JP4138453B2

JP4138453B2 - Mammalian zona pellucida egg and method for producing the same

Info

Publication number: JP4138453B2
Application number: JP2002318788A
Authority: JP
Inventors: 直己中潟; 竜之中島
Original assignee: アーク・リソース株式会社; 中潟直己
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2022-10-31
Also published as: JP2004147604A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の卵透明帯に穿孔した卵子（本明細書において、「透明帯穿孔卵」という。）および透明帯穿孔卵の作製方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、凍結融解後の運動性の悪い精子に対しても、良好な体外受精を可能とする透明帯穿孔未受精卵および該透明帯穿孔未受精卵をレーザー光線を用いて作製する方法に関するものである。
【０００２】
また、本発明は、透明帯穿孔卵の作製のためのレーザー穿孔装置を用いる穿孔システムを提供するものである。
【０００３】
【従来の技術】
現在、ゲノム解析の進渉に伴ない、遺伝子の機能を解析・研究する必要性が強くなり、その目的のために、クローン化されたＤＮＡのマウス生殖系列への導入などにより、膨大な数量および種類の遺伝子導入マウスまたは遺伝子破壊マウス等の遺伝子改変マウスが作製されている。
そこで、膨大に開発される遺伝子改変マウスの保存が極めて重要な課題となっている。
【０００４】
しかしながら、何万種類もの極めて多種類の遺伝子改変マウスをすべて生体で維持することは不可能であり、受精卵および精子等の生殖細胞の凍結保存が経済的にもまた技術的にも有利なことからこれらの開発が急速に進められている。特に、受精卵に比較して精子が数の面でも多量に保存可能なため、マウス精子の凍結保存が注目されており、将来は精子の凍結保存が主流になるものと予測されている。
【０００５】
ところが、遺伝子改変マウスのバックグラウンドに約７０％以上も多用されているＣ５７ＢＬ／６系統マウスの精子は、凍結後、融解すると、その運動性は比較的良好であるものの、受精能が極端に低下し、通常の体外受精が、見込めないという状況にある。その原因は、本発明者らの検討によれば、精子の頭部の膜が、凍結処理および融解処理により破壊され、卵透明帯を自力で通過できなくなる点にあることが把握された。すなわち、図３の電子顕微鏡写真で示す新鮮な精子に対し、図４に示すように凍結融解精子は、頭部の膜が破壊されていることが観察できる。
【０００６】
かかる状況下において、従来、受精相手の未受精卵の透明帯の一部について研究者自ずからの手作業によるスリット状切開が実施されてきた（透明帯部分切開法(Partial Zona Pellucida Dissection) 以下、「ＰＺＤ」と称する。）（例えば、非特許文献１参照。）。かかる操作で透明帯の一部を切開することにより、運動性の悪い精子でも卵細胞質へ侵入させ、受精率を向上させることが試みられてきた。
【０００７】
また、非特許文献２には、圧電マイクロマニピュレーターを用いて透明帯の一部を切開する方法（Zona Pellucida Incision Using Piezo-micromanipulator） (以下、「ＺＩＰ」と称する。)が開示され、長さが約２６μｍの切開の事例が記載されている。
【０００８】
しかしながら、かかるＰＺＤおよびＺＩＰの方法は、いずれも透明帯の一部をスリット状に切開するものであり、手作業によるものであるから切開にはかなりの熟練と労力を要するものであり、処理量には限度があった。また、切開寸法の大きさにバラツキが生じ、均一の寸法のものが連続的に得られないなど、作製効率が低く、その結果、体外受精率も低いものであった。
【０００９】
【非特許文献１】
「BIOLOGY OF REPRODUCTION」（米国）57, 1050-1055（1997）
【非特許文献２】
「Journal of Mammalian( Ova Research）」（日本）19, 26-31（2002）
【非特許文献３】
「Journal of REPRODUCTION and fertility」（米国）87, 479-483（1989）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の第一の課題は、前記の如き、斯界における開発状況に鑑み、凍結保存および融解処理後の運動性の低下した精子に対してもさらに体外受精率の高い未受精卵を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の第二の課題は、従来のＰＺＤおよびＺＩＰの手作業による卵透明帯の一部切開方法の難点を克服し、最も良好な穿孔サイズを均一に施した透明帯穿孔卵の効率的な作製方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、卵子を覆っている透明帯にレーザー光線を用いて穿孔を形成させる方法を採用することにより、ほぼ円形状で均一の大きさの穿孔を有し、体外受精率が９０％にも達する良好な透明帯穿孔卵を実現できることができ、また、透明帯穿孔卵の作製方法として、例えば、一人一日当たり１０００個以上もの高効率で処理することができ、しかも穿孔後の生存卵の割合が１００％を達成できることに着目し、かかる知見に基づいて本発明の完成に至った。
【００１３】
かくして、本発明によれば、
哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが、１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させてなることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵が提供される。
【００１４】
また、本発明によれば、
哺乳動物から採取した未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通する穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法が提供される。
【００１５】
特に、前記レーザー光線の照射による穿孔位置が、前記未受精卵を細胞収縮処理に供し、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位にある前記哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法
が提供される。
【００１６】
本発明は、前記の如く哺乳動物の透明帯穿孔卵および該透明帯穿孔卵の作製方法を提供するものであるが、さらに、次に示す如き１）〜５）の好ましい実施の態様を包含する。
【００１７】
１）前記哺乳動物が遺伝子改変マウスである前記哺乳動物の透明帯穿孔卵。
２）前記透明帯穿孔卵が、凍結保存された未受精凍結卵である前記哺乳動物の透明帯穿孔卵。
３）雌マウスから採取された未受精卵を細胞収縮処理に供し、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位にレーザー光線を穿孔条件下において照射し、前記透明帯を貫通する直径または短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させる前記透明帯穿孔卵の作製方法。
４）前記レーザー光線の穿孔条件が、波長：５００ｎｍ〜２，０００ｎｍ、出力：２０ｍＷ〜２００ｍＷ、パルス巾：０．１ｍｓ〜１２５ｍｓである前記透明帯穿孔卵の作製方法。
５）雌マウスから採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を波長：１，０００ｎｍ〜１，８００ｎｍ、出力：１００ｍＷ〜２００ｍＷ、パルス巾：３ｍｓ〜１００ｍｓで照射し、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが１０μｍ〜２０μｍの穿孔を形成させた透明帯採光卵の作製方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、哺乳動物の卵透明帯に特定のほぼ円形状の穿孔をレーザー光線により形成させた透明帯穿孔卵および該透明帯穿孔卵の作製方法を提供するものである。
【００１９】
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法に用いられる未受精卵を提供する哺乳動物は、特に限定されるものではなく、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、豚、ウサギ等の家畜およびマウス、ラット、モルモット、その他の実験動物等のあらゆる哺乳動物を対象とすることができるが、本発明によれば、マウス、ラット、特に遺伝子改変マウスに有用である。
【００２０】
哺乳動物の卵透明帯は、卵細胞質の周囲を覆う透明な卵膜であり、糖タンパク質から成り、精子受容体活性および先体反応誘起活性を有することが知られている。その直近の外側は、濾泡細胞からなる放射冠があり、その外側は濾泡細胞からなる卵丘で囲まれている。通常、精子はアクロシン等により透明帯を溶かし囲卵腔に侵入するものと理解されている。
【００２１】
受精に際しては、近傍に到来した精子は、透明帯に接触すると先体反応が生じ、頭部の先端にある先体が変化してヒアルロニダーゼ、アクロシン等の溶解素が放出され、これらの働きにより精子は透明帯を通過し、内部に存在する卵細胞に到達し、受精に到るが、前記した如く、凍結保存されたマウス、特にＣ５７ＢＬ／６系統雄マウスの精子は、凍結処理および融解処理により損傷をうけ活力を低下し、透明帯を通過する力を欠いているものが多く、受精率が低いことに鑑み、精子が透明帯を通過できるように特定の大きさで、かつ最適な形状の穿孔を透明帯に形成させたものである。
【００２２】
かかる透明帯に形成させた穿孔の形状は、図１の本発明に係る透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真で示すように、穿孔部分がほぼ円形状のものであり、透明帯を貫通したものである。かかる穿孔形状を有する透明帯穿孔卵は、体外受精率の向上に寄与する点が大きく、これは、円形状の穿孔構造が精子の通過を容易にしているものと推定されるのであり、スリット状の切開方法による場合と比較して穿孔した後の生存卵の割合（生存率）、体外受精率等の点において著しく顕著な効果を奏するものである。
【００２３】
また、透明帯の穿孔の寸法は、その直径または楕円形の場合の短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍ、好ましくは１０μｍ〜２０μｍであり、かかる直径等の範囲において体外受精率を著しく向上させることができる。
【００２４】
以下、本発明に係る哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法についてマウスを例に説明する。
すなわち、該透明帯穿孔卵の作製方法は、少なくとも次の工程を含む。
【００２５】
１）未受精卵の採取
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法において、哺乳動物、特にマウスからの未受精卵の採取に際しては、当該技術分野で実施されている前処理を採用することができる。すなわち、排卵誘発剤の投与により過排卵処理を行なった雌マウスを安楽死させ腹部を切開する。子宮、卵管、卵巣を体外に取り出した後、卵管のみを採取し、卵管膨大部より卵丘細胞に包まれた未受精卵を取り出す。具体的には、過排卵処理は、排卵誘発剤、例えば、卵胞刺激ホルモン性の性腺刺激ホルモンの卵胞成熟効果と、黄体形成ホルモン性の性腺刺激ホルモンの排卵効果とを組合せたものであり、具体的には、成熟雌マウスに所定濃度の妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ）とヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を、例えば４８時間間隔で腹腔内に投与（２．５〜７．５単位／匹）することにより過排卵処理を施すことができる。過排卵処理を施した雌マウスの卵管膨大部より未受精卵塊を採取する。
【００２６】
２）卵丘細胞の除去
前記工程にて得られた未受精卵をヒアルロニダーゼ処理に供し、卵丘細胞を除去する。具体的には、未受精卵をヒアルロニダーゼを添加した体外受精用培地（ＨＴＦ培地）に導入し、ヒアルロニダーゼで処理し、洗浄後、卵丘細胞が除去された未受精卵を得る。
【００２７】
３）細胞質収縮処理
卵細胞収縮処理は、前記の如くして得られた未受精卵をレーザー光線による穿孔に供する前に、スクロース（Sucrose）溶液に導入するものである。すなわち、前記工程にて得られた未受精卵をスクロース溶液に導入することにより、細胞質を収縮させ、細胞質と透明帯の間の囲卵腔を拡大させる。スクロースの濃度としては、０．１Ｍ〜１Ｍのものが好ましい。スクロース処理により図２に示すように卵細胞質が収縮し、囲卵腔が拡大されるので、同図に示すようにレーザー光線の照射位置を最適化することができ、これにより、レーザーによる卵細胞質へのダメージを回避することができる。
【００２８】
４）レーザー光線による穿孔
前記工程にて得られた未受精卵の囲卵腔の最大スペースの透明帯部位（図２参照。）に透明帯穿孔卵作製用レーザー穿孔装置（図５）を用いてモニター画面を見ながらボタン操作とピント調整によりレーザー光線を穿孔条件下において照射する。レーザー光線の照射による透明帯穿孔卵の作製方法について図５を参照して具体的に説明する。レーザー光線により得られた透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真を図１に示す。
【００２９】
透明帯穿孔卵の作製に用いられるレーザー穿孔装置を図５に示す。該穿孔装置は、透明帯に照射するレーザー光線を発生させるレーザー装置１、レーザー装置１から出力されたレーザー光線（ビーム）ａａを照射する未受精卵を保有するシャーレ６を具備する倒立顕微鏡２、モニター３およびリモコン４から構成されたものである。倒立顕微鏡２は、ケーブルａおよびｂによりレーザー装置１およびモニター３に接続され、倒立顕微鏡２の映像は、ケーブルｂを経てモニター３に映し出される。レーザー装置１の設定およびレーザー照射は、すべてリモコン４により操作される。リモコン４からの信号によりレーザー装置１から出力されたレーザー光線ａａは線ａを経て倒立顕微鏡２に入り、ステージ５上に置かれたシャーレ６内の未受精卵に下から照射され、透明帯の所定部位が穿孔される。
【００３０】
次に、穿孔の操作について説明する。
本発明に係る透明帯穿孔卵は、前記レーザー穿孔装置を用いることにより効率よく作製することができ、透明帯卵作製方法によれば、次の操作手順を採用することができる。
【００３１】
倒立顕微鏡２のステージ５に卵丘細胞を除去した所定数量の未受精卵を装入したシャーレ４を載置する。倒立顕微鏡２を覗いて視野の中央に未受精卵を移動させる。モニター３の画面にも所定操作により顕微鏡と同じ画像が映し出されるように制御する。レーザー装置１とケーブルＣにより接続しているリモコン４で穿孔の大きさを設定する。ついで、ステージ５を移動させて、モニター３画面上の照射ポイントに未受精卵の穿孔部位とピントを合わせた後、リモコン４のスイッチ４を押し、レーザー光線をケーブルａを経て倒立顕微鏡２のステージ５上のシャーレ６内の未受精卵に照射し穿孔する。
【００３２】
穿孔を確認後、ステージ５を移動させ、次に未受精卵を前記と同様にモニター３画面上の照射ポイントに合わせ、リモコン４を操作してレーザー装置１からレーザー光線をシャーレ６内の未受精卵に照射し穿孔する。
【００３３】
かかる操作により、すべての未受精卵の穿孔が終了した後、倒立顕微鏡ステージ５からシャーレ６を脱着し、新たなシャーレを設置する。この操作を繰り返すことにより、穿孔作業を連続的に行なうことができる。
【００３４】
前記レーザー装置は、誘導放出を利用した光の増巾器または発振器であるが、レーザー媒質の種類により、気体レーザー、固体レーザー、半導体レーザー等各種の型が開発されている。気体レーザーとしては、ＨｅとＮｅとの混合ガスを用いたＨｅ−Ｎｅレーザー、アルゴンイオンの励起準位を利用したアルゴンレーザー、炭酸ガスを用いる炭酸ガスレーザーのほか、銅蒸気レーザー等を、また固体レーザーとしては、ネオジウムイオン（Ｎｄ³⁺）をドープしたＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット結晶）を用いるＮｄ：ＹＡＧレーザー、ガラスにネオジウムイオンをドープしたガラスレーザー、ルピーにクロムイオンをドープしたルピーレーザー等を挙げることができる。本発明の透明帯穿孔卵の作製には、レーザー光線の波長、出力およびパルス巾等の穿孔条件を設定・制御できるものであれば、特に限定するものではなく、市販品を使用することができる。
【００３５】
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法において、用いられるレーザー光線は、波長（λ）として５００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲のものを選択することができるが、特に、１０００ｎｍ〜１８００ｎｍの範囲のものが好ましい。出力としては、２０ｍＷ〜２００ｍＷ、好ましくは１００ｍＷ〜２００ｍＷの範囲のものを採用することができる。また、パルス巾としては０．１ｍｓ〜１２５ｍｓ、好ましくは、３ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のものを選択して採用することができる。
【００３６】
レーザー光線による穿孔条件は、前記の各条件を適宜選択して組合せることができるが、波長が５００ｎｍに達しないと穿孔が十分形成できず、一方、２０００ｎｍを超えると細胞破壊の弊害が生ずる。また、出力が２０ｍＷに達しないと、穿孔が不十分であり容易に貫通孔が得られない。一方、２００ｍＷを超えると細胞破壊のおそれが生じ、効率よく穿孔処理ができないという難点がある。また、パルス巾についても０．１ｍｓに満たないと穿孔不十分のおそれがあり、一方、１２５ｍｓを超えると細胞破壊が生ずるという難点を包蔵する。
【００３７】
５）穿孔卵の凍結保存
前記工程にて得られた透明帯穿孔卵は、通常、凍結保存に供される。
凍結方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、中尾・中潟式簡易ガラス化法、緩慢法、二段階法等をはじめ各種方法を任意に選択して用いることができる。中尾・中潟式簡易ガラス化方法によれば、非特許文献３に示すように、透明帯穿孔未受精卵を５μｌの１Ｍジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共にクライオチューブ内に移し、５分間静置する。次に簡易ガラス化保存用液（ＤＡＰ２１３；２Ｍジメチルスルホキシド、１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含むリン酸緩衝液）を４５μｌ添加し、５分後液体窒素中に浸漬し、未受精卵を凍結保存する方法が採用されている。
【００３８】
なお、本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法に供される未受精卵は、当然のことながら凍結保存後、融解処理したものも用いることができる。前記方法による凍結保存は、透明帯穿孔卵のほか、未穿孔卵、穿孔受精卵についても同様に適用することができる。
【００３９】
ここでマウスについて、本発明に係るレーザー光線を用いる透明帯穿孔卵の作製方法と従来から実施されているＰＺＤ法との各評価項目に対する評価結果をまとめると表１に示す通りである。
【００４０】
【表１】

【００４１】
表中、作業性を示す「作業時間」は、穿孔または切開から洗浄までの時間であり、レーザーおよびＰＺＤにはあまり相違がないが、「労力」、「熟練度」については本発明に係るレーザーによれば、ヒトへの負担は小さいため軽く、また、レーザー装置は操作が容易なため熟練度は不必要である。
【００４２】
また、「作業量」については、本発明の方法では一人一日当たり１０００個以上の穿孔卵の作製が可能であるが、ＰＺＤでは手作業のため約３００個が限界とされる。また、穿孔卵の品質・性能については、穿孔卵の生存率がＰＺＤでは手作業による操作ミスのため９０％にとどまるのに対し、本発明では１００％の結果であり、全量安全に確保することができる。
【００４３】
さらに、「体外受精率」が、本発明の場合９０％と高水準に達するのに対し、ＰＺＤでは高々６０％程度のものであり、本発明の効果が如実に現われている。かくして、本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法によれば、前記した如く、従来から実施されているＰＺＤ法に比較して、作業性において効率上極めて優れており、また、得られる透明帯穿孔卵の生存率、体外受精率が著しく高いことから、効率よく高品質の透明帯穿孔卵の作製を実現することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明について、実施例および比較例を以ってさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、実施例等により何ら限定されるものではない。
【００４５】
なお、実施例等において用いた供試動物、透明帯穿孔用レーザー装置および穿孔システムは次の通りである。
（１）供試動物
Ｃ５７ＢＬ／６系統雌マウス（日本クレア社）
（２）使用機器
レーザー装置、倒立顕微鏡、テレビモニターの各市販品
【００４６】
実施例１
成熟した前記Ｃ５７ＢＬ／６系統雌マウス３０匹に妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ）を腹腔内に投与し、その４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を腹腔内に１匹あたり２．５〜７．５単位を投与し、過排卵処理を行なった。
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与１５時間後に過排卵処理した雌マウスを屠殺し、卵管膨大部より未受精卵を取り出し、体外受精用培地（ＨＴＦ）に導入した。未受精卵を導入したＨＴＦ培地に０．１％ヒアルロニダーゼを添加し、３分間インキュベーター内に静置した。その後、３回洗浄を行ない、卵丘細胞を除去した。
卵丘細胞を除去した未受精卵は、クラス３Ｂレーザー装置を用いる透明帯への穿孔に供した。すなわち、該未受精卵をレーザーによる卵細胞質へのダメージを避けるため０．１Ｍ〜１Ｍ sucrose溶液に導入し、図２に示すように卵の細胞質を収縮させた。次に、レーザー光線を下記の操作により卵細胞質と透明帯の間、すなわち囲卵腔のスペースが最も広いところ１ケ所に照射し直径１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させた。
透明帯の穿孔は、図５に示す透明帯穿孔卵作製レーザー穿孔装置を用いて次の操作手順により行なった。
【００４７】
１．先ず、レーザー装置１、倒立顕微鏡２およびモニター３を稼働状態とした後、倒立顕微鏡２のステージ中央にプラスティックシャーレ４を載置した。プラスティックシャーレ４には卵丘細胞を除去した未受精卵を数十個入れておいた。
２．倒立顕微鏡を覗いて、視野の中央に未受精卵を移動させた。
３．モニター画面にも顕微鏡と同一の画像が映し出されることを確認した。
４．レーザー装置本体１からケーブルで結合しているリモコンで穿孔する穴の大きさを設定した。
５．倒立顕微鏡２のステージを移動させモニター画面上の照射ポイントに未受精卵の穿孔部位とピントを合わせた。
６．リモコン４のスイッチを押し、レーザーを照射し穿孔した。
７．穿孔を確認後、ステージを移動させ、次の未受精卵をモニター画面上の照射ポイントに合わせ、レーザー光線ａａを照射した。
８．すべての未受精卵の穿孔の終了後、倒立顕微鏡ステージ５からプラスティックシャーレ６を下ろし、新たなシャーレと交換した。
【００４８】
前記穿孔操作においてレーザー光線による透明帯穿孔の条件は次の通りとした。
波長；１．４８０ｎｍ
出力；１６５〜２００ｍＷ
パルス巾；０．１〜７．０ｍｓ
前記の如くして透明帯への穿孔が終了した透明帯穿孔未受精卵をＨＴＦ培地で３回洗浄し、その後、体外受精に供した。
【００４９】
（精子の融解）
凍結保存していたＣ５７ＢＬ／６系統雄マウスの精子を液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬した。１５分間放置後融解した精子を１００μｌの体外受精用培地（ＨＴＦ）に懸濁させた。凍結融解後の精子は、図３に示す新鮮精子と比較して図４に示すように頭部に損傷を有するものであった。
【００５０】
（体外受精）
前記の受精用培地（ＨＴＦ）に懸濁させた精子の濃度を５００〜７００精子／ｍｌに調整し、その一部を前記透明帯穿孔未受精卵の培地に導入した。３時間後に該透明帯穿孔卵を新鮮な培養液（ＨＴＦ）で洗浄し、２細胞期へ発生した胚および未受精卵を回収し、それらの数を計測し、体外受精率を次の式で求めたところ９０％であった。
体外受精率（％）
＝（２細胞期胚の数）／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）×１００
【００５１】
実施例２
実施例１と同一の操作により得られた透明帯穿孔未受精卵を中尾・中潟式簡易ガラス化方法を用いて凍結した。
すなわち、透明帯に穿孔した未受精卵を５μｌの１Ｍ DMSO と共にクライオチューブ内に移し、５分間静止した。次に、簡易ガラス化保存用液ＤＡＰ２１３^*を４５μｌ添加し、５分間液体窒素中に浸漬し、凍結保存に供した。
凍結保存後、凍結された透明帯穿孔未受精卵を融解処理に供した後、実施例１に記載の体外受精方法と同一条件・操作の体外受精方法に供したところ、体外受精率７０％であった。
*２ＭＤＭＳＯ、１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含むリン酸緩衝液
【００５２】
実施例３
レーザー光線による透明帯穿孔卵作製において、透明帯に穿孔した穴の数が１個〜５個となるように、レーザー光線の照射条件を制御して穿孔を行なった。それら透明帯穿孔卵は実施例１と同一の操作おび条件による体外受精に供した。その結果、穿孔数による大きな影響は認められず、穿孔後の生存率は９０％〜１００％、体外受精率は７０％〜９０％であった。
【００５３】
比較例１
卵丘細胞を除去した未受精卵のレーザー光線による透明帯の穿孔の代わりにＰＺＤにより透明帯を切開した。
すなわち、過排卵処理した雌マウスから未受精卵を採取し、０．１％ヒアルロニダーゼを添加することにより卵丘細胞の除去を行なった。卵丘細胞を除去した未受精卵は、０．３Ｍ sucrose溶液に導入し、卵の細胞質を収縮させ、プラスティックシャーレの底に卵を固定させた。次に顕微鏡下で３０ゲージの注射針を用いて１個１個手作業によって長さ５０〜１００μｍの切り込みを入れ、透明帯に切開を行なった。切開後、透明帯切開卵はＨＴＦ培地で３回洗浄し、その体外受精に供した。なお、透明帯切開以外は、すべて実施例１の操作と同一の操作により体外受精に供した。この方法による生存率は９０％、体外受精率は６０％であった。
【００５４】
【表２】

【００５５】
【発明の効果】
レーザー光線を用いる透明帯穿孔卵の作製は、従来のＰＺＤに比較して、連続的な作業が可能であり、熟練を要することがないので、例えば、一人１日当たりＰＺＤでは３００個が限界であるのに対し、本発明では、１０００個以上可能であり、操作ミスが小さいため、穿孔卵の生存率も１００％に達する。
また、レーザー穿孔により体外受精率が９０％にも達するなど高品質の透明帯穿孔卵を提供することができる。
さらに、透明帯穿孔卵作製用レーザー穿孔装置によれば、正確で安定した穿孔が可能であり、高効率の透明帯穿孔卵の作製に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真（倍率；１５００倍である。
【図２】本発明に係る透明帯穿孔卵の穿孔位置を示す断面写真である。
【図３】Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの新鮮精子の電子顕微鏡写真である。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの凍結融解精子の電子顕微鏡写真である。
【図５】本発明に係る透明帯穿孔卵の作製に用いるレーザー穿孔装置の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
１レーザー装置
２倒立顕微鏡
３テレビモニター
４リモートコントローラー[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an egg perforated in the egg zona pellucida of a mammal (referred to herein as “zona pellucida egg”) and a method for producing a zona pellucida perforated egg. More specifically, the present invention uses a laser beam to produce a zona perforated unfertilized egg that allows good in vitro fertilization even for sperm with poor motility after freezing and thawing, and the zona perforated unfertilized egg. It is about how to do.
[0002]
The present invention also provides a perforation system using a laser perforation apparatus for the production of zona pellucida perforated eggs.
[0003]
[Prior art]
Currently, with the progress of genome analysis, there is a strong need to analyze and study the function of genes, and for that purpose, the introduction of cloned DNA into the mouse germline, etc. Genetically modified mice such as various types of transgenic mice or gene disrupted mice have been produced.
Therefore, the preservation of gene-modified mice that are developed in large quantities is an extremely important issue.
[0004]
However, it is impossible to maintain all tens of thousands of genetically modified mice in vivo, and cryopreservation of germ cells such as fertilized eggs and sperm is economically and technically advantageous. Since then, these developments are progressing rapidly. In particular, since sperm can be stored in a large amount in terms of number compared to fertilized eggs, cryopreservation of mouse sperm is attracting attention, and it is predicted that cryopreservation of sperm will become the mainstream in the future.
[0005]
However, the sperm of C57BL / 6 strain mice, which are used about 70% or more in the background of genetically modified mice, are relatively good in motility when thawed after freezing, but fertility is extremely reduced. However, normal in vitro fertilization is not expected. According to the study by the present inventors, it has been found that the membrane of the sperm head is destroyed by freezing and thawing treatment and cannot pass through the egg zona pellucida by itself. That is, in contrast to the fresh sperm shown in the electron micrograph of FIG. 3, it can be observed that the membrane of the head of the freeze-thawed sperm is broken as shown in FIG.
[0006]
Under such circumstances, conventionally, a slit-shaped incision was manually performed by a researcher on a part of the zona pellucida of a non-fertilized egg of a fertilization partner (Partial Zona Pellucida Dissection). PZD ") (see Non-Patent Document 1, for example). It has been attempted to improve the fertilization rate by incising a part of the zona pellucida by such an operation so that sperm with poor motility can enter the egg cytoplasm.
[0007]
Non-Patent Document 2 discloses a method of cutting a part of the zona pellucida (Zona Pellucida Incision Using Piezo-micromanipulator) (hereinafter referred to as “ZIP”), and has a length. An example of an incision of about 26 μm is described.
[0008]
However, both of these PZD and ZIP methods are to cut a part of the zona pellucida in a slit shape, and are manual work. Therefore, the incision requires considerable skill and labor, and the amount of processing is large. There was a limit. In addition, the incision size varies, and a uniform size cannot be obtained continuously. Thus, the production efficiency is low. As a result, the in vitro fertilization rate is low.
[0009]
[Non-Patent Document 1]
“BIOLOGY OF REPRODUCTION” (USA) 57 , 1050-1055 (1997)
[Non-Patent Document 2]
"Journal of Mammalian (Ova Research)" (Japan) 19 , 26-31 (2002)
[Non-Patent Document 3]
"Journal of REPRODUCTION and fertility" (USA) 87 , 479-483 (1989)
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the first problem of the present invention is to provide an unfertilized egg having a higher in vitro fertilization rate even for sperm with reduced motility after cryopreservation and thawing treatment in view of the development situation in the field as described above. There is to do.
[0011]
In addition, the second problem of the present invention is to overcome the disadvantages of the conventional method of partially incising the egg zona pellucida by manual operation of PZD and ZIP, and to improve the efficiency of the zona pellucida perforated egg with the best perforation size uniformly applied. It is to provide a practical manufacturing method.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventors have made extensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and by adopting a method of forming a perforation using a laser beam on a transparent band covering an egg, it is substantially circular and uniform. Can produce a zona pellucida egg with an in vitro fertilization rate as high as 90%. Also, as a method for producing a zona pellucida egg, for example, 1000 or more per person per day Focusing on the fact that the ratio of viable eggs after perforation can be achieved at 100% with high efficiency, the present invention has been completed based on this finding.
[0013]
Thus, according to the present invention,
A zona pellucida that covers the periphery of an unfertilized egg collected from a mammal is formed with a substantially circular perforation that penetrates the zona pellucida and has a diameter or short axis length of 10 μm to 40 μm. A mammalian zona pellucida perforated egg is provided.
[0014]
Moreover, according to the present invention,
A method for producing a zona pellucida-perforated egg of a mammal, comprising irradiating a zona pellucida covering a periphery of an unfertilized egg collected from a mammal under a perforation condition to form a perforation penetrating the zona pellucida Is provided.
[0015]
In particular, the transparent position of the mammal in which the perforation position by irradiation with the laser beam is in the zona pellucida site where the unfertilized egg is subjected to cell contraction treatment and the volume of the oviposition cavity between the cytoplasm and the zona pellucida is maximized A method for producing a band-perforated egg is provided.
[0016]
The present invention provides a zona pellucida perforated egg of a mammal and a method for producing the zona pellucida perforated egg as described above, and further includes preferred embodiments 1) to 5) as shown below. .
[0017]
1) The zona pellucida perforated egg of the mammal, wherein the mammal is a genetically modified mouse.
2) The zona pellucida perforated egg of the mammal, wherein the zona pellucida perforated egg is a cryopreserved unfertilized frozen egg.
3) subjecting an unfertilized egg collected from a female mouse to a cell contraction treatment, irradiating a zona pellucida region where the volume of the oviposition space between the cytoplasm and the zona pellucida is maximized under a perforation condition, The method for producing a zona perforated egg, wherein a perforation having a diameter or a short axis length of 10 μm to 40 μm penetrating the zona pellucida is formed.
4) The method for producing a zona pellucida punched egg, wherein the laser beam drilling conditions are a wavelength: 500 nm to 2,000 nm, an output: 20 mW to 200 mW, and a pulse width: 0.1 ms to 125 ms.
5) A zona pellucida covering the periphery of an unfertilized egg collected from a female mouse is irradiated with a laser beam at a wavelength of 1,000 nm to 1,800 nm, an output: 100 mW to 200 mW, and a pulse width: 3 ms to 100 ms. A method for producing a zona pellucida egg which has a substantially circular perforation penetrating through the perforation and has a diameter or a short axis length of 10 μm to 20 μm.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides a zona pellucida egg in which a specific substantially circular perforation is formed in a mammalian egg zona pellucida by a laser beam, and a method for producing the zona pellucida egg.
[0019]
Mammals that provide unfertilized eggs used in the method for producing zona pellucida perforated eggs according to the present invention are not particularly limited, and domestic animals such as cows, horses, goats, sheep, pigs, rabbits, mice, rats , Guinea pigs and other mammals such as other laboratory animals can be targeted, but the present invention is useful for mice, rats, particularly genetically modified mice.
[0020]
The mammalian egg zona pellucida is a transparent egg membrane covering the periphery of the egg cytoplasm, is composed of glycoprotein, and is known to have sperm receptor activity and acrosome reaction-inducing activity. The immediate outside is a radial crown made of filter foam cells, and the outside is surrounded by cumulus made of filter foam cells. Usually, it is understood that spermatozoa dissolve the zona pellucida with acrosin or the like and invade the follicular cavity.
[0021]
Upon fertilization, sperm that arrives in the vicinity undergoes acrosome reaction when it contacts the zona pellucida, and the acrosome at the tip of the head changes to release lysins such as hyaluronidase and acrosin. Passes through the zona pellucida, reaches the egg cells present inside, and reaches fertilization. As described above, sperm of cryopreserved mice, particularly C57BL / 6 strain male mice, are damaged by freezing and thawing treatment. In view of the low fertility rate and the low fertilization rate, the perforation has a specific size and optimal shape so that sperm can pass through the zona pellucida. Is formed into a zona pellucida.
[0022]
The shape of the perforations formed in the zona pellucida, as shown in the electron micrograph of the zona pellucida perforated egg according to the present invention in FIG. is there. The zona perforated egg having such a perforated shape has a large contribution to the improvement of in vitro fertilization rate, which is presumed that the circular perforated structure facilitates the passage of sperm, and is slit-shaped. Compared with the case of the incision method, the ratio of viable eggs after being perforated (survival rate), in vitro fertilization rate, etc. are remarkably remarkable.
[0023]
The dimension of the perforation of the zona pellucida is 10 μm to 40 μm, preferably 10 μm to 20 μm, with the diameter or the length of the short axis in the case of an ellipse, and the in vitro fertilization rate is remarkably improved in such a range of the diameter. Can do.
[0024]
Hereinafter, a method for producing a zona pellucida perforated egg of a mammal according to the present invention will be described taking a mouse as an example.
That is, the method for producing the zona pellucida-pierced egg includes at least the following steps.
[0025]
1) Collection of unfertilized eggs In the method for producing zona pellucida-perforated eggs according to the present invention, pretreatment performed in the technical field is performed when collecting unfertilized eggs from mammals, particularly mice. Can be adopted. That is, a female mouse that has been superovulated by administration of an ovulation inducer is euthanized and the abdomen is cut open. After the uterus, fallopian tube, and ovary are removed from the body, only the fallopian tube is collected, and unfertilized eggs wrapped in cumulus cells are removed from the huge portion of the fallopian tube. Specifically, the superovulation treatment is a combination of an ovulation inducer, for example, the follicular maturation effect of follicle stimulating hormone-type gonadotropin and the ovulation effect of luteinizing hormone-type gonadotropin, Specifically, a mature female mouse is administered intraperitoneally with a predetermined concentration of pregnant mare serum gonadotropin (PMS) and human chorionic gonadotropin (hCG) at intervals of 48 hours (2.5 to 7.5 units). The superovulation treatment can be performed. An unfertilized egg mass is collected from the enormous portion of the fallopian tube of a female mouse subjected to superovulation treatment.
[0026]
2) Removal of cumulus cells The unfertilized egg obtained in the above step is subjected to hyaluronidase treatment to remove cumulus cells. Specifically, an unfertilized egg is introduced into an in vitro fertilization medium (HTF medium) to which hyaluronidase is added, treated with hyaluronidase, and after washing, an unfertilized egg from which cumulus cells have been removed is obtained.
[0027]
3) Cytoplasmic contraction treatment In the egg cell contraction treatment, an unfertilized egg obtained as described above is introduced into a sucrose solution before being perforated with a laser beam. That is, by introducing the unfertilized egg obtained in the above step into a sucrose solution, the cytoplasm is contracted, and the surrounding space between the cytoplasm and the zona pellucida is expanded. The sucrose concentration is preferably 0.1M to 1M. As shown in FIG. 2, the sucrose treatment contracts the egg cytoplasm and enlarges the surrounding space, so that the irradiation position of the laser beam can be optimized as shown in FIG. Damage can be avoided.
[0028]
4) Perforation by laser beam Laser perforation apparatus for producing zona pellucida perforated eggs (Fig. 5) in the zona pellucida region (see Fig. 2) of the maximum space in the surrounding cavity of the unfertilized egg obtained in the above step. While observing the monitor screen using the button, the laser beam is irradiated under drilling conditions by button operation and focus adjustment. A method for producing a zona pellucida perforated egg by laser beam irradiation will be specifically described with reference to FIG. FIG. 1 shows an electron micrograph of zona pellucida eggs obtained with a laser beam.
[0029]
FIG. 5 shows a laser perforation apparatus used for producing zona pellucida perforated eggs. The perforating apparatus includes a laser apparatus 1 that generates a laser beam that irradiates a zona pellucida, an inverted microscope 2 that includes a petri dish 6 that holds an unfertilized egg that irradiates a laser beam (beam) aa output from the laser apparatus 1, and a monitor 3. And a remote controller 4. The inverted microscope 2 is connected to the laser device 1 and the monitor 3 by cables a and b, and the image of the inverted microscope 2 is displayed on the monitor 3 through the cable b. Setting of the laser device 1 and laser irradiation are all operated by the remote controller 4. The laser beam aa output from the laser device 1 by the signal from the remote controller 4 enters the inverted microscope 2 via the line a, and is irradiated from below to the unfertilized egg in the petri dish 6 placed on the stage 5 to give a predetermined zona pellucida. The site is perforated.
[0030]
Next, the drilling operation will be described.
The zona pellucida perforated egg according to the present invention can be efficiently produced by using the laser perforation apparatus, and according to the zona pellucida production method, the following operation procedure can be adopted.
[0031]
A petri dish 4 loaded with a predetermined number of unfertilized eggs from which cumulus cells have been removed is placed on the stage 5 of the inverted microscope 2. Look into the inverted microscope 2 and move the unfertilized egg to the center of the visual field. Control is performed so that the same image as the microscope is displayed on the screen of the monitor 3 by a predetermined operation. The size of the perforation is set by the remote controller 4 connected to the laser device 1 by the cable C. Next, the stage 5 is moved so that the pierced part of the unfertilized egg is focused on the irradiation point on the screen of the monitor 3, and then the switch 4 of the remote control 4 is pressed, and the laser beam is passed through the cable a to the stage 5 of the inverted microscope 2. Irradiate and puncture the unfertilized eggs in the upper petri dish 6.
[0032]
After confirming the perforation, the stage 5 is moved, and then the unfertilized egg is aligned with the irradiation point on the screen of the monitor 3 in the same manner as described above, and the remote controller 4 is operated to apply the laser beam from the laser device 1 to the unfertilized egg in the petri dish 6. Irradiate and drill.
[0033]
With this operation, after all unfertilized eggs have been punched, the petri dish 6 is detached from the inverted microscope stage 5 and a new petri dish is installed. By repeating this operation, the drilling operation can be performed continuously.
[0034]
The laser device is a light amplifier or oscillator using stimulated emission, but various types such as a gas laser, a solid laser, and a semiconductor laser have been developed depending on the type of laser medium. Gas lasers include He-Ne lasers using a mixed gas of He and Ne, argon lasers using the excitation levels of argon ions, carbon dioxide lasers using carbon dioxide, copper vapor lasers, etc. Lasers include Nd: YAG laser using YAG (yttrium, aluminum, garnet crystal) doped with neodymium ions (Nd ³⁺ ), glass laser doped with neodymium ions in glass, rupee laser doped with chromium ions in rupee, etc. Can be mentioned. Production of the zona pellucida egg of the present invention is not particularly limited as long as the perforation conditions such as the wavelength, output, and pulse width of the laser beam can be set and controlled, and commercially available products can be used.
[0035]
In the method for producing a zona pellucida perforated egg according to the present invention, the laser beam used can be selected in the range of 500 nm to 2000 nm as the wavelength (λ), and in particular, the range of 1000 nm to 1800 nm is preferable. As the output, those in the range of 20 mW to 200 mW, preferably 100 mW to 200 mW can be adopted. Further, a pulse width in the range of 0.1 ms to 125 ms, preferably 3 ms to 100 ms can be selected and employed.
[0036]
The conditions for perforation with a laser beam can be appropriately selected and combined with the above-mentioned conditions. However, if the wavelength does not reach 500 nm, the perforation cannot be sufficiently formed, whereas if it exceeds 2000 nm, the detrimental effect of cell destruction occurs. If the output does not reach 20 mW, the perforations are insufficient and the through holes cannot be obtained easily. On the other hand, when it exceeds 200 mW, there is a risk that cell destruction may occur and the perforation process cannot be performed efficiently. Further, if the pulse width is less than 0.1 ms, the perforation may be insufficient. On the other hand, if the pulse width exceeds 125 ms, the disadvantage that cell destruction occurs is included.
[0037]
5) Cryopreservation of perforated eggs The zona pellucida perforated eggs obtained in the above step are usually subjected to cryopreservation.
The freezing method is not particularly limited, and various methods such as Nakao / Nakagata simple vitrification method, slow method, two-step method and the like can be arbitrarily selected and used. According to the Nakao / Nakagata simple vitrification method, as shown in Non-Patent Document 3, zona perforated unfertilized eggs are transferred into a cryotube together with 5 μl of 1M dimethyl sulfoxide (DMSO) and allowed to stand for 5 minutes. Next, 45 μl of a solution for preserving vitrification (DAP213; phosphate buffer containing 2M dimethyl sulfoxide, 1M acetamide and 3M propylene glycol) is added and immersed in liquid nitrogen after 5 minutes, and the unfertilized egg is stored frozen. The method is adopted.
[0038]
In addition, as a matter of course, the unfertilized egg used in the method for producing a zona pellucida-perforated egg according to the present invention can be used after being frozen and then thawed. Cryopreservation by the above method can be applied to unperforated eggs and perforated fertilized eggs in addition to zona perforated eggs.
[0039]
Table 1 summarizes the evaluation results for each evaluation item of the method for producing a zona pellucida egg using the laser beam according to the present invention and the PZD method that has been conventionally performed for the mouse.
[0040]
[Table 1]

[0041]
In the table, “working time” indicating workability is the time from drilling or incision to cleaning, and there is not much difference between laser and PZD, but “labor” and “skill level” are the lasers according to the present invention. According to the above, the burden on human beings is small and light, and the laser device is easy to operate, so that the skill level is unnecessary.
[0042]
Regarding the “work volume”, the method of the present invention can produce 1000 or more perforated eggs per person per day, but PZD has a limit of about 300 because of manual work. In addition, regarding the quality and performance of the perforated eggs, the survival rate of the perforated eggs is only 90% due to manual operation errors in PZD, whereas in the present invention, the result is 100%, and the entire amount is ensured safely. Can do.
[0043]
Further, the “in vitro fertilization rate” reaches a high level of 90% in the present invention, whereas it is about 60% at most in PZD, and the effect of the present invention is clearly shown. Thus, according to the method for producing a zona pellucida-perforated egg according to the present invention, as described above, the zona pellucida is extremely excellent in workability as compared with the PZD method that has been conventionally performed, and the zona pellucida obtained is Since the survival rate and in vitro fertilization rate of the perforated egg are remarkably high, it is possible to efficiently produce a high-quality zona pellucida perforated egg.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and comparative examples. However, the present invention is not limited to the examples.
[0045]
The test animals, laser devices for punching zona pellucida, and punching systems used in Examples and the like are as follows.
(1) Test animal C57BL / 6 female mouse (CLEA Japan)
(2) Equipment used Commercially available laser equipment, inverted microscope, TV monitor
Example 1
Serum gonadotropin (PMS) was administered intraperitoneally to 30 mature female C57BL / 6 strain female mice, and human chorionic gonadotropin (hCG) was intraperitoneally administered per mouse 48 hours later. 5-7.5 units were administered and superovulation treatment was performed.
Female mice that had been superovulated 15 hours after administration of human chorionic gonadotropin (hCG) were sacrificed, unfertilized eggs were taken out from the huge part of the fallopian tube, and introduced into an in vitro fertilization medium (HTF). 0.1% hyaluronidase was added to the HTF medium into which the unfertilized egg was introduced, and left in an incubator for 3 minutes. Thereafter, washing was performed 3 times to remove cumulus cells.
Unfertilized eggs from which cumulus cells were removed were subjected to perforation into the zona pellucida using a class 3B laser device. That is, the unfertilized egg was introduced into a 0.1 M to 1 M sucrose solution to avoid damage to the egg cytoplasm by the laser, and the cytoplasm of the egg was contracted as shown in FIG. Next, a laser beam was irradiated to one place between the egg cytoplasm and the zona pellucida, that is, where the space of the clonal cavity was the widest by the following operation to form perforations having a diameter of 10 μm to 40 μm.
The zona piercing of the zona pellucida was performed by the following operation procedure using a zona pellucida perforated egg production laser perforation apparatus shown in FIG.
[0047]
1. First, after putting the laser device 1, the inverted microscope 2 and the monitor 3 into an operating state, the plastic petri dish 4 was placed in the center of the stage of the inverted microscope 2. The plastic petri dish 4 contained dozens of unfertilized eggs from which cumulus cells had been removed.
2. Looking through an inverted microscope, the unfertilized egg was moved to the center of the field of view.
3. It was confirmed that the same image as the microscope was displayed on the monitor screen.
4). The size of the hole to be drilled by the remote controller connected with the cable from the laser device body 1 was set.
5. The stage of the inverted microscope 2 was moved and the perforated part of the unfertilized egg and the focus were aligned with the irradiation point on the monitor screen.
6). The switch of the remote controller 4 was pressed, and laser was irradiated to perforate.
7). After confirming the perforation, the stage was moved, the next unfertilized egg was aligned with the irradiation point on the monitor screen, and the laser beam aa was irradiated.
8). After completion of perforation of all unfertilized eggs, the plastic petri dish 6 was lowered from the inverted microscope stage 5 and replaced with a new petri dish.
[0048]
In the punching operation, the conditions for punching the zona pellucida with a laser beam were as follows.
Wavelength: 1.480nm
Output: 165-200mW
Pulse width; 0.1-7.0ms
The zona perforation unfertilized eggs that had been perforated into the zona pellucida as described above were washed three times with HTF medium and then subjected to in vitro fertilization.
[0049]
(Thawing sperm)
The spermatozoa of C57BL / 6 strain male mice that had been cryopreserved were taken out of liquid nitrogen and immersed in warm water at 37 ° C. Sperm that had been thawed for 15 minutes and then thawed were suspended in 100 μl of in vitro fertilization medium (HTF). The sperm after freezing and thawing had damage to the head as shown in FIG. 4 compared to the fresh sperm shown in FIG.
[0050]
(In vitro fertilization)
The concentration of sperm suspended in the fertilization medium (HTF) was adjusted to 500 to 700 sperm / ml, and a part of the sperm was introduced into the medium of the unperforated zona sperm egg. After 3 hours, the zona pellucida perforated eggs were washed with fresh culture fluid (HTF), embryos that had developed into the 2-cell stage and unfertilized eggs were collected, the number of them was counted, and the in vitro fertilization rate was calculated using the following formula: When calculated, it was 90%.
In vitro fertilization rate (%)
= (Number of 2-cell stage embryos) / (number of 2-cell stage embryos + number of unfertilized eggs) x 100
[0051]
Example 2
The zona perforated unfertilized egg obtained by the same operation as in Example 1 was frozen using the Nakao / Nakagata vitrification method.
That is, an unfertilized egg perforated in the zona pellucida was transferred into a cryotube together with 5 μl of 1M DMSO, and rested for 5 minutes. Next, 45 μl of a simple vitrification storage solution DAP213 ^* was added, immersed in liquid nitrogen for 5 minutes, and subjected to cryopreservation.
After cryopreservation, the frozen zona pellucid-perforated unfertilized eggs were subjected to a thawing treatment, and then subjected to the in vitro fertilization method under the same conditions and operation as the in vitro fertilization method described in Example 1. As a result, the in vitro fertilization rate was 70%. there were.
* Phosphate buffer containing 2M DMSO, 1M acetamide and 3M propylene glycol.
Example 3
In the production of zona pellucida perforated eggs by laser light, the perforation was carried out by controlling the laser beam irradiation conditions so that the number of holes perforated in the zona pellucida was 1-5. These zona pellucida perforated eggs were subjected to in vitro fertilization under the same operation and conditions as in Example 1. As a result, there was no significant effect due to the number of perforations, the survival rate after perforation was 90% to 100%, and the in vitro fertilization rate was 70% to 90%.
[0053]
Comparative Example 1
The zona pellucida was incised by PZD instead of perforation of the zona pellucida by the laser beam of the unfertilized egg from which cumulus cells were removed.
That is, unfertilized eggs were collected from superovulated female mice, and cumulus cells were removed by adding 0.1% hyaluronidase. The unfertilized egg from which cumulus cells were removed was introduced into a 0.3 M sucrose solution, the egg cytoplasm was contracted, and the egg was fixed to the bottom of the plastic petri dish. Next, an incision of 50-100 μm in length was made by hand using a 30 gauge injection needle under a microscope, and an incision was made in the zona pellucida. After the incision, zona pellucida incised eggs were washed three times with HTF medium and subjected to in vitro fertilization. All but the zona incision was subjected to in vitro fertilization by the same operation as in Example 1. The survival rate by this method was 90%, and the in vitro fertilization rate was 60%.
[0054]
[Table 2]

[0055]
【The invention's effect】
Production of zona perforated eggs using a laser beam can be performed continuously as compared to conventional PZD and does not require skill. For example, 300 per person per day is the limit for PZD. On the other hand, in the present invention, 1000 or more are possible, and the operation error is small, so the survival rate of the perforated eggs reaches 100%.
In addition, high-quality zona pellucida perforated eggs can be provided such that the in vitro fertilization rate reaches 90% by laser perforation.
Furthermore, according to the laser perforation apparatus for producing zona pellucida eggs, accurate and stable puncture is possible, which can contribute to the production of zona ova perforations with high efficiency.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an electron micrograph (magnification: 1500 times) of a zona pellucida egg according to the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional photograph showing a perforation position of a zona pellucida egg according to the present invention.
FIG. 3 is an electron micrograph of fresh sperm of a C57BL / 6 strain mouse.
FIG. 4 is an electron micrograph of freeze-thawed spermatozoa of C57BL / 6 strain mice.
FIG. 5 is a block diagram showing a configuration of a laser perforation apparatus used for producing a zona pellucida perforated egg according to the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Laser device 2 Inverted microscope 3 TV monitor 4 Remote controller

Claims

A zona pellucida surrounding an unfertilized egg collected from a mammal (excluding a human) , and the volume of the surrounding space between the cytoplasm and the zona pellucida is reduced by cell contraction treatment of the unfertilized egg. The maximum zona pellucida part is irradiated with a laser beam at a wavelength of 500 nm to 2000 nm, an output of 100 mW to 200 mW and a pulse width of 0.1 ms to 7.0 ms , and almost penetrates the zona pellucida. A method for producing a zona pellucida perforated egg of a mammal (excluding humans), characterized by forming a circular perforation.

The method for producing a zona pellucida-perforated egg according to claim 1, wherein the mammal (excluding human) is a mouse.

The method for producing a zona pellucida perforated egg according to claim 1 or 2, wherein the zona pellucida perforated egg is an unfertilized egg capable of external fertilization even for sperm subjected to cryopreservation and thawing treatment.

A zona perforated egg of a mammal (excluding human) produced by the method for producing a zona perforated egg according to claim 1.