JP4129298B2 - Random peptides that bind to the gastrointestinal tract (GIT) transport receptor and related methods - Google Patents

Description

［式中、Ａは301nmにおける吸光度であり、vはピペリジンの20％DMA溶液の容量（ml）であり、7800はジベンゾフルベン−ピペリジン付加物の吸光係数（mol^-1dm³cm^-1）であり、wはペプチド−樹脂試料の重量（mg）である。］
によって計算することができる。
最後に、N-末端Fmoc基をピペリジンの20％DMA溶液を用いて切断し、次いで無水酢酸とピペリジンのDMA溶液を用いてアセチル化する。ペプチド樹脂をDMA、CH₂Cl₂、そして最後にジエチルエーテルで徹底的に洗浄する。
5.3.2. 切断および脱保護
一例として、しかし限定するものではないが、切断および脱保護は下記のようにして行うことができる。空気乾燥したペプチド樹脂を、95％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液を添加する前にエチルメチルスルフィド（EtSMe）、エタンジチオール（EDT）、およびチオアニソール（PhSMe）で約20分間処理する。これらの試薬をペプチド樹脂１グラム当たり合計50mlの容量で用いる。下記の比率で用いる：TFA:EtSMe:EDT:PhSMe（10:0.5:0.5:0.5）。混合物をN₂雰囲気下で室温にて3時間攪拌する。混合物を濾過し、樹脂をTFAで洗浄する（２×３ml）。濾液を一つにまとめて減圧濃縮し、この黄色／橙色樹脂に無水ジエチルエーテルを加える。得られた白色の沈殿物を濾過により単離する。種々の切断方法に関してはKingら，1990,Int.J.Peptide Protein Res.36:255-266を参照されたい。
5.3.3. ペプチドの精製
合成されたペプチドの精製は、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC））、遠心分離、示差溶解性などの標準的な方法、または任意のその他の標準技術によって行うことができる。
5.3.4. 生物学的ペプチドライブラリー
生物学的ペプチドライブラリーを用いることにより、GIT輸送受容体に結合するペプチドを発現させ、同定することができる。組換えDNA技術を含むこの第2のアプローチによれば、ペプチドを、例えば、可溶性融合タンパク質またはウイルスキャプシドタンパク質のような生物学的系で発現させることができる。
5.3.4.1. バインダーを同定するための方法：ライブラリーの構築
特定の実施形態においては、GIT輸送受容体に特異的に結合する本発明のペプチドは、ランダムペプチドライブラリーをHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSI（または本質的にその細胞外ドメインまたはそのドメインの断片からなる分子）から選択されるリガンドに接触させ、該リガンドに特異的に結合するライブラリーのメンバーを同定することにより該ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。
特定の実施形態においては、本発明のペプチドを同定するための方法は、当技術分野で周知の方法によって構築された組換えベクターのライブラリーを利用するものであり、例えば近づきやすいベクターの表面構造タンパク質に結合した細胞外GIT輸送受容体ドメインをコードする挿入された合成オリゴヌクレオチド配列を発現する組換えベクターのライブラリーをスクリーニングしてHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIに結合するペプチドを産生するメンバーを単離することを含む。単離されたベクターの挿入合成オリゴヌクレオチドの核酸配列を決定し、コードされるアミノ酸配列を推定することにより選り抜きのリガンド（例えばHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSI）を結合する結合ドメインを同定することができる。
本発明は、HPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるリガンドに結合するペプチドを同定する方法であって、ランダムペプチドのライブラリーを該リガンド（またはその細胞外ドメインもしくは断片）を用いてリガンド結合に導く条件下でスクリーニングし、該リガンドに結合するペプチドを単離することを含む前記方法を包含する。また、本発明の方法はさらに同定されたペプチドの結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を決定して該結合ドメインのアミノ酸配列を推定することを含む。
5.3.4.2. 細胞外ドメインリガンドの調製
特定の実施形態においては、本質的に所望のGIT輸送受容体の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの断片からなる分子を用いてそれに対する結合についてランダムペプチドライブラリーをスクリーニングする。好ましくは、細胞外ドメインをコードする核酸をクローニングし、組換え発現させ、次いで該ドメインを使用のために精製する。GIT輸送受容体は好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択される。
5.3.4.3. バインダーを同定するための方法：ライブラリーのスクリーニング
適当なランダムペプチドライブラリーを構築したら（あるいは取得したら）、そのライブラリーをスクリーニングしてGIT輸送受容体、例えばHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIに対して結合親和性を有するペプチドを同定する。好ましい態様においては、このライブラリーはTSARライブラリー（1996年3月12日付けの米国特許第5,498,538号および1994年8月18日付けのPCT国際公開公報WO94/18318を参照されたい。両方とも参照により本明細書に含まれるものである。）である。ライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の種々の方法のいずれによっても行うことができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する、下記の参考文献を参照されたい:ParmleyおよびSmith,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;ScottおよびSmith,1990,Science 249:386-390;Fowlkesら，1992,BioTechniques 13:422-427;Oldenburgら，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393-5397;Yuら，1994,Cell 76:933-945;Staudtら，1988,Science 241:577-580;Bockら，1992,Nature 355:564-566;Tuerkら，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988-6992;Ellingtonら，1992,Nature 355:850-852;米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号および米国特許第5,198,346号（すべてLadnerら）；ならびにRebarおよびPabo,1993,Science 263:671-673。また、1994年8月18日付けのPCT国際公開公報WO94/18318も参照されたい。
当業者であれば、適当な変更を加えることにより、下記のスクリーニング法が広範な生物学的発現ライブラリーに適することがわかるであろう。
ライブラリーが構築、あるいは取得されたら、そのライブラリーをスクリーニングすることにより、好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるGIT輸送受容体についてのリガンドに対して特異的結合親和性を有する結合性分子を同定する。
ライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の種々の方法のいずれによっても行うことができる。代表的なスクリーニング法は、Fowlkesら，1992,BioTechniques,13:422-427に記載されており、これはベクターを固定化した標的リガンドと接触させ、前記リガンドに結合するベクターを採取することを含む。そのような有用なスクリーニング法は「パンニング」法と呼ばれる。本ライブラリーをスクリーニングするのに有用なパンニング法においては、標的リガンドはプレート、ビーズ（磁気ビーズなど）、セファロース、カラムに用いられるビーズなどに固定され得る。所望により、固定化された標的リガンドを、例えばFACS選別するために、例えばビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンなどの標識を用いて「タグ付け」することができる。パンニング法はParmley,S.F.およびSmith,G.P.,1988,Gene 73:305-318にも開示されている。
本発明の特定の実施形態においては、ライブラリーは組換え受容体ドメインを用いてスクリーニングすることができる。別の実施形態においては、ライブラリーは受容体ドメインを用いて、次いでCaCO-2細胞上で逐次的にスクリーニングすることができる。
in vitroでのペプチドライブラリーのスクリーニングについては、スクリーニングに関与する溶媒に要求される条件は水性溶媒に限定されず、よってin vivoで見出されるものとは異なる非生理学的結合相互作用および条件を利用することができる。
ライブラリーのスクリーニングは、下記のような第1の「富化（enrichment）」工程および第2のフィルターリフト（lift）を含む方法を用いて行うことができる。下記の記載は一例として示したものであり、限定するものではない。
所与のリガンドへの結合能を有する（「陽性」の）発現したライブラリー（例えばファージ内）由来のバインダーを、最初に１または２サイクルのパンニング法またはアフィニティクロマトグラフィーにより富化する。マイクロタイターウェルをリガンド（例えば100μl中約10μg）で受動的に被覆する。次いでウェルをBSAの溶液でブロックし、ライブラリーのファージのプラスチック表面への非特異的付着を防止する。例えば、その後ペプチドを発現する約10¹¹個のファージ粒子をウェルに加え、数時間インキュベートする。未結合ファージをプレートを繰り返し洗浄することにより除去し、特異的に結合したファージを酸性グリシン-HCl溶液またはその他の溶離緩衝液を用いて溶離される。溶出したファージ溶液をアルカリで中和し、例えばE.coliに感染させ、ルリア肉汁（LB）を加えた寒天を含む大きなシャーレで平板培養することにより増幅させる。次いで結合性ペプチドを発現する増幅培養物を力価測定し、このプロセスを繰り返す。あるいはまた、リガンドを市販の活性化ビーズ試薬を用いてアガロースまたはアクリルアミドビーズに共有結合されてもよい。次いでファージ溶液を結合ビーズマトリックスを含む小さいカラムに簡単に通し、その後徹底的に洗浄し、酸またはその他の溶離液を用いて溶離させる。どちらの場合においても、目標は陽性物を約1/10⁵よりも高い頻度まで富化することである。
富化後、フィルターリフトアッセイを行う。例えば、特異的バインダーをファージ内で発現させる場合、約１〜２×10⁵個のファージを500μlの対数期E.coliに加え、肉汁液中に0.7％のアガロースを含む大きなルリア肉汁−アガロースプレート上で平板培養する。アガロースを固化し、ニトロセルロースフィルター（例えば0.45μ）をアガロース表面に置く。滅菌針で一連の位置合わせマークをつけて下記のように成長後にフィルターおよびプレートを再度置き換える。ファージプラークを37℃で一晩インキュベートすることにより成長させる（フィルターの存在はこのプロセスを阻害しない）。次いでフィルターを、in situで付着した個々のプラーク由来のファージを有するプレートから除去する。次にフィルターをBSAの溶液またはその他のブロッキング剤に１〜２時間曝して、リガンド（または「プローブ」）の非特異的結合を防止する。
プローブ自体は、例えば、ビオチン化（市販のNHS-ビオチンを用いる）、または、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼによる直接酵素標識化によって標識する。この様式で標識化したプローブはいつまでも安定であり、数回再使用することができる。ブロックしたフィルターをプローブの溶液に数時間曝すことにより、プローブをフィルター上のファージにin situで結合させてプローブへの有意な親和性を有するペプチドを表示させる。次いで、フィルターを洗浄して未結合プローブを除去し、その後酵素基質溶液に曝すことによって発色させるか（直接標識化プローブの場合）、またはさらに酵素標識化アビジンの溶液に曝す（ビオチン化プローブの場合）。陽性ファージプラークは、オリジナルプレート上のプラークに対応するフィルター上の着色酵素切断産物の局所的析出によって同定される。発色させたフィルターを、位置合わせマークを用いて単純にプレートに再度置き直し、「陽性」プラークをアガロースから抜き取ってファージを回収する。オリジナルプレート上のプラークは高密度なので、最初の一回でプレートから単一のプラークを単離することは困難であるかもしれない。したがって、最初の抜き取り物（core）から回収したファージを低密度で再平板培養することができ、このプロセスを繰り返すことにより個々のプラークの単離が可能になり、よってファージの単一クローンの単離が可能になる。
３ラウンドの連続スクリーニングを用いることにより満足すべきスクリーニング実験が最適に行われる。次いで回収した細胞を低密度で平板培養して個々の分析に対して単離コロニーを得る。個々のコロニーを選択し、アンピシリンを含むLB培養培地への接種に用いる。37℃で一晩培養した後、培養物を遠心分離によって分離させる。次に、個々の細胞アリコートをビーズに結合した標的リガンドに対する結合について再試験する。関連性のないリガンドを結合したその他のビーズへの結合を陰性対照として用いることができる。
ライブラリーのスクリーニングの一つの態様は溶出である。下記の考察は、ランダムペプチドが表面融合分子上で発現される任意の系に適用可能である。ファージの回収中にペプチド−標的相互作用を妨害する条件は、ファージ上で発現した複数のタンパク質由来の全ての所与のペプチド配列に特異的であると考えられる。例えば、ある相互作用は、酸性pHによって妨害され得るが塩基性pHでは妨害されず、またその逆もありうる。したがって、種々の溶出条件（限定するものではないが、pH２〜３、pH12〜13、競合における過剰標的、界面活性剤、温和なタンパク質変性剤、尿素、温度の変更、光、金属イオンの存在の有無、キレート剤など）を試験し、各条件セットについて回収したファージ上で発現した結合性タンパク質の一次構造を比較することにより各リガンド／結合性タンパク質の組み合わせに適した溶出条件を決定することが望ましくあり得る。これらの溶出条件のいくつかは殺菌性であり、透析（すなわち透析バッグ、Centricon/Amiconマイクロ濃縮器）により除去することが必要であるので、ファージ感染に不適合であり得る。
好ましい実施形態においては、ランダムペプチドのファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによりGIT輸送受容体に結合するペプチドを発現するファージを選択する。好ましくは、第1の工程は予備選択したファージライブラリーを単離することである。「予備選択したファージライブラリー」とは、ファージ表示ライブラリーのサブ集団からなるライブラリーである。このサブ集団は、標的GIT輸送受容体に特異的に結合するファージのサブ集団を選択することができるように該受容体（またはそのドメイン）に対して最初にスクリーニングすることによって形成され得るものである。あるいはまた、サブ集団は、胃腸管の標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに特異的に結合するか、またはin situもしくはin vivoで標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに結合する、および／またはそれらを横切って（またはそれらの間に）輸送されるファージのサブ集団を選択することができるように、標的細胞もしくは細胞型または組織型もしくは組織バリアに対してスクリーニングすることによって形成され得るものである。この予備選択されたファージライブラリーまたは選択されたファージのサブ集団は、標的GIT輸送受容体に対しても再スクリーニングされ得るものであり、GIT輸送受容体または標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに結合するか、またはin situもしくはin vivoで標的細胞、標的組織または標的組織バリアに結合する、および／またはそれらを横切って輸送されるファージのサブ集団をさらに選択することができる。そのような再スクリーニングは０〜30回繰り返すことができ、それぞれの連続する「予備選択されたファージライブラリー」はさらなる予備選択されたファージライブラリーを生み出すものである。
好ましい実施形態においては、好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるGIT輸送受容体であるリガンドを結合する予備選択されたファージライブラリーは、上記のin vitroスクリーニング工程により得られるものであり、次いでファージは、場合によっては、ファージを目的の受容体ドメインまたはCaco-2細胞に直接結合させることからなるin vitroアッセイ、またはin vivoアッセイを用いてさらに特性付けされる。別の好ましい実施形態においては、腸組織による、またはGITによるファージの取り込みを測定するin vivoアッセイが用いられる。別の実施形態においては、そのようなさらなるin vitroまたはin vivoアッセイは最初のスクリーニング工程として用いることができる。
用い得るin vivoアッセイを下記の実施例に記載する。
5.4. GIT輸送受容体結合性ペプチドおよびその誘導体に対する抗体の作製
本発明によれば、GIT輸送受容体結合性ペプチド、その断片またはその他の誘導体、またはその類似体を免疫原として用いることにより、そのような免疫原を免疫特異的に結合する抗体を産生させ得るものである。かかる抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーが挙げられる。
当技術分野で公知の種々の操作がGIT輸送受容体結合性ペプチドまたは誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体の産生に用いられ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物、例えば（しかし限定するものではないが）ウサギ、マウス、ラット、ニワトリなどを、天然GIT輸送受容体結合性ペプチド、またはその合成タイプ、または誘導体（例えば断片）の注射により免疫感作することができる。宿主種に応じて、例えば（しかし限定するものではないが）フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにBCG（カルメット−ゲラン杆菌）およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントなどの種々のアジュバントを用いることにより、免疫応答を増大させることができる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドまたはその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を生じさせる任意の技術が用いられ得る。例えば、もともとKohlerおよびMilstein（1975,Nature 256:495-497）によって開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983,Immunology Today 4:72）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）。本発明のさらなる実施形態においては、モノクローナル抗体を、最新技術（PCT/US90/02545）を利用して無菌動物において産生させることができる。本発明によれば、ヒト抗体が用いられ得るものであり、これはヒトハイブリドーマを用いることによって（Coteら，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030）、またはin vitroでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換することによって（Coleら，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77-96）得ることができる。本発明によれば、GIT輸送受容体結合性ペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子ならびに適当な生物活性のあるヒト抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrisonら，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neubergerら，1984,Nature 312:604-608;Takedaら，1985,Nature 314:452-454）を用いることができる。
本発明によれば、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号）をGIT輸送受容体結合性ペプチド特異的一本鎖抗体の作製に適合させることができる。本発明のその他の実施形態は、Fab発現ライブラリーの構築について記載された技術（Huseら，1989,Science 246:1275-1281）を利用することにより、GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体、または類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能にするものである。
上記分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技術により作製することができる。例えば、かかるフラグメントとしては、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るF（ab’）₂フラグメント；F（ab’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じ得るFab’フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生じ得るFabフラグメント、ならびにFvフラグメントが挙げられる。
抗体の作製においては、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えばELISA（固相酵素免疫検定法）によって行うことができる。例えば、GIT輸送受容体結合性ペプチドの特定のドメインを認識する抗体を選択するために、かかるドメインを含むGIT輸送受容体結合性ペプチド断片に結合する産物に対して生じたハイブリドーマをアッセイすることができる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメインに特異的な抗体も提供される。
前述の抗体は、本発明のGIT輸送受容体結合性ペプチド配列の局在化および活性に関する当技術分野で公知の方法、例えばこれらのペプチドのin vivo投与後の画像化（例えば治療効率を監視するため）、適当な生理学的試料におけるそのレベルの測定、診断方法などにおいて使用することができる。例えば、GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメイン、またはペプチドに導入されたダンシル基または何らかのその他のエピトープのようなペプチドの誘導体に特異的な抗体または抗体フラグメントを用いることにより、1）ナノ粒子またはその他の基質におけるペプチドの存在を確認すること；2）ナノ粒子におけるペプチドの量を定量すること；3）適当な生理学的試料におけるペプチドのレベルを測定すること；4）組織試料における免疫組織学を行うこと；5）ペプチドをin vivo投与後に画像化すること；6）イムノアフィニティカラムを用いて混合物からペプチドを精製すること、または7）ナノ粒子の表面にペプチドを結合もしくは固定することができる。この最後の用途は、抗体（または抗体のフラグメント）を薬剤添加ナノ粒子またはその他の基質の表面に結合させ、次いでこの結合体をペプチドとともにインキュベートすることを想定したものである。この方法により一定の決まった方向にペプチドの結合が生じ、ペプチドが十分活性であるように抗体に結合されたペプチドを含む粒子が生じる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメインまたはペプチドに導入されたダンシル基もしくは何らかのその他のエピトープのようなペプチドの誘導体に特異的なアブチド（abtides）［すなわち、抗原結合性ペプチド（Antigen binding peptides）］は、抗体について上記で確認したのと同じ７つの目的に用いることができる。
5.5.GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体および類似体のアッセイ
GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体および類似体の機能的活性は種々の方法によってアッセイすることができる。
好ましい実施形態においては（これは、GIT輸送受容体への結合をアッセイするもの）、この結合は下記の実施例に記載されたようなin vivoまたはin vitroアッセイ、または当技術分野で公知のその他の方法によってアッセイすることができる。
別の実施形態においては（これは、抗GIT輸送受容体結合性ペプチド抗体への結合について全長GIT輸送受容体結合性ペプチドと結合または競合する能力についてアッセイするもの）、当技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば限定するものではないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA（固相酵素免疫検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えばコロイドゲル、酵素または放射性同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Aアッセイ、免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合的および非競合的アッセイ系などを用いることができる。一つの実施形態においては、抗体結合は一次抗体における標識を検出することによって検出される。別の実施形態においては、一次抗体は一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらに別の実施形態においては、二次抗体が標識化される。イムノアッセイにおいて結合を検出するためには多くの方法が当技術分野で公知であり、それらは本発明の範囲に含まれるものである。
その他の方法が当業者には公知であり、それらは本発明の範囲に含まれるものである。
5.6 用途
本発明は有効成分を含む材料に結合させた本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質からなる組成物を提供する。そのような組成物は、GITに有効成分をターゲットすることおよび/またはGITの管腔を経由しての有効成分の全身循環への移送を可能とすることに用いる。有効成分が造影剤である場合には、組成物はin vivoでGIT（あるいはGITの特定の輸送受容体）を造影するために投与することができる。その他の有効成分としては次のものが挙げられるが、それらに限定されない：任意の薬剤もしくは抗原、またはヒトもしくは動物の体内で生物学的応答を引き出すことのできる任意の薬剤もしくは抗原を負荷した、または薬剤もしくは抗原を被包したナノ粒子、ミクロ粒子、リポゾーム、もしくはミセル体。薬剤もしくは抗原を負荷した、または薬剤もしくは抗原を被包した製剤の例としては、有効成分が生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子などのナノ粒子もしくはミクロ粒子中に被包されたもしくは負荷したものであり、そのナノ粒子もしくはミクロ粒子の表面上にGIT輸送受容体結合タンパク質もしくはその誘導体もしくは類似体が、吸着され、コートされ、または直接連結するかもしくは連結部分を介して結合するなどで共有結合されたものである。さらに、そのタンパク質、誘導体、もしくは類似体はナノ粒子もしくはミクロ粒子それ自体を形成することができ、またはそのタンパク質、誘導体、もしくは類似体は生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子、または薬剤を負荷した、もしくは薬剤を被包したナノ粒子もしくはミクロ粒子の製造の際に用いられるポリマーまたは複数のポリマーに共有結合によって付着させることができ、またはペプチドを直接的に有効成分とコンジュゲートさせることができる。そのような有効成分とのコンジュゲーションとしては、融合タンパク質があり、その融合タンパク質を製するには、治療用ペプチドもしくはタンパク質をコードしている遺伝子もしくはcDNAに前記ペプチドをコードしているDNA配列をフレーム内で融合させ、改変された遺伝子が組換え融合タンパク質をコードするようにする。
好ましい実施形態においては、本発明は治療用化合物（ここでは「治療薬」と呼ぶ）投与による各種の疾患および障害の治療を提供する。そのような「治療薬」としては次のものが挙げられるがそれらに限定されない：GIT輸送受容体と結合するGIT輸送受容体結合タンパク質、およびその類似体および誘導体（断片を含む）（例えば上述のものなど）であって、疾病もしくは障害（好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトの疾病もしくは障害）の治療もしくは予防に有用な有効成分と結合したもの。治療薬としては、治療用もしくは予防用の有効成分と結合したGIT輸送受容体結合タンパク質、類似体、もしくは誘導体をコードする核酸も挙げられるがそれに限定されない。有効成分は好ましくは薬剤である。
治療もしくは予防される疾病もしくは障害の如何により、および薬剤が投与される被験者のタイプの如何により、当業界で知られているいかなる薬剤をも用いることができる。ここで用いられている「薬剤」という用語は、製薬上有効ないかなる成分をも包含し、限定されない。代表的な薬剤としては、ペプチドもしくはタンパク質、ホルモン、鎮痛剤、抗偏頭痛剤、抗凝固剤、制吐剤、心血管剤、抗高血圧剤、麻薬拮抗剤、キレート剤、抗狭心症剤、化学療法剤、鎮静剤、制癌剤、プロスタグランディン、および抗利尿剤が挙げられるがそれらに限定されない。典型的な薬剤としてはインシュリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子調節タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、ベータセロン、エリスロポエチン（EPO）、α、β、もしくはγインターフェロンなどのインターフェロン、ソマトロピン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インシュリン様成長因子（ソマトメジン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド、第VIII因子、インターロイキン-2などのインターロイキン、およびそれらの類似体などのペプチド、タンパク質もしくはホルモン；フェンタニール、スフェンタニール、ブトルファノール、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルヒネ、ヒドロモルホン、ヒドコドン、オキシモルホン、メサドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナク、ナプロキセン、パベリン、およびそれらの類似体などの鎮痛剤；ヘパリン、ヒルジン、およびそれらの類似体などの抗偏頭痛剤；スコポラミン、オンダンセトロン、ドンペリドン、エトクロプラミド、およびそれらの類似体などの抗凝固剤；ジルチアゼム、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビド5−モノ硝酸、有機硝酸、心臓障害に用いられる薬剤およびそれらの類似体などの心血管剤、抗高血圧剤および血管拡張剤；ベンゾジアゼピン、フェノチアジン、およびそれらの類似体などの鎮静剤；ナルトレキソン、ナロキソン、およびそれらの類似体などの麻薬拮抗剤；デフェロキサミンおよびその類似体などのキレート剤；デスモプレッシン、バソプレッシン、およびそれらの類似体などの抗利尿剤；ニトログリセリンおよびその類似体などの抗狭心症剤；5-フルオロウラシル、ブレオマイシン、およびそれらの類似体などの抗癌剤；プロスタグランディンおよびその類似体；ならびにビンクリスチンおよびその類似体などの化学療法剤が挙げられる。
代表的な薬剤としては、また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子、遺伝子補正ハイブリッドオリゴヌクレオチド（gene correcting hybrid oligonucleotide）、リボザイム、アプタマー性（aptameric）オリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、シグナル伝達経路阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびDNA改変剤なども挙げられるがそれらに限定されない。薬剤として用いることの出来るものとしてはまた、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイルスなどの治療用遺伝子送達のためのウイルス系、リポゾーム、陽イオン性脂質、デンドリマー（dendrimers）、および酵素などの遺伝子治療薬を含有する系をも含むがそれらに限定されない。例えば、そのターゲッティングペプチドを遺伝子送達ウイルスの表面上で発現させ、標的とする遺伝子送達ができるように改変することができる。
好ましい実施形態においては、治療薬はヒト患者に治療的にもしくは予防的に投与される。
追加説明および本発明に従って用いることのできる治療薬の出所については本明細書の各節に記載されている。
5.7 治療的/予防的投与、組成、および製剤
本発明は、本発明の治療薬の有効量を対象に投与することによる治療（および予防）方法を提供する。好ましい態様においては、治療薬は実質的に精製されたものである。対象は好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌその他が含まれるがそれらに限定されず、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
今後明らかとなるように、ある薬剤をin vivoに全身的に提供することもしくはin vivoでGITに薬剤をターゲットすること（本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質、その誘導体、類似体との結合によって）に応答するような疾病もしくは障害のいかなるものも、本発明の治療薬の投与によって治療もしくは予防することができる。そのような疾病としては高血圧、糖尿病、骨粗鬆症、血友病、貧血、癌、偏頭痛、および狭心症など、挙げたものは少数であるが、それらに限定されない。
当業界で知られているいかなる投与経路も用いることができ、それらには経口、経鼻、局所、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、くも膜下腔内、筋肉内などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは投与経路は経口である；そのような実施形態においては本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質、その誘導体もしくは類似体は、治療用有効成分のGIT管腔を経由しての全身循環への輸送が容易となるように有利に働く。
本発明はまた治療用組成物/製剤を提供する。本発明のある特定の実施形態においては、対象のGIT輸送受容体結合ペプチドまたはモチーフは、治療的もしくは予防的に有効な成分、好ましくは薬剤もしくは薬剤を含有するナノ粒子もしくはミクロ粒子と会合している。より好ましくは薬剤を被包している、もしくは薬剤を負荷した、生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子などのナノ粒子もしくはミクロ粒子であり、それらの粒子ではペプチドが物理的に吸着されているか、コートされているかあるいは直接連結しているかあるいは連結部分を介するなどで共有結合で結合されて、ナノ粒子もしくはミクロ粒子の表面上に結びつけられている。あるいはまた、ペプチドをナノ粒子もしくはミクロ粒子そのものとなるように形成させることもでき、または直接的に有効成分とコンジュゲートを形成させることもできる。そのようなコンジュゲーションとしては融合タンパク質があり、その融合タンパク質を製するには、治療用ペプチドもしくはタンパク質をコードしている遺伝子もしくはcDNAに前記ペプチドをコードしているDNA配列をフレーム内で融合させ、改変された遺伝子が組換え融合タンパク質をコードするようにし、その組換え融合タンパク質内では「ターゲッティング」ペプチドが治療用ペプチドもしくはタンパク質に融合されており、「ターゲッティング」ペプチドはその融合タンパク質のGITからの吸着を増加させる。好ましくは粒子のサイズは200-600nmの範囲である。
従って、ある特定の実施形態においては、GIT輸送受容体結合タンパク質は薬剤を含有させた徐放性（放出制御性）の仕組みのものと結合させることができる。ある特定の実施形態においてはポリマー性材料を用いることができる（放出制御の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）,LangerとWise編，CRC Pres.,Boca Raton,米国フロリダ州（1974）；制御された薬剤のバイオアベイラビリティー、薬剤製剤のデザインおよび性能（Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance）,SmolenとBall編，Wiley,米国ニューヨーク州（1984）；RangerとPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61（1983）を参照されたい；また、Levyら，Science 228:190（1985）；Duringら，Ann.Neurol.25:351（1989）；Howardら，J.Neurosurg.71:105（1989）をも参照されたい）。
本発明は、医薬組成物をも提供する。そのような組成物は治療上有効な量の治療薬および製薬上許容しうる担体を含んでなる。ある特定の実施形態においては、「製薬上許容しうる」という用語は連邦または州政府の薬事部署によって承認されている、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている動物、より特定すればヒトに用いるための薬局方に記載されているものをいう。「担体」という用語は溶剤、アジュバント、賦形剤、もしくはビヒクルであってそれとともに治療薬が投与されるものを意味する。そのような医薬担体には水や油などの無菌の液剤を用いることができ、その油としては石油に含まれるもの、動物、植物もしくは合成物を起源とするもので、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、および類似のものなどがある。医薬組成物が静脈内に投与される場合には水が好ましい担体である。食塩溶液、ブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用液として用いることができる。医薬賦形剤として適当なものとしてはデンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、および類似のものが挙げられる。所望により、組成物は少量の湿潤剤、乳化剤、もしくはpH緩衝剤を含有させることができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤、および類似のものの形態をとることができる。その組成物は、従来から用いられているトリグリセリドなどの結合剤および担体を用いて坐剤とすることができる。経口用製剤には医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含有させることができる。適当な医薬担体の例についてはE.W.Martin著の“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に述べられている。そのような組成物は、治療上有効な量の治療薬、好ましくは精製された形での治療薬を、適当な量の担体とともに含むことによって患者への投与に適した形態のものを提供することとなる。
本発明の治療薬は中性もしくは塩の形態とすることができる。製薬上許容される塩としては塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などと遊離アミノ基とで形成する塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどと遊離カルボキシル基とで形成される塩が挙げられる。
特定の障害もしくは病状の治療に有効であるような本発明の治療薬の量はその障害もしくは病状の性質によって変わるものであり、標準的な臨床手法によって定めることができる。さらに、in vitroアッセイ法も最適投与量の範囲を定めるために用いうる。ある製剤において使用すべき正確な量については投与経路、およびその疾病もしくは障害の重篤度によっても変わり、実施する医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
6. 実施例
6.1 GIT受容体ターゲットの選択
HPT1、hPEPT1、D2HおよびhSI受容体を、いくつかの判断基準に基づきGIT受容体ターゲットとしてクローニングするために選択した。その判断基準は：（1）消化管（GIT）の上皮細胞の表面に発現される；（2）小腸の長軸方向に沿って発現される（HPT1、hPEPT1、D2H）；（3）局所的に高濃度で発現する（hSI）；（4）大きな推定上の細胞外ドメインがGITの管腔に面している；および（5）ターゲッティング粒子によるアクセスおよび生物接着が容易となるような細胞外ドメインがあるということである。
ペプチドライブラリーでスクリーニングされた4種の組換え受容体部位はさらに次のような特徴を有する：

図1-4（それぞれ配列番号176,178,179,および181）はそれぞれ、hPEPT1、HPT1、hSI、およびD2Hの予測アミノ酸配列を示す。
6.2. 選択された受容体部位の細胞外ドメインのクローニング
下記の受容体ドメインをクローン化し、標準的な手法によりHis-タグ融合タンパク質として発現させた。
受容体 ドメイン（アミノ酸残基）
hPEPT1^a 391-571
HPT1^b 29-273
hSI^c 272-667
D2H^d 387-685
a Liangら，1995,J.Biol.Chem.270:6456-6463
b Dantzigら，1994,カドヘリンスーパーファミリー関連タンパク質と腸内ペプチド輸送との関連Association of Intestinal Peptide Transport with a Protein Related to the Cadherin Superfamily
c Chantretら，Biochem.J.285:915-923
d Bertranら，J.Biol.Chem.268:14842-14949
受容体タンパク質はHis-タグ融合タンパク質として発現させ、尿素もしくは塩酸グアニジンを用いた変性条件下でNi-NTAアガロースに対するpET His-タグ金属キレートアフィニティーを用いて精製した（Hochuli,E.,金属キレート吸着剤を用いた組換えタンパク質の精製（Purification of recombinant proteins with metal chelate adsorbent）,Genetic Engineering,Principals and Methods（J.K.Setlow編）,Plenum Press,米国ニューヨーク州,Vol.12（1990）,pp.87-98）。
6.3 ファージライブラリー
M13中でＮ末端pIII融合を発現しているDC8、D38、およびDC43の3種のファージライブラリーをGIT受容体に結合するペプチドを同定するために用いた。D38およびDC43ライブラリーは、それぞれ37と43のランダムなアミノ酸ドメインからできており、既に述べられている（McConnellら，1995,Molecular Diversity,1:165-176）。DC8ライブラリーは、ランダム挿入物がアミノ酸8個の長さで末端がそれぞれシステイン残基に隣接している（すなわちCX₈C）ことを除いては他の2種のライブラリーと類似している。
6.4 バイオパニング（Biopanning）
GIT受容体についてバイオパニングをほぼ標準的な方法（McConnellら，1995,Molecular Diversity,1:165-176）によって、DC8（1 X 10¹⁰pfu）、D38およびDC43（1X10¹¹pfu）ファージライブラリーの混合物を用いて3ラウンド行った。パニングの各ラウンド後、回収されたファージのパーセンテージを測定した。最初の2ラウンドのパニング後、溶出したファージを一晩増幅させた。3回目のパニングから得たファージをプレートから取り出し、100個のプラークを取り、一晩増幅させ、関連の受容体およびBSAとの結合をELISAでアッセイしてスクリーニングした。データの分析後、ELISAアッセイで高い吸収を示すおよび/またはBSAとの結合に比べてターゲットとの結合率の良いファージクローンを同定した。インシュリン分解酵素（IDE）および組換えヒト組織因子（hTF）を関係のない対照として用いた。標準的なパニング技法に下記に述べるいくつかの変更を加えて行った。選択またはパニング方法は、２つの方策のうちの1つに従って行った。第一の方策は混合したライブラリーを固体表面に吸着させた特定のGIT受容体上でパニングすることである。第二の方策はライブラリーをGIT受容体に対して2回パニングし、次いでCaco-2細胞（PetersonとMooseker,1992,J.Cell Science 102:581-600）に対してパニングするものである。選択方法はクローンの命名法に反映しており、それは下記のとおりである。
SはそのクローンがhS1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
DはそのクローンがD2H受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
PはそのクローンがPEPT1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
HはそのクローンがHPT-1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
Niと示されたファージは、標準的な方法にNi-NTA Agarose（Qiagen,Chatworth,米国カリフォルニア州）を加えた方法を用いたGIT受容体パンの固相バンドから得たものである。受容体をコートしたプレートを、160μlのNi-NTAアガロースを含有する0.5％ BSA/PBSでブロックし、50μlのNi-NTAアガロースの存在下でライブラリーをパニングした。受容体タンパク質はHis-タグ融合タンパク質として発現された。His-タグはNi-NTAアガロースに高いアフィニティーを有している。プレートをブロックし、Ni-NTAアガロースの存在下でパニングすることにより、ファージの組換え受容体のHis-タグ部分への結合を最小限にすることができる。
AXと示されたファージは酸及び第Ｘa因子で溶出させた。ファージはまず最初に標準的な酸溶出を行い、次いで第Ｘa因子（New England Biolabs,Beverly,米国マサチューセッツ州：300μlの20mM Tris-HCl,100mM NaCl,2mM CaCl₂の中に1μgのプロテアーゼ）をパニングプレートに添加し、2時間インキュベートした。2つの方法で溶出させたファージをプールし、次いでプレーティングした。
ABと示したファージは酸及び塩基で溶出させた。最初に標準的な酸溶出により、次いで100mMトリエチルアミン（pH12.1）をパニングプレートに添加して10分間ファージを溶出させた。2つの方法で溶出させたファージをプールし、次いでプレーティングした。
Cと示したファージは受容体上でパニングした後、Caco-2細胞によってパニングしたものである。第一および第二ラウンドのパニングは受容体上で行い、第三ラウンドのパニングはCaco-2細胞のsnapwell上で行った。2回のパニングをD2H受容体、第三のパニングをCaco-2細胞上で行うことによってDCX11,DCX8,およびDCX33を同定した。第3ラウンドの、Caco-2細胞からの第Ｘa因子による溶出物をD2H、BSAおよび固定Caco-2細胞上でELISAでスクリーニングを行った。HCA3については最初の2ラウンドのパニングはHPT-1受容体上で行い、第三のパニングはCaco-2細胞のsnapwell上で培養させた単層上で行った。
5PAXと示したファージは5ラウンドのパニングを行い、その後、ELISAスクリーニングの前に多数のファージの配列を調べた。
6.5 選択されたファージの配列決定
受容体ドメインおよび/またはCaco-2細胞に対する結合とバックグラウンドのBSAに対する結合との比率が良い比率であることが示されたファージ挿入物のアミノ酸配列を、ウイルスゲノム中の適切な領域のDNA鎖の双方の配列を調べて（Sequenase^▲Ｒ▼,U.S.Biochemical Corp.,Cleveland,米国オハイオ州）得られたヌクレオチド配列から推定した。第3ラウンドの酸溶出物をELISAでHPT-1、BSA、およびCaco-2固定細胞上でスクリーニングした。5PAXと示したファージは5ラウンドのパニングを行い、その後、ELISAスクリーニングの前に多数のファージの配列を調べた。
24ウエルのプレートの1つのウエルを10μg/mlのGIT受容体でコートし、そのプレートを一晩4℃でインキュベートした。そのプレートを0.5％ BSA-PBSで1時間ブロックした。DC8、D38、DC43ファージライブラリーの混合物をプレートに添加し、プレートを室温で回転機上で2-3時間インキュベートした。ウエルを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20をPBS中に含むもので10回洗い、ウエルを0.05mグリシン、pH2で溶出させた。次いでファージを0.2M NaPO₄で溶出させた。溶出したファージを寒天プレート上で力価を測定した。残りのファージは一晩増幅させた。翌日増幅させたファージを第二のコートしたプレートに添加し、パニング手順を上述のとおり繰り返した。2回目のパニングから溶出させたファージおよび1回目のパニングから増幅させたファージの力価を寒天プレート上で測定した。2回目のパニングから得たファージを一晩増幅させた後、パニング手順を上述のとおり繰り返した。3回目のパニングから溶出させたファージおよび2回目のパニングから増幅させたファージの力価を寒天プレート上で一晩測定した。単離したファージコロニーをELISAアッセイに用いる前に一晩増幅させた。
6.6 受容体ELISA操作法
96ウエルのプレートをGIT受容体、BSA、および任意でIDE（インシュリン分解酵素、無関係のHis-融合タンパク質）もしくはhTFを用いて、一晩コートした。プレートを0.5％ BSA-PBSで1時間ブロックした。清澄化した後、増幅したファージを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20を含むPBSで1:100に希釈し、プレートに添加した。回転機上で1-2時間プレートをインキュベートした後、プレートを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20を含むPBSで5回洗った。希釈した抗M13-HRPコンジュゲート（抗M13抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と連結したもの）をすべてのウエルに添加し、プレートを回転機上で1時間インキュベートした。プレートを上述のとおり5回洗った後、TMB基質をウエルに添加した。プレートの吸光度を650nmで読み取った。
受容体ELISAの結果：
下記はhSI受容体上でパニングされたファージの、hSIおよびBSAをコートしたマイクロタイタープレートへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表1はODの結果およびhSIとの結合のBSAとの結合との比を示している。

下記はD2H受容体上でパニングされたファージの、D2HおよびBSAをコートしたマイクロタイタープレートへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表2はODの結果およびD2Hとの結合のBSAとの結合との比を示している。

下記はD2H受容体上でのパニングを2ラウンド、次いで第3ラウンドのパニングをCaco-2 snapwell上で行ったファージの結合を評価したELISAアッセイの結果である。固定Caco-2細胞、D2HおよびBSAとの結合を調べた。表3はODの結果およびD2Hとの結合のBSAとの結合との比を示している。

下記はhPEPT1受容体上でパニングされたファージの、hPEPT1およびBSAへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表4はODの結果およびhPEPT1との結合のBSAとの結合との比を示している。

表5はHPT-1受容体上でパニングされたファージのHPT-1およびBSAへの結合を評価したELISAの結果を示している。この表はODの結果およびHPT-1との結合のBSAとの結合との比を示している。

表6はHPT-1受容体上でのパニングを2ラウンド、次いで第3ラウンドのパニングをCaco-2 snapwell上で行ったファージの結合を評価したELISAの結果を示している。固定Caco-2細胞、HPT-1、およびBSAへの結合を調べた。この表はODの結果およびHPT-1との結合のBSAとの結合との比を示している。

細胞ELISA操作法
ファージELISAは上述の方法に下記の変更を加えて用いた。希釈液および洗浄用バッファーは、1％ BSAおよび0.05％ Tween 20を含有するPBSを用い、プレートは各洗浄ステップで5回洗った。感染した細菌の培養液の上清を1:100に希釈し、タンパク質をコートしたプレートとともに2-3時間緩徐に動かしつつインキュベートした。抗M13西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート（Pharmacia,Piscataway,米国ニュージャージー州）は1:8000に希釈した。
固定Caco-2、C2BBel、およびA431細胞のプレートを組織培養処理マイクロタイタープレート上で細胞を増殖させることによって調製した。細胞がコンフルエントになった時に、プレートを10％ホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗い、0.5％BSA-PBSで−20℃で保存した。アッセイ当日に、融解したプレートを0.1％フェニルヒドラジンを含有するPBSで1時間37℃で処理し、次いでPBSで2回洗い、0.5％BSA-PBSで1時間ブロックした。この時点では標準的なELISA操作法に従って行った。
GIT受容体に特異性を示したファージをさらにELISAで種々の組換えタンパク質上で特徴を調べた。GIT受容体への特異性を示し続けたファージの配列を調べた。

ペプチドモチーフ
GIT受容体に結合するクローンのアミノ酸配列の比較により、いくつかの配列の類似性すなわち「モチーフ」が確認された。これらのモチーフはしばしば、標的への結合にとって重要な配列の一部となることがある。表９は、GIT結合ペプチド内で同定された配列類似性の領域または配列モチーフ（太字）を示す（対応する配列番号を表７に示す）。

Caco-2細胞へのファージの結合
予測されるGIT結合ペプチドインサートを発現するファージはまた、以下のように固定化Caco-2またはC2BBel細胞についてELISAにより測定した。細胞を培地100μlに１×10⁵細胞／ウェルで塗布し、30℃で５％二酸化炭素中で一晩インキュベートした。各ウェルに100μlの25％ホルムアルデヒドを15分間加えた。プレートを転倒してウェルの内容物を除去した。次にプレートをDPBSで３回洗浄した。各ウェルに0.1％フェニルヒドラジンDPBS溶液を加え、37℃で１時間インキュベートした。プレートを転倒して、３回洗浄した。プレートを0.5％BSA-DPBSで室温で１時間ブロックした。プレートを転倒して、１％BPT（１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS）で３回洗浄した。１％BPTで希釈したファージを、固定化細胞を含有するウェルに加えた。ファージを加えないウェルを使用して、HRP結合体のバックグランド結合を測定した。プレートを室温でローター上で２〜３時間インキュベートした。プレートを前記したように洗浄した。プレートを１％BPT中の希釈抗M13-HRP抗体で室温で１時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を加え、プレートの吸光度を650nmで読んだ。表10は、ペプチドをコードするファージの固定化Caco-2細胞への相対的結合を示す。

in vivoファージ選択：
GITに結合するかまたはGITを輸送することができるペプチドを発現するファージのさらなる選択は、以下のように行なった。精製ライブラリーをTBSまたはPBSのような緩衝液に再懸濁し、組織バリアーの片側（例えば、十二指腸、空腸、回腸、大腸または他のin vivoの動物部位）に、例えばクローズドループモデルまたはオープンループモデルを使用して導入した。注入後、組織バリアーを横断して存在する体液サンプル（例えば、門脈循環および／または全身性循環のサンプル）をあらかじめ決められた時点（例えば、０〜90分および／または２〜６時間またはそれ以上）で採取した。ファージの存在を確認するために、宿主（例えば、大腸菌（E.coli））を直接感染するのに、採取したサンプル（例えば、血液）のアリコートを使用した。残りのサンプルをインキュベート（例えば37℃で攪拌しながら大腸菌（E.coli）と一晩インキュベート）した。培養物中に存在する増幅したファージは個々に配列決定して、ファージによりコードされるペプチドの本体を決定するか、またはさらに濃縮が所望であればPEGを使用して沈殿させPBS中に再懸濁してもよい。次にPEGを使用してファージをさらに沈殿させるか、またはクローズドもしくはオープンGITループモデル系を使用して別の動物に投与するために直接使用することができる。門脈血または全身血サンプルを採取し、次にこのような循環系に輸送されたファージを増幅する。こうして、動物のGITにファージ表示ライブラリーを投与（所望であれば増幅したファージを繰り返し投与）すると、GITから動物の門脈および／または全身性循環に輸送されたファージの選択が可能になった。
所望であれば動物モデルの組織バリアー（例えば、GIT）へのファージ表示ライブラリーの投与後に、組織バリアーの対応する領域を上記方法の最後に回収することができる。この回収された組織を適当な緩衝液（例えばプロテアーゼインヒビターを含有するPBS）中で繰り返し洗浄して、例えばプロテアーゼインヒビターを含有するPBS中でホモジナイズすることができる。ホモジネートを使用して宿主（例えば大腸菌（E.coli））を感染させ、こうして組織バリアー（例えば、小腸組織）に強く結合するファージを増幅することができる。あるいは回収した組織を適当なPBS緩衝液中でホモジナイズし、繰り返し洗浄し、最終的組織ホモジネート中に存在するファージを大腸菌（E.coli）中で増幅することができる。このアプローチにより、組織バリアー（例えば、小腸組織）に強く結合するファージまたは組織バリアーの細胞（例えば、小腸組織の上皮細胞）中に取り込まれるファージの増幅（および以後の関連ペプチドが同定）が可能になる。この組織に結合するかまたは組織により取り込まれるファージの選択アプローチは繰り返すことができる。
ファージ表示集団による動物組織バリアーのin vivoの処理
精製したファージ表示ライブラリー（ランダムまたはあらかじめ選択された）を500μlのPBS緩衝液に希釈し、クローズド（またはオープン）小腸ループモデル（例えば、ラット、ウサギまたは他の種）中に注入した。時間０でおよび注入後の連続的時点に、門脈循環または全身性循環のサンプルを採取した。採取した血液のアリコートを大腸菌（E.coli）とともにインキュベートし、次にファージプラーク形成または形質導入単位のために、またはファージがテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性をコードするコロニーについて試験するために、プレートに塗布した。採取した血液サンプル（150μlまで）の残りを250μlの大腸菌（E.coli）および５mlのLB培地もしくは他の適当な増殖培地とインキュベートした。大腸菌（E.coli）培養物を、振盪台の上で37℃で一晩インキュベートした。他の時点（例えば、15分、30分、45分、60分、最大６時間）で採取した血液サンプルを同様に処理して、これらの時点で大腸菌（E.coli）中の門脈または全身性循環中に存在するファージが増幅された。増幅後、増幅ファージをPEG沈殿により回収し、PBS緩衝液またはTBS緩衝液中に再懸濁した。PEG沈殿前後の増幅ファージの力価を測定した。増幅したPEG沈殿したファージを、既知のファージ力価（一般的に10⁸〜10¹⁰ファージまたはプラーク形成単位（p.f.u.）／ml）まで希釈し、動物クローズド（またはオープン）ループモデルのGIT中に注入した。種々の時点で門脈および／または全身性循環から血液サンプルを採取し、血液サンプル中に輸送されたファージを、最初のサイクルについて前記したように大腸菌（E.coli）中で増幅した。次にファージをPEG沈殿し、再懸濁し、力価測定し、希釈し、動物クローズド（またはオープン）ループモデルのGIT中に注入した。このファージ注入の操作と以後の門脈および／または全身性血液サンプルの採取とこれらの血液サンプル中に輸送されるファージの増幅は、例えば10回まで繰り返すことができ、GITから門脈および／または全身性循環中に優先的に輸送されるファージを選択することができる。
6.7. 門脈および全身性循環へのラットルーメンからのファージの輸送
ランダムファージ表示ライブラリーからのファージならびに対照ファージを、ラット胃腸管のルーメン（in situのラットクローズドループモデル）中に注入した。全身性循環または門脈循環からの血液を経時的に採取し、循環中に輸送されたファージの数を、大腸菌（E.coli）の血液サンプルを力価測定することにより決定した。
この試験で使用されるファージ表示ライブラリーは、D38とDC43であり、ここでは第III遺伝子はそれぞれ38量体および43量体ペプチドをコードする。陰性対照として、第III遺伝子が「ランダム」ペプチド配列をコードしない同一のファージM13mp18を使用した。大腸菌（E.coli）からライブラリーファージD38とDC43の両方を調製し、一緒に混合し、PBSに対して透析し、PEG/NaClを使用して沈殿させ、PBS緩衝液に再懸濁した。M13mp18対照を同様に処理した。各ファージサンプルの力価を測定し、ほぼ同じ力価になるようにPBSで希釈した後ラットクローズドループモデル中に注入した。
全身性循環からのサンプリングのために、ウィスターラットの十二指腸の約15cmを縛って血行を止め（クローズドループモデル）、約0.5mlのファージ溶液をクローズドループ中に注入し、血液（0.4ml）を種々の時間に尾静脈からサンプリングした。使用した時点（分）は、０、15、30、45、60、90、120、180、240、および300分である。門脈循環からのサンプリングのために、門脈にカテーテルを挿入し、十二指腸の約15cmを縛って血行を止め（クローズドループモデル）、0.5mlのファージ溶液をクローズドループ中に注入し、血液を種々の時間に門脈カテーテルからサンプリングした。門脈サンプリングは微妙なため、サンプリング時間は可能な場合15、30、45および60分に限定した。各動物中に注入されたファージの容量は以下の通りである：
動物（15） 注入されたファージの容量
R1-R3 0.50ml
R4 0.43ml
R5-R15 0.45ml
各動物に注入された容量の差を補正するために（標準容量として0.5mlを使用して）、輸送されたファージの予測される数を調整した。
全身性循環中への輸送を調べるために、動物R1、R2、およびR3に対照ファージM13mp18を投与し、動物R4、R5、R6、およびR7には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。門脈循環への輸送を試験するために、動物R8、R9、およびR10に対照ファージM13mp18を投与し、動物R11、R12、R13、およびR14には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。動物R4〜R7（表11を参照）からの１日目に全身性循環から採取し、大腸菌（E.coli）で増幅し、PEG沈殿させ、PBSに再懸濁したファージサンプルを組合せたものを、動物R15*に投与した。以後の分析において、このファージの力価は、動物R8〜R14について使用した他のファージサンプルより100倍以上高いことがわかった。従って動物R15*について提示したデータを下げて補正した。
各モデル系で各時点に約0.4mlの血液を採取した。採取した血液（全身性）30μlを100μlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと混合し、37℃で30分インキュベートし、LBプレート上でTop Agaroseを使用してプラーク形成させるために塗布した。種々の陰性対照を力価測定実験に含めた。翌日プラーク形成単位数を測定した。同様に30μlの採取血液（門脈）とその連続希釈物（1:100、1:1000）を、100μlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと混合し、37℃で30分インキュベートし、LBプレート上でTop Agaroseを使用してプラーク形成させるために塗布した。翌日プラーク形成単位数を測定した。
さらに各時点で採取した血液（全身性および門脈）の約300μlを５mlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと、５mM MgCl₂/MgSO₄を含有する修飾増殖培地中で37Cで一晩攪拌（ファージ増幅を可能にするため）しながらインキュベートした。サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを捨てた。ファージ上清のサンプルを採取し、TBS緩衝液で連続的に希釈（10^-2、10^-4、10^-6、10^-8）し、塗布してプラークについて調べ、増幅ファージサンプル中に存在するプラーク形成単位数を測定した。
さらに試験動物R4〜R7から得られた「増幅した」上清（各時点からのサンプルを使用した）からファージのアリコートを取り、一緒にし、PEGを使用して２時間沈殿させた。沈殿したファージをPBS緩衝液中に再懸濁し、動物R15*のクローズドループモデル中に注入し、次に門脈サンプリングを行なった。
クローズドループモデルから全身性循環中に輸送されるファージの数を、下記表11に示す。クローズドループモデルから門脈循環中に輸送されるファージの数を、下記表12に示す。これらの数は、ファージ投入量の差および容量投入量の差について補正されている。門脈サンプル中には全身性サンプル中に存在するファージより多くのファージが存在し、全身性循環中での肝性もしくはRESクリアランスおよび／またはファージ不安定性を示していることは明らかである。さらにGITから門脈循環へのファージの取り込みは非常に迅速であり、多数のファージが15分以内に検出される。門脈サンプリング実験からの結果はまた、D38/DC43ライブラリーからのファージの取り込み速度は、対照ファージより速いことを示している。すなわちGITから門脈循環への、ランダムペプチド配列をコードするファージの優先的取り込みがあるかも知れない。動物R13、R14、およびR15*の場合、限られた時間枠（それぞれ、30、45および15分）以内に力価測定された血液サンプル中に輸送されるファージの％は、それぞれ0.13％、1.1％、および0.013％と推定された。

動物R1、R2、およびR3には対照ファージM13mp18を投与した。
動物R4、R5、R6、およびR7には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。

動物R8、R9、およびR10には対照ファージM13mp18を投与した。
動物R11、R12、R13、およびR14には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。
動物R15*には、１日目に動物R4〜R7（表11を参照）からの全身性循環からサンプリングし、次にPEG沈殿させPBS中に懸濁した、組合せファージサンプルを投与した。次に分析すると、このファージの力価は動物R8〜R14について使用した他のファージサンプルより100倍高かった。すなわち動物R15*の門脈循環中へのファージの輸送を測定したデータは下げて調整した。
これらの試験は、大腸菌（E.coli）中で血液に輸送されたファージを力価測定することにより証明されるように、対照ファージとD38/DC43ファージともにGITのルーメンから門脈循環および全身性循環に経時的に輸送されることを示した。対応する対照ファージサンプルより多くのファージが試験ファージサンプルから門脈循環に輸送された。さらに門脈循環への試験ファージの輸送速度は、対照ファージのそれより速いようであった。異なる動物（R4〜R7）の全身性循環中に現れたD38/DC43ライブラリーからのファージをプールし、大腸菌（E.coli）中で増幅し、沈殿させ、GITのルーメンに再適用し、次に門脈循環中で採取し、大腸菌（E.coli）中で力価測定した。これらの選択されたファージはまた、GITのルーメンから門脈循環中に輸送された。このin situループモデルは、GITから循環中へのファージと粒子の輸送を促進するペプチド配列を同定するための魅力的なスクリーニングモデルであるかも知れない。
このスクリーニングモデル系を使用して、現在多くのあらかじめ選択されたファージライブラリーが存在し、例えば動物R4〜R7からのワンパス全身性ファージライブラリー、動物R11〜R14からのワンパス門脈ライブラリー、および動物R15*からのツーパスの迅速輸送全身性−門脈ファージライブラリーSP-2がある。
6.8. 門脈循環および全身性循環へのラットルーメンからのあらかじめ選択されたファージライブラリーのファージの輸送
GIT中のHPT1、HPEPT1、D2H、およびhSI受容体または結合部位を使用してランダムファージ表示ライブラリーD38とDC43をスクリーニングしてあらかじめ選択したファージをプールすることにより、４つのあらかじめ選択されたファージライブラリーGI-D2H、GI-hSI、GI-HPT1およびGI-hPEPT1を作製した。ファージプール、あらかじめ選択されたファージライブラリーを表13に示す。PAX2、HAX1、HAX5、HAX6、HAX10、H10およびHAX44についての配列は同じであることに注意されたい。またHAX40の配列はH44の配列と同じである。対応する配列番号を表７に示す。

本明細書で前記した方法と同様に、３つのあらかじめ選択されたファージライブラリーを陰性対照ファージM13mp18とともに、ラットクローズドループモデル（あらかじめ選択したファージライブラリーについて６匹の動物）に注入し、門脈静脈を介して門脈循環から経時的に血液を採取し、実験の最後に尾静脈から全身の血液サンプルを採取し、クローズドループからの小腸組織領域を採取した。
特にGIT中に存在する各受容体または結合部位に対してin vitroで選択されたファージを大腸菌（E.coli）中で増幅させ、PEG沈殿させ、TBSに再懸濁し、前記のように大腸菌（E.coli）中でプラークを形成させることにより各ファージサンプルの力価を測定した。次に各受容体部位について同数の各ファージ（８×10⁸ファージ）を、陰性対照ファージM13mp18とともにあらかじめ選択されたファージライブラリー中にプールし、各あらかじめ選択したファージライブラリーを、ライブラリー当たり６匹のウィスターラットに投与した（ラット１〜６；GI-D2H、ラット７〜12；GI-hSI、ラット13〜18；GI-hPEPT1、およびラット19〜24；GI-HPT1）。前記のin situループモデルを使用して、0.5mlのあらかじめ選択したファージライブラリー溶液を、十二指腸／空腸の縛った部分に注入した。門脈静脈から０、15、30、45および60分に、血液をヘパリン化チューブ中に加えた。実験の最後に全身性循環から血液サンプルを取った。同様にファージ注入のために使用した十二指腸／空腸の部分を取った。
採取した門脈血（希釈なし、10^-2、10^-4、10^-6希釈）30μlを、30μlの大腸菌（E.coli）K91Kan細胞（一晩培養物）に添加し、37℃で10分インキュベートした。次に３mlのtopアガロースを加え、サンプルを塗布してプラークを形成させた。採取した門脈血液100μlを100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加えた。次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中でサンプルを37℃で一晩インキュベートした。遠心分離して大腸菌（E.coli）を除去し、増幅したファージ上清サンプルを直接力価測定したか、またはPEG沈殿させ、TBSに再懸濁し力価測定した。増幅したファージの力価測定後に、各セットの動物からのファージを含有するサンプルを合わせ、各サンプルの力価を同じ力価に調整し、LB寒天プレート（22cm²平方プレート）上でプラークを形成させるために塗布した。12,000または24,000ファージをプラーク形成のために塗布した。
採取した全身血液（希釈なし、10^-2、10^-4、10^-6希釈）30μlを、大腸菌（E.coli）K91Kan細胞に添加し、37℃で10分インキュベートした。次に３mlのトップ（top）アガロースを加え、サンプルを塗布してプラークを形成させた。採取した全身血液100μlを100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加え、37℃で10分インキュベートした。次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中でサンプルを37℃で一晩インキュベートした。遠心分離して大腸菌（E.coli）を除去し、増幅したファージ上清サンプルを直接力価測定したか、またはPEG沈殿させ、TBSに再懸濁して力価測定した。増幅したファージの力価測定後に、各セットの動物からのファージを含有するサンプルを合わせ、各サンプルの力価を同じ力価に調整し、LB寒天プレート（22cm²平方プレート）上でプラークを形成させるために塗布した。12,000または24,000ファージをプラーク形成のために塗布した。
各クローズドループ中で使用した小腸組織部分を切り出した。組織を小片に切り、次にプロテアーゼインヒビターを含有する無菌PBS中で３回洗浄し、Ultra thorexホモジナイザーでホモジナイズした（Int-Dサンプル）。あるいは組織（プロテアーゼインヒビターを補足したPBS中）をUltra Thorexホモジナイザーでホモジナイズし、プロテアーゼインヒビターを含有するPBS中で３回洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含有するPBS中に再懸濁した（Int-Gサンプル）。各場合に組織ホモジネートの連続希釈物（希釈なし、10^-2、10^-4、10^-6希釈）を大腸菌（E.coli）中で力価測定した。さらに組織ホモジネートのアリコート（100μl）を100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加え、37℃で10分インキュベートし、次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中で37℃で一晩インキュベートした。
門脈血液、全身血液、および小腸組織から増幅したファージを、プラーク形成させるために塗布した。プラークをHybond-N Nylonフィルターに移し、変性（1.5Ｍ NaCl、0.5Ｍ NaOH）させ、中和（0.5Ｍトリス−塩酸、pH7.4、1.5Ｍ NaCl）し、２×SSC緩衝液中で洗浄した。フィルターを空気乾燥し、DNAをフィルターに架橋させた（UV架橋：２分、高の設定）。フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（６×SSC、５×デンハルト溶液、0.1％SDS、20μg/ml酵母tRNA）中で40℃〜45℃で少なくとも60分インキュベートした。
あらかじめ選択したファージライブラリーを作成するために使用した受容体または結合部位をコードする領域に相補的な合成オリゴヌクレオチド（22量体）を合成した（以下の表14を参照）。

オリゴヌクレオチド（５pmol）を³²P-ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼで5’末端標識し、約2.5pmolの標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション試験に使用した。ハイブリダイゼーションは40〜45℃で６×SSC、５×デンハルト溶液、0.1％SDS、20μg/ml酵母tRNAおよび放射能標識合成オリゴヌクレオチドを含有する緩衝液中で一晩行ない、次に以下の緩衝液で洗浄した（40〜45℃で20〜30分）：（i）２×SSC／0.1％SDS、（ii）１×SSC／0.1％SDS、（iii）0.1×SSC／0.1％SDS。フィルターを空気乾燥し、オートラジオグラフィーのために15時間、24時間、または72時間感光させた。
ハイブリダイゼーションデータは、すべてのオリゴヌクレオチドプローブが、明らかに標識されなかったHAX9プローブを除いて、そのファージ標的に特異的に結合することを示した。M13mp18 DNAのみにハイブリダイズした陰性対照プローブは、試験したすべてのサンプル中で弱〜負のシグナルを示した（データは示していない）。
各受容体群のラットからのプールのハイブリダイゼーションデータをまとめた。表15、16、17および18は、HSI、D2H、HPT1、およびhPEPT1受容体群の代表的オートラジオグラフィーシグナルの編集を示す。これらの表は、クローズドループGITモデルから門脈および全身性循環へのファージ吸収と取り込み、および小腸組織へのファージ吸収／インターナリゼーションを示す。これらの表において、Int-Gは、洗浄と回収の前にホモジナイズされた小腸組織を示し、Int-Dはホモジナイゼーションとファージ回収前に洗浄した小腸組織を示す。すべての場合で、２匹以上の動物に主要なファージ候補が存在した。

HAX9に対する合成オリゴヌクレオチドとは別に、対応するファージ標的へのハイブリダイゼーションにより測定されるように、すべてのオリゴヌクレオチドはまず放射能標識されていることを確認した（例えば、ファージS15はオリゴヌクレオチドS15にハイブリダイズした）。さらに使用した実験条件下で、これらのオリゴヌクレオチドは基本的に陰性対照ファージ鋳型M13mp18にハイブリダイズしなかった。ファージM13mp18に２つのオリゴヌクレオチドを合成した：（1）M13mp18と各GIT受容体またはGIT結合部位選択ファージの両方の保存された配列とハイブリダイズする陽性オリゴヌクレオチド［M13（陽性）と呼ぶ］；および（2）ファージM13mp18の複数のクローニング部位にユニークな配列とのみハイブリダイズし、GIT受容体またはGIT結合部位選択ファージのいずれにもハイブリダイズしない陰性オリゴヌクレオチド。
ファージのhSIプールの場合、クローズドループモデルから門脈循環に４つのファージ（ファージS15、SNi-10、SNi-34およびSNi-38）のみが輸送された。他のファージ（S21、S22、SNi-28、SNi-45、SNiAX-2、SNiAX-6およびSNiAX-8）はGITから門脈循環中に輸送されなかった。さらにファージSNi-10、および程度は少し小さいがファージS15とS22は、小腸サンプルまたは画分中に見つかり、他のファージは見つからなかった。Int-Gサンプル中にはファージM13mp18がほんのわずか（<0.1％）存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのD2Hプールの場合は、GITクローズドループモデルから門脈循環にファージが輸送されるランク順位があり、ファージDCX11とDAB10が優先的に輸送され、次にファージDCX8、DAB30、DAB3およびDAB7が輸送された。このプールからの多くのファージは門脈循環中に輸送されなかった（ファージDAB18、DAB24、DAX15、DAX24、DAX27、DCX26、DCX36、DXC39、DCX42、DCX45を含む）。GITから門脈循環への非常に低レベルのファージDAX23の輸送がある。同様に一部のファージのみが小腸サンプルまたは画分中にみつかった（ファージDAB30、DCX33、DAB7、DCX11、DCX45を含有し、はるかに弱い程度にファージDAB3、DAB10、DCX8、DCX39、DCX42を含む）。あるファージは小腸サンプル中に見つからなかった（ファージDAB18、DAB24、DAX15、DAX24、DCX26、およびDCX36を含む）。Int-Gサンプル中にはファージM13mp18がほんのわずか（<0.1％）存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのHPT1プールの場合は、GITクローズドループモデルから門脈または全身性循環にファージが輸送されるランク順位があった。ファージPAX2（これはこのプール中の他のファージに対して４×濃度で使用された）次にファージHAX42が門脈および全身性循環中に見つかり、ファージh40は全身性循環のみに見つかった。このプール中のいずれのファージも小腸サンプルまたは画分中に見つからなかった。ファージM13mp18は小腸画分または全身性循環中には見つからず、門脈循環中にはほんのわずか（<0.001％）に存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈および／または全身性循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのhPEPT1プールの場合は、このプールにファージPAX2とH40も含めた。このプールから多くのファージが門脈循環中に見つかった（ファージP31（配列番号43）、PAX46、PAX9、H40、PAX17、PAX40、PAX2、PAX14、5PAX3および5PAX12を含む）。門脈血液中には多くのファージは見つからなかった（陰性対照ファージM13mp18、PAX15、PAX16、PAX18、PAX35、PAX38、PAX43、PAX45、P90、5PAX5および5PAX7を含む）。全身性循環中に見つかったファージはファージ5PAX5とP31（配列番号43）のみであった。さらに小腸への一部のファージの優先的結合があった（ファージ5PAX12、5PAX7、5PAX3、H40、P31（配列番号43）、PAX9、およびより程度は小さいがPAX38とPAX15を含む）。あるファージは小腸サンプル中には見つからなかった（陰性対照ファージM13mp18、およびファージPAX2、PAX14、PAX16、PAX18、PAX35、PAX45、PAX46、P90および5PAX5を含む）。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈および／または全身性循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
選択配列のさらなる性状解析
ファージ表示ライブラリーを用いて胃腸管組織の４つの組換え受容体部位（hPEPT1、HPT1、D2H、hSI）の最初のスクリーニング後、陰性対照タンパク質であるBSAタンパク質および組換えタンパク質である組換えヒト組織因子（hTF）（これは胃腸管組織の組換え受容体のように、そのアミノ末端にポリヒスチジン標識を含有した）と比較して、各標的受容体部位に優先的結合を示した一連のファージを単離した。以後の実験で各標的受容体部位に結合する選択ファージの同じ力価を一緒にして１つのプールとした（すなわち、HPT1結合ファージの１つのプール、hPEPT1結合ファージの１つのプール、D2H結合ファージの１つのプール、およびhSI結合ファージの１つのプール）。各プールは、等しい力価の陰性対照ファージM13mp18で補足された。これらのファージプールを、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループ領域に注入し、次に、小腸組織に結合および保持されたおよび／または小腸ループから門脈および／または全身性循環に吸収されたファージを採取し回収した。さらに標的組換え受容体部位に結合する初期のファージの選択を、固定化Caco-2細胞への結合および／または固定化C2BBel細胞への結合について分析した。最終的リードペプチド配列の選択は、（1）陰性対照タンパク質BSAおよび／またはhTFsに対するその結合よりも、in vitroで標的組換え受容体部位に結合する、（2）陰性対照ファージM13mp18よりも、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループへの注入後にラット小腸組織に結合する、（3）陰性対照ファージM13mp18よりも、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループへの注入後に、ラット小腸組織から門脈および／または全身性循環に吸収される、および（4）陰性対照ファージM13mp18よりも、ファージ結合試験において固定化Caco-2細胞または固定化C2BBel細胞に結合する、ペプチド配列をコードするファージの能力を基礎にした。また化学合成の容易さを考慮してペプチドを選択した。
6.9. GIT標的ペプチドのGST融合タンパク質
GI標的ペプチドのGST融合タンパク質の作製
GI標的ペプチドの融合タンパク質をコードするグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）ベクターを、ベクターpGEX4T-2（供給源、Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）中で作製した。簡単に説明すると、目的のクローンから１本鎖DNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。増幅したDNAを次に、制限酵素XhoIとNotIで切断し、次にSalI／NotI切断したpGEX4T-2中に連結した。形質転換後、各構築物のDNA配列を配列決定により証明した。
次に、挿入配列が45塩基対より小さいGST融合タンパク質の末端切断型の構築のために、付着SalIとNotI末端を含有し目的の配列をコードする重複オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次に直接SalI／NotI切断したpGEX4T-2中に連結した。形質転換後、各構築物のDNA配列を配列決定により証明した。
合成された種々のGST融合タンパク質構築物の模式図を図5A〜5Cに示す。
GST融合タンパク質の発現と精製
GST融合タンパク質構築物を含有する大腸菌（Escherichia coli）BL21細胞を、100μg/mlアンピシリン（2X YT/amp）を含有する2X YT培地中で一晩増殖させた。一晩培養物を2X YTブロス（100ml）で1:100希釈し、細胞をＡ₆₀₀が0.5になるまで30℃で増殖させ、１mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導し、さらに３時間増殖させた。遠心分離して細胞を採取し、プロテイナーゼインヒビター（Boehringer/Mannheim）の混合物を含有するPBS５ml中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理し、細胞溶解物を12,000×ｇで４℃で10分遠心分離した。上清画分をグルタチオン−セファロース（登録商標）4Bの50％スラリー２mlと室温で30分反応させ、1.5mlのPBSで３回洗浄（室温で）し、結合したGST融合タンパク質を、３×１mlの10mM還元グルタチオネイン50mMトリス塩酸（pH8.0）で室温で10分反応させて溶出した。タンパク質をBio-Radプロテインアッセイで定量し、次にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により性状解析した。
GST融合ペプチドのELISA
標準的ELISA法を以下のように修飾した。GSTタンパク質を、１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS（１％BPT）中で適当な濃度に希釈し、力価測定し、室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、抗GSTモノクローナル抗体（Sigma、セントルイス、クローンGST-2、１％BPT中で1:10,000に希釈）を加え、１時間インキュベートした。さらに５回洗浄後、ヤギ抗マウスIgG2b-HRPを加え（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL、１％BPT中で1:4,000に希釈）、１時間インキュベートした。５回洗浄後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で発色させた。すべてのデータはバックグランド結合を引いて示す。
図６は、hSI受容体と固定化C2BBel細胞へのGST-SNi10、GST-SNi34およびGST単独の結合を示す。
選択されたGITターゲティングペプチドのGST融合タンパク質
結果は、GST対照結合と比較して、GST-DXB8、GST-PAX2、GST-P31、GST-SNi10およびGST-SNi34が固定化Caco-2またはC2BBel細胞（図７と８）に結合することを示す。GST-HAX42、GST-5PAX5はすべて、GST対照に比較して弱〜中程度の結合を示した。
興味深いことにP31末端切断型103-GST融合タンパク質はほとんど完全長P31（配列番号43）のように、固定化Caco-2細胞に結合した（Ａ）。これは、P31配列（配列番号43）の結合に関与する部分がこの部分にあることを示唆する。PAX2.107は完全長PAX2と同様に結合した。従ってこの部分は、結合に関与するアミノ酸配列を含有する可能性が最も高い（Ｂ）。予備アッセイにおいて、DCX8末端切断型のいずれも完全長DCX8と同様にCaco-2細胞には結合せず、結合領域はこれらの部分の２つ以上にわたっていることを示唆している。
合成ペプチドによる結合の阻害
固定化C2BBel細胞へのGST-P31の結合
標準的ELISA法を以下のように修飾した。GST融合タンパク質とペプチドを、１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS中で適当な濃度に希釈した。ペプチドを力価測定し、力価測定したペプチドに一定濃度の希釈GSTタンパク質を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、抗GSTモノクローナル抗体（Sigma、セントルイス、クローンGST-2、１％BPT中で1:10,000に希釈）を加え、１時間インキュベートした。さらに５回洗浄後、ヤギ抗マウスIgG2b-HRPを加え（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL、１％BPT中で1:4,000に希釈）、１時間インキュベートした。５回洗浄後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で発色させた。すべてのデータはバックグランド結合を引いて示す。
図９Ａと９Ｂは、C2BBel固定化細胞へのGST-P31の結合の阻害を示す。ペプチド競合物質は、P31（配列番号43）のダンシル化ペプチドであるZElan024、およびP31（配列番号43）の末端切断型ダンシル化物であるZElan044、ZElan049、およびZElan050である。データは、O.D.対ペプチド濃度、およびGST-P31結合の阻害パーセント対ペプチド濃度として示す。競合のないGST-P31結合を100％結合と見なした。IC₅₀値は、阻害パーセントグラフ上の50％線を使用する推定値である。
GST-P31とGST-PAX2は、競合アッセイで使用した0.5μg/ml濃度でZElan024（P31）（配列番号43）とZElan018（PAX2）に対して交差反応結合を示さなかった。GST-HAX42は、競合アッセイで使用した0.5μg/ml濃度でZElan018（PAX2）とZElan021（HAX42）に対して交差反応結合を示した。
図10A〜10Cは、固定化C2BBel細胞上のGST-P31、GST-PAX2、GST-SNi10およびGST-HAX42対種々のダンシル化ペプチドの競合ELISAにより作成したデータのまとめである。IC₅₀値はμMで示し、複数のアッセイで決定した範囲を含む。GST/C2BBel欄は、固定化C2BBel細胞へのGSTタンパク質の結合の要約である。
固定化Caco-2細胞への結合
Caco-2細胞を固定化し、フェニルヒドラジンで処理し、前記したようにブロックした。合成ペプチド（100μg/ml）を二重測定でCaco-2細胞に適用し、96ウェルプレートに沿って連続的に希釈した。対応するGST−ペプチド融合タンパク質（10μg）を各ウェルに加え、プレートを攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。細胞へのGST−ペプチド融合タンパク質の結合を、上記ELISA法を使用して測定した。GST−P31結合は、ZElan024、ZElan028およびZElan031ならびに２つのＤ型であるZElan053とZElan054により阻害された。GST-PAX2結合は、ZElan032、ZElan033、およびZElan035により阻害された。GST-HAX42結合は、ZElan021（完全長HAX42）により阻害されなかったが、ZElan018（PAX2）とZElan026およびZElan038（混合PAX2ペプチド）により阻害された。
生きたCaco-2細胞へのGST−ペプチド融合体の輸送と取り込み
HBSS緩衝液中で４hrかけて培養して分極化（polarized）したCaco-2単層を介するGST−ペプチド融合体および欠失誘導体の輸送と取り込みを、抗GST ELISA測定法を使用して調べた。別の実験で、GST−ペプチド融合体および無血清培地（SFM）中で24hrかけて培養した分極化Caco-2単層を介する欠失誘導体の輸送と取り込みを、抗GST ELISA測定法を使用して調べた。
材料
緩衝化ハンクス平衡塩類溶液（bHBSS）＝0.011Ｍグルコース（１g/l）、25mMヘペス（15mMの酸（3.575g/l；Sigma CN.H3375）；10mM塩基（2.603g/l；Sigma CN.H1016）］を補足した１×HBSS（Gibco CN.14065-031）。
クロロキン：10mM水溶液として作成した［Sigma CN C6628］
溶解緩衝液：30mMトリス−塩酸（pH8.0）；１mM EDTA
無血清培地（SFM）は血清を含まない普通の培地である。
方法
a）4時間HBSS試験：スナップウェル上で増殖させたCaco-2単層（継代33；23日令）を介する経上皮電気フラックス（TER）を測定して、単層の完全性を確認した後実験を開始した。培地を除去し、細胞をbHBSSで１回洗浄した。100μMクロロキンを含有するbHBSSを加え、細胞を37℃で２時間インキュベートした。bHBSS＋クロロキンをGST−ペプチド融合体（100μg/ml）を含有する0.5ml bHBSSで交換し、細胞を前記したようにインキュベートした。以下の時間に側底側（basolateral）のサンプルを取った：０、0.5時間、２時間、および４時間。４時間日にTERを測定し、頂端側（apical）の培地をサンプリングし、頂端側のリザーバーをHBSSで６回洗浄した。細胞を氷上で溶解緩衝液中で１時間溶解させ、次に溶解サンプルを採取した。すべてのサンプルを、抗GST ELISAで測定するまで−70℃で保存した。分析の前に、BioRadプロテインアッセイを使用してサンプルを互いにタンパク質含量について標準化した。
ｂ）24時間SFM試験：スナップウェル上で増殖させたCaco-2単層（継代33；23日令）を介する経上皮電気フラックス（TER）を測定して、単層の完全性を確認した後実験を開始した。培地を除去し、細胞をSFMで１回洗浄した。GST−ペプチド融合体（100μg/ml）を含有するSFMを細胞に加え、これを５％二酸化炭素で37℃で24時間インキュベートした。24時間後、TER読み値を取り、側底側および頂端側のリザーバーからサンプルを取った。頂端側のリザーバーをPBSで６回洗浄した。細胞を氷上で溶解緩衝液中で１時間溶解させ、次に溶解サンプルを採取した。すべてのサンプルを、抗GST ELISAで測定するまで−70℃で保存した。分析の前に、BioRadプロテインアッセイを使用してサンプルを互いにタンパク質含量について標準化した。
結果
試験したすべてのGST−ペプチド融合体と対照は、生きたCaco-2単層を介して輸送された。完全長GST-P31とGST-DCX8（しかしこれらの分子の末端切断型は含まない）はGST単独より高いフラックスを有した。
極性化Caco-2細胞へのGST−ペプチド融合体のインターナリゼーションを、２つの実験で調べた。実験１では、15μgのGST−ペプチド融合体をbHBSSで適用し、インターナライズされたGST−ペプチドを、細胞を４時間溶解することにより回収した。実験２では、10μgのGST−ペプチドを、ａ）bHBSS（４時間後に回収された溶解物）、またはｂ）無血清培地（24時間後に回収された溶解物）中で適用した。
図11Aは、極性化したCaco-2単層を介するGST−ペプチドの完全な輸送を説明し、必ずしもインターナリゼーションではなく、すなわちスナップウェルの側底側リザーバーからGST−ペプチドが回収されたが、タンパク質は傍細胞の経路によりバリアを横断した可能性があることを示す。
GSTペプチド融合物の固定化Caco-2細胞への結合におけるトロンビン切断の効果
完全なGSTペプチド融合物とトロンビン切断GSTペプチド融合物の固定化Caco-2細胞への結合を比較した。完全な融合物に対しトロンビン切断GSTペプチド融合物の結合が低下したことにより、GSTドメインではなく融合物のペプチド成分が結合に介在することが示される。
方法
PBS中の0.1%BSAでブロッキングする前に、96-ウェルプレート（p38）中で増殖させたCaco-2密集単層を固定化し、0.1%フェニルヒドラジンで処理した。各GSTペプチド30μgを20mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,2.5mM CaCl₂中、室温で18時間、ウシトロンビン（1μ/ml;0.4 NIH単位;Sigma CN.T9681）で処理した。対照はトロンビンを添加せずに同様に処理した。各GSTペプチド融合物10μgをPAGE解析用に取り出し、5倍連続希釈（1%BPT希釈液）の前に、融合物10μgを２連で固定化Caco-2細胞へ添加した。この融合物を室温で1時間結合させた。1%BPTで6回洗浄した後、結合をELISAによりアッセイした。
結果
結果を図12に示す。
結論:
PAGE解析により、トロンビンがGSTペプチド融合物を効果的に切断することが確認された。トロンビンによる切断により、GST-P31.103、GST-PAX2.106、GST-DCX8、GST-SNi10の固定化Caco-2細胞への結合の検出が有意に減少し、GSTドメインではなくペプチド成分が結合を媒介することが示される。
6.10.ペプチドの合成
6.10.1.固相合成法
ペプチドは当該技術分野で公知の方法により調製してよい。例えば簡潔に記載すると、固相ペプチド合成は、C末端アミノ酸のカルボキシル基の樹脂への結合およびN-α保護アミノ酸の連続的な付加からなる。保護基は当該技術分野で公知のいずれのものであってもよい。各々の新しいアミノ酸を生長鎖（growing chain）に付加する前に、鎖へ付加した前記アミノ酸の保護基を除去する。アミノ酸の適当な樹脂への結合については、Rivierら、米国特許第4,244,946号により記載される。かかる固相合成については、例えばMerrifield,1964,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Valeら，1981,Science 213:1394-1397;Markiら，1981,J.Am.Chem.Soc.103:3178および米国特許第4,305,872号および同第4,316,891号により記載されている。好ましい態様では、自動ペプチドシンセサイザーを使用する。
限定されるものでないが例示すれば、ペプチドはABIにより提供される“Fastmoc”合成プロトコールを用い、Applied Biosystems社（“ABI”）モデル431A自動ペプチドシンセサイザーで合成可能であり、これはカップリング剤として、2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（“HBTU”）（R.Knorrら，1989,Tet.Lett.,30:1927）を使用する。この合成は市販の4-（2’,4’-ジメトキシフェニル-（9-フルオレニル-メトキシカルボニル）-アミノメチル）-フェノキシポリスチレン樹脂（Advanced ChemTechからの“Rink resin”）（H.Rink,1987,Tet.Lett.28:3787）0.25mmolで行うことができる。Fmocアミノ酸（1mmol）はFastmocプロトコールに従って結合させる。以下の側鎖保護Fmocアミノ酸誘導体：
FmocArg（Pmc）OH;FmocAsn（Mbh）OH;FmocAsp（^tBu）OH;
FmocCys（Acm）OH;FmocGlu（^tBu）OH;FmocGln（Mbh）OH;FmocHis（Tr）OH;
FmocLys（Boc）OH;FmocSer（^tBu）OH;FmocThr（^tBu）OH;
FmocTyr（^tBu）OH
が使用される。［略語：Acm、アセトアミドメチル；Boc、t-ブトキシカルボニル；^tBu、t-ブチル；Fmoc、9-フルオレニルメトキシカルボニル；Mbh、4,4’-ジメトキシベンズヒドリル；Pmc、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル；Tr、トリチル］
合成は、溶媒としてN-メチルピロリドン（NMP）を用い、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させたHBTUを加えて行う。Fmoc基の脱保護はNMP中の約20%ピペリジンを用いて達成される。各々の合成の終了時にペプチドの存在量を紫外線分光によりアッセイする。乾燥ペプチド樹脂サンプル（約3-10mg）を秤量し、次いでDMA（1ml）中の20%ピペリジンを添加する。30分音波処理した後、ジベンゾフルベン-ピペリジン付加生成物（N末端Fmoc基の切断により形成される）のUV（紫外線）吸光度を301nmにて記録する。ペプチド置換（mmol g^-1）は式：

（式中、Aは301nmにおける吸光度、vはDMA中の20%ピペリジン容量（ml）、7800はジベンゾフルベン-ピペリジン付加生成物の吸光係数（mol^-1dm³cm^-2）、およびwはペプチド樹脂サンプルの重量（mg）である）
に従って算出できる。
最後に、N末端Fmoc基をDMA中の20%ピペリジンを用いて切断し、次いでDMA中の無水酢酸およびピリジンを用いてアセチル化する。ペプチド樹脂はDMA、CH₂Cl₃および最後にジエチルエーテルで十分に洗浄する。
6.10.2.切断および脱保護
限定されるものではないが例示すれば、切断および脱保護は以下のように行うことができる：95%トリフルオロ酢酸水溶液（TFA）の添加に先立ち、風乾したペプチド樹脂をエチルメチル-スルフィド（EtSMe）、エタンジチオール（EDT）およびチオアニソール（PhSMe）で約20分間処理する。ペプチド樹脂グラム当たり全容量約50mlのこれら試薬を使用する。以下の比率：TFA:EtSMe:EDT:PhSMe（10:0.5:0.5:0.5）を使用する。この混合物をN₂雰囲気下、室温で3時間攪拌する。混合物を濾過し、樹脂をTFAで洗浄する（2x3ml）。混合した濾液を真空蒸発させ、無水ジエチルエーテルを黄／橙色の残渣へ添加する。得られた白色沈殿を濾過により単離する。種々の切断法については、Kingら，1990,Int.J.Peptide Protein Res.36:255-266を参照。
6.10.3.ペプチドの精製
合成されたペプチドの精製はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC））、遠心分離、示差溶解性、または他の標準的な技術のいずれかを含む標準的な技術により行うことができる。
6.10.4.ペプチドの他の分子への結合
本発明のペプチドは、当該技術分野で周知の方法により他の分子（例えば、本発明の種々の実施形態に従う検出可能な標識、固相支持体への吸着を促進する分子、または毒素）と結合させてもよい。かかる方法としては、ホモ二官能価およびヘテロ二官能価架橋分子の使用が挙げられる。
ホモ二官能価分子は少なくとも2つの反応性官能基を有し、それらは同一のものである。ホモ二官能価分子における反応性官能基としては、例えばアルデヒド基および活性エステル基が挙げられる。
アルデヒド基を有するホモ二官能価分子としては、例えばグルタルアルデヒドおよびスバルアルデヒドが挙げられる。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用については、Poznanskyら，1984,Science 223:1304-1306により開示されている。
少なくとも2つの活性エステル単位を有するホモ二官能価分子としては、ジカルボン酸およびN-ヒドロキシスクシンイミドのエステルが挙げられる。かかるN-スクシンイミジルエステルのいくつかの例としては、スベリン酸ジスクシンイミジルおよびジチオ−ビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）、ならびにそれらのナトリウムおよびカリウム塩などの可溶性ビススルホン酸およびビススルホン酸塩が挙げられる。これらのホモ二官能価試薬はPierce、Rockford、Illinoisより入手可能である。
ヘテロ二官能価分子は少なくとも2つの異なる反応性官能基を有する。反応性ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能価試薬のいくつかの例としては、3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸N-スクシンイミジル（Carlssonら，1978,Biochem J.173:723-737）、S-4-スクシンイミジロキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム、および4-スクシンイミジロキシカルボニル−α−メチル−（2-ピリジルジチオ）トルエンが挙げられる。3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸N-スクシンイミジルが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含んでなるヘテロ二官能価試薬のいくつかの例としては、4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジルおよびm-マレイミド安息香酸スクシンイミジルが挙げられる。
他のヘテロ二官能価分子としては、3-（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミジル、4-（p-マレイミド−フェニル）酪酸スルホスクシンイミジル、4-（N-マレイミドメチル−シクロヘキサン）-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシ−スクシンイミドエステルが挙げられる。m-マレイミド安息香酸スクシンイミジルのスルホン酸ナトリウム塩が好ましい。前記のヘテロ二官能価試薬およびそれらのスルホン酸塩の多くはPierceより入手可能である。
他の多官能価試薬はもちろん、これらの製造および使用方法についてのさらなる情報は下記刊行物または当該技術分野で入手可能な他のもの：
Carlssonら，1978,Biochem.J.173:723-737;Cumberら，1985,Methods in Enzymology 112:207-224;Jueら，1978,Biochem.17:5399-5405;Sunら，1974,Biochem.13:2334-2340;Blattlerら，1985,Biochem.24:1517-152;Liuら，1979,Biochem.18:690-697;YoulsおよびNeville,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5483-5486;Lernerら，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3403-3407;JungおよびMoroi,1983,Biochem.Biophys.Acta 761:162;Caulfieldら，1984,Biochem.81:7772-7776;Staros,1982,Biochem.21:3950-3955:Yoshitakeら，1979,Eur.J.Biochem.101:395-399;Yoshitakeら，1982,J.Biochem.92:1413-1424;PilchおよびCzech,1979,J.Biol.Chem.254:3375-3381;Novickら，1987,J.Biol.Chem.262:8483-8487;LomantおよびFairbanks,1976,J.Mol.Biol.104:243-261;HamadaおよびTsuruo,1987,Anal.Biochem.160:483-488;Hashidaら，1984,J.Applied Biochem.6:56-63
より入手できる。
さらに、架橋方法については、MeansおよびFeeney,1990,Bioconjugate Chem.1:2-12により概説されている。
6.10.4.1.ペプチドのビオチニル化
ペプチドをビオチニル化する方法は、当該技術分野では周知である。本発明の実施においてはいずれの常法を用いてもよい。例えば、下記手法を使用した。ペプチド10μgを0.1%酢酸100μlに溶解させた。PBS（900μl）およびビオチン-LC-NHS（Pierce,Rockford,IL）3.3mgを添加した。室温で30分間インキュベートした後、ビオチニル化ペプチドをSuperose12カラム（Pharmacia,Piscataway,NJ）で精製した。
6.10.5.合成ペプチド
表19、20および21では、本発明の実施において作製された種々の合成ペプチドの一次構造を提供する。

GITペプチドのGST融合タンパク質を表21に示す。

6.10.6.ペプチドの安定性
ZElan031、ZElan053およびZElan054の相対的安定性を模擬腸液（SIF）中で決定した。SIFは、パンクレアチン（Sigma cat#P-1625,lot# 122H0812）100mgをリン酸貯蔵液8.4mlに溶解させ、0.2N NaOHでpH7.5に調整し、水で容量を10mlに調整することにより作製した。
ペプチド（3.25mg）を37℃で10,000倍希釈SIF溶液3.25mlに溶解させた。次いでアリコート（0.7ml）の消化溶液を＜1分、1時間、3時間、21時間または24時間で回収した。このサンプルを迅速にシリンジフィルター（Millipore Millex-GV 0.22μm,part# SLGV025LS,lot# H2BM95250）に通し、濾過した溶液300μlを直ちに、C-8カラム（Applied Biosystemsカラムおよびガードカラム：カラム-p/n 0711-0023 Spheri-5 ODS 5μm,220x4.6mm）を装備したHewlett-Packard HPLCシステムへ注入した。生成物はアセトニトリル−水勾配を用い、1.5ml/分で溶出させた。主要な蛍光ピークを採取し、凍結乾燥して、MS解析により同定した。
使用したHPLC勾配は：
時間（分） 溶媒混合物
0 95% H₂O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）
5 95% H₂O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）
35 85% H₂O-15% アセトニトリル（0.1%TFA）直線的溶媒変化
40 0% H₂O-100% アセトニトリル（0.1%TFA） 〃
45 95% H₂O-5% アセトニトリル（0.1%TFA） 〃
52 95% H₂O-5% アセトニトリル（0.1%TFA） 〃
であった。
表22で示されるように、3種のペプチドの（SIFに対する）相対的安定性は、ZElan053＞ZElan054＞ZElan031であった。ペプチドの酵素切断は期待されたようにアルギニンおよび／またはリジンで起こることがわかった。1-アミノ酸をそれらのD-アミノ酸類似体と置換することにより、これら残基におけるタンパク質分解率は有意に低下した。

7.ペプチド被覆粒子の特性決定
ペプチド被覆PLGAナノ粒子の固定化Caco-2細胞への結合
標的化ペプチドで被覆したナノ粒子の固定化Caco-2細胞への結合を、抗体と、ペプチドに存在するダンシル部分との反応に基づくELISAアッセイを用いて調べた。選択した合成ペプチドの等電点は表23に示されている（対応する配列番号は表7に示される）。対応するダンシル化合成GIT結合ペプチドを表24に示す。

方法：
PBS中の0.1%BSAでブロッキングする前に、96-ウェルプレート（p38）で増殖させたCaco-2密集単層を固定化し、0.1%フェニルヒドラジンで処理した。対照およびダンシルペプチド被覆ナノ粒子を10mg/mlで滅菌水中に再懸濁させ、室温で1時間磁石で攪拌した。サンプルは、（1）ブランクナノ粒子対照、（2）スクランブルしたPAX2被覆ナノ粒子、（3）PAX2被覆ナノ粒子、（4）HAX42被覆ナノ粒子、（5）PAX2/HAX42被覆ナノ粒子、および（6）8ペプチド被覆ナノ粒子からなった。
ナノ粒子を1%BSA-PBS（このアッセイではTween80は使用しない）100μl中に10mg/mlで細胞に添加し、さらに2倍連続希釈した。96-ウェルプレートを室温で1時間インキュベートした。このプレートを1%BSA-PBSで5回洗浄し、ウェル当り抗ダンシル抗体（Cytogen DB3-226.3;0.5μg/ml;batch May 1997）100μlを添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルを1%BSA-PBSで5回洗浄し、ウェル当りヤギ抗マウスλ:HRP抗体（Southern Biotechnology CN.1060-05;1:10,000）を添加して、さらにプレートを室温で1時間インキュベートした。1%BSA-PBSで5回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質（KPL CN.50-76-00）100μlをウェルに添加し、15分後、650nmにて光学密度を測定した。
図13A-Bで示されるように、漸減量のナノ粒子を固定化Caco-2細胞に適用する場合、PAX2、HAX2、PAX2+HAX2、および8つの標的化ペプチドの混合物で被覆したナノ粒子に関しては抗ダンシルELISA応答の低下が見られた。ブランクナノ粒子またはスクランブル型のPAX2ペプチドで被覆したナノ粒子には濃度の影響は見られなかった。PAX2、HAX2、PAX2+HAX2、および8つのペプチド混合物で被覆したナノ粒子は、ブランクナノ粒子またはスクランブル型のPAX2ペプチドで被覆したナノ粒子に比例して応答の増加を示した。このOD値は通常固定化Caco-2細胞に結合しているGSTペプチド融合物に認められるものより低かった。
下記表25はインスリン効力および組成1の粒子（下記に示されたコアセルベーション法による組成物）に対する粒子上に被覆されたペプチドのレベル（蛍光性により測定される）を示している。

ダンシル化ペプチドおよびインスリン被覆PLGA粒子のELISA
標準的なELISA手法を次のように変更した。ペプチドおよび粒子を1%BSAを含有するPBSで好適な濃度まで希釈し（粒子を音波処理して均一な溶液にした）、滴定して室温で1時間インキュベートした。1%BSAを含有するPBSで5回洗浄した後、自家IgG1λ抗ダンシルモノクロナール抗体を添加し（1%BSA-PBSで1μg/mlに希釈）、プレートを1時間インキュベートした。さらに5回洗浄した後、ヤギ抗マウスλ-HRPを添加し（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL,1%BSA-PBSで1:10,000希釈）、プレートを1時間インキュベートした。5回洗浄した後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で顕色させた。データはすべて差し引かれるバックグラウンド結合とともに示されている。このアッセイにインスリン被覆PLGA粒子が含まれる場合は、Tween20を希釈液または洗液に添加しなかった。
図14A-14Bはダンシル化ペプチドSNi10のhSIおよびBSAへの結合を示す。
8.合成ペプチドおよびペプチド被覆粒子のCaco-2細胞由来S100およびP100画分への結合
8.1.膜（p100）およびサイトソル（S100）画分への結合の検出
Caco-2細胞膜（P100）およびサイトソル（S100）画分はKinsella,B.T.,O’Mahony,D.J.およびG.A.FitzGerald,1994,J.Biol.Chem.269（47）:29914-29919に記載される方法の変法を用いて調製した。Caco-2密集細胞単層（75cm²フラスコ内で37℃および5%CO₂で1週間増殖させた）をダルベッコのPBS（DPBS）で2回洗浄し、10mM EDTA-DPBSでの処理後、細胞を1000rpmでの遠心分離により回収した。この細胞をDPBSで3回洗浄し、最終の細胞ペレットを3容量の氷冷HEDバッファー（20mM HEPES（pH 7.67），1mM EGTA,0.5mM ジチオトレイトール，1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF））中に再懸濁させた。細胞は30秒間のホモジナイズに先立ち氷上で5分間膨潤させた。このホモジネートを4℃で45分間、40,000rpmで遠心分離した。上清（S100）を除去し、ペレット（P100）をHEDGバッファー（20mM HEPES（pH 7.67）,1mM EGTA,0.5mM ジチオトレイトール，100mM NaCl，10% グリセロール,1mM PMSF）中に再懸濁させた。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Bradford,M.M.,1976,Anal.Biochem.72:248-254）を用いて測定した。
ペプチドおよび／またはペプチド被覆PLGA粒子の膜（P100）およびサイトソル（S100）画分への結合をペプチド内に組み込まれるダンシル部分の検出により評価した。Costar96ウェルELISAプレートをS100およびP100画分（0.05M NaHCO₃中100μg/ml）で4℃で一晩被覆した。プレートを室温で1時間、DPBS中の0.5%ウシ血清アルブミンでブロックし、1%BSA-DPBSで3回洗浄した。ペプチド被覆粒子またはペプチドを同一のバッファー中に分散させ、0.325-0.5mg/ウェルの範囲の濃度でプレートへ添加した。室温で1時間後、プレートを1%BSA-DPBSで5回洗浄し、ウェル当たり抗ダンシル抗体（Cytogen DB3-226.3;0.5μg/ml）100μlを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルを1%BSA-DPBSで3回洗浄し、ウェル当たりヤギ抗マウスIgGλ:HRP抗体（Southern Biotechnology 1060-05;1:10,000）100μlを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。1%BSA-DPBSで3回洗浄した後、TMB基質（3,3’,5’,5-テトラメチルベンジジン；Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard and Perry Laboratories 50-76-00）100μlを添加し、種々の時間間隔で650nmにて光学密度を測定した。
8.2. ペプチド被覆PLGA粒子の結合
新規のアッセイ系はペプチド被覆PLGA粒子と、Caco-2生細胞由来の膜（P100）およびサイトソル（S100）画分との結合の検出のための本発明により提供される。このアッセイ系を用いて得られる吸光度の読み取り値は実質上、固定化Caco-2細胞において同様のペプチド被覆PLGA粒子濃度を用いて得られるものより高かった。この高い感受性ならびにCaco-2生細胞由来のS100およびP100画分の導出により、このアッセイがペプチド被覆PLGA粒子結合の検出のために選択されたアッセイ系であろうことが示唆される。アッセイは濃度に依存し、ペプチド／粒子の相互関係は特異的および非特異的結合間の相互作用の識別を可能にした。
ペプチド被覆PLGA粒子の結合は、前記のCaco-2生細胞由来のS100およびP100画分を用いて評価した。画分は0.05M NaHCO₃中10μg/ウェルで96-ウェルプレートへ被覆し、ELISAによりペプチド被覆PLGA粒子を0.0325-0.5mg/ウェルの範囲の濃度でアッセイした。
図15Aおよび15Bにより、ペプチドなし、スクランブルしたPAX2（対照）、P31D-Arg 16-マー（ZElan053）、HAX42、PAX2およびHAX42/PAX2それぞれで被覆した粒子に対してS100およびP100画分で得られたでデータを示す。粒子濃度0.0325-0.5mg/ウェルを用いた場合、すべての試験ペプチド被覆PLGA粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子より強いS100およびP100両画分への結合を示した。P31 D-Arg 16マー（ZElan053）を除くすべての粒子はS100画分よりP100画分へ強い結合を示した。P31 D-Arg 16マー（ZElan053）被覆粒子のS100画分への強い結合は、P31ペプチド（配列番号43）のD-Arg修飾による非特異的結合を示すものであろう。
0.05-5.0mg/gの範囲の種々の濃度のPAX2ペプチドで被覆したPLGA粒子の結合は、a）固定化Caco-2細胞（P35）およびb）S100およびP100画分（Caco-2 P33）を用いて評価した。粒子を0.03125-0.0625mg/ウェルの範囲の濃度でアッセイした。
0.0625mg/ウェルの範囲の粒子濃度を用いた場合、0.05mg/gで被覆したものを除くすべてのPAX2被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子より強い固定化Caco-2細胞への結合を示した。Caco-2細胞の結合を向上させる漸増するPAX2ペプチド濃度（0.05-1.0mg/gの範囲）による濃度の影響があることが明らかである。しかしながら、吸光度の読み取り値はいずれも低く、PAX2（5mg/g）の結合はこのパターンに一致しなかった。
0.03125-0.0625mg/ウェルの粒子濃度を用いた場合、PAX2（0.05mg/g）を除くすべての試験ペプチド被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子と同等か、またはより強いS100およびP100両画分への結合を示した。すべての粒子はS100画分よりP100画分へ強い結合を示した。S100およびP100両画分への結合はその粒子のPAX2ペプチド濃度に直接的に比例していた。このアッセイ系を用いて得られる吸光度の読み取り値は実質上、固定化Caco-2細胞において得られるものより高かった。
ペプチド被覆PLGA粒子のP100画分（Caco-2 P35）への結合におけるブロッキング溶液の効果を1%ウシ血清アルブミン（BSA）およびバックグラウンド結合を評価するための1%粉乳ブロッキング溶液を用いて評価した。下記の粒子：ペプチドなし；スクランブルしたPAX2；および5-0.05mg/gのペプチド濃度を有するPAX2被覆粒子を0.03125-0.0625mg/ウェルの範囲の濃度を用いてアッセイした。これまでに1%BSAを用いて観察されたように、0.05mg/gで被覆したPAX2を除くすべての試験ペプチド被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子と同等か、またはより強いP100画分への結合を示した。P100画分への結合は、その粒子のPAX2ペプチド濃度に直接的に比例していた（この場合、PAX2（5mg/g）はPAX2（1mg/g）よりわずかに弱い結合を示した）。1%粉乳および0.0625mg/ウェルの粒子濃度を用いた場合にも同様の傾向が見られた。しかしながら、1%粉乳を用いた場合、吸光度の読み取り値はいずれも低く、0.0625mg/ウェルの濃度の粒子を用いた場合には結合パターンが検出できなかった。
ペプチド被覆PLGA粒子のプラスチックへの非特異的結合もまた、1%BSAおよび1%粉乳ブロッキング溶液を用いて評価した。BSAを用いた場合、前記で見られた結合パターンが検出できた；しかしながら、吸光度の読み取り値は実質的に低く、粒子PAX2（0.1および0.05mg/g各々）の結合は検出できなかった。1%粉乳を用いた場合、吸光度に読み取り値はいずれも低く、検出可能な結合パターンはなかった。次のアッセイのブロッキング用にはBSAを選択した。
8.3.P100画分へ結合するペプチド被覆粒子と合成ペプチドの比較
ダンシル化ペプチドのP100画分への結合を評価して、ペプチド結合によりペプチド被覆粒子結合が推定可能であるかを調べた。図16はダンシル化ペプチドA）HAX42,P31 D型およびスクランブルしたPAX2およびB）PAX2、HAX42およびスクランブルしたPAX-2について得られたデータを示す。
連続した２つのアッセイは、吸光度読み取り値に実質的変化をもたらした。最初、HAX42ペプチドはスクランブルしたPAX-2対照と比較した場合、強い結合を示した。P31 D型ペプチド（ZElan053）は最大希釈でのみ結合を示した。反復アッセイでは、HAX42もまたスクランブルしたPAX-2対照と比較して有意な結合を示した。しかしながら、スクランブルしたPAX-2対照およびHAX42は、前記のアッセイで得られたものと比較して高い吸光度値であった。PAX2ペプチドはスクランブルしたPAX-2対照と区別がつかなかった。ペプチド／粒子結合相互関係を下記表26に要約する：

ペプチド／粒子結合はHAX42ペプチドに対して十分な相互関係があった。これに対し、P31 D型（ZElan053）ペプチドに対して検出され得る相互関係はなかった。P31 D型ペプチド被覆粒子はP100画分よりS100画分へ強い結合を示した（他の試験ペプチドとは異なる）ため、粒子結合相互作用は非特異的であり、またはいくつかの他の分子はS100画分ではなく、P100画分への結合に対して競合していたようである。かくして、ペプチド／粒子アッセイ相関性は特異的および非特異的結合相互作用間の識別に有用であろう。PAX2結合相互関係の評価は困難であったため、スクランブルしたPAX2対照は様々な結果をもたらした。
8.4.HAX42およびPAX2結合モチーフ配列の決定
HAX42、PAX2および種々の誘導体のペプチドおよびGST融合タンパク質をCaco-2細胞由来のP100膜画分に対するペプチドELISAを用いてアッセイした。GST-PAX2タンパク質およびPAX2ペプチドデータにより、コア結合モチーフがアミノ酸配列TNAKHSSHNRRLRTR（配列番号）、そうでなければGST-106およびZElan033にあることが示される。同様に、HAX42ペプチドデータにより、HAX42のコア結合モチーフがアミノ酸配列PGDYNCCGNCNSTG（配列番号）、そうでなければZElan091にあることが示唆される。
ペプチドおよびタンパク質を、96ウェルプレートを0.05M炭酸バッファー pH9.6中、4℃で一晩100μl/ウェルの被覆タンパク質（通常100μg/ml P100膜画分）で被覆するダンシル化ペプチドELISA法により解析した。非特異的結合は、ダンシル化ペプチドとのインキュベーションに先立ち、37℃で2時間、200μl/ウェル、2% Marvel／PBSを用いてブロックした。一連の各インキュベーション工程の後、このプレートをPBS/0.05% Tween20で3回洗浄した。ペプチドは開始濃度100μg/mlでブロッキング溶液に希釈し、1:2の下方希釈して100μl/ウェルとし、次いで正確に室温で１時間のインキュベーションした。バッファーブランク対照には、プラスチックへのバックグラウンド結合がアッセイ系で用いる抗体によるものではないことを保証するという含意がある。ダンシル化ペプチドを検出するため、ブロッキングバッファー溶液で1:1340希釈および100μl/ウェルのマウス抗ダンシル抗体（DB3 Cytogen Corp.）を添加し、次いで室温で1時間インキュベートした。さらに、プレートをブロッキング溶液で1:10,000希釈、100μl/ウェルの抗マウスλ-HRP複合抗体（Southern Biotech 1060-05）とともに室温で1時間インキュベートした。プレートを75μl/ウェル Bionostics TMB基質を用いて発色させ、約10分間インキュベートした。発色反応をBionostics Red Stop溶液（25μl/ウェル）を用いて停止させ、650nmにおいてプレートの光学密度を読み取った。
GST-PAX2ペプチド−P100画分への相対結合
P100結合値からプラスチックへのGSTペプチド結合を差し引いた後、GST-PAX2ペプチドの結合を任意の値1.00を示すP100に対するGST-HAX42結合の比率として表した。下記の比率は、ペプチド濃度20μg/mlにおけるGSTペプチドのP100への結合から決定した。太字はP100膜画分への正の結合を示す。

PAX2ペプチド−P100画分への相対結合
ZElan021、すなわち全長HAX42は、シグナル対ノイズ比データから決定される所与のペプチド濃度におけるP100への結合の任意の値を1.00とした。PAX2およびその誘導体はHAX42値の比率として示され、表29に示されるCaco-2細胞系由来のP100膜画分へのそれらの結合能力を表す。表30では太字で正の結合ペプチドを示すPAX2ペプチドの一覧を提供する。GST-PAX2ペプチドとPAX2ペプチドデータは、一致し、このことは結合モチーフがアミノ酸配列TNAKHSSHNRRLRTR（GST-106およびZElan033）中にあることを実証するものである。

HAX42ペプチド−P100画分への相対結合
ZElan021、すなわち全長HAX42は、シグナル対ノイズ比データから決定される所与のペプチド濃度におけるP100への結合の任意の値を1.00とした。HAX42およびその誘導体はHAX42値の比率として示され、表31に示されるCaco-2細胞系由来のP100膜画分へのそれらの結合能力を表す。表32では太字で正の結合ペプチドを示すHAX42ペプチドの一覧を提供する。コア結合モチーフはアミノ酸配列PGDYNCCGNCNSTG（ZElan091）中にあると思われる。

9.処方
コアセルベート粒子の一般調製法
本明細書で定義される治療薬を含有する固体粒子をコアセルベート法を用いて調製した。この粒子はポリマーから形成し、約10nm〜500μm、最も好ましくは50〜800nmの粒子サイズを有する。さらに、この粒子はいくつかの方法を用いて粒子に組み込まれるターゲティングリガンドを含む。
前記に示された一般法の有機相（B）ポリマーは可溶性、浸透性、非浸透性、生物分解性または胃保持性であってよい。ポリマーはポリマーまたはコポリマーの混合物からなり、天然または合成ポリマーであってよい。典型的な生物分解性ポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリグリコリド；ポリラクチド；DL、LおよびD型を含むポリ（ラクチド−co−グリコリド）；コポリオキサレート；ポリカプロラクトン；ポリエステルアミド；ポリオルトエステル；ポリアンヒドリド；ポリアルキルシアノアクリレート；ポリヒドロキシブチレート；ポリウレタン；アルブミン；カゼイン；キトサン誘導体；ゼラチン；アラビアゴム；セルロース；ポリサッカライド；アルギン酸；ポリペプチドなど、そのコポリマー、その混合物およびその立体異性体が挙げられる。典型的な合成ポリマーとしては、アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；セルロースエステル；ニトロセルロース；アクリル酸およびメタアクリル酸のポリマーおよびそのエステル；デキストラン；ポリアミド；ポリカーボネート；ポリアルキレン；ポリアルキレングリコール；ポリアルキレンオキシド；ポリアルキレンテレフタレート；ポリビニルアルコール；ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリビニルハライド；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサンおよびポリウレタンおよびそのコポリマーが挙げられる。
典型的には、粒子は以下の一般法を用いて形成される：
ポリマー、界面活性剤、界面安定剤もしくは変性剤または塩、あるいは界面活性剤好ましくはポリビニルアルコール（PVA）または加水分解率50-100%、分子量域500-500,000、最も好ましくは加水分解率80-100%、分子量10,000-150,000の誘導体の水溶液（A）を容器に入れる。混合物（A）を低い剪断条件下で10-2000rpm、好ましくは100-600rpmで攪拌する。この溶液のPHおよび／またはイオン強度は塩、バッファーまたは他の変性剤を用いて改質してもよい。この溶液の粘度はポリマー、塩類、または他の増粘剤または変性剤を用いて改質してもよい。
ポリマー、好ましくはポリ（ラクチド−co−グリコリド）、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはその組合せ、またはいずれかの鏡像体、もしくはターゲティングリガンドを有するこれらのポリマーの共有結合体を水混和性有機溶媒に溶解させ、有機相（B）を得る。最も好ましくは、アセトンおよびエタノールの組合せを、用いるポリマーにもよるが、0:100アセトン：エタノール〜100:0アセトン：エタノールまでの比の範囲で用いる。
さらにポリマー、ペプチド糖、塩、天然／生物学的ポリマーまたは他の薬剤をこの有機相（B）に添加し、得られる粒子生成物の物理的および化学的特性を改質してもよい。
薬剤または生物活性物質を水相（A）または有機相（B）のいずれかに入れてもよい。またターゲティングリガンドをこの時点で水相（A）または有機相（B）のいずれかに入れてもよい。
有機相（B）を一貫した速度で攪拌した水相（A）に加える。溶媒は、好ましくは周囲より温度を上昇させ、および／または真空ポンプの使用により蒸発させる。ここで粒子は懸濁液（C）と表す。この時点で攪拌した懸濁液にターゲティングリガンドを入れてもよい。
この工程でポリマー、ペプチド糖、塩、天然／生物学的ポリマーまたは他の薬剤の第2層をいずれかの好適な方法により予備形成粒子コアへ付着させてもよい。次いで、粒子（D）を標準的なコロイド分離技術、好ましくは高「g」力での遠心分離、濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは電荷分離技術により懸濁液（C）から分離する。この上清は廃棄し、粒子（D）を洗浄液（E）、好ましくは水、塩水、バッファーまたは有機溶媒に再懸濁させる。粒子（D）を前記と同様に洗浄液から分離し、通常2回再洗浄する。ターゲティングリガンドは、最終洗浄工程で洗浄液（E）に溶解させてもよく、これを使用して粒子（D）を洗浄してもよい。
次いで、この粒子を乾燥すればよい。その後、粒子にさらに処理し、例えば錠剤化したり、カプセル封入したり、噴霧乾燥してもよい。
上記のように形成された粒子の放出プロフィールは、使用するおよび／または所望の処方にもよるが、即時放出から徐放または遅延放出まで多様であってよい。
薬剤添加量（drug loading）は0-90%w/wの範囲内であってよい。ターゲティングリガンドの添加量（loading）は0-90%w/wの範囲内であってよい。
具体的な実施例として、次の実施例が挙げられる：
実施例1:最終洗浄工程で添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：ペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでウシインスリンをロード（load）したナノ粒子2gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583） 2.0g
アセトン 45ml
エタノール 5ml
PVA（水 5%w/v） 400ml
ウシインスリン（ロット番号 86H0674） 100mg
ペプチド：PAX2（ZElan018） 10mg/50ml dH₂O
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌することにより調製した。有機相は、アセトン45mlおよびエタノール5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 2gを有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針（green needle）を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
この懸濁液を、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」を粉砕し、dH₂O（200ml）を添加して粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
ペプチド溶液、（ZElan018、dH₂O 50ml中10mg）を調製し、最終洗浄工程の間に粒子へ添加した。この懸濁粒子を前記のように遠心分離した。上清をデカンテーションし、粉砕した「ケーク」および粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.45gであった。走査型電子顕微鏡により、300-500nmのサイズの適度に球状の独立粒子であることが示された。有効性は49.2mg/g（ラベルクレイムの98.0%）であった。ペプチドの添加量は2.42μg/mg（ラベルクレイムの48.4%）であった。
実施例2:製造開始時に添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：製造開始時にペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子2gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583） 2.0g
アセトン 45ml
エタノール： 5ml
PVA（水 5%w/v） 400ml
ウシインスリン（ロット番号 65H0640） 100mg
ペプチド：PAX2（ZElan018ii） 10mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン45mlおよびエタノール5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H（ポリアクチド−co−グリコリド、Boehringer Ingelheim）2gを前記工程で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。PAX2（ZElan018ii、10mg）を攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。懸濁液は、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。
粒子の「ケーク」を粉砕し、dH₂O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.6gであった。有効性は47.3mg/g（ラベルクレイムの94.6%）であった。ペプチドの添加量は1.689μg/mg（ラベルクレイムの33.8%）であった。
実施例3:遠心分離１時間前に添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：遠心分離１時間前にペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子1gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583） 1.0g
アセトン 22.5ml
エタノール： 2.5ml
PVA（水 5%w/v） 200ml
ウシインスリン（ロット番号 65H0640） 50mg
ペプチド：PAX2（ZElan018） 5mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン22.5mlおよびエタノール2.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 1gを前記で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液200mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 50mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
PAX2（ZElan018 5mg）を攪拌した粒子懸濁液に添加した。1時間後、懸濁液をスイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」は粉砕し、dH₂O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。有効性は20.75mg/g（ラベルクレイムの41.5%）であった。ペプチド添加量は1.256μg/mg（ラベルクレイムの25.12%）であった。
実施例4:ロイプロリド（Leuprolide）をロードしたナノ粒子
目的：ペプチドZElan024を添加し、理論添加量20mg/gでロイプロリド−アセテートをロードしたナノ粒子3gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 271077） 3.0g
アセトン 67.5ml
エタノール： 7.5ml
PVA（水 5%w/v） 600ml
ロイプロリド−アセテート（ロット番号 V14094） 60mg
ペプチド：P31（ZElan024） 15mg/50ml dH₂O
試験詳細：
PVA溶液を調製し、有機相は、アセトン67.5mlおよびエタノール7.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 3gを前記で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液600mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ロイプロリドアセテート 60mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。懸濁液をスイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で15,000rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションし、解析用に確保した。
粒子の「ケーク」は粉砕し、dH₂O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
ペプチド溶液（P31（配列番号43）、dH₂O 50ml中 15mg）を調製し、最終洗浄工程で粒子に添加した。懸濁した粒子を前記のように遠心分離した。上清液をデカンテーションし、粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.87gであった。走査型電子顕微鏡により、300-500nmサイズ範囲の適度に球状の、独立粒子であった。有効性は4.7mg/g（ラベルクレイムの23.4%）であった。ペプチドの添加量は1.76μg/mgであった。
実施例5:ポリマー−ペプチド結合体により「スパイキング」ポリマー相を添加したペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：ポリマー−ペプチド結合体PLGA-ZElan019を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子3gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 271077） 2.85g
RG504H-ZElan019結合体 0.15g
（5PAX5-結合体）
アセトン 67.5ml
エタノール： 7.5ml
PVA（水 5%w/v） 600ml
ウシインスリン（ロット番号 86H0674） 150mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン67.5mlおよびエタノール7.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504Hおよびポリマー−ペプチド結合体を有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。
IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
懸濁液は、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」は粉砕し、dH₂O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は2.8gであった。有効性は53.1mg/g（ラベルクレイムの106.2%）であった。ペプチドの添加量は4.02μg/mg（ラベルクレイムの80.4%）であった。
10．動物研究
研究 1
試験溶液を回腸内へ直接注入するオープンループ研究を行った。ウィスターラット（300-350g）を4時間絶食させ、ケタミン溶液［ケタミン（100mg/ml）0.525mlおよびマレイン酸アセプロマジン-BP ACP（2mg/ml）0.875ml］を加えた試験溶液の投与に先立ち、15〜20分の筋肉注射により麻酔をかけた。次いで、ラットに試験溶液を幽門下方2-3cmで十二指腸内に注入した（注入容量：1.5ml PBS）。この試験溶液は、前記で提供されたコアセルベーション手法または前記で提供される「スパイク」手法のいずれかによりターゲティングペプチド有りまたは無しで作製したPLGA粒子を含有した。インスリン（即時作用 ウシ；28.1 iu/mg）を合計で100iuインスリン（70mg粒子）または300iuインスリン（210mg粒子）につき薬剤添加量5%で粒子に混合した。ラットの血中グルコース値は、Glucometer（商標）（Bayer;0.1〜33.3m/mol/L）を用いて測定し；血漿インスリン値は、Phadeseph RIAキット（商標）（Upjohn Pharmacia;3〜240μU/ml-全く同一にアッセイ）を用いて測定した。全身血（systemic blood）および門脈血をサンプルとした。
研究群としては、以下の表33に示されるペプチドで被覆した粒子を含有する試験溶液を投与した動物が挙げられる。

対照群としては、1）PBS対照（1.5ml）オープンループ；2）インスリン溶液（1iu/0.2ml）皮下；3）インスリン粒子−ペプチドなし（1iu/0.2ml）皮下；4）インスリン粒子／すべての8ペプチド混合物（1iu/0.2ml）皮下；5）粒子にロードしたインスリン／ペプチド対照（混合5PAX5）（100iu/1.5ml）オープンループ；6）粒子にロードしたインスリン／ペプチド対照（混合5PAX5）（300iu/1.5ml）オープンループ；7）対照粒子（インスリンなし）／すべての8ペプチド混合物（100iu/1.5mlと等価）オープンループ；および8）対照粒子（インスリンなし）／すべての8ペプチド混合物（300iu/1.5mlと等価）オープンループが挙げられる。
下記は300iu添加量に対する薬物速度論を記載する：

図17Aおよび17Bは対照（PBS）;インスリン溶液;インスリン粒子;すべての8ペプチド混合粒子および研究群ペプチド-粒子（100iu）の腸内投与の後の全身血中グルコースおよびインスリンレベルを示している。図18Aおよび18Bは対照（PBS）;インスリン溶液;インスリン粒子および研究群ペプチド-粒子（300iu）の腸内投与の後の全身血中グルコースおよびインスリンレベルを示している。
インスリンの皮下注射におけるインスリンの送達については、HPT1標的ペプチド被覆粒子により最も効果的に高まり、スパイクしたhPEPT1＞混合PAX2＞mix-8＞hPEPT1＞D2H＞非被覆粒子＞hSI＞溶液の順であった。反復研究において、インスリンを含有する非被覆粒子では類似したプロフィールが得られたが、HPT1-ペプチド標的粒子では減少したプロフィールが得られた（3倍）。インスリンを含まないPLGA粒子およびすべての8混合粒子では、インスリンまたはグルコースの基礎レベルへの効果は示さなかった。HPT1ターゲティング粒子、スパイクしたPEPT1ターゲティング粒子、およびPEPT1ターゲティング粒子もまた誘導されたインスリンが生物活性であることを示す血中グルコースレベルを減少させた。他のターゲティング粒子もまたHPT1粒子およびスパイクしたPEPT1粒子と同じレベルまでではないが、血中グルコースレベルを減少させることも示された。評価した処方のいずれに対しても、小腸内に認められる組織構造的な差はなかった。
研究 2
第2のオープンループ研究は、前記の研究1と同様に、表34に示す以下の処理群により行った。

ウシインスリンの皮下用量に対する漸増する応答では、1〜20iuの範囲を越えては直線的増加が認められないため、投与後のインスリン有効性は、1および20iu皮下用量について評価した。大部分の動物に対し、投与後3時間までのデータを入手できた。従ってまずベースライン差し引きデータから評価される個々のAUC（0-3時間）データ（これに対し3時間までのデータが入手できる）を用いて有効性を評価した。
高い応答をする数種の動物は3時間生存せず、それゆえ解析から除外したため、このアプローチでは有効性が過小評価される可能性がある。可能な限り早い時点で認められたこれらの高い応答を捕らえる試みでは、平均ベースライン差し引き血漿濃度データを用い各群のAUCを評価した。表35はこの第2アプローチに基づいた結果（平均血漿濃度データより算出したAUC（0-3時間））を示す。

第3群（インスリン非被覆粒子）のデータはラット43有りおよび無しで示される。この動物はこれらのインスリン非被覆粒子に対し、不規則な高い応答を有し、それゆえこの群に対するデータに偏りが生じたと考えられる。
このデータより、ペプチド被覆粒子（HAX42/PAX2または5PAX5/P31）を組合せても、個々のペプチドで被覆した粒子より高い有効性は認められないことが判る。さらに、ペプチド被覆粒子はペプチド非被覆より高い有効性を有する。40量体PAX2ペプチドの混合で生物学的利用能の低下は起こらなかった。この低下は幾分ペプチドサイズの縮小によると思われるが、PAX2ペプチドの混合および19量体へのサイズの縮小により生物学的利用能の低下が起こった。ペプチドサイズの縮小により生物学的利用能の低下が起こった。P31（ZElan053）のD型では、ペプチド分解に対する高い耐性のために生物学的利用能が増大した。ペプチドの競合過剰により生物学的利用能の低下が起こり、さらに凍結乾燥により生物学的利用能の低下が起こった。例として、血中グルコースレベルの測定により、HAX42、PAX2、P31 D型（配列番号43）およびP31（ZElan053）を含むHPT1およびhPEPT1ターゲティング粒子が送達されたインスリンが、生物活性であることを示す血中グルコースレベルを低下させたことが示された。
さらなる研究では、インスリンを、粒子形成後のターゲティング粒子より溶解させて取り出し、非変性ドデジル硫酸ナトリウム（SDS）ポルアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）での電気泳動により解析した。非変性SDS-PAGEおよびまた膜へ転移させ、次いでインスリンに対する抗体でスクリーニングするウエスタンブロットによるインスリンの解析により、インスリンが完全なものあること、すなわち粒子形成工程間に分解、二量体化または凝集の形跡がないことが示された。
研究3
ウィスターラット（300-350g）で十二指腸内オープンループモデル研究を行った。第1群には酢酸ロイプロリド（12.5μg）を皮下注入した。第2群には非被覆酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。第3群にはPAX2を被覆した酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。第4群にはP31（配列番号43）を被覆した酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。図19はこれら第4群への投与後のロイプロリド血漿濃度を示す。十二指腸内投与したP31（配列番号43）およびPAX2被覆ロイプロリド粒子両者では皮下注入に対しロイプロリドの血漿レベルが高まった。
既知のタンパク質に対するGIT運搬体結合ペプチド相同体は図20、21A-Fおよび22A-Dに示されている。
本発明は本明細書に記載の具体的な実施形態にその範囲が限定されるものではない。実際、当業者ならば前記の記載および添付の図面より本明細書に記載のものの他、本発明の種々の変形や変更が明らかであろう。かかる変形や変更も添付の請求の範囲内にあると考えられる。
種々の刊行物が本明細書で引用されているが、それらの記載はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
（2）配列番号１
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号２
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号３
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号４
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号５
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号６
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:41アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号７
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号８
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号９
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号10
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号11
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号12
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号13
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号14
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号15
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号16
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号17
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号18
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号19
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号20
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号21
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号22
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:36アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号23
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号24
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号25
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号26
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号27
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号28
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:37アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号29
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号30
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号31
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号32
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号33
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号34
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号35
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号36
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号37
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号38
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号39
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号40
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号41
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号42
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号43
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号44
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号45
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号46
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号47
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号48
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号49
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号50
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号51
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号52
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号53
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号54
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号55
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号56
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号57
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号58
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号59
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号60
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号61
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:168塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号62
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:135塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号63
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号64
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号65
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号66
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号67
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号68
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号69
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:176塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号70
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号71
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号72
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号73
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号74
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号75
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号76
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号77
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:152塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号78
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号79
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号80
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号81
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号82
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号83
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:156塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号84
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:178塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号85
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号86
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号87
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号88
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号89
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:160塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号90
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号91
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号92
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号93
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号94
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号95
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号96
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号97
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号98
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号99
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号100
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号101
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号102
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号103
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号104
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号105
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号106
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号107
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号108
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号109
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:158塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号110
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:708アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号111
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号112
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号113
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号114
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号115
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号116
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号117
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号118
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号119
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号120
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号121
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号122
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号123
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号124
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号125
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号126
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号127
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号128
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号129
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号130
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号131
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号132
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号133
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号134
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号135
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号136
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号137
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号138
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号139
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号140
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号141
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号142
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号143
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号144
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号145
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号146
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号147
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号148
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号149
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号150
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号151
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号152
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号153
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号154
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号155
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号156
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号157
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号158
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号159
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号160
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号161
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号162
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号163
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号164
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号165
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:17塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号166
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列

（2）配列番号167
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:37アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号168
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号169
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:41アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号170
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:20アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号171
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:29アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号172
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号173
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号174
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:14アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号175
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号176
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:708アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号177
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:3345塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:88...2583
（D）他の情報:
（xi）配列

（2）配列番号178
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:832アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列

（2）配列番号179
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:1827アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号180
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:2284塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:45...2099
（D）他の情報:
（xi）配列

（2）配列番号181
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:685アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列

（2）配列番号182
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:54アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号183
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号184
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号185
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号186
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号187
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号188
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号189
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:24アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号190
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:26アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号191
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号192
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号193
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号194
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号195
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号196
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号197
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号198
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号199
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号200
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号201
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号202
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:40アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号203
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号204
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号205
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号206
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号207
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号208
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号209
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号210
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号211
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:717塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:1...714
（D）他の情報:
（xi）配列

（2）配列番号212
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:238アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列

（2）配列番号213
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号214
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号215
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:279アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号216
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号217
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号218
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号219
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号220
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号221
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号222
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:258アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号223
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号224
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:267アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号225
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号226
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号227
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号228
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号229
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号230
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号231
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号232
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号233
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:249アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号234
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号235
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:258アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号236
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号237
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号238
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号239
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号240
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号241
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号242
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号243
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号244
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号245
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号246
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:262アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号247
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:264アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号248
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号249
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号250
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:40アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号251
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号252
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:23アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号253
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:１
（D）他の情報:XaaはSerまたはThr
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:３
（D）他の情報:XaaはArgまたはLys
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:４
（D）他の情報:XaaはLysまたはArg
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:６
（D）他の情報:XaaはSerまたはLeu
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはArg、Ile、ValまたはSer
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはSer、Tyr、PheまたはHis
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:10
（D）他の情報:XaaはPhe、HisまたはArg
（xi）配列

（2）配列番号254
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:２
（D）他の情報:XaaはSer、AlaまたはGly
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:４
（D）他の情報:XaaはValまたはGln
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはPro、GlyまたはSer
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはTrpまたはTyr
（xi）配列

（2）配列番号255
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号:Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはAlaまたはPhe
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはArgまたはHis
（xi）配列

（2）配列番号256
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号257
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号258
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号259
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号260
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号261
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号262
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号263
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号264
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:12アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

（2）配列番号265
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列

This application claims priority to US Provisional Application No. 60 / 046,595 (filed May 15, 1997). The entire contents of the application are incorporated herein by reference.
1. Introduction
The present invention relates generally to random peptides that can specifically bind to the gastrointestinal tract (GIT) transport receptor. More particularly, the present invention relates to peptide sequences and motifs that facilitate the delivery and transport of drugs through tissues, eg, epithelial cells that cover the luminal side of the gastrointestinal tract (GIT), and derivatives thereof. The present invention also provides methods for producing peptides, derivatives, and antibodies. The present invention further relates to pharmaceutical compositions, formulations, and related methods.
2. Background of the Invention
2.1 Peptide library
Two different approaches have been taken in building random peptide libraries. In one approach, peptides are chemically synthesized in vitro in several formats. Examples of such chemical synthesis libraries include: Fodor, S et al., 1991, Science 251: 767-773; Houghten, R et al., 1991, Nature 354: 84-86; Lam, K et al., 1991, Nature 354: 82-84.
A second approach in constructing a random peptide library has used M13 phage, particularly the protein pIII of M13. Protein 13 (pIII) of M13, a viral capsid protein, is involved in bacterial infection. A p406 capsid protein of 406 amino acids in length has been found by mutation analysis of several researchers to have two domains. The C-terminus of pIII anchors this protein to the viral coat and the N-terminus of pIII is essential for the interaction of this protein with the E. coli pilin protein (Crissman, JW and Smith, GP, 1984, Virology). 132: 445-455). Although the N-terminus of pIII has been shown to be essential during viral infection, the N-terminal end of the mature protein can be altered. In 1985, Smith published an experiment reporting the use of the pIII protein of bacteriophage M13 as an experimental system for expressing foreign proteins on the coat surface of the virus (Smith, GP, 1985, Science 228: 1315 -1317). Subsequently, the two groups separately confirmed the possibility that the display system of the MIII phage PIII gene would be useful in mapping the epitope of the antibody (De la Cruz, V. et al., 1988, J. Biol Chem. 263: 4318-4322; Parmley, SF and Smith GP, 1988, Gene 73: 305-318).
Parmley et al. (Parmley, SF and Smith GP, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218) suggested that a short synthetic DNA segment cloned into the pIII gene could serve as a library of epitopes. . Parmley et al., Because linear epitopes are often about 6 amino acids in length, by expressing any possible hexapeptide using a random recombinant DNA library, the epitope that binds to the antibody can be determined. It was argued that it could be isolated. Scott et al. (Scott, J.K. and Smith, G.P., 1990, Science 249: 386-390) describe the construction of an “epitope library” consisting of hexapeptides that is expressed on the surface of M13. Cwirla et al. (Cwirla, SE et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382) also described a similar library of hexapeptides expressed as gene pIII fusions of M13fd phage. Yes. The PCT application of Dower and Cwirla (Dower et al.) (WO 91/19818, published December 26, 1991) describes a similar library of random amino acid sequences from pentamers to octamers. Devlin et al. (Devlin et al., 1990, Science, 249: 404-406) describe an approximately 15 residue peptide live generated using the (NNS) coding scheme for the synthesis of oligonucleotides where S is G or C. The rally is described. Cristian et al. Describe a phage display library expressing decapeptide (Cristian, R.B. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718).
Other researchers have used other viral capsid proteins to express non-viral DNA on the surface of phage particles. For example, Cesareni et al. (Cesareni, G., 1992, FEBS Lett. 307: 66-70) used the major capsid protein pVIII. Bacteriophages other than M13 are also used to construct peptide libraries. Sequences of 4 and 6 amino acids corresponding to various segments of the major surface antigen of Plasmodium falciparum have been cloned and expressed in the filamentous bacteriophage fd (Greenwood, J. et al., 1991 J. Mol. Biol. 220: 821-827).
Kay et al. (Kay, 1993, Gene 128: 59-65) disclose a method for constructing a peptide library that encodes a peptide of a completely random sequence that is longer than any of the conventional libraries. The library disclosed in Kay encodes a fully synthetic random peptide of about 20 amino acids or more in length. Such libraries are advantageous because they can be screened to identify peptides, polypeptides, and / or other proteins that have binding specificities for various ligands (US Pat. No. 5,498,538 (1996)). March 12) and PCT publication number WO 94/18318 (August 18, 1994)).
For a comprehensive review of various peptide libraries, see Gallop et al. (Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233-1251).
Peptide library screening was often performed by using antibodies as ligands (Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott, and Smith, 1990, Science 249: 386-390). In many cases, the purpose of the screening was to identify peptides similar to the epitope to which the antibody binds from the library. Once an available antibody is determined, the peptide library is an excellent source for identifying the epitope or epitope-like molecule of that antibody (Yanon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10643- 10647).
McCafferty et al. (McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554) used PCR to amplify genes in the variable (V) region of immunoglobulins, and cloned the amplified genes into phage expression vectors. McCafferty et al. Suggest that phage libraries of V, diversity (D), and binding (J) regions can be screened with antigens. Phage bound to the antigen can be mutated in the antigen binding loop of the antibody gene and screened again. If this process is repeated several times, a phage that binds strongly to the antigen can be finally obtained.
Marks et al. (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597) also used PCR to amplify genes in the variable (V) region of immunoglobulins and clone the amplified genes into phage expression vectors. did.
Kang et al. (Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-4366) describe antibody heavy and light chain variable (V) regions and constant (C) specific for antigen. A phagemid vector was made that could be used to express the region. By manipulating the V-C regions of the heavy and light chains, antibody-like molecules that bind with periplasm and have a functional antigen-binding site are generated. When cells having this phagemid were infected with helper phage, antibody-like molecules were introduced on the surface of the phage having phagemid DNA. As a result, it was possible to identify and concentrate these phages by screening with antigen. It was suggested that antibody-like molecules that can bind more strongly to the antigen can be isolated by performing mutations and further screening on the enriched phage.
Hoogenboom et al. (Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) suggested that the naive antibody gene could be cloned into a phage display library. If this is possible, random mutations can be induced in the cloned antibody gene to produce mutants with high affinity.
Bass et al. (Bass et al., 1990, Proteins: Struct. Func. Genet. 8: 308-314) fused human growth hormone (hGH) to the carboxy terminus of the gene III protein of phage fd. This fusion protein was incorporated into a phagemid vector. When cells having this phagemid were infected with helper phage, about 10% of the generated phage particles expressed the fusion protein on the surface. These phage particles were enriched by screening using beads coated with hGH receptor. It was suggested that this system could be used in developing hGH mutants with altered receptor binding properties.
Lowman et al. (Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838) selected mutant hGH proteins with exceptionally high affinity for the hGH receptor using a modification of the Bass et al. System described above. . Lowman et al. Randomly induced mutations in the hGH-pIII fusion protein at sites near 12 amino acids of hGH that have already been identified as important for receptor binding.
Balass et al. (Balass et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10638-10642) resemble conformation-dependent epitopes of the nicotinic acetylcholine receptor using phage display libraries. A linear peptide was isolated. In isolation, the library was screened with monoclonal antibodies specific for conformation-dependent epitopes. The monoclonal antibody used was considered specific for the binding site of the acetylcholine receptor to acetylcholine, the natural ligand of the acetylcholine receptor.
2.2 Drug delivery system
General routes for administering therapeutic agents include administration routes by oral ingestion and parenteral (intravenous, subcutaneous, and muscle) administration routes. Intravenous drug administration (i) risk of side effects due to rapid accumulation of high concentrations of drug, (ii) repeated injections may cause patient discomfort, (iii) repeated There are a number of limitations such as the risk of infection from the injection site. Subcutaneous injection is generally unsuitable for administering large amounts of drugs or stimulating drugs. Although oral administration is generally more convenient, oral administration cannot be used if the therapeutic substance is not efficiently absorbed by the gastrointestinal tract. So far, the goal of developing oral formulations that can efficiently deliver peptides, proteins, and macromolecules remains unfulfilled. Inadequate membrane permeability, enzyme instability, large molecular size and hydrophilic properties are the four main factors that have been barriers in formulating peptides and proteins (Fix, JA, 1996, J. Pharmac. Sci. 85: 1282-1285 review). In order to develop an effective oral formulation, the peptide is protected from the enzymatic environment of the gastrointestinal tract (GIT) and a sufficient concentration of the peptide is brought into contact with the absorptive epithelial cell barrier to produce transcellular transport ( Fix, JA, 1996, J. Pharmac. Sci. 85: 1282-1285), and if possible, the peptide should be "smuggled" from the top to the basolateral side of the epithelial cell barrier ("Smuggled") There is.
Site-specific drug delivery or drug targeting consists of (i) primary targeting to a specific organ, (ii) secondary targeting to a specific type of cell within that organ, and (iii) a specific intracellular structure. Can be achieved at various levels, such as tertiary targeting to deliver drugs to the nucleus (eg, the nucleus in the case of genes) (Review by Davis and Jllum, 1994, Gregoriadis, McCormack, and Poste, Targeting of Drugs 4,183-194 Acquisition). A significant amount of research is currently underway in the area of drug delivery systems (DDS), many of which are available in (i) targeting delivery, (ii) macromolecules, peptides, proteins, and the biotechnology industry. It is directed to the development of a non-invasive delivery method of the produced product into the body (Evers, P., 1995, Developments in Drug Delivery: Technology and Markets, Financial Times Management Report). It is generally accepted that targeted drug delivery is essential to improve the treatment of certain diseases, especially cancer, and many development efforts for targeted drug delivery are moving towards the cancer area. It is not surprising that it is done. Many anticancer agents are toxic not only to malignant cells but also to the body. If the drug or delivery system can be improved to allow the drug to “target” the tumor, it will be possible to fully exploit the anticancer effect by maximizing the drug concentration at the disease site, In addition, toxicity can be greatly reduced. The tumor contains an antigen, which induces a living body to produce an antibody that adheres to and destroys the antigen. Monoclonal antibodies serve as delivery vehicles in tumor cell targeting (reviewed by Pietersz, GA, 1990, Bioconjugate Chem. 1: 89-95) and imaging agents or tumor surface imaging to carry drug molecules It is used as a substance.
2.3 Transport route
Epithelial cells covering the luminal side of the gastrointestinal tract (GIT) are a major obstacle to drug delivery of orally administered drugs. However, the following four transport routes, namely, transcellular transport route, paracellular transport route, carrier-mediated route, and transcytosis route, are recognized as transport routes that can be used for promoting drug delivery and transport. Yes. When a normal drug, peptide, protein, macromolecule, or nano or microparticle system has the ability to “interact” with any of these transport pathways, the drug or particle from the GIT to the circulation under the GIT Delivery is promoted.
For the case of receptor mediated transport pathway, carrier mediated transport pathway or transcytosis transport pathway, some of the uptake signals have been identified. Such signals include, among other things, folic acid, which interacts with the folate receptor, and cobalamin, which interacts with intrinsic factor. In addition, leucine or tyrosine-based peptide selection motifs or internalization sequences such as YSKV, FPHL, YRGV, YQTI, TEQF, TEVM, TSAF, YTFR (SEQ ID NOs: 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, respectively) are also present, which are specific A membrane receptor or binding site is used to facilitate protein uptake or targeting by identifying peptides that specifically bind to that receptor or binding site.
Non-receptor based assays to find specific ligands have also been used. For example, Fong et al. (Fong et al., 1994, Drug Development Research 33: 64-70) disclose a strategy for identifying peptides that cause changes in cellular function, which include phage display, The whole cell is scanned using the library. However, this method uses whole cells rather than intact tissues or polarized cultures when screening phage display libraries, so it has the ability to affect transport through the polarized cell layer. Information about sequences that have major functions is not available.
Stevenson et al. (Stevenson et al., 1995, Pharmaceutical Res. 12 (9), S94) also used Caco-- when screening a synthetic tripeptide combinatorial library for information about dipeptide or tripeptide permeability. It discloses the use of two monolayer cultures.
Methods have been developed to identify peptides that permit or facilitate the transport of active substances through human or animal tissues (see US patent application Ser. No. 08 / 746,411, filed Nov. 8, 1996). The entire contents of this application are hereby incorporated by reference). The phage of the random phage library is inoculated, ie contacted, with an in vitro, in vivo, or in situ tissue sample or first side, preferably the top side of a polar tissue cell culture. The phages transported to the second side opposite to the first side of the tissue, preferably the basolateral side, are collected and the transported phages are selected. A cycle of amplifying the transported phage in the host (using the transport phage obtained in the last cycle) is repeated to select phage live containing phage that can be transported from the first side to the second side Get rally.
The above discussion and reference content of the reference should not be understood as the above description means the prior art of the present invention.
3. Summary of the Invention
The present invention relates generally to random peptides and peptide motifs that can specifically bind to GIT transport receptors. Such proteins can be identified using any random peptide library, such as a chemically synthesized peptide library or a biologically expressed peptide library. When using a biological peptide expression library, a nucleic acid encoding a peptide that binds to a selected ligand can be recovered and sequenced, and its nucleotide sequence can be sequenced, thereby mediating binding. An array can be derived. Alternatively, the amino acid sequence of an appropriate binding domain can be determined by directly determining the amino acid sequence of a peptide selected from a peptide library containing chemically synthesized peptides. Although not as preferred, it is also possible to directly sequence the amino acid sequence of a binding peptide selected from a biological peptide expression library.
In particular, the present invention encodes proteins (eg, peptides) and derivatives (eg, fragments) and analogs thereof that can facilitate the transport of active ingredients to human or animal gastrointestinal tissue, and these proteins and derivatives. Nucleotide sequence to be
Preferably, the tissue that is easily transported is tissue of the duodenum, jejunum, ileum, ascending colon, transverse colon, descending colon, or pelvic colon. This tissue is most preferably epithelial cells lined up on the luminal side of GIT.
The proteins of the present invention are used to facilitate transport of active ingredients from the luminal side of GIT to the systemic blood system and / or to target active ingredients to GIT. Thus, targeting a drug to a specific receptor site or transport pathway known to function in the human gastrointestinal tract, for example, by binding (covalently or non-covalently) the protein of the invention to an orally administered drug. Thus, the absorption of the drug into the whole body can be facilitated.
The invention also relates to derivatives and analogs of the invention that are functionally active, i.e. capable of exhibiting one or more known functional activities involving full-length peptides. Such functional activities include antigenicity (the ability to bind or compete with a GIT transport receptor binding peptide to bind to an anti-GIT transport receptor antibody), and a full-length peptide to bind to a GIT transport receptor. This includes, but is not limited to, the ability to bind or compete.
The present invention further relates to fragments (and derivatives and analogs thereof) of GIT transport receptor binding peptides containing one or more motifs of GIT transport receptor binding peptides.
In addition, antibodies to GIT transport receptor binding peptides and GIT transport receptor binding peptide derivatives and analogs are also provided.
Also provided are methods for producing GIT transport receptor binding peptides, derivatives, fragments and analogs, eg, recombinant methods.
The invention also relates to therapeutic methods, pharmaceutical compositions and formulations based on GIT transport receptor binding peptides. The preparation of the present invention includes a GIT transport receptor-binding peptide or motif and derivatives thereof (including fragments); an antibody against them; and a nucleic acid encoding a GIT transport receptor-binding peptide or derivative related to an active ingredient, It is not limited to these. Preferably, the active ingredient is a drug or drug-containing nanoparticles or microparticles.
The GIT transport receptor binding peptides of the invention can also be used to measure their levels by binding to GIT transport receptors in a sample.
The GIT transport receptor binding protein can also be used to identify molecules that bind to it by contacting the candidate test molecule under conditions that lead to binding or by detecting any binding that occurs. it can.
4). Description of drawings
Figure 1. FIG. 1 shows the sequence (Liang R. et al.) Of a cDNA clone encoding human PEPT1 (SEQ ID NO: 176) containing the extracellular domain of amino acids 391-573 (Fei et al., Nature 368: 563 (1994)). J. Biol. Chem. 270 (12): 6456-6463 (1995)) represents the deduced amino acid sequence of human PEPT1.
Figure 2A-2C. 2A-2C shows the DNA sequence of the cDNA encoding the human intestinal peptide-related transporter HPT1 and the corresponding deduced amino acid sequence (bases 1 to 3345; Medline: 94204643) (SEQ ID NOs: 177 and 178, respectively).
Figures 3A-3B. Figures 3A-3B represent the deduced human sucrase-isomaltase complex (hSI) amino acid sequence determined from the sequence of a cDNA clone encoding human sucrase-isomaltase complex (SEQ ID NO: 179) (Chantret I., et al ., Biochem. J.285(Pt3): 915-923 (1992)).
Figures 4A-4B. Figures 4A-4B represent the D2H nucleotide and deduced amino acid sequences of human D2H transporter (SEQ ID NOs: 180 and 181 respectively) (Wells, R. G. et al., J. Clin. Invest.90: 1959-1963 (1993)).
Figures 5A-5C. FIG. 5A schematically shows the cloning of the DNA insert present in the gene III of the phage selected from the phage display library into the expression vector pGex-4T-2. PCR amplification of the gene insert in the phage III gene using a DNA primer flanking the gene insert (this DNA primer contained a recognition sequence for a specific restriction endonuclease at its 5 'end) did. Alternatively, by using a specific primer that amplifies a specific region of a DNA insert in the phage III gene, which contains a recognition sequence for a specific restriction endonuclease at the most 5 ′ end thereof, PCR amplification experiments were performed. After amplification of the gene insert, the amplified PCR fragment was digested with restriction endonucleases XhoI and NotI. Similarly, plasmid pGex-4T-2 encoding glutathione S-transferase (GST), a reporter protein, was digested with restriction endonucleases SalI and NotI. This digested PCR fragment is ligated to the digested plasmid pGex-4T-2 using T4 DNA ligase, the ligation product is transformed into competent E. coli, and transformed on agar plates containing antibiotics for selection. The body was selected. Selected clones were cultured, the plasmid was recovered and the in-frame sequence of the DNA insert in the plasmid was confirmed by DNA sequencing. The correct clone was then used to express a GST-fusion protein (SEQ ID NO: 182); FIG. 5B represents the following expressed as a fusion protein with GST: a series of full-length P31s (denoted as P31) ) (SEQ ID NO: 43) and a truncated peptide derived from P31 (clone # 101, 102, 103 and 119) (SEQ ID NO: 183, 184, 185 and 186, respectively); full length PAX2 (denoted as PAX2) (sequence #: 55) and a truncated peptide derived from PAX2 (clone # 104,105,106) (SEQ ID NO: 170, 187 and 188, respectively); and a full-length DCX8 (DCX8) (SEQ ID NO: 23) and a series of truncations derived from DCX8 Peptide (clone # 107, 108, 109) (SEQ ID NOs: 189, 190 and 191 respectively). The construction of these GST-fusion proteins is represented in FIG. 5A. FIG. 5C represents the following expressed as a fusion protein with GST: a series of full-length P31 (denoted P31) (SEQ ID NO: 43) and a truncated peptide derived from P31 (clone # 103, 110, respectively) 119, 111 and 112) (SEQ ID NOs: 185, 192, 193, 194 and 195, respectively); full length PAX2 (denoted PAX2) (SEQ ID NO: 55) and truncated peptide derived from PAX2 (clone # 106, 113, 114, 115) (SEQ ID NOs: 188, 196, 197 and 198, respectively); and a full-length SNi10 (denoted by SNi10) (SEQ ID NO: 4) and a series of truncated peptides derived from SNi10 (clone # 116, 117, 118) (SEQ ID NO: 199, 200 and 201, respectively). The construction of these GST-fusion proteins is shown in FIG. 5A. (In FIGS. 5A to 5C, the direction of the arrangement is indicated by underline and bold line).
6A-6B. FIGS. 6A-6B represent GST and GST-fusion protein binding to recombinant hSI and fixed C2BBe1 fixed cells detected by ELISA assay. FIG. 6A shows the control protein GST (without the fusion peptide), and the GST-fusion protein from SNi10 (shown as GST-SNi10) and the GST-fusion protein from SNi34 (with GST-SNi34) against recombinant hIS. (Shown). FIG. 6B shows immobilization of the control protein GST (without the fusion peptide), and the GST-fusion protein from SNi10 (shown as GST-SNi10) and the GST-fusion protein from SNi34 (shown as GST-SNi34) Represents binding to C2BBe1 cells.
Figures 7A-7M. FIGS. 7A-7M show fixed Caco-2 cells, fixed C2BBe1 cells detected by ELISA assay with increasing concentrations of control GST protein and GST-fusion protein (expressed in μg / ml on the X-axis) And binding of GST peptide and truncated fusion protein to fixed A431 cells or to recombinant GIT transport receptors D2H, HPT1, hPEPT1, or BSA. FIG. 7A shows a control protein GST (without the fusion peptide), and a series of GST-fusion proteins derived from P31 (a fusion with the full-length P31 peptide (shown as P31) (SEQ ID NO: 43), and a clone with P31 Represents the binding of a fusion with # 101 (indicated by P31, 101), a fusion with clone # 102 (indicated by P31, 102), and a fusion with clone # 103 (indicated by P31, 103). . FIG. 7B shows the control protein GST (without the fusion peptide), as well as a series of GST-fusion proteins derived from PAX2 (a fusion with the full-length PAX2 peptide (shown as PAX2), and a fusion of PAX2 and clone # 104. (Indicated by PAX2, 104), fusion with clone # 105 (indicated by PAX2, 105), fusion with clone # 106 (indicated by PAX2, 106) (SEQ ID NOs: 55, 170, 187 and 188, respectively) ). FIG. 7C shows the control protein GST (without the fusion peptide), and a series of GST-fusion proteins derived from DCX8 (a fusion with the full length DCX8 peptide (shown as DCX8), and a fusion between DCX8 and clone # 107. (Indicated by DCX8, 107), fusion with clone # 108 (indicated by DCX8, 108), fusion with clone # 109 (indicated by DCX8, 109) (SEQ ID NOs: 23, 189, 190 and 191 respectively) ). FIG. 7D shows a set of control protein GST (without fusion peptide), and GST-fusion protein from DCX8 (shown as GST-DCX8) and GST-fusion protein from DCX11 (shown as GST-DCX11). Represents binding to D2H. FIG. 7E shows immobilization of the control protein GST (without the fusion peptide), and the GST-fusion protein from DCX8 (denoted GST-DCX8) and the GST-fusion protein from DCX11 (denoted GST-DCX11). Represents binding to C2BBe1 cells. FIG. 7F shows a set of control protein GST (without fusion peptide), and GST-fusion protein from P31 (shown as GST-P31) and GST-fusion protein from 5PAX5 (shown as GST-5PAX5) Represents binding to hPEPT1. FIG. 7G shows immobilization of control protein GST (without fusion peptide) and GST-fusion protein from P31 (shown as GST-P31) and GST-fusion protein from 5PAX5 (shown as GST-5PAX5) Represents binding to C2BBe1 cells. FIG. 7H shows a set of control protein GST (without fusion peptide) and a GST-fusion protein from HAX42 (shown as GST-HAX42) and a GST-fusion protein from PAX42 (shown as GST-PAX42) Represents binding to the replacement HPTl. FIG. 7I shows the control protein GST (without the fusion peptide), and the GST-fusion protein from HAX42 (shown as GST-HAX42) and the GST-fusion protein from PAX2 (shown as GST-PAX2) Represents binding to fixed C2BBe1 cells. FIG. 7J shows a control protein GST (without the fusion peptide), as well as a GST-fusion protein derived from P31 (denoted GST-P31) (a fusion with clone # 101, a truncated derivative (GST-P31- 101), a fusion with the truncated derivative clone # 102 (shown as GST-P31-102) and a fusion with the truncated derivative clone # 103 (shown as GST-P31-103) To the recombinant hPEPT1 or BSA. FIG. 7K shows a control protein GST (without fusion peptide), as well as a GST-fusion protein derived from P31 (shown as GST-P31), a fusion with the truncated derivative clone # 101 (GST-P31- 101), a fusion with the truncated derivative clone # 102 (denoted GST-P31-102) and a fusion with the truncated derivative clone # l03 (denoted GST-P31-l03) The binding to fixed C2BBe1 cells or to fixed A431 cells. FIG. 7L shows a control protein GST (without the fusion peptide) as well as a GST-fusion protein derived from PAX2 (indicated as GST-PAX2) (a fusion with the truncated derivative clone # 104 (GST-PAX2- fusion with clone # 105, a truncated derivative (shown as GST-PAX2-105), and fusion with clone # 106, a truncated derivative (shown as GST-PAX2-106) Represents binding to recombinant hPEPT1 or to BSA. FIG. 7M shows a control protein GST (without fusion peptide) and a GST-fusion protein derived from PAX2 (denoted GST-PAX2) (a fusion with the truncated derivative clone # 106 (GST-PAX2- represents the binding to fixed Caco-2 cells or to fixed A431 cells.
Figures 8A-8D. FIG. 8 depicts the transport of GST or GST-peptide fusion derivatives from the apical side to the basolateral side through the polarized Caco-2 cells as detected by ELISA assay as a function of time (1-4 hours). FIG. 8A shows GST fusion with GST, full-length P31 peptide (SEQ ID NO: 43), GST clone derivative after first administering the protein to the apical medium of polarized Caco-2 cells. The transport from the apical side to the basolateral side of polarized Caco-2 cells of any fusion with a clone # 103 (shown at P31.103) is expressed as a function of time. The line marked “no protein” corresponds to the control assay. In the control assay, the basolateral medium was sampled as a function of time (hours) after adding control buffer to the apical medium of polarized Caco-2 cells, and GST assay was performed by ELISA assay. FIG. 8B shows GST, a GST fusion with full-length PAX2 peptide (shown as PAX2), and clone # 106, a GST clone derivative, after first administering the protein to the apical medium of polarized Caco-2 cells. Transport from either apical side to basolateral side in polarized Caco-2 cells of any of the fusions (shown as PAX2.10) is expressed as a function of time. The line marked “no protein” corresponds to the control assay. In the control assay, the basolateral medium was sampled as a function of time (hours) after adding the control buffer to the apical medium of polarized Caco-2 cells, and the GST assay was performed by ELISA assay. FIG. 8C shows GST fusion with GST, full-length DCX8 peptide (shown as DCX8) (with clone # 107, a GST clone derivative) after the protein was first administered to the apical medium of polarized Caco-2 cells. Transport from apical side to basolateral side through polarized Caco-2 cells, either fusion (shown as DCX8.l07) or fusion with clone # 109 (shown as DCX8.l09), time As a function of (time). The line marked “no protein” corresponds to the control assay. In the control assay, the control buffer was added to the apical medium of polarized Caco-2 cells, then the basolateral medium was sampled as a function of time (hours), and the GST assay was performed by ELISA assay. FIG. 8D shows the GST and GST-fusion proteins (P31, P31-l03, PAX2, PAX2.l06, used in the experiments shown in panel AC above, detected by ELISA assay in the apical medium of polarized Caco-2 cells. DCX8, DCX8-l07, DCX8-l09 and GST fusion).
9A-9B. Figures 9A-9B show inhibition of binding of GST-P31 to C2BBe1-fixed cells when the concentration of the competitor is varied while keeping the GST-P31 concentration constant at 0.015 μM; Competitors are ZElan024 (dansylated peptide of P31 (SEQ ID NO: 43)) and ZElan044, ZElan049 and ZElan050 (dansylated fragments of truncated P31 (SEQ ID NO: 43)). Data are presented as (O.D.) vs. (peptide concentration) (FIG. 9A) and (% inhibition of GST-P31 binding) vs. (peptide concentration) (FIG. 9B).
Figures 10A-10C. FIGS. 10A-10C represent a compilation of the results of a competitive ELISA test of (GST-P31, GST-PAX2, GST-SNi10 and GST-HAX42) versus (listed dansylated peptides on immobilized C2BBe1 cells) (“ “Z” refers to ε-aminodansyl lysine). Also included is the pI of the dansylated peptide. Estimated IC₅₀Values are expressed in μM and IC (if any)₅₀The range represents the results of multiple assays. I c₅₀If the value cannot be determined, the symbol “>” or “<” is used. The GST / C2BBe1 column represents GST proteins that bind to fixed C2BBe1 cells.
11A-11B. FIG.11A represents the transport of GST or GST-peptide fusion derivatives from apical to basolateral direction through polarized Caco-2 cells detected by ELISA assay after 0, 0.5, 2 and 4 hours. Are described in detail herein. The proteins used in the assay include GST, GST-P31 fusion, GST-5PAX5 fusion, GST-DCX8 fusion, GST-DCX11 fusion, GST-PAX2 fusion, GST-HAX42 fusion, GST-SNi34 fusion Body and GST-SNi10 fusion. The column labeled “no protein” is the control experiment (0, 0.5, 2 and 4 hours after adding buffer to the apical medium of the cells, and for the corresponding basolateral medium of these cells, the buffer was added. , ELISA assay was performed). FIG. 11B shows that after administering GST or GST-fusion protein derivative to the apical medium of polarized Caco-2, cells were recovered from the transwell and GST or GST fusion in the recovered cell lysate was ELISA Represents the internalization of GST or GST-peptide fusion derivatives into polarized Caco-2 cells as detected by the assay (described in detail herein). The proteins used in this assay include GST, GST-P31 fusion, GST-5PAX5 fusion, GST-DCX8 fusion, GST-DCX11 fusion, GST-PAX2 fusion, GST-HAX42 fusion, GST-SNi34 Fusions and GST-SNi10 fusions are included. The column labeled “No Protein” indicates a control experiment (buffer was added to the apical media of the cells and the corresponding cell lysate of these cells was subjected to an ELISA assay at the end of the experiment).
FIG. Figure 12 shows the binding of GST and GST-fusion protein to immobilized Caco-2 cells and after digestion with protease thrombin (which cuts the recognition site between the GST moiety and the fusion peptide part of the GST fusion protein). Represents the binding of the corresponding protein. The symbol "-" represents a protein that was not digested with thrombin prior to use in the binding assay, and "+" represents a protein that was digested with thrombin prior to use in the binding assay. Protein binding to fixed Caco-2 cells was detected by ELISA assay.
13A-13B. Figures 13A-13B represent binding of peptide-coated nanoparticles to immobilized Caco-2 cells.
14A-14B. 14A-14B show (A) binding of dansylated peptide SNi10 to purified hSI receptor and BSA, and (B) dansylated peptide and peptide loaded insulin-containing PLGS to immobilized C2BBe1 cells. Represents the binding of microparticles. FIG. 14B represents the binding of dansylated peptides corresponding to P31 (SEQ ID NO: 43), PAX2, HAX42 and SNi10 to immobilized C2BBe1 cells and insulin-containing PLGA particles adsorbed with each of these peptides. Data is represented by subtracting the background.
Figures 15A-15B. FIG. 15 represents the binding of peptide-coated particles to A) S100 and B) P100 fractions harvested from Caco-2 cells. A serial dilution of 1: 2 to 1:64 represents a particle concentration of 0.0325 to 0.5 μg / well. Data is represented with background subtracted. These particles are identified as follows: 939, no peptide; 1635, scrambled PAX2; 1726, P31 D-Arg 16-mer (ZElan053); 1756, HAX42; 1757, PAX2; 1758, HAX42 / PAX2 .
16A-16B. FIG. 16 represents the binding of dansylated peptides to the P100 fraction harvested from Caco-2 cells. Peptides were assayed in the range of 0.0032-2.5 μg / well. Data is represented by subtracting the background. A) HAX42, P31 D-type (XElan 053) and mixed PAX2; B) PAX2, HAX42 and mixed PAX2.
Figures 17A-17B. 17A and 17B show (A) insulin levels after intestinal administration of systemic blood glucose and (B) control (PBS); insulin solution; insulin particles; all 8 peptide mixed particles and peptides of the test group of the present invention. Represents particles (100 iu insulin loading).
18A-18B. 18A and 18B show (A) insulin levels after intestinal administration of systemic blood glucose and (B) control (PBS); insulin solution; insulin particles and peptide particles of the test group of the present invention (300 iu insulin addition amount) ).
FIG. FIG. 19 represents the increase in plasma levels of leuprolide after administration of leuprolide loaded P31 (SEQ ID NO: 43) and PAX2 coated nanoparticles compared to subcutaneous injection. Group 1 was injected subcutaneously with leuprolide acetate (12.5 μg). Group 2 received uncoated leuprolide acetate particles (600 μg; 1.5 ml) intraduodenum. Group 3 received leuprolide acetate particles coated with PAX2 (600 μg; 1.5 ml) intraduodenum. Group 4 was administered leuprolide acetate particles coated with P31 (SEQ ID NO: 43) (600 μg, 1.5 ml) intraduodenum.
FIG. FIG. 20 lists the known protein homologies of P31 (SEQ ID NO: 43).
21A-21C. 21A-21C list the known protein homologies of DCX8.
FIG. FIG. 22 lists the known protein homologies of DAB10.
FIG. FIG. 23 shows the DNA sequence of glutathione S-transferase (SEQ ID NO: 211) and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 212) (Smith and Johnson, 1988, Gene 7: 31-40).
5.Detailed Description of the Invention
The present invention relates to proteins (eg, peptides) that bind to GIT transport receptors and nucleic acids encoding such proteins. The invention further relates to fragments and other derivatives of said proteins. Nucleic acids encoding such fragments or derivatives are also included within the scope of the present invention. The invention further relates to fragments (and derivatives and analogs thereof) of GIT transport receptor binding peptides comprising one or more domains of the GIT transport receptor binding peptide.
The present invention also relates to functionally active derivatives of the GIT transport receptor binding proteins and analogs of the present invention, i.e. they are one or more known functional related to full length GIT transport receptor binding peptides. Has the ability to show activity. Such functional activities include, but are not limited to, the ability to bind to GIT transport receptors, antigenic [binding ability to anti-GIT transport receptor binding peptide antibodies (or competition with peptides for binding). Ability)], and immunogenicity (the ability to produce an antibody that binds to a GIT transport receptor-binding peptide).
Also provided is the production of said proteins and derivatives, for example by recombinant methods.
Further provided are antibodies against GIT transport receptor binding proteins, derivatives and analogs.
The invention also relates to therapeutic and diagnostic methods and compositions based on GIT transport receptor binding peptides and nucleic acids.
The invention will now be described by way of example.
For clarity of disclosure and not limitation, the detailed description of the invention is divided into the following subsections:
5.1.GIT transport receptor binding peptides, derivatives and analogs
The present invention relates to peptides that bind GIT transport receptors and derivatives thereof (including but not limited to fragments) and analogs. In certain embodiments of the invention, such peptides that bind to GIT transport receptors include, but are not limited to, amino acid sequences substantially as set forth in Table 7 (SEQ ID NOs: 1-55). ) As a primary amino acid sequence. Nucleic acids encoding such peptides, derivatives and peptide analogs are also provided. In one embodiment, the GIT transport receptor binding peptide is encoded by a nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in Table 8 below (SEQ ID NOs: 56-109). Provided is a protein whose amino acid sequence comprises or consists of SEQ ID NOs: 1-55 or a portion thereof that mediates binding to a GIT transport receptor.
The manufacture and use of derivatives and analogs related to GIT transport receptor binding peptides are within the scope of the present invention. In certain embodiments, the derivative or analog is functionally active, ie, has the ability to exhibit one or more functional activities associated with a full-length GIT transport receptor binding peptide. For example, such derivatives or analogs having the desired immunogenicity or antigenicity can be used in immunoassays, such as for immunization. Certain embodiments relate to GIT transport receptor binding peptide fragments to which anti-GIT transport receptor binding peptide antibodies can bind. In preferred embodiments, the derivative or analog has the ability to bind to a GIT transport receptor. Derivatives or analogs of GIT transport receptor binding peptides are bound to GIT transport receptor domains or Caco-2 cells in vitro or to intestinal tissue in vivo by procedures known in the art. It can be tested for the desired activity, such as binding (see examples below).
In particular, derivatives can be produced by modifying the GIT transport receptor binding peptide sequence by substitutions, additions or deletions that give rise to functionally equivalent molecules. In the practice of the present invention, other nucleotide sequences that encode substantially the same amino acid sequence may be used due to the degeneracy of the nucleotide coding sequence. These include, but are not limited to, nucleotide sequences that are altered by substituting various codons that encode functionally equivalent amino acid residues within the sequence such that silent changes occur. Similarly, the GIT transport receptor binding peptide derivative of the present invention is not limited, but can be changed by substituting residues in the sequence with functionally equivalent amino acid residues so that a silent change occurs. Examples of the primary amino acid sequence such as the sequence that has been prepared include those containing all or part of the amino acid sequence of the GIT transport receptor-binding peptide. For example, one or more amino acid residues in the sequence can be replaced with another amino acid of similar polarity that acts as a functional equivalent to cause a silent change. A substitution of an amino acid within the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
In certain embodiments of the invention, all GIT transport receptor binding peptides consisting of at least 5, 10, 15, 20, 25, 30 or 35 (contiguous) amino acids of the full length GIT transport receptor binding peptide Alternatively, a protein consisting of or comprising a fragment is provided. In certain embodiments, such proteins are no more than 20, 30, 40, 50, or 75 amino acids in length. Derivatives or analogs of the GIT transport receptor binding peptide include, but are not limited to, regions substantially homologous to the GIT transport receptor binding peptide or fragments thereof (eg, at least 50%, 60%, 70% , 80% or 90% identity) (eg, for sequences of the same size or when compared to sequences sequenced by computer homology programs known in the art), or encoding nucleic acid thereof Molecules that have the ability to hybridize to the encoded GIT transport receptor binding peptide sequence under stringent conditions, moderate stringent conditions, or non-stringent conditions.
In certain embodiments, the GIT transport receptor binding derivative of the invention is not a known protein homologous to the GIT transport receptor binding peptide of the invention or a portion thereof.
The GIT transport receptor-binding peptide derivatives and analogs of the present invention can be produced by various methods known in the art. The operations that produce them can occur at the gene or protein level. For example, cloned GIT transport receptor binding peptide gene sequences can be obtained from a number of strategies known in the art (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring. Harbor, New York). The sequence can be cleaved at an appropriate site by a restriction endonuclease, and then further subjected to further enzymatic modification as desired, and can be isolated and ligated in vitro. In the preparation of a gene encoding a derivative or analog of a GIT transport receptor binding peptide, the modified gene is interrupted by a translation stop signal in the gene region encoding the desired GIT transport receptor binding peptide activity. Care should be taken to ensure that they remain within the same translation reading frame that is not.
In addition, nucleic acid sequences encoding GIT transport receptor binding peptides can be mutated in vitro or in vivo to create and / or destroy translation, initiation and / or termination sequences, or mutations in the coding region. Further in vitro modifications can be facilitated by creating and / or forming new restriction endonuclease sites or destroying preexisting sites. Without limitation, chemical mutagenesis, in vitro site-directed mutagenesis (Hutchinson, C. et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), TAB® linker (Pharmacia) Any technique for mutagenesis known in the art can be used, such as use, use of PCR primers containing mutations for use in amplification.
Manipulation of GIT transport receptor binding peptide sequences can also be performed at the protein level. The scope of the invention includes, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibody molecules or other cells during or after translation or chemical synthesis. GIT transport receptor binding peptide fragments or other derivatives or analogs that are specifically modified, such as by binding to a ligand, are included. Any of a number of chemical modifications such as but not limited to cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH_FourSpecific chemical cleavage by: acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin may be performed by known techniques. In certain embodiments, the amino- and / or carboxy-terminus is modified.
Furthermore, GIT transport receptor binding peptides and analogs and derivatives thereof can be chemically synthesized. For example, peptides corresponding to all or part of a GIT transport receptor binding peptide containing a desired domain or mediating a desired activity in vitro can be synthesized by using a peptide synthesizer. Furthermore, if desired, nonclassical amino acids or chemical amino acid analogs can be introduced as substitutions or additions to the GIT transport receptor binding peptide sequence. Non-classical amino acids include, but are not limited to, the normal amino acid D-isomer, α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, γ-Abu, ε-Ahx, 6- Aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropionic acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, sarcosine, citrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, β -Alanine, fluoro-amino acids, and designer amino acids such as β-methyl amino acids, Cα-methyl amino acids, Nα-methyl amino acids and amino acid analogs in general. Furthermore, the amino acid may be D (dextrorotatory) or L (left-handed).
In certain embodiments, the GIT transport receptor binding peptide derivative is a chimeric or fusion peptide and is bound to its amino- or carboxy-terminus via a peptide linked to the amino acid sequence of a different peptide. Binding peptide or fragment thereof (preferably at least one domain or motif of a GIT transport receptor binding peptide, or at least 6, 10, 15, 20, 25, 30 or all of GIT transport receptor binding peptides An amino acid or a binding part thereof). In one embodiment, such chimeric peptides are made by recombinant expression of a nucleic acid encoding the protein (including a transport receptor coding sequence linked in frame to a coding sequence of a different protein). Such a chimeric product is obtained by linking appropriate nucleic acid sequences encoding the desired amino acid sequence together in the proper coding frame by methods known in the art, and by chimeric methods generally known in the art. Can be produced. Such chimeric products can also be produced by protein synthesis techniques such as the use of peptide synthesizers. A chimeric gene may be constructed that includes a portion of the GIT transport receptor fused to any heterologous protein coding sequence. A particular embodiment relates to a chimeric protein comprising a fragment of a GIT transport receptor binding peptide consisting of at least 6 amino acids.
In another specific embodiment, the GIT transport receptor binding peptide derivative is a molecule comprising a region homologous to the GIT transport receptor binding peptide. As an example, in various embodiments, when the amino acid sequence of the first protein region is compared to any sequence in the second region consisting of a number of amino acids equal to the number contained in the first protein region Or at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% when compared to the sequence of a second region (sequenced sequence) sequenced by computer homology programs known in the art , 80%, 90%, or 95% identical, a first protein region can be considered “homologous” to a second protein region. For example, a molecule can include one or more regions that are homologous to a GIT transport receptor binding peptide domain (see below) or a portion thereof.
The GIT transport receptor binding protein and derivatives thereof of the present invention are bound by appropriate in vivo or in vitro assays as described in the examples below and / or as known to those skilled in the art. It can be assayed for activity.
Other specific embodiments for derivatives and analogs are described in the subsections below and in the Examples section below.
5.2.GIT transport receptor binding peptide motif / derivative containing one or more domains of GIT transport receptor binding protein
In certain embodiments, the present invention relates to GIT transport receptor binding peptide derivatives and analogs, particularly GIT transport receptor binding peptide fragments and derivatives of such fragments, wherein one of the GIT transport receptor binding peptides is Contain or consist of one or more domains. In particular, examples of such domains are identified in the examples below.
5.3.Peptide synthesis
The peptides and derivatives of the invention can be synthesized chemically or using recombinant DNA technology.
5.3.1Solid phase synthesis method
Peptides can be chemically prepared by methods known in the art. For example, in brief, solid phase peptide synthesis consists of coupling the carboxyl group of the C-terminal amino acid to a resin and continuously adding N-α protected amino acids. The protecting group can be any known in the art. Before each new amino acid is added to the extended chain, the protecting group of the amino acid previously added to the chain is removed. Coupling of amino acids to suitable resins is described in US Pat. No. 4,244,946 to Rivier et al. Such solid phase synthesis is described, for example, by Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Vale et al., 1981, Science 213: 1394-1397; Marki et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. .103: 3178, and U.S. Pat. Nos. 4,305,872 and 4,316,891. In a preferred embodiment, an automatic peptide synthesizer is used.
By way of example but not limitation, peptides can be synthesized on an Applied Biosystems Inc. (“ABI”) model 431A automated peptide synthesizer using the “Fastmoc” synthesis protocol provided by ABI. This is a coupling agent with 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (“HBTU”) (R. Knorr et al., 1989, Tet. Lett., 30: 1927). The synthesis consists of commercially available 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl- (9-fluorenyl-methoxycarbonyl) -aminomethyl) -phenoxypolystyrene resin (“Rink resin” from Advanced ChemTech) (H. Rink, 1987, Tet. Lett. 28: 3787) can be carried out on 0.25 mmol. Fmoc amino acid (1 mmol) is coupled according to the Fastmoc protocol. The following side chain protected Fmoc amino acid derivatives are used: FmocArg (Pmc) OH; FmocAsn (Mbh) OH; FmocAsp (^tBu) OH; FmocCys (Acm) OH; FmocGlu (^tBu) OH; FmocGln (Mbh) OH; FmocHis (Tr) OH; FmocLys (Boc) OH; FmocSer (^tBu) OH; FmocThr (^tBu) OH; FmocTyr (^tBu) OH (abbreviation: Acm, acetamidomethyl; Boc, tert-butoxycarbonyl;^tBu, tert-butyl; Fmoc, 9-fluorenylmethoxycarbonyl; Mbh, 4,4'-dimethoxybenzhydryl; Pmc, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl; Tr, Trityl).
The synthesis is performed using N-methylpyrrolidone (NMP) as a solvent with HBTU dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF). Deprotection of the Fmoc group is performed using an approximately 20% NMP solution of piperidine. At the end of each synthesis, the amount of peptide present is assessed by UV spectroscopy. Weigh a sample of dry peptide resin (about 3-10 mg) and then add 20% DMA solution (10 ml) of piperidine. After sonication for 30 minutes, the UV (ultraviolet) absorbance of the dibenzofulvene-piperidine adduct (formed by cleavage of the N-terminal Fmoc group) is recorded at 301 nm. Peptide substitution (mmol g^-1) Equation:

[Wherein, A is the absorbance at 301 nm, v is the volume (ml) of 20% DMA solution of piperidine, 7800 is the extinction coefficient (mol of dibenzofulvene-piperidine adduct)^-1dm^Threecm^-1) And w is the weight (mg) of the peptide-resin sample. ]
Can be calculated by:
Finally, the N-terminal Fmoc group is cleaved using 20% DMA solution of piperidine and then acetylated using DMA solution of acetic anhydride and piperidine. Peptide resin DMA, CH₂Cl₂And finally wash thoroughly with diethyl ether.
5.3.2.Cutting and deprotection
By way of example but not limitation, cleavage and deprotection can be performed as follows. The air dried peptide resin is treated with ethyl methyl sulfide (EtSMe), ethanedithiol (EDT), and thioanisole (PhSMe) for about 20 minutes before adding 95% aqueous trifluoroacetic acid (TFA). These reagents are used in a total volume of 50 ml per gram of peptide resin. Used in the following ratio: TFA: EtSMe: EDT: PhSMe (10: 0.5: 0.5: 0.5). N mixture₂Stir at room temperature for 3 hours under atmosphere. The mixture is filtered and the resin is washed with TFA (2 × 3 ml). The filtrates are combined and concentrated under reduced pressure, and anhydrous diethyl ether is added to the yellow / orange resin. The resulting white precipitate is isolated by filtration. See King et al., 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255-266 for various cleavage methods.
5.3.3.Peptide purification
Purification of the synthesized peptide can be accomplished by standard methods such as chromatography (eg, ion exchange, affinity and sizing column chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC)), centrifugation, differential solubility, or any other Can be done by standard techniques.
5.3.4.Biological peptide library
By using biological peptide libraries, peptides that bind to GIT transport receptors can be expressed and identified. According to this second approach involving recombinant DNA technology, peptides can be expressed in biological systems such as, for example, soluble fusion proteins or viral capsid proteins.
5.3.4.1.Methods for identifying binders: library construction
In certain embodiments, a peptide of the invention that specifically binds to a GIT transport receptor comprises a random peptide library comprising HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI (or essentially an extracellular domain thereof or a fragment of that domain). The library is identified by screening said library by contacting a ligand selected from said molecule and identifying members of the library that specifically bind to said ligand.
In certain embodiments, the method for identifying peptides of the present invention utilizes a library of recombinant vectors constructed by methods well known in the art, such as accessible vector surface structures. A member that screens libraries of recombinant vectors that express inserted synthetic oligonucleotide sequences encoding extracellular GIT transport receptor domains bound to proteins to produce peptides that bind to HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI Isolating. Identify the binding domain that binds the selected ligand (eg HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI) by determining the nucleic acid sequence of the insert synthetic oligonucleotide of the isolated vector and deducing the encoded amino acid sequence Can do.
The present invention relates to a method for identifying a peptide that binds to a ligand selected from HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI, wherein a library of random peptides is liganded using said ligand (or its extracellular domain or fragment). Including said method comprising screening under conditions leading to binding and isolating peptides that bind to said ligand. The method of the present invention further includes determining a nucleotide sequence encoding a binding domain of the identified peptide to estimate an amino acid sequence of the binding domain.
5.3.4.2.Preparation of extracellular domain ligand
In certain embodiments, a random peptide library is screened for binding thereto using a molecule consisting essentially of the extracellular domain or fragment of the extracellular domain of the desired GIT transport receptor. Preferably, the nucleic acid encoding the extracellular domain is cloned, recombinantly expressed, and then the domain is purified for use. The GIT transport receptor is preferably selected from HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI.
5.3.4.3.Methods for identifying binders: library screening
Once an appropriate random peptide library has been constructed (or obtained), the library is screened to identify peptides with binding affinity for GIT transport receptors such as HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI. In a preferred embodiment, this library is referred to the TSAR library (US Pat. No. 5,498,538, Mar. 12, 1996 and PCT International Publication No. WO 94/18318, Aug. 18, 1994. Both are referenced. Is included in this specification.). Library screening can be performed by any of a variety of methods known to those skilled in the art. See, for example, the following references that disclose screening of peptide libraries: Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249: 386 -390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76: 933-945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577-580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850 -852; U.S. Patent No. 5,096,815, U.S. Patent No. 5,223,409 and U.S. Patent No. 5,198,346 (all Ladner et al.); And Rebar and Pabo, 1993, Science 263: 671-673. See also PCT International Publication No. WO94 / 18318 dated August 18, 1994.
One skilled in the art will recognize that, with appropriate modifications, the following screening methods are suitable for a wide range of biological expression libraries.
Once the library is constructed or acquired, it has specific binding affinity for ligands for GIT transport receptors, preferably selected from HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI by screening the library Identify binding molecules.
Library screening can be performed by any of a variety of methods known to those skilled in the art. An exemplary screening method is described in Fowlkes et al., 1992, BioTechniques, 13: 422-427, which involves contacting the vector with an immobilized target ligand and collecting a vector that binds to the ligand. . Such useful screening methods are called “panning” methods. In panning methods useful for screening the library, the target ligand can be immobilized on plates, beads (such as magnetic beads), sepharose, beads used in columns, and the like. If desired, the immobilized target ligand can be “tagged” with a label such as biotin, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, for example, for FACS sorting. The panning method is also disclosed in Parmley, S.F. and Smith, G.P., 1988, Gene 73: 305-318.
In certain embodiments of the invention, the library can be screened using the recombinant receptor domain. In another embodiment, the library can be screened sequentially using the receptor domain and then on CaCO-2 cells.
For in vitro peptide library screening, the conditions required for the solvents involved in the screening are not limited to aqueous solvents, thus utilizing non-physiological binding interactions and conditions different from those found in vivo. can do.
Library screening can be performed using a method that includes a first “enrichment” step and a second filter lift as described below. The following description is given by way of example and not limitation.
Binders from expressed libraries (eg, within phage) that have the ability to bind to a given ligand (eg, within a phage) are first enriched by one or two cycles of panning or affinity chromatography. Microtiter wells are passively coated with a ligand (eg, about 10 μg in 100 μl). The wells are then blocked with a solution of BSA to prevent non-specific attachment of the library phage to the plastic surface. For example, about 10 expressing the peptide afterwards¹¹Individual phage particles are added to the wells and incubated for several hours. Unbound phage are removed by repeated washing of the plate, and specifically bound phage are eluted using acidic glycine-HCl solution or other elution buffer. The eluted phage solution is neutralized with an alkali, infected with, for example, E. coli, and amplified by plating on a large petri dish containing agar supplemented with Luria gravy (LB). The amplified culture expressing the binding peptide is then titrated and the process is repeated. Alternatively, the ligand may be covalently bound to agarose or acrylamide beads using commercially available activated bead reagents. The phage solution is then simply passed through a small column containing the bound bead matrix, and then thoroughly washed and eluted with acid or other eluent. In both cases, the goal is about 1/10 of positives.^FiveEnrichment to a higher frequency.
After enrichment, a filter lift assay is performed. For example, when a specific binder is expressed in a phage, about 1-2 × 10^FiveIndividual phages are added to 500 μl log phase E. coli and plated on large Luria broth-agarose plates containing 0.7% agarose in the broth. The agarose is solidified and a nitrocellulose filter (eg 0.45μ) is placed on the agarose surface. Place a series of alignment marks with a sterile needle and replace the filter and plate again after growth as described below. Phage plaques are grown by incubating overnight at 37 ° C. (the presence of filters does not inhibit this process). The filter is then removed from the plate with phage from individual plaques attached in situ. The filter is then exposed to a solution of BSA or other blocking agent for 1-2 hours to prevent non-specific binding of the ligand (or “probe”).
The probe itself is labeled, for example, by biotinylation (using commercially available NHS-biotin) or direct enzyme labeling, for example with horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Probes labeled in this manner are always stable and can be reused several times. By exposing the blocked filter to a solution of the probe for several hours, the probe is bound in situ to the phage on the filter to display peptides with significant affinity to the probe. The filter is then washed to remove unbound probe and then developed by exposure to enzyme substrate solution (for directly labeled probes) or further exposed to a solution of enzyme labeled avidin (for biotinylated probes) ). Positive phage plaques are identified by local precipitation of colored enzyme cleavage products on the filter corresponding to the plaques on the original plate. The developed filter is simply placed back on the plate using the alignment mark and the “positive” plaques are removed from the agarose and the phages are recovered. Because the plaques on the original plate are dense, it may be difficult to isolate a single plaque from the plate in the first round. Thus, the phage recovered from the initial core can be re-plated at low density, and the process can be repeated to isolate individual plaques and thus a single clone of a single phage clone. Separation is possible.
Satisfactory screening experiments are performed optimally by using three rounds of continuous screening. The collected cells are then plated at low density to obtain isolated colonies for individual analysis. Individual colonies are selected and used to inoculate LB culture medium containing ampicillin. After overnight culture at 37 ° C., the culture is separated by centrifugation. The individual cell aliquots are then retested for binding to the target ligand bound to the beads. Binding to other beads conjugated with unrelated ligands can be used as a negative control.
One embodiment of library screening is elution. The following considerations are applicable to any system in which random peptides are expressed on surface fusion molecules. Conditions that interfere with peptide-target interactions during phage recovery are believed to be specific for all given peptide sequences from multiple proteins expressed on the phage. For example, certain interactions can be hampered by acidic pH but not at basic pH, and vice versa. Thus, various elution conditions (including but not limited to pH 2-3, pH 12-13, excessive targets in competition, detergents, mild protein denaturants, urea, temperature changes, light, presence of metal ions The elution conditions suitable for each ligand / binding protein combination by comparing the primary structure of the binding protein expressed on the phage recovered for each set of conditions. It may be desirable. Some of these elution conditions are bactericidal and may be incompatible with phage infection because they need to be removed by dialysis (ie dialysis bags, Centricon / Amicon microconcentrator).
In a preferred embodiment, phage expressing peptides that bind to the GIT transport receptor are selected by screening a phage display library of random peptides. Preferably, the first step is to isolate a preselected phage library. A “preselected phage library” is a library consisting of a subpopulation of phage display libraries. This subpopulation can be formed by first screening against the receptor (or its domain) so that a subpopulation of phage that specifically binds to the target GIT transport receptor can be selected. is there. Alternatively, the subpopulations specifically bind to a target cell or target cell type or target tissue or target tissue barrier of the gastrointestinal tract, or target cell or target cell type or target tissue or target tissue in situ or in vivo. Screen against target cells or cell types or tissue types or tissue barriers so that a sub-population of phage can be selected that binds to and / or is transported across (or between) them Can be formed. This preselected phage library or selected subpopulation of phage can also be rescreened against the target GIT transport receptor, the GIT transport receptor or target cell or target cell type or target tissue or Subpopulations of phage that bind to the target tissue barrier or that bind to and / or transport across the target cell, target tissue or target tissue barrier in situ or in vivo can be further selected. Such re-screening can be repeated 0-30 times, each successive “preselected phage library” being one that produces additional preselected phage libraries.
In a preferred embodiment, a preselected phage library that binds a ligand that is a GIT transport receptor, preferably selected from HPT1, hPEPT1, D2H, or hSI, is obtained by the in vitro screening process described above. Yes, then the phage is optionally further characterized using an in vitro assay, or an in vivo assay consisting of binding the phage directly to the receptor domain of interest or Caco-2 cells. In another preferred embodiment, an in vivo assay that measures uptake of phage by intestinal tissue or by GIT is used. In another embodiment, such additional in vitro or in vivo assays can be used as an initial screening step.
In vivo assays that can be used are described in the examples below.
5.4.Production of antibodies against GIT transport receptor-binding peptides and their derivatives
According to the present invention, GIT transport receptor binding peptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs thereof can be used as immunogens to produce antibodies that immunospecifically bind such immunogens. Is. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and Fab expression libraries.
Various procedures known in the art can be used to produce polyclonal antibodies to GIT transport receptor binding peptides or derivatives or analogs. For the production of antibodies, various host animals, such as, but not limited to, rabbits, mice, rats, chickens, etc., can be obtained from natural GIT transport receptor binding peptides, or synthetic types or derivatives thereof (eg, Immunization can be achieved by injection of the fragments. Depending on the host species, for example (but not limited to) Freund (complete and incomplete), inorganic gels such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, By using surface active substances such as dinitrophenol and various adjuvants such as potentially useful human adjuvants such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum, the immune response can be increased.
For the preparation of monoclonal antibodies against GIT transport receptor binding peptides or analogs thereof, any technique that results in the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture can be used. For example, producing hybridoma technology, trioma technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) originally developed by Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497), and human monoclonal antibodies EBV hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). In a further embodiment of the invention, monoclonal antibodies can be produced in sterile animals utilizing state of the art technology (PCT / US90 / 02545). According to the invention, human antibodies can be used, which can be used by using human hybridomas (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) or in vitro. It can be obtained by transforming human B cells with EBV virus (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). According to the present invention, for the production of a “chimeric antibody” by splicing a gene derived from a mouse antibody molecule specific for a GIT transport receptor binding peptide and a gene derived from a human antibody molecule having an appropriate biological activity. The developed technology (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) Can be used.
According to the present invention, techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) can be adapted for the production of GIT transport receptor binding peptide specific single chain antibodies. Other embodiments of the invention utilize GIT transport receptor binding peptides, derivatives, or derivatives by utilizing techniques described for the construction of Fab expression libraries (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281). It allows rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity for the analogue.
Antibody fragments containing the idiotype of the molecule can be produced by known techniques. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules.₂Fragment; F (ab ’)₂Fab 'fragments that can be generated by reducing the disulfide bridges of the fragments, Fab fragments that can be generated by treating antibody molecules with papain and a reducing agent, and Fv fragments.
In the production of an antibody, screening for a desired antibody can be performed by a technique known in the art, for example, ELISA (solid phase enzyme immunoassay). For example, to select an antibody that recognizes a particular domain of a GIT transport receptor binding peptide, assaying the resulting hybridoma for products that bind to a GIT transport receptor binding peptide fragment containing such domain. it can.
Antibodies specific for the domain of the GIT transport receptor binding peptide are also provided.
Such antibodies are known in the art for the localization and activity of the GIT transport receptor binding peptide sequences of the invention, such as imaging after in vivo administration of these peptides (eg, monitoring therapeutic efficacy). Therefore, it can be used in the measurement of its level in an appropriate physiological sample, diagnostic methods, etc. For example, by using an antibody or antibody fragment specific to a domain of a GIT transport receptor binding peptide, or a derivative of a peptide such as a dansyl group or some other epitope introduced into the peptide, 1) nanoparticles or other Confirming the presence of the peptide in the substrate; 2) quantifying the amount of peptide in the nanoparticles; 3) measuring the level of peptide in the appropriate physiological sample; 4) performing immunohistology in the tissue sample 5) imaging the peptide after in vivo administration; 6) purifying the peptide from the mixture using an immunoaffinity column; or 7) binding or immobilizing the peptide on the surface of the nanoparticles. This last use envisions binding of the antibody (or antibody fragment) to the surface of a drug-loaded nanoparticle or other substrate and then incubating the conjugate with the peptide. This method results in peptide binding in a fixed direction, resulting in particles containing the peptide bound to the antibody so that the peptide is sufficiently active.
GIT transport receptor binding peptide domains or abstides specific to peptide derivatives such as dansyl groups or any other epitope introduced into the peptide [ie, antigen binding peptides (Antigenbinding peptides)] Can be used for the same seven purposes as confirmed above for antibodies.
5.5.Assays for GIT transport receptor binding peptides, derivatives and analogs
The functional activity of GIT transport receptor binding peptides, derivatives and analogs can be assayed by various methods.
In preferred embodiments (which assay for binding to the GIT transport receptor), this binding can be performed in an in vivo or in vitro assay as described in the examples below, or other known in the art. It can be assayed by this method.
In another embodiment (which assay for the ability to bind or compete with a full-length GIT transport receptor binding peptide for binding to an anti-GIT transport receptor binding peptide antibody), a variety of known in the art. Immunoassays such as, but not limited to, radioimmunoassays, ELISA (solid phase enzyme immunoassay), “sandwich” immunoassays, immunoradiometric assays, gel diffusion precipitation reactions, immunodiffusion assays, in situ immunoassays (eg colloidal gels) , Using enzyme or radioisotope labels), Western blots, precipitation reactions, agglutination assays (eg gel aggregation assays, hemagglutination assays), complement binding assays, immunofluorescence assays, protein A assays, immunoelectrophoresis assays, etc. Competitive and non-competitive app A sei system or the like can be used. In one embodiment, antibody binding is detected by detecting a label on the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by detecting binding of a secondary antibody or reagent to the primary antibody. In yet another embodiment, the secondary antibody is labeled. Many methods are known in the art for detecting binding in an immunoassay and are within the scope of the present invention.
Other methods are known to those skilled in the art and are within the scope of the present invention.
5.6Application
The present invention provides a composition comprising the GIT transport receptor binding protein of the present invention bound to a material containing an active ingredient. Such compositions are used to target the active ingredient to the GIT and / or to allow the active ingredient to be transferred to the systemic circulation via the lumen of the GIT. When the active ingredient is a contrast agent, the composition can be administered to image GIT (or a specific transport receptor for GIT) in vivo. Other active ingredients include, but are not limited to: any drug or antigen loaded, or any drug or antigen capable of eliciting a biological response in the human or animal body, Alternatively, nanoparticles, microparticles, liposomes, or micelles encapsulating drugs or antigens. Examples of preparations loaded with drugs or antigens or encapsulated drugs or antigens are those in which the active ingredient is encapsulated or loaded in nanoparticles or microparticles such as biodegradable nanoparticles or microparticles A GIT transport receptor binding protein or a derivative or analog thereof is adsorbed, coated, or directly linked to the surface of the nanoparticle or microparticle by binding or binding via a linking moiety. It has been done. Further, the protein, derivative, or analog can form a nanoparticle or microparticle itself, or the protein, derivative, or analog is loaded with a biodegradable nanoparticle or microparticle, or drug. Or can be covalently attached to the polymer or polymers used in the manufacture of the drug encapsulated nanoparticles or microparticles, or the peptide can be conjugated directly to the active ingredient. As a conjugation with such an active ingredient, there is a fusion protein, and in order to produce the fusion protein, a gene or cDNA encoding a therapeutic peptide or protein is converted to a DNA sequence encoding the peptide. It is fused in frame so that the modified gene encodes the recombinant fusion protein.
In preferred embodiments, the present invention provides for the treatment of various diseases and disorders by administration of therapeutic compounds (referred to herein as “therapeutic agents”). Such “therapeutic agents” include, but are not limited to: GIT transport receptor binding proteins that bind to GIT transport receptors, and analogs and derivatives (including fragments) (eg, as described above) In combination with an active ingredient useful for the treatment or prevention of a disease or disorder (preferably a mammal, most preferably a human disease or disorder). Therapeutic agents also include, but are not limited to, nucleic acids encoding GIT transport receptor binding proteins, analogs, or derivatives conjugated with therapeutic or prophylactic active ingredients. The active ingredient is preferably a drug.
Any drug known in the art can be used, depending on the disease or disorder to be treated or prevented, and on the type of subject to whom the drug is administered. The term “drug” as used herein includes any pharmaceutically active ingredient and is not limited. Typical drugs include peptides or proteins, hormones, analgesics, anti-migraine agents, anticoagulants, antiemetics, cardiovascular agents, antihypertensive agents, narcotic antagonists, chelating agents, antianginal agents, chemicals Examples include, but are not limited to, therapeutic agents, sedatives, anticancer agents, prostaglandins, and antidiuretics. Typical drugs include insulin, calcitonin, calcitonin gene regulatory protein, atrial natriuretic protein, colony stimulating factor, betatheron, erythropoietin (EPO), interferons such as alpha, beta, or gamma interferon, somatropin, somatotropin, somatostatin, Insulin-like growth factor (somatomedin), luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH), tissue plasminogen activator (TPA), growth hormone-releasing hormone (GHRH), oxytocin, estradiol, growth hormone, leuprolide acetate, factor VIII, inter Peptides, proteins or hormones such as interleukins such as leukin-2 and analogs thereof; fentanyl, sufentanil, butorphanol, buprenor Analgesics such as vin, levorphanol, morphine, hydromorphone, hydrocodone, oxymorphone, methadone, lidocaine, bupivacaine, diclofenac, naproxen, paverine, and their analogs; anti-biased such as heparin, hirudin, and their analogs Anti-coagulants such as scopolamine, ondansetron, domperidone, etoclopramide, and analogs thereof; diltiazem, clonidine, nifedipine, verapamil, isosorbide 5-mononitrate, organic nitrate, drugs used for cardiac disorders and the like Cardiovascular agents, antihypertensives and vasodilators such as analogs of sedatives; sedatives such as benzodiazepines, phenothiazines, and analogs thereof; narcotic antagonists such as naltrexone, naloxone, and analogs thereof; Chelating agents such as min and its analogs; antidiuretics such as desmopressin, vasopressin and their analogs; antianginal agents such as nitroglycerin and its analogs; 5-fluorouracil, bleomycin, and the like Anti-cancer agents such as the body; prostaglandins and analogs thereof; and chemotherapeutic agents such as vincristine and analogs thereof.
Representative agents also include antisense oligonucleotides, genes, gene correcting hybrid oligonucleotides, ribozymes, aptameric oligonucleotides, triple helix forming oligonucleotides, signal transduction pathway inhibitors, Examples include, but are not limited to, tyrosine kinase inhibitors and DNA modifying agents. Also usable as drugs are viral systems for the delivery of therapeutic genes such as adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, herpes simplex virus, Sindbis virus, liposomes, cationic lipids, dendrimers. ), And systems containing gene therapeutics such as enzymes, but are not limited thereto. For example, the targeting peptide can be expressed on the surface of a gene delivery virus and modified to allow targeted gene delivery.
In preferred embodiments, the therapeutic agent is administered therapeutically or prophylactically to a human patient.
Additional sources and sources of therapeutic agents that can be used in accordance with the present invention are described in the sections of this specification.
5.7Therapeutic / prophylactic administration, composition and formulation
The present invention provides a method of treatment (and prevention) by administering to a subject an effective amount of the therapeutic agent of the present invention. In a preferred embodiment, the therapeutic agent is substantially purified. The subject is preferably an animal, including but not limited to cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs and others, preferably mammals, most preferably humans.
As will become clear in the future, providing a drug systemically in vivo or targeting a drug to GIT in vivo (by binding to the GIT transport receptor binding protein of the present invention, its derivatives, and analogs) Any disease or disorder that responds to) can be treated or prevented by administration of the therapeutic agents of the present invention. Such diseases include, but are not limited to, high blood pressure, diabetes, osteoporosis, hemophilia, anemia, cancer, migraine, and angina.
Any route of administration known in the art can be used, including oral, nasal, topical, intravenous, intraperitoneal, intradermal, mucosal, intrathecal, intramuscular, etc. It is not limited to. Preferably, the route of administration is oral; in such embodiments, the GIT transport receptor binding protein, derivative or analog of the invention is directed to the systemic circulation via the GIT lumen of the therapeutic active ingredient. It works advantageously to facilitate transportation.
The present invention also provides therapeutic compositions / formulations. In certain embodiments of the invention, the subject GIT transport receptor binding peptide or motif is associated with a therapeutically or prophylactically active ingredient, preferably a drug or a nanoparticle or microparticle containing the drug. Yes. More preferably, it is a nanoparticle or microparticle such as a biodegradable nanoparticle or microparticle encapsulating a drug or loaded with a drug, in which the peptide is physically adsorbed, Coated or directly linked or linked by a covalent bond such as via a linking moiety and bound on the surface of the nanoparticle or microparticle. Alternatively, the peptides can be formed to be nanoparticles or microparticles themselves, or can be conjugated directly to the active ingredient. Such a conjugation includes a fusion protein. To produce the fusion protein, a DNA sequence encoding the peptide is fused in frame to a gene or cDNA encoding a therapeutic peptide or protein. The modified gene encodes a recombinant fusion protein in which a “targeting” peptide is fused to a therapeutic peptide or protein, and the “targeting” peptide is derived from the GIT of the fusion protein. Increase the adsorption of Preferably the particle size is in the range of 200-600 nm.
Thus, in certain embodiments, the GIT transport receptor binding protein can be conjugated to a sustained release (controlled release) mechanism that contains the drug. In certain embodiments, polymeric materials can be used (Medical Applications of Controlled Release, Ed. Langer and Wise, CRC Pres., Boca Raton, Florida, USA (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball, Wiley, New York, USA (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. .71: 105 (1989)).
The present invention also provides a pharmaceutical composition. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of a therapeutic agent and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the term “pharmaceutically acceptable” is more specifically identified by federal or state government pharmacy departments, or by the United States Pharmacopeia or other generally accepted animals. For example, what is described in the pharmacopoeia for human use. The term “carrier” means a solvent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. As such a pharmaceutical carrier, a sterile liquid such as water or oil can be used, and the oil is derived from petroleum, originated from animals, plants or synthetics, such as peanut oil, soybean oil. , Mineral oil, sesame oil, and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions, aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry skim milk powder, glycerol , Propylene, glycol, water, ethanol, and the like. If desired, the composition can contain minor amounts of wetting, emulsifying, or pH buffering agents. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be made into a suppository using binders and carriers such as triglycerides conventionally used. Oral formulations can contain standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in “Remington ’s Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin. Such compositions provide a form suitable for administration to a patient by including a therapeutically effective amount of the therapeutic agent, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier. It will be.
The therapeutic agents of the present invention can be in neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include salts formed with free amino groups with hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, etc., and sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, isopropylamine, triethylamine, Examples include salts formed with 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine and the like and a free carboxyl group.
The amount of the therapeutic agent of the present invention that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will vary with the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays can be used to define optimal dosage ranges. The exact amount to be used in a formulation will depend on the route of administration and the severity of the disease or disorder and should be determined according to the judgment of the practitioner and the circumstances of each patient.
6.Example
6.1GIT receptor target selection
HPT1, hPEPT1, D2H and hSI receptors were selected for cloning as GIT receptor targets based on several criteria. The criteria are: (1) expressed on the surface of the epithelial cells of the gastrointestinal tract (GIT); (2) expressed along the long axis of the small intestine (HPT1, hPEPT1, D2H); (3) local Expressed at high concentrations (hSI); (4) a large putative extracellular domain faces the lumen of the GIT; and (5) extracellular that facilitates targeting particle access and bioadhesion That there is a domain.
The four recombinant receptor sites screened in the peptide library further have the following characteristics:

Figures 1-4 (SEQ ID NOs: 176, 178, 179, and 181 respectively) show the predicted amino acid sequences of hPEPT1, HPT1, hSI, and D2H, respectively.
6.2.Cloning of the extracellular domain of selected receptor sites
The following receptor domains were cloned and expressed as His-tag fusion proteins by standard techniques.
Receptor          Domain (amino acid residue)
hPEPT1^a         391-571
HPT1^b           29-273
hSI^c            272-667
D2H^d            387-685
a Liang et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 6456-6463
b Dantzig et al., 1994, Association of Intestinal Peptide Transport with a Protein Related to the Cadherin Superfamily
c Chantret et al., Biochem. J.285: 915-923
d Bertran et al., J. Biol. Chem. 268: 14842-14949
The receptor protein was expressed as a His-tag fusion protein and purified using pET His-tag metal chelate affinity for Ni-NTA agarose under denaturing conditions with urea or guanidine hydrochloride (Hochuli, E., metal chelate adsorption). Purification of recombinant proteins with metal chelate adsorbent, Genetic Engineering, Principals and Methods (edited by JK Setlow), Plenum Press, New York, USA, Vol. 12 (1990), pp. 87- 98).
6.3Phage library
Three phage libraries, DC8, D38, and DC43 expressing an N-terminal pIII fusion in M13, were used to identify peptides that bind to the GIT receptor. The D38 and DC43 libraries are made up of 37 and 43 random amino acid domains, respectively, and have already been described (McConnell et al., 1995, Molecular Diversity, 1: 165-176). In the DC8 library, random inserts are 8 amino acids long and each end is adjacent to a cysteine residue (ie CX₈C) Similar to the other two libraries except that
6.4Biopanning
For the GIT receptor, biopanning is performed by a nearly standard method (McConnell et al., 1995, Molecular Diversity, 1: 165-176).^Tenpfu), D38 and DC43 (1X10¹¹pfu) 3 rounds with a mixture of phage libraries. After each round of panning, the percentage of phage recovered was measured. After the first two rounds of panning, the eluted phage was amplified overnight. Phages from the third round of panning were removed from the plates, 100 plaques were picked and amplified overnight, and screened by binding to the relevant receptor and BSA by ELISA. After analysis of the data, phage clones were identified that showed high absorption in the ELISA assay and / or better binding to the target compared to binding to BSA. Insulin degrading enzyme (IDE) and recombinant human tissue factor (hTF) were used as unrelated controls. The standard panning technique was made with some modifications described below. The selection or panning method was performed according to one of two strategies. The first strategy is to pan the mixed library on specific GIT receptors adsorbed on the solid surface. The second strategy is to pan the library twice against the GIT receptor and then pan against Caco-2 cells (Peterson and Mooseker, 1992, J. Cell Science 102: 581-600). The selection method reflects the clone nomenclature and is as follows.
S indicates that the clone was identified by binding to the hS1 receptor domain.
D indicates that the clone was identified by binding to the D2H receptor domain.
P indicates that the clone was identified by binding to the PEPT1 receptor domain.
H indicates that the clone was identified by binding to the HPT-1 receptor domain.
Phages designated Ni were obtained from the solid phase band of the GIT receptor pan using the standard method plus Ni-NTA Agarose (Qiagen, Chatworth, Calif., USA). The receptor-coated plate was blocked with 0.5% BSA / PBS containing 160 μl Ni-NTA agarose and the library was panned in the presence of 50 μl Ni-NTA agarose. The receptor protein was expressed as a His-tag fusion protein. His-tag has high affinity for Ni-NTA agarose. Blocking the plate and panning in the presence of Ni-NTA agarose can minimize binding of the phage to the His-tag portion of the recombinant receptor.
The phage labeled AX was eluted with acid and factor Xa. The phage is first subjected to standard acid elution followed by Factor Xa (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA: 300 μl 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂Was added to the panning plate and incubated for 2 hours. The phage eluted in two ways were pooled and then plated.
Phages designated AB were eluted with acid and base. Phages were eluted first by standard acid elution, then 100 mM triethylamine (pH 12.1) was added to the panning plate. The phage eluted in two ways were pooled and then plated.
The phage labeled C is panned on the receptor and then panned by Caco-2 cells. The first and second rounds of panning were performed on the receptor, and the third round of panning was performed on snap wells of Caco-2 cells. DCX11, DCX8, and DCX33 were identified by performing two pannings on the D2H receptor and a third panning on Caco-2 cells. The third round of factor Xa eluate from Caco-2 cells was screened by ELISA on D2H, BSA and fixed Caco-2 cells. For HCA3, the first two rounds of panning were performed on the HPT-1 receptor and the third panning was performed on a monolayer cultured on snapwells of Caco-2 cells.
The phage designated 5PAX was panned 5 rounds, after which numerous phage sequences were examined prior to ELISA screening.
6.5Sequencing of selected phage
The amino acid sequence of the phage insert, which was shown to have a good ratio of binding to the receptor domain and / or Caco-2 cells and background BSA, was obtained from the DNA strand of the appropriate region in the viral genome. Examine both sequences (Sequenase^{▲ R ▼}U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA) was deduced from the obtained nucleotide sequence. The third round of acid eluate was screened on HPT-1, BSA, and Caco-2 fixed cells by ELISA. The phage designated 5PAX was panned 5 rounds, after which numerous phage sequences were examined prior to ELISA screening.
One well of a 24 well plate was coated with 10 μg / ml GIT receptor and the plate was incubated overnight at 4 ° C. The plate was blocked with 0.5% BSA-PBS for 1 hour. A mixture of the DC8, D38, DC43 phage library was added to the plate and the plate was incubated on a rotator for 2-3 hours at room temperature. The wells were washed 10 times with 1% BSA plus 0.05% Tween 20 in PBS and the wells were eluted with 0.05m glycine, pH2. The phage is then 0.2M NaPO_FourAnd eluted. The titer of the eluted phage was measured on an agar plate. The remaining phage were amplified overnight. The phage amplified the next day was added to the second coated plate and the panning procedure was repeated as described above. The titers of the phage eluted from the second panning and the phage amplified from the first panning were measured on an agar plate. After the phage obtained from the second panning was amplified overnight, the panning procedure was repeated as described above. The titers of the phage eluted from the third panning and the phage amplified from the second panning were measured overnight on agar plates. Isolated phage colonies were amplified overnight prior to use in ELISA assays.
6.6Receptor ELISA procedure
96 well plates were coated overnight with GIT receptor, BSA and optionally IDE (insulin-degrading enzyme, irrelevant His-fusion protein) or hTF. Plates were blocked with 0.5% BSA-PBS for 1 hour. After clarification, the amplified phage was diluted 1: 100 with PBS containing 1% BSA plus 0.05% Tween 20 and added to the plate. After incubating the plate for 1-2 hours on a rotator, the plate was washed 5 times with PBS containing 1% BSA plus 0.05% Tween 20. Diluted anti-M13-HRP conjugate (anti-M13 antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)) was added to all wells and the plate was incubated on a rotator for 1 hour. After washing the plate 5 times as described above, TMB substrate was added to the wells. The absorbance of the plate was read at 650 nm.
Receptor ELISA results:
Below are the results of an ELISA assay that evaluated the binding of phage panned on the hSI receptor to hSI and BSA coated microtiter plates. Table 1 shows the OD results and the ratio of hSI binding to BSA binding.

Below are the results of an ELISA assay that evaluated the binding of phage panned on the D2H receptor to D2H and BSA coated microtiter plates. Table 2 shows the OD results and the ratio of D2H binding to BSA binding.

The following are the results of an ELISA assay that evaluated the binding of phages that were panned on the D2H receptor for two rounds and then a third round of panning on Caco-2 snapwell. Binding to fixed Caco-2 cells, D2H and BSA was examined. Table 3 shows the OD results and the ratio of D2H binding to BSA binding.

The following are the results of an ELISA assay that evaluated the binding of phage panned on the hPEPT1 receptor to hPEPT1 and BSA. Table 4 shows the OD results and the ratio of binding to hPEPT1 to binding to BSA.

Table 5 shows the results of an ELISA that evaluated the binding of phage panned on the HPT-1 receptor to HPT-1 and BSA. This table shows the OD results and the ratio of HPT-1 binding to BSA binding.

Table 6 shows the results of an ELISA that evaluated the binding of phage with two rounds of panning on the HPT-1 receptor followed by a third round of panning on Caco-2 snapwell. Binding to fixed Caco-2 cells, HPT-1 and BSA was examined. This table shows the OD results and the ratio of HPT-1 binding to BSA binding.

Cell ELISA procedure
Phage ELISA was used with the following modifications to the above method. The diluent and wash buffer were PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20, and the plate was washed 5 times at each wash step. The supernatant of the infected bacterial culture was diluted 1: 100 and incubated with the protein-coated plate for 2-3 hours with slow motion. Anti-M13 horseradish peroxidase (HRP) conjugate (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) was diluted 1: 8000.
Plates of fixed Caco-2, C2BBel, and A431 cells were prepared by growing the cells on tissue culture treated microtiter plates. When the cells were confluent, the plates were fixed with 10% formaldehyde, washed twice with PBS and stored at −20 ° C. with 0.5% BSA-PBS. On the day of the assay, the thawed plate was treated with PBS containing 0.1% phenylhydrazine for 1 hour at 37 ° C., then washed twice with PBS and blocked with 0.5% BSA-PBS for 1 hour. At this point, the standard ELISA procedure was followed.
Phages that showed specificity for the GIT receptor were further characterized on various recombinant proteins by ELISA. The phage sequences that continued to show specificity for the GIT receptor were examined.

Peptide motif
Comparison of the amino acid sequences of clones that bind to the GIT receptor confirmed several sequence similarities or “motifs”. These motifs can often be part of a sequence that is important for binding to the target. Table 9 shows the sequence similarity regions or sequence motifs (bold) identified within the GIT binding peptides (corresponding SEQ ID numbers are shown in Table 7).

Phage binding to Caco-2 cells
Phages expressing the predicted GIT-binding peptide insert were also measured by ELISA for immobilized Caco-2 or C2BBel cells as follows. 1x10 cells in 100 μl medium^FiveCells / well were applied and incubated overnight at 30 ° C. in 5% carbon dioxide. 100 μl of 25% formaldehyde was added to each well for 15 minutes. The contents of the well were removed by inverting the plate. The plate was then washed 3 times with DPBS. 0.1% phenylhydrazine DPBS solution was added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The plate was inverted and washed 3 times. Plates were blocked with 0.5% BSA-DPBS for 1 hour at room temperature. The plate was inverted and washed 3 times with 1% BPT (PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20). Phage diluted with 1% BPT was added to wells containing immobilized cells. Background binding of HRP conjugate was measured using wells without added phage. Plates were incubated on the rotor for 2-3 hours at room temperature. Plates were washed as described above. Plates were incubated with diluted anti-M13-HRP antibody in 1% BPT for 1 hour at room temperature. After washing, TMB substrate was added and the absorbance of the plate was read at 650 nm. Table 10 shows the relative binding of the peptide-encoding phage to immobilized Caco-2 cells.

In vivo phage selection:
Further selection of phage expressing peptides capable of binding to GIT or transporting GIT was performed as follows. Resuspend the purified library in a buffer such as TBS or PBS and place it on one side of the tissue barrier (eg duodenum, jejunum, ileum, large intestine or other in vivo animal sites), eg closed loop model or open loop model Introduced using. After injection, fluid samples (eg, portal circulation and / or systemic circulation samples) that exist across the tissue barrier are pre-determined (eg, 0-90 minutes and / or 2-6 hours or more) The above was collected. To confirm the presence of the phage, an aliquot of the collected sample (eg, blood) was used to directly infect the host (eg, E. coli). The remaining sample was incubated (eg, incubated overnight with E. coli with agitation at 37 ° C.). Amplified phage present in the culture is individually sequenced to determine the body of the peptide encoded by the phage, or, if further enrichment is desired, precipitated using PEG and resuspended in PBS. It may be cloudy. PEG can then be used to further precipitate the phage or used directly for administration to another animal using a closed or open GIT loop model system. Portal blood or systemic blood samples are taken and then the phages transported to such circulatory system are amplified. Thus, administration of the phage display library to the GIT of the animal (repeated administration of amplified phage if desired) enabled selection of phage transported from the GIT to the animal portal and / or systemic circulation. .
If desired, after administration of the phage display library to an animal model tissue barrier (eg, GIT), the corresponding region of the tissue barrier can be recovered at the end of the method. The collected tissue can be washed repeatedly in a suitable buffer (eg, PBS containing protease inhibitors) and homogenized, eg, in PBS containing protease inhibitors. The homogenate can be used to infect a host (eg, E. coli), thus amplifying phage that bind strongly to a tissue barrier (eg, small intestine tissue). Alternatively, the collected tissue can be homogenized in a suitable PBS buffer, washed repeatedly, and the phage present in the final tissue homogenate can be amplified in E. coli. This approach allows the amplification (and subsequent identification of related peptides) of phage that bind strongly to tissue barriers (eg, small intestine tissue) or that are incorporated into cells of tissue barriers (eg, epithelial cells of small intestine tissue) Become. The selection of phage that bind to or are taken up by this tissue can be repeated.
In vivo treatment of animal tissue barriers with phage display populations
The purified phage display library (random or pre-selected) was diluted in 500 μl PBS buffer and injected into a closed (or open) small intestine loop model (eg, rat, rabbit or other species). Portal venous or systemic circulation samples were taken at time 0 and at successive time points after infusion. An aliquot of the collected blood is incubated with E. coli and then tested for phage plaque formation or transduction units or for colonies where the phage encodes resistance to antibiotics such as tetracycline. It was applied to the plate. The remainder of the collected blood sample (up to 150 μl) was incubated with 250 μl E. coli and 5 ml LB medium or other suitable growth medium. E. coli cultures were incubated overnight at 37 ° C. on a shaking table. Blood samples taken at other time points (eg, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, up to 6 hours) are processed in the same way, and at these time points the portal vein or whole body in E. coli Phages present in the sex cycle were amplified. After amplification, the amplified phage was recovered by PEG precipitation and resuspended in PBS buffer or TBS buffer. The titer of amplified phage before and after PEG precipitation was measured. Amplified PEG-precipitated phage is analyzed using a known phage titer (generally 10⁸~Ten^TenDiluted to phage or plaque forming units (p.f.u.) / Ml) and injected into GIT in an animal closed (or open) loop model. Blood samples were taken from the portal vein and / or systemic circulation at various time points, and phage transported into the blood samples were amplified in E. coli as described above for the first cycle. The phage was then PEG precipitated, resuspended, titered, diluted and injected into an animal closed (or open) loop model GIT. This phage injection procedure and subsequent collection of portal vein and / or systemic blood samples and amplification of phage transported into these blood samples can be repeated, for example, up to 10 times, from the GIT to the portal vein and / or Phages that are preferentially transported into the systemic circulation can be selected.
6.7.Transport of phage from rat lumen into the portal vein and systemic circulation
Phage from a random phage display library as well as control phage were injected into the lumen of the rat gastrointestinal tract (in situ rat closed loop model). Blood from the systemic circulation or portal circulation was collected over time and the number of phage transported into the circulation was determined by titrating a blood sample of E. coli.
The phage display libraries used in this study are D38 and DC43, where gene III encodes a 38mer and 43mer peptide, respectively. As a negative control, the same phage M13mp18 was used in which the gene III did not encode a “random” peptide sequence. Both library phage D38 and DC43 were prepared from E. coli, mixed together, dialyzed against PBS, precipitated using PEG / NaCl, and resuspended in PBS buffer. M13mp18 control was treated similarly. The titer of each phage sample was measured, and diluted with PBS so as to have almost the same titer, and then injected into a rat closed loop model.
For sampling from the systemic circulation, approximately 15 cm of the duodenum of Wistar rats was tied to stop blood circulation (closed loop model), about 0.5 ml of the phage solution was injected into the closed loop, and various blood (0.4 ml) was injected. At the time of sampling from the tail vein. The time points (minutes) used are 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, and 300 minutes. For sampling from the portal circulation, a catheter is inserted into the portal vein, the blood flow is stopped by tying about 15 cm of the duodenum (closed loop model), 0.5 ml of phage solution is injected into the closed loop, and various blood is injected At the time of sampling from the portal vein catheter. Because portal vein sampling is subtle, sampling times were limited to 15, 30, 45 and 60 minutes where possible. The volume of phage injected into each animal is as follows:
Animal (15) Volume of injected phage
R1-R3 0.50ml
R4 0.43ml
R5-R15 0.45ml
To correct for the difference in volume injected into each animal (using 0.5 ml as the standard volume), the expected number of phage transferred was adjusted.
To examine transport into the systemic circulation, animals R1, R2, and R3 received control phage M13mp18, and animals R4, R5, R6, and R7 received test phage D38 / DC43 mix. To test transport into the portal circulation, animals R8, R9, and R10 were administered control phage M13mp18, and animals R11, R12, R13, and R14 were administered test phage D38 / DC43 mix. A combination of phage samples taken from systemic circulation on day 1 from animals R4 to R7 (see Table 11), amplified in E. coli, PEG precipitated and resuspended in PBS. Administered to animal R15 *. In subsequent analyses, it was found that the titer of this phage was over 100 times higher than the other phage samples used for animals R8-R14. Therefore, the data presented for animal R15 * was reduced and corrected.
Approximately 0.4 ml of blood was collected at each time point in each model system. 30 μl of collected blood (systemic) was mixed with 100 μl of prepared E. coli strain K91Kan, incubated at 37 ° C. for 30 minutes and spread to plaque using Top Agarose on LB plates . Various negative controls were included in the titration experiment. The number of plaque forming units was measured the next day. Similarly, 30 μl of collected blood (portal vein) and serial dilutions (1: 100, 1: 1000) are mixed with 100 μl of prepared E. coli strain K91Kan and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, Coated for plaque formation using Top Agarose on LB plates. The number of plaque forming units was measured the next day.
Furthermore, about 300 μl of blood (systemic and portal vein) collected at each time point was prepared with 5 ml of prepared E. coli strain K91Kan and 5 mM MgCl.₂/ MgSO_FourIncubated at 37C overnight in modified growth medium containing (to allow phage amplification). The sample was centrifuged and the cell pellet was discarded. Samples of phage supernatant are taken and serially diluted with TBS buffer (10^-2,Ten^-Four,Ten^-6,Ten^-8And applied to examine plaques, and the number of plaque-forming units present in the amplified phage sample was measured.
In addition, aliquots of phage were taken from “amplified” supernatants obtained from test animals R4 to R7 (samples from each time point were used), combined and precipitated using PEG for 2 hours. Precipitated phage were resuspended in PBS buffer and injected into a closed loop model of animal R15 *, followed by portal vein sampling.
The number of phage transported into the systemic circulation from the closed loop model is shown in Table 11 below. The number of phage transported into the portal circulation from the closed loop model is shown in Table 12 below. These numbers are corrected for differences in phage input and volume input. It is clear that there are more phage in the portal vein sample than those present in the systemic sample, indicating hepatic or RES clearance and / or phage instability in the systemic circulation. Furthermore, the uptake of phage from the GIT into the portal circulation is very rapid, and a large number of phage are detected within 15 minutes. Results from portal vein sampling experiments also indicate that the rate of phage uptake from the D38 / DC43 library is faster than the control phage. That is, there may be preferential uptake of phage encoding random peptide sequences from the GIT into the portal circulation. For animals R13, R14, and R15 *, the percentage of phage transported into the titered blood sample within a limited time frame (30, 45, and 15 minutes, respectively) is 0.13% and 1.1%, respectively. %, And 0.013%.

Animals R1, R2, and R3 received control phage M13mp18.
Animals R4, R5, R6, and R7 received test phage D38 / DC43 mix.

Animals R8, R9, and R10 received the control phage M13mp18.
Animals R11, R12, R13, and R14 received test phage D38 / DC43 mix.
Animal R15 * received a combined phage sample sampled from the systemic circulation from animals R4 to R7 (see Table 11) on day 1 and then PEG precipitated and suspended in PBS. When analyzed next, the titer of this phage was 100 times higher than the other phage samples used for animals R8-R14. That is, the data measured for phage transport into the portal circulation of animal R15 * were adjusted to be lower.
These studies show that both control and D38 / DC43 phages from the GIT lumen to portal circulation and systemicity, as evidenced by titrating the phages transported to blood in E. coli. It was shown to be transported to the circulation over time. More phage were transported from the test phage sample into the portal circulation than the corresponding control phage sample. Furthermore, the rate of transport of the test phage into the portal circulation appeared to be faster than that of the control phage. Phages from the D38 / DC43 library that appeared in the systemic circulation of different animals (R4-R7) were pooled, amplified in E. coli, precipitated, reapplied to the GIT lumen, and then Were collected in the portal circulation and titered in E. coli. These selected phages were also transported from the GIT lumen into the portal circulation. This in situ loop model may be an attractive screening model for identifying peptide sequences that facilitate the transport of phage and particles from the GIT into the circulation.
Using this screening model system, there are currently many preselected phage libraries, such as one-pass systemic phage libraries from animals R4-R7, one-pass portal vein libraries from animals R11-R14, and There is a two-pass rapid transport systemic-portal phage library SP-2 from animal R15 *.
6.8.Transport of phage from a preselected phage library from rat lumen to portal and systemic circulation
Four preselected phage live by pooling preselected phage by screening random phage display libraries D38 and DC43 using HPT1, HPEPT1, D2H, and hSI receptors or binding sites in GIT Larry GI-D2H, GI-hSI, GI-HPT1 and GI-hPEPT1 were prepared. The phage pool and preselected phage library are shown in Table 13. Note that the sequences for PAX2, HAX1, HAX5, HAX6, HAX10, H10 and HAX44 are the same. The sequence of HAX40 is the same as that of H44. The corresponding sequence numbers are shown in Table 7.

Similar to the method described hereinabove, three preselected phage libraries with the negative control phage M13mp18 were injected into the rat closed loop model (6 animals for the preselected phage library) and the portal vein Blood was collected over time from the portal circulation through the vein, and a whole body blood sample was collected from the tail vein at the end of the experiment, and the small intestine tissue region from the closed loop was collected.
In particular, phage selected in vitro for each receptor or binding site present in GIT are amplified in E. coli, PEG precipitated, resuspended in TBS, and E. coli ( The titer of each phage sample was determined by forming plaques in E. coli. Next, the same number of each phage (8x10⁸Phage) together with the negative control phage M13mp18 in a preselected phage library and each preselected phage library was administered to 6 Wistar rats per library (rats 1-6; GI-D2H). , Rats 7-12; GI-hSI, rats 13-18; GI-hPEPT1, and rats 19-24; GI-HPT1). Using the in situ loop model, 0.5 ml of preselected phage library solution was injected into the duodenum / jejunum tied part. Blood was added into heparinized tubes at 0, 15, 30, 45 and 60 minutes from the portal vein. Blood samples were taken from the systemic circulation at the end of the experiment. Similarly, the duodenum / jejunum portion used for phage injection was taken.
Collected portal vein blood (no dilution, 10^-2,Ten^-Four,Ten^-630 μl of dilution) was added to 30 μl of E. coli K91Kan cells (overnight culture) and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then 3 ml of top agarose was added and the sample was applied to form a plaque. 100 μl of collected portal vein blood was added to 100 μl of E. coli K91Kan. 5 ml of LB medium was then added and the samples were incubated overnight at 37 ° C. in a rotating microbial incubator. Centrifuged to remove E. coli and amplified phage supernatant samples were titrated directly or PEG precipitated, resuspended in TBS and titrated. After titering the amplified phage, combine the samples containing phage from each set of animals, adjust the titer of each sample to the same titer, and add the LB agar plate (22 cm²It was applied to form plaques on the square plate. 12,000 or 24,000 phage were applied for plaque formation.
Collected whole body blood (no dilution, 10^-2,Ten^-Four,Ten^-6Dilution) 30 μl was added to E. coli K91Kan cells and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then 3 ml of top agarose was added and the sample was applied to form a plaque. 100 μl of the collected whole body blood was added to 100 μl of E. coli K91Kan and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. 5 ml of LB medium was then added and the samples were incubated overnight at 37 ° C. in a rotating microbial incubator. Centrifuged to remove E. coli and amplified phage supernatant samples were titrated directly or PEG precipitated and resuspended in TBS for titration. After titering the amplified phage, combine the samples containing phage from each set of animals, adjust the titer of each sample to the same titer, and add the LB agar plate (22 cm²It was applied to form plaques on the square plate. 12,000 or 24,000 phage were applied for plaque formation.
The small intestine tissue part used in each closed loop was cut out. The tissue was cut into small pieces, then washed 3 times in sterile PBS containing protease inhibitors and homogenized with an Ultra thorex homogenizer (Int-D sample). Alternatively, tissue (in PBS supplemented with protease inhibitors) was homogenized with an Ultra Thorex homogenizer, washed 3 times in PBS containing protease inhibitors, and resuspended in PBS containing protease inhibitors (Int-G sample) . Serial dilutions of tissue homogenate in each case (no dilution, 10^-2,Ten^-Four,Ten^-6Dilution) was titrated in E. coli. An additional aliquot of tissue homogenate (100 μl) was added to 100 μl E. coli K91Kan and incubated at 37 ° C. for 10 minutes, then 5 ml LB medium was added and incubated overnight at 37 ° C. in a rotating microbial incubator. .
Phage amplified from portal blood, systemic blood, and small intestine tissue was applied for plaque formation. Plaques were transferred to Hybond-N Nylon filters, denatured (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), neutralized (0.5 M Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl) and washed in 2 × SSC buffer. . The filter was air dried to crosslink the DNA to the filter (UV crosslinking: 2 minutes, high setting). Filters were incubated at 40-45 ° C. for at least 60 minutes in prehybridization buffer (6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS, 20 μg / ml yeast tRNA).
A synthetic oligonucleotide (22-mer) complementary to the region encoding the receptor or binding site used to generate the preselected phage library was synthesized (see Table 14 below).

Oligonucleotide (5 pmol)³²5 'end labeling with P-ATP and T4 polynucleotide kinase and approximately 2.5 pmol of labeled oligonucleotide was used for hybridization studies. Hybridization is performed overnight at 40-45 ° C. in a buffer containing 6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS, 20 μg / ml yeast tRNA and radiolabeled synthetic oligonucleotide, and then the following buffer: (I) 2 x SSC / 0.1% SDS, (ii) 1 x SSC / 0.1% SDS, (iii) 0.1 x SSC / 0.1% SDS. Filters were air dried and exposed for 15 hours, 24 hours, or 72 hours for autoradiography.
Hybridization data indicated that all oligonucleotide probes bound specifically to the phage target, except for the HAX9 probe, which was not clearly labeled. The negative control probe hybridized to M13mp18 DNA alone showed a weak to negative signal in all samples tested (data not shown).
Hybridization data for pools from rats of each receptor group were summarized. Tables 15, 16, 17, and 18 show compilations of representative autoradiographic signals for the HSI, D2H, HPT1, and hPEPT1 receptor groups. These tables show phage absorption and uptake from the closed loop GIT model into the portal vein and systemic circulation, and phage absorption / internalization into small intestine tissue. In these tables, Int-G represents the small intestine tissue homogenized before washing and recovery, and Int-D represents the small intestinal tissue washed before homogenization and phage recovery. In all cases, there were major phage candidates in more than one animal.

Apart from synthetic oligonucleotides for HAX9, all oligonucleotides were first confirmed to be radioactively labeled as determined by hybridization to the corresponding phage target (eg, phage S15 was linked to oligonucleotide S15). Hybridized). Furthermore, under the experimental conditions used, these oligonucleotides basically did not hybridize to the negative control phage template M13mp18. Two oligonucleotides were synthesized on phage M13mp18: (1) a positive oligonucleotide that hybridizes to the conserved sequences of both M13mp18 and each GIT receptor or GIT binding site selection phage [referred to as M13 (positive)]; and (2) A negative oligonucleotide that hybridizes only to a unique sequence at a plurality of cloning sites of phage M13mp18 and does not hybridize to either GIT receptor or GIT binding site selection phage.
In the case of the phage hSI pool, only four phages (phage S15, SNi-10, SNi-34 and SNi-38) were transported from the closed loop model to the portal circulation. Other phages (S21, S22, SNi-28, SNi-45, SNiAX-2, SNiAX-6 and SNiAX-8) were not transported from the GIT into the portal circulation. In addition, phage SNi-10 and, to a lesser extent, phages S15 and S22 were found in small intestine samples or fractions and no other phage were found. Only a small amount (<0.1%) of phage M13mp18 was present in the Int-G sample. These results allow the identification of phage that are further selected from preselected libraries that are transported from the GIT closed loop into the portal circulation or that bind to or are internalized in the small intestine tissue. Indicates that
In the case of the phage D2H pool, there is a rank order in which phages are transported from the GIT closed loop model to the portal circulation, with phage DCX11 and DAB10 preferentially transported, followed by phage DCX8, DAB30, DAB3 and DAB7. It was done. Many phages from this pool were not transported into the portal circulation (including phage DAB18, DAB24, DAX15, DAX24, DAX27, DCX26, DCX36, DXC39, DCX42, DCX45). There is a very low level of phage DAX23 transport from the GIT to the portal circulation. Similarly, only some of the phages were found in small intestine samples or fractions (containing phage DAB30, DCX33, DAB7, DCX11, DCX45, and to a much lesser extent, including phage DAB3, DAB10, DCX8, DCX39, DCX42) . Certain phage were not found in small intestine samples (including phage DAB18, DAB24, DAX15, DAX24, DCX26, and DCX36). Only a small amount (<0.1%) of phage M13mp18 was present in the Int-G sample. These results allow the identification of phage that are further selected from preselected libraries that are transported from the GIT closed loop into the portal circulation or that bind to or are internalized in the small intestine tissue. Indicates that
In the case of the phage HPT1 pool, there was a rank order in which phage was transported from the GIT closed loop model to the portal vein or systemic circulation. Phage PAX2 (which was used at a 4 × concentration relative to the other phages in this pool) then phage HAX42 was found in the portal vein and systemic circulation, and phage h40 was found only in the systemic circulation. None of the phages in this pool were found in the small intestine sample or fraction. Phage M13mp18 was not found in the small intestine fraction or systemic circulation and was present only in the portal circulation (<0.001%). These results indicate that phage is further selected from a preselected library that binds or is internalized to phage transported from the GIT closed loop into the portal vein and / or systemic circulation, or small intestine tissue. Shows that it allows identification of phage.
In the case of the hPEPT1 pool of phage, phage PAX2 and H40 were also included in this pool. Many phages from this pool were found in the portal circulation (including phage P31 (SEQ ID NO: 43), PAX46, PAX9, H40, PAX17, PAX40, PAX2, PAX14, 5PAX3 and 5PAX12). Many phage were not found in the portal blood (including negative control phage M13mp18, PAX15, PAX16, PAX18, PAX35, PAX38, PAX43, PAX45, P90, 5PAX5 and 5PAX7). The only phages found in the systemic circulation were phage 5PAX5 and P31 (SEQ ID NO: 43). In addition, there was preferential binding of some phages to the small intestine (including phage 5PAX12, 5PAX7, 5PAX3, H40, P31 (SEQ ID NO: 43), PAX9, and to a lesser extent PAX38 and PAX15). Certain phage were not found in small intestine samples (including negative control phage M13mp18, and phage PAX2, PAX14, PAX16, PAX18, PAX35, PAX45, PAX46, P90 and 5PAX5). These results indicate that phage is further selected from a preselected library that binds or is internalized to phage transported from the GIT closed loop into the portal vein and / or systemic circulation, or small intestine tissue. Shows that it allows identification of phage.
Further characterization of selected sequences
After initial screening of four recombinant receptor sites (hPEPT1, HPT1, D2H, hSI) in gastrointestinal tract tissue using a phage display library, negative control protein BSA protein and recombinant human tissue recombinant protein A series of phage that showed preferential binding at each target receptor site compared to factor (hTF), which contained a polyhistidine tag at its amino terminus, like a recombinant receptor in gastrointestinal tissue Was isolated. In subsequent experiments, the same titers of selection phage that bind to each target receptor site were combined into one pool (ie, one pool of HPT1-binding phage, one pool of hPEPT1-binding phage, and D2H-binding phage. One pool and one pool of hSI-binding phage). Each pool was supplemented with an equal titer of negative control phage M13mp18. These phage pools are injected into the closed duodenal loop region of rat small intestine tissue, and then the phages bound and retained in the small intestine tissue and / or absorbed from the small intestine loop into the portal vein and / or systemic circulation are collected. And recovered. In addition, the selection of the initial phage that binds to the target recombinant receptor site was analyzed for binding to immobilized Caco-2 cells and / or binding to immobilized C2BBel cells. The selection of the final lead peptide sequence is (1) binds to the target recombinant receptor site in vitro rather than its binding to the negative control protein BSA and / or hTFs, (2) rat rather than the negative control phage M13mp18 Binds to rat small intestine tissue after injection into the closed duodenal loop of the small intestine tissue (3) from the rat small intestinal tissue portal vein and / or systemic after injection into the closed duodenal loop of the rat small intestine tissue, rather than the negative control phage M13mp18 Based on the ability of the phage encoding peptide sequences to be absorbed into the circulation and (4) bind to immobilized Caco-2 cells or immobilized C2BBel cells in the phage binding assay rather than the negative control phage M13mp18. In addition, peptides were selected considering the ease of chemical synthesis.
6.9.GST fusion protein of GIT target peptide
Preparation of GST fusion protein of GI target peptide
A glutathione-S-transferase (GST) vector encoding a fusion protein of the GI targeting peptide was generated in the vector pGEX4T-2 (source, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Briefly, single-stranded DNA was amplified from the target clone by polymerase chain reaction. The amplified DNA was then cut with restriction enzymes XhoI and NotI and then ligated into SalI / NotI cut pGEX4T-2. Following transformation, the DNA sequence of each construct was verified by sequencing.
Next, for construction of a truncated version of a GST fusion protein with an insert of less than 45 base pairs, the overlapping oligonucleotide containing the attached SalI and NotI ends and encoding the sequence of interest is then annealed, and then directly SalI / Ligated into NotI-cut pGEX4T-2. Following transformation, the DNA sequence of each construct was verified by sequencing.
Schematic diagrams of various GST fusion protein constructs synthesized are shown in FIGS.
Expression and purification of GST fusion protein
Escherichia coli BL21 cells containing the GST fusion protein construct were grown overnight in 2X YT medium containing 100 μg / ml ampicillin (2X YT / amp). The overnight culture is diluted 1: 100 with 2X YT broth (100 ml) and the cells are₆₀₀Was grown at 30 ° C. until the pH was 0.5, induced with 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, and further grown for 3 hours. Cells were harvested by centrifugation and resuspended in 5 ml of PBS containing a mixture of proteinase inhibitors (Boehringer / Mannheim). Cells were sonicated on ice and cell lysates were centrifuged at 12,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant fraction was reacted with 2 ml of a 50% slurry of glutathione-Sepharose® 4B at room temperature for 30 minutes, washed 3 times with 1.5 ml of PBS (at room temperature), and the bound GST fusion protein was 3 × 1 ml. And eluted with 10 mM reduced glutathionein 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) at room temperature for 10 minutes. The protein was quantified by Bio-Rad protein assay and then characterized by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
GST fusion peptide ELISA
The standard ELISA method was modified as follows. GST protein was diluted to the appropriate concentration in PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20 (1% BPT), titered and incubated for 1 hour at room temperature. After washing 5 times, anti-GST monoclonal antibody (Sigma, St. Louis, clone GST-2, diluted 1: 10,000 in 1% BPT) was added and incubated for 1 hour. After further washing 5 times, goat anti-mouse IgG2b-HRP was added (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL, diluted 1: 4,000 in 1% BPT) and incubated for 1 hour. After washing 5 times, the plate was developed with TMB peroxidase substrate (Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD). All data is shown with background coupling subtracted.
FIG. 6 shows the binding of GST-SNi10, GST-SNi34 and GST alone to hSI receptor and immobilized C2BBel cells.
GST fusion protein of selected GIT targeting peptide
The results show that GST-DXB8, GST-PAX2, GST-P31, GST-SNi10 and GST-SNi34 bind to immobilized Caco-2 or C2BBel cells (FIGS. 7 and 8) compared to GST control binding. Show. GST-HAX42 and GST-5PAX5 all showed weak to moderate binding compared to the GST control.
Interestingly, the P31 truncated 103-GST fusion protein bound to immobilized Caco-2 cells, almost like the full length P31 (SEQ ID NO: 43) (A). This suggests that there is a part involved in the binding of the P31 sequence (SEQ ID NO: 43) in this part. PAX2.107 bound in the same way as full-length PAX2. This part is therefore most likely to contain an amino acid sequence involved in binding (B). In preliminary assays, none of the DCX8 truncated forms bind to Caco-2 cells, as does full-length DCX8, suggesting that the binding region spans more than one of these parts.
Inhibition of binding by synthetic peptides
Binding of GST-P31 to immobilized C2BBel cells
The standard ELISA method was modified as follows. GST fusion protein and peptide were diluted to appropriate concentrations in PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20. The peptide was titrated, a fixed concentration of diluted GST protein was added to the titrated peptide, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. After washing 5 times, anti-GST monoclonal antibody (Sigma, St. Louis, clone GST-2, diluted 1: 10,000 in 1% BPT) was added and incubated for 1 hour. After further washing 5 times, goat anti-mouse IgG2b-HRP was added (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL, diluted 1: 4,000 in 1% BPT) and incubated for 1 hour. After washing 5 times, the plate was developed with TMB peroxidase substrate (Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD). All data is shown with background coupling subtracted.
Figures 9A and 9B show inhibition of GST-P31 binding to C2BBel immobilized cells. Peptide competitors are ZElan024, a dansylated peptide of P31 (SEQ ID NO: 43), and ZElan044, ZElan049, and ZElan050, a truncated dansylated product of P31 (SEQ ID NO: 43). Data are presented as O.D. versus peptide concentration and percent inhibition of GST-P31 binding versus peptide concentration. GST-P31 binding without competition was considered as 100% binding. I c₅₀Values are estimates using the 50% line on the percent inhibition graph.
GST-P31 and GST-PAX2 showed no cross-reactive binding to ZElan024 (P31) (SEQ ID NO: 43) and ZElan018 (PAX2) at the 0.5 μg / ml concentration used in the competition assay. GST-HAX42 showed cross-reactive binding to ZElan018 (PAX2) and ZElan021 (HAX42) at the 0.5 μg / ml concentration used in the competition assay.
FIGS. 10A-10C are a summary of data generated by competitive ELISA of GST-P31, GST-PAX2, GST-SNi10 and GST-HAX42 versus various dansylated peptides on immobilized C2BBel cells. I c₅₀Values are given in μM and include ranges determined from multiple assays. The GST / C2BBel column is a summary of GST protein binding to immobilized C2BBel cells.
Binding to immobilized Caco-2 cells
Caco-2 cells were fixed and treated with phenylhydrazine and blocked as described above. Synthetic peptide (100 μg / ml) was applied to Caco-2 cells in duplicate and serially diluted along a 96-well plate. The corresponding GST-peptide fusion protein (10 μg) was added to each well and the plate was incubated for 2 hours at room temperature with agitation. Binding of GST-peptide fusion protein to the cells was measured using the ELISA method described above. GST-P31 binding was inhibited by ZElan024, ZElan028 and ZElan031 and two D forms, ZElan053 and ZElan054. GST-PAX2 binding was inhibited by ZElan032, ZElan033, and ZElan035. GST-HAX42 binding was not inhibited by ZElan021 (full length HAX42), but was inhibited by ZElan018 (PAX2) and ZElan026 and ZElan038 (mixed PAX2 peptide).
Transport and uptake of GST-peptide fusions into living Caco-2 cells
Transport and incorporation of GST-peptide fusions and deletion derivatives through polarized Caco-2 monolayers cultured in HBSS buffer for 4 hr was investigated using anti-GST ELISA assay . In another experiment, the transport and uptake of deletion derivatives through GST-peptide fusions and polarized Caco-2 monolayers cultured in serum-free medium (SFM) for 24 hrs using an anti-GST ELISA assay. I investigated.
material
Buffered Hanks balanced salt solution (bHBSS) = 0.011 M glucose (1 g / l), 25 mM hepes (15 mM acid (3.575 g / l; Sigma CN.H3375); 10 mM base (2.603 g / l; Sigma CN.H1016) ] Supplemented with 1 × HBSS (Gibco CN.14065-031).
Chloroquine: Prepared as a 10 mM aqueous solution [Sigma CN C6628]
Lysis buffer: 30 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA
Serum-free medium (SFM) is a normal medium that does not contain serum.
Method
a) 4-hour HBSS test: Transepithelial electrical flux (TER) through Caco-2 monolayer (passage 33; 23 days old) grown on Snapwell was measured to confirm monolayer integrity Later experiment started. The medium was removed and the cells were washed once with bHBSS. BHBSS containing 100 μM chloroquine was added and the cells were incubated at 37 ° C. for 2 hours. bHBSS + chloroquine was exchanged with 0.5 ml bHBSS containing GST-peptide fusion (100 μg / ml) and the cells were incubated as described above. Basolateral samples were taken at the following times: 0, 0.5 hours, 2 hours, and 4 hours. TER was measured on the 4th day, apical medium was sampled, and the apical reservoir was washed 6 times with HBSS. Cells were lysed in lysis buffer for 1 hour on ice and then lysed samples were taken. All samples were stored at -70 ° C until measured by anti-GST ELISA. Prior to analysis, samples were normalized for protein content relative to each other using the BioRad protein assay.
b) 24-hour SFM test: transepithelial electrical flux (TER) through Caco-2 monolayers grown on Snapwell (passage 33; 23 days old) was measured to confirm monolayer integrity Later experiment started. The medium was removed and the cells were washed once with SFM. SFM containing GST-peptide fusion (100 μg / ml) was added to the cells and this was incubated with 5% carbon dioxide at 37 ° C. for 24 hours. After 24 hours, TER readings were taken and samples were taken from the basolateral and apical reservoirs. The apical reservoir was washed 6 times with PBS. Cells were lysed in lysis buffer for 1 hour on ice and then lysed samples were taken. All samples were stored at -70 ° C until measured by anti-GST ELISA. Prior to analysis, samples were normalized for protein content relative to each other using the BioRad protein assay.
result
All GST-peptide fusions and controls tested were transported through live Caco-2 monolayers. Full length GST-P31 and GST-DCX8 (but not including truncated forms of these molecules) had higher flux than GST alone.
Internalization of GST-peptide fusions into polarized Caco-2 cells was examined in two experiments. In Experiment 1, 15 μg of GST-peptide fusion was applied with bHBSS, and the internalized GST-peptide was recovered by lysing the cells for 4 hours. In Experiment 2, 10 μg of GST-peptide was applied in a) bHBSS (lysate collected after 4 hours), or b) serum-free medium (lysate collected after 24 hours).
FIG. 11A illustrates the complete transport of GST-peptide through the polarized Caco-2 monolayer, not necessarily internalization, ie GST-peptide was recovered from the basolateral reservoir of Snapwell, It indicates that the protein may have crossed the barrier by the paracellular pathway.
Effect of thrombin cleavage on binding of GST peptide fusion to immobilized Caco-2 cells
The binding of complete GST peptide fusion and thrombin cleaved GST peptide fusion to immobilized Caco-2 cells was compared. The reduced binding of the thrombin-cleaved GST peptide fusion to the complete fusion indicates that the peptide component of the fusion mediates binding rather than the GST domain.
Method
Prior to blocking with 0.1% BSA in PBS, Caco-2 confluent monolayers grown in 96-well plates (p38) were immobilized and treated with 0.1% phenylhydrazine. 30 μg of each GST peptide is added to 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂Treated with bovine thrombin (1 μ / ml; 0.4 NIH units; Sigma CN. T9681) for 18 hours at room temperature. The control was treated in the same way without adding thrombin. 10 μg of each GST peptide fusion was removed for PAGE analysis and 10 μg of fusion was added in duplicate to the immobilized Caco-2 cells prior to 5-fold serial dilution (1% BPT dilution). The fusion was allowed to bind for 1 hour at room temperature. After 6 washes with 1% BPT, binding was assayed by ELISA.
result
The results are shown in FIG.
Conclusion:
PAGE analysis confirmed that thrombin effectively cleaves the GST peptide fusion. Cleavage with thrombin significantly reduces the detection of binding of GST-P31.103, GST-PAX2.106, GST-DCX8, and GST-SNi10 to immobilized Caco-2 cells and binds peptide components rather than GST domains It is shown to mediate.
6.10.Peptide synthesis
6.10.1.Solid phase synthesis
The peptide may be prepared by methods known in the art. For example, in brief, solid phase peptide synthesis consists of conjugating the carboxyl group of the C-terminal amino acid to the resin and sequentially adding N-α protected amino acids. The protecting group may be any known in the art. Before each new amino acid is added to the growing chain, the protecting group of the amino acid added to the chain is removed. The attachment of amino acids to suitable resins is described by Rivier et al., US Pat. No. 4,244,946. For such solid phase synthesis, for example, Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Vale et al., 1981, Science 213: 1394-1397; Marki et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103 : 3178 and U.S. Pat. Nos. 4,305,872 and 4,316,891. In a preferred embodiment, an automated peptide synthesizer is used.
By way of example and not limitation, peptides can be synthesized on an Applied Biosystems (“ABI”) model 431A automated peptide synthesizer using the “Fastmoc” synthesis protocol provided by ABI, which can be used as a coupling agent. 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (“HBTU”) (R. Knorr et al., 1989, Tet. Lett., 30: 1927 ). This synthesis is commercially available 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl- (9-fluorenyl-methoxycarbonyl) -aminomethyl) -phenoxypolystyrene resin (“Rink resin” from Advanced ChemTech) (H. Rink, 1987, Tet. Lett. 28: 3787) 0.25 mmol. Fmoc amino acid (1 mmol) is coupled according to the Fastmoc protocol. The following side chain protected Fmoc amino acid derivatives:
FmocArg (Pmc) OH; FmocAsn (Mbh) OH; FmocAsp (^tBu) OH;
FmocCys (Acm) OH; FmocGlu (^tBu) OH; FmocGln (Mbh) OH; FmocHis (Tr) OH;
FmocLys (Boc) OH; FmocSer (^tBu) OH; FmocThr (^tBu) OH;
FmocTyr (^tBu) OH
Is used. [Abbreviations: Acm, acetamidomethyl; Boc, t-butoxycarbonyl;^tBu, t-butyl; Fmoc, 9-fluorenylmethoxycarbonyl; Mbh, 4,4'-dimethoxybenzhydryl; Pmc, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl; Tr, Trityl]
The synthesis is performed using N-methylpyrrolidone (NMP) as a solvent and adding HBTU dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF). Deprotection of the Fmoc group is achieved using about 20% piperidine in NMP. At the end of each synthesis, the amount of peptide present is assayed by UV spectroscopy. Weigh dry peptide resin sample (approximately 3-10 mg) and then add 20% piperidine in DMA (1 ml). After sonication for 30 minutes, the UV (ultraviolet) absorbance of the dibenzofulvene-piperidine addition product (formed by cleavage of the N-terminal Fmoc group) is recorded at 301 nm. Peptide substitution (mmol g^-1) Is the formula:

(In the formula, A is the absorbance at 301 nm, v is the 20% piperidine capacity (ml) in DMA, 7800 is the extinction coefficient (mol of dibenzofulvene-piperidine addition product)^-1dm^Threecm^-2), And w is the weight (mg) of the peptide resin sample)
Can be calculated according to
Finally, the N-terminal Fmoc group is cleaved with 20% piperidine in DMA and then acetylated with acetic anhydride and pyridine in DMA. Peptide resin is DMA, CH₂Cl_ThreeAnd finally wash thoroughly with diethyl ether.
6.10.2.Cutting and deprotection
By way of example and not limitation, cleavage and deprotection can be carried out as follows: Prior to the addition of 95% aqueous trifluoroacetic acid (TFA), the air-dried peptide resin is treated with ethyl methyl-sulfide (EtSMe). ), Ethanedithiol (EDT) and thioanisole (PhSMe) for about 20 minutes. A total volume of about 50 ml of these reagents is used per gram of peptide resin. Use the following ratio: TFA: EtSMe: EDT: PhSMe (10: 0.5: 0.5: 0.5). N this mixture₂Stir at room temperature for 3 hours under atmosphere. The mixture is filtered and the resin is washed with TFA (2 × 3 ml). The combined filtrates are evaporated in vacuo and anhydrous diethyl ether is added to the yellow / orange residue. The resulting white precipitate is isolated by filtration. See King et al., 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255-266 for various cleavage methods.
6.10.3.Peptide purification
Purification of the synthesized peptide can be performed by chromatography (eg, ion exchange, affinity, and sizing column chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC)), centrifugation, differential solubility, or any other standard technique. Can be performed by standard techniques including:
6.10.4.Binding of peptides to other molecules
The peptides of the present invention can be coupled to other molecules (eg, detectable labels, molecules that facilitate adsorption to a solid support, or toxins according to various embodiments of the present invention) by methods well known in the art. You may let them. Such methods include the use of homobifunctional and heterobifunctional cross-linking molecules.
A homobifunctional molecule has at least two reactive functional groups, which are the same. Examples of the reactive functional group in the homobifunctional molecule include an aldehyde group and an active ester group.
Examples of the homobifunctional molecule having an aldehyde group include glutaraldehyde and subalaldehyde. The use of glutaraldehyde as a cross-linking agent is disclosed by Poznansky et al., 1984, Science 223: 1304-1306.
Homobifunctional molecules having at least two active ester units include dicarboxylic acids and esters of N-hydroxysuccinimide. Some examples of such N-succinimidyl esters include disuccinimidyl suberate and dithio-bis- (succinimidyl propionate), and soluble bissulfonates and bissulfonates such as their sodium and potassium salts. It is done. These homobifunctional reagents are available from Pierce, Rockford, Illinois.
Heterobifunctional molecules have at least two different reactive functional groups. Some examples of heterobifunctional reagents containing reactive disulfide bonds include N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (Carlsson et al., 1978, Biochem J.173: 723-737), S 4-succinimidyloxycarbonyl-α-methylbenzylthiosulfate sodium, and 4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl- (2-pyridyldithio) toluene. N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate is preferred. Some examples of heterobifunctional reagents comprising a reactive group with a double bond that reacts with a thiol group include succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate and m-maleimidobenzoic acid Acid succinimidyl is mentioned.
Other heterobifunctional molecules include succinimidyl 3- (maleimido) propionate, sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimido-phenyl) butyrate, 4- (N-maleimidomethyl-cyclohexane) -1-carboxylic acid And sulfosuccinimidyl, maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester. The sulfonic acid sodium salt of succinimidyl m-maleimidobenzoate is preferred. Many of the above heterobifunctional reagents and their sulfonates are available from Pierce.
Additional information on their preparation and use, as well as other multifunctional reagents, can be found in the following publications or others available in the art:
Carlsson et al., 1978, Biochem. J.173: 723-737; Cumber et al., 1985, Methods in Enzymology 112: 207-224; Jue et al., 1978, Biochem.17: 5399-5405; Sun et al., 1974, Biochem.13 : 2334-2340; Blattler et al., 1985, Biochem. 24: 1517-152; Liu et al., 1979, Biochem. 18: 690-697; Youls and Neville, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5483- 5486; Lerner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3403-3407; Jung and Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761: 162; Caulfield et al., 1984, Biochem. 81: 7772-7776; Staros, 1982, Biochem. 21: 3950-3955: Yoshitake et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101: 395-399; Yoshitake et al., 1982, J. Biochem. 92: 1413-1424; Pilch and Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254: 3375-3381; Novick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 8483-8487; Lomant and Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104: 243-261; Hamada and Tsuruo 1987, Anal. Biochem. 160: 483-488; Hashida et al., 1984, J. Applied Biochem. 6: 56-63.
More available.
In addition, crosslinking methods are reviewed by Means and Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1: 2-12.
6.10.4.1.Biotinylation of peptides
Methods for biotinylating peptides are well known in the art. Any conventional method may be used in the practice of the present invention. For example, the following method was used. 10 μg of peptide was dissolved in 100 μl of 0.1% acetic acid. PBS (900 μl) and 3.3 mg biotin-LC-NHS (Pierce, Rockford, IL) were added. After 30 minutes incubation at room temperature, the biotinylated peptide was purified on a Superose 12 column (Pharmacia, Piscataway, NJ).
6.10.5.Synthetic peptide
Tables 19, 20 and 21 provide the primary structures of various synthetic peptides made in the practice of the present invention.

Table 21 shows GST fusion proteins of GIT peptides.

6.10.6.Peptide stability
The relative stability of ZElan031, ZElan053 and ZElan054 was determined in simulated intestinal fluid (SIF). SIF is obtained by dissolving 100 mg of pancreatin (Sigma cat # P-1625, lot # 122H0812) in 8.4 ml of phosphate stock solution, adjusting to pH 7.5 with 0.2N NaOH, and adjusting the volume to 10 ml with water. Produced.
The peptide (3.25 mg) was dissolved in 3.25 ml of a 10,000-fold diluted SIF solution at 37 ° C. Aliquots (0.7 ml) of digestion solution were then collected at <1 minute, 1 hour, 3 hours, 21 hours or 24 hours. This sample is quickly passed through a syringe filter (Millipore Millex-GV 0.22 μm, part # SLGV025LS, lot # H2BM95250) and 300 μl of the filtered solution is immediately added to a C-8 column (Applied Biosystems column and guard column: column-p / n 0711-0023 Spheri-5 ODS 5 μm, 220 × 4.6 mm). The product was eluted at 1.5 ml / min using an acetonitrile-water gradient. Major fluorescence peaks were collected, lyophilized and identified by MS analysis.
The HPLC gradient used was:
Hours (minutes)    Solvent mixture
0 95% H₂O-5% acetonitrile (0.1% TFA)
5 95% H₂O-5% acetonitrile (0.1% TFA)
35 85% H₂O-15% acetonitrile (0.1% TFA) linear solvent change
40 0% H₂O-100% Acetonitrile (0.1% TFA) 〃
45 95% H₂O-5% Acetonitrile (0.1% TFA) 〃
52 95% H₂O-5% Acetonitrile (0.1% TFA) 〃
Met.
As shown in Table 22, the relative stability (relative to SIF) of the three peptides was ZElan053> ZElan054> ZElan031. It was found that enzymatic cleavage of the peptide occurred at arginine and / or lysine as expected. Replacing 1-amino acids with their D-amino acid analogs significantly reduced the rate of proteolysis at these residues.

7.Characterization of peptide-coated particles
Binding of peptide-coated PLGA nanoparticles to immobilized Caco-2 cells
Binding of nanoparticles coated with targeting peptides to immobilized Caco-2 cells was examined using an ELISA assay based on the reaction of antibodies with dansyl moieties present in the peptides. The isoelectric points of the selected synthetic peptides are shown in Table 23 (corresponding SEQ ID NOs are shown in Table 7). Corresponding dansylated synthetic GIT-binding peptides are shown in Table 24.

Method:
Prior to blocking with 0.1% BSA in PBS, Caco-2 confluent monolayers grown in 96-well plates (p38) were immobilized and treated with 0.1% phenylhydrazine. Control and dansyl peptide-coated nanoparticles were resuspended in sterile water at 10 mg / ml and stirred with a magnet at room temperature for 1 hour. Samples were (1) blank nanoparticle controls, (2) scrambled PAX2 coated nanoparticles, (3) PAX2 coated nanoparticles, (4) HAX42 coated nanoparticles, (5) PAX2 / HAX42 coated nanoparticles, and (6 ) Made of 8 peptide-coated nanoparticles.
Nanoparticles were added to the cells at 10 mg / ml in 100 μl of 1% BSA-PBS (Tween 80 not used in this assay) and further serially diluted 2-fold. The 96-well plate was incubated for 1 hour at room temperature. The plate was washed 5 times with 1% BSA-PBS, 100 μl of anti-dansyl antibody (Cytogen DB3-226.3; 0.5 μg / ml; batch May 1997) was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 1 hour. The wells were washed 5 times with 1% BSA-PBS, goat anti-mouse λ: HRP antibody (Southern Biotechnology CN.1060-05; 1: 10,000) was added per well, and the plate was further incubated at room temperature for 1 hour. After washing 5 times with 1% BSA-PBS, 100 μl of TMB peroxidase substrate (KPL CN.50-76-00) was added to the well, and after 15 minutes, the optical density was measured at 650 nm.
As shown in Figures 13A-B, when applying decreasing amounts of nanoparticles to immobilized Caco-2 cells, for nanoparticles coated with a mixture of PAX2, HAX2, PAX2 + HAX2, and eight targeting peptides A decrease in anti-dancil ELISA response was seen. No influence of concentration was observed on blank nanoparticles or nanoparticles coated with scrambled PAX2 peptide. Nanoparticles coated with PAX2, HAX2, PAX2 + HAX2, and eight peptide mixtures showed an increase in response in proportion to nanoparticles coated with blank or scrambled PAX2 peptides. This OD value was usually lower than that observed for GST peptide fusions bound to immobilized Caco-2 cells.
Table 25 below shows insulin potency and the level of peptide coated on the particles (measured by fluorescence) relative to particles of composition 1 (composition according to the coacervation method shown below).

ELISA of dansylated peptides and insulin-coated PLGA particles
The standard ELISA method was changed as follows. Peptides and particles were diluted to a suitable concentration with PBS containing 1% BSA (particles were sonicated to a homogeneous solution), titrated and incubated for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with PBS containing 1% BSA, autologous IgG1λ anti-dansyl monoclonal antibody was added (diluted to 1 μg / ml with 1% BSA-PBS) and the plate was incubated for 1 hour. After a further 5 washes, goat anti-mouse λ-HRP was added (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL, diluted 110,000 with 1% BSA-PBS) and the plates were incubated for 1 hour. After 5 washes, the plates were developed with TMB peroxidase substrate (Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD). All data is shown with background binding subtracted. If this assay included insulin-coated PLGA particles, Tween 20 was not added to the diluent or wash.
Figures 14A-14B show the binding of dansylated peptide SNi10 to hSI and BSA.
8.Binding of synthetic peptides and peptide-coated particles to S100 and P100 fractions derived from Caco-2 cells
8.1.Detection of binding to membrane (p100) and cytosol (S100) fractions
Caco-2 cell membrane (P100) and cytosol (S100) fractions were obtained from Kinsella, B.T., O'Mahony, D.J. and G.A. FitzGerald, 1994, J. Biol.269(47): Prepared using a modification of the method described in 29914-29919. Caco-2 dense cell monolayer (75cm²37 ° C and 5% CO in flask₂Was grown twice for 1 week) with Dulbecco's PBS (DPBS), and after treatment with 10 mM EDTA-DPBS, the cells were collected by centrifugation at 1000 rpm. The cells are washed 3 times with DPBS and the final cell pellet in 3 volumes of ice-cold HED buffer (20 mM HEPES (pH 7.67), 1 mM EGTA, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) And resuspended. Cells were swollen on ice for 5 minutes prior to 30 seconds of homogenization. The homogenate was centrifuged at 40,000 rpm for 45 minutes at 4 ° C. The supernatant (S100) was removed and the pellet (P100) was resuspended in HEDG buffer (20 mM HEPES (pH 7.67), 1 mM EGTA, 0.5 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF) . Protein concentration was determined by Bradford assay (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem.72: 248-254).
Binding of peptides and / or peptide-coated PLGA particles to the membrane (P100) and cytosol (S100) fractions was assessed by detection of dansyl moieties incorporated into the peptides. Costar 96-well ELISA plate with S100 and P100 fractions (0.05M NaHCO_Three100 μg / ml) at 4 ° C. overnight. Plates were blocked with 0.5% bovine serum albumin in DPBS for 1 hour at room temperature and washed 3 times with 1% BSA-DPBS. Peptide coated particles or peptides were dispersed in the same buffer and added to the plate at concentrations ranging from 0.325-0.5 mg / well. After 1 hour at room temperature, the plate was washed 5 times with 1% BSA-DPBS and 100 μl of anti-dansyl antibody (Cytogen DB3-226.3; 0.5 μg / ml) was added per well. Plates were incubated for 1 hour at room temperature. Wells were washed 3 times with 1% BSA-DPBS and 100 μl of goat anti-mouse IgGλ: HRP antibody (Southern Biotechnology 1060-05; 1: 10,000) was added per well. Plates were incubated for 1 hour at room temperature. After washing 3 times with 1% BSA-DPBS, 100 μl of TMB substrate (3,3 ′, 5 ′, 5-tetramethylbenzidine; Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard and Perry Laboratories 50-76-00)) was added, and various The optical density was measured at 650 nm with a time interval of.
8.2.Binding of peptide-coated PLGA particles
A novel assay system is provided by the present invention for detection of binding of peptide-coated PLGA particles to membranes (P100) and cytosol (S100) fractions derived from live Caco-2 cells. Absorbance readings obtained using this assay system were substantially higher than those obtained using similar peptide-coated PLGA particle concentrations in immobilized Caco-2 cells. This high sensitivity and the derivation of S100 and P100 fractions from live Caco-2 cells suggests that this assay will be the assay system selected for detection of peptide-coated PLGA particle binding. The assay was concentration dependent, and the peptide / particle interaction allowed discrimination between interactions between specific and non-specific binding.
The binding of peptide-coated PLGA particles was evaluated using the S100 and P100 fractions derived from the aforementioned live Caco-2 cells. Fraction is 0.05M NaHCO_ThreeMedium 96 μg / well was coated onto 96-well plates and peptide-coated PLGA particles were assayed by ELISA at concentrations ranging from 0.0325-0.5 mg / well.
15A and 15B, obtained in S100 and P100 fractions for particles coated with no peptide, scrambled PAX2 (control), P31D-Arg 16-mer (ZElan053), HAX42, PAX2 and HAX42 / PAX2, respectively. Shows the data. When using a particle concentration of 0.0325-0.5 mg / well, all test peptide-coated PLGA particles showed stronger binding to both S100 and P100 fractions than scrambled PAX2-coated control particles. All particles except P31 D-Arg 16mer (ZElan053) showed stronger binding to the P100 fraction than to the S100 fraction. Strong binding of the P31 D-Arg 16mer (ZElan053) coated particles to the S100 fraction would indicate non-specific binding due to D-Arg modification of the P31 peptide (SEQ ID NO: 43).
Binding of PLGA particles coated with various concentrations of PAX2 peptide ranging from 0.05-5.0 mg / g a) immobilized Caco-2 cells (P35) and b) S100 and P100 fractions (Caco-2 P33) Evaluated. The particles were assayed at concentrations ranging from 0.03125-0.0625 mg / well.
When using particle concentrations in the range of 0.0625 mg / well, all PAX2-coated particles except those coated at 0.05 mg / g showed stronger binding to immobilized Caco-2 cells than scrambled PAX2-coated control particles . It is clear that there is a concentration effect with increasing PAX2 peptide concentration (in the range of 0.05-1.0 mg / g) that improves Caco-2 cell binding. However, all absorbance readings were low and PAX2 (5 mg / g) binding did not match this pattern.
When using a particle concentration of 0.03125-0.0625 mg / well, all test peptide coated particles except PAX2 (0.05 mg / g) are equivalent to or stronger than both scrambled PAX2 coated control particles. Showed the bond. All particles showed stronger binding to the P100 fraction than to the S100 fraction. Binding to both S100 and P100 fractions was directly proportional to the PAX2 peptide concentration of the particles. Absorbance readings obtained using this assay system were substantially higher than those obtained in immobilized Caco-2 cells.
The effect of blocking solution on the binding of peptide-coated PLGA particles to the P100 fraction (Caco-2 P35) was evaluated using 1% bovine serum albumin (BSA) and 1% milk powder blocking solution to assess background binding . The following particles: no peptide; scrambled PAX2; and PAX2 coated particles with a peptide concentration of 5-0.05 mg / g were assayed using concentrations ranging from 0.03125-0.0625 mg / well. As previously observed with 1% BSA, all test peptide coated particles except PAX2 coated at 0.05 mg / g were equivalent to or stronger than the scrambled PAX2 coated control particles. Showed binding. Binding to the P100 fraction was directly proportional to the PAX2 peptide concentration of the particles (in this case PAX2 (5 mg / g) showed slightly weaker binding than PAX2 (1 mg / g)). A similar trend was seen when using 1% milk powder and a particle concentration of 0.0625mg / well. However, when 1% powdered milk was used, the absorbance readings were all low, and a binding pattern could not be detected when particles with a concentration of 0.0625 mg / well were used.
Nonspecific binding of peptide-coated PLGA particles to plastic was also evaluated using 1% BSA and 1% milk powder blocking solution. When BSA was used, the binding pattern seen above could be detected; however, the absorbance readings were substantially low and binding of particles PAX2 (0.1 and 0.05 mg / g respectively) could not be detected. When 1% powdered milk was used, the absorbance readings were all low and there was no detectable binding pattern. BSA was chosen for blocking the next assay.
8.3.Comparison of peptide-coated particles that bind to the P100 fraction and synthetic peptides
The binding of dansylated peptides to the P100 fraction was evaluated to determine whether peptide-coated particle binding could be estimated by peptide binding. FIG. 16 shows the data obtained for dansylated peptide A) HAX42, P31 type D and scrambled PAX2 and B) PAX2, HAX42 and scrambled PAX-2.
Two consecutive assays resulted in substantial changes in absorbance readings. Initially, the HAX42 peptide showed strong binding when compared to the scrambled PAX-2 control. P31 D-type peptide (ZElan053) showed binding only at the highest dilution. In repeated assays, HAX42 also showed significant binding compared to the scrambled PAX-2 control. However, the scrambled PAX-2 control and HAX42 had higher absorbance values compared to those obtained in the above assay. The PAX2 peptide was indistinguishable from the scrambled PAX-2 control. The peptide / particle binding interactions are summarized in Table 26 below:

Peptide / particle binding was well correlated with the HAX42 peptide. In contrast, there was no correlation that could be detected for the P31 D-type (ZElan053) peptide. Because P31 D-type peptide-coated particles showed stronger binding to the S100 fraction than the P100 fraction (unlike other test peptides), the particle-binding interaction was non-specific, or some other molecules It appears that they were competing for binding to the P100 fraction, not the S100 fraction. Thus, peptide / particle assay correlation may be useful in discriminating between specific and non-specific binding interactions. Because assessment of PAX2 binding interactions was difficult, scrambled PAX2 controls yielded various results.
8.4.Determination of HAX42 and PAX2 binding motif sequences
HAX42, PAX2 and various derivative peptides and GST fusion proteins were assayed using a peptide ELISA against P100 membrane fractions derived from Caco-2 cells. GST-PAX2 protein and PAX2 peptide data indicate that the core binding motif is in the amino acid sequence TNAKHSSHNRRLRTR (SEQ ID NO), otherwise in GST-106 and ZElan033. Similarly, HAX42 peptide data suggests that the core binding motif of HAX42 is in the amino acid sequence PGDYNCCGNCNSTG (SEQ ID NO), otherwise ZElan091.
Peptides and proteins were analyzed by dansylated peptide ELISA method in which 96 well plates were coated with 100 μl / well of coated protein (usually 100 μg / ml P100 membrane fraction) in 0.05 M carbonate buffer pH 9.6 at 4 ° C. . Non-specific binding was blocked with 200 μl / well, 2% Marvel / PBS for 2 hours at 37 ° C. prior to incubation with dansylated peptide. After each incubation step, the plate was washed 3 times with PBS / 0.05% Tween20. The peptide was diluted in blocking solution at a starting concentration of 100 μg / ml, diluted 1: 2 down to 100 μl / well, then incubated exactly 1 hour at room temperature. The buffer blank control has implications to ensure that background binding to plastic is not due to the antibody used in the assay system. To detect dansylated peptides, a 1: 1340 dilution in blocking buffer solution and 100 μl / well of mouse anti-dansyl antibody (DB3 Cytogen Corp.) was added and then incubated for 1 hour at room temperature. In addition, the plates were incubated for 1 hour at room temperature with a 1: 10,000 dilution in blocking solution, 100 μl / well of anti-mouse λ-HRP conjugate antibody (Southern Biotech 1060-05). Plates were developed with 75 μl / well Bionostics TMB substrate and incubated for about 10 minutes. The color reaction was stopped with Bionostics Red Stop solution (25 μl / well) and the optical density of the plate was read at 650 nm.
Relative binding to GST-PAX2 peptide-P100 fraction
After subtracting the GST peptide bond to plastic from the P100 binding value, the binding of GST-PAX2 peptide was expressed as the ratio of GST-HAX42 binding to P100 showing an arbitrary value of 1.00. The following ratio was determined from the binding of GST peptide to P100 at a peptide concentration of 20 μg / ml. Bold indicates positive binding to the P100 membrane fraction.

Relative binding to PAX2 peptide-P100 fraction
ZElan021, full length HAX42, gave an arbitrary value of 1.00 binding to P100 at a given peptide concentration determined from signal to noise ratio data. PAX2 and its derivatives are shown as a ratio of HAX42 values and represent their ability to bind to the P100 membrane fraction from the Caco-2 cell line shown in Table 29. Table 30 provides a list of PAX2 peptides that show positive binding peptides in bold. The GST-PAX2 peptide and PAX2 peptide data are consistent, demonstrating that the binding motif is in the amino acid sequence TNAKHSSHNRRLRTR (GST-106 and ZElan033).

Relative binding to HAX42 peptide-P100 fraction
ZElan021, full length HAX42, gave an arbitrary value of 1.00 binding to P100 at a given peptide concentration determined from signal to noise ratio data. HAX42 and its derivatives are shown as a ratio of HAX42 values and represent their ability to bind to the P100 membrane fraction from the Caco-2 cell line shown in Table 31. Table 32 provides a list of HAX42 peptides that show positive binding peptides in bold. The core binding motif appears to be in the amino acid sequence PGDYNCCGNCNSTG (ZElan091).

9.Prescription
General preparation of coacervate particles
Solid particles containing a therapeutic agent as defined herein were prepared using the coacervate method. The particles are formed from a polymer and have a particle size of about 10 nm to 500 μm, most preferably 50 to 800 nm. In addition, the particles include targeting ligands that are incorporated into the particles using several methods.
The organic phase (B) polymer of the general method set forth above may be soluble, permeable, impermeable, biodegradable or gastric retentive. The polymer consists of a mixture of polymers or copolymers and may be a natural or synthetic polymer. Exemplary biodegradable polymers include, but are not limited to, polyglycolide; polylactide; poly (lactide-co-glycolide) including DL, L, and D forms; copolyoxalate; polycaprolactone; polyesteramide; Polyorthoester; Polyanhydride; Polyalkylcyanoacrylate; Polyhydroxybutyrate; Polyurethane; Albumin; Casein; Chitosan derivative; Gelatin; Gum arabic; Cellulose; Polysaccharides; Isomers. Typical synthetic polymers include: alkyl cellulose; hydroxyalkyl cellulose; cellulose ether; cellulose ester; nitrocellulose; polymers of acrylic acid and methacrylic acid and esters thereof; dextran; polyamide; polycarbonate; Polyalkylene terephthalate; Polyvinyl alcohol; Polyvinyl ether; Polyvinyl ester; Polyvinyl halide; Polyvinyl pyrrolidone; Polysiloxane and polyurethane and copolymers thereof.
Typically, the particles are formed using the following general method:
Polymer, surfactant, surfactant or modifier or salt, or surfactant, preferably polyvinyl alcohol (PVA) or hydrolysis rate 50-100%, molecular weight range 500-500,000, most preferably hydrolysis rate 80-100 An aqueous solution (A) of a derivative having a molecular weight of 10,000-150,000 is put in a container. The mixture (A) is stirred at 10-2000 rpm, preferably 100-600 rpm under low shear conditions. The PH and / or ionic strength of this solution may be modified using salts, buffers or other denaturing agents. The viscosity of this solution may be modified with polymers, salts, or other thickeners or modifiers.
Dissolving a polymer, preferably poly (lactide-co-glycolide), polylactide, polyglycolide or combinations thereof, or any enantiomer, or a covalent conjugate of these polymers with a targeting ligand, in a water-miscible organic solvent; Organic phase (B) is obtained. Most preferably, a combination of acetone and ethanol is used in a range of ratios from 0: 100 acetone: ethanol to 100: 0 acetone: ethanol, depending on the polymer used.
In addition, polymers, peptide sugars, salts, natural / biological polymers or other agents may be added to this organic phase (B) to modify the physical and chemical properties of the resulting particle product.
The drug or bioactive substance may be placed in either the aqueous phase (A) or the organic phase (B). The targeting ligand may also be placed in either the aqueous phase (A) or the organic phase (B) at this point.
Add the organic phase (B) to the stirred aqueous phase (A) at a consistent rate. The solvent is preferably evaporated by raising the temperature from ambient and / or using a vacuum pump. Here, the particles are denoted as suspension (C). The targeting ligand may be added to the stirred suspension at this point.
In this step, a second layer of polymer, peptide sugar, salt, natural / biological polymer or other drug may be attached to the preformed particle core by any suitable method. The particles (D) are then separated from the suspension (C) by standard colloidal separation techniques, preferably centrifugation at high “g” force, filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography or charge separation techniques. . The supernatant is discarded and the particles (D) are resuspended in a washing solution (E), preferably water, brine, buffer or organic solvent. Particles (D) are separated from the washing liquid as before and are usually rewashed twice. The targeting ligand may be dissolved in the washing solution (E) in the final washing step, and this may be used to wash the particles (D).
The particles can then be dried. The particles can then be further processed, eg tableted, encapsulated or spray dried.
The release profile of the particles formed as described above can vary from immediate release to sustained or delayed release, depending on the used and / or desired formulation.
The drug loading may be in the range of 0-90% w / w. The loading of targeting ligand may be in the range of 0-90% w / w.
Specific examples include the following:
Example 1: Peptides added in the final washing step
Product: Nanoparticles loaded with bovine insulin
Objective: Preparation of a 2g batch of nanoparticles loaded with peptide ZElan018 and loaded with bovine insulin at a theoretical loading of 50mg / g.
Prescription details
RG504H (lot number 250583) 2.0g
Acetone 45ml
Ethanol 5ml
PVA (water 5% w / v) 400ml
Bovine insulin (lot number 86H0674) 100mg
Peptide: PAX2 (ZElan018) 10mg / 50ml dH₂O
Exam details:
A 5% w / v PVA solution was prepared by heating water to near the boiling point, adding PVA and stirring until further cooled. The organic phase was prepared by adding together 45 ml acetone and 5 ml ethanol. The polymer solution was prepared by adding 2 g of RG504H to the organic phase and stirring until dissolved. An IKA ™ reactor was set up, all seals were oiled and the temperature was set at 25 ° C. 400 ml of PVA solution was added to the reactor and stirred at 400 rpm.
100 mg of bovine insulin was added to the stirred PVA solution. The polymer solution was slowly added dropwise to the stirred PVA solution with a peristaltic pump set at 40 using a clean tube and a green needle. The solvent was evaporated by opening and stirring the dispersion overnight at 400 rpm.
This suspension was centrifuged at 12,500 rpm at 4 ° C. with a Beckman Ultracentrifuge ™ equipped with a swing-out rotor. The supernatant was decanted and discarded. Crush the “cake” of particles and dH₂O (200 ml) was added to wash the particles. Centrifugation and washing steps were repeated twice.
Peptide solution, (ZElan018, dH₂10 mg in 50 ml of O) was prepared and added to the particles during the final washing step. The suspended particles were centrifuged as described above. The supernatant was decanted and the ground “cake” and particles were dried in a vacuum oven.
The particles were crushed and placed in a securitainer and sent for analysis. The weight of the recovered particles was 1.45 g. Scanning electron microscopy showed moderately spherical independent particles with a size of 300-500 nm. The efficacy was 49.2 mg / g (98.0% of label claim). The amount of peptide added was 2.42 μg / mg (48.4% of the label claim).
Example 2: Peptides added at the start of production
Product: Nanoparticles loaded with bovine insulin
Purpose: Preparation of 2g batch of nanoparticles loaded with peptide ZElan018 at the start of production and loaded with insulin at a theoretical loading of 50mg / g.
Prescription details
RG504H (lot number 250583) 2.0g
Acetone 45ml
Ethanol: 5ml
PVA (water 5% w / v) 400ml
Bovine insulin (lot number 65H0640) 100mg
Peptide: PAX2 (ZElan018ii) 10mg
Exam details:
A 5% w / v PVA solution was prepared by heating water to near the boiling point, adding PVA and stirring until further cooled. The organic phase was prepared by adding together 45 ml acetone and 5 ml ethanol. The polymer solution was prepared by adding 2 g of RG504H (polyactide-co-glycolide, Boehringer Ingelheim) to the organic phase prepared in the previous step and stirring until dissolved. An IKA ™ reactor was set up, all seals were oiled and the temperature was set at 25 ° C. 400 ml of PVA solution was added to the reactor and stirred at 400 rpm.
100 mg of bovine insulin was added to the stirred PVA solution. PAX2 (ZElan018ii, 10 mg) was added to the stirred PVA solution. The polymer solution was slowly added dropwise to the stirred PVA solution with a peristaltic pump set to 40 using a clean tube and an unbaked needle. The solvent was evaporated by opening and stirring the dispersion overnight at 400 rpm. The suspension was centrifuged at 12,500 rpm at 4 ° C. with a Beckman Ultracentrifuge ™ equipped with a swing-out rotor. The supernatant was decanted and discarded.
Crush the “cake” of particles and dH₂O (200 ml) was added to wash the particles. Centrifugation and washing steps were repeated twice. The “cake” was crushed and the particles were dried in a vacuum oven.
The particles were crushed and placed in a securitainer and sent for analysis. The weight of the recovered particles was 1.6 g. The efficacy was 47.3 mg / g (94.6% of the label claim). The amount of peptide added was 1.688 μg / mg (33.8% of the label claim).
Example 3: Peptide added 1 hour before centrifugation
Product: Nanoparticles loaded with bovine insulin
Purpose: Preparation of a 1g batch of nanoparticles loaded with peptide ZElan018 1 hour before centrifugation and loaded with insulin at a theoretical loading of 50 mg / g.
Prescription details
RG504H (lot number 250583) 1.0g
Acetone 22.5ml
Ethanol: 2.5ml
PVA (water 5% w / v) 200ml
Bovine insulin (lot number 65H0640) 50mg
Peptide: PAX2 (ZElan018) 5mg
Exam details:
A 5% w / v PVA solution was prepared by heating water to near the boiling point, adding PVA and stirring until further cooled. The organic phase was prepared by adding together 22.5 ml acetone and 2.5 ml ethanol. The polymer solution was prepared by adding 1 g of RG504H to the organic phase prepared above and stirring until dissolved. An IKA ™ reactor was set up, all seals were oiled and the temperature was set at 25 ° C. 200 ml of PVA solution was added to the reactor and stirred at 400 rpm.
Bovine insulin 50 mg was added to the stirred PVA solution. The polymer solution was slowly added dropwise to the stirred PVA solution with a peristaltic pump set to 40 using a clean tube and an unbaked needle. The solvent was evaporated by opening and stirring the dispersion overnight at 400 rpm.
PAX2 (ZElan018 5 mg) was added to the stirred particle suspension. After 1 hour, the suspension was centrifuged at 12,500 rpm at 4 ° C. with a Beckman Ultracentrifuge ™ equipped with a swing-out rotor. The supernatant was decanted and discarded. The “cake” of particles is crushed and dH₂O (200 ml) was added to wash the particles. Centrifugation and washing steps were repeated twice.
The “cake” was crushed and the particles were dried in a vacuum oven. The particles were crushed and placed in a securitainer and sent for analysis. The efficacy was 20.75 mg / g (41.5% of the label claim). The amount of peptide added was 1.256 μg / mg (25.12% of the label claim).
Example 4: Nanoparticles loaded with Leuprolide
Objective: Preparation of 3g batch of nanoparticles loaded with peptide ZElan024 and loaded with leuprolide-acetate at a theoretical loading of 20mg / g.
Prescription details
RG504H (Lot number 271077) 3.0g
Acetone 67.5ml
Ethanol: 7.5ml
PVA (water 5% w / v) 600ml
Leuprolide-acetate (lot number V14094) 60mg
Peptide: P31 (ZElan024) 15mg / 50ml dH₂O
Exam details:
A PVA solution was prepared and the organic phase was prepared by adding together 67.5 ml acetone and 7.5 ml ethanol. The polymer solution was prepared by adding 3 g of RG504H to the organic phase prepared above and stirring until dissolved. An IKA ™ reactor was set up, all seals were oiled and the temperature was set at 25 ° C. 600 ml of PVA solution was added to the reactor and stirred at 400 rpm.
60 mg of leuprolide acetate was added to the stirred PVA solution. The polymer solution was slowly added dropwise to the stirred PVA solution with a peristaltic pump set to 40 using a clean tube and an unbaked needle. The solvent was evaporated by opening and stirring the dispersion overnight at 400 rpm. The suspension was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C. with a Beckman Ultracentrifuge ™ equipped with a swing-out rotor. The supernatant was decanted and secured for analysis.
The “cake” of particles is crushed and dH₂O (200 ml) was added to wash the particles. Centrifugation and washing steps were repeated twice.
Peptide solution (P31 (SEQ ID NO: 43), dH₂15 mg in 50 ml) was added and added to the particles in the final wash step. The suspended particles were centrifuged as described above. The supernatant was decanted and the particles were dried in a vacuum oven.
The particles were crushed and placed in a securitainer and sent for analysis. The weight of the recovered particles was 1.87 g. According to a scanning electron microscope, they were moderately spherical and independent particles in the 300-500 nm size range. The efficacy was 4.7 mg / g (23.4% of label claim). The amount of peptide added was 1.76 μg / mg.
Example 5: Peptide with "spiking" polymer phase added by polymer-peptide conjugate
Product: Nanoparticles loaded with bovine insulin
Purpose: Preparation of 3g batch of nanoparticles loaded with polymer-peptide conjugate PLGA-ZElan019 and loaded with insulin at a theoretical loading of 50mg / g.
Prescription details
RG504H (lot number 271077) 2.85g
RG504H-ZElan019 conjugate 0.15g
(5PAX5-conjugate)
Acetone 67.5ml
Ethanol: 7.5ml
PVA (water 5% w / v) 600ml
Bovine insulin (lot number 86H0674) 150mg
Exam details:
A 5% w / v PVA solution was prepared by heating water to near the boiling point, adding PVA and stirring until further cooled. The organic phase was prepared by adding together 67.5 ml acetone and 7.5 ml ethanol. The polymer solution was prepared by adding RG504H and polymer-peptide conjugate to the organic phase and stirring until dissolved.
An IKA ™ reactor was set up, all seals were oiled and the temperature was set at 25 ° C. 400 ml of PVA solution was added to the reactor and stirred at 400 rpm.
100 mg of bovine insulin was added to the stirred PVA solution. The polymer solution was slowly added dropwise to the stirred PVA solution with a peristaltic pump set to 40 using a clean tube and an unbaked needle. The solvent was evaporated by opening and stirring the dispersion overnight at 400 rpm.
The suspension was centrifuged at 12,500 rpm at 4 ° C. with a Beckman Ultracentrifuge ™ equipped with a swing-out rotor. The supernatant was decanted and discarded. The “cake” of particles is crushed and dH₂O (200 ml) was added to wash the particles. Centrifugation and washing steps were repeated twice.
The “cake” was crushed and the particles were dried in a vacuum oven. The particles were crushed and placed in a securitainer and sent for analysis. The weight of the recovered particles was 2.8 g. The efficacy was 53.1 mg / g (106.2% of the label claim). The amount of peptide added was 4.02 μg / mg (80.4% of the label claim).
Ten.Animal research
Study 1
An open loop study was performed in which the test solution was injected directly into the ileum. Wistar rats (300-350 g) are fasted for 4 hours and 15 minutes prior to administration of the test solution with ketamine solution [0.525 ml ketamine (100 mg / ml) and acepromazine maleate-BP ACP (2 mg / ml) 0.875 ml]. Anesthesia was given by ˜20 min intramuscular injection. Rats were then injected with the test solution 2-3 cm below the pylorus into the duodenum (injection volume: 1.5 ml PBS). This test solution contained PLGA particles made with or without the targeting peptide by either the coacervation procedure provided above or the “spike” procedure provided above. Insulin (immediate action cattle; 28.1 iu / mg) was mixed into the particles at a drug loading of 5% per 100 iu insulin (70 mg particles) or 300 iu insulin (210 mg particles). Rat blood glucose levels were measured using a Glucometer ™ (Bayer; 0.1-33.3 m / mol / L); plasma insulin levels were measured using the Phadeseph RIA kit ™ (Upjohn Pharmacia; 3-240 μU / ml). -Measured using exactly the same assay). Systemic blood and portal blood were used as samples.
The study group includes animals that received a test solution containing particles coated with the peptides shown in Table 33 below.

Control groups include: 1) PBS control (1.5 ml) open loop; 2) Insulin solution (1iu / 0.2 ml) subcutaneous; 3) Insulin particles-no peptide (1iu / 0.2 ml) subcutaneous; 4) Insulin particles / all 8 peptide mixture (1iu / 0.2ml) subcutaneous; 5) Particle loaded insulin / peptide control (mixed 5PAX5) (100iu / 1.5ml) open loop; 6) Particle loaded insulin / peptide control (mixed 5PAX5) (300iu 7) Control particles (no insulin) / all 8 peptide mixtures (equivalent to 100iu / 1.5ml) open loop; and 8) Control particles (no insulin) / all 8 peptide mixtures (300iu / (Equivalent to 1.5ml) Open loop is mentioned.
The following describes the pharmacokinetics for 300iu loading:

Figures 17A and 17B show systemic blood glucose and insulin levels after enteral administration of control (PBS); insulin solution; insulin particles; all 8 peptide mixed particles and study group peptide-particles (100iu). 18A and 18B show systemic blood glucose and insulin levels after enteral administration of control (PBS); insulin solution; insulin particles and study group peptide-particles (300 iu).
Delivery of insulin in subcutaneous injection of insulin was most effectively enhanced by HPT1 target peptide coated particles, in the order of spiked hPEPT1> mixed PAX2> mix-8> hPEPT1> D2H> uncoated particles> hSI> solution . In repeated studies, a similar profile was obtained with uncoated particles containing insulin, but a reduced profile was obtained with HPT1-peptide target particles (3-fold). PLGA particles without insulin and all 8 mixed particles showed no effect on basal levels of insulin or glucose. HPT1 targeting particles, spiked PEPT1 targeting particles, and PEPT1 targeting particles also reduced blood glucose levels indicating that the induced insulin is bioactive. Other targeting particles have also been shown to reduce blood glucose levels, although not to the same level as HPT1 and spiked PEPT1 particles. There were no histological differences observed in the small intestine for any of the formulations evaluated.
Study 2
The second open loop study was conducted with the following treatment groups shown in Table 34, as in Study 1 above.

Since increasing responses to subcutaneous doses of bovine insulin did not show a linear increase beyond the range of 1-20 iu, post-dose insulin efficacy was evaluated for 1 and 20 iu subcutaneous doses. Data for up to 3 hours after administration was available for most animals. Therefore, efficacy was first assessed using individual AUC (0-3 hours) data evaluated from baseline subtracted data (where data up to 3 hours are available).
Some animals with high responses did not survive for 3 hours and were therefore excluded from the analysis, so this approach may underestimate the effectiveness. In an attempt to capture these high responses observed at the earliest possible time, mean baseline subtracted plasma concentration data was used to assess each group's AUC. Table 35 shows the results based on this second approach (AUC (0-3 hours) calculated from mean plasma concentration data).

Data for group 3 (uninsulin-coated particles) are shown with and without rat 43. It is believed that this animal had an irregular high response to these uninsulin-coated particles and therefore biased data for this group.
This data shows that combining peptide-coated particles (HAX42 / PAX2 or 5PAX5 / P31) is not as effective as particles coated with individual peptides. Furthermore, peptide-coated particles have a higher effectiveness than peptide-uncoated. The mixture of 40-mer PAX2 peptide did not decrease bioavailability. Although this decrease appears to be somewhat due to the reduction in peptide size, mixing of the PAX2 peptide and reduction in size to the 19-mer resulted in a decrease in bioavailability. Reduction in peptide size resulted in a decrease in bioavailability. The P31 (ZElan053) form D had increased bioavailability due to its high resistance to peptide degradation. Overcompetition of the peptide caused a decrease in bioavailability, and freeze drying resulted in a decrease in bioavailability. As an example, blood glucose level measurements indicate that insulin delivered to HPT1 and hPEPT1 targeting particles, including HAX42, PAX2, P31 type D (SEQ ID NO: 43) and P31 (ZElan053), is bioactive It was shown to reduce medium glucose levels.
In further studies, insulin was dissolved and removed from the targeted particles after particle formation and analyzed by electrophoresis on non-denatured sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Analysis of insulin by non-denaturing SDS-PAGE and also Western blotting, which is then transferred to a membrane and then screened with antibodies against insulin, confirms that the insulin is intact, ie, degraded, dimerized or aggregated during the particle formation process. It was shown that there was no evidence.
Study 3
We conducted a duodenal open-loop model study in Wistar rats (300-350g). The first group was injected subcutaneously with leuprolide acetate (12.5 μg). The second group was injected with uncoated leuprolide acetate particles (600 μg, 1.5 ml) in the duodenum. In the third group, leuprolide acetate particles (600 μg, 1.5 ml) coated with PAX2 were injected into the duodenum. In the fourth group, leuprolide acetate particles (600 μg, 1.5 ml) coated with P31 (SEQ ID NO: 43) were injected into the duodenum. FIG. 19 shows the leuprolide plasma concentration after administration to these fourth groups. Both P31 (SEQ ID NO: 43) and PAX2-coated leuprolide particles administered intraduodenum increased plasma levels of leuprolide compared to subcutaneous injection.
GIT carrier binding peptide homologues for known proteins are shown in FIGS. 20, 21A-F and 22A-D.
The scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications and changes of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings, as well as those described herein. Such variations and modifications are considered to be within the scope of the appended claims.
Various publications are cited herein, all of which are incorporated herein by reference.
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(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 57
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 58
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 59
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 60
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 168 base pairs
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(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 62
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 135 base pairs
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(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 63
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 64
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 159 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 68
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 69
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 176 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 71
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 159 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 72
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 73
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 74
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 75
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 76
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 77
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 152 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 78
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 79
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 80
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
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(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 81
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 82
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 83
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 156 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 178 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 87
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 159 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 88
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 89
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 160 base pairs
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 90
(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 92
(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Xi) Array

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(I) Features of the array
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 97
(I) Features of the array
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 98
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 159 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 99
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 100
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
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(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 101
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 102
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 103
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 104
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 105
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 162 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
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(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 106
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 107
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 108
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 177 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 109
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 158 base pairs
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(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 110
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 708 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 111
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 112
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 113
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 114
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 115
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 116
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 117
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 118
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 119
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 120
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 121
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 122
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 123
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 124
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 125
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 126
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 127
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 128
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 129
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 130
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 131
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 132
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 133
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 134
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 135
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 136
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 137
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 138
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 139
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 140
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 141
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 142
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 143
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 144
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 145
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 146
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 147
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 148
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 149
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 150
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 151
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 152
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 153
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 154
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 155
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 156
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 157
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 158
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 159
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 160
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 161
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 162
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 163
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 164
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 22 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 165
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 17 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 166
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 167
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 37 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 168
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 44 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 169
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 41 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 170
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 20 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 171
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 29 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 172
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 173
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 9 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 174
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 14 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 175
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 176
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 708 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 177
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 3345 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: 1 chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Ix) Features of the array
(A) Symbols representing sequence characteristics: Coding Sequence
(B) Location: 88 ... 2583
(D) Other information:
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 178
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 832 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: protein
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 179
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 1827 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 180
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 2284 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Ix) Features of the array
(A) Symbols representing sequence characteristics: Coding Sequence
(B) Location: 45 ... 2099
(D) Other information:
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 181
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 685 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: protein
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 182
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 54 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 183
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 184
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 185
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 186
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 187
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 188
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 189
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 24 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 190
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 26 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 191
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 192
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 193
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 39 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 194
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 195
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 9 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 196
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 9 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 197
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 198
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 199
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 200
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 201
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 19 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 202
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 40 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 203
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 204
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 205
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 206
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 207
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 208
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 209
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 210
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 211
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 717 base pairs
(B) Sequence type: nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: DNA
(Ix) Features of the array
(A) Symbols representing sequence characteristics: Coding Sequence
(B) Location: 1 ... 714
(D) Other information:
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 212
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 238 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: protein
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 213
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 282 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 214
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 282 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 215
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 279 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 216
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 277 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 217
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 277 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 218
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 219
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 220
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 221
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 247 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 222
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 258 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 223
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 224
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 267 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 225
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 277 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 226
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 277 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 227
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 228
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 259 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 229
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 230
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 231
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 232
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 247 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 233
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 249 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 234
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 277 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 235
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 258 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 236
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 259 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 237
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 238
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 247 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 239
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 240
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 248 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 241
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 282 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 242
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 243
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 259 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 244
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 257 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 245
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 282 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 246
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 262 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 247
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 264 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 248
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 259 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 249
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 44 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 250
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 40 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 251
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 21 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 252
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 23 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 253
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Ix) Features of the array
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 1
(D) Other information: Xaa is Ser or Thr
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 3
(D) Other information: Xaa is Arg or Lys
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 4
(D) Other information: Xaa is Lys or Arg
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 6
(D) Other information: Xaa is Ser or Leu
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 7
(D) Other information: Xaa is Arg, Ile, Val or Ser
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 8
(D) Other information: Xaa is Ser, Tyr, Phe or His
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 10
(D) Other information: Xaa is Phe, His or Arg
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 254
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 8 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Ix) Features of the array
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 2
(D) Other information: Xaa is Ser, Ala or Gly
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 4
(D) Other information: Xaa is Val or Gln
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 7
(D) Other information: Xaa is Pro, Gly or Ser
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 8
(D) Other information: Xaa is Trp or Tyr
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 255
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Ix) Features of the array
(A) Symbol representing the characteristics of the array: Modified Site
(B) Location: 7
(D) Other information: Xaa is Ala or Phe
(A) Symbol representing the characteristics of the sequence: Modified Site
(B) Location: 8
(D) Other information: Xaa is Arg or His
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 256
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 257
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 258
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 10 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 259
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 260
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 8 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 261
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 8 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 262
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 8 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 263
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 4 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 264
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 12 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

(2) SEQ ID NO: 265
(I) Features of the array
(A) Sequence length: 11 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(C) Number of chains:
(D) Topology: unknown
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Array

Claims (25)

A protein that specifically binds to the gastrointestinal tract receptor HPT1 (SEQ ID NO: 178) , wherein the protein mediates binding to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 55 or HPT1 A protein that contains part of a sequence . The protein of claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52. The protein of claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55. The protein according to any one of claims 1 to 3, which has a length of 40 amino acids or less. The protein according to any one of claims 1 to 3, which has a length of 30 amino acids or less. The protein according to any one of claims 1 to 3, which has a length of 20 amino acids or less. In which purified protein according to any one of claims 1-3. The protein according to claim 1, wherein the part exhibits the antigenicity or immunogenicity of the second protein, and the amino acid sequence of the second protein consists of SEQ ID NO: 52. The protein according to claim 1, wherein the part exhibits the antigenicity or immunogenicity of the second protein, and the amino acid sequence of the second protein consists of SEQ ID NO: 55. The protein according to claim 8 or 9 , wherein an antibody against the second protein can be bound to the part . 2. The protein of claim 1, wherein the portion is at least 15 contiguous amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52. 2. The protein of claim 1, wherein the portion is at least 15 contiguous amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55. The protein according to claim 1, wherein the protein is a fusion protein covalently fused to the amino acid sequence of a second protein. The composition containing the protein of any one of Claims 1-3 or 11-12 couple | bonded with the substance in which the said protein contains the active ingredient selected from the group which consists of a contrast agent , a chemical | medical agent , and an antigen . The composition according to claim 14 , wherein the substance is a particle containing the active ingredient. 15. A composition according to claim 14 , wherein the substance is a sustained release device comprising the active ingredient. The composition according to claim 14 , wherein the active ingredient is a drug. 18. A composition according to any one of claims 14 to 17, wherein the protein facilitates transport of active ingredients through human or animal gastrointestinal tissue. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the composition of any one of claims 14 to 17 and a pharmaceutically acceptable carrier. The nanoparticle or microparticle containing the protein of any one of Claims 1-3 or 11-12 . Use of the composition according to claim 14 for the manufacture of a medicament for delivery of an active ingredient to a subject in vivo upon administration. The use according to claim 21 , wherein the administration is oral administration. The use according to claim 21 , wherein the subject is a human. The use according to claim 21 , wherein the active ingredient is insulin . An isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the protein of claim 1.

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