JP4130937B2

JP4130937B2 - ENZYME SENSOR AND ANALYZING DEVICE USING SAME, ENZYME SENSOR MANUFACTURING METHOD, AND AMYLASE ACTIVITY MEASURING METHOD

Info

Publication number: JP4130937B2
Application number: JP2004058868A
Authority: JP
Inventors: 昌樹山口; 昭彦小松; 修一澤田; 康文水野; 一人鈴木
Original assignee: Yamaha Corp; Toyama University
Current assignee: Yamaha Corp; Toyama University
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2024-03-03
Also published as: JP2005249530A

Description

本発明は、酵素センサおよびそれを用いた分析装置、酵素センサの製造方法、ならびにアミラーゼ活性測定方法に関する。 The present invention relates to an enzyme sensor and an analyzer using the same, a method for producing the enzyme sensor, and a method for measuring amylase activity.

従来、酵素反応を用いて種々の物質を検出する酵素センサが広く知られている。酵素センサは、一般に酵素が固定された作用極、作用極との間に電位差を生じる対極、および基準となる電位を与える参照極を有している（特許文献１参照）。このような酵素センサは、例えばヒトが受けているストレスを判定するために、アミラーゼ活性の測定に適用される（特許文献２、非特許文献１参照）。 Conventionally, enzyme sensors that detect various substances using an enzyme reaction are widely known. In general, an enzyme sensor has a working electrode to which an enzyme is fixed, a counter electrode that generates a potential difference with the working electrode, and a reference electrode that provides a reference potential (see Patent Document 1). Such an enzyme sensor is applied to the measurement of amylase activity in order to determine, for example, stress that a human is subjected to (see Patent Document 2 and Non-Patent Document 1).

唾液中のアミラーゼの活性を測定する原理は、次の通りである。
複数のグルコースの糖鎖からなる基質としてのデンプンは、被験者から採取した唾液と混合される。これにより、デンプンは、唾液中のアミラーゼの作用によりマルトースに分解する。分解したマルトースは、酵素センサに固定化されているα−グルコシダーゼの作用によりグルコースに分解する。分解したグルコースは、さらに酵素センサに固定化されているグルコースオキシダーゼにより酸化され、グルコノラクトンおよび過酸化水素を生成する。生成した過酸化水素が酸素と水とに分解する際に生じる電子を検出することにより、唾液中のアミラーゼの活性が測定される。 The principle of measuring the activity of amylase in saliva is as follows.
Starch as a substrate composed of a plurality of glucose sugar chains is mixed with saliva collected from a subject. Thereby, starch is decomposed into maltose by the action of amylase in saliva. The decomposed maltose is decomposed into glucose by the action of α-glucosidase immobilized on the enzyme sensor. The decomposed glucose is further oxidized by glucose oxidase immobilized on the enzyme sensor to produce gluconolactone and hydrogen peroxide. The activity of amylase in saliva is measured by detecting electrons generated when the generated hydrogen peroxide is decomposed into oxygen and water.

特開平９−６５８９２号公報JP-A-9-65892 特開２００２−１６８８６０号公報JP 2002-168860 A Biosensor and Bioelectronics 18(2003)835-840Biosensor and Bioelectronics 18 (2003) 835-840

上述のような酵素センサには、取り扱いを容易にするため小型化および軽量化が要求される。近年では、酵素センサの製造には例えばフォトリソグラフィや印刷技術が用いられている。これにより、平面上に複数の電極を形成することができ、酵素センサの小型化および軽量化ならびに量産化が図られている。
しかしながら、酵素センサの小型化を進めると、酵素が固定化される作用極、ならびに作用極に近接する対極および参照極は微小化する。そのため、微小な作用極にのみ酵素を固定化することは困難となっている。 The enzyme sensor as described above is required to be reduced in size and weight for easy handling. In recent years, for example, photolithography and printing techniques are used in the manufacture of enzyme sensors. Thereby, a plurality of electrodes can be formed on a plane, and the enzyme sensor is reduced in size, weight, and mass production.
However, when the size of the enzyme sensor is further reduced, the working electrode on which the enzyme is immobilized, and the counter electrode and the reference electrode adjacent to the working electrode are miniaturized. Therefore, it is difficult to immobilize an enzyme only on a minute working electrode.

そこで、本発明は、電極が微小化されても所定の電極への酵素の固定化が容易であり、体格の小型化が図られる酵素センサおよびそれを用いた分析装置を提供することを目的とする。
また、本発明は、所定の電極への酵素の固定化が容易な酵素センサの製造方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an enzyme sensor that can easily fix an enzyme to a predetermined electrode even if the electrode is miniaturized, and can be downsized, and an analyzer using the same. To do.
Another object of the present invention is to provide a method for producing an enzyme sensor that facilitates the immobilization of an enzyme to a predetermined electrode.

上記の第一の目的を達成するため、本発明による酵素センサによると、基板と、前記基板に設置されている第一電極を含む二つ以上の電極と、前記二つ以上の電極のうち、前記第一電極を含む少なくとも一つの電極の外側に設置されている規定部と、酵素を含有し、前記規定部内の前記第一電極側において前記第一電極の少なくとも一部を覆っている酵素固定部と、を備えることを特徴とする。複数の電極のうち少なくとも一つの第一電極の外周部に第一電極を包囲する規定部を設置することにより、規定部の内側に酵素固定部が設置される。そのため、例えば塗布、硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は規定部の内側に塗布される。このとき、酵素液は規定部によって移動が制限される。その結果、酵素液が所定外の位置へ塗布されることはない。したがって、本発明による酵素センサは、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。また、電極が微小化されるため、酵素センサの小型化を図ることができる。ここで、電極の外周部とは、電極側壁の外側もしくは電極上面の側壁側端部をいうものとする。 To achieve the first object, according to the enzyme sensor of the present invention, a substrate, two or more electrodes including a first electrode installed on the substrate, and the two or more electrodes, A prescription part installed outside at least one electrode including the first electrode, and an enzyme immobilization containing an enzyme and covering at least a part of the first electrode on the first electrode side in the prescription part And a section. An enzyme immobilization part is installed inside a regulation part by installing a regulation part which surrounds the 1st electrode in the perimeter part of at least one 1st electrode among a plurality of electrodes. Therefore, for example, when an enzyme is immobilized on a liquid resin that forms the enzyme immobilization part by coating and curing, the liquid enzyme solution containing the enzyme is applied to the inside of the prescribed part. At this time, the movement of the enzyme solution is restricted by the defining portion. As a result, the enzyme solution is not applied to a position other than the predetermined position. Therefore, the enzyme sensor according to the present invention can easily fix an enzyme to a predetermined electrode even if the electrode is miniaturized. Moreover, since the electrode is miniaturized, the enzyme sensor can be miniaturized. Here, the outer peripheral portion of the electrode means the outer side of the electrode side wall or the side wall side end of the upper surface of the electrode.

さらに本発明による酵素センサによると、前記規定部は、前記第一電極の外周部において前記酵素固定部を周方向に包囲する筒状に形成されている。そのため、酵素固定部となる酵素液および硬化した酵素固定部の移動は、第一電極の周方向の全周において制限することができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the defining portion is formed in a cylindrical shape surrounding the enzyme fixing portion in the circumferential direction at the outer peripheral portion of the first electrode. Therefore, the movement of the enzyme solution serving as the enzyme immobilization part and the cured enzyme immobilization part can be restricted over the entire circumference of the first electrode in the circumferential direction.

さらに、本発明による酵素センサによると、前記基板は前記第一電極が設置されている凹部を有し、前記規定部は前記凹部の端部に形成される側壁部である。そのため、酵素固定部となる酵素液および硬化した酵素固定部の移動は、凹部の端部に形成される側壁部により制限することができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the substrate has a recess in which the first electrode is installed, and the defining portion is a side wall portion formed at an end of the recess. Therefore, the movement of the enzyme solution serving as the enzyme fixing part and the cured enzyme fixing part can be limited by the side wall part formed at the end of the recess.

さらに、本発明の酵素センサによると、前記電極は、前記第一電極と、前記第一電極の外周部において、前記規定部を挟んで前記第一電極と同心円状に配置される第二電極と、前記第二電極の径方向外側において前記第一電極および第二電極と同心円状の半円形状に配置される第三電極とを有している。そのため、基板の大型化を招くことなく、第一電極、第二電極および第三電極との対向部分の全長を延長することができる。したがって、性能の低下を招くことなく、体格の小型化を図ることができる。 Further, according to the enzyme sensor of the present invention, the electrode includes the first electrode, and a second electrode disposed concentrically with the first electrode across the defining portion at an outer peripheral portion of the first electrode. And a third electrode arranged in a semicircular shape concentrically with the first electrode and the second electrode on the radially outer side of the second electrode. Therefore, it is possible to extend the entire length of the facing portions of the first electrode, the second electrode, and the third electrode without increasing the size of the substrate. Therefore, the size of the physique can be reduced without causing a decrease in performance.

さらに、本発明の酵素センサによると、前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極は、二種類以上の異なる材料から形成され、前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極の少なくとも一つは、白金から形成されている。白金のイオン化傾向は小さいため、電極の電気分解がされにくい。この結果、電極の劣化による性能（感度）の低下がおきにくいという効果がある。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the first electrode, the second electrode, and the third electrode are formed of two or more different materials, and the first electrode, the second electrode, and the third electrode At least one of is formed from platinum. Since the ionization tendency of platinum is small, the electrode is not easily electrolyzed. As a result, there is an effect that the performance (sensitivity) is hardly lowered due to the deterioration of the electrode.

さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、前記第一電極の全部を覆っている。そのため、酵素固定部と第一電極との接触面積が拡大する。したがって、酵素反応により生じた電位差を高精度に検出することができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the enzyme fixing part covers the entire first electrode. Therefore, the contact area between the enzyme immobilization part and the first electrode is increased. Therefore, the potential difference generated by the enzyme reaction can be detected with high accuracy.

さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、二種類以上が混合された複数の酵素を含有する。そのため、単一の酵素固定部で複数の反応が進行する。したがって、酵素ごとに酵素固定部を設置する必要がなく、体格の小型化を図ることができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the enzyme fixing part contains a plurality of enzymes in which two or more kinds are mixed. Therefore, a plurality of reactions proceed in a single enzyme immobilization part. Therefore, it is not necessary to install an enzyme fixing part for each enzyme, and the size of the physique can be reduced.

さらに、本発明の酵素センサによると、一種類の酵素を含有する膜片部を複数有している。そのため、各膜片部において単一の反応が進行する。したがって、反応速度が小さい場合でも、各膜片部において確実に反応を進行することができる。また、親和性の低い複数の酵素を用いる場合、酵素間の相互作用を低減することができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, it has a plurality of membrane pieces containing one kind of enzyme. Therefore, a single reaction proceeds in each piece of membrane. Therefore, even when the reaction rate is low, the reaction can surely proceed at each piece of film. Moreover, when using several enzyme with low affinity, the interaction between enzymes can be reduced.

さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、少なくともグルコースオキシターゼおよびマルトースホスホリラーゼを含有する。例えば、アミラーゼの活性を測定する場合、マルトペンタオース（Ｇ５）を分解して生成するマルトース（Ｇ２）およびマルトトリオース（Ｇ３）をα−グルコシダーゼを用いて分解し、生成したグルコースの量を測定することが知られている。しかし、α−グルコシダーゼは、酵素固定部への固定化が困難であり、固定化による活性の低下を招きやすい。これに対し、マルトースホスホリラーゼは、酵素固定部への固定化が容易であり、固定化による活性の低下も小さい。したがって、酵素の固定化を容易にすることができ、酵素の活性を高めることができる。
さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部には、４つ以上のグルコースからなる糖鎖を基質として含有する分析溶液が供給される。したがって、アミラーゼの活性を精度よく測定することができる。 Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, the enzyme immobilization part contains at least glucose oxidase and maltose phosphorylase. For example, when measuring amylase activity, maltose (G2) and maltotriose (G3) produced by degrading maltopentaose (G5) are degraded using α-glucosidase, and the amount of glucose produced is measured. It is known to do. However, α-glucosidase is difficult to be immobilized on the enzyme immobilization part, and tends to cause a decrease in activity due to immobilization. In contrast, maltose phosphorylase is easy to be immobilized on the enzyme immobilization part, and the decrease in activity due to immobilization is small. Therefore, the immobilization of the enzyme can be facilitated and the activity of the enzyme can be increased.
Furthermore, according to the enzyme sensor of the present invention, an analysis solution containing a sugar chain composed of four or more glucoses as a substrate is supplied to the enzyme immobilization part. Therefore, the amylase activity can be measured with high accuracy.

本発明に係る分析装置によると、上述の酵素センサと、重力方向において前記酵素固定部の上方に設置され、前記規定部の軸方向へ前記酵素固定部に基質を含む分析溶液を供給する供給部と、前記酵素固定部に供給された分析溶液を、前記酵素固定部の径方向外側へ排出する排出部とを備えることを特徴とする。これにより、基質を含む分析溶液は酵素センサの酵素固定部に概ね垂直に流入する。そのため、分析溶液と酵素固定部とは確実に接触する。また、酵素固定部へ供給された分析溶液は、酵素固定部の径方向外側へ排出される。そのため、分析溶液が酵素固定部に留まることはない。さらに、供給部と排出部とは概ね垂直な位置関係となり、分析装置の設置に必要な容積は低減する。したがって、分析装置の体格の小型化が図られるとともに、酵素センサによる測定精度を高めることができる。 According to the analyzer of the present invention, the above-described enzyme sensor and a supply unit that is installed above the enzyme fixing unit in the direction of gravity and supplies an analysis solution containing a substrate to the enzyme fixing unit in the axial direction of the defining unit. And a discharge part for discharging the analysis solution supplied to the enzyme fixing part to the outside in the radial direction of the enzyme fixing part. Thereby, the analysis solution containing the substrate flows into the enzyme fixing part of the enzyme sensor substantially vertically. Therefore, the analysis solution and the enzyme immobilization part are in reliable contact. Moreover, the analysis solution supplied to the enzyme fixing part is discharged to the outside in the radial direction of the enzyme fixing part. Therefore, the analysis solution does not stay in the enzyme immobilization part. Furthermore, the supply unit and the discharge unit are in a substantially vertical positional relationship, and the volume necessary for installing the analyzer is reduced. Therefore, the size of the analyzer can be reduced, and the measurement accuracy by the enzyme sensor can be increased.

また、本発明に係る分析装置によると、上述の酵素センサと、前記酵素センサが設置される基礎部材と、前記基礎部材との間に、前記酵素センサを収容する第一収容室、および前記第一収容室に接続し前記酵素固定部に含まれている酵素と異なる酵素を含有する膜部材を収容する第二収容室を形成するケーシングと、を備えることを特徴とする。これにより、基質を含む分析溶液は、第二収容室において第一段階の化学反応を経た後、酵素センサを収容する第一収容室に流入する。そのため、酵素センサでは所定の化学反応が確実に進行する。したがって、酵素センサによる測定精度を高めることができる。 Further, according to the analyzer according to the present invention, the enzyme sensor, the base member on which the enzyme sensor is installed, the first storage chamber for storing the enzyme sensor between the base member, and the first A casing that is connected to one storage chamber and forms a second storage chamber that stores a membrane member containing an enzyme different from the enzyme contained in the enzyme fixing portion. As a result, the analysis solution containing the substrate flows through the first storage chamber that stores the enzyme sensor after undergoing a first-stage chemical reaction in the second storage chamber. Therefore, a predetermined chemical reaction reliably proceeds in the enzyme sensor. Therefore, the measurement accuracy by the enzyme sensor can be increased.

上記の第二の目的を達成するため、本発明の酵素センサの製造方法によると、基板に第一電極を形成する段階と、前記第一電極の径方向外側に、前記第一電極を周方向に包囲し前記第一電極から反基板側に立ち上がる規定部を形成する段階と、前記規定部の内側に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階とを含むことを特徴とする。第一電極の外側に規定部を形成することにより、規定部の内側に酵素固定部が容易に形成される。例えば硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は規定部の内側に塗布される。このとき、酵素を含有する液状の酵素液は規定部によって移動が制限される。その結果、酵素液は所定外の位置へ塗布されることがない。したがって、本発明による酵素センサの製造方法では、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。
さらに、本発明の酵素センサの製造方法によると、前記規定部はフォトリソグラフィにより形成する。したがって、微小な電極の外側に微小な規定部を容易に形成することができる。 In order to achieve the second object, according to the method for producing an enzyme sensor of the present invention, the step of forming the first electrode on the substrate, and the first electrode in the circumferential direction on the radially outer side of the first electrode Forming a defining portion that surrounds the first electrode and rises from the first electrode to the opposite side of the substrate, and forming an enzyme fixing portion that contains an enzyme and covers the first electrode inside the defining portion. Features. By forming the defining portion outside the first electrode, the enzyme immobilization portion is easily formed inside the defining portion. For example, when the enzyme is immobilized on a liquid resin that forms the enzyme immobilization part by curing, the liquid enzyme solution containing the enzyme is applied to the inside of the defined part. At this time, the movement of the liquid enzyme solution containing the enzyme is restricted by the defining portion. As a result, the enzyme solution is not applied to a non-predetermined position. Therefore, in the method for producing an enzyme sensor according to the present invention, an enzyme can be easily immobilized on a predetermined electrode even if the electrode is miniaturized.
Further, according to the enzyme sensor manufacturing method of the present invention, the defining portion is formed by photolithography. Therefore, a minute defining portion can be easily formed outside the minute electrode.

上記の第二の目的を達成するため、本発明の酵素センサの製造方法によると、基板の一方の面側に、他方の面側に窪む凹部を形成する段階と、前記凹部に第一電極を形成する段階と、前記凹部に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階とを含むことを特徴とする。第一電極を基板の一方の面側に形成された凹部に形成することにより、凹部の内部に酵素固定部が容易に形成される。例えば硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は凹部の内側に塗布される。このとき、酵素を含有する液状の酵素液は凹部の側壁部によって移動が制限される。その結果、酵素液は所定外の位置へ塗布されることがない。したがって、本発明による酵素センサの製造方法では、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。 In order to achieve the above second object, according to the method for producing an enzyme sensor of the present invention, a step of forming a recess recessed on one surface side of the substrate and the other surface side, and a first electrode on the recess And forming an enzyme immobilization part containing an enzyme and covering the first electrode in the recess. By forming the first electrode in the recess formed on the one surface side of the substrate, the enzyme immobilization portion is easily formed in the recess. For example, when the enzyme is immobilized on a liquid resin that forms the enzyme immobilization part by curing, the liquid enzyme solution containing the enzyme is applied to the inside of the recess. At this time, the movement of the liquid enzyme solution containing the enzyme is restricted by the side wall portion of the recess. As a result, the enzyme solution is not applied to a non-predetermined position. Therefore, in the method for producing an enzyme sensor according to the present invention, an enzyme can be easily immobilized on a predetermined electrode even if the electrode is miniaturized.

本発明のアミラーゼ活性測定方法によると、上述の酵素センサを用いて、アミラーゼの活性を測定することを特徴とする。したがって、体格の小さな酵素センサにより、アミラーゼの活性を高い精度で測定することができる。
本発明のヒトストレス判定方法によると、上述のアミラーゼ活性測定方法を用いて前記アミラーゼの活性を測定する段階を含むことを特徴とする。したがって、アミラーゼの活性によりヒトストレスを高い精度で測定することができる。 According to the amylase activity measuring method of the present invention, the amylase activity is measured using the enzyme sensor described above. Therefore, amylase activity can be measured with high accuracy by an enzyme sensor having a small physique.
According to the human stress determination method of the present invention, the method includes the step of measuring the amylase activity using the amylase activity measurement method described above. Therefore, human stress can be measured with high accuracy by the activity of amylase.

（１．酵素センサ）
まず、本発明による酵素センサの複数の実施形態を図面に基づいて説明する。
（第１参考例）
本発明の第１参考例による酵素センサを図１に示す。図１は、第１参考例による酵素センサを示す概略図である。
酵素センサ１０は、ガラスなどの絶縁体から形成されている基板１１を備えている。基板１１は、絶縁体であれば例えば樹脂あるいはセラミックスなどを適用してもよく、ガラスに限るものではない。基板１１の一方の面には、ポテンショスタットを構成する第一電極としての作用極１２、第二電極としての対極１３および第三電極としての参照極１４が設置されている。作用極１２および対極１３は、白金により形成されている。また、参照極１４は、銀により形成されている。なお、作用極１２、対極１３および参照極１４は、白金または銀に限らず、銅などの金属または炭素などの導電体で形成してもよい。 (1. Enzyme sensor)
First, a plurality of embodiments of an enzyme sensor according to the present invention will be described with reference to the drawings.
( First Reference Example )
FIG. 1 shows an enzyme sensor according to a first reference example of the present invention. FIG. 1 is a schematic view showing an enzyme sensor according to a first reference example .
The enzyme sensor 10 includes a substrate 11 formed of an insulator such as glass. The substrate 11 may be made of, for example, resin or ceramics as long as it is an insulator, and is not limited to glass. On one surface of the substrate 11, a working electrode 12 as a first electrode constituting a potentiostat, a counter electrode 13 as a second electrode, and a reference electrode 14 as a third electrode are installed. The working electrode 12 and the counter electrode 13 are made of platinum. The reference electrode 14 is made of silver. The working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 are not limited to platinum or silver but may be formed of a metal such as copper or a conductor such as carbon.

作用極１２は、第一配線部１５により第一パッド１６と接続されている。対極１３は、第二配線部１７により第二パッド１８と接続されている。参照極１４は、第三配線部１９により第三パッド２０と接続されている。第一パッド１６、第二パッド１８および第三パッド２０には、外部に接続される導線などの図示しない配線部材が接続される。対極１３および参照極１４は、作用極１２を中心とする同心円状に配置されている。そのため、作用極１２の外周側には、作用極１２の周方向に沿って対極１３が対向して設置されている。また、対極１３のさらに外周側には、対極１３の周方向に沿って参照極１４が設置されている。 The working electrode 12 is connected to the first pad 16 by the first wiring portion 15. The counter electrode 13 is connected to the second pad 18 by the second wiring portion 17. The reference electrode 14 is connected to the third pad 20 by the third wiring portion 19. A wiring member (not shown) such as a conductive wire connected to the outside is connected to the first pad 16, the second pad 18, and the third pad 20. The counter electrode 13 and the reference electrode 14 are arranged concentrically around the working electrode 12. Therefore, on the outer peripheral side of the working electrode 12, the counter electrode 13 is installed facing the circumferential direction of the working electrode 12. Further, a reference electrode 14 is provided on the outer peripheral side of the counter electrode 13 along the circumferential direction of the counter electrode 13.

作用極１２は、略円形状に形成されている。本実施例の場合、作用極１２の面積は２．５４ｍｍ^２に設定している。対極１３は、周方向の一部に切欠部２１を有する略円弧状に形成されている。対極１３は、切欠部２１を除き作用極１２を周方向に包囲している。作用極１２に接続する第一配線部１５は、対極１３の切欠部２１を経由して第一パッド１６に接続している。参照極１４は、略半円弧状に形成され、対極１３の外側を周方向に包囲している。 The working electrode 12 is formed in a substantially circular shape. In the case of the present embodiment, the area of the working electrode 12 is set to 2.54 mm ² . The counter electrode 13 is formed in a substantially arc shape having a notch 21 in a part in the circumferential direction. The counter electrode 13 surrounds the working electrode 12 in the circumferential direction except for the notch 21. The first wiring part 15 connected to the working electrode 12 is connected to the first pad 16 via the notch part 21 of the counter electrode 13. The reference electrode 14 is formed in a substantially semicircular arc shape and surrounds the outer side of the counter electrode 13 in the circumferential direction.

略円形状に形成されている作用極１２と、所定の間隔を形成して作用極１２と周方向に対向する対極１３との間には、規定部２２が設置されている。規定部２２は、樹脂により略円筒状に形成され、作用極１２と対極１３との間、および第一配線部１５の反基板側に設置されている。これにより、規定部２２は、作用極１２の外周側を周方向に筒状に包囲している。第１参考例の場合、作用極１２、対極１３、参照極１４、第一配線部１５、第二配線部１７および第三配線部１９を形成する白金または銀からなる金属層の厚さは０．４μｍから１．０μｍ程度であるのに対し、規定部２２の厚さすなわち軸方向の長さは０．１ｍｍ程度である。したがって、規定部２２は、基板１１の一方の面から立ち上がって形成されている。なお、規定部２２は、樹脂に限らず絶縁体の材料により形成することができる。 A defining portion 22 is installed between the working electrode 12 formed in a substantially circular shape and the counter electrode 13 that forms a predetermined interval and faces the working electrode 12 in the circumferential direction. The defining portion 22 is formed in a substantially cylindrical shape with resin, and is disposed between the working electrode 12 and the counter electrode 13 and on the opposite side of the first wiring portion 15. Accordingly, the defining portion 22 surrounds the outer peripheral side of the working electrode 12 in a cylindrical shape in the circumferential direction. In the case of the first reference example , the thickness of the metal layer made of platinum or silver forming the working electrode 12, the counter electrode 13, the reference electrode 14, the first wiring part 15, the second wiring part 17, and the third wiring part 19 is 0. While the thickness is about 4 μm to 1.0 μm, the thickness of the defining portion 22, that is, the length in the axial direction is about 0.1 mm. Accordingly, the defining portion 22 is formed to rise from one surface of the substrate 11. Note that the defining portion 22 is not limited to resin but can be formed of an insulating material.

筒状の規定部２２の内側には、酵素固定部２３が設置されている。規定部２２は作用極１２の径方向外側に周方向へ形成されているため、規定部２２の内側に設置された酵素固定部２３は作用極１２の全面を覆っている。これにより、酵素固定部２３の面積は、作用極１２と概ね同一となる。なお、酵素固定部２３は、作用極１２の一部を覆う構成としてもよい。 An enzyme immobilization section 23 is installed inside the cylindrical defining section 22. Since the defining portion 22 is formed in the circumferential direction outside the working electrode 12 in the radial direction, the enzyme fixing portion 23 installed inside the defining portion 22 covers the entire surface of the working electrode 12. As a result, the area of the enzyme fixing part 23 is substantially the same as that of the working electrode 12. The enzyme fixing part 23 may be configured to cover part of the working electrode 12.

酵素固定部２３は、酵素を固定化した樹脂が硬化したものである。第１参考例の場合、酵素は架橋法により固定化されている。酵素は、架橋法に限らず、例えば包括法あるいは担体結合法など任意の手法により固定化してもよい。酵素固定部２３は、単一種の酵素または複数種の酵素を含有している。酵素固定部２３に複数種の酵素を固定化する場合、酵素固定部２３には複数種の酵素を混合して固定化することができる。なお、酵素固定部２３は、図２に示すように種類の異なる酵素をそれぞれ膜片部２３１、２３２に固定化し、膜片部２３１、２３２を規定部２２の軸方向に積層する構成としてもよい。また、図３に示すように種類の異なる酵素をそれぞれ膜片部２３３、２３４に固定化し、膜片部２３３、２３４を隣接して配置してもよい。酵素は、酵素センサを適用する基質に応じて任意に選定することができる。また、酵素固定部２３および膜片部２３１、２３２、２３３、２３４には、単一または複数種の酵素を固定化することができる。 The enzyme fixing part 23 is obtained by curing a resin on which an enzyme is fixed. In the case of the first reference example , the enzyme is immobilized by a crosslinking method. The enzyme is not limited to the crosslinking method, and may be immobilized by any method such as a comprehensive method or a carrier binding method. The enzyme fixing part 23 contains a single type of enzyme or a plurality of types of enzymes. When a plurality of types of enzymes are immobilized on the enzyme immobilization unit 23, a plurality of types of enzymes can be mixed and immobilized on the enzyme immobilization unit 23. In addition, the enzyme fixing | fixed part 23 is good also as a structure which fixes the enzyme from which a kind differs, respectively, as shown in FIG. . Further, as shown in FIG. 3, different types of enzymes may be immobilized on the membrane pieces 233 and 234, respectively, and the membrane pieces 233 and 234 may be arranged adjacent to each other. The enzyme can be arbitrarily selected according to the substrate to which the enzyme sensor is applied. In addition, single or plural kinds of enzymes can be immobilized on the enzyme immobilization part 23 and the membrane piece parts 231, 232, 233, 234.

次に、第１参考例による酵素センサ１０の製造方法について説明する。
第１参考例による酵素センサ１０は、フォトリソグラフィにより製造される。図４に示すように、基板１１となるガラス板３０が準備される。なお、ガラス板３０には複数の酵素センサが形成されるが、ここでは説明の簡単のため単一の酵素センサの製造について説明する。 Next, a method for manufacturing the enzyme sensor 10 according to the first reference example will be described.
The enzyme sensor 10 according to the first reference example is manufactured by photolithography. As shown in FIG. 4, the glass plate 30 used as the board | substrate 11 is prepared. Note that a plurality of enzyme sensors are formed on the glass plate 30, but here, the manufacture of a single enzyme sensor will be described for the sake of simplicity.

準備されたガラス板３０の一方の面には、図５に示すように例えばスパッタリングにより白金膜３１が形成される。ガラス板３０に白金膜３１が形成されると、図６に示すようにフォトレジストによりパターンマスク３２が形成される。パターンマスク３２は、図１に示す酵素センサ１０の作用極１２、対極１３、第一配線部１５、第二配線部１７、第一パッド１６および第二パッド１８の形状に対応している。 As shown in FIG. 5, a platinum film 31 is formed on one surface of the prepared glass plate 30 by sputtering, for example. When the platinum film 31 is formed on the glass plate 30, a pattern mask 32 is formed of a photoresist as shown in FIG. The pattern mask 32 corresponds to the shapes of the working electrode 12, the counter electrode 13, the first wiring part 15, the second wiring part 17, the first pad 16, and the second pad 18 of the enzyme sensor 10 shown in FIG.

パターンマスク３２を形成した後、図７に示すように白金膜３１はドライエッチングされる。これにより、図１に示す酵素センサ１０の作用極１２、対極１３、第一配線部１５、第二配線部１７、第一パッド１６および第二パッド１８の形状に対応する白金膜３１が形成される。パターンマスク３２を除去することにより、図８に示すようにガラス板３０には白金膜３１からなる導電パターン３３が形成される。 After the pattern mask 32 is formed, the platinum film 31 is dry etched as shown in FIG. Thereby, the platinum film 31 corresponding to the shape of the working electrode 12, the counter electrode 13, the first wiring part 15, the second wiring part 17, the first pad 16, and the second pad 18 of the enzyme sensor 10 shown in FIG. 1 is formed. The By removing the pattern mask 32, a conductive pattern 33 made of a platinum film 31 is formed on the glass plate 30 as shown in FIG.

形成された白金膜３１からなる導電パターン３３は、図９に示すように保護マスク３４で保護される。保護マスク３４は、白金膜３１からなる導電パターン３３を覆う。保護マスク３４は、例えばフォトレジストにより形成される。保護マスク３４が形成されると、図１０に示すようにガラス板３０の全体に銀膜３５を形成する。銀膜３５は、例えばスパッタリングにより形成される。このとき、白金膜３１からなる導電パターン３３は、保護マスク３４に保護されている。そのため、銀膜３５は、ガラス板３０のうち保護マスク３４で覆われていない部分に形成される。 The formed conductive pattern 33 made of the platinum film 31 is protected by a protective mask 34 as shown in FIG. The protective mask 34 covers the conductive pattern 33 made of the platinum film 31. The protective mask 34 is formed of, for example, a photoresist. When the protective mask 34 is formed, a silver film 35 is formed on the entire glass plate 30 as shown in FIG. The silver film 35 is formed by sputtering, for example. At this time, the conductive pattern 33 made of the platinum film 31 is protected by the protective mask 34. Therefore, the silver film 35 is formed on a portion of the glass plate 30 that is not covered with the protective mask 34.

ガラス板３０に銀膜３５が形成されると、銀膜３５の上方に図１１に示すようにフォトレジストによりパターンマスク３６が形成される。パターンマスク３６は、図１に示す酵素センサ１０の参照極１４、第三配線部１９および第三パッド２０の形状に対応している。パターンマスク３６を形成した後、図１２に示すように銀膜３５はドライエッチングされる。これにより、図１に示す酵素センサ１０の参照極１４、第三配線部１９および第三パッド２０の形状に対応する銀膜３５が形成される。パターンマスク３６および保護マスク３４を除去することにより、図１３に示すようにガラス板３０には、白金膜３１からなる導電パターン３３、および銀膜３５からなる導電パターン３７が形成される。 When the silver film 35 is formed on the glass plate 30, a pattern mask 36 is formed above the silver film 35 with a photoresist as shown in FIG. The pattern mask 36 corresponds to the shapes of the reference electrode 14, the third wiring portion 19, and the third pad 20 of the enzyme sensor 10 shown in FIG. After forming the pattern mask 36, the silver film 35 is dry-etched as shown in FIG. Thereby, the silver film 35 corresponding to the shape of the reference electrode 14, the third wiring part 19, and the third pad 20 of the enzyme sensor 10 shown in FIG. 1 is formed. By removing the pattern mask 36 and the protective mask 34, a conductive pattern 33 made of a platinum film 31 and a conductive pattern 37 made of a silver film 35 are formed on the glass plate 30 as shown in FIG.

導電パターン３３および導電パターン３７が形成されると、図１４に示すように導電パターン３３のうち作用極に対応する電極の外周部に図１に示す酵素センサ１０の規定部２２となる突部３８が形成される。突部３８は、フォトリソグラフィーによりフォトレジストなどの樹脂で形成される。なお、突部３８は、図１に示すように作用極１２の上に形成してもよいし、作用極１２の外側の基板１１上に形成してもよく、または作用極１２と基板１１とにまたがって形成してもよい。さらに、作用極１２と対極１３との間を埋めるように形成してもよい。 When the conductive pattern 33 and the conductive pattern 37 are formed, as shown in FIG. 14, a protrusion 38 that becomes the defining portion 22 of the enzyme sensor 10 shown in FIG. 1 is formed on the outer periphery of the electrode corresponding to the working electrode in the conductive pattern 33. Is formed. The protrusion 38 is formed of a resin such as a photoresist by photolithography. The protrusion 38 may be formed on the working electrode 12 as shown in FIG. 1, may be formed on the substrate 11 outside the working electrode 12, or the working electrode 12 and the substrate 11 It may also be formed across. Furthermore, the gap between the working electrode 12 and the counter electrode 13 may be formed.

複数の酵素センサ１０に対応する導電パターン３３および導電パターン３７が形成されたガラス板３０は、酵素センサ１０の基板１１に対応する大きさにダイシングされ、洗浄される。基板１１の洗浄が完了すると、形成された規定部２２の内側に酵素固定部２３が設置される。液状または半固形状の流動性のある樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液は、規定部２２の内側に所定量充填される。充填された酵素液を例えば乾燥して硬化させることにより、規定部２２の内側に酵素固定部２３が形成される。 The glass plate 30 on which the conductive patterns 33 and the conductive patterns 37 corresponding to the plurality of enzyme sensors 10 are formed is diced into a size corresponding to the substrate 11 of the enzyme sensor 10 and cleaned. When the cleaning of the substrate 11 is completed, the enzyme immobilization part 23 is installed inside the formed regulation part 22. An enzyme solution in which an enzyme is dispersed or dissolved in a liquid or semisolid fluid resin is filled in a predetermined amount inside the defining portion 22. For example, the enzyme fixing part 23 is formed inside the defining part 22 by drying and hardening the filled enzyme solution.

なお、酵素固定部２３は、酵素を分散または溶解した光架橋性の樹脂を規定部２２の内側に充填した後、所定の波長の光を照射することにより硬化させる方法など、他の方法を用いて形成してもよい。また、酵素の安定性が高く酵素活性の低下が小さい場合、ガラス板３０をダイシングする前に、規定部２２の内部に酵素固定部２３を設置する手順としてもよい。さらに、酵素固定部２３を硬化させた後、レジストを溶かす等により、規定部２２を除去する工程を追加してもよい。 The enzyme immobilization unit 23 uses other methods such as a method in which a photocrosslinkable resin in which an enzyme is dispersed or dissolved is filled inside the defining unit 22 and then cured by irradiation with light of a predetermined wavelength. May be formed. Further, when the enzyme stability is high and the decrease in enzyme activity is small, the procedure may be such that the enzyme fixing part 23 is installed inside the defining part 22 before dicing the glass plate 30. Further, after the enzyme fixing part 23 is cured, a step of removing the defining part 22 may be added by dissolving the resist.

以上の手順により第１参考例による酵素センサ１０は製造される。
第１参考例による酵素センサ１０は、作用極１２の周囲に規定部２２を有している。そのため、硬化する前は流動性を有している酵素固定部２３は、規定部２２により所定の位置以外への移動が制限される。これにより、酵素固定部２３は作用極１２にのみ形成され、酵素を含む酵素固定部２３が作用極１２以外の部位に流動することは防止される。したがって、酵素センサ１０の小型化にともない作用極１２が微小化しても、確実かつ容易に酵素固定部２３を作用極１２にのみ形成することができる。 The enzyme sensor 10 according to the first reference example is manufactured by the above procedure.
The enzyme sensor 10 according to the first reference example has a defining portion 22 around the working electrode 12. Therefore, the movement of the enzyme immobilization part 23 having fluidity before curing is restricted by the defining part 22 to other than a predetermined position. Thereby, the enzyme fixing | fixed part 23 is formed only in the working electrode 12, and it prevents that the enzyme fixing | fixed part 23 containing an enzyme flows into parts other than the working electrode 12. FIG. Therefore, even if the working electrode 12 is miniaturized as the enzyme sensor 10 is downsized, the enzyme fixing part 23 can be formed only on the working electrode 12 reliably and easily.

また、第１参考例による酵素センサ１０は、対極１３および参照極１４が作用極１２を中心とした同心円状に配置されている。そのため、酵素センサ１０の小型化を図る場合でも、作用極１２、対極１３および参照極１４に要求される電極の全長は確保される。したがって、性能の低下を招くことなく、酵素センサ１０の小型化を図ることができる。 In the enzyme sensor 10 according to the first reference example , the counter electrode 13 and the reference electrode 14 are arranged concentrically around the working electrode 12. Therefore, even when the enzyme sensor 10 is downsized, the total length of the electrodes required for the working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 is ensured. Therefore, the enzyme sensor 10 can be reduced in size without degrading performance.

（第１実施例）
本発明の第１実施例による酵素センサを図１５に示す。図１５は、第１実施例による酵素センサ４０を示す断面図である。なお、第１参考例と実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、説明を省略する。
第１実施例による酵素センサ４０は、ガラスなどの絶縁体から形成されている基板４１を備えている。基板４１は、一方の面側に他方の面側に窪んでいる凹部４２を有している。これにより、基板４１は、中央部に凹部４２を有し、凹部４２の両端部に凸部４３および凸部４４を有している。また、基板４１は、凹部４２の一方の端部において凸部４３との間に形成される側壁部４５と、凹部４２の他方の端部において凸部４４との間に形成される側壁部４６とを有している。基板４１は、凹部４２に第一電極としての作用極１２を有している。また、基板４１は、凸部４３および凸部４４に第二電極としての対極１３を有し、凸部４３に第三電極としての参照極１４を有している。 ( First embodiment )
An enzyme sensor according to the first embodiment of the present invention is shown in FIG. FIG. 15 is a cross-sectional view showing the enzyme sensor 40 according to the first embodiment . In addition, the same code | symbol is attached | subjected to the component substantially the same as a 1st reference example, and description is abbreviate | omitted.
The enzyme sensor 40 according to the first embodiment includes a substrate 41 formed of an insulator such as glass. The board | substrate 41 has the recessed part 42 dented in the other surface side at the one surface side. As a result, the substrate 41 has a concave portion 42 at the center, and has convex portions 43 and convex portions 44 at both ends of the concave portion 42. The substrate 41 has a side wall portion 45 formed between the convex portion 43 at one end portion of the concave portion 42 and a side wall portion 46 formed between the convex portion 44 at the other end portion of the concave portion 42. And have. The substrate 41 has a working electrode 12 as a first electrode in the recess 42. The substrate 41 has the counter electrode 13 as the second electrode on the convex portion 43 and the convex portion 44, and the reference electrode 14 as the third electrode on the convex portion 43.

凹部４２に設置されている作用極１２は、酵素を含有する酵素固定部４７により覆われている。酵素固定部４７は、流動性を有している場合でも、側壁部４５および側壁部４６によって移動が制限される。すなわち、側壁部４５および側壁部４６は、特許請求の範囲に記載の規定部を構成している。
第１実施例による酵素センサ４０を製造する場合、まず基板４１となるガラス板に凹部４２を形成する。凹部４２は、例えば研磨や切削などの機械的な加工、またはエッチングなどの化学的な加工により形成される。凹部４２が形成されると、凹部４２に作用極１２が形成され、凸部４３、４４に対極１３および参照極１４が形成される。作用極１２、対極１３および参照極１４は、第１参考例と同様にフォトリソグラフィにより形成される。作用極１２、対極１３および参照極１４が形成されると、凹部４２に酵素を含有する酵素固定部４７を設置する。このとき、液状または半固形状の流動性のある樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液は、凹部４２に所定量充填される。充填された酵素液を硬化させることにより、凹部４２の内部に酵素固定部４７が形成される。 The working electrode 12 installed in the recess 42 is covered with an enzyme fixing part 47 containing an enzyme. Even when the enzyme fixing part 47 has fluidity, the movement is restricted by the side wall part 45 and the side wall part 46. That is, the side wall portion 45 and the side wall portion 46 constitute a defining portion described in the claims.
When manufacturing the enzyme sensor 40 according to the first embodiment , first, the concave portion 42 is formed in the glass plate to be the substrate 41. The recess 42 is formed by mechanical processing such as polishing or cutting, or chemical processing such as etching. When the concave portion 42 is formed, the working electrode 12 is formed in the concave portion 42, and the counter electrode 13 and the reference electrode 14 are formed in the convex portions 43 and 44. The working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 are formed by photolithography as in the first reference example. When the working electrode 12, the counter electrode 13 and the reference electrode 14 are formed, an enzyme fixing part 47 containing an enzyme is installed in the recess 42. At this time, a predetermined amount of the enzyme solution in which the enzyme is dispersed or dissolved in a liquid or semisolid fluid resin is filled in the recess 42. By hardening the filled enzyme solution, the enzyme fixing part 47 is formed inside the recess 42.

第１実施例では、基板４１に形成された凹部４２に酵素固定部４７を設置している。そのため、基板４１の凹部４２と凸部４３または凸部４４との間に形成される側壁部４５および側壁部４６は流動性のある酵素液の移動を制限する。これにより、酵素固定部４７は凹部４２に設置されている作用極１２にのみ形成され、酵素を含む酵素固定部４７が作用極１２以外の部位に流動することは防止される。したがって、酵素センサ４０の小型化にともない作用極１２が微小化しても、作用極１２にのみ酵素固定部４７を確実かつ容易に形成することができる。 In the first embodiment , the enzyme immobilization part 47 is installed in the recess 42 formed in the substrate 41. Therefore, the side wall portion 45 and the side wall portion 46 formed between the concave portion 42 of the substrate 41 and the convex portion 43 or the convex portion 44 restrict the movement of the fluid enzyme solution. As a result, the enzyme fixing part 47 is formed only on the working electrode 12 installed in the recess 42, and the enzyme fixing part 47 containing the enzyme is prevented from flowing to a part other than the working electrode 12. Therefore, even if the working electrode 12 is miniaturized as the enzyme sensor 40 is downsized, the enzyme fixing part 47 can be reliably and easily formed only on the working electrode 12.

（第２、第３参考例）
本発明の第２参考例および第３参考例について説明する。図１６は第２参考例による酵素センサの断面図であり、図１７は第３参考例による酵素センサの断面図である。なお、第１参考例と実質的に同一の構成部位には、同一の符号を付し、説明を省略している。
図１６に示す第２参考例および図１７に示す第３参考例は、酵素を含有する酵素固定部の形成方法が上述の第１参考例または第１実施例と異なる。 ( Second and third reference examples )
The second reference example and the third reference example of the present invention will be described. FIG. 16 is a cross-sectional view of the enzyme sensor according to the second reference example, and FIG. 17 is a cross-sectional view of the enzyme sensor according to the third reference example. In addition, the same code | symbol is attached | subjected to the component substantially the same as a 1st reference example, and description is abbreviate | omitted.
The second reference example shown in FIG. 16 and the third reference example shown in FIG. 17 are different from the first reference example or the first embodiment described above in the method of forming an enzyme fixing part containing an enzyme.

第２参考例では、図１６（Ａ）に示すように基板１１にはフォトリソグラフィにより作用極１２、対極１３および参照極１４をはじめとする各種の導電パターンが形成される。これらの電極および配線部などの導電パターンの形成は、第１参考例と同様である。導電パターンが形成されると、基板１１の作用極１２を除く部位に保護シート２５を貼付する。保護シート２５は、例えば低温発泡テープなどを用いることができる。これにより、保護シート２５は作用極１２を除く部分を覆う。 In the second reference example , as shown in FIG. 16A, various conductive patterns including the working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 are formed on the substrate 11 by photolithography. The formation of conductive patterns such as these electrodes and wiring portions is the same as in the first reference example . When the conductive pattern is formed, the protective sheet 25 is attached to the portion of the substrate 11 excluding the working electrode 12. For example, a low-temperature foam tape can be used as the protective sheet 25. Thereby, the protective sheet 25 covers a portion excluding the working electrode 12.

保護シート２５の貼付が完了すると、樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液を基板に塗布し硬化させる。このとき、作用極１２を除く部分は保護シート２５で覆われているため、酵素を含む酵素液は作用極１２にのみ塗布される。酵素液が硬化し、酵素を含む酵素固定部２６が形成されると、基板１１に貼付されている保護シート２５は除去される。これにより、図１６（Ｂ）に示すように作用極１２にのみ酵素固定部２６が形成される。なお、変形例として、保護シート２５を除去せず残してもよい。また、保護シート２５に代えて、基板１１上に撥水性を向上させる処理を施し、酵素液が他の基板１１領域に付着しないようにしてもよい。 When the application of the protective sheet 25 is completed, an enzyme solution in which an enzyme is dispersed or dissolved in a resin is applied to the substrate and cured. At this time, since the portion excluding the working electrode 12 is covered with the protective sheet 25, the enzyme solution containing the enzyme is applied only to the working electrode 12. When the enzyme solution is cured and the enzyme fixing part 26 containing the enzyme is formed, the protective sheet 25 attached to the substrate 11 is removed. Thereby, as shown in FIG. 16B, the enzyme fixing part 26 is formed only on the working electrode 12. As a modification, the protective sheet 25 may be left without being removed. Moreover, it may replace with the protection sheet 25 and the process which improves water repellency may be performed on the board | substrate 11, and it may be made not to adhere an enzyme liquid to the other board | substrate 11 area | region.

第３参考例では、図１７に示すようにフォトリソグラフィにより作用極１２、対極１３および参照極１４をはじめとする各種の導電パターンが形成される。これらの導電パターンの形成は、第１参考例と同様である。導電パターンが形成されると、スタンプ装置５０は、樹脂に酵素を分散または溶解させた酵素液を基板１１に塗布する。スタンプ装置５０は、タンク５１内に酵素液を蓄えている。タンク５１に蓄えられている酵素液は、浸透部５２を経由して基板１１側へしみ出す。これにより、スタンプ装置５０を導電パターンが形成された基板１１の所定の位置に押し付けることにより、所定の位置に酵素液が塗布される。本参考例の場合、スタンプ装置５０は、作用極１２に酵素液を塗布する。塗布された酵素液を硬化させることにより、作用極１２にのみ酵素を含む酵素固定部が形成される。
なお、スタンプ装置５０による酵素液の塗布に限らず、例えば印刷技術を利用して所定の位置に酵素を含む酵素液を印刷する構成としてもよい。 In the third reference example , various conductive patterns including the working electrode 12, the counter electrode 13, and the reference electrode 14 are formed by photolithography as shown in FIG. The formation of these conductive patterns is the same as in the first reference example . When the conductive pattern is formed, the stamp device 50 applies an enzyme solution in which an enzyme is dispersed or dissolved in a resin to the substrate 11. The stamp device 50 stores an enzyme solution in the tank 51. The enzyme solution stored in the tank 51 oozes out to the substrate 11 side through the infiltration portion 52. Thus, the enzyme solution is applied to the predetermined position by pressing the stamp device 50 against the predetermined position of the substrate 11 on which the conductive pattern is formed. In the case of this reference example, the stamp device 50 applies an enzyme solution to the working electrode 12. By curing the applied enzyme solution, an enzyme fixing part containing the enzyme is formed only on the working electrode 12.
In addition, it is good also as a structure which prints the enzyme liquid which contains not only the application of the enzyme liquid by the stamp apparatus 50 but a predetermined position using a printing technique, for example.

（２．アミラーゼ活性測定装置）
次に、上述の複数の実施例で説明した酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムの実施例について説明する。
図１８は、酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システム６０の一実施例を示す模式図である。アミラーゼ活性測定システム６０は、基質タンク６１、ポンプ６２、試料導入部６３、分析装置７０および廃液タンク６４を備えている。アミラーゼ活性測定システム６０では、ヒトストレス判定の指標となるα−アミラーゼ（以下、「α−ＡＭＹ」と省略する。）の活性を測定する。α−ＡＭＹの活性測定は、唾液に含まれるα−ＡＭＹを基質に作用させ、生成した反応生成物を検出することにより実施する。基質としては、例えばデンプン、オリゴ糖およびこれらの誘導体を用いることができる。本実施例の場合、次の反応を用いてα−ＡＭＹの活性を測定する。基質がデンプンである場合、デンプンをα−ＡＭＹの作用によりマルトースに分解する。分解したマルトースは、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）の作用によりブドウ糖（グルコース）に分解する。さらに、生成したグルコースには、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を作用させることによりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。ここで、生成した過酸化水素が分解する際に放出される電子を検出することにより、α−ＡＭＹの活性を測定する。 (2. Amylase activity measuring device)
Next, an embodiment of an amylase activity measuring system to which the enzyme sensor described in the above-described embodiments is applied will be described.
FIG. 18 is a schematic diagram showing an example of an amylase activity measuring system 60 to which an enzyme sensor is applied. The amylase activity measurement system 60 includes a substrate tank 61, a pump 62, a sample introduction unit 63, an analyzer 70, and a waste liquid tank 64. The amylase activity measurement system 60 measures the activity of α-amylase (hereinafter abbreviated as “α-AMY”) that serves as an index for human stress determination. α-AMY activity is measured by allowing α-AMY contained in saliva to act on a substrate and detecting the produced reaction product. As the substrate, for example, starch, oligosaccharide and derivatives thereof can be used. In the case of this example, the activity of α-AMY is measured using the following reaction. When the substrate is starch, the starch is broken down into maltose by the action of α-AMY. The decomposed maltose is decomposed into glucose (glucose) by the action of maltose phosphorylase (MP). Furthermore, gluconolactone and hydrogen peroxide are produced by causing glucose oxidase (GOD) to act on the produced glucose. Here, the activity of α-AMY is measured by detecting electrons emitted when the generated hydrogen peroxide is decomposed.

本参考例のアミラーゼ活性測定システム６０は、酵素センサを有する分析装置７０を備えている。酵素センサは、上述の第１実施例及び第１参考例から第３参考例で説明した酵素センサを適用することができる。ここでは、第１参考例による酵素センサ１０を用いた例について説明する。本参考例の反応系では、基質としてマルトペンタオースを適用するとともに、酵素センサ１０の酵素固定部２３には、酵素としてＭＰおよびＧＯＤを固定化している。酵素センサ１０の酵素固定部２３には、混合されたＭＰおよびＧＯＤが固定化されている。なお、酵素固定部２３には、ＭＰを固定化した固定化膜とＧＯＤを固定化した固定化膜とを積層または隣接して設置してもよい。なお、痾−ＡＭＹの基質としては、デンプンあるいはマルトペンタオースに限らず、他のグルコース単位で構成されるマルトオリゴ糖、あるいはそれらの誘導体などを適用することができる。 The amylase activity measurement system 60 of this reference example includes an analyzer 70 having an enzyme sensor. As the enzyme sensor, the enzyme sensor described in the first embodiment and the first to third reference examples can be applied. Here, an example using the enzyme sensor 10 according to the first reference example will be described. In the reaction system of this reference example, maltopentaose is applied as a substrate, and MP and GOD are immobilized as enzymes in the enzyme immobilization portion 23 of the enzyme sensor 10. Mixed MP and GOD are fixed to the enzyme fixing part 23 of the enzyme sensor 10. In the enzyme immobilization section 23, an immobilization film immobilizing MP and an immobilization film immobilizing GOD may be stacked or adjacent to each other. The substrate of 痾 -AMY is not limited to starch or maltopentaose, and malto-oligosaccharides composed of other glucose units or derivatives thereof can be applied.

アミラーゼ活性測定システム６０は、基質タンク６１を備えている。基質タンク６１には、アミラーゼ活性測定システム６０に適用される基質溶液が蓄えられている。基質溶液は、適当なｐＨの緩衝溶液に基質となるマルトペンタオースを溶解したものである。基質の濃度は、通常は０．０５ｍＭから１Ｍ程度に調整される。酵素としてＭＰを用いる場合、緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液を用いる。 The amylase activity measurement system 60 includes a substrate tank 61. A substrate solution applied to the amylase activity measurement system 60 is stored in the substrate tank 61. The substrate solution is obtained by dissolving maltopentaose serving as a substrate in a buffer solution having an appropriate pH. The concentration of the substrate is usually adjusted to about 0.05 mM to 1M. When MP is used as the enzyme, a phosphate buffer solution is used as the buffer solution.

基質タンク６１に蓄えられている基質溶液は、ポンプ６２により分析装置７０に供給される。分析装置７０に供給される基質溶液には、分析装置７０へ導入される前に試料導入部６３から試料溶液が混合される。試料には被験者から採取した唾液を用いる。唾液には、α−ＡＭＹが含まれている。基質溶液に試料溶液を混合することにより、試料溶液に含まれるα−ＡＭＹは基質であるマルトペンタオースをマルトースに分解する。基質の分解反応時における反応温度は、常温付近であり、特に限定されない。また、反応時間は、基質の種類などに依存するものの、数分程度である。 The substrate solution stored in the substrate tank 61 is supplied to the analyzer 70 by the pump 62. The substrate solution supplied to the analyzer 70 is mixed with the sample solution from the sample introduction unit 63 before being introduced into the analyzer 70. Saliva collected from the subject is used as the sample. Saliva contains α-AMY. By mixing the sample solution with the substrate solution, α-AMY contained in the sample solution decomposes maltopentaose as a substrate into maltose. The reaction temperature during the decomposition reaction of the substrate is around normal temperature and is not particularly limited. The reaction time is about several minutes although it depends on the type of substrate.

試料溶液が混合された基質溶液は、分析溶液として分析装置７０に供給される。分析装置７０は、図１９に示すように酵素センサ１０およびケーシング７１を備えている。ケーシング７１は、酵素センサ１０の基板１１に結合され、酵素センサ１０の規定部２２側の面を覆っている。ケーシング７１は、例えば樹脂で形成されており、供給部７２および排出部７３を有している。供給部７２はポンプ６２に接続している。ポンプ６２により供給された分析溶液は、供給部７２を経由して酵素センサ１０に供給される。供給部７２は、酵素センサ１０の酵素固定部２３の上方に設置されている。すなわち、供給部７２と酵素固定部２３とは概ね同軸上に配置されている。そのため、ポンプ６２により供給された分析溶液は、酵素固定部２３に対し概ね垂直に流入する。一方、排出部７３は、酵素固定部２３の径方向外側に配置されている。そのため、酵素固定部２３に対し概ね垂直に流入した分析溶液は、流入方向とは概ね垂直な水平方向へ流出する。これにより、供給部７２から酵素センサ１０の酵素固定部２３へ概ね垂直に流入した分析流体は、排出部７３から酵素固定部２３の径方向外側へ排出される。分析流体は、廃液タンク６４に排出される。また、ポンプ６２は、分析流体の流速を酵素センサ１０における反応時間に対応するように調整する。 The substrate solution mixed with the sample solution is supplied to the analyzer 70 as an analysis solution. The analyzer 70 includes an enzyme sensor 10 and a casing 71 as shown in FIG. The casing 71 is coupled to the substrate 11 of the enzyme sensor 10 and covers the surface of the enzyme sensor 10 on the side of the defining portion 22. The casing 71 is made of resin, for example, and has a supply unit 72 and a discharge unit 73. The supply unit 72 is connected to the pump 62. The analysis solution supplied by the pump 62 is supplied to the enzyme sensor 10 via the supply unit 72. The supply unit 72 is installed above the enzyme fixing unit 23 of the enzyme sensor 10. That is, the supply part 72 and the enzyme fixing | fixed part 23 are arrange | positioned substantially coaxially. Therefore, the analysis solution supplied by the pump 62 flows substantially perpendicularly to the enzyme fixing unit 23. On the other hand, the discharge part 73 is disposed on the radially outer side of the enzyme fixing part 23. Therefore, the analysis solution that has flowed in substantially perpendicular to the enzyme immobilization part 23 flows out in a horizontal direction that is substantially perpendicular to the inflow direction. Thereby, the analysis fluid that has flowed from the supply unit 72 into the enzyme fixing unit 23 of the enzyme sensor 10 substantially vertically is discharged from the discharge unit 73 to the outside in the radial direction of the enzyme fixing unit 23. The analysis fluid is discharged to the waste liquid tank 64. Further, the pump 62 adjusts the flow rate of the analysis fluid so as to correspond to the reaction time in the enzyme sensor 10.

供給部７２から酵素センサ１０の酵素固定部２３へ流入した分析溶液に含まれるマルトースは、酵素固定部２３に固定化されているＭＰの作用によりグルコースに分解される。さらに、分解されたグルコースからは、酵素固定部２３に固定化されているＧＯＤの作用によりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。生成した過酸化水素は酸素とともに電子を放出し、酵素センサ１０の作用極１２では放出された電子を検出する。この放出された電子により変化する電位を検出することにより、基質を分解するα−ＡＭＹの活性が測定される。 Maltose contained in the analysis solution that has flowed from the supply unit 72 into the enzyme fixing unit 23 of the enzyme sensor 10 is decomposed into glucose by the action of the MP immobilized on the enzyme fixing unit 23. Furthermore, from the decomposed glucose, gluconolactone and hydrogen peroxide are generated by the action of GOD immobilized on the enzyme immobilization part 23. The generated hydrogen peroxide emits electrons together with oxygen, and the working electrode 12 of the enzyme sensor 10 detects the emitted electrons. By detecting the potential that changes due to the emitted electrons, the activity of α-AMY that degrades the substrate is measured.

以上説明したアミラーゼ活性測定システム６０では、分析装置７０は酵素センサ１０の酵素固定部２３の上方に設置される供給部７２を備えている。そのため、供給部７２を経由して酵素センサ１０に流入する分析溶液は酵素固定部２３に確実に供給される。また、酵素固定部２３に供給された分析溶液は、酵素固定部２３の径方向外側に設置されている排出部７３から排出される。そのため、酵素固定部２３には分析流体が確実に供給されるとともに、反応を終えた分析流体は酵素固定部２３の近傍に留まることなく排出部７３から排出される。したがって、酵素センサ１０による測定精度を高めることができる。
また、供給部７２と排出部７３との位置関係を概ね垂直にすることにより、分析装置７０の設置に要する容積は低減する。したがって、分析装置７０の体格の小型化を図ることができる。 In the amylase activity measurement system 60 described above, the analysis device 70 includes the supply unit 72 installed above the enzyme fixing unit 23 of the enzyme sensor 10. Therefore, the analysis solution flowing into the enzyme sensor 10 via the supply unit 72 is reliably supplied to the enzyme fixing unit 23. Further, the analysis solution supplied to the enzyme fixing unit 23 is discharged from a discharge unit 73 installed on the outer side in the radial direction of the enzyme fixing unit 23. Therefore, the analysis fluid is reliably supplied to the enzyme fixing unit 23, and the analysis fluid that has finished the reaction is discharged from the discharge unit 73 without staying in the vicinity of the enzyme fixing unit 23. Therefore, the measurement accuracy by the enzyme sensor 10 can be increased.
Further, by making the positional relationship between the supply unit 72 and the discharge unit 73 substantially vertical, the volume required for installing the analyzer 70 is reduced. Therefore, the size of the analyzer 70 can be reduced.

（分析装置の変形例）
次に、上述のアミラーゼ活性システムに適用される分析装置の変形例について説明する。図２０は、酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムに含まれる分析装置の変形例を示す模式図である。
変形例による分析装置８０は、酵素センサ、基礎部材８１およびケーシング８２を備えている。酵素センサは、上述の第１実施例および第１参考例から第３参考例で説明した酵素センサを適用することができる。ここでは、第１参考例による酵素センサ１０を用いた例について説明する。酵素センサ１０は、ガラスなどの絶縁体で形成されている基礎部材８１に設置されている。基礎部材８１には、酵素センサ１０を収容可能な図示しない凹部が形成されている。これにより、基礎部材８１のケーシング８２側の面と酵素センサ１０のケーシング８２側の面（下面）とは、段差を形成することなく同一平面上に位置する。 (Modification of analyzer)
Next, a modified example of the analyzer applied to the above-mentioned amylase activity system will be described. FIG. 20 is a schematic diagram showing a modification of the analyzer included in the amylase activity measuring system to which the enzyme sensor is applied.
The analyzer 80 according to the modified example includes an enzyme sensor, a base member 81 and a casing 82. As the enzyme sensor, the enzyme sensor described in the first embodiment and the first to third reference examples can be applied. Here, an example using the enzyme sensor 10 according to the first reference example will be described. The enzyme sensor 10 is installed on a base member 81 made of an insulator such as glass. The base member 81 has a recess (not shown) that can accommodate the enzyme sensor 10. Thereby, the casing 82 side surface of the base member 81 and the casing 82 side surface (lower surface) of the enzyme sensor 10 are positioned on the same plane without forming a step.

ケーシング８２は基礎部材８１側が反基礎部材側へ窪んでいる。これにより、基礎部材８１とケーシング８２とを結合したとき、基礎部材８１とケーシング８２とは、第一収容室８３、第二収容室８４、接続通路８５、供給通路８６および排出通路８７を形成する。第一収容室８３は、酵素センサ１０を収容している。変形例による分析装置８０の場合、酵素センサ１０の酵素固定部２３には酵素としてＧＯＤのみが固定化されている。一方、第二収容室８４には、膜部材８８を収容している。膜部材８８は、酵素を含有する固定化膜である。本例の場合、膜部材８８にはＭＰが固定化されている。 In the casing 82, the base member 81 side is recessed toward the anti-base member side. Thereby, when the base member 81 and the casing 82 are joined together, the base member 81 and the casing 82 form a first storage chamber 83, a second storage chamber 84, a connection passage 85, a supply passage 86 and a discharge passage 87. . The first storage chamber 83 stores the enzyme sensor 10. In the case of the analyzer 80 according to the modification, only GOD is immobilized as an enzyme in the enzyme immobilization unit 23 of the enzyme sensor 10. On the other hand, the membrane member 88 is accommodated in the second accommodation chamber 84. The membrane member 88 is an immobilized membrane containing an enzyme. In the case of this example, MP is fixed to the membrane member 88.

接続通路８５は、第一収容室８３と第二収容室８４とを接続している。供給通路８６は、一方の端部が第二収容室８４に接続し、他方の端部がポンプ６２に接続している。排出通路８７は、一方の端部が第一収容室８３に接続し、他方の端部が廃液タンク６４に接続している。そのため、分析装置８０に供給される分析溶液は、供給通路８６を経由して第二収容室８４に流入する。第二収容室８４に流入した分析溶液は、接続通路８５を経由して第一収容室８３に流入する。そして、分析溶液は、第一収容室８３から排出通路８７を経由して廃液タンク６４へ排出される。 The connection passage 85 connects the first storage chamber 83 and the second storage chamber 84. The supply passage 86 has one end connected to the second storage chamber 84 and the other end connected to the pump 62. The discharge passage 87 has one end connected to the first storage chamber 83 and the other end connected to the waste liquid tank 64. Therefore, the analysis solution supplied to the analysis device 80 flows into the second storage chamber 84 via the supply passage 86. The analysis solution that has flowed into the second storage chamber 84 flows into the first storage chamber 83 via the connection passage 85. Then, the analysis solution is discharged from the first storage chamber 83 to the waste liquid tank 64 via the discharge passage 87.

供給通路８６から第二収容室８４に流入した分析溶液は、α−ＡＭＹによりマルトペンタオースを分解して生成したマルトースを含んでいる。分析溶液に含まれるマルトースは、膜部材８８に固定化されているＭＰによりグルコースに分解される。分解されたグルコースは、分析溶液とともに接続通路８５を経由して第一収容室８３に流入する。第一収容室８３に流入した分析溶液は、酵素センサ１０の酵素固定部２３に固定化されているＧＯＤの作用を受ける。これにより、分析溶液に含まれるグルコースからは、ＧＯＤの作用によりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。生成した過酸化水素が酸素とともに放出する電子は、酵素センサ１０の作用極１２により検出される。 The analysis solution flowing into the second storage chamber 84 from the supply passage 86 contains maltose generated by decomposing maltopentaose with α-AMY. Maltose contained in the analysis solution is decomposed into glucose by MP immobilized on the membrane member 88. The decomposed glucose flows into the first storage chamber 83 through the connection passage 85 together with the analysis solution. The analysis solution flowing into the first storage chamber 83 is subjected to the action of GOD immobilized on the enzyme immobilization part 23 of the enzyme sensor 10. Thereby, gluconolactone and hydrogen peroxide are produced from the glucose contained in the analysis solution by the action of GOD. Electrons released from the generated hydrogen peroxide together with oxygen are detected by the working electrode 12 of the enzyme sensor 10.

以上説明した変形例による分析装置８０は、第一収容室８３および第二収容室８４を有している。第一収容室８３は酵素固定部２３にＧＯＤが固定化されている酵素センサ１０を収容し、第二収容室８４はＭＰが固定化されている膜部材８８を収容している。これにより、分析溶液は、第二収容室８４の膜部材８８に固定化されたＭＰによる化学反応を経た後、酵素センサ１０を収容する第一収容室８３に水平に流入する。そのため、酵素センサ１０ではＧＯＤの作用によるグルコースの酸化反応が先立って進行する。したがって、酵素センサ１０による測定精度を高めることができる。 The analyzer 80 according to the modified example described above includes a first storage chamber 83 and a second storage chamber 84. The first storage chamber 83 stores the enzyme sensor 10 in which GOD is fixed in the enzyme fixing portion 23, and the second storage chamber 84 stores the membrane member 88 in which MP is fixed. As a result, the analytical solution undergoes a chemical reaction by MP immobilized on the membrane member 88 of the second storage chamber 84 and then flows horizontally into the first storage chamber 83 that stores the enzyme sensor 10. Therefore, in the enzyme sensor 10, the oxidation reaction of glucose by the action of GOD proceeds in advance. Therefore, the measurement accuracy by the enzyme sensor 10 can be increased.

また、変形例による分析装置８０では、水平に配置することにより、酵素センサ１０の酵素固定部２３と膜部材８８とが別個に設置される。例えば、異なる種類の酵素間における親和性や相互作用の問題から、混合して固定化することに適さない酵素を用いる場合がある。このような場合でも、変形例による分析装置８０では、酵素固定部２３と膜部材８８とにそれぞれ酵素が固定化される。したがって、複数の酵素を混合する必要がなく、酵素間の相互作用を低減することができる。 Moreover, in the analyzer 80 according to the modified example, the enzyme fixing part 23 and the membrane member 88 of the enzyme sensor 10 are separately installed by arranging them horizontally. For example, an enzyme that is not suitable for mixing and immobilizing may be used due to problems of affinity and interaction between different types of enzymes. Even in such a case, in the analyzer 80 according to the modified example, the enzyme is immobilized on the enzyme immobilization unit 23 and the membrane member 88, respectively. Therefore, it is not necessary to mix a plurality of enzymes, and the interaction between the enzymes can be reduced.

（３．ヒトストレスの判定）
上述のアミラーゼ活性測定システム６０を用いたヒトストレスの判定について説明する。
ヒトの唾液に含まれるα−アミラーゼの酵素活性を測定することにより、ヒトが受けた肉体的ストレス、精神的ストレスを包括するヒトストレスの判定が可能であることが知られている（特開２００２−１６８８６０号公報参照）。 (3. Determination of human stress)
The determination of human stress using the above-described amylase activity measurement system 60 will be described.
It is known that by measuring the enzyme activity of α-amylase contained in human saliva, it is possible to determine human stress including physical stress and mental stress received by humans (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002). No. 168860).

具体的には、被験者の安静時に採取した唾液中のα−ＡＭＹの活性を基準値として、被験者の任意の状態におけるα−ＡＭＹの活性と比較する。基準値よりも酵素活性が大きなとき、被験者は不快なストレスを受けていると判定でき、基準値よりも酵素活性が小さなとき、被験者は快適なストレスを受けていると判定することができる。また、基準値との差が大きなときほど、受けているストレスも大きくなることが知られている。 Specifically, the activity of α-AMY in saliva collected when the subject is resting is used as a reference value and compared with the activity of α-AMY in any state of the subject. When the enzyme activity is larger than the reference value, it can be determined that the subject is receiving unpleasant stress, and when the enzyme activity is lower than the reference value, it can be determined that the subject is receiving comfortable stress. In addition, it is known that the greater the difference from the reference value, the greater the stress received.

図２０に示す分析装置８０を適用したアミラーゼ活性測定システム６０を用いる場合、図２１に示すようにα−ＡＭＹの活性と検出される電流との間は相関を示す。アミラーゼの活性測定は、次の通りである。
被験者３名から唾液を採取する。採取した唾液は、α−ＡＭＹ活性が９０ｋＵ／Ｌから１９０ｋＵ／Ｌである。採取した唾液を試料溶液として基質溶液に混合する。その結果、図２１に示すように、α−ＡＭＹ活性に比例して３１ｎＡから７５ｎＡ程度の電流振幅を検出することができる。一回の分析には、数十秒程度を要する。図２０に示す分析装置８０を適用してアミラーゼの活性を測定すると、図２１の検量線に示すようにＲ^２値＝０．９５、ＣＶ値＝１０．６％（ｎ＝１２）と良好な相関を示す。 When using the amylase activity measuring system 60 to which the analyzer 80 shown in FIG. 20 is applied, as shown in FIG. 21, there is a correlation between the activity of α-AMY and the detected current. The measurement of amylase activity is as follows.
Saliva is collected from 3 subjects. The collected saliva has an α-AMY activity of 90 kU / L to 190 kU / L. The collected saliva is mixed with the substrate solution as a sample solution. As a result, as shown in FIG. 21, a current amplitude of about 31 nA to 75 nA can be detected in proportion to the α-AMY activity. A single analysis requires several tens of seconds. When the activity of amylase was measured by applying the analyzer 80 shown in FIG. 20, the R ² value = 0.95 and the CV value = 10.6% (n = 12) as shown in the calibration curve of FIG. Show correlation.

このように、測定した検量線を用いて被験者のα−ＡＭＹ活性が測定される。測定されたα−ＡＭＹ活性を用いて基準値と比較することにより、上述のように被験者が受けているストレスを判定することができる。これにより、図２０に示す分析装置８０を用いてヒトストレス判定の材料となるα−ＡＭＹ活性を測定することができる。したがって、分析装置８０の小型化が可能となるとともに、短時間で連続的に測定を実施することができる。 In this way, the α-AMY activity of the subject is measured using the measured calibration curve. By comparing the measured α-AMY activity with a reference value, it is possible to determine the stress that the subject is receiving as described above. Accordingly, the α-AMY activity that is a material for determining human stress can be measured using the analyzer 80 shown in FIG. Therefore, the analyzer 80 can be miniaturized and measurements can be performed continuously in a short time.

以上説明した実施例では、酵素センサをデンプンあるいはマルトペンタオースを基質とする反応系に適用し、酵素センサに固定化する酵素としてα−ＡＭＹあるいはＭＰを適用する例について説明した。しかし、本発明の酵素センサは、上述の基質に限らず他の基質を用いる反応系に適用してもよく、基質に応じて固定化する酵素を変更することができる。また、本発明では、酵素センサの作用極に固定化酵素部を設置する構成としたが、他の電極に固定化酵素部を設置する構成、あるいは二以上の電極に固定化酵素部を設置する構成としてもよい。 In the embodiment described above, an example in which the enzyme sensor is applied to a reaction system using starch or maltopentaose as a substrate and α-AMY or MP is applied as an enzyme to be immobilized on the enzyme sensor has been described. However, the enzyme sensor of the present invention may be applied not only to the above-mentioned substrate but also to a reaction system using another substrate, and the enzyme to be immobilized can be changed according to the substrate. In the present invention, the immobilized enzyme unit is installed on the working electrode of the enzyme sensor. However, the immobilized enzyme unit is installed on another electrode, or the immobilized enzyme unit is installed on two or more electrodes. It is good also as a structure.

本発明の第１参考例による酵素センサを示す図であって、（Ａ）は概略平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a figure which shows the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising : (A) is a schematic plan view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの酵素固定部を示す変形例である。It is a modification which shows the enzyme fixing | fixed part of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention. 本発明の第１参考例による酵素センサの酵素固定部を示す変形例である。It is a modification which shows the enzyme fixing | fixed part of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention. 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１参考例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。It is a schematic diagram which shows the manufacturing procedure of the enzyme sensor by the 1st reference example of this invention, Comprising: (A) is a top view, (B) is sectional drawing in the BB line of (A). 本発明の第１実施例による酵素センサを示す断面図である。It is sectional drawing which shows the enzyme sensor by 1st Example of this invention. 本発明の第２参考例による酵素センサを示す断面図であって、（Ａ）は保護シートを貼付した図であり、（Ｂ）は保護シートを除去した図である。It is sectional drawing which shows the enzyme sensor by the 2nd reference example of this invention, Comprising : (A) is the figure which affixed the protection sheet, (B) is the figure which removed the protection sheet. 本発明の第３参考例による酵素センサを示す断面図である。It is sectional drawing which shows the enzyme sensor by the 3rd reference example of this invention. 本発明の酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムの一参考例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows one reference example of the amylase activity measuring system to which the enzyme sensor of this invention is applied. 図１８に示すアミラーゼ活性測定システムの分析装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the analyzer of the amylase activity measuring system shown in FIG. 図１８に示すアミラーゼ活性測定システムの分析装置の変形例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the modification of the analyzer of the amylase activity measuring system shown in FIG. 図２０に示す分析装置を用いて測定したアミラーゼの活性と検出電流との相関を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the correlation of the activity of amylase measured using the analyzer shown in FIG. 20, and a detection electric current.

Explanation of symbols

１０、４０酵素センサ、１１、４１基板、１２作用極（第一電極）、１３対極（第二電極）、１４参照極（第三電極）、２２規定部、２３、４７酵素固定部、４２凹部、４５、４６側壁部、７０分析装置、７２供給部、７３排出部、８０分析装置、８１基礎部材、８２ケーシング、８３第一収容室、８４第二収容室、８８膜部材、２３１、２３３膜片部 10, 40 Enzyme sensor, 11, 41 Substrate, 12 Working electrode (first electrode), 13 Counter electrode (second electrode), 14 Reference electrode (third electrode), 22 Regulating part, 23, 47 Enzyme fixing part, 42 Recessed part , 45, 46 Side wall part, 70 Analyzer, 72 Supply part, 73 Discharge part, 80 Analyzer, 81 Base member, 82 Casing, 83 First storage chamber, 84 Second storage chamber, 88 Membrane member, 231, 233 Membrane One part

Claims

A substrate,
Two or more electrodes including a working electrode and a counter electrode installed on the substrate;
A defining part installed on the outer periphery of the working electrode;
An enzyme immobilization part containing an enzyme and covering at least a part of the working electrode on the working electrode side in the defining part;
With
The defining portion has a side wall portion that surrounds the enzyme fixing portion in the circumferential direction,
The counter electrode is arranged at the outer peripheral portion of the working electrode so as to surround the working electrode in the circumferential direction with the defining portion interposed therebetween and not to contact the wiring connected to the working electrode ,
The substrate has a recess in which the working electrode is installed,
The enzyme sensor according to claim 1, wherein the defining portion is a side wall portion formed at an end portion of the recess .

The enzyme sensor according to claim 1, wherein the defining portion is formed in a cylindrical shape surrounding the enzyme fixing portion in a circumferential direction.

The electrode is arranged so as to surround the working electrode and the counter electrode in the circumferential direction outside the counter electrode in the radial direction, and so as not to contact a wiring connected to the working electrode and a wiring connected to the counter electrode. The enzyme sensor according to claim 1, further comprising a reference electrode .

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 3, wherein at least one of the electrodes is made of platinum.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 4, wherein the enzyme fixing part covers the entire working electrode.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 5, wherein the enzyme fixing part contains a plurality of enzymes in which two or more kinds are mixed.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 6, wherein the enzyme immobilization part has a plurality of membrane piece parts containing one kind of enzyme.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 7, wherein the enzyme immobilization part contains at least glucose oxidase and maltose phosphorylase.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 8, wherein an analysis solution containing a sugar chain composed of four or more glucoses as a substrate is supplied to the enzyme immobilization unit.

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 9,
A supply unit that is installed above the enzyme immobilization unit in the direction of gravity and supplies an analysis solution containing a substrate to the enzyme immobilization unit in the axial direction of the defining unit;
A discharge part for discharging the analysis solution supplied to the enzyme fixing part to a radially outer side of the enzyme fixing part;
An analysis apparatus comprising:

The enzyme sensor according to any one of claims 1 to 9,
A base member on which the enzyme sensor is installed;
The accommodating for the previous SL base member, first chamber for accommodating the enzyme sensor, and a film member connected to said first chamber containing different enzymes and enzyme contained in the enzyme-immobilized portion A casing forming two containment chambers;
An analysis apparatus comprising:

Forming a recess recessed on one surface side of the substrate on the other surface side;
Forming a working electrode in the recess;
Forming an enzyme immobilization part containing an enzyme and covering the working electrode in the recess;
A method for producing an enzyme sensor, comprising:

A method for measuring amylase activity, comprising measuring the activity of amylase using the enzyme sensor according to any one of claims 1 to 9.

14. A method for determining human stress, comprising the step of measuring the activity of the amylase using the method for measuring amylase activity according to claim 13.