JP4139888B2

JP4139888B2 - Manufacturing method of macromolecular crystal and manufacturing apparatus used therefor

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Publication number: JP4139888B2
Application number: JP2003033718A
Authority: JP
Inventors: 哲夫奥津; 浩士平塚
Original assignee: Gunma University NUC
Current assignee: Gunma University NUC
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-02-12
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2023-02-12
Also published as: JP2003306497A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は巨大分子の結晶化方法、この方法を用いて調製された巨大分子結晶、及び巨大分子結晶の製造装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質等の巨大分子を結晶化させるには、バッチ法、透析法、液相間拡散法、気液相関拡散法等の方法が用いられている（日本生化学会編、新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ−分離・精製・性質−」、１９９０年、東京化学同人発行、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」参照）。
例えば、バッチ法によれば、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム等の沈殿剤を結晶化濃度まで直接加える。一般には、巨大分子溶液の入った容器に沈殿剤を加え巨大分子が過飽和となるように制御し、巨大分子の結晶を作成していた。このバッチ法では、高濃度の巨大分子試料を大量に必要とすること、操作に熟練を要し再現性が低いこと、結晶化条件のスクリーニングが困難であること、等の欠点がある。また、従来の上記結晶化方法は、特定の巨大分子に比較的特異な結晶化条件を要し、汎用的な条件がないという欠点を有している。
【０００３】
特開平６−１１６０９８にはタンパク質結晶の核形成に適した温度条件に設定したタンパク質溶液に可視域と思われるレーザー光を照射し、このレーザー光の散乱状況を解析することによりタンパク質結晶の核形成の開始を検出し、核形成の開始を検出した時点でタンパク質溶液を結晶成長に適した温度条件に制御するようにした技術が開示されている。この例にあるように、巨大分子溶液から結晶を得る過程で溶液に光を作用させる従来の例は、光が巨大分子あるいは発生した結晶の検出を行うのみであり、結晶の核形成ないしは結晶成長に光照射は何らの積極的な作用をもたらしてはいなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
発明が解決しようとする課題は、従来の結晶化方法に見られる欠点を解消して、簡便に、再現性良く、汎用的に、巨大分子結晶を製造できる新規な方法及びその方法に用いる製造装置を提供することである。本発明が解決しようとするは、結晶化が難しい低分子の結晶を簡便に製造できる新規な方法及びその方法に用いる製造装置を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、以下の解決手段により達成された。
１）巨大分子の溶液に光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法、
２）巨大分子がタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、及び核酸よりなる群から選ばれた１）に記載の巨大分子結晶の製造方法、
３）照射する光が巨大分子の電子遷移を起こさせる波長範囲の光を含む１）又は２）記載の巨大分子結晶の製造方法、
４）巨大分子の溶液が各生成及び／又は結晶成長を促進する沈殿剤又はｐＨ調節剤を含有する１）ないし３）いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法、
５）水銀灯、キセノンランプ、レーザー光源又はエキシマーレーザー光源を用いて光を照射する１）ないし４）いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法、
６）１）ないし５）いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法により得られた巨大分子結晶、
７）１）、３）、４）又は５）において、巨大分子の代わりに、低分子を使用することを特徴とする低分子結晶の製造方法、
８）巨大分子結晶又は低分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせるための光照射部を有することを特徴とする巨大分子結晶の製造装置。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「巨大分子」とは、分子量が１万以上の典型的な高分子以外に分子量が約千以上１万未満のオリゴマー領域の分子をいう。
本発明において、「低分子」とは、分子量が約千未満である分子をいい、好ましくは、分子量が３００以上１，０００未満の分子をいう。
本発明の方法は、種々の巨大分子の結晶化に適用することができるが、特にポリペプチド、タンパク質、および核酸例えばＤＮＡ、ならびにそれらの誘導体の結晶化に適している。ここで、誘導体には糖タンパク質、ＤＮＡコンジュゲート等が含まれる。
【０００７】
以下、本発明の製造方法及び製造装置を巨大分子について説明するが、「低分子」についても説明は共通である。
本発明において、「核形成」とは、巨大分子の溶液中から巨大分子の結晶が出現する初期の段階をいい、形成される核を「結晶核」ともいう。結晶核は、安定に存在しうる巨大分子の規則的凝集体であって、結晶成長を引き起こすことのできる巨大分子の集合体である。
「結晶成長」とは、上記の結晶核の表面に溶質分子である巨大分子が取り込まれて、結晶が大きくなることをいう。
本発明の巨大分子結晶の製造方法は、結晶核の形成段階のみに使用しても良く、また予め別の方法で形成された核を成長させる結晶成長の段階にのみ使用しても良く、核形成とそれに続く結晶成長の両段階を連続して、又は、途中で中断して逐次的に、実施しても良い。
【０００８】
巨大分子の溶液は、必須成分として、巨大分子とこれを溶解する溶媒とを含む。溶媒は、巨大分子に応じて選択でき、水、有機溶媒、又は、水及び水と混合する有機溶媒（水性有機溶媒）との混合物であることができる。
【０００９】
本発明の巨大分子結晶の製造方法において、巨大分子の溶液中における濃度は、光照射する条件下における飽和濃度の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、飽和濃度であるか過飽和であることが特に好ましい。核形成及び／又は結晶成長に伴い、溶液濃度を上記の範囲内に維持することが好ましい。この溶液濃度を維持するためには、溶質の補充、温度の低下、沈殿剤の追加等の少なくとも１つを実施することが好ましい。
【００１０】
本発明において、結晶化に供する巨大分子は、その純度および均質性が高い方が容易に結晶を作製することができる。このために本発明による結晶製造に先立って、結晶化させる巨大分子に適当な精製を行うことが好ましい。
ポリペプチドとしては、大腸菌、酵母または動物細胞における発現によって得た後、慣用方法で単離されたポリペプチド、または合成ポリペプチドを挙げることができる。結晶化前の精製を、アフィニティークロマトグラフィー、慣用のクロマトグラフィー、ｒｐＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等によって行なうことが好ましい。核酸は、慣用の単離法により得た後、精製により純度を高めた後に結晶化させることが好ましい。タンパク質は慣用の方法により純度を高め、等電点電気泳動法あるいは光散乱法等により純度を確認した後結晶化させることが好ましい。
【００１１】
巨大分子結晶の核形成あるいは結晶成長を起こさせるために用いられる光としは、巨大分子を電子的に励起させる波長を含む単色光又は連続光を使用することが好ましい。電子遷移を起こさせる波長とは、分子吸光係数が１０以上である波長をいい、多くの巨大分子に対しては、一般的に可視光（波長３９０ないし７００ｎｍ）あるいは紫外光（波長３９０未満）である。本発明に使用できる紫外光には、波長１８０ないし３００ｎｍのｄｅｅｐＵＶ、波長３００ないし３５０のｍｉｄＵＶ、及び波長３５０ないし３９０ｎｍのｎｅａｒＵＶが含まれる。溶質が一般的なタンパク質の場合には、１８０ないし３２０ｎｍの紫外線が好ましく使用できる。
【００１２】
巨大分子の結晶化のために用いることのできる光は、タングステンランプ、水銀灯、キセノンランプなどの定常点灯光源の他に、固体レーザー、気体レーザー、半導体レーザー、エキシマーレーザーなどのレーザー光源を使用することもできる。パルスキセノン光源、マイクロ波励起ランプ、ＫｒＦ（２４９ｎｍ）、ＡｒＦ（１９３ｎｍ）、ＸｅＣｌ（３０８ｎｍ）、ＫｒＣｌ（２２２ｎｍ）及びＦ_２（１５７ｎｍ）等のエキシマーレーザーによれば、効率よくパルス状に紫外光を発生することができる。
照射する光の強度は、適宜選択できるが、通常は、数μＷないし数１００Ｗの範囲にある強度の光を用いることができる。
光照射は、定常光でも良く、パルス光でも良い。必要に応じて、照射強度、１パルス当たりのエネルギー、パルス間隔等を変化させることもできる。
【００１３】
本発明の核形成／結晶化方法において、光を照射する巨大分子の溶液には、結晶化を促進する沈殿剤、ｐＨ調節剤、その他タンパク質の結晶化に使用される添加剤を加えることができる。
核形成／結晶化に使用する溶液の最適条件は、結晶化させる巨大分子ごとに、ｐＨ、沈殿剤の種類と濃度、温度ならびにその他の因子を選択する。結晶化させる巨大分子に対する至適条件（溶質濃度、溶媒組成、温度、沈殿剤の種類と濃度、及びこれらの時間変化を含む。）は実験室的定常作業の一部であり、当該分野に従事する技術者により容易に決定できる。
【００１４】
結晶化に用いることのできる沈殿剤として塩類、有機溶媒、水溶性高分子等を用いることができる。塩類としては、硫酸アンモニウムが最もよく用いられているが、塩化ナトリウム、リン酸塩、クエン酸ナトリウム、硫酸塩、硝酸塩などを用いることができる。有機溶媒も水溶性のものは沈殿剤として用いることができる。例えば、２−メチル−２，４−ペンタジオール（ＭＰＤ）やエタノール、プロパノールジオキサンなどを用いることができる。高分子量の沈殿剤としてはポリエチレングリコールを用いることができ、平均分子量として２０００から８０００のものを用いることができる。
結晶化の方法として、ハンギングドロップ蒸気拡散法、シッティングドロップ蒸気拡散法、ミクロ透析法、自由界面拡散法、静置バッチ法を用いることができる。
その他の結晶化を促進する条件は、前掲の日本生化学会編、新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ−分離・精製・性質−」、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」、及びＡ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ著、”ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓｔａｌｓ”（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００１５】
本発明において、結晶核生成及び／又は結晶成長の時間は、０．５時間ないし数ヶ月の範囲から任意選択できる。
【００１６】
本発明で得られる巨大分子結晶の結晶形は、従来の沈殿剤によるバッチ法により得られる結晶の結晶形と異なる場合がある。実施例に示すように、光照射により正方晶のリゾチーム結晶を得ることができる。又、本発明において使用する光源を変えことにより、その照射される光の分光エネルギー分布、パルス光・定常光の相違等に基づき、生成する結晶の形を変化させることもできる。
本発明によれば、Ｘ線結晶解析に適した大型の結晶を得ることができる。
【００１７】
本発明により結晶化された巨大分子は、Ｘ線結晶構造解析のための試料に供されるばかりでなく、一般に保存安定性が極めて高いので、予防用または治療用剤形として医薬組成物に使用することが可能であり、巨大分子が結晶型であることにより特に有利な投与が可能になる。結晶は、例えば経口、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、筋肉内等の投与に適当である。本発明はしたがって、同様に、活性物質として本発明により結晶化された巨大分子の薬理学的有効量および、必要に応じて１種または２種以上の慣用の医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を包含する。
【００１８】
本発明によって結晶化された巨大分子は、原理的に、多くの巨大分子について知られているのと同じ方法で、医薬製剤中に、例えば薬理学的に有効な巨大分子０.００１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を投与するためのデポ製剤として使用することができる。したがって、広範囲の様々な巨大分子が本発明によって結晶化された形態で、例えば治療剤デポ製剤、抗原デポ製剤、ＤＮＡデポ製剤または糖デポ製剤として使用できる。結晶中に含有される結晶化補助剤はしかも、アジュバント（ワクチン接種において）として使用される。
【００１９】
本発明に用いる巨大分子結晶の製造装置は、光源、光を巨大分子が含まれる溶液まで導くための光学系、巨大分子を含む溶液セル、セルの温度を制御するための温度コントローラー、および結晶を観察するための拡大鏡より構成することができる。巨大分子の電子遷移が紫外光で起こる場合は、光源から照射試料まで光を導く光路に用いられる、レンズ、ミラー等の光学部品が紫外線を効率よく透過あるいは反射するものを用いることが好ましい。
上記の光学系には、適宜、反射鏡、集光レンズ、光フィルター、赤外線遮断フィルター、光ファイバー、非線形光学素子等の光学部材を使用することができる。
本発明の結晶製造装置における溶液セルの容量は適宜選択できる。１ｍｌ以下から数１００ｌの範囲に及ぶ。溶液である巨大分子の溶解量も数ｍｇから数Ｋｇ又はこれ以上に及ぶことができる。
【００２０】
本発明の結晶化装置において温度コントローラーは、巨大分子を含む溶液セルの内部温度を、一定温度に保っても良く、必要な温度変化をさせるプログラム回路を備えていても良い。また、必要に応じて、巨大分子溶液中における結晶核の生成、沈殿剤濃度、ｐＨ等を検出し、またこれらを制御するための装置、回路、プログラムを具備していても良い。結晶条件の検出及び制御のためには、複数の結晶条件検出用セルを１チップ化した装置とすることが好ましい。このような検出チップは、特開２００１−２１３６９９号公報に記載されたように、半導体装置の一般的な製造プロセスにより製造することができる。
本発明の結晶製造装置に、特開平６−１１６０９８に記載されたような、結晶核の生成又は結晶成長には寄与しないが、結晶核の生成状況を検出するための巨大分子が吸収しない長波のレーザー光を使用することもできる。
【００２１】
本発明の作用機構は未だ解明されていない。一つの可能性としては、巨大分子の溶液中において巨大分子を取り囲む溶媒（水溶液の場合には水和水となる）が光照射により離脱しやすくなるために、巨大分子の核形成及び結晶成長が促進されるという機構が考えられる。ただし、この機構の当否は、本発明の特許性又は有効性に何ら影響を及ぼすものではない。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）
リゾチーム６０ｍｇ／ｍｌおよび塩化ナトリウム２５ｍｇ／ｍｌを含み、酢酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ４．３に保たれた溶液Ａを調整した。以下の実施例は全て室温約２０℃で行った。溶液Ａを一滴スライドグラスに滴下し、光学顕微鏡上のステージに設置した。ネオジウムＹＡＧレーザーの第４高調波２６６ｎｍ、パルス幅３０ｎｓ、１パルス当たり２ｍＪのレーザー光を１０Ｈｚで２０分間スライドグラス上のリゾチーム溶液に照射したところ溶液が白濁した。レーザー光照射後の溶液には、数十μｍの大きさの正方晶のリゾチーム結晶が析出していることが確認できた。結晶の析出が光による作用であるか否か確認するために、溶液Ａを一滴スライドグラスに滴下し、レーザー光を当てずに２０分間放置し、溶液の変化を観察した。採取した溶液中にははじめ斜方晶の結晶が散見されたが、２０分間放置した後でもレーザー光を照射したときに観察された正方晶の結晶の析出は観察されなかった。また、最初に存在していた斜方晶の結晶の形も変化していなかった。以上の結果から、レーザー光照射により、リゾチーム結晶が、均一な溶液から析出することが明らかとなった。
（実施例２）
レーザー光源の代わりにキセノンランプを用いる他は実施例１と同様にして実験を行った。キセノンランプはUSHIO UXL-500D ５００Ｗランプを定常点灯で用いた。実施例１で調整した溶液Ａをスライドグラス上に一滴滴下した。キセノンランプ光を３０分間照射した。光照射前には均一な溶液であったが、キセノンランプ照射後に、結晶の析出が確認できた。このことから、レーザー光でなくても、紫外線を含む光照射によりリゾチーム結晶が析出したことが確認された。
（実施例３）
スペルミン、ＭＰＤ、塩化マグネシウム、カコジル酸ナトリウム緩衝溶液、及び合成ＤＮＡオリゴマーｄＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧを含む水溶液に、実施例１と同様にレーザー光を照射したところ、結晶の析出が見られる。
（実施例４）
細胞性ＲＮａｓｅＨの１種である、大腸菌ＲＮａｓｅＨＩを含む水溶液を実施例１と同様に調製して、実施例１と同様にレーザー光照射を行ったところ、結晶の析出が見られる。
（実施例５）
リゾチーム結晶を、ハンギングドロップ法により作成した。
結晶作成用の母液をガラスプレート上に５マイクロリットル滴下し、塩化ナトリウム溶液５マイクロリットルと混合した。液滴の塩化ナトリウム濃度は１．０，２．０，２．５又は３．０％とした。母液に対しキセノンランプ光を１５秒あるいは３０秒間照射した。その後ガラスプレートを裏返しリザーバー液の入ったウェルにグリースを用い密閉した。７日後に観察された液滴中には、リゾチーム結晶が観察された。光照射を行わない液滴では結晶の出現が見られないが、光照射を行った２．０％濃度の液滴中には結晶が出現した。このことから結晶の出現が不利な条件であっても結晶を出現させることができることが判明した。また、光照射を行い出現した結晶のＸ線結晶構造解析を行ったところ、通常の方法で作成したものと同じ構造を示した。
図３に、光照射時間と結晶数の関係を示した。
（実施例６）
タンパク質としてソーマチン（Thaumatin）を用い、ハンギングドロップ法で結晶を作成した。タンパク質濃度は２０ｍｇ／ｍｌ、沈殿剤として酒石酸ナトリウムカリウム０．７５Ｍを用いた。光照射はキセノンランプ光を５分間照射した。７日後観察したところ、光照射を行った液滴中により多くの結晶が存在した。この事実から光照射はソーマチン結晶核の形成を促進したものと考えられる。
（実施例７）
タンパク質としてグルコースイソメラーゼを用い、ハンギングドロップ法で結晶を作成した。市販のグルコースイソメラーゼ懸濁液を８倍に希釈し均一な溶液とした。光照射はキセノンランプ光を５分間照射した。４日後観察したところ、光照射を行った液滴中により数多く結晶が出現した。
（実施例８）
インドメタシン（分子量３５８）のエタノール−水（１：１）飽和溶液に、３０８ｎｍレーザー光を照射すると、針状結晶の析出が見られた。レーザー光を照射しない場合には結晶の析出は認められなかった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によると、タンパク質等の巨大分子の結晶を、簡便にまた再現性良く製造することができる。製薬工業や食品工業において、巨大分子電解質を含む巨大分子を精製するために用いることができる。本発明は、酵素、及び膜タンパクを含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸及びこれらの誘導体を精製ないし結晶化するために用いることができる。本発明はまた分子量が３００〜１，０００である低分子の結晶化にも使用できる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の結晶製造装置の一実施態様を示す概念図である。
【図２】図２は、本発明により得られたタンパク質結晶の一例についてその結晶構造を示す光学顕微鏡写真である。
（Ａ）：レーザー光照射後のリゾチーム溶液に認められた結晶
（Ｂ）：キセノンランプ照射後のリゾチーム溶液に認められた結晶
【図３】タンパク質としてソーマチンを用いて、ハンギングドロップ法で結晶を作成する場合の光照射時間と結晶数の関係を示した図である。
【符号の説明】
１：パルスレーザー光源
２：光ファイバー
３：巨大分子溶液
４：光学顕微鏡
５：温度制御装置 [0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for crystallizing a macromolecule, a macromolecule crystal prepared by using this method, and an apparatus for producing the macromolecule crystal.
[0002]
[Prior art]
In order to crystallize macromolecules such as proteins, methods such as batch method, dialysis method, liquid phase diffusion method, gas-liquid correlation diffusion method, etc. are used (Japan Biochemical Society, New Chemistry Experiment Course 1 “Protein I-Separation / Purification / Property- ”, 1990, published by Tokyo Chemical Doujin, written by Tsunehiro Takano, Chapter 14,“ Crystallization ”).
For example, according to the batch method, a precipitant such as ammonium sulfate is directly added to the protein solution to a crystallization concentration. In general, a precipitant is added to a container containing a macromolecule solution, and the macromolecule is controlled to be supersaturated to create a macromolecule crystal. This batch method has drawbacks such as requiring a large amount of a macromolecule sample with a high concentration, requiring skill in operation and low reproducibility, and difficult to screen for crystallization conditions. Further, the conventional crystallization method has a drawback that a specific macromolecule requires relatively specific crystallization conditions and there is no general-purpose condition.
[0003]
Japanese Patent Laid-Open No. 6-116098 irradiates a protein solution set to a temperature condition suitable for nucleation of protein crystals with laser light that appears to be visible, and analyzes the scattering state of the laser light to nucleate protein crystals. A technique is disclosed in which the start of nucleation is detected and the protein solution is controlled to a temperature condition suitable for crystal growth when the start of nucleation is detected. As shown in this example, the conventional example in which light is applied to a solution in the process of obtaining a crystal from a macromolecular solution only detects macromolecules or generated crystals, and crystal nucleation or crystal growth. However, the light irradiation had no positive effect.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the invention is to solve the drawbacks found in the conventional crystallization method, and to easily and reproducibly and universally produce a macromolecular crystal and a production apparatus used in the method. Is to provide. An object of the present invention is to provide a novel method capable of easily producing a low-molecular crystal that is difficult to crystallize and a production apparatus used in the method.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The above problem has been achieved by the following solutions.
1) A method for producing a macromolecular crystal, comprising a step of nucleating and / or growing a macromolecular crystal by irradiating the macromolecular solution with light,
2) The method for producing a macromolecular crystal according to 1), wherein the macromolecule is selected from the group consisting of a protein, a polypeptide, a glycoprotein, and a nucleic acid,
3) The method for producing a macromolecular crystal according to 1) or 2), wherein the irradiated light includes light in a wavelength range that causes an electronic transition of the macromolecule,
4) The method for producing a macromolecular crystal according to any one of 1) to 3), wherein the macromolecule solution contains a precipitant or a pH adjuster that promotes each production and / or crystal growth,
5) The method for producing a macromolecular crystal according to any one of 1) to 4), wherein light is irradiated using a mercury lamp, a xenon lamp, a laser light source or an excimer laser light source,
6) A macromolecular crystal obtained by the method for producing a macromolecular crystal according to any one of 1) to 5),
7) In 1), 3), 4) or 5), a method for producing a low-molecular crystal, wherein a low molecule is used instead of a macromolecule,
8) An apparatus for producing a macromolecular crystal comprising a light irradiation unit for nucleation and / or crystal growth of a macromolecular crystal or a low molecular crystal.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the term “macromolecule” refers to a molecule in an oligomer region having a molecular weight of about 1,000 or more and less than 10,000 in addition to a typical polymer having a molecular weight of 10,000 or more.
In the present invention, “low molecule” means a molecule having a molecular weight of less than about 1,000, preferably a molecule having a molecular weight of 300 or more and less than 1,000.
The method of the invention can be applied to the crystallization of various macromolecules, but is particularly suitable for the crystallization of polypeptides, proteins, and nucleic acids such as DNA, and derivatives thereof. Here, the derivatives include glycoproteins, DNA conjugates and the like.
[0007]
Hereinafter, the production method and production apparatus of the present invention will be described for macromolecules, but the description for “small molecules” is also common.
In the present invention, “nucleation” refers to an initial stage in which a macromolecular crystal appears from a macromolecular solution, and the formed nucleus is also referred to as “crystal nucleus”. Crystal nuclei are regular aggregates of macromolecules that can exist stably, and are aggregates of macromolecules that can cause crystal growth.
“Crystal growth” means that a macromolecule, which is a solute molecule, is taken into the surface of the crystal nucleus and the crystal becomes large.
The method for producing a macromolecular crystal of the present invention may be used only for the formation stage of crystal nuclei, or may be used only for the stage of crystal growth in which nuclei previously formed by another method are grown. Both steps of formation and subsequent crystal growth may be carried out continuously or sequentially with interruption in the middle.
[0008]
The macromolecule solution contains, as essential components, a macromolecule and a solvent that dissolves the macromolecule. The solvent can be selected depending on the macromolecule, and can be water, an organic solvent, or a mixture of water and an organic solvent (aqueous organic solvent) mixed with water.
[0009]
In the method for producing a macromolecular crystal of the present invention, the concentration of the macromolecule in the solution is preferably 80% or more of the saturation concentration under light irradiation conditions, more preferably 90% or more, and the saturation concentration. Or supersaturated is particularly preferred. With nucleation and / or crystal growth, the solution concentration is preferably maintained within the above range. In order to maintain the solution concentration, it is preferable to perform at least one of replenishment of solute, lowering of temperature, addition of a precipitant, and the like.
[0010]
In the present invention, a macromolecule subjected to crystallization can easily produce a crystal when its purity and homogeneity are higher. For this reason, it is preferable to perform appropriate purification of the macromolecules to be crystallized prior to crystal production according to the present invention.
Examples of the polypeptide include a polypeptide obtained by expression in Escherichia coli, yeast or animal cells and then isolated by a conventional method, or a synthetic polypeptide. The purification before crystallization is preferably performed by affinity chromatography, conventional chromatography, rpHPLC, FPLC, or the like. The nucleic acid is preferably obtained by a conventional isolation method and then crystallized after purification by increasing the purity. The protein is preferably crystallized after increasing the purity by a conventional method and confirming the purity by isoelectric focusing or light scattering.
[0011]
As the light used for causing nucleation or crystal growth of the macromolecular crystal, it is preferable to use monochromatic light or continuous light including a wavelength that electronically excites the macromolecule. The wavelength causing electronic transition refers to a wavelength having a molecular extinction coefficient of 10 or more. For many macromolecules, generally visible light (wavelength 390 to 700 nm) or ultraviolet light (wavelength 390) is used. is there. Ultraviolet light that can be used in the present invention includes deep UV having a wavelength of 180 to 300 nm, mid UV having a wavelength of 300 to 350, and near UV having a wavelength of 350 to 390 nm. When the solute is a general protein, ultraviolet rays of 180 to 320 nm can be preferably used.
[0012]
The light that can be used for crystallization of macromolecules should be a solid-state laser, gas laser, semiconductor laser, excimer laser, or other laser light source in addition to a steady-state light source such as a tungsten lamp, mercury lamp, or xenon lamp. You can also. Excimer lasers such as a pulsed xenon light source, a microwave excitation lamp, KrF (249 nm), ArF (193 nm), XeCl (308 nm), KrCl (222 nm) and F ₂ (157 nm) efficiently emit ultraviolet light in a pulse shape. Can be generated.
The intensity of light to be irradiated can be selected as appropriate, but usually light having an intensity in the range of several μW to several hundred W can be used.
The light irradiation may be stationary light or pulsed light. The irradiation intensity, energy per pulse, pulse interval, etc. can be changed as necessary.
[0013]
In the nucleation / crystallization method of the present invention, a precipitant that promotes crystallization, a pH regulator, and other additives used for protein crystallization can be added to the macromolecular solution irradiated with light. .
Optimum conditions for the solution used for nucleation / crystallization select the pH, type and concentration of precipitating agent, temperature and other factors for each macromolecule to be crystallized. Optimum conditions for macromolecules to crystallize (including solute concentration, solvent composition, temperature, type and concentration of precipitating agents, and their time variations) are part of routine laboratory work and are engaged in the field Can be easily determined by a technician who
[0014]
As a precipitant that can be used for crystallization, salts, organic solvents, water-soluble polymers, and the like can be used. As the salts, ammonium sulfate is most often used, but sodium chloride, phosphate, sodium citrate, sulfate, nitrate and the like can be used. A water-soluble organic solvent can be used as a precipitant. For example, 2-methyl-2,4-pentadiol (MPD), ethanol, propanoldioxane, or the like can be used. Polyethylene glycol can be used as the high molecular weight precipitating agent, and those having an average molecular weight of 2000 to 8000 can be used.
As a crystallization method, a hanging drop vapor diffusion method, a sitting drop vapor diffusion method, a microdialysis method, a free interface diffusion method, or a stationary batch method can be used.
Other conditions for promoting crystallization are described in the above-mentioned edition of the Japanese Biochemical Society, Shinsei Kagaku Kogaku Kenkyu 1 “Protein I-Separation / Purification / Property”, Tsunehiro Takano, Chapter 14, “Crystallization” McPherson, “Preparation and Analysis of Protein Crystals” (John Wiley & Son, Inc.).
[0015]
In the present invention, the time for crystal nucleation and / or crystal growth can be arbitrarily selected from the range of 0.5 hours to several months.
[0016]
The crystal form of the macromolecular crystal obtained in the present invention may be different from the crystal form of a crystal obtained by a batch method using a conventional precipitant. As shown in the examples, tetragonal lysozyme crystals can be obtained by light irradiation. Further, by changing the light source used in the present invention, the shape of the generated crystal can be changed based on the spectral energy distribution of the irradiated light, the difference between pulsed light and steady light, and the like.
According to the present invention, a large crystal suitable for X-ray crystal analysis can be obtained.
[0017]
The macromolecule crystallized according to the present invention is not only used as a sample for X-ray crystal structure analysis, but also generally has a very high storage stability, so it is used in a pharmaceutical composition as a prophylactic or therapeutic dosage form. The macromolecule is in crystalline form, which allows for particularly advantageous administration. Crystals are suitable for oral, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, intramuscular administration, for example. The invention therefore likewise consists of a pharmacologically effective amount of the macromolecule crystallized according to the invention as active substance and optionally one or more conventional pharmaceutically acceptable carriers. Includes pharmaceutical compositions.
[0018]
The macromolecules crystallized according to the invention are in principle in the same way as known for many macromolecules in pharmaceutical preparations, for example pharmacologically effective macromolecules 0.001 μg / kg It can be used as a depot formulation for administering a daily dose of 100 mg / kg body weight. Accordingly, a wide variety of macromolecules can be used in crystallized form according to the present invention, for example as therapeutic agent depot formulations, antigen depot formulations, DNA depot formulations or sugar depot formulations. The crystallization aid contained in the crystals is also used as an adjuvant (in vaccination).
[0019]
An apparatus for producing a macromolecular crystal used in the present invention includes a light source, an optical system for guiding light to a solution containing a macromolecule, a solution cell containing the macromolecule, a temperature controller for controlling the temperature of the cell, and a crystal. It can be composed of a magnifying glass for observation. When the electronic transition of the macromolecule occurs in the ultraviolet light, it is preferable to use an optical component such as a lens or a mirror that efficiently transmits or reflects the ultraviolet light used in the optical path for guiding the light from the light source to the irradiated sample.
In the optical system, optical members such as a reflecting mirror, a condensing lens, an optical filter, an infrared blocking filter, an optical fiber, and a nonlinear optical element can be used as appropriate.
The capacity of the solution cell in the crystal production apparatus of the present invention can be appropriately selected. It ranges from less than 1 ml to several hundred liters. The amount of macromolecule dissolved in solution can also range from a few mg to a few Kg or more.
[0020]
In the crystallization apparatus of the present invention, the temperature controller may maintain the internal temperature of the solution cell containing macromolecules at a constant temperature, or may be provided with a program circuit that changes the necessary temperature. In addition, if necessary, a device, a circuit, and a program for detecting and controlling the generation of crystal nuclei in the macromolecular solution, the concentration of the precipitant, pH, and the like may be provided. In order to detect and control the crystal condition, it is preferable to use a device in which a plurality of crystal condition detection cells are integrated into one chip. Such a detection chip can be manufactured by a general manufacturing process of a semiconductor device as described in JP-A-2001-213699.
The crystal production apparatus of the present invention does not contribute to the formation of crystal nuclei or crystal growth as described in JP-A-6-1116098, but long waves that are not absorbed by macromolecules for detecting the state of formation of crystal nuclei. Laser light can also be used.
[0021]
The mechanism of action of the present invention has not yet been elucidated. One possibility is that the solvent surrounding the macromolecule in the macromolecule solution (which becomes hydrated water in the case of an aqueous solution) is easily detached by irradiation with light, so that the nucleation and crystal growth of the macromolecule are prevented. A mechanism that is promoted is conceivable. However, whether or not this mechanism is appropriate does not affect the patentability or effectiveness of the present invention.
[0022]
【Example】
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
(Example 1)
Solution A, which contained 60 mg / ml lysozyme and 25 mg / ml sodium chloride, was maintained at pH 4.3 with a sodium acetate buffer solution. All the following examples were performed at room temperature of about 20 ° C. Solution A was dropped onto a slide glass and placed on a stage on an optical microscope. When a lysozyme solution on a slide glass was irradiated with a laser beam having a fourth harmonic of 266 nm of a neodymium YAG laser, a pulse width of 30 ns, and a pulse width of 2 mJ at 10 Hz for 20 minutes, the solution became cloudy. It was confirmed that tetragonal lysozyme crystals having a size of several tens of μm were deposited in the solution after laser light irradiation. In order to confirm whether or not the precipitation of crystals was caused by light, the solution A was dropped on a slide glass and allowed to stand for 20 minutes without being irradiated with laser light, and changes in the solution were observed. In the collected solution, orthorhombic crystals were initially scattered, but no tetragonal crystal precipitation observed when irradiated with laser light even after standing for 20 minutes. In addition, the orthorhombic crystal shape which was present at the beginning did not change. From the above results, it was revealed that lysozyme crystals were precipitated from a uniform solution by laser light irradiation.
(Example 2)
The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that a xenon lamp was used instead of the laser light source. As the xenon lamp, a USHIO UXL-500D 500 W lamp was used in steady lighting. One drop of the solution A prepared in Example 1 was dropped on a slide glass. Xenon lamp light was irradiated for 30 minutes. Although it was a homogeneous solution before light irradiation, it was confirmed that crystals were precipitated after irradiation with a xenon lamp. From this, it was confirmed that lysozyme crystals were precipitated by light irradiation including ultraviolet rays, even if not laser light.
(Example 3)
When an aqueous solution containing spermine, MPD, magnesium chloride, sodium cacodylate buffer solution, and synthetic DNA oligomer dCGGCGAATTCGCG is irradiated with laser light in the same manner as in Example 1, precipitation of crystals is observed.
Example 4
When an aqueous solution containing Escherichia coli RNase HI, which is one type of cellular RNase H, was prepared in the same manner as in Example 1, and laser irradiation was performed in the same manner as in Example 1, precipitation of crystals was observed.
(Example 5)
Lysozyme crystals were prepared by the hanging drop method.
5 microliters of the mother liquor for crystal formation was dropped on a glass plate and mixed with 5 microliters of sodium chloride solution. The sodium chloride concentration of the droplets was 1.0, 2.0, 2.5 or 3.0%. The mother liquor was irradiated with xenon lamp light for 15 seconds or 30 seconds. Thereafter, the glass plate was turned over and sealed in a well containing the reservoir solution using grease. Lysozyme crystals were observed in the droplets observed after 7 days. Crystals did not appear in the droplets that were not irradiated with light, but crystals appeared in the droplets of 2.0% concentration that were irradiated with light. From this, it has been found that crystals can appear even if the appearance of crystals is disadvantageous. Moreover, when the X-ray crystal structure analysis of the crystal which appeared by light irradiation was performed, the same structure as what was produced by the normal method was shown.
FIG. 3 shows the relationship between the light irradiation time and the number of crystals.
(Example 6)
Crystals were prepared by the hanging drop method using thaumatin as a protein. The protein concentration was 20 mg / ml, and 0.75 M sodium potassium tartrate was used as a precipitant. Light irradiation was performed with xenon lamp light for 5 minutes. When observed 7 days later, more crystals were present in the light-irradiated droplets. From this fact, it is considered that light irradiation promoted the formation of thaumatin crystal nuclei.
(Example 7)
Crystals were prepared by the hanging drop method using glucose isomerase as the protein. A commercially available glucose isomerase suspension was diluted 8 times to obtain a uniform solution. Light irradiation was performed with xenon lamp light for 5 minutes. When observed 4 days later, a large number of crystals appeared in the droplets irradiated with light.
(Example 8)
When a saturated solution of indomethacin (molecular weight 358) in ethanol-water (1: 1) was irradiated with 308 nm laser light, acicular crystals were deposited. When the laser beam was not irradiated, no crystal deposition was observed.
[0023]
【The invention's effect】
According to the present invention, crystals of macromolecules such as proteins can be produced easily and with good reproducibility. In the pharmaceutical industry and food industry, it can be used to purify macromolecules including macromolecular electrolytes. The present invention can be used to purify or crystallize enzymes, proteins, including membrane proteins, peptides, polypeptides, nucleic acids and derivatives thereof. The present invention can also be used for the crystallization of small molecules having a molecular weight of 300 to 1,000.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram showing one embodiment of the crystal production apparatus of the present invention.
FIG. 2 is an optical micrograph showing the crystal structure of an example of a protein crystal obtained by the present invention.
(A): Crystals observed in lysozyme solution after irradiation with laser beam (B): Crystals observed in lysozyme solution after irradiation with xenon lamp. It is the figure which showed the relationship between the light irradiation time in the case of doing, and the number of crystals.
[Explanation of symbols]
1: Pulse laser light source
2: Optical fiber
3: Macromolecular solution
4: Optical microscope
5: Temperature control device

Claims

Irradiating a macromolecule solution , which is uniform before light irradiation, with light including a wavelength range that causes electronic transition of the macromolecule, thereby causing nucleation and / or crystal growth of the macromolecular crystal. A method for producing a macromolecular crystal characterized by the above.

The method for producing a macromolecular crystal according to claim 1, wherein the macromolecule is selected from the group consisting of proteins, polypeptides, glycoproteins, and nucleic acids.

The method for producing a macromolecular crystal according to claim 1 or 2 , wherein the macromolecule solution contains a precipitation agent or a pH adjusting agent that promotes nucleation and / or crystal growth.

The wavelength causing the electronic transition of the macromolecule is such that the molecular extinction coefficient of the macromolecule is 10 (l · cm ^-1-1 ・ Mol ^-1-1 4) The method for producing a macromolecular crystal according to any one of claims 1 to 3, which has the above wavelength.

The method for producing a macromolecular crystal according to any one of claims 1 to 4, wherein the light includes a wavelength of 180 to 320 nm.

The method for producing a macromolecular crystal according to any one of claims 1 to 5, wherein the macromolecule is a protein, and the light includes a wavelength of 180 to 320 nm.