JP4143160B2

JP4143160B2 - Dementia detection reagent

Info

Publication number: JP4143160B2
Application number: JP05912798A
Authority: JP
Inventors: 素樹藤田; 泰三林; 浩二内田; 雄志松尾
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2018-02-25
Also published as: JPH11239500A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、痴呆疾患の鑑別システムに関するものであり、更に詳細には、アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）と脳血管性痴呆（ＶＤ）とを効果的に鑑別するシステムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホグリセリン酸ムターゼ（Phosphoglyceric acid mutase）（ＰＧＡＭということもある：ＥＣ５．４．２．１）は、解糖系酵素の一つで、２，３−ビスホスホグリセリン酸（2,3-bisphosphoglycerate : Glycerate-2,3-P2）の存在下、２−ホスホグリセリン酸（2-phosphoglycerate : Glycerate-2-P）と３−ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate : Glycerate-3-P）の相互交換を触媒する。
【０００３】
哺乳動物にはＰＧＡＭをコードする遺伝子が二つ存在する。Ｍサブユニット（分子量約３万）の遺伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これらの組織ではＭＭホモダイマー（Ｍ型ＰＧＡＭ、Ｍ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＭＭ、ＰＧＡＭ−Ｍ又はＭ型アイソザイムともいう）が存在する。Ｂサブユニット（分子量約３万）の遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤血球で発現され、これらの組織ではＢＢホモダイマー（Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｂ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＢＢ、ＰＧＡＭ−Ｂ又はＢ型アイソザイムともいう）が存在する。従って、Ｍ型ＰＧＡＭは筋肉特異的アイソザイムに、またＢ型ＰＧＡＭは非筋肉型あるいは脳型アイソザイムに分類される。ＭおよびＢの両サブユニットの遺伝子は心筋で特異的に発現されており、この組織ではＢ型およびＭ型ＰＧＡＭに加えてＭＢヘテロダイマー（ＭＢ型ＰＧＡＭ、ＭＢ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＭＢ又はＭＢ型アイソザイムともいう）も存在する。
【０００４】
YatesらはＰＧＡＭアイソザイムを分別定量できるisoelectric focusingを使って、正常血漿中のＰＧＡＭ活性が専らＢ型アイソザイムに由来することを示した。また、Markertは正常ヒト胎児および成人の脳では、主にＰＧＡＭのＢ型アイソザイムが存在するが、脳腫瘍組織ではＭＢ型およびＭ型アイソザイムが認められ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関すること、それに対して筋肉特異的酵素であるクレアチンキナーゼ（Creatine kinase:CK）ではそのような変化は認められないことを示した。しかし、これまで、血清中のＰＧＡＭアイソザイムの変動と各種脳性疾患病態との関連についてはあまり調べられておらず、本発明者らが先に特許出願したＢ型ＰＧＡＭの脳卒中マーカーとしての利用が報告されている程度である（特開平８−３２２５９５）。また、痴呆症との関連についての報告もなく、ましてやＤＡＴとＶＤとの鑑別に至っては全く何も知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
どの疾患においても正確にして迅速な診断が不可欠であるが、特に痴呆症においては、ＤＡＴとＶＤとではその治療法を大きく異にするため、これらの正確にして迅速且つ簡便な早期鑑別システムの開発が強く求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した当業界の要望に応える目的でなされたものであって、ＤＡＴとＶＤとを鑑別する方法を求めて各方面から研究した結果、ＰＧＡＭが有用であることをはじめてつきとめただけでなく、血中のＰＧＡＭを測定することによりＤＡＴとＶＤとの鑑別が可能であることもはじめて発見した。
【０００７】
鑑別マーカーの測定にあたり、血清等の血液サンプルを試料として使用できることは、細胞等を試料としなければならない場合に比して、採取、取扱い、測定の面できわめてすぐれていることにほかならないし、そのうえ、血中の全ＰＧＡＭの測定のほか、ＰＧＡＭアイソザイムの内、血中の主成分であるＢ型アイソザイムを測定することにより両者の鑑別が可能であること、換言すれば、全ＰＧＡＭにかえて血中のＢ型ＰＧＡＭを測定すれば両者の鑑別が可能であることもはじめて見出し、これらの有用新知見に基づき、遂に本発明の完成に至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明者らは、ＰＧＡＭ（全ＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ）がＤＡＴとＶＤの鑑別マーカーとして有用であることをはじめて明らかにしただけでなく、血液サンプル中のＰＧＡＭを測定することにより両者の鑑別が可能であること、なかんずく、全ＰＧＡＭはもとより、血液中のＢ型ＰＧＡＭを測定するだけで充分両者の鑑別が可能であることもつきとめた。そして更に、両者鑑別のためのＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭの測定方法として、本発明者らが先に開発した方法（特開平８−３２２５９５）が適用可能なことも確認して、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明を詳しく説明する。
【０００９】
本発明に係るＰＧＡＭの測定方法を、先ず、血中の主成分であるＢ型アイソザイムについて述べる。Ｂ型ＰＧＡＭを測定する方法は、血清等の血液サンプルをＰＧＡＭ阻害剤によって処理し、特定のアイソザイムを失活せしめた後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することからなるものである。例えばＰＧＡＭ阻害剤として四チオン酸を用いた場合、Ｍ型アイソザイムはほぼ１００％失活し、ＭＢ型は約５０％失活し、Ｂ型はほとんど失活しない。したがって、血清に四チオン酸を添加してＭ型アイソザイムを失活させた後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することにより、Ｂ型アイソザイムを分別定量することができるのである。
【００１０】
なお、ＰＧＡＭの精製アイソザイムを用いた阻害実験によれば、四チオン酸処理によってＭＢ型は５０％しか失活せず、５０％は活性が残存するが、現実において、正常血清及び脳組織のＰＧＡＭ活性のほとんどは、Ｂ型アイソザイムによるものであるので、ＭＢ型アイソザイムの残存活性は、生体サンプルにおけるＤＡＴとＶＤの鑑別を行う場合においては、これを無視することができることが確認されるとともに、Ｂ型ＰＧＡＭ値と全ＰＧＡＭ値とは、両者の鑑別を行うにおいて、実質的な差異がないこと、換言すれば、血液中のＢ型ＰＧＡＭ値を測定しても全ＰＧＡＭ値を測定しても両者の鑑別が可能であることも確認された。
【００１１】
ＰＧＡＭ阻害剤としては、酸化剤、ＳＨ試薬等ＰＧＡＭ又はそのアイソザイムの活性を選択的に阻害しうる物質がすべて使用できる。その非限定例としては、ポリチオン酸及び／又はその誘導体が挙げられる。ポリチオン酸は、三〜六チオン酸がいずれも使用可能であって、その誘導体としてはカリウム塩、ナトリウム塩等が使用可能であり、好適例のひとつとして、四チオン酸カリウムが例示される。
【００１２】
本発明に係る測定方法は、血清等の血液試料に四チオン酸カリウム等の阻害剤を作用させてＰＧＡＭ−Ｍを失活させ（ＰＧＡＭ−ＭＢの活性は上記したように本生体測定系においては無視できる）、残存のＰＧＡＭ−Ｂを測定試薬を用いて測定するものである。
【００１３】
その測定原理は、下記表１に記載したように、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイムの阻害剤である四チオン酸カリウムを用いてＭ型アイソザイムを失活せしめた後、次のようにして活性測定を行うことからなるものである。すなわち、２，３−ビスホスホグリセリン酸（Glycerate-2,3-P2）の存在下、ＰＧＡＭ−Ｂによって、３−ホスホグリセリン酸（Glycerate-3-P）を２−ホスホグリセリン酸（Glycerate-2-P）とし、これをエノラーゼによりＰＥＰとＨ₂Ｏとする。次いでＰＥＰを、ＡＤＰの存在下ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によりピルビン酸（Pyruvate）とＡＴＰとにし、得られたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を作用させ、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ（rate assay）するものである。
【００１４】
【表１】

【００１５】
ＮＡＤＨの減少は市販の測定機器によって容易に測定することができ、ＰＧＡＭ−Ｂが正確に且つ迅速に測定できる（全ＰＧＡＭも同様である）。しかも後述する実施例からも明らかなように、痴呆疾患患者由来の血清サンプル中のＰＧＡＭ値は、ＤＡＴ患者よりもＶＤ患者の方が高く、したがってＰＧＡＭの測定は、ＤＡＴとＶＤとの鑑別にきわめて有効であることが判明し、ＰＧＡＭは両者の鑑別用マーカーとしてきわめて好適であることも実証された。このようなことは従来全く知られておらず、ＰＧＡＭは鑑別用新規マーカーと認められる。
【００１６】
また、本発明によれば、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、ＮＡＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＰＧＡＭ阻害剤（四チオン酸カリウム等：ＰＧＡＭ−Ｂ測定の場合のみ）を含有し、更に必要に応じて、基質、緩衝液を含有したＰＧＡＭ−Ｂ測定試薬を提供することができ、これはＤＡＴとＶＤの鑑別剤として利用することができる。本試薬は、後記実施例に例示したように試薬１及び試薬２としてキットとして市販することも可能である。
【００１７】
以上、ＰＧＡＭ−Ｂの測定について述べたが、全ＰＧＡＭ（単にＰＧＡＭ又はＴ−ＰＧＡＭということもある）も、Ｂ型アイソザイムと同じ行動を示し、Ｔ−ＰＧＡＭもＰＧＡＭ−Ｂと全く同様にＤＡＴとＶＤの鑑別に利用することができる。
【００１８】
Ｔ−ＰＧＡＭの測定方法も、阻害剤を使用しないだけで、他はＢ型アイソザイムの場合と全く同一であって（その測定原理も、表１に示した測定原理の内、阻害剤を使用する（１）を除き、そして（２）のＰＧＡＭ−ＢをＴ−ＰＧＡＭに代えた点を除き、全く同一である）、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ法で測定すればよく、Ｂ型アイソザイムの場合と同様に、Ｔ−ＰＧＡＭの測定もＤＡＴとＶＤの鑑別に利用することができる。この場合は、阻害剤を使用することなく測定することができ、両者の鑑別において有効性が高いものである。
【００１９】
Ｔ−ＰＧＡＭの測定試薬及び同キットについても、阻害剤を使用する点を除き、Ｂ型アイソザイムの場合と全く同一であり、上記した理由と同じ理由により、これ（ら）もＤＡＴとＶＤの鑑別用試薬としてきわめて有効に利用することができる。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２０】
【実施例１】
下記表２の作業手順、条件にしたがい、血清試料について、血中ＰＧＡＭ値を日立７１５０自動分析器を用いて測定した。対象は、アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）患者６８例、血管性痴呆（ＶＤ）患者５４例とし、痴呆の程度や平均年齢には有意差はなかった。検体は、すべて早朝空腹時に採取された。
【００２１】
【表２】

【００２２】
測定試薬としては、下記組成を有する試薬１（Ｒ−１）及び試薬２（Ｒ−２）を用いた。
【００２３】

【００２４】

【００２５】
試薬１（Ｒ−１）２５０μｌと、血清サンプル５μｌを混合し、５分間放置した。次いで試薬２（Ｒ−２）を用いてＰＧＡＭの活性を測定した。
試薬２（Ｒ−２）にはグリセリン酸−３−リン酸（基質）が含まれているので、試薬２を４１μｌ添加することによって反応を開始せしめた（基質スタート）。試薬２の添加から約１．５分後に測定を開始した。
【００２６】
測定には日立７１５０自動分析装置を用い、アッセイコードをＲＡＴＥ−Ａ：３２−３９、測定温度を３７℃に設定し、約１．５分ＮＡＤＨの減少による吸光度Ａ３４０ｎｍの減少を測定した。なお、副波長は４０５ｎｍで測定を行った。
【００２７】
酵素の１単位（１Ｕ：１unit）は、３７℃で１分当りに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量と定義した。実際の測定値は、レートアッセイ値に検量係数（ＫＦＡＣＴＯＲ）を乗じて求めた。得られた結果を図１に示した。
【００２８】
その結果から明らかなように、血中ＰＧＡＭ値はＤＡＴで３７．７±２２．３Ｕ／ｌ、ＶＤは５２．１±３７．６Ｕ／ｌで、両群間に有意差がみられた（Ｐ＜０．０５、ｔ−ｔｅｓｔ）。本発明者らは、健常者５０例並びにルーチン検査が正常範囲内の外来患者２２７例（６〜８９才）のデータから、２２〜６０Ｕ／ｌを正常範囲としている。ＤＡＴでは８例（１２％）が高値、１０例（１４％）が低値であった。一方、ＶＤでは１３例（２４％）が高値を示したが、低値を示したのは１例（２％）のみであって、ＤＡＴに比してＶＤで高値を示した。
【００２９】
上記結果から、血中ＰＧＡＭ値は、両痴呆間に有意差があり、両痴呆疾患の鑑別に利用できることが明らかになり、ＰＧＡＭ値が両者の鑑別用マーカーとして利用できることが立証された。
【００３０】
【実施例２】
四チオン酸カリウムのＰＧＡＭ−Ｂ及びＰＧＡＭ−Ｍに対する影響を自動分析法によって検討した。試料としては、Ｂ型及びＭ型の標準品（いずれもプール血清ベース）を用い、生理食塩水で希釈して１／１〜１／８のサンプルを用意した。これらのサンプルに各種濃度の四チオン酸カリウムを添加し、５分間反応させた後、Ｂ型及びＭ型ＰＧＡＭ量を自動分析法を利用して測定した。
【００３１】
実施例１の試薬を用い、自動分析法によってＰＧＡＭ−Ｂ、ＰＧＡＭ−Ｍ量をそれぞれ測定し、下記表３の結果を得た。その結果から明らかなように、四チオン酸カリウムによってＭ型アイソザイムのみが特異的に失活し、Ｂ型アイソザイムは全く影響されないことが判った。
【００３２】
【表３】

【００３３】
【実施例３】
実施例１で用いた血清試料について、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイム阻害剤として四チオン酸カリウムを用いて、ＰＧＡＭ活性の測定を行った。測定試薬としては、実施例１で使用したＰＧＡＭ活性測定試薬（Ｒ−１）に２．２５ｍＭ（最終濃度１．９ｍＭ）となるように四チオン酸カリウム（分子量３０２．４）を添加溶解し（（Ｒ−１）試薬２２ｍｌに四チオン酸カリウムを１５ｍｇ溶解）、Ｍ型を失活させ、Ｂ型ＰＧＡＭ活性測定試薬を調製した。
【００３４】
試薬１（Ｒ−１）に四チオン酸カリウムを添加溶解した液２５０μｌと、血清サンプル５μｌを混合し、５分間放置した。その間に血清サンプル中のＭ型（及びＭＢ型）ＰＧＡＭが失活、阻害されるので、以下、試薬２（Ｒ−２）を用いてＢ型ＰＧＡＭの活性を測定した。
その結果、Ｔ−ＰＧＡＭの場合と同様に、Ｂ−ＰＧＡＭ値もＤＡＴに比してＶＤの方が高く、Ｂ−ＰＧＡＭが両者の鑑別に利用できることが示された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、ＰＧＡＭ（Ｂ−ＰＧＡＭも同様）を測定することにより、ＤＡＴとＶＤとを迅速且つ正確に鑑別することが可能となってので、両者の正確な早期診断が可能となり、的確な痴呆症の治療を早期から実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）と血管性痴呆（ＶＤ）における血中ＰＧＡＭ濃度を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a system for identifying a dementia disease, and more particularly, to a system for effectively distinguishing between Alzheimer type dementia (DAT) and cerebrovascular dementia (VD).
[0002]
[Prior art]
Phosphoglyceric acid mutase (also referred to as PGAM: EC 5.4.2.1) is one of glycolytic enzymes, and 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-bisphosphoglycerate: Glycerate-2,3-P2) in the presence of 2-phosphoglycerate (Glycerate-2-P) and 3-phosphoglycerate (Glycerate-3-P) To do.
[0003]
There are two genes encoding PGAM in mammals. The gene of M subunit (molecular weight of about 30,000) is expressed in adult skeletal muscle and cardiac muscle, and in these tissues, it is also called MM homodimer (M-type PGAM, M-PGAM, PGAM-MM, PGAM-M or M-type isozyme). ) Exists. The gene of B subunit (molecular weight about 30,000) is expressed in adult brain, liver, kidney and erythrocyte, and in these tissues, BB homodimer (B type PGAM, B-PGAM, PGAM-BB, PGAM-B or B type) Also called isozymes). Therefore, M-type PGAM is classified as a muscle-specific isozyme, and B-type PGAM is classified as a non-muscle type or brain-type isozyme. The genes of both M and B subunits are specifically expressed in the myocardium, and in this tissue, in addition to B-type and M-type PGAM, MB heterodimers (MB-type PGAM, MB-PGAM, PGAM-MB or MB-type) (Also called isozymes).
[0004]
Yates et al. Showed that PGAM activity in normal plasma was exclusively derived from type B isozymes using isoelectric focusing, which can fractionally quantify PGAM isozymes. In addition, in the brain of normal human fetuses and adults, Markert mainly has PGAM type B isozymes, but MB type and M type isozymes are observed in brain tumor tissues, and the expression level correlates with the malignancy of the tumor, In contrast, creatine kinase (CK), a muscle-specific enzyme, showed no such change. However, until now, there has been little research on the relationship between fluctuations in serum PGAM isozymes and various cerebral disease pathologies, and the use of B-type PGAM, which was previously filed by the present inventors as a stroke marker, has been reported. (Japanese Patent Laid-Open No. 8-322595). Moreover, there is no report on the relationship with dementia, and nothing is known about the differentiation between DAT and VD.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An accurate and prompt diagnosis is indispensable for any disease, but especially in dementia, the treatment method differs greatly between DAT and VD. There is a strong demand for development.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention was made for the purpose of meeting the above-mentioned demands of the industry, and as a result of research from various directions for a method for differentiating between DAT and VD, it was the first time that PGAM was useful. It was also discovered for the first time that DAT and VD can be differentiated by measuring PGAM in blood.
[0007]
The ability to use a blood sample such as serum as a sample in the measurement of a differential marker is nothing other than that in terms of collection, handling, and measurement, compared to the case where a cell or the like must be used as a sample. Moreover, in addition to measuring total PGAM in blood, it is possible to distinguish between both by measuring B-type isozyme, which is the main component in blood, in other words, in place of all PGAM. It was also discovered for the first time that B type PGAM in blood can be measured, and based on these useful new findings, the present invention has finally been completed.
[0008]
That is, the present inventors have not only clarified that PGAM (total PGAM, B-type PGAM) is useful as a differential marker between DAT and VD for the first time, but also by measuring PGAM in a blood sample. It has also been found that differentiation is possible, and in particular, it is possible to distinguish between both PGAMs as well as measuring B-type PGAM in blood. Furthermore, as a method for measuring PGAM and B-type PGAM for discrimination between the two, it was confirmed that the method previously developed by the present inventors (JP-A-8-322595) was applicable, and the present invention was completed. It has come.
The present invention will be described in detail below.
[0009]
First, the method for measuring PGAM according to the present invention will be described for type B isozymes, which are the main components in blood. The method of measuring B-type PGAM comprises measuring a residual PGAM activity after treating a blood sample such as serum with a PGAM inhibitor to inactivate a specific isozyme. For example, when tetrathioic acid is used as a PGAM inhibitor, the M type isozyme is almost 100% inactivated, the MB type is inactivated about 50%, and the B type is hardly inactivated. Therefore, after the tetrathionate is added to serum to inactivate the M-type isozyme, the residual PGAM activity is measured, whereby the B-type isozyme can be differentially quantified.
[0010]
In addition, according to the inhibition experiment using purified PGAM isozyme, only 50% of MB type was inactivated by tetrathionic acid treatment, and 50% of the activity remained, but in reality, PGAM of normal serum and brain tissue was used. Since most of the activity is due to the B-type isozyme, it is confirmed that the residual activity of the MB-type isozyme can be ignored when differentiating DAT and VD in biological samples. There is no substantial difference between the type PGAM value and the total PGAM value, in other words, both the B type PGAM value in blood and the total PGAM value are measured. It was also confirmed that discrimination of
[0011]
As the PGAM inhibitor, any substance that can selectively inhibit the activity of PGAM or its isozyme such as an oxidizing agent and SH reagent can be used. Non-limiting examples include polythionic acid and / or derivatives thereof. As the polythionic acid, any of tri to hexathionic acid can be used, and as a derivative thereof, potassium salt, sodium salt or the like can be used, and potassium tetrathionate is exemplified as one of suitable examples.
[0012]
In the measurement method according to the present invention, an inhibitor such as potassium tetrathionate is allowed to act on a blood sample such as serum to inactivate PGAM-M (the activity of PGAM-MB is as described above in this biological measurement system). It can be ignored), and the remaining PGAM-B is measured using a measuring reagent.
[0013]
As shown in Table 1 below, the measurement principle is to inactivate the M-type isozyme using potassium tetrathionate, which is an inhibitor of the M-type PGAM isozyme, and then measure the activity as follows. It consists of That is, in the presence of 2,3-bisphosphoglycerate (Glycerate-2,3-P2), 3-phosphoglycerate (Glycerate-3-P) was converted to 2-phosphoglycerate (Glycerate-2) by PGAM-B. -P), which is converted into PEP and H ₂ O by enolase. Next, PEP is converted to pyruvate and ATP by pyruvate kinase (PK) in the presence of ADP, and lactate dehydrogenase (LDH) is allowed to act on the obtained pyruvate in the presence of NADH, thereby reducing NADH. A rate assay is performed.
[0014]
[Table 1]

[0015]
The reduction in NADH can be easily measured with commercially available measuring instruments, and PGAM-B can be measured accurately and quickly (as is all PGAM). Moreover, as is clear from the examples described later, the PGAM value in the serum sample derived from a patient with dementia is higher in VD patients than in DAT patients. Therefore, the measurement of PGAM is extremely different from DAT and VD. It proved to be effective, and PGAM was proved to be very suitable as a differentiation marker for both. This has never been known so far, and PGAM is recognized as a new marker for differentiation.
[0016]
Further, according to the present invention, it contains enolase, pyruvate kinase (PK), NADH, lactate dehydrogenase (LDH), PGAM inhibitor (potassium tetrathionate, etc .: only for PGAM-B measurement), and further required Accordingly, a PGAM-B measurement reagent containing a substrate and a buffer can be provided, and this can be used as a DAT and VD discrimination agent. This reagent can also be marketed as a kit as Reagent 1 and Reagent 2 as illustrated in the Examples below.
[0017]
The measurement of PGAM-B has been described above. All PGAMs (sometimes simply referred to as PGAM or T-PGAM) also exhibit the same behavior as the B-type isozyme, and T-PGAM and PGAM-B are exactly the same as DAT. It can be used for VD identification.
[0018]
The T-PGAM measurement method is the same as in the case of the B-type isozyme except that an inhibitor is not used (the measurement principle is also the same as the measurement principle shown in Table 1 using an inhibitor). Except for (1) and except that (2) PGAM-B is replaced with T-PGAM), the reduction of NADH may be measured by a rate assay method. Similarly, T-PGAM measurement can also be used to differentiate between DAT and VD. In this case, it can measure without using an inhibitor, and is highly effective in distinguishing both.
[0019]
The T-PGAM measurement reagent and the same kit are the same as in the case of the B-type isozyme except that an inhibitor is used. For the same reason as described above, this is also used to distinguish DAT and VD. It can be used very effectively as a reagent for use.
Examples of the present invention will be described below.
[0020]
[Example 1]
According to the work procedure and conditions shown in Table 2 below, blood PGAM values were measured using a Hitachi 7150 automatic analyzer for serum samples. The subjects were 68 Alzheimer-type dementia (DAT) patients and 54 vascular dementia (VD) patients, and there was no significant difference in the degree of dementia or the average age. All specimens were collected early in the morning on an empty stomach.
[0021]
[Table 2]

[0022]
As the measurement reagent, Reagent 1 (R-1) and Reagent 2 (R-2) having the following composition were used.
[0023]

[0024]

[0025]
Reagent 1 (R-1) 250 μl and serum sample 5 μl were mixed and left for 5 minutes. Subsequently, the activity of PGAM was measured using Reagent 2 (R-2).
Since reagent 2 (R-2) contains glyceric acid-3-phosphate (substrate), 41 μl of reagent 2 was added to start the reaction (substrate start). The measurement started about 1.5 minutes after the addition of reagent 2.
[0026]
Hitachi 7150 automatic analyzer was used for the measurement, the assay code was set to RATE-A: 32-39, the measurement temperature was set to 37 ° C., and the decrease in absorbance A340 nm due to the decrease in NADH was measured for about 1.5 minutes. The subwavelength was measured at 405 nm.
[0027]
One unit of enzyme (1 U: 1 unit) was defined as the amount of enzyme that decreased 1 μmol of NADH per minute at 37 ° C. The actual measured value was obtained by multiplying the rate assay value by a calibration factor (K FACTOR). The obtained results are shown in FIG.
[0028]
As is clear from the results, the blood PGAM value was 37.7 ± 22.3 U / l in DAT and V2.1 was 52.1 ± 37.6 U / l, showing a significant difference between the two groups (P <0.05, t-test). The present inventors set 22-60 U / l as a normal range from data of 50 healthy subjects and 227 outpatients (6-89 years old) whose routine examinations are within the normal range. In DAT, 8 cases (12%) were high and 10 cases (14%) were low. On the other hand, in VD, 13 cases (24%) showed a high value, but only one case (2%) showed a low value, which was higher in VD than DAT.
[0029]
From the above results, it was clarified that the blood PGAM value has a significant difference between both dementias and can be used to differentiate both dementia diseases, and it was proved that the PGAM value can be used as a differentiation marker for both.
[0030]
[Example 2]
The effect of potassium tetrathionate on PGAM-B and PGAM-M was examined by automated analysis. As samples, B-type and M-type standards (both pooled serum bases) were used and diluted with physiological saline to prepare 1/1 to 1/8 samples. Various concentrations of potassium tetrathionate were added to these samples and allowed to react for 5 minutes, and then the amounts of B-type and M-type PGAM were measured using an automatic analysis method.
[0031]
Using the reagent of Example 1, the amounts of PGAM-B and PGAM-M were measured by automatic analysis, and the results shown in Table 3 below were obtained. As is apparent from the results, it was found that only the M-type isozyme was specifically inactivated by potassium tetrathionate, and the B-type isozyme was not affected at all.
[0032]
[Table 3]

[0033]
[Example 3]
The serum sample used in Example 1 was measured for PGAM activity using potassium tetrathionate as an M-type PGAM isozyme inhibitor. As a measurement reagent, potassium tetrathionate (molecular weight 302.4) was added and dissolved in the PGAM activity measurement reagent (R-1) used in Example 1 so as to be 2.25 mM (final concentration 1.9 mM) ( (R-1) 15 mg of potassium tetrathionate was dissolved in 22 ml of the reagent), the M-type was deactivated, and a B-type PGAM activity measuring reagent was prepared.
[0034]
250 μl of a solution in which potassium tetrathionate was added and dissolved in Reagent 1 (R-1) and 5 μl of a serum sample were mixed and allowed to stand for 5 minutes. In the meantime, M-type (and MB-type) PGAM in the serum sample was inactivated and inhibited. Hereinafter, the activity of B-type PGAM was measured using Reagent 2 (R-2).
As a result, as in the case of T-PGAM, the B-PGAM value was higher in VD than in DAT, indicating that B-PGAM can be used to distinguish both.
[0035]
【The invention's effect】
By measuring PGAM (same for B-PGAM) according to the present invention, it becomes possible to distinguish DAT and VD quickly and accurately, enabling accurate early diagnosis of both and accurate dementia. Can be treated from an early stage.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows blood PGAM concentration in Alzheimer type dementia (DAT) and vascular dementia (VD).

Claims

A serum phosphoglycerate mutase (PGAM) or its type B isozyme measurement reagent, which distinguishes Alzheimer-type dementia (DAT) from vascular dementia (VD) .

The reagent according to claim 1, wherein the PGAM measurement reagent contains enolase, pyruvate kinase, NADH, or lactate dehydrogenase.

The reagent according to any one of claims 1 to 2, wherein the B type isozyme measuring reagent contains a PGAM inhibitor.

The reagent according to claim 3, wherein the PGAM inhibitor is polythioic acid, or a potassium salt or a sodium salt thereof.

The reagent according to claim 4, wherein the PGAM inhibitor is a potassium salt and / or a sodium salt of tetrathionic acid.

A method for identifying dementia, characterized in that PGAM in blood after being collected from a human body is measured by a rate assay method using the reagent according to claim 1.

Using reagents and PGAM inhibitor according to any one of claims 1-2, after processing the blood after collecting from a human body, characterized in that, to measure the B-type isozyme of PGAM by the rate assay A method for identifying dementia.

A marker for differentiating dementia, comprising PGAM or its type B isozyme, which distinguishes Alzheimer-type dementia (DAT) from vascular dementia (VD).