は、分離媒体が充填されているマイクロチャネル（一般には、キャピラリーチューブ次元）を必要とする。サンプルをマイクロチャネルの一端に導入して、このチャネルの全長にわたって移動させた後、反対の末端で検出する。この分離媒体は電解質緩衝液を含み、これによって陽極から陰極へと電流を流すことができる。キャピラリー電気泳動の1つの一般的な方法では、この分離媒体に含まれるポリマーは、生体分子の分離のための篩（シーブ）として働く。生体分子の動きは、シービングマトリックス（sieving matrix）によって阻害される。ここでは、低分子ほど、摩擦に打ち勝つことができ、そしてより大きい分子よりもマトリックスをより素早く通過できる。

米国特許第4,865,706号は、荷電した分子の分離のための分子篩剤として、架橋されたポリアクリルアミドゲルの使用を開示している。キャピラリーの内側壁は、結合剤による共有結合により修飾される。代表的には、架橋された分離マトリックスの重合は、キャピラリーチューブの内側で生じる。モノマーおよび架橋剤の混合物を、キャピラリーに注入して、触媒的に重合型に転化させる。これは、泡の不完全な重合形成、およびゲルの均一性の欠失を生じる可能性がある。この問題は架橋した分離マトリックスの主要な欠点を示す。別の欠点は、架橋されたゲルを除去することが困難であることである。

米国特許第5,089,111号；同第5,374,527号、および同第5,370,777号は、直鎖状ポリマーのエンタングルされた（entangled）溶液からなる交換式のマトリックスによる、CEマトリックス技術の大きな改善を記載している。架橋されたゲルよりは堅くないが、エンタングルされたマトリックスにおける動的細孔の網目状構造によって、生体分子の分離のための同等の媒体が提供される。エンタングルされたポリマー媒体の主な利点は、キャピラリーの外側での調製であり、これによって、このマトリックスの高い均一性が得られる。別の重要な利点は、高圧を用いた各々の泳動後、キャピラリーにおいて、このマトリックスを置換する性能であり、これにより泳動と泳動との再現性が増大する。

種々のポリマーが、荷電した生体分子の分離のためのエンタングルされた媒体として提唱されている。米国特許第5,567,292号は、電気浸透流の抑制のため、およびコーティングしていないキャピラリー中での約100〜500ヌクレオチドの大きさの範囲のポリヌクレオチドの分離のためのマトリックスとしての両方について、ポリマーの使用を提唱している。分離化合物は水溶性であり、6〜9のpHの液体媒体中では荷電した基を有さず、5×10³〜1×10⁶ダルトンの分子量、および0.001〜10％の濃度を有する。これらの分離媒体としては、ポリラクタム（例えば、ポリビニルピロリドン）、および置換されたポリアクリルアミド誘導体が挙げられる。

これらのタイプの媒体を用いると、約100〜1000塩基の長さの範囲のオリゴヌクレオチドの分離には、一塩基についてのエンタングルメント（entanglement）が必要条件である。

エンタングルされた媒体の粘性は、キャピラリーへのマトリックスの高圧の導入を必要とする。さらに、サンプルの電気運動的な多数回の注入を利用する新しく開発されたCE法、は、古典的なエンタングルされたマトリックスと適合していない。多数回の注入に必要な多数回のサンプルロード、および電流の遮断は、エンタングルされたマトリックスを分解すると考えられる。エンタングルされたマトリックスの主な特徴は、比較的高い分子量のシービングポリマーによる高い篩い分け能力である。しかし、この特徴は、単一ヌクレオチド多型（一塩基変異多型）（SNP）タイピングにおいて生じるような、小さいオリゴヌクレオチドの分離には必要ではない。SNPタイピングのためのアッセイ（例えば、単一ヌクレオチドプライマー伸長（SNuPE）、マイクロシーケンシング、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ（OLA））は、小さいオリゴヌクレオチドフラグメント（100塩基、またはそれ以下）を生成する。高圧充填、およびサンプル詰め込みに起因するマトリックス不均質性の要件を回避するため、小さいオリゴヌクレオチドフラグメントの高速での分離および高い分解能を提供する、別の分離媒体が所望される。

1993年に、小さいイオン性化合物の分離に用いられる改良型フリーゾーン（free-zone）CEが開発された。この方法では、限外希釈直鎖状ポリマーを、CE緩衝電解質に添加する。これらのポリマー性添加物は、分離のためのシュードフェーズ（pseudo-phase）として作用する。篩い分け（シービング）とは対照的に、シュードフェーズは、水素結合、疎水性相互作用、立体相互作用、および双極子間相互作用を通じてサンプル混合物の分離をもたらす。しかし、現在まで、シュードフェーズによる分離のためのこれらのポリマーの使用は、かなり限定されている。1例では、高分子ポリビニルピロリドン［PVP］は、低濃度で、トリプトファンのジアステレオマー誘導体のキャピラリー電気泳動による分離のための緩衝液添加物として用いられた。Schutzner，ら、J. Crhromatogr. 639（1993）375〜378。同様の様式で、アゾ色素化合物の電気泳動による分離のために、ポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンの組み合わせが、固有の疎水性に基づいて用いられた。Blatnyら、J. Chromatogr. 717（1995）157〜166。同様の高分子PVPマトリックスが、ヌクレオチド付加物の分離に適用された（Barryら）。これらの研究によって、PVPが、疎水性に修飾されたオリゴマーの分離のためのシュードフェーズ（pseudophase）として使用可能であることが最初に示された。

CEにおいて最も頻繁に用いられる検出技術の1つは、レーザー誘導性蛍光である。DNAは、自然な状態では蛍光を示さないので、通常は、合成色素を各々のDNA分子の５’末端に導入する。最も蛍光性の色素としては、PI電極の励起、およびそれに続く蛍光の放出を可能にする、芳香環が挙げられる。本来、芳香環は、固有の疎水性を示し、これは、PVPのシュードフェーズマトリックスとの相互作用のために直接利用することができ、これによって、クロマトグラフィーのような分離を行うことができる。

分離マトリックス、およびそれに付随する分離マトリックスを用いる方法を提供することが本発明の目的である。これによって、小さい、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドフラグメント（10〜100塩基のフラグメント）の1塩基対の解析を得ることができる。

高い解像度を示す、粘性の低い分離媒体を提供することが、さらなる目的である。このような媒体は、低圧窒素充填によってキャピラリーに導入することができる。

複合重合は必要ではなく、かつ篩い分けのようなエンタングルメント特性を示さない分離媒体を提供することが、本発明のさらなる目的である。優れたピーク間隔（分離選択性を示す）およびピーク効率を示す、小さいオリゴヌクレオチドフラグメントの分離手順を提供することが、さらなる目的である。

エンタングルされたポリマーマトリックスを含む分離媒体の使用によって可能であるよりも高い電圧を使用することを可能にすることが、さらなる目的である。

低分子化合物を含有するサンプルの分離のために、多数回の注入手順に用いることができるCE媒体を提供することがさらなる目的である。

（発明の要旨）
上記の目的は、マイクロチャネル電気泳動調製システムにおける分離媒体としての使用のための、低分子（MN＝10,000〜40,000）の非エンタングルポリビニルピロリドンの使用により達成された。この非毒性の媒体によって、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのような、疎水性特性を有する化合物の分離のための低コストのツールが提供される。非エンタングル分離媒体の低い粘性は、マイクロチャネルの充填を簡単にする。この分離媒体の使用は、単一のキャピラリーチューブへの多数のサンプルの多数回の時間間隔を空けた注入を可能にするシステムでの使用に特に有用である。なぜなら、非エンタングル媒体は、サンプルの移動に影響されず、従って分離混合物の多数回のロードに耐えることができるからである。サンプル注入の時間間隔は、サンプルが注入器に達したときに、各々のサンプルセットが検出可能に分離されるのに十分な間隔である。これによって、単一ヌクレオチド多型（SNP）のスクリーニング、オリゴヌクレオチドの品質管理（quality control）（QC）、および他の関連するオリゴヌクレオチドアッセイのような、高い処理能力のサンプル解析の方法が得られる。

図1Aは、PVP濃度の関数として粘度のプロットである（PVP MN＝40,000）。 図1Bは、ポリビニルピロリドン、および蛍光標識（FAM）の化学構造式である。 図2Aは、分離媒体として直鎖状ポリアクリルアミドを用いる小さいオリゴヌクレオチドフラグメントの分離の電気泳動図である。 図2Bは、図2Aで分離されたものと同じ化合物の分離の電気泳動図であって、ここでは、分離媒体として非エンタングルポリビニルピロリドンを用いた、電気泳動図である。 図3Aは、6kV、および12kVで、分離媒体としてPVPを用いたピーク形状の例示である。 図3Bは、3つのオリゴヌクレオチドフラグメントについて得られた、泳動電圧の増大に伴う、ピーク効率の増大のグラフである。

（発明の詳細な説明）
CEにおいて、高分子量ポリビニルピロリドン（Mn＝1,000，000）は、生体高分子のためのエンタングルされたマトリックスとして用いられている。エンタングルされたマトリックスとして用いる場合、PVPは、一般に、比較的大きい荷電した化合物（例えば、100bp以上のオリゴヌクレオチド）の分離に限定される。本発明においては、短いオリゴヌクレオチド上の蛍光標識（それらの蛍光検出のために設計された）の存在を分離のために利用する。この分離は、低分子PVP（Mn＝10,000〜40,000）の溶液との相互作用から得られる。疎水性標識は、このフェーズとの接触の位置を表す。小さいフラグメントについては、この標識は、大きさのより重要な部分を構成し、従って、その移動は、相互作用によってより大きく影響される。結果として、分離機構は、篩い分けと反対であって、ここでは、より大きい化合物を最初に溶出し、小さい化合物を最後に溶出する。低分子PVPによって、高濃度の、非エンタングルの低粘度PVP溶液（10％（w/v）まで）の調製物が可能になり、これは、単位容積あたり相互作用するビニルピロリドンの数がより多いことを示しており、そして、分離力を有意に増大する。この媒体は、特に、11〜30塩基長のフラグメントの分離に適切である。分離媒体の低い粘度によって、低圧下でキャピラリーを充填し、かつ空にすることが可能になる。高圧充填の必要性がなければ、マイクロチャネル充填システムは、高圧密閉として設計される必要はない。

非エンタングルPVPの使用は、低粘度という利点を有する。図１Aに関しては、溶液の粘度を、PVP濃度の関数としてプロットする。この実施例では、PVP（Mn＝40,000）を用いた。エンタングルメント閾値Φを、溶液粘度の顕著な増大を示す勾配の変化位置として規定する。この実施例では、PVP（Mn＝40,000）について、Φは１１.４％である。この濃度より上では、粘度は、急速な増大を示す。Φ濃度は、PVPの分子量および温度にともなって、変化する。

背景に示したように、シュードフェーズ分離アッセイは、エンタングル分離マトリックスを必要としない。その代わり、この化合物は、分離媒体との化学的相互作用に基づいて分離される。このような相互作用は、疎水性相互作用であっても、水素結合であっても、双極子間の相互作用であってもよい。本発明の分離媒体においては、小さい核酸フラグメントは複数の芳香環を有する少なくとも1つの化合物によって各々標識する。これらの複数の芳香環は、PVP媒体上に存在する環状アミドと相互作用すると考えられる。この相互作用は、核酸分子の泳動を遅らせる。核酸分子が大きいほど、分子の大きさのうち標識化合物からなる割合は小さくなる。対照的に、オリゴヌクレオチドフラグメントが小さいほど、分子のうち標識化合物である割合は、大きくなる。結果として、フラグメントが小さいほど、その移動度が分離媒体との相互作用の際により大きく影響され、結果として溶出時間がより長くなる。対照的に、フラグメントが大きいほど、分子のうち標識からなる割合が小さくなり、PVPによる影響が小さくなり、そして比較的早い移動速度を有し、これによって、これらのフラグメントが、より小さいフラグメントの前に検出されることになる。

図1Bに関しては、蛍光標識FAMの構造およびPVPモノマーの構造を示す。FAMの複数の芳香環は、PVP分子の環状アミド環と相互作用すると考えられる。この相互作用は、移動中の荷電した分子の移動を遅らせる。荷電のみに基づいて分子を分離するフリーゾーン電気泳動とは対照的に、荷電した環の間のこの相互作用によって、小さいオリゴヌクレオチドフラグメントの分離のための有利な分離方法が得られる。

FAMのような標識は、当該分野で公知の結合体化方法を用いて、ヌクレオチド塩基に結合体化され得る。標識されたヌクレオチドはまた、分子プローブであるEugene Orのような商業的な供給源から入手することができる。次いで、これらの塩基を、合成反応の間にDNAフラグメント中に組み込むこともできる。記述されたとおり、SnuPE、ローリングサークル（rolling circle）増幅、リガーゼ増幅、マイクロシーケンシング、および他のアッセイは、核の解析に用いることができ、小さいDNAフラグメントを生じることができる。単一ヌクレオチド多型解析において、このアッセイは、単一ヌクレオチド位置におけるDNA配列のバリエーションを決定しようとするものである。このような解析については、解析のための小さいフラグメントの生成Ga効率的な分析的方法を可能にする。

非エンタングルPVPは、種々のマイクロチャネル電気泳動分離システムに用いることができる。「マイクロチャネル（microchannel）」、および「キャピラリー（capillary）」という用語は、互換的に用いられ、そして広義には、電気泳動が行われる、細長いチャネルをいう。このチャネルは、内部の断面を有するが、この内部断面は、円形であっても、長方形であっても、正方形であってもよく、または他の形状でもよい。このチャネルは、チューブの内孔中にあってもよいし、またはプレート、チップ、もしくは他の基板中のチャネル、もしくは溝（グルーブ）であってもよい。このようなチャネルは、小立方体に切ること（dicing）、エッチング、鋳型成形（cast molding）、または他の公知の製造法によって製造することができる。これらのチャネルの全ての特徴は、分離媒体に接触する表面の表面積対体積率が高いことであり、これによって電気泳動による分離手順の間の効率的な熱放散が得られる。マイクロチャネルは、シリカ、石英、または他の類似の材料から形成されることが好ましい。熱放散はさらに、この材料（これからマイクロチャネルができるだけ小さく製造される）が完全な材料厚を有することによって増強される。

本発明の分離媒体が有用であり得る1つのシステムは、本明細書において全ての目的のために参考として援用される、米国特許第09/556,897号に記載されており、これは、荷電した化合物の電気泳動による分離のためのキャピラリー電気泳動チップ、およびシステムを記載している。このシステムは、基板上にマイクロチャネルの高度に平行なセットを有する分離チップを備える。各々のマイクロチャネルは、各々のマイクロチャネルの個々の操作を可能にするための個々のリードを有する。このシステムはまた、サンプルプレートから各々のマイクロチャネルの個々の開口部へのサンプルの移動のための自動化システムを備える。このシステムにおいては、PVP分離マトリックスを、分離媒体として含むことができる。この媒体によって、マイクロチャネルのロード（loading）および洗浄を簡単にすることができる。エンタングルされた分離マトリックスが用いられる場合、分離チップのマイクロチャネルは、圧力密封によって圧力下で充填され、そしてマイクロチャネルは、高圧洗浄システムを用いて洗浄される。非エンタングルPVP分離マトリックスを用いると、マイクロチャネルのロードおよび洗浄のための高圧洗浄を用いることなく、このマイクロチャネルを充填することができる。

米国特許出願第09/352,281号（本明細書において全ての目的のためにここに援用される）は、マイクロチャネルを用いる別のシステム、および化合物の分離方法（本発明の分離媒体がかなり適切である）を例示する。この参考文献においては、キャピラリーアレイ電気泳動システムが記載されている。このシステムは、現在、Amersham Pharmacia Biotech（Franklin Lakes, New Jersey）の1部門であるMolecular Dynamics, Sunnyvale, CAから、MegaBACE（登録商標）システムとして販売されている。このシステムでは、キャピラリーチューブの高度に平行なセットを、このセットが、96キャピラリー中の平行な分離のために用いられ得るように整列させる。このシステムでは、エンタングルされた分離マトリックスの高圧注入によって、キャピラリーアレイを充填する。サンプルは、このキャピラリー中に電気運動により注入され、そしてこのキャピラリーの末端は、アノードリザーバおよびカソードリザーバと接触させられる。分離手順の後、このキャピラリーから媒体を取り出して、このキャピラリーを分離媒体で再度充填してもよい。本発明の媒体を、このシステムで用いる場合、低圧充填方法を用いてこのキャピラリーを充填することができる。さらに、キャピラリーチューブのクリーニングは簡易化されて、このキャピラリーチューブの内容物を空にするために高圧ポンプを用いる必要はない。

この引用文献はまた、小さいフラグメントサンプルの解析の処理能力を増大するためのシステム、および方法を開示する。この方法では、分離されることになる複数の低分子化合物を含有する第一のサンプルを、最初にマイクロチャネルに注入して、選択された間隔で、電気泳動用電流に曝した。この電流は、このキャピラリーの注入末端からサンプルを移動させて、この注入末端から遠位の位置にあるマイクロチャネル上の検出領域に向かわせる。選択された間隔の後、多重のサンプルフラグメントを含有する第二のサンプルを、各々のキャピラリーに注入する。この注入のタイミング（すなわち、各々の注入の間の間隔）は、この化合物がマイクロチャネル（例えば、キャピラリー）上の検出位置に達するときに、化合物の各々の注入されたセットが、化合物のすべての他のセットから検出可能に分離され（すなわち、ピークの重複がない）、そして各々のサンプル内の化合物が検出可能に分離されるように、選択される。注入のこのサイクルは、何回も反復され、ここで各々のサンプル注入後に分離期間が続けられ、ここでサンプル中の化合物が注入末端から移動されて検出位置に向かう。第一のサンプルセットが、検出位置に近接している場合、注入されたサンプルの全てが、検出位置を通過するサンプル中で、各々の化合物として連続して検出される。この多数回の注入方法を用いて、小さいヌクレオチドフラグメントの解析の処理能力を大きく増大することが可能である。

PVP分離媒体は、非エンタングルシュードフェーズとして用いられる場合、直鎖状ポリアクリルアミドよりも安定（これによって、PVPは多数回の注入分離手順のための良好な媒体となる）でなければならない。エンタングルされたマトリックス（例えば、エンタングルされた直鎖状ポリアクリルアミド）の均一性はしばしば、化合物を泳動する衝撃によって影響される。これによって、このマトリックスが、各々の分離手順後に置換されることが必要となる。さらに、頻繁な電圧の遮断はマトリックスエンタングルメントの崩壊を生じやすく、そしてエンタングルされたマトリックスを用いて可能な注入サイクルの総回数が制限される場合がある。緩衝液に溶解された低分子量シュードフェーズ分離ポリマーからなる均一な媒体は、緩衝液の相互作用、または頻繁な電圧の遮断に対する感受性が低いことが期待される。これによって、PVPは、この手順に理想的な媒体となる。

分離媒体としてのPVPの使用は、多数回の注入に有用であることが証明される。一般に、多数回の注入に最適であるサンプルは、低分子からなるサンプルである。100塩基長未満の標識されたオリゴヌクレオチドフラグメントを含むサンプルは、多数回の注入にかなり適しており、10〜30塩基長のフラグメントは、このような注入に最適である。非エンタングルPVPの分離マトリックスとしての使用によって、これらのフラグメント大きさで用いるために特に選択される分離媒体が提供される。

キャピラリーアレイ電気泳動、またはキャピラリーチップ電気泳動のいずれかにおいて、種々の検出器を用いて、検出位置を通過する化合物の移動としてこの化合物が検出できる。多くの核酸解析システムにおいて、共焦点検出器によって、レーザー誘導性蛍光（LIF）を検出する。オリゴヌクレオチドフラグメントを、光学的に検出可能な標識で標識する。分子が、検出位置を通過して移動するにつれて、レーザーイルミネーションビームは、この標識から蛍光を励起させる。この蛍光は、検出ウインドウにおいてキャピラリー内の細い対象の平面から収集されて、検出器に伝達される。光学的検出のこの方法の利点の1つは、この検出器が、標識の特徴的な放射プロフィールに基づいて、異なる標識を同定する能力である。これによって、多重化のさらなる方法が得られ、異なる蛍光プロフィールを有する標識の同時検出が可能になる。

LIF検出に加えて、他の検出方法を本発明の分離媒体を用いる用途に適応することができる。これらとしては、質量分析法、および電気伝導度ゲーティングを用いる検出が挙げられる。これらの検出方法のいずれによっても、分離された荷電した化合物の検出が可能である。いずれの方法においても、分離されている荷電した化合物は、複数の芳香環を有する標識に結合され得る。このことが、サンプル分子のシュードフェーズ分離および種々の検出方法を用いる検出の両方を補助する。

ほとんどの電気泳動の分離方法においては、天然の状態で荷電している化合物を用いてマイクロチャネルの内部表面をマスクするために、いくつかのコーティングを用いる。これによって電気浸透を抑制する。電気浸透は、正に荷電した緩衝液イオンと、分離マイクロチャネルの負に荷電したシリカ表面との相互作用によって生じる分離媒体のバルクフローである。この表面は、内部表面コーティングを形成するために、動的なコーティング、または共有結合による修飾によってマスクすることもできる。1つのコーティングにおいては、薄層のポリアクリルアミドを重合して、高度に粘稠性の層を用いてマイクロチャネルの内側をコーティングする。さらに、他のコーティングが当該分野において公知である。しかし、コーティングされていないキャピラリーもまた使用できると考えられる。PVPは、電気浸透を抑制することが知られている。LidoおよびYoung, Anal. Chem. 70（1998）、第13頁を参照のこと。窒素ガス圧を100psiで用いてキャピラリーを充填した。対照的に、現在のキャピラリーの直鎖状ポリアクリルアミド充填のためには、1000psiまで必要である。

本発明の本明細書の説明は、非エンタングルPVPに限定されているが、任意の疎水性の非エンタングル可溶性ポリマーが、低分子量で、PVPの等価物であり得る。
以下の実施例において、非エンタングルPVPマトリックスの使用を説明する。

（分離媒体の調製）
分離媒体を、水500ml中に3.03gのTRIS、6.08gのTAPS、および0.45gのEDTAを溶解させることによって調製した。この緩衝液に2gのPVP（Mn＝40,000）を添加した。このPVPを、約４時間、ゆっくり撹拌しながら溶解させた。これによって、4.0% PVP（w/v）を含有する50mM Tris-TAPS緩衝液を得た。この濃度では、PVPは、非エンタングル形態であり、そのエンタングルメント閾値よりかなり下である（図１を参照のこと）。

（キャピラリーチューブ充填）
MegaBACE_キャピラリー電気泳動システムのキャピラリーチューブアレイ中のキャピラリーチューブを、上記の分離媒体によって低圧（100psi）で充填した。用いたキャピラリーを、ポリアクリルアミドでコーティングした。

11塩基から30塩基までの範囲の20種のオリゴヌクレオチドを含有するサンプルの分離の電気泳動図を図2A、および2Bに示す。図2Aは、エンタングルポリアクリルアミドマトリックスを含有している50mM Tris-TAPS緩衝液で充填したキャピラリー中の分離を示す。このサンプルを、15秒間10kvで電気運動的に注入した。分離は10kVで行った。この電気泳動図は、ピークがほとんど分離されなかったことを示す。このことは、他の分離システム（ここでは、直鎖状ポリアクリルアミドエンタングルマトリックスでは、この大きさのフラグメントを一塩基分離まで分解することができなかった）と一致する。代わりに、2塩基分離が通常であって、これは、ちょうど1塩基ずつ異なるバンドの重複を生じる。対照的に、図2Bの電気泳動は、非エンタングルPVP分離マトリックスにより検出された強度ピークを示す。この分離では、サンプルを分離するために、非エンタングルPVPを用いた。50mM Tris-TAPS緩衝液中で、4.0% PVP（Mr＝40,000）を用いた。サンプルを15kVで5秒間かけて注入した。次いで、MegaBACE_キャピラリー電気泳動システムを用いて15kvで、このサンプルを分離した。図2Bからの結果は、このピークが、かなり異なっており、これによって11塩基から30塩基までのフラグメントによる全てのピークの同定が可能であることを示す。サンプルが検出位置を通過する順序は、図2A〜図2Bに示す。図2Bのように、PVPを分離マトリックスとして用いると、フラグメントが大きいほど、小さいフラグメントよりも素早く移動する。その反対が、図2Aで用いたようなエンタングルされたマトリックスについてあてはまる。

図2においては、直鎖状ポリアクリルアミドを含有するマイクロチャネルを、PVPを含有しているキャピラリーよりも低い電圧で泳動させた。直鎖状ポリアクリルアミド、または類似の粘稠性シービングマトリックスを、分離媒体として用いると、電圧を上昇させるにつれて、バンドの広がり（band broading）が生じ得る。これによって、分離に用いることができる電圧が制限され、これが分離の速度を拘束する。対照的に、分離媒体として低粘稠性PVPを用いた場合には、バンドの広がりの最大の原因は、縦方向の拡散である。マイクロチャネル中でのサンプルの滞在時間が短くなると、拡散は減少する。PVPによって、より高い電圧の使用が可能になり、これによって、より迅速な移動、より少ない拡散、およびより先鋭な検出ピークが得られる。本実施例では、11塩基から30塩基までのフラグメントのほとんど（ここでは、各々のフラグメントが、単一塩基ずつ異なる）を、MegaBACEを用いて、20分未満で、高い解像度で分離できた。

標準的な蛍光色素を用いた場合、30塩基対のフラグメントが、一塩基分離についての上限であると考えられる。フラグメントが、少なくとも2塩基長ずつ各々分離されることが既知である場合、30塩基より長いフラグメントを含有するフラグメントセットを分離して、さらに検出可能な分解を達成することが可能であり得る。さらに、エネルギー伝達色素を用いる場合、30塩基より長いフラグメントの一塩基分解が可能であるはずである。エネルギー伝達色素は、本実施例で用いた色素よりも疎水性である。これによって、この色素の保持時間が延長され、結果としてより広い分離ウインドウが得られる。

図3Aおよび3Bは、分離のためのより高い電圧の使用によって達成されるさらなる利点を例示する。図3Aに示すように、6kVから12kVへと電圧を増大させることによって、より狭いピークが得られる。より高い電圧では、キャピラリー中で短時間で分離されるほど、化合物は、拡散に供されることが少なく、従ってより狭いピークを生じる。これによって、一塩基ずつ異なるフラグメントを検出する能力が増強される。図3Bは、高い電圧での分離によって生じたピーク効率の改善を説明する。このグラフでは、DNAフラグメントの3つの大きさ全て（11塩基対、20塩基対、および30塩基対）が、電圧の増大に伴って、分離効率の増大を示した。

Claims (9)

1. オリゴヌクレオチドフラグメントの混合物の電気泳動による分離のための方法であって、ここで該混合物は、異なる長さの少なくとも２つのフラグメントを含み、かつ該長さが、１１塩基から３０塩基の間であり、該方法は、以下の工程：
   ａ）１００ｐｓｉ（０．６９ＭＰａ）以下のガス圧でのローディングによって少なくとも１つのマイクロチャネルを分離媒体で充填する工程であって、該分離媒体は、数平均分子量（Ｍｎ）１０，０００〜４０，０００の非エンタングルポリビニルピロリドンを含み、かつ該分離媒体は、エンタングルシービングマトリックスを含まない、工程；
   ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの該混合物を該マイクロチャネルの第一の末端に注入する工程；
   ｃ）該オリゴヌクレオチドフラグメントを該分離媒体を通って移動させるのに十分な電気泳動用電流を、該分離媒体を通して流す工程であって、
   ここで、該分離媒体と該フラグメントとの間の相互作用が、該フラグメントの移動を遅れさせ、ここで、より小さいフラグメントは、より大きいフラグメントよりも強い程度まで遅らされる、工程
   ｄ）該マイクロチャネルの検出位置で、該マイクロチャネルの該注入末端から取り出された分離されたオリゴヌクレオチドフラグメントを検出する工程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、分離された化合物を検出する前記工程が、フラグメントが検出ウインドウを通って移動する際のレーザー誘導性蛍光の検出により行われる、方法。
3. 分離された化合物を検出する前記工程が、質量分析法によって行われる、請求項１に記載の方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマイクロチャネルが、マイクロチャネルのアレイの一部であり、ここで前記（ａ）から（ｄ）までの工程が、マイクロチャネルの該アレイ中の各々のマイクロチャネルで行われる、方法。
5. マイクロチャネルの前記アレイが、キャピラリーチューブアレイである、請求項４に記載の方法。
6. マイクロチャネルの前記アレイが、分離基板によって規定される複数のマイクロチャネルである、請求項４に記載の方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｂ）および（ｃ）が少なくとも２回繰り返され、ここで、各々の注入工程後に電気泳動用電流が一定間隔で流され、その結果、フラグメントの各々の混合物は、該フラグメント各々の混合物が前記検出位置を通過する際に、フラグメントの任意の他の混合物から検出可能に分離される、方法。
8. 請求項１に記載の方法であって、前記マイクロチャネルを充填する前記工程が、該マイクロチャネルの内部表面を処理して電気浸透を阻害する工程を包含する、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記マイクロチャネルを処理して電気浸透を阻害する工程が、該マイクロチャネルの内部表面の共有結合による修飾を包含する、方法。

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