JP4140984B2

JP4140984B2 - Drug with differentiation-inducing action

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Publication number: JP4140984B2
Application number: JP35457595A
Authority: JP
Inventors: 仁一井ノ口; 久雄野尻; 守京ケ島
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2015-12-20
Also published as: JPH09169664A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害物質を有効成分とする分化誘導剤に関する。詳細には本発明は、上記阻害物質を投与することによって未分化な状態で異常増殖する細胞の分化を誘導し、一定の寿命を持つ終末分化細胞に分化させて、異常増殖状態からの離脱をはかることを目的とした分化誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞の表面に存在する糖鎖は、構造化学的に多様であるばかりでなく、動物種・臓器種・細胞種によって高い構造特異性がみられる。細胞は、細胞社会における多様な生物学的情報をそれらに対応する特異的なアンテナ分子である糖鎖を介して識別している。しかし、糖鎖構造は、必ずしも静的なものではなく、細胞の発生・分化や、癌化の過程で劇的に変動する。すなわち、動的な側面を持つ。
【０００３】
最近、分化の過程で発現してくる糖鎖が細胞の増殖・分化のシグナルを制御したり、あるいはそれ自身が直接シグナルを形成して細胞の次の運命を決定している可能性が示されてきている。しかも、このような分化段階特異的な糖鎖発現は、サイトカインによって制御されている可能性がある。このことは、細胞は遺伝子の二次的産物（一次産物は糖鎖合成酵素）である糖鎖を介して自分の細胞社会における運命（次の遺伝子発現）を決定していることになる。したがって、糖鎖の発現機構の異常は細胞社会学的統制からの逸脱を誘発することになり、さまざまな疾患の原因を構成することになる。しかし、糖鎖の発現機構の詳細はいぜんとして不明のままである。
【０００４】
最近まで単なる生体膜構造体のひとつと考えられてきたグルコスフィンゴ糖脂質（以下「糖脂質」ということもある。）分子そのものに分化誘導活性などの生物活性が発見されるに及んで「情報伝達系における機能性膜分子」としての姿が明らかになってきた。このような活性は特異的糖鎖構造を介して発揮される。糖鎖は糖転移酵素群やその糖鎖に対応する糖分解酵素のバランスにより作り出される遺伝子の二次的産物で、分子生物学的アプローチが困難であるため直接的な機能解明が遅れていた。糖転移酵素（遺伝子）の発現の変化によってもたらされる糖鎖構造の変化が細胞の増殖・分化の制御機構に「直接的に」関与しているという知見は、外来性の分子（相手の細胞も含む）が認識する細胞マーカーや分化抗原といったどちらかといえば静的な観点より捉えられてきた糖鎖の持つ生理的意義に、新たな見地を提供することになるだろう。しかし、糖鎖を介するシグナル伝達機構の分子レベルでの研究は端緒についたばかりであり、糖鎖の作用ははたして直接的なものか、あるいは間接的なものかは不明であり、その解明が待たれている。
【０００５】
現在、糖脂質の機能を探る手法として最も多く使われているものは、実験系に外から糖脂質を添加するというタイプのものであるが、その場合内因性糖脂質との関連が問題となる。つまり、細胞膜に存在する内因性糖脂質が種々の細胞表面受容体等と既に複合体を形成している中に、さらに糖脂質を添加して導きだされる結果は、内因性糖脂質の真の細胞生理学的意義を常に反映しているとは限らないと考えられる。従って、糖脂質の細胞生理学上に於ける本来の役割を知るためには、内因性糖脂質の生合成を特異的に阻害する方法が必要であった。本発明者等は先に、セラミドのアナログである２−アシルアミノプロパノール誘導体を種々合成しそれらの糖脂質生合成阻害活性を検討した結果、１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）の立体異性体の中でＤ−、またはＤＬ−トレオ体がグルコシルセラミド生合成酵素を特異的に阻害し、グルコシルセラミドを出発物質とする全ての糖脂質の細胞内含量を著しく減少させることを証明した（Ａｄｖ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，２６，１８３−２１３，１９９３）。また、ＰＤＭＰはグルコシルセラミド合成阻害により、グルコシルセラミドの生合成前駆体であるセラミドの細胞内含量を増加させる効果を有するが、近年セラミド分子は、分化、アポトーシスや細胞増殖の抑制に関与している細胞内シグナル伝達系における重要な細胞内情報伝達分子としての証拠が数多く報告されてきている（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，１６，２９４−２９５，１９９５）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
細胞が未分化の状態で異常増殖を呈する病態において、その細胞中には特定の糖脂質分子が正常細胞に比べて異常に発現している。本発明はこのような糖脂質の発現を特異的な生合成阻害剤により抑制することで異常増殖状態から離脱させ、細胞を正常な状態に分化させて細胞の異常増殖に基づく疾患を処置する薬剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の理由から、固形腫瘍等の異常増殖を示す細胞の糖脂質の発現を阻害すること、特に特異的なグルコシルセラミド生合成酵素の阻害剤、例えば特定の２−アシルアミノプロパノール誘導体で抑制することにより、異常増殖細胞の分化を誘導し正常化できるのではないかという仮説を立て、鋭意研究を進めついに本発明を完成した。
本発明は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を有効成分とする分化誘導作用を有する薬剤を提供する。
また、上記において、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤が、一般式〔１〕
【化２】

〔式中、Ｒ^１はアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよびニトロからなる群から選ばれる同一または異なる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、ｎは２〜１６の整数を表す。〕で示される２−アシルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容されるその塩である薬剤を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明はグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を有効成分とする分化誘導作用を有する薬剤（以下、単に「本発明の分化誘導剤」ともいう。）である。ここで「グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤」とはグルコスフィンゴ糖脂質の生体内での合成を阻害する機能を有する物質を全て包含する。また、「グルコスフィンゴ糖脂質」とはグルコシルセラミドとそれを出発物質として生合成されるスフィンゴ糖脂質を意味する。
グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤としては、グルコシルセラミド生合成酵素阻害活性を有する一般式〔１〕で示される２−アシルアミノプロパノール誘導体、好ましくは一般式〔１〕においてＲ^１がフェニル基であり、ｎが８である化合物、すなわち１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以下、ＰＤＭＰという。）が挙げられる。ＰＤＭＰには立体異性体が４種類あるが、上記酵素阻害活性を有するＤ−トレオ−ＰＤＭＰおよびＤＬ−トレオ−ＰＤＭＰが好ましい。また、Ｎ−ブチルガラクトノジリマイシン、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンなどのアザ糖誘導体もグルコシルセラミド生合成阻害活性を有しているので本発明のグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤として使用することができる。
上記一般式〔１〕で示される化合物の薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、蟻酸等の無機酸塩；酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、シュウ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、トリフロオロ酢酸、メタンスルホン酸、ρ−トルエンスルホン酸等の有機酸の塩を挙げることができる。
【０００９】
薬剤
本発明の分化誘導剤は、ヒトを含む哺乳動物の、細胞が未分化な状態で異常増殖を呈することに基づく各種疾患の処置、すなわちこのような疾患の治療、軽減（症状の改善）、維持（悪化防止）または予防を目的とする医薬品として使用することができる。このような疾患としては、良性腫瘍（子宮筋腫など）、悪性固形腫瘍（食道癌、大腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、肝癌等の扁平上皮癌や腺癌など）、脳腫瘍、神経膠腫、腎炎（糸球体腎炎など）、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群、リンパ球増殖性疾患、血管免疫芽細胞性リンパ節症、免疫芽細胞性リンパ節症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、進行性全身性硬化症、多発性筋炎（皮膚筋炎）、シェーグレン症候群、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、強皮症、リウマチ、乾癬、創傷の過形成（肉芽等）などの異常増殖性疾患が例示されるが、本発明はグルコスフィンゴ糖脂質の生合成を阻害することによって細胞の分化を誘導し、処置できる全ての疾患を対象とすることができる。
【００１０】
本発明の分化誘導剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤、例えば一般式〔１〕で示される２−アシルアミノプロパノール誘導体または薬学的に許容されるその塩、あるいは必要により薬学的に許容される公知の担体、賦形剤、その他の添加物とともに、目的に応じて経口的あるいは非経口的投与に適した製剤とすることができる。さらに公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
【００１１】
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、又はステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、ヒドロキシプロピルセルロース、酸化チタン、ゼラチン、白糖等を用いて糖衣錠とすることもできる。さらに、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、酢酸フタル酸セルロース等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に溶解し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グリセリン等の甘味剤とグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビヤゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム、レシチン、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリエチレングリコール等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることもできる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。
【００１２】
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、必要に応じ、塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム等のｐＨ調整剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過または加熱蒸気滅菌（オートクレーブ）した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール等の糖アルコール、デキストラン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、レシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、マクロゴール等の乳化剤、可溶化剤または溶解補助剤を加えた後、水中で乳化させた注射用乳剤にすることもできる。
【００１３】
また、注射剤としては、溶解性、目標臓器への移行速度の改善が可能なリポソーム製剤が挙げられる。特に、ナノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子）は網内系組織に取り込まれることなく血中濃度を高め、薬効発現に必要な最小有効投与量を低下させることができる。リポソーム製剤は公知のリポソーム調製法（Ｃ．Ｇ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ＦｒｏｍＰｈｙｓｉｃａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−８２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７５，４１９４（１９７８））に従って調製することができる。
【００１４】
すなわち、リポソーム膜を形成する両親媒性物質としては、天然リン脂質（卵黄レシチン、大豆レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン等）、合成リン脂質（ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン等）等のリン脂質が使用される。
【００１５】
また、膜の安定性、流動性、薬剤の膜透過性を改善するために、コレステロール類（コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール等）、リポソームに負荷電を付与することが知られている物質（ホスファチジン酸、ジセチルホスフェート等）、正荷電を付与することが知られている物質（ステアリルアミン、ステアリルアミンアセテート等）、酸化防止剤（トコフェロール等）、油性物質（大豆油、綿実油、ゴマ油、肝油等）等、公知の種々の添加剤を使用してもよい。
【００１６】
リポソームの製造は、例えば、以下の方法で行うことができる。上記両親媒性物質及び添加剤と、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、有機溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノール、ヘキサン等の単独又は混合溶媒）にそれぞれ溶解し、両溶液を混合し、フラスコ等の容器中において不活性ガス（窒素ガス、アルゴンガス等）の存在下で有機溶媒を除去し、器壁に薄膜を付着させる。次いで、この薄膜を適当な水性媒体（生理食塩水、緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等）に加え、撹拌機で撹拌する。小粒径のリポソームを得るためには、超音波乳化機、加圧型乳化機、フレンチプレス細胞破砕機等を用いて更に分散させる。このようにリポソーム化に必要な両親媒性物質等によってリポソーム化が進行し、粒径分布が制御されたナノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子；粒子径２５〜５０ｎｍ程度）を得ることができる。また、リポソームを限外濾過、遠心分離、ゲル濾過等の分画処理に付し、担持されなかった薬剤を除去してもよい。
また、膜形成物質として、上記両親媒性物質、添加剤の他に、β−オクチルグルコシド、Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン、フェニルアミノマンノシドまたはスルファチドを添加することによって得られる、グルコース残基、チロシン残基、マンノース残基又はスルファチドを膜上に有するリポソームにグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を担持させることもできる。
【００１７】
直腸投与剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、カカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶融し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはグルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、ポリエチレングリコール、大豆油等に溶解した後、ソフトレクタルカプセル、ゼラチン膜等で被覆して得ることができる。
【００１８】
皮膚外用剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じ加温し、混練して得ることができる。パップ剤またはテープ剤は、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス（窒素ガス、炭酸ガス等）等の噴霧剤に、グルコスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００１９】
投与方法
本発明の薬剤の投与方法は、特に限定されず、対象疾患および上記の剤型に応じた投与方法が用いられる。
例えば、悪性腫瘍を処置するための分化誘導剤（脱癌剤）として使用する場合、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射または経口投与が好ましい。
特に神経膠腫（グリオーマ）等の脳の疾患の処置に使用する場合、リポソーム製剤または脂質エマルジョン製剤を注射する方法が好ましい。
【００２０】
投与量
投与量は、対象とする疾患、患者の年齢、体重、健康状態、および病態等に応じ適宜決定されるが、一般には０．２５〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｋｇを一日一回あるいはそれ以上に分けて投与する。
【００２１】
毒性
本発明の薬剤の有効成分である一般式〔１〕で示される２−アシルアミノプロパノール誘導体又はその塩は、薬理活性を示す投与量において、ほとんどもしくは全く細胞毒性を示さない。
特に、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、２０μＭで食道癌細胞の分化を誘導したが、後述の実施例４に示すように、この濃度において細胞毒性が全く認められなかった。また、マウス（雄）の腹腔内投与における急性毒性、ＬＤ_５０値は約２５０ｍｇ／ｋｇであった。
【００２２】
【実施例】
実施例１
ヒト培養食道癌細胞株のｉｎｖｉｔｒｏでの培養系を用いてＰＤＭＰの分化誘導能に対して検討を行った。
【００２３】
細胞培養
ヒト培養食道癌細胞株は、リンパ節転移巣由来中分化型偏平上皮癌細胞株ＥＳ−２、原発巣由来中分化型偏平上皮細胞株ＥＳ−６の２種を用いた。培養は、５％牛胎児血清（ＦＣＳ，ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，日水製薬）中で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。培養フラスコは、Ｆａｌｃｏｎ３０８２および３０８４組織培養フラスコ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ，ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた。細胞数は、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）により細胞を遊離させた後、直ちにダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬）で洗浄しヘモサイトメーターにより計数した。細胞の生存率は、エリスロシンＢによる色素排除試験（ｄｙｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｔｅｓｔ）法により算出した。
【００２４】
ＥＳ−２またはＥＳ−６細胞（２×１０^５細胞個数／ｍｌ）にグルコシルセラミド合成酵素阻害剤、Ｄ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ）、またはその光学対掌体であるＬ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｌ−トレオ−ＰＤＭＰ）を２０μＭの濃度になるように添加し、１日または２日培養後、細胞の分化誘導を形態学的に観察した。
【００２５】
また、糖脂質生合成に対する効果を検討するため、ＥＳ−２細胞にＬ−〔３−^１４Ｃ〕セリン（５０μＣｉ／ｍｌ，ＡｍｅｒｓｈａｍＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥ，Ｂｕｃｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を３００ｎＣｉ／ｍｌとなるように添加（阻害剤を用いる場合は同時に添加）し、同様にＰＤＭＰで処理した。指定時間培養後、細胞を回収し、クロロホルム／メタノール（２：１，Ｖ／Ｖ）混合液を用いて総脂質を抽出した。得られた総脂質画分をクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８，Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合液に溶解し、同混合液で平衡化したＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ２５（ファルマシア）カラムにアプライし、過剰の上記混合液で中性糖脂質を溶出後、ガングリオシドを含む酸性糖脂質画分をクロロホルム／メタノール／０．８Ｍ酢酸ナトリウム（３０：６０：８，Ｖ／Ｖ／Ｖ）により溶出させた。さらに、酸性脂質画分を分離し、脱塩後、３×１０^６個相当量をＨＰＴＬＣプレートにアプライし、展開した。
【００２６】
ＨＰＴＬＣプレートをＦｕｊｉｘｉｍａｇｉｎｇｐｌａｔｅ２０４０（富士写真フィルム）に１４時間露光し、ｉｍａｇｉｎｇａｎａｌｙｚｅｒＢＡＳ−２０００（富士写真フィルム）により検出、定量した。スタンダードは同一プレート上で展開後切り離し、オルシノール・硫酸スプレー試薬による発色で検出した。
【００２７】
結果
Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰまたはＬ−トレオ−ＰＤＭＰを２０μＭの濃度で、ＥＳ−２細胞を２日間処理し、またはＥＳ−６細胞を１日間処理した際の細胞の形態学的変化の顕微鏡写真を、それぞれ図１および図２に示した。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰで処理した両細胞では明らかに接触阻害（コンタクトインヒビション）の出現および細胞間連絡の回復が起こり、正常上皮細胞様の形態に分化していることが判明した。一方、グルコシルセラミド生合成酵素の阻害活性が無いＬ−トレオ−ＰＤＭＰで同様に処理した場合には、分化誘導活性は認められず、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ処理において観察された分化誘導現象は、糖脂質の発現を抑制していることによると考えられた。
【００２８】
このことを、ＥＳ−２細胞の糖脂質生合成に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰとＬ−トレオ−ＰＤＭＰの効果を解析することにより証明を試みた。図３に示すようにＤ−トレオ−ＰＤＭＰ処理では、固形腫瘍ＥＳ−２に発現している全ての糖脂質、特に癌化した上皮細胞において発現が増加（平成７年日本癌学会総会講演要旨集、第１４５頁、演題３７９）しているＳＰＧ（シアリルパラグロボシド）の発現を著しく抑制していることが判明した。
【００２９】
実施例２
ウサギショープ癌細胞株（Ｓｈｏｐｅｃａｒｃｉｏｍａ）に対する影響
使用した細胞はＢ／Ｊ系のウサギ皮膚由来で、ワタオノウサギパピローマウイルスにより癌化したウサギ偏平上皮癌細胞株、二株である（ＳｅｔｏＡ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７，３２７−３３１，１９９１）。すなわち、形態的に分化型で、Ｂ／Ｊ系ウサギやヌードマウスに移植されても造腫瘍能を示さないＳＣＢ−５ａと形態的に未分化型で、Ｂ／Ｊ系ウサギやヌードマウスに移植されて造腫瘍能を示し、軟寒天培地中でコロニー形性能を示すＳＣＢ−５ｅの二種類である。これらの細胞は通常１０％胎児ウシ血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含んだＲＰＭＩ１６４０を含む液体培地（以下、培地Ａ）で、５％炭酸ガス、９５％空気存在下、３７℃で培養された。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは少量の無菌水に溶かされ、前述の培地に適宜加えられた。
【００３０】
１）液体培地中でのＤ−トレオ−ＰＤＭＰの癌細胞の増殖、形態に対する影響
（方法）
液体培地中でのＤ−トレオ−ＰＤＭＰの癌細胞の増殖、形態に対する影響は、２４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて調べられた。ＳＣＢ−５ｅの場合は、５×１０^４／ｍｌ／穴、ＳＣＢ−５ａの場合は、１０×１０^４／ｍｌ／穴となるように各穴に蒔かれた。培地は、各々Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰを含まないもの（対照群）、１０μＭ，２０μＭ，３０μＭの終濃度を含むものが各々用いられた。培地は２日ないし３日ごとに、新たに調製されたものと交換された。観察は位相差顕微鏡を用いて行われた。
【００３１】
（結果）
図４に増殖グラフを示す。ＳＣＢ−５ｅは培養開始２４時間後より濃度依存性に増殖の抑制が認められた。ＳＣＢ−５ａでは１０μＭ，２０μＭの範囲では培養３日目までは明らかな増殖抑制は見られなかったが、それ以降では増殖は抑制された。３０μＭでは常に増殖は抑制された。ＳＣＢ−５ａの５日目の形態変化を図５に示す。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ非存在下では細胞は紡水形で小さく配列は不規則で接触阻害が見られず、堆積化は顕著である（図５Ａ）。それに対してＤ−トレオ−ＰＤＭＰ１０μＭ（図５Ｂ）、２０μＭ（図５Ｃ）および３０μＭ（図５Ｄ）の存在下では細胞は大きく、配列は規則的で接触阻害は濃度依存性に見られ、堆積化もやはり濃度依存性に解消されている。こういった形態への影響は、ＳＣＢ−５ｅでも観察された。
【００３２】
２）軟寒天培地中でのコロニー形成能
軟寒天培地中でのコロニー形成能は、細胞の悪性度の一つの指標である、造腫瘍能と相関することが知られている（Ｈｏｓｏｉ，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６，５５８２−５５８６，１９８６）ので、ＳＣＢ−５ｅ細胞を用いてこれに対する影響を見た。
【００３３】
（方法）
培地Ａに０．８％（ｗ／ｖ）となるようにアガロース（Ｓｅａｐｌａｑｕｅａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を加え４５℃に保温したものを３５ｍｍのプラスチックプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１．５ｍｌ入れゲル化後、培地Ａに０．６％（ｗ／ｖ）となるように前述のアガロースを入れ、４５℃に保温したものへ、温度が下がりゲル化する直前に４×１０^４の細胞を素早く均一に加えたもの１．５ｍｌを重層した。ＰＤＭＰを入れる場合は各々終濃度、１０，２０，３０μＭとなるように培地に加えた。ゲル化後５％炭酸ガス、９５％空気存在下、３７℃で一週間培養した。その後既報（Ｓｈａｅｆｆｅｒ，Ｗ．Ｉ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．１，２５９−２６２，１９７６）に従い、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリドを用いて生体染色をし、コロニーを可視化し、その長径が５０μｍ以上のものをコロニーとしてカウントした。
【００３４】
（結果）
図６に、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ未添加時のコロニー形成率を１００％としたとき、各濃度のＰＤＭＰ添加時におけるコロニー形成率（％）を示し、図７にコロニーの写真を示す（図７Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ無添加、図７Ｂ：１０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ、図７Ｃ：２０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ、図７Ｄ：３０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ）。図６、７より明らかなように、コロニー形成率は濃度依存性に減少した。またコロニーの大きさも濃度依存性に減少し、２０μＭ以上では図７の如く長径が５０μｍに達せず、コロニーとしてカウントできないものが目立った。
【００３５】
実施例３
マウスに移植したショープ癌細胞株の増殖に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理の効果
ＳＣＢ−５ｅ細胞を３０μＭのＤ−トレオ−ＰＤＭＰ存在下または非存在下（コントロール）で３日間培養後、１×１０^６個の細胞を６週令のヌードマウス（雄）の肩部に皮下移植した。移植６週間後に摘出腫瘍重量を測定した。
【００３６】
（結果）
コントロール群（ｎ＝１３）とＤ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理群（ｎ＝１０）の摘出平均腫瘍重量（ＴｕｍｏｒＷｅｉｇｈｔ）は、それぞれ６９２±８３ｍｇおよび５５５±７９ｍｇであり、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理群で減少していた（図８）。また、ヌードマウスに移植後、両群において一週間以内に全てのマウスに腫瘍が形成されたが、肉眼的に腫瘍形成が確認できる日数はＤ−トレオ−ＰＤＭＰでは１〜２日遅かった。
これらの結果は、実施例１および２のｉｎｖｉｔｒｏの実験系において確認されたＤ−トレオ−ＰＤＭＰの脱癌活性がｉｎｖｉｖｏにおいても有効性を示すことを強く示唆するものである。
【００３７】
実施例４
ヒト正常二倍体胎児肺線維芽細胞株（ＭＲＣ−５）に対するＤ−トレオ−ＰＤＭＰの細胞毒性を測定した。すなわち、種々の濃度のＤ−トレオ−ＰＤＭＰを添加し、２４時間後の細胞毒性をＭＴＴ法（Ｔ．Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）により検討した結果、８０μＭにおいても細胞毒性を示さないことを確認した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば一般式〔１〕に示した、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰに代表される２−アシルアミノプロパノール誘導体を有効成分とする、未分化な状態で異常な細胞増殖を呈することに基づく各種疾患に対する分化誘導剤（細胞を正常な状態に戻す薬剤）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２の形態変化に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真である。
【図２】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−６の形態変化に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表す顕微鏡写真である。
【図３】ヒト食道癌細胞株ＥＳ−２のガングリオシド生合成に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ＰＤＭＰ）またはＬ−トレオ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ＰＤＭＰ）の効果を表すクロマトグラフである。
【図４】ウサギショープ癌細胞株ＳＣＢ−５ｅおよびＳＣＢ−５ａの増殖（細胞数）に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰの効果を表す図面である。
【図５】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰのウサギショープ癌細胞株ＳＣＢ−５ｅの形態変化（５日目）に及ぼす効果を示す顕微鏡写真（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ非存在下、Ｂ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ１０μＭ、Ｃ：２０μＭ，Ｄ：３０μＭ）である。
【図６】Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ未添加時のコロニー形成率を１００％としたとき、各濃度のＤ−トレオ−ＰＤＭＰ添加時におけるコロニー形成率（％）を示す図面である。
【図７】コロニーの顕微鏡写真（Ａ：Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰ無添加、Ｂ：１０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ、Ｃ：２０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ、Ｄ：３０μＭＤ−トレオ−ＰＤＭＰ）である。
【図８】マウスに移植したショープ癌細胞株の増殖に及ぼすＤ−トレオ−ＰＤＭＰ前処理の効果を示す図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a differentiation inducer comprising a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor as an active ingredient. Specifically, the present invention induces differentiation of cells that proliferate abnormally in an undifferentiated state by administering the inhibitor, and differentiates into terminally differentiated cells having a certain life span, thereby detaching from the abnormal proliferative state. The present invention relates to a differentiation inducer intended to measure.
[0002]
[Prior art]
The sugar chains present on the surface of animal cells are not only diverse in terms of structural chemistry, but also have high structural specificity depending on the animal species / organ species / cell types. Cells distinguish various biological information in the cellular society through sugar chains, which are specific antenna molecules corresponding to them. However, the sugar chain structure is not necessarily static, and changes dramatically in the process of cell development / differentiation and canceration. That is, it has a dynamic aspect.
[0003]
Recently, it has been shown that sugar chains expressed during the differentiation process may control cell growth and differentiation signals, or directly form signals themselves to determine the next fate of cells. It is coming. Moreover, such differentiation stage-specific sugar chain expression may be controlled by cytokines. This means that the cell determines its fate (next gene expression) in its cell society via a sugar chain, which is a secondary product of the gene (the primary product is a sugar chain synthase). Therefore, abnormalities in the expression mechanism of sugar chains induce deviations from cytosociological control and constitute the cause of various diseases. However, the details of the sugar chain expression mechanism remain unclear.
[0004]
Until recently, biological activities such as differentiation-inducing activity were discovered in glycosphingoglycolipid (hereinafter also referred to as “glycolipid”) molecules, which were considered to be just one of the biological membrane structures. The figure as “functional membrane molecules in the system” has been revealed. Such activity is exhibited through a specific sugar chain structure. Sugar chains are secondary products of genes created by the balance of glycosyltransferases and glycolytic enzymes corresponding to the sugar chains, and direct functional elucidation has been delayed because molecular biological approaches are difficult. The finding that the changes in sugar chain structure brought about by changes in the expression of glycosyltransferases (genes) are “directly” involved in the regulation of cell growth and differentiation is based on the fact that foreign molecules (including other cells) It will provide a new perspective on the physiological significance of sugar chains that have been captured from a static perspective. However, molecular-level studies of signal transduction mechanisms via sugar chains have just begun, and it is unclear whether the action of sugar chains is indeed direct or indirect, and we are awaiting its elucidation. ing.
[0005]
Currently, the most commonly used method for exploring the function of glycolipids is to add glycolipids from the outside to the experimental system. In this case, the relationship with endogenous glycolipids becomes a problem. . In other words, while the endogenous glycolipid present in the cell membrane has already formed a complex with various cell surface receptors, etc., the result derived by adding additional glycolipid is the true result of endogenous glycolipid. It may not always reflect the cellular physiological significance of. Therefore, in order to know the original role of glycolipids in cell physiology, a method for specifically inhibiting endogenous glycolipid biosynthesis was required. The present inventors first synthesized various 2-acylaminopropanol derivatives, which are analogs of ceramide, and examined their glycolipid biosynthesis inhibitory activity. As a result, 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino- Among the stereoisomers of 1-propanol (PDMP), the D- or DL-threo form specifically inhibits glucosylceramide biosynthetic enzymes, and the intracellular content of all glycolipids starting from glucosylceramide It was proved to be significantly reduced (Adv. Lipid Res., 26, 183-213, 1993). PDMP has the effect of increasing the intracellular content of ceramide, which is a biosynthetic precursor of glucosylceramide, by inhibiting glucosylceramide synthesis. In recent years, ceramide molecules have been involved in the suppression of differentiation, apoptosis and cell proliferation. Many evidences as important intracellular signal transduction molecules in the intracellular signal transduction system have been reported (Immunology Today, 16, 294-295, 1995).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In a pathological condition in which cells grow abnormally in an undifferentiated state, specific glycolipid molecules are abnormally expressed in the cells compared to normal cells. The present invention is a drug for treating a disease based on abnormal growth of a cell by causing such a glycolipid to be released from the abnormal growth state by suppressing the expression of a glycolipid with a specific biosynthesis inhibitor and differentiating the cell into a normal state The purpose is to provide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
For the above reasons, inhibition of glycolipid expression in cells exhibiting abnormal growth such as solid tumors, especially inhibition with specific inhibitors of glucosylceramide biosynthetic enzymes, such as specific 2-acylaminopropanol derivatives Based on the above, the hypothesis that the differentiation of abnormally proliferating cells can be induced and normalized is made, and the present invention was finally completed by diligent research.
The present invention provides a drug having a differentiation-inducing action comprising a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor as an active ingredient.
In the above, the glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor is represented by the general formula [1].
[Chemical 2]

[In the formula, R¹Represents a phenyl group which may be substituted with 1 to 3 identical or different substituents selected from the group consisting of alkyl, alkoxy, hydroxy and nitro, and n represents an integer of 2 to 16. A 2-acylaminopropanol derivative represented by the formula: or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a drug having differentiation-inducing action comprising a glucosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor as an active ingredient (hereinafter also simply referred to as “differentiation-inducing agent of the present invention”). Here, the “glucosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor” includes all substances having a function of inhibiting the synthesis of glycosphingoglycolipid in vivo. “Glycosphingoglycolipid” means glucosylceramide and glycosphingolipid biosynthesized starting from glucosylceramide.
As a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor, a 2-acylaminopropanol derivative represented by the general formula [1] having glucosylceramide biosynthesis enzyme inhibitory activity, preferably R in the general formula [1]¹Is a phenyl group and n is 8, that is, 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (hereinafter referred to as PDMP). PDMP has four types of stereoisomers, and D-threo-PDMP and DL-threo-PDMP having the enzyme inhibitory activity are preferred. Azasugar derivatives such as N-butylgalactonojirimycin and N-butyldeoxynojirimycin also have glucosylceramide biosynthesis inhibitory activity and can therefore be used as the glucosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor of the present invention. .
Pharmaceutically acceptable salts of the compound represented by the general formula [1] include inorganic acid salts such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, formic acid; acetic acid, citric acid, lactic acid, malic acid, oxalic acid, Mention may be made of organic acid salts such as maleic acid, fumaric acid, succinic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid and ρ-toluenesulfonic acid.
[0009]
Drug
The differentiation-inducing agent of the present invention treats various diseases based on the abnormal growth of cells in an undifferentiated state in mammals including humans, that is, treatment, alleviation (improvement of symptoms), and maintenance of such diseases. (Prevention of deterioration) or can be used as a medicine for prevention. These include benign tumors (such as uterine fibroids), malignant solid tumors (such as esophageal cancer, colon cancer, lung cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer and other squamous cell carcinomas and adenocarcinoma), brain tumors, gliomas, Nephritis (such as glomerulonephritis), human autoimmune lymphoproliferative syndrome, lymphoproliferative disorder, vascular immunoblastic lymphadenopathy, immunoblastic lymphadenopathy, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease ( Crohn's disease, ulcerative colitis, etc.), progressive systemic sclerosis, polymyositis (dermatomyositis), Sjogren's syndrome, leukemia, lymphoma, myelodysplastic syndrome, scleroderma, rheumatism, psoriasis, wound hyperplasia ( Although abnormal proliferative diseases such as granulation etc. are exemplified, the present invention can be directed to all diseases that can induce and differentiate cells by inhibiting biosynthesis of glycosphingoglycolipids.
[0010]
The differentiation inducer of the present invention is a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor, for example, a 2-acylaminopropanol derivative represented by the general formula [1] or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable if necessary. In addition to known carriers, excipients and other additives, a preparation suitable for oral or parenteral administration can be prepared depending on the purpose. Furthermore, it is possible to obtain a sustained-release preparation by a known technique.
[0011]
Examples of oral preparations include solid preparations such as powders, granules, capsules and tablets; liquid preparations such as syrups, elixirs and emulsions. The powder can be obtained by mixing with excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, calcium hydrogen phosphate, magnesium aluminate metasilicate, and silicic anhydride. In addition to the above-mentioned excipients, the granule is added with a binder such as sucrose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, starch or the like, or a disintegrant such as carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, starch, etc. It can be obtained by dry granulation. Tablets can be obtained by compressing the powder or granules as described above or by adding a lubricant such as magnesium stearate or talc. In addition, dragee tablets can be prepared using hydroxypropylcellulose, titanium oxide, gelatin, sucrose, and the like. Furthermore, the tablet or granule is coated with an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methyl methacrylate copolymer, hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate, cellulose acetate phthalate, or with ethyl cellulose, carnauba wax, hydrogenated oil, etc. These can be coated into enteric or long lasting formulations. The hard capsule can be obtained by filling the above powder or granule into a hard capsule. Soft capsules can be obtained by dissolving a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil or the like and coating it with a gelatin film. A syrup can be obtained by dissolving a sweetener such as sucrose, sorbitol, and glycerin and a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor in water. In addition to sweeteners and water, essential oils, ethanol, etc. are added to make elixirs, or Arabic gum, tragacanth, polysorbate 80, sodium carboxymethylcellulose, lecithin, crystalline cellulose / carmellose sodium, macrogol, polyethylene glycol, etc. Can be added to form an emulsion or suspension. Moreover, a corrigent, a coloring agent, a preservative, etc. can be added to these liquid preparations as needed.
[0012]
Examples of parenteral preparations include injections, rectal administration agents, pessaries, external preparations for skin, inhalants, aerosols, eye drops and the like. Injections include glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitors, as needed, hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactic acid, sodium lactate, acetic acid, sodium acetate, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, monohydrogen phosphate PH adjusters such as potassium and potassium dihydrogen phosphate; isotonic agents such as sodium chloride and glucose; and distilled water for injection are added, sterilized by filtration or heat steam sterilized (autoclave), and then filled into ampoules. be able to. Furthermore, sugar alcohols such as mannitol, dextran, gelatin and the like can be added and lyophilized in a vacuum to obtain a dissolution type injection for use. In addition, an emulsifier such as lecithin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, macrogol, solubilizer or solubilizer is added to the glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor, and then the emulsion for injection emulsified in water is added. You can also
[0013]
In addition, examples of the injection include liposome preparations that can improve solubility and transfer rate to a target organ. In particular, nanosphere liposomes (lipid ultrafine particles) can increase the blood concentration without being taken into the reticuloendothelial tissue, and can reduce the minimum effective dose required for the development of drug efficacy. Liposome preparations can be prepared by known methods for preparing liposomes (CG Knight, Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications, pp. 51-82, Elsevier, Amsterdam (1981); Proc. Nat. A., Vol. 75, 4194 (1978)).
[0014]
That is, examples of amphipathic substances that form liposome membranes include natural phospholipids (egg yolk lecithin, soybean lecithin, sphingomyelin, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, cardiolipin). Phospholipids such as lipids (distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, etc.) are used.
[0015]
It is also known to impart negative charge to cholesterols (cholesterol, ergosterol, phytosterol, sitosterol, stigmasterol, etc.) and liposomes in order to improve membrane stability, fluidity, and drug membrane permeability. Substances (phosphatidic acid, dicetyl phosphate, etc.), substances known to impart a positive charge (stearylamine, stearylamine acetate, etc.), antioxidants (tocopherol, etc.), oily substances (soybean oil, cottonseed oil) , Sesame oil, liver oil, etc.) may be used.
[0016]
The liposome can be produced, for example, by the following method. The above amphiphile and additive and the glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor are dissolved in an organic solvent (single or mixed solvent such as chloroform, dichloromethane, ethanol, methanol, hexane, etc.), and both solutions are mixed. In a container such as a flask, the organic solvent is removed in the presence of an inert gas (nitrogen gas, argon gas, etc.), and a thin film is adhered to the vessel wall. Next, this thin film is added to an appropriate aqueous medium (physiological saline, buffer solution, phosphate buffered physiological saline, etc.) and stirred with a stirrer. In order to obtain a liposome having a small particle size, it is further dispersed using an ultrasonic emulsifier, a pressure emulsifier, a French press cell crusher, or the like. As described above, nanosphere liposomes (ultralipid microparticles; particle diameter of about 25 to 50 nm) having a controlled particle size distribution can be obtained by the progress of liposome formation by an amphipathic substance necessary for liposome formation. Further, the liposome may be subjected to fractionation treatment such as ultrafiltration, centrifugation, and gel filtration to remove the unsupported drug.
In addition to the above amphiphilic substance and additives, β-octylglucoside, L-tyrosine-7-amido-4-methylcoumarin, phenylamino mannoside or sulfatide is added as a film forming substance. The glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor can also be supported on a liposome having a glucose residue, tyrosine residue, mannose residue or sulfatide on the membrane.
[0017]
For rectal administration, a suppository base such as mono-, di- or triglycerides of cocoa fatty acid, polyethylene glycol, etc. is added to a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor, then heated to melt and poured into a mold. Or a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor dissolved in polyethylene glycol, soybean oil or the like and then coated with a soft rectal capsule, gelatin film or the like.
[0018]
The external preparation for skin can be obtained by adding white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol or the like to a glucosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor, heating as necessary, and kneading. The poultice or tape agent can be obtained by kneading a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor with a pressure-sensitive adhesive such as rosin or an alkyl acrylate polymer and spreading the mixture on a nonwoven fabric or the like. The inhalant is prepared by, for example, dissolving or dispersing a glycosphingoglycolipid biosynthesis inhibitor in a spray such as a pharmaceutically acceptable inert gas (nitrogen gas, carbon dioxide gas, etc.), and filling it in a pressure resistant container. Obtainable.
[0019]
Administration method
The administration method of the drug of the present invention is not particularly limited, and an administration method according to the target disease and the above dosage form is used.
For example, when used as a differentiation inducer (cancer removal agent) for treating malignant tumors, injection such as intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection, or oral administration is preferable.
In particular, when used for the treatment of brain diseases such as glioma, a method of injecting a liposome preparation or a lipid emulsion preparation is preferred.
[0020]
Dose
The dose is appropriately determined according to the target disease, the patient's age, weight, health condition, pathological condition, etc., but is generally 0.25 to 200 mg / kg, preferably 0.5 to 100 mg / kg. Administer once or more daily.
[0021]
toxicity
The 2-acylaminopropanol derivative represented by the general formula [1] or a salt thereof, which is an active ingredient of the drug of the present invention, exhibits little or no cytotoxicity at a dose exhibiting pharmacological activity.
In particular, D-threo-PDMP induced differentiation of esophageal cancer cells at 20 μM, but no cytotoxicity was observed at this concentration as shown in Example 4 described later. In addition, acute toxicity after intraperitoneal administration of mice (male), LD₅₀The value was about 250 mg / kg.
[0022]
【Example】
Example 1
PDMP differentiation inducing ability was examined using an in vitro culture system of human cultured esophageal cancer cell lines.
[0023]
Cell culture
As human cultured esophageal cancer cell lines, two types of lymph node metastasis-derived moderately differentiated squamous cell carcinoma cell line ES-2 and primary lesion-derived moderately differentiated squamous cell line ES-6 were used. The culture was carried out in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Nissui Pharmaceutical) supplemented with 5% fetal calf serum (FCS, Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, USA) at 37 ° C, 5% CO.₂Performed under conditions. Falcon 3082 and 3084 tissue culture flasks (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ, USA) were used as culture flasks. The number of cells was released with trypsin / EDTA (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA), immediately washed with Dulbecco's PBS (-) (Nissui Pharmaceutical) and counted with a hemocytometer. The cell viability was calculated by a dye-exclusion test method using erythrosine B.
[0024]
ES-2 or ES-6 cells (2 × 10⁵The number of cells / ml) is a glucosylceramide synthase inhibitor, D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-threo-PDMP), or an optical antipode thereof. L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (L-threo-PDMP) was added to a concentration of 20 μM, and after 1 day or 2 days of culture, cell differentiation Induction was observed morphologically.
[0025]
Moreover, in order to examine the effect on glycolipid biosynthesis, L-2 [3-¹⁴C] Serine (50 μCi / ml, Amersham LIFE SCIENCE, Buchinghamshire, England) was added to 300 nCi / ml (when an inhibitor was used, it was added at the same time), and similarly treated with PDMP. After culturing for a specified time, the cells were collected, and total lipids were extracted using a chloroform / methanol (2: 1, V / V) mixture. The obtained total lipid fraction was dissolved in a chloroform / methanol / water (30: 60: 8, V / V / V) mixed solution and applied to a DEAE Sephadex A25 (Pharmacia) column equilibrated with the same mixed solution, After elution of neutral glycolipid with an excess of the above mixture, the acidic glycolipid fraction containing ganglioside was eluted with chloroform / methanol / 0.8 M sodium acetate (30: 60: 8, V / V / V). Furthermore, the acidic lipid fraction was separated and, after desalting, 3 × 10⁶An equivalent amount was applied to an HPTLC plate and developed.
[0026]
The HPTLC plate was exposed to Fuji imaging plate 2040 (Fuji Photo Film) for 14 hours, and detected and quantified by imaging analyzer BAS-2000 (Fuji Photo Film). Standards were developed on the same plate, separated, and detected by color development with orcinol / sulfuric acid spray reagent.
[0027]
result
Photomicrographs of morphological changes of cells when ES-2 cells were treated with D-threo-PDMP or L-threo-PDMP at a concentration of 20 μM for 2 days or ES-6 cells were treated for 1 day. These are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. In both cells treated with D-threo-PDMP, the appearance of contact inhibition (contact inhibition) and the restoration of cell-cell communication occurred, and it was found that the cells differentiated into a normal epithelial cell-like form. On the other hand, when similarly treated with L-threo-PDMP, which has no inhibitory activity on glucosylceramide biosynthetic enzymes, differentiation-inducing activity is not observed, and the differentiation-inducing phenomenon observed in D-threo-PDMP treatment is This was thought to be due to the suppression of lipid expression.
[0028]
This was proved by analyzing the effects of D-threo-PDMP and L-threo-PDMP on glycolipid biosynthesis in ES-2 cells. As shown in FIG. 3, in D-threo-PDMP treatment, the expression increased in all glycolipids expressed in solid tumor ES-2, particularly in cancerous epithelial cells. 145, abstract 379), SPG (sialylparagloboside) expression was significantly suppressed.
[0029]
Example 2
Effects on Rabbit Shope Cancer Cell Line (Shope Carcioma)
The cells used were two rabbit squamous cell carcinoma cell lines derived from B / J-type rabbit skin and cancerized by cotton-tailed rabbit papilloma virus (Seto A. et al., J. Invest. Dermatol. 97, 327). -331, 1991). That is, SCB-5a is morphologically differentiated and does not show tumorigenicity even when transplanted into B / J rabbits or nude mice, and is morphologically undifferentiated and transplanted into B / J rabbits or nude mice. Two types of SCB-5e exhibiting tumorigenicity and exhibiting colony-shaped performance in soft agar medium. These cells are usually a liquid medium (hereinafter referred to as medium A) containing RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum, 100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. Incubated at 0 ° C. D-threo-PDMP was dissolved in a small amount of sterile water and added appropriately to the aforementioned medium.
[0030]
1) Effect of D-threo-PDMP on growth and morphology of cancer cells in liquid medium
(Method)
The influence of D-threo-PDMP on the growth and morphology of cancer cells in a liquid medium was examined using a 24-well microplate (Corning). In the case of SCB-5e, 5 × 10⁴/ Ml / hole, 10 x 10 for SCB-5a⁴It was sown in each hole to be / ml / hole. As the culture medium, one containing no D-threo-PDMP (control group) and one containing final concentrations of 10 μM, 20 μM, and 30 μM were used. The medium was replaced with freshly prepared medium every 2-3 days. Observation was performed using a phase contrast microscope.
[0031]
(result)
FIG. 4 shows a proliferation graph. SCB-5e was inhibited from growing in a concentration-dependent manner 24 hours after the start of culture. In SCB-5a, in the range of 10 μM and 20 μM, no obvious growth suppression was observed until the third day of culture, but thereafter the growth was suppressed. Growth was always suppressed at 30 μM. FIG. 5 shows the shape change of SCB-5a on the fifth day. In the absence of D-threo-PDMP, the cells were spun and small in arrangement, and contact inhibition was not observed, and deposition was remarkable (FIG. 5A). In contrast, in the presence of D-threo-PDMP 10 μM (FIG. 5B), 20 μM (FIG. 5C) and 30 μM (FIG. 5D), the cells are large, the arrangement is regular, contact inhibition is seen in a concentration-dependent manner, and deposition is also observed. Again, the concentration dependency is eliminated. These effects on morphology were also observed with SCB-5e.
[0032]
2) Colony forming ability in soft agar medium
It is known that colony-forming ability in soft agar medium correlates with tumorigenicity, which is one index of cell malignancy (Hosoi, et al., Cancer Res. 46, 5582-5586, 1986). Therefore, the effect on this was observed using SCB-5e cells.
[0033]
(Method)
Agarose (Seaplate agarose, manufactured by FMC Bioproducts) was added to medium A to 0.8% (w / v) and kept at 45 ° C., and 1.5 ml was placed in a 35 mm plastic plate (Falcon). After the formation, the above-mentioned agarose is added to the medium A to 0.6% (w / v), and the temperature is kept at 45 ° C.⁴Of 1.5 ml of cells added quickly and uniformly. When PDMP was added, it was added to the medium so that the final concentrations were 10, 20, and 30 μM, respectively. After gelation, the cells were cultured at 37 ° C. for 1 week in the presence of 5% carbon dioxide gas and 95% air. Thereafter, in accordance with the previous report (Shaeffer, WI Cancer Lett. 1,259-262, 1976), vital staining using 2- (p-iodophenyl) -3- (p-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium chloride The colonies were visualized, and those having a major axis of 50 μm or more were counted as colonies.
[0034]
(result)
FIG. 6 shows the colony formation rate (%) when each concentration of PDMP was added when the colony formation rate when D-threo-PDMP was not added was 100%, and FIG. 7 shows a photograph of the colony (FIG. 7A). : D-threo-PDMP added, FIG. 7B: 10 μMD-threo-PDMP, FIG. 7C: 20 μM D-threo-PDMP, FIG. 7D: 30 μM D-threo-PDMP). As apparent from FIGS. 6 and 7, the colony formation rate decreased in a concentration-dependent manner. In addition, the size of the colony also decreased in a concentration-dependent manner, and when it was 20 μM or more, the major axis did not reach 50 μm as shown in FIG.
[0035]
Example 3
Effect of D-threo-PDMP pretreatment on the growth of Shope cancer cell lines transplanted into mice
After culturing SCB-5e cells in the presence or absence of 30 μM D-threo-PDMP (control) for 3 days, 1 × 10⁶Cells were transplanted subcutaneously into the shoulders of 6-week-old nude mice (male). The excised tumor weight was measured 6 weeks after transplantation.
[0036]
(result)
The average tumor weights (Tumor Weight) in the control group (n = 13) and the D-threo-PDMP pretreatment group (n = 10) were 692 ± 83 mg and 555 ± 79 mg, respectively, and D-threo-PDMP pretreatment It decreased in the group (FIG. 8). In addition, after transplantation into nude mice, tumors were formed in all mice within one week in both groups, but the number of days on which macroscopic tumor formation was confirmed was delayed by 1-2 days for D-threo-PDMP.
These results strongly suggest that the decancerous activity of D-threo-PDMP confirmed in the in vitro experimental systems of Examples 1 and 2 is also effective in vivo.
[0037]
Example 4
The cytotoxicity of D-threo-PDMP against human normal diploid fetal lung fibroblast cell line (MRC-5) was measured. That is, various concentrations of D-threo-PDMP were added, and cytotoxicity after 24 hours was examined by the MTT method (T. Mosmann, J. Immunological Methods, 65, 55-63, 1983). It was confirmed that it did not show cytotoxicity.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, various active substances based on 2-acylaminopropanol derivatives represented by the general formula [1] represented by D-threo-PDMP are used as active ingredients and exhibit abnormal cell growth in an undifferentiated state. It is possible to provide a differentiation-inducing agent (a drug that returns cells to a normal state) against a disease.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph showing the effect of D-threo-PDMP (D-PDMP) or L-threo-PDMP (L-PDMP) on the morphological changes of human esophageal cancer cell line ES-2.
FIG. 2 is a photomicrograph showing the effect of D-threo-PDMP (D-PDMP) or L-threo-PDMP (L-PDMP) on the morphological changes of human esophageal cancer cell line ES-6.
FIG. 3 is a chromatograph showing the effect of D-threo-PDMP (D-PDMP) or L-threo-PDMP (L-PDMP) on ganglioside biosynthesis of human esophageal cancer cell line ES-2.
FIG. 4 is a drawing showing the effect of D-threo-PDMP on the proliferation (cell count) of rabbit shop cancer cell lines SCB-5e and SCB-5a.
FIG. 5 is a photomicrograph showing the effect of D-threo-PDMP on the morphological change (day 5) of rabbit Shope cancer cell line SCB-5e (A: in the absence of D-threo-PDMP, B: D- Threo-PDMP 10 μM, C: 20 μM, D: 30 μM).
FIG. 6 is a drawing showing the colony formation rate (%) when D-threo-PDMP at each concentration is added, when the colony formation rate when D-threo-PDMP is not added is 100%.
FIG. 7 is a micrograph of colonies (A: D-threo-PDMP non-added, B: 10 μM D-threo-PDMP, C: 20 μM D-threo-PDMP, D: 30 μM D-threo-PDMP).
FIG. 8 is a drawing showing the effect of D-threo-PDMP pretreatment on the growth of a shope cancer cell line transplanted into mice.

Claims

Lymph node metastasis-derived moderately differentiated type or primary focus- derived moderately differentiated type containing D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient An agent for inducing differentiation of esophageal cancer cells or undifferentiated cancer cells transformed into papillomavirus.

Method for inducing differentiation of undifferentiated type of cancer cells become cancerous by esophageal cancer cells or papillomavirus lymph node metastasis-derived differentiated or primary tumor-derived differentiated comprising administering a differentiation-inducing agent according to claim 1, wherein (Except for methods of treating the human body.)