JP4129178B2 - Stabilized interferon composition - Google Patents
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Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、概して、薬学的組成物に関し、より詳細には、安定化された、液体のまたは凍結乾燥されたタンパク質(インターフェロンβなどを含む)の処方物に関する。
【0002】
(発明の背景)
インターフェロンは、ウイルス、二本鎖RNA、他のポリヌクレオチド、抗原およびマイトジェンを含む多数のシグナルによって、細胞からの分泌が誘導される糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、多数の生物学的活性を示し、これには、抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節活性が含まれる。少なくとも3つの異なる型のヒトインターフェロンα、βおよびγが、抗ウイルス活性および抗増殖活性を含む多数の因子に基づいて識別されている。
【0003】
インターフェロンβ(IFN−β)は、多発性硬化症(MS)を伴う患者にとって初めて有効であると同定された処置であり、そして再発性MSおよび弛張性MSに罹患した患者が受ける攻撃の数を減少することが実証された。IFN−β組成物はまた、B型肝炎およびC型肝炎の感染の処置において有用である。
【0004】
すべてのタンパク質ベースの医薬と同様に、治療剤としてIFN−βの使用において克服されねばならない1つの主要な障壁は、薬学的処方物におけるその不安定性から生じ得る薬学的有用性の喪失である。薬学的処方物におけるポリペプチドの活性および効力を脅かす物理的不安定性としては、変性ならびに可溶性および不溶性の凝集物の形成が挙げられ、他方、化学的不安定性としては、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化および脱アミド課が挙げられる。これらの変化のいくつかは、目的のタンパク質の薬学的活性の喪失または低減をもたらすことが知られる。他の場合において、これらの変化の正確な効果は知られていないが、得られる分解産物はなおも、所望されない副作用についての可能性に起因して、薬学的に受容可能ではないと考えられるべきである。
【0005】
薬学的調製物においてポリペプチドの不安定性は、タンパク質ベースの医薬の承認のために設定されたガイドラインは、そのポリペプチドの活性および分子特性における変化が最小限であるべきであることが強調されているように、直接、それらの薬学的有用性に影響を与える。例えば、International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use(欧州連合、日本および米国における実行のための、医薬に関連する政策提言を行う三極機関)によって発行されたバイオテクノロジー/生物製剤の安定性試験に関する1995年11月30日の報告は、「分解産物形成の指標となる有意な定量的または定性的な変化が長期間の安定性、加速安定性、および/またはストレス安定性の研究の間に検出される場合、可能な有害性ならびに長期安定性プログラム内の分解産物の特徴づけおよび定量についての必要性に対して考慮が与えられるべきである。」と言及している。
【0006】
その結果、さらなるタンパク質薬学的組成物(IFN−β組成物を含む)についての必要性が存在する。この組成物は、還元性の不純物が実質的にない生理学的に適合可能な安定剤を含み、それにより、そのタンパク質を安定化し、そしてその薬学的有用性を増強する。
【0007】
(発明の要旨)
治療活性成分としてIFN−βおよび賦形剤として高度に精製されたマンニトールを含む組成物が提供される。その組成物は、高度に精製されていないマンニトールを含むIFN−β組成物と比較して、貯蔵の間の安定性の改善によって特徴付けられる。これらの組成物の製造方法もまた提供される。
【0008】
(発明の詳細な説明)
本発明は、安定性が増大したIFN−β薬学的組成物、およびそれらの調製方法に関する。この組成物は、IFN−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む。この高度に精製されたマンニトールは、分解産物の形成を減少させることによってその処方物の安定性を増大させる。安定化されたIFN−β処方物は、より安全である(可能な有害な副作用が減少することに起因する)、およびより経済的である(処方物の寿命が増大することによる)という点で有利である。
【0009】
開示された組成物の安定性の増大は、高度に精製されたマンニトールの使用から生じる。本発明の新規な知見は、高度に精製されていないマンニトールがIFN−βと相互作用して所望されない付加物(分解産物)を生成する還元活性を含むのに対して、他方、高度に精製されたマンニトールは、この還元活性を含まず、そしてIFN−β処方物におけるこれらの付加物の形成を生じないことである。本明細書において提示される実験結果(実験の節における実施例1を参照のこと)は、IFN−β付加物形成を担う精製されていないマンニトール中に存在する還元活性は、還元糖活性ではないことを示す。なぜなら、高度に精製されていないマンニトールの存在下で形成された付加物は、既知の還元糖活性(例えば、デキストロース)を有する賦型剤の存在下で形成される付加物とは明らかに識別され得るからである。
【0010】
本明細書において用いられる「高度に精製されたマンニトール」とは、低レベルの還元活性を有するマンニトールをいう。高度に精製されたマンニトールの還元活性は、本明細書において別の場所において記載される還元活性アッセイによって測定されると20ppmUSP未満である。種々の実施形態において、高度に精製されたマンニトールの還元活性は、19ppm未満であり、18ppm未満であり、17ppm未満であり、16ppm未満であり、15ppm未満であり、14ppm未満であり、あるいは13ppm未満である。1つの実施形態において、高度に精製されたマンニトールはUSP(米国薬局方)またはACS(米国化学会)等級のマンニトールである。この等級のマンニトールは、1)メタノール抽出;2)炭素処理;3)限外濾過;および4)再結晶化のさらなる工程を受けている。高度に精製されたマンニトールは、その処方物を安定化するために十分な濃度で存在する。本発明に包含される処方物は、約0.1%(w/v)ほどの少なさの高度に精製されたマンニトールを有していてもよく、または約7.5%(w/v)ほどの多さの高度に精製されたマンニトールを有していてもよい。種々の実施形態において、このマンニトールは、約0.2〜約7.0%の濃度で存在し、約0.25%〜約2.5%の濃度で存在し、そして約1.25%の濃度で存在する。
【0011】
治療活性成分としてIFN−β、および賦型剤として高度に精製されたマンニトールを含む、液体および凍結乾燥の両方の薬学的組成物が開示される。本発明の目的のために、薬学的組成物または処方物に関し、用語「液体」とは、用語「水性」を包含することが意図される。IFN−β薬学的処方物に関し用語「凍結乾燥」とは、複数のバイアルの減圧下での迅速な凍結乾燥(フリーズドライ)をいう。このバイアルは各々、本発明のインターフェロン処方物の単位用量をその中に含む。上記凍結乾燥を行う凍結乾燥剤は市販されており、そして当業者によって容易に実施され得る。本発明の1つの実施形態において、液体組成物は凍結乾燥されている。
【0012】
本発明の液体または凍結乾燥されたIFN−β処方物は、「安定化される」。「安定化された」組成物あるいは「増大した安定性」または「改善された安定性」を有する組成物とは、高度に精製されていないマンニトールを用いて処方されたIFN−β組成物に対して貯蔵安定性が増大した組成物を意味する。安定性のこの増大は、高度に精製されていないマンニトールを用いた処方物との比較において、貯蔵の間のIFN−β付加物または分解産物の処方物における減少によって証明される。付加物または分解産物の形成は、本明細書において記載される質量分析アッセイを用いて測定され得る。安定化された、高度に精製されたマンニトール処方された本発明のIFN−β組成物は、本明細書において記載される質量分析アッセイによって決定されるように、USPマンニトール処方されたIFN−βにおいて、マンニトールなしで処方されるIFN−β組成物と比較したときに観察されるさらなるピークの非存在によって特徴付けられる。例えば、図9に示される、高度に精製されたマンニトールを用いて処方されたIFN−βの質量スペクトルを参照のこと。これは、図10に示されるマンニトールなしで処方されたIFN−βの質量スペクトルと比較してさらなるピークを示さない。対照的に、図11に示される、USPマンニトールで処方されたIFN−βの質量スペクトルは、マンニトールなしで処方されたIFN−βの質量スペクトルと比較して、多数のさらなるピーク(付加物)を解像する。本発明の安定化されたIFN−β薬学的処方物は、その効力を保持し、そして30℃で貯蔵したときに約2年までの期間にわたり、および25℃で貯蔵したときに少なくとも2年間、0.02mg/ml未満のグルコシル化されたIFN−βを含む。
【0013】
本発明の安定化された薬学的処方物は、IFN−βおよびその改変体を含む。本明細書において使用される用語「IFN−β」とは、IFN−βまたはその改変体(これは、ときに、IFN−β様ポリペプチドと呼ばれる)をいう。ヒトIFN−β改変体(これは、天然に存在するもの(例えば、IFN−β遺伝子座において生じる対立遺伝子改変体)であり得るか、または組換え産生され得る)は、ネイティブの成熟IFN−β配列と同じか、類似するか、または実質的に類似する、アミノ酸配列を有する。活性を保持するIFN−βフラグメントまたはIFN−βの短縮形態もまた、包含される。これらの生物学的に活性な、IFN−βのフラグメントまたは短縮形態は、全長IFN−βアミノ酸配列から、当該分野において周知の組換えDNA技術を用いてアミノ酸残基を除くことによって生成される。IFN−βポリペプチドは、グルコシル化されていてもよく、グルコシル化されていなくてもよい。なぜなら、文献において、グルコシル化されているIFN−βポリペプチドおよびグルコシル化されていないIFN−βポリペプチドの両方が質的に類似する特異的活性を示し、そして従ってグルコシル化部分は、IFN−βの生物学的活性に関与せず、そして寄与もしていないと報告されているからである。
【0014】
本明細書において含まれるIFN−β改変体は、ネイティブの成熟IFN−β配列のムテインを含む(例えば、米国特許第5,814,485号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される)。ここでは、生物学的活性に必須ではない1つまたは複数のシステイン残基が故意に欠失されているか、または他のアミノ酸で置き換えられ、分子間架橋または不正確な分子間ジスルフィド結合形成のいずれかのための部位が除去されている。この型のIFN−β改変体は、ネイティブの成熟アミノ酸配列のアミノ酸17に見出されるシステインに代えて、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、またはメチオニンを含む改変体を包含する。セリンおよびスレオニンは、それらがシステインと化学的に類似することから、もっとも好ましい置換物である。セリン置換がもっとも好ましい。例えば、ネイティブの成熟配列のアミノ酸17において見出されるシステインがセリンで置換されたIFN−β改変体を参照のこと(米国特許第5,814,485号)。システイン17はまた、当該分野において公知の方法を用いて欠失され得る(例えば、米国特許第4,588,584号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される)。このことにより、ネイティブの成熟IFN−βよりも1アミノ酸短い成熟IFN−βムテインが生じる。例としてはまた、米国特許第4,530,787号;同第4,572,798号;および同第4,588,585号を参照のこと。従って、たとえば、その薬学的有用性を改善する1つまたは複数の改変体を有するIFN−β改変体もまた、本発明に包含される。
【0015】
当業者は、更なる変化が、IFN−βをコードするヌクレオチド配列への変異によって、インターフェロンの生物学的活性を変化させることなく、IFN−βアミノ酸配列における変化を生じることによって導入され得ることを理解する。従って、ネイティブの成熟IFN−βについてのアミノ酸配列とは異なる配列を有するIFN−β改変体をコードする、単離された核酸分子は、1または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列へと導入し、それにより1または複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が、コードされるIFN−βへと導入されることによって作製され得る。変異は、標準的な技術(例えば、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発)によって導入され得る。そのようなIFN−β改変体もまた、本発明に包含される。
【0016】
例えば、保存的アミノ酸置換は、1または複数の予測された、好ましくは非必須のアミノ酸残基において行われ得る。「非必須」のアミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなくIFN−βの野生型配列とは異なり得る残基である。他方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」とは、そのアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換をいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を包含する。そのような置換は、保存されたアミノ酸残基に対してはなされないか、あるいは、保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対しては行われない。
【0017】
あるいは、改変体IFN−βヌクレオチド配列は、飽和変異誘発のような、IFN−βコード配列のすべてまたは部分にわたってランダムに導入される変異によって作製され得る。そして、得られた変異体は、IFN−βの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を保持する変異体を同定し得る。変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性は、本明細書において記載される標準的なアッセイ技術を用いて決定され得る。
【0018】
IFN−βの生物学的に活性な改変体は、一般的に、比較の基礎として作用する、参照IFN−βポリペプチド(例えば、ネイティブヒトIFN−β)に対して、少なくとも80%、より好ましくは約90〜約95%またはそれを超えるか、そしてもっとも好ましくは約96%〜約99%またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する。「配列同一性」とは、改変体ポリペプチド、ならびにその改変体のアミノ酸配列の、特定の連続セグメントが参照分子のアミノ酸配列とアラインメントし、そして比較されるとき、参照として作用するポリペプチド分子内に見出される、同じアミノ酸残基を意味する。
【0019】
配列同一性決定の目的のために2つの配列の最適なアラインメントの目的のために、改変体のアミノ酸配列の連続セグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対して、さらなるアミノ酸残基を有し得るかまたはアミノ酸残基の欠失を有し得る。参照アミノ酸配列に対して比較するために使用される連続セグメントは、少なくとも20の連続アミノ酸残基を含む。改変体アミノ酸配列中へのギャップの挿入に伴う配列同一性の増大に関する補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行われ得る。配列アラインメントの方法は、当該分野において周知である。
【0020】
従って、任意の2つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために利用される、1つの好ましいが非限定的な数学アルゴリズムの例としては、Myers and Miller (1988)Comput.Appl.Biosci.4:11〜7のアルゴリズムが挙げられる。そのようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)において利用される。このプログラムは、GCGアラインメントソフトウェアパッケージの一部である。PAM120重量残基の表、12のギャップ長さペナルティ、および4のギャップペナルティが、アミノ酸配列の比較のときのALIGNプログラムに対して用いられ得る。2つの配列を比較する際に使用するための、別の好ましい非限定的な数学アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877のアルゴリズムであり、これは、Karlin and Altshcul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873−5877において改変される。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403〜410のNBLASTおよびXBLASTプログラムへと取り込まれている。BLASTアミノ酸配列検索は、XBLASTプログラムを用いて実施され得る。ここで、スコア=50であり、ワード長=3である。その結果、目的のポリペプチドと類似のアミノ酸配列が得られる。比較の目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップのあるBLASTは、Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載されるように利用され得る。あるいは、PSI−BLASTを使用して、分子間の離れた関係を検出するインターレイト検索を行うことができる。Altschul et al.(1997)前出を参照のこと。BLAST、ギャップのあるBLASTまたはPSI−BLASTのプログラムを利用する場合、デフォルトパラメータが使用され得る。http://www.ncbi.n1m.nih.govを参照のこと。Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.中のALIGNプログラム(Dayhoff(1978))、およびWisconsin Sequence Analysis Package,Version 8(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsinから入手可能)中のプログラム(例えば、GAPプログラム)もまた参照のこと。ここでは、このプログラムのデフォルトパラメータが利用される。
【0021】
アミノ酸配列同一性の比率を考慮するとき、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質機能の特性に影響を与えない、保存的アミノ酸置換の結果として異なり得る。これらの場合、パーセント配列同一性は、上方に修正されて保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明することができる。そのような修正は当該分野において周知である。例えば、Myers and Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11−17を参照のこと。
【0022】
本発明に包含される生物学的に活性なIFN−β改変体は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)またはアルブミンに共有結合架橋されたIFN−βポリペプチドも含む。これらの共有結合のハイブリッドIFN−β分子は、特定の所望の薬学的特性(例えば、患者への投与後の血清半減期の延長)を有する。PEG−IFN付加物を作製するための方法は、モノメトキシポリエチレングリコールを化学改変してIFN−βと反応する活性化化合物を作製することを含む。PEG連結されたポリペプチドを作製および使用するための方法は、例えば、Delgado et al.(1992)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.9:249〜304に記載される。アルブミン融合ポリペプチドを作製する方法は、目的のポリペプチド(例えば、IFN−β)およびアルブミンのコード配列の融合を包含し、そして米国特許第5,876,969号に記載されており、これは、本明細書において参考として援用される。これらのハイブリッドIFN−β分子は、USPマンニトール中に存在する不純物と反応し、そして高度に精製されたマンニトールとともに処方されるとき、より安定である。
【0023】
本発明に包含されるIFN−βの生物学的に活性な改変体は、IFN−β活性(特に、IFN−βレセプターへの結合能)を保持するべきである。いくつかの実施形態において、IFN−β改変体は、参照IFN−βポリペプチド(たとえば、ネイティブなヒトIFN−β)の少なくとも約25%、約50%、約75%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%またはそれより高い生物学的活性を保持する。参照IFN−βポリペプチドの活性と比較してその活性が増加しているIFN−β改変体もまた包含される。IFN−β改変体の生物学的活性は、当該分野において公知の任意の方法によって測定され得る。そのようなアッセイの例は、以下に見出され得る:Fellous et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:3082−3086;Czerniecki et al.(1984)J.Virol.49(2):490−496;Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662−5666;Branca et al.(1981)Nature 277:221−223;Williams et al.(1979)Nature 282:582−586;Herberman et al.(1979)Nature 277:221−223;Anderson et al.(1982)J.Biol.Chem.257(19):11301−11304;および本明細書において記載されるIFN−β効力アッセイ(実施例2を参照のこと)。
【0024】
本発明の処方物のIFN−βは、以下を含むがそれらに限定されない任意の動物種に由来し得る:鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒト。好ましくは、IFN−βは、その処方物が哺乳動物IFN−β障害の処置において使用されるべきときは、哺乳動物種に由来し、より好ましくは、これは、そのような障害について処置を受ける哺乳動物と同じ種の哺乳動物種由来である。
【0025】
本発明に包含されるIFN−βポリペプチドおよびIFN−β改変体ポリペプチドの非限定的な例は、以下に示される:Nagata et al.(1980)Nature 284:316−320;Goeddel et al.(1980)Nature 287:411−416;Yelverton et al.(1981)Nucleic Acids Res.9:731−741;Streuli et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2848−2852;EP028033BlおよびEP109748Bl。以下もまた参照のこと:米国特許第4,518,584号;第4,569,908号;第4,588,585号;第4,738,844号;第4,753,795号;第4,769,233号;第4,793,995号;第4,914,033号;第4,959,314号;第5,545,723号;および第5,814,485号。これらの開示は、本明細書において参考として援用される。これらの引用はまた、生物学的活性の喪失なしに変化され得るIFN−βポリペプチドの残基および領域に関するガイダンスを提供する。
【0026】
本発明の1つの実施形態において、安定化された薬学的処方物内のIFN−βは、ネイティブな成熟IFN−βポリペプチドである。別の実施形態において、これらの処方物におけるIFN−βは、成熟IFN−βポリペプチドであって、ネイティブの成熟配列のアミノ酸17に見出されるシステインは、上記に議論したようにセリンで置換される。しかし、本発明は、安定化された薬学的処方物内のIFN−βが任意の生物学的に活性なIFN−βポリペプチドであるかまたは本明細書において他の場所に記載される改変体である、他の実施形態を包含する。
【0027】
本発明のこのいくつかの実施形態において、IFN−βは、組換え産生される。「組換え産生されたIFN−β」とは、ネイティブの成熟なIFN−βに匹敵する生物学的活性を有し、そして組換えDNA技術によって調製されているIFN−βを意図する。IFN−βは、IFN−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって生成され得る。この宿主細胞は、ヌクレオチド配列を転写し得、その所望のタンパク質を産生し得る細胞であり、そして、原核生物(たとえば、E.coli)であり得、または真核生物(たとえば、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞)であり得る。IFN−βの組換え産生の例は、以下に与えられる:Mantei et al.(1982)Nature 297:128;Ohno et al.(1982)Nucleic Acids Res.10:967;Smith et al.(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156,ならびに米国特許第4,462,940号;第5,702,699号;および第5,814,485号;これらは、本明細書において参考として援用される。米国特許第 5,795,779号もまた参照のこと。ここでは、IFN−β−1aがチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で組換え産生される。これもまた、本明細書において参考として援用される。ヒトインターフェロン遺伝子は、組換えDNA(「rDNA」)技術を用いてクローニングされ、そしてE.coliにおいて発現されている(Nagola et al.(1980)Nature 284:316;Goeddel et al.(1980)Nature 287:411;Yelverton et al.(1981)Nuc.Acid Res.9:731;Streuli et al.(1981)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.78:2848)。あるいは、IFN−βは、当該分野において公知の方法に従って、目的のIFN−βタンパク質を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物によって産生され得る。
【0028】
あるいは、IFN−βは、ペプチド技術分野における当業者に公知のいくつかの任意の技術により化学合成され得る。たとえば、以下を参照のこと:Li et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2216−2220,Steward and Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois),およびBaraney and Merrifield(1980)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,ed.Gross and Meinhofer,Vol.2(Academic Press,New York,1980),pp.3−254(これは、固相ペプチド合成技術を議論する);ならびにBodansky(1984)Principles of Peptide Synthesis (Springer−Verlag,Berlin)ならびにGross and Meinhofer,eds.(1980)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Vol.1(Academic Press,New York)(これは、古典的な溶液合成を議論する)。IFN−βはまた、同時複数ペプチド合成の方法により化学的に調製され得る。例えば、以下を参照のこと:Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131−5135;および米国特許第4,631,211号。
【0029】
本発明により包含される組成物は、少なくて約0.01mg/mlのIFN−β〜多くて約15mg/ml(重量/容量)のIFN−βを有し得る。種々の実施形態において、IFN−βは、約0.015mg/ml〜約12.5mg/mlの濃度、約0.025mg/ml〜約10mg/mlの濃度、約0.05mg/ml〜約8mg/mlの濃度、約0.075mg/ml〜約6mg/mlの濃度、約0.1mg/ml〜約4mg/mlの濃度、約0.125mg/ml〜約2mg/mlの濃度、約0.175mg/ml〜約1mg/mlの濃度、約0.2mg/ml〜約0.5mg/mlの濃度、約0.225mg/ml〜約0.3mg/mlの濃度、ならびに約0.25mg/mlの濃度で存在する。
【0030】
いくつかの実施形態において、本発明の処方物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、貯蔵、投与、および/または治療成分の治癒効果を容易にするために従来より当該分野において使用されているキャリアを意図する。キャリアはまた、IFN−βの所望されない任意の副作用を減少させ得る。適切なキャリアは、安定であるべき、すなわち、処方物における他の成分と反応し得ないべきである。これは、処置のために使用される投薬量および濃度においてレシピエントにおける有意な局所または全身性の有害作用を生成すべきではない。そのようなキャリアはは、一般に、当該分野において知られている。本発明に適切なキャリアは、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ポリサッカリド、モノサッカリド、ポリビニル−ピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、不揮発性油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、ソルビトール、ポリエチレングリコール(PEG)などの従来使用される大きな安定した高分子である。徐放性キャリア(例えば、ヒアルロン酸)もまた、適切であり得る。特に、Prisell et al.(1992)Int.J.Pharmaceu.85:51−56、および米国特許第5,166,331号を参照のこと。この組成物中の他の受容可能な成分としては、等張性を改変する薬学的に受容可能な薬剤が挙げられるがそれらに限定されず、水、塩、糖、ポリオール、アミノ酸、および緩衝剤が含まれる。適切な緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、および他の有機酸またはその塩、ならびに等張性を改変する塩(例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなど)が挙げられ、そして上記の緩衝剤をも含み得る。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは、ヒトアルブミンである。ヒトアルブミンは、天然に存在するヒトアルブミンであり得るか、あるいは組換え産生されたヒトアルブミンであり得る。これらの2つの形態は、本明細書において総称して「ヒトアルブミン」と呼ぶ。本発明に包含される処方物は、少なくて約0.01%(重量/容量)のヒトアルブミン〜多くて約15%(重量/容量)ヒトアルブミンを有し得る。種々の実施形態において、ヒトアルブミンは、約0.025%〜約12.5%の濃度、約0.05%〜約10%の濃度、約0.1%〜約9%の濃度、約0.25%〜約8%の濃度、約0.5%〜約7%の濃度、約0.6%〜約2%の濃度、約0.7%〜約1.75%の濃度、約0.75%〜約1.5%の濃度、約1.2%〜約1.3%の濃度、ならびに約1.25%の濃度で存在する。
【0032】
薬学的組成物は、さらに、可溶化剤または可溶性増強剤を含み得る。グアニジウム基を含む化合物(もっとも好ましくは、アルギニン)は、IFN−βについて適切な可溶性増強剤である。そのような可溶性増強剤の例としては、アミノ酸アルギニン、およびアルギニンのアミノ酸類似体であって、IFN−βの可溶性を増強する能力を保持するものが挙げられる。そのような類似体としては、限定することなく、アルギニンを含むジペプチドおよびトリペプチドが挙げられる。さらなる適切な可溶化剤は、以下に議論される:米国特許第4,816,440号;第4,894,330号;同第5,004,605号;同第5,183,746号;同第5,643,566号;ならびにWang et al.(1980)J Parenteral Drug Assoc.34:452−462、これらは、本明細書において参考として援用される。
【0033】
本発明に包含される、非限定的な可溶化剤の例としては、IFN−βを可溶化するに適切な疎水性親水性バランスを有する表面活性剤(界面活性剤)が挙げられる。強力な天然のまたは合成のアニオン性表面活性剤(例えば、脂肪酸のアルカリ金属塩およびアルカリ金属アルキル硫酸塩)が使用され得る。そのような薬剤は、通常、10〜14の炭素原子を含む。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)およびラウリル酸ナトリウムは、特に好ましい可溶化剤である。本発明の組成物において使用され得る他の可溶化剤の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:ドデシルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナトリウム、ミルスチン酸ナトリウム、カプロイル酸ナトリウム、ドデシルN−サルコシン酸ナトリウム、およびテトラデシルN−サルコシン酸ナトリウム。表面活性剤または乳化剤による医薬の古典的な安定化は、例えば、以下に記載される:Levine et al.(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3):160−165。さらなる適切な表面活性剤は、以下に議論される:米国特許第4,507,281号;同第4,816,440号;および同第5,183,746号。これらは、本明細書において参考として援用される。
【0034】
上記に開示される薬剤に加え、他の安定化剤(例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)またはその塩の一つ(例えば、EDTA二ナトリウム)を加えて、液体薬学的組成物の安定性をさらに増強することができる。EDTAは、多くの酸化反応を触媒することが知られる金属イオンのスカベンジャーとして作用し、したがって、さらなる安定化剤を提供する。
【0035】
IFN−β処方物が、哺乳動物(例えば、ヒト)への送達に使用される場合、その組成物の等張性もまた、考慮事項である。従って、1つの実施形態において、IFN−βの注射可能な溶液のための組成物は、患者の血清または体液のものと同じかまたは類似する等張性を提供する。等張性を達成するために、塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはリン酸緩衝剤)は適切な濃度でその溶液に加えられ得る。
【0036】
処方物のpHもまた、考慮事項である。本発明の安定化されたIFN−β処方物は、約3.0〜約9の範囲のpHを有する。適切なpHの範囲は、例えば、約4.0〜約8.8、約5.0〜約8.6、約6.0〜約8.4、約6.8〜約8.2、約6.9〜約8.0、約7.0〜約7.8、約7.1〜約7.7、約7.2〜約7.6、および約7.3〜約7.5を包含する。
【0037】
本発明の、安定化された液体IFN−β処方物、または再構成された安定化された凍結乾燥されたIFN−β薬学的処方物の薬学的に有効な量が被検体に投与される。「薬学的に有効な量」とは、疾患または状態の処置、予防または診断において有用な量を意図する。投与の代表的な経路としては、経口投与、経鼻送達、肺送達、および非経口投与(経皮、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内および腹腔内の注射または注入を含む)が挙げられるがそれらに限定されない。1つのそのような実施形態において、投与は、注射、好ましくは皮下注射による。本発明の組成物の注射可能形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられるがそれらに限定されない。代表的に、IFN−βの治療上有効な量は、約0.01μg/kg〜約5mg/kgの組成物、好ましくは約0.05μg/kg〜約1000μg/kg、より好ましくは約0.1μg/kg〜約500μg/kg、さらにより好ましくはなお約0.5μg/kg〜約30μg/kgを包含する。
【0038】
1つの実施形態において、IFN−βを含む安定化された薬学的組成物は、単位投薬量で処方され、そして溶液、懸濁液またはエマルジョンのような注射可能または注入可能な形態であり得る。さらに、この組成物は、乾燥形態で(例えば、凍結乾燥粉末)凍結貯蔵または調製され得る。これは、経口または非経口の投与経路を含む、種々の方法のいずれかによって、投与前に液体溶液、懸濁液またはエマルジョンへと再構成され得る。安定化された薬学的組成物は、メンブレン濾過によって滅菌され得、そして封入バイアルまたはアンプルのような単位用量または多数回用量の容器中に貯蔵される。当該分野において一般的に公知の薬学的組成物を処方するためのさらなる方法は、それらが開示される高度に精製されたマンニトールの有益な効果に有害に影響しない限り、本明細書に開示された薬学的組成物の貯蔵安定性をさらに増強するために使用され得る。処方物および薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤などの選択の完全な議論は、以下に見出され得る:Reminington’s Pharmaceutical Sciences(1990)(18th ed.,Mack Pub.Co.,Eaton,Pennsylvania)、これは、本明細書において参考として援用される。
【0039】
いくつかの実施形態において、本発明の液体組成物は、シリンジ(本発明の「予備充填された」シリンジ)中に包装される。次に、1つの実施形態において、本発明の組成物を含む予備充填されたシリンジは、凍結され得る。この凍結された予備充填されたシリンジは、貯蔵または輸送の目的のために有用である。
【0040】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されるのではない。
【0041】
(実験)
(実施例1:安定性が増大したIFN−β薬学的処方物の開発)
I.序論
賦形剤としてデキストロースを含むIFN−β薬学的処方物は当該分野において知られている。そのような処方物が37℃以上の温度でインキュベートされるとき、これらの処方物におけるデキストロースは、IFN−βとともに共有結合付加物を形成し、これは、RP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)によって検出され得る。USPマンニトールで処方されるIFN−βは、同じ条件下でRP−HPLC検出可能な共有結合付加物を形成しない。しかし、USPマンニトールは、IFN−βと合わせて、エレクトロスプレー質量分析によって検出される付加物種を形成する不純物を含む。USPマンニトール中の不純物の性質は、知られていない。これらの付加物(または分解産物)の形成は、薬学的に所望されないと考えられており、薬学的に受容可能ではないとまで考えられている。ポリペプチドベースの医薬についての現在のガイドラインは、処方物における分解産物の形成を最小限にすることの重要性を強調しているからである。分解産物は、所望されないかまたは受容可能ではないと考えられている。なぜなら、それらは、そのペプチドベースの医薬が所望されない副作用を生じる機会を増大するからである。本発明の新規な知見は、IFN−βがそれが高度に精製されたマンニトールと処方されるとき、安定性の増大を示し、その結果、その還元活性は、高度に精製されていないマンニトールで処方されるときと比べて、20ppm未満であることである。本発明のさらなる新規な知見は、メタノールでの抽出、炭素処理、限外濾過および再結晶化によるUSPマンニトールの精製が、20ppm未満の還元活性を伴うマンニトール調製物を生じることである。
【0042】
II.方法
これらの実験において使用するためのIFN−β−1bを、本質的に米国特許第4,462,940号および同第5,702,699号(これらは、参考として援用される)において記載されるようにE.coliにおいて生成した。ドデシル硫酸ナトリウムおよび塩をIFN−βからクロマトグラフィーにより除き;そしてIFN−β−1bを、ヒトアルブミンの溶液とpH11.5〜12.0で合わせた。溶液のpHを、HClで7.5に調整した。そして賦形剤((マンニトールまたはデキストロース)を含む溶液を加えて最終濃度を1.25%にした。その処方物におけるヒトアルブミンの最終濃度は、1.25%w/vであった。
【0043】
これらの処方物からのIFN−β−1bを、RP−HPLCによる質量分析のために調製した。この方法によって、クロマトグラムにおける分離したピーク(B1)として分離された後、グルコシル化したIFN−β−1bの定量が可能となる。この方法でのグルコシル化されたIFN−β−1bについての検出限界は、0.02mg/mlである。このピークの量が0.02mg/ml未満の場合、2つのピーク面積が合算され、そして処方されていないIFN−β参照と比較されて、IFN−β−1bの合計含量を得る。このピーク面積が0.02mg/mlを超える場合、その濃度は、独立に決定されそして報告される。
【0044】
以下の装置およびそのそれぞれの製造業者の指示マニュアルを分析に使用した。
【0045】
溶媒送達系:Waters 626 Gradient Pump
注射系:Waters 717およびAutosampler 200 ml注射ループ
ポリプロピレンオートサンプラーバイアル(Teflon septa付)
オートサンプラー温度制御を4℃に設定して冷蔵
84%アセトニトリルを針洗浄として使用する。
【0046】
カラムヒーター:Waters 600
カラムヒーターを40℃に設定
カラム:BAKERBOND Wide−Pore Butyl C4 RP−Column,300Å 5μm,4.6 mm(ID)250 mm,J.T.Baker part number 22010。
【0047】
カラムを、カラム標識において指示されるように溶媒流の方向に接続し、そしてカラムヒーターに配置した。
【0048】
検出器:Waters 486 UV Detector。
【0049】
波長を214nmに設定する。
【0050】
データシステム入力を減衰させない。
【0051】
データシステム:P.E.Nelson Turbochrom Data System
凍結乾燥させたIFN−β処方物サンプルを、1.20mlの0.54%塩化ナトリウムで再構成し、緩やかに反転させて混合し、そして雰囲気温度で30±5分間インキュベートした。キャリブレータは、処方されていないIFN−β参照である。キャリブレータストック溶液は、約0.5mg/mlにまで希釈され、そして希釈されたキャリブレータ溶液の濃度は、UV吸収によって決定される(6連の平均)。希釈されたキャリブレータ溶液の最終濃度は、UV吸収の読み取りの平均を1.7(IFN−β−1b吸光係数)で割ったものである。希釈されたキャリブレータ溶液濃度は、3つの顕著な形態に対する吸収によって決定される。次いで、キャリブレータ溶液を、作業用キャリブレータ溶液として使用するために0.25mg/mlに希釈した。
【0052】
オートサンプラーを、1回の注射あたり20μlで70分の間隔で注射するようにプログラムした。このデータシステム電圧範囲は1ボルトであり、サンプリング速度は、1秒あたり1点であり、そして獲得時間は70分であった。溶離液Aは0.1% TFA(トリフルオロ酢酸、HPLC等級)であり、そして溶離液Bは84%アセトニトリル(HPLC等級)および0.084% TFA(HPLC等級)であった。溶出流速を1.0ml/分(70%溶離液Aおよび30%溶離液B)に設定し、そしてカラムを1時間平衡化した。検出器の基底線およびシステムを平衡化した後、勾配ブランクを分析した。分析を、第二の勾配ブランクにおいて顕著なピークが存在しないときにはじめた。
【0053】
IFN−β濃度を、改変されていないIFN−β(「B」ピーク)およびグルコシル化されたIFN−β(「B1」ピーク)に対応するピークの面積の合計から決定する。例えば、キャリブレータ溶液が0.25mg/mlの処方されていないIFN−βである場合、IFN−β濃度(mg/ml)=(試験サンプル合計ピーク面積B1+B/キャリブレータ合計ピーク面積B1+B)×0.25mg/mlである。
【0054】
エレクトロスプレイ質量スペクトル(ES−MS)データを、このクロマトグラフィーからの画分を用いて得た。分析の前におのおののピークの画分を収集し、そして濃縮した。エレクトロスプレイ質量スペクトルを、Harvard シリンジポンプ(Harvard Apparatus,South Natick,MA)およびRheodyne 8125インジェクタ(100μM内径の溶融シリカチューブ付)を装着した、API 100単一四重極質量スペクトロメータ(Perkin−Elmer Sciex Instruments,Thornhill,Ontario,Canada)を用いて得た。質量スペクトルを、0.2Daの工程サイズを用いて6秒/走査で、140〜2500の範囲の質量/電荷比(m/z)を走査することによって正モードで記録した。質量スペクトロメータを、2mM酢酸アンモニウムを含む50:50:0.1の水:メタノール:蟻酸(v:v:v)中に3.3×10−5M PPG425、1×10−4M PPG1000および2×10−4M PPG2000(Aldrich Chemical Co.)を含むポリプロピレングリコール混合物を用いて較正した。タンパク質溶液(2μL中に20〜50pM)のアリコートを、49:40:1の水:アセトニトリル:酢酸中の質量スペクトロメータイオン供給源中に20μL/分で導入した。タンパク質は、低いpHでイオン供給源中に導入されることから、塩基性部位(例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの残基の側鎖における窒素原子)は、種々の程度でプロトン化されて、プロトン化についてアクセス可能な部位の数に依存して、多数の荷電状態を有する分子イオン(例えば、[M+H]+,[M+2H]2+)を生じる。検出器は、種々の荷電状態における分子イオンのm/z比を記録し、そして質量スペクトルは、Biotoolboxソフトウェア(Perkin−Elmer Sciex Instruments)を用いてデコンボリューションをして、タンパク質の分子量を得ることができる。20kDaでの分子量測定の質量精度は、2kDa以内であった。
【0055】
マンニトールの還元活性を、USPプロトコルの改変によって決定した。このプロトコルは、ビシンコニン酸(BCA、Pierce、製造業者の指示に従って調製した)の存在下でのアルカリ溶液におけるCu2+の減少を測定する。BCAはCu1+と錯体を形成し、そしてこの錯体は、562nmでのピーク吸収(A)を伴う青色を有する。
【0056】
2つのマンニトールサンプル(500μlの150mg/mlマンニトール溶液)を、各々の条件についてアッセイした。標準曲線を、既知の還元活性を用いて、グルコース溶液の連続希釈を用いて作成した。500μlの調製されたBCA溶液を、各々の試験サンプル、標準サンプルおよびブランクに加え、そして60℃で40分間インキュベートした。グルコース標準を、線形曲線に適合させ、そしてマンニトール試験サンプルの還元活性(ppm)を、((マンニトールサンプルのA562/標準曲線の勾配)/(マンニトール含量mg/ml(1000))×106)として計算した。
【0057】
III.結果および考察
グルコシル化を、IFN−β−1bの分子量に加えられた162ダルトンの乗数として質量分析を用いて、デキストロース処方物において検出した。IFN−β−1bペプチドの分析によって、これらの付加物がタンパク質のリジン残基と還元糖との反応(アマドリ反応)から生じることが示唆された。図1は、デキストロース処方物の処方されたバルクのRP−HPLCクロマトグラムを、50℃で1週間貯蔵した凍結乾燥処方物に対して比較する。この図は、デキストロース処方物中のIFN−β−1bが50℃で容易に反応して凍結乾燥状態におけるB1ピークを生成することを示す。処方されたバルクのES−MS(図2)は、グルコース付加物(プラス162)に関連するピークを有しない。対照的に、インキュベートされた凍結乾燥デキストロース処方物の質量スペクトル(図3)は、広汎な改変を示す。従って、グルコースは、IFN−β−1bと反応して、ES−MSによってその全体構造が確認される、RP−HPLCによって検出される種を形成する。
【0058】
対照的に、USPマンニトールを用いて作製されたIFN−β−1b処方物は、RP−HPLCによってピークB1として検出可能である種を形成しない。図4は、50℃で7日にわたって保持される凍結乾燥処方物に対して、マンニトール処方されたバルクを比較する。明らかにピークB1は形成されていない。しかし、図5において処方されたバルクの質量スペクトルは、20040におけるピークの存在を示し、そして図6におけるインキュベートされた凍結乾燥マンニトール処方物の質量スペクトルは、20201に新たなピークを有する。マンニトールと形成された付加物の量は、ES−MSによって定量され得ない。しかし、この付加物のシグナルは、装置の検出限界付近にしばしばある。これらのピークの形成の機構は知られていない。IFN−β−1bとマンニトールとの反応では、デキストロースと形成された種またはグルコースを用いて形成された種のような種を形成せず、ピークB1は形成されない。従って、このデータは、IFN−β−1b付加物の形成を妨害するのに、より純粋な形態のマンニトールが必要とされることを示す。
【0059】
次いで、不純物を減少させるようにメタノール抽出されたマンニトールを、IFN−β−1bの安定性に対するその効果について試験した。IFN−β−1bを、メタノール抽出したマンニトールの3つの異なるロットを用いて処方し、そして処方されたバルクおよび最終容器の試験サンプルを、上述のRP−HPLCおよびES−MSアッセイを用いてアッセイした。図7は、未処理のマンニトールを用いて処方したIFN−β−1bの質量スペクトルを示し、そして図8は、メタノールを用いて精製された、同じロットのマンニトールを用いて処方されたIFN−β−1bの質量スペクトルを示す。3つすべてのロットのマンニトールが類似のパターンを示した。図17は、還元活性の半分より多くがメタノール処理によって除去されることを示す。明らかに、メタノール処理は、IFN−β−1bと複合体を形成する不純物を除去するが、いくらかは、この処理によって完全には除去されないかもしれない。
【0060】
マンニトールにおける残りの不純物を減少させるために、3つのさらなる工程を、精製プロセスに加えた。これらのさらなる工程は炭素処理、限外濾過および再結晶である。メタノール抽出、炭素抽出、限外濾過および再結晶マンニトールの3つのロットを上記のように試験した。呈色還元活性アッセイは、還元活性含量をさらなる精製工程が約10ppmまで低下させることを実証した(図17を参照のこと、サンプル7〜9)。処方物を、高度に精製されたマンニトールを用いて調製した。高度に精製されたマンニトールを用いて調製され、そしてネガティブコントロールとして同じ日に実行した処方物の質量スペクトル(図9)は、マンニトールなしに調製された処方されたバルク(図10)において存在しないさらなるピークは示さなかった。USPマンニトールを用いて調製された処方物の質量スペクトル(図11)もまた、ポジティブコントロールとして同じ日に実行した。従って、マンニトールの更なる処理は、還元活性が低く、そしてES−MSではIFN−β−1bと反応しないようである産物を生じる。
【0061】
(実施例2:高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物の安定性:短期加速研究)
I.導入
IFN−β−1bの実験的処方物を、上述のようにデキストロールおよびマンニトールを用いて調製し、そして加速安定性研究を行って、これらの処方物を比較した。処方物の安定性を、2つの異なる条件下で試験した。第一のものは高温ストレスに対してその処方物を供するためのものであり、そして第二のものは室温での長期貯蔵における安定性を測定するためのものであった。高度に精製されたマンニトールを含む処方物において、25℃で3ヶ月間後に変化は見られず、そしてその処方物の効力は、37℃で3ヶ月の貯蔵または50℃で1ヶ月の貯蔵の後も本質的に変化しないままであった。
【0062】
II.方法
各処方物のサンプルを8℃、25℃、または37℃で3ヶ月貯蔵した。さらに、2ヶ月の時点で、各温度からサンプルを採り、そしてさらに1ヶ月間50℃で貯蔵した。50℃シフトの目的は、貯蔵の最初の二ヶ月において発生し得た可能な変化を悪化させるためのものであり、従って25℃または37℃に2ヶ月配置することによって、8℃というもとの貯蔵温度に返還するときにその産物がより迅速に分解するようになるかどうかをより良好に決定することを可能にする。
【0063】
IFN−β−1bの特異的活性を以下のようにアッセイした。A549ヒト肺がん細胞(ATCC CCL 185)およびマウス脳心筋炎ウイルス(EMC株(ATCC VR−129B))は、American Type Culture Collectionから得た。処方物サンプルを、1.2ml希釈液(0.54% NaCl)で再構成し、増殖/アッセイ培地で連続希釈し、そして96ウェルアッセイプレートに、IFN−β−1b標準とともに加えた。各々のウェルにおいて希釈されたIFN−βの容量は、100μlであった。増殖/アッセイ培地(Earle塩および2.2g/L重炭酸ナトリウム、8.9%仔ウシ血清、1.79mML−グルタミン、89U/mlペニシリン、および89μgストレプトマイシン/mlを伴うEagle’s MEM)中のA549細胞に1×104細胞/ウェルの濃度で加えた。次いで、このプレートを加湿した37℃±2℃、5±1% CO2のインキュベーター中でインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、細胞を、5と16との間の感染多重度でEMCウイルスに感染させた。次いで、このプレートを、24±1時間にわたって加湿した37±2℃、5±1%のCO2インキュベーター中でインキュベートした。この細胞を、予備加熱した(37℃)MTT(3−[4,5−ジメチルチアゾリル−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、5mg/ml、50μl/ウェル)を用いて染色し、そして以前と同じように3.5時間〜4.5時間インキュベートした。この培地を、細胞から吸引し、そして100μlの染色可溶化溶液(81%v/v2−プロパノール、3%w/vドデシル硫酸ナトリウム、0.04N HCl)を、各ウェルに加えた。次いで、プレートを30〜60分間雰囲気温度にて暗所にてインキュベートした。次いで、プレートを、8±3分間マイクロプレートシェーカーにて振盪した。最後に、各ウェルの570nmでの吸光度をマイクロプレート分光光度計で測定した。IFN−β活性標準の活性を、線形回帰曲線に適合させ、そしてその試験サンプルの活性をこの曲線から決定した。各サンプルの特異的活性を、使用したサンプルの質量に基づいて計算した。
【0064】
IFN−β−1b濃度のRP−HPLC分析を上記のように行った。添加物処方物もまた、IFN−β−1bバンドの分子量における見かけ上の増大として還元型SDS−PAGEウェスタンブロットにおけるモニターした。
【0065】
III.結果および考察
マンニトール処方物の効力(特異的活性)は、この研究の間本質的に変化ないまま保持された。他方、デキストロース処方物の効力は増大した。37℃の温度への1ヶ月の暴露は、効力に対して影響がなかった(図14および15を参照のこと)。マンニトールIFN−β−1b処方物について、グリコシル化IFN−β−1bの量は、この研究の間にわたって、50℃でさえ、検出限界未満のままであった。対照的に、グリコシル化は、37℃で2ヶ月および50℃で2週間後にデキストロース処方物において検出されたが25℃で3ヶ月の貯蔵の後には検出されなかった。広汎なグリコシル化によって、合計のIFN−β−1bの含量を測定するにはクロマトグラムが多すぎるように改変された。このデキストロース処方物における付加物の形成もまた、37℃で2ヶ月の貯蔵または50℃で1ヶ月の貯蔵の後に、還元SDS−PAGEウェスタンブロットにおいて検出された。対照的に、どの貯蔵条件でもマンニトール処方物については、SDS−PAGEウェスタンブロットにおいて変化が観察されなかった。
【0066】
(実施例3:高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物の長期安定性)
高度に精製されたマンニトールを含む3つのロット(N006、N005およびN009)のIFN−β−1b処方物を、4℃、25℃または30℃において貯蔵し、そしてその安定性を、1年間にわたって3ヶ月の間隔で、およびさらに1年間6ヶ月の間隔でアッセイした。安定性は、上記の方法によってアッセイした。
【0067】
すべての3つのロットは、4℃および30℃において、24ヶ月を通じて効力を保持していた。データは、図16〜18に提示される。さらに、すべての3つのロットが、すべての温度およ時点において、ピークB1(グルコシル化されたIFN−β種)が0.02mg/mlを超えないことを実証した。
【0068】
当業者は、単なる慣用される実験を用いて、IFN−βについて本明細書において記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または確認することができる。さらに、当業者は、慣用的な実験を超えないものを用いて、例としてIFN−βを用いて提供される上記実験および処方物がタンパク質一般(もっとも特定すれば、薬学的タンパク質)に適用可能であることを認識し、または確認することができる薬学的タンパク質としては、以下のタンパク質を含むがそれらに限定されない:ヒト成長ホルモン、すべてのインターフェロン、すべてのインターロイキン、コロニー刺激因子(GM−CSF、G−CSF、M−CSF)、βグルコセレブロシダーゼ、チロトロピン、エタネルセプト(etanercept)、モノクローナル抗体(例えば、abciximab,basiliximab,palivizumab,rituximab,およびtranstuzumab)、血液因子(例えば、第VIIa因子および第VIII因子)、酵素(例えば、ウロキナーゼ、アスパルギナーゼ、アニストレプラーゼ、およびアルテプラーゼ)。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが意図される。
【0069】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者のレベルの指標である。すべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願があたかも具体的かつ個々に、参考として援用されるべきと言及されたかのように、同程度に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、1週間にわたって50℃にてインキュベートされたデキストロース処方されたIFN−βバルクおよび凍結乾燥された粉末についてのRP−HPLCのクロマトグラムの比較を示す。処方物におけるグルコース化されたIFN−β付加物の、50℃に保持される処方物は、(およそ画分48における)第二のピーク(B1)の外見として見られ、その後、(およそ画分49〜50における)メインのIFN−βピークが続く。実施例1を参照のこと。
【図2】 図2は、バルクのデキストロース処方されたIFN−βについての質量スペクトルを示す。いくつかの小さなピークが、19878アム(原子質量単位)においてメインのIFN−βピークに加えて検出可能であった。実施例1を参照のこと。
【図3】 図3は、バルク組成物から凍結乾燥され、そして50℃で1週間格納された、デキストロース処方されたIFN−βのサンプルについての質量スペクトルを示す。図2とは対照的に、主なピークは、IFN−β付加物に対応する。実施例1を参照のこと。
【図4】 図4は、50℃で1週間インキュベートされた、USPマンニトール処方されたIFN−βバルクおよび凍結乾燥粉末についての、RP−HPLCクロマトグラムの比較を示す。処方物において50℃に保持された、グルコシル化されたIFN−β付加物の処方物(B1ピークの外見)は、見出されない。実施例1を参照のこと。
【図5】 図5は、USPマンニトール処方されたIFN−βバルクの質量スペクトルを示す。IFN−βは、19880アムにおけるピークとして検出される。実施例1を参照のこと。
【図6】 図6は、凍結乾燥し、そして50℃で1週間でインキュベートされた、USPマンニトール処方されるIFN−βの質量スペクトルを示す。さらなるピーク(付加物を示す)の形成がスペクトル中に見出され得る。実施例1を参照のこと。
【図7】 図7は、精製されていないマンニトール処方されるIFN−βの質量スペクトルを示す。多数の付加ピーク(付加物を示す)の形成がこのスペクトルにおいて見出され得る。実施例1を参照のこと。
【図8】 図8は、図7において使用されるのと同じロットからのメタノール抽出したマンニトールを用いて処方されたIFN−βの質量スペクトルを示す。付加物ピークの大きさおよび数は、実質的に減少した。実施例1を参照のこと。
【図9】 図9は、高度に精製された(メタノール抽出、炭素処理、限外濾過、および再結晶化)マンニトールを含むIFN−β処方物の質量スペクトルを示す。3つの小さなピークのみが、改変されていないIFN−βを示す主なピークに加えて見られる。実施例1を参照のこと。
【図10】 図10は、マンニトールの不在下で処方されるIFN−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルから、図9に存在する主な二次ピークは、高度に精製されたマンニトールと相互作用することによって形成されないことが、これらがまた賦形剤の不在下で現れるのと同様に見出され得る。実施例1を参照のこと。
【図11】 図11は、上記図9と同じ日に実施した、USPマンニトールで処方されるIFN−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルは、USPマンニトールで処方されるIFN−βがさらなるピーク(付加物)を形成することを確認する。このピークは、高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物においては存在しない。実施例1を参照のこと。
【図12】 図12は、実施例2に記載されるようなIFN−βデキストロース処方物についての安定性評価データを示す。
【図13】 図13は、実施例2に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物についての安定性評価データを示す。
【図14】 図14は、実施例3に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物のロット006についての安定性評価データを示す。
【図15】 図15は、実施例3に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物のロット008についての安定性評価データを示す。
【図16】 図16は、実施例3に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むIFN−β処方物のロット009についての安定性評価データを示す。
【図17】 図17は、還元活性が種々のマンニトールサンプルに存在することを示す。サンプル1−3は、メタノール抽出も、炭素濾過も、限外濾過もされていないUSPマンニトールである。サンプル4−6は、メタノール抽出されたUSPマンニトールである。そしてサンプル7−9は、メタノール抽出され、炭素処理され、限外濾過され、そして再結晶化されたマンニトールである。[0001]
(Field of Invention)
The present invention relates generally to pharmaceutical compositions, and more particularly to formulations of stabilized, liquid or lyophilized proteins (including interferon beta and the like).
[0002]
(Background of the Invention)
Interferons are a family of glycoproteins whose secretion from cells is induced by a number of signals including viruses, double stranded RNA, other polynucleotides, antigens and mitogens. Interferons exhibit a number of biological activities, including antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activities. At least three different types of human interferons α, β and γ have been identified based on a number of factors including antiviral and antiproliferative activity.
[0003]
Interferon-beta (IFN-beta) is a treatment that has been identified for the first time for patients with multiple sclerosis (MS) and measures the number of attacks that patients suffering from recurrent MS and relaxant MS undergo. It has been demonstrated to decrease. IFN-β compositions are also useful in the treatment of hepatitis B and hepatitis C infections.
[0004]
As with all protein-based drugs, one major barrier that must be overcome in the use of IFN-β as a therapeutic agent is a loss of pharmaceutical utility that can result from its instability in pharmaceutical formulations. Physical instabilities that threaten the activity and efficacy of polypeptides in pharmaceutical formulations include denaturation and the formation of soluble and insoluble aggregates, while chemical instabilities include hydrolysis, imide formation, oxidation. , Racemization and deamidation section. Some of these changes are known to result in loss or reduction of the pharmaceutical activity of the protein of interest. In other cases, the exact effects of these changes are not known, but the resulting degradation products should still be considered pharmaceutically unacceptable due to the possibility of unwanted side effects. It is.
[0005]
Polypeptide instability in pharmaceutical preparations is emphasized that guidelines set for the approval of protein-based drugs should minimize changes in the activity and molecular properties of the polypeptide. As such, it directly affects their pharmaceutical utility. For example, International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals of Pharmaceuticals for Human Use A report of 30 November 1995 on the stability test of "A significant quantitative or qualitative change indicative of degradation product formation is indicative of long-term stability, accelerated stability, and / or stress stability. If detected during the study, consideration should be given to possible hazards and the need for characterization and quantification of degradation products within the long-term stability program "
[0006]
As a result, there is a need for additional protein pharmaceutical compositions (including IFN-β compositions). The composition includes a physiologically compatible stabilizer that is substantially free of reducing impurities, thereby stabilizing the protein and enhancing its pharmaceutical utility.
[0007]
(Summary of the Invention)
Compositions comprising IFN-β as a therapeutically active ingredient and highly purified mannitol as an excipient are provided. The composition is characterized by improved stability during storage compared to an IFN-β composition containing highly non-purified mannitol. Methods for producing these compositions are also provided.
[0008]
(Detailed description of the invention)
The present invention relates to IFN-β pharmaceutical compositions with increased stability and methods for their preparation. This composition comprises IFN-β and highly purified mannitol. This highly purified mannitol increases the stability of the formulation by reducing the formation of degradation products. Stabilized IFN-β formulations are safer (due to reduced possible adverse side effects) and more economical (due to increased formulation lifespan) It is advantageous.
[0009]
The increased stability of the disclosed composition results from the use of highly purified mannitol. The novel finding of the present invention is that highly purified mannitol contains a reducing activity that interacts with IFN-β to produce an undesired adduct (degradation product), whereas highly purified. Mannitol does not contain this reducing activity and does not result in the formation of these adducts in the IFN-β formulation. The experimental results presented herein (see Example 1 in the experimental section) show that the reducing activity present in unpurified mannitol responsible for IFN-β adduct formation is not reducing sugar activity. It shows that. Because adducts formed in the presence of highly unpurified mannitol are clearly distinguished from adducts formed in the presence of excipients with known reducing sugar activity (eg, dextrose). Because you get.
[0010]
As used herein, “highly purified mannitol” refers to mannitol having a low level of reducing activity. The reducing activity of highly purified mannitol is less than 20 ppm USP as measured by the reducing activity assay described elsewhere herein. In various embodiments, the highly purified reducing activity of mannitol is less than 19 ppm, less than 18 ppm, less than 17 ppm, less than 16 ppm, less than 15 ppm, less than 14 ppm, or less than 13 ppm. It is. In one embodiment, the highly purified mannitol is USP (American Pharmacopoeia) or ACS (American Chemical Society) grade mannitol. This grade of mannitol has undergone further steps of 1) methanol extraction; 2) carbon treatment; 3) ultrafiltration; and 4) recrystallization. Highly purified mannitol is present in a concentration sufficient to stabilize the formulation. Formulations encompassed by the present invention may have as little as about 0.1% (w / v) highly purified mannitol, or about 7.5% (w / v) It may have as much highly purified mannitol. In various embodiments, the mannitol is present at a concentration of about 0.2 to about 7.0%, is present at a concentration of about 0.25% to about 2.5%, and is about 1.25% Present in concentration.
[0011]
Disclosed are both liquid and lyophilized pharmaceutical compositions comprising IFN-β as a therapeutically active ingredient and highly purified mannitol as an excipient. For the purposes of the present invention, with respect to pharmaceutical compositions or formulations, the term “liquid” is intended to encompass the term “aqueous”. The term “lyophilized” with respect to IFN-β pharmaceutical formulations refers to rapid lyophilization (freeze drying) of multiple vials under reduced pressure. Each vial contains therein a unit dose of an interferon formulation of the invention. The lyophilizing agent for performing the lyophilization is commercially available and can be easily carried out by those skilled in the art. In one embodiment of the invention, the liquid composition is lyophilized.
[0012]
A liquid or lyophilized IFN-β formulation of the present invention is “stabilized”. A “stabilized” composition or a composition with “increased stability” or “improved stability” refers to an IFN-β composition formulated with highly unpurified mannitol. It means a composition having increased storage stability. This increase in stability is evidenced by a decrease in the formulation of IFN-β adducts or degradation products during storage in comparison to formulations with highly unpurified mannitol. The formation of adducts or degradation products can be measured using the mass spectrometry assay described herein. A stabilized, highly purified mannitol formulated IFN-β composition of the present invention is determined in USP mannitol formulated IFN-β as determined by the mass spectrometry assay described herein. Characterized by the absence of additional peaks observed when compared to IFN-β compositions formulated without mannitol. See, for example, the mass spectrum of IFN-β formulated with highly purified mannitol shown in FIG. This shows no further peaks compared to the mass spectrum of IFN-β formulated without mannitol as shown in FIG. In contrast, the mass spectrum of IFN-β formulated with USP mannitol, shown in FIG. 11, shows a number of additional peaks (adducts) compared to the mass spectrum of IFN-β formulated without mannitol. Resolve. The stabilized IFN-β pharmaceutical formulation of the present invention retains its efficacy and for a period of up to about 2 years when stored at 30 ° C. and for at least 2 years when stored at 25 ° C. Contains less than 0.02 mg / ml glucosylated IFN-β.
[0013]
The stabilized pharmaceutical formulation of the present invention comprises IFN-β and variants thereof. As used herein, the term “IFN-β” refers to IFN-β or a variant thereof (sometimes referred to as an IFN-β-like polypeptide). Human IFN-β variants, which can be naturally occurring (eg, allelic variants occurring at the IFN-β locus) or can be produced recombinantly, are native mature IFN-β. It has an amino acid sequence that is the same, similar or substantially similar to the sequence. Also encompassed are IFN-β fragments or truncated forms of IFN-β that retain activity. These biologically active fragments or truncated forms of IFN-β are generated by removing amino acid residues from full-length IFN-β amino acid sequences using recombinant DNA techniques well known in the art. The IFN-β polypeptide may or may not be glucosylated. Because, in the literature, both glucosylated and non-glucosylated IFN-β polypeptides exhibit qualitatively similar specific activities, and thus the glucosylated moiety is This is because it has been reported that it is not involved in and contributes to the biological activity of selenium.
[0014]
IFN-β variants included herein include muteins of the native mature IFN-β sequence (see, eg, US Pat. No. 5,814,485, which is incorporated herein by reference). ). Here, one or more cysteine residues that are not essential for biological activity have been deliberately deleted or replaced with other amino acids, either intermolecular crosslinks or inaccurate intermolecular disulfide bond formation. The site for the carp has been removed. This type of IFN-β variant is glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, tryptophan, serine, threonine, or methionine instead of cysteine found at amino acid 17 of the native mature amino acid sequence. Including variants. Serine and threonine are the most preferred substitutions because they are chemically similar to cysteine. Serine substitution is most preferred. See, for example, an IFN-β variant in which the cysteine found at amino acid 17 of the native mature sequence is replaced with serine (US Pat. No. 5,814,485). Cysteine 17 can also be deleted using methods known in the art (see, eg, US Pat. No. 4,588,584, which is incorporated herein by reference). This results in a mature IFN-β mutein that is one amino acid shorter than native mature IFN-β. See also U.S. Pat. Nos. 4,530,787; 4,572,798; and 4,588,585 for examples. Thus, for example, IFN-β variants having one or more variants that improve their pharmaceutical utility are also encompassed by the invention.
[0015]
One skilled in the art will recognize that further changes can be introduced by causing changes in the IFN-β amino acid sequence by altering the nucleotide sequence encoding IFN-β without altering the biological activity of the interferon. to understand. Thus, an isolated nucleic acid molecule that encodes an IFN-β variant having a sequence that differs from the amino acid sequence for native mature IFN-β, has one or more nucleotide substitutions, additions, or deletions, Introducing into the corresponding nucleotide sequences disclosed herein, one or more amino acid substitutions, additions or deletions can be made by introducing into the encoded IFN-β. Mutations can be introduced by standard techniques, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Such IFN-β variants are also encompassed by the present invention.
[0016]
For example, conservative amino acid substitutions can be made at one or more predicted, preferably non-essential amino acid residues. A “non-essential” amino acid residue is a residue that can differ from the wild-type sequence of IFN-β without altering biological activity. On the other hand, “essential” amino acid residues are necessary for biological activity. “Conservative amino acid substitution” refers to a substitution in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (eg, glycine) , Asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids with β-branched side chains (eg , Threonine, valine, isoleucine), and amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Such substitutions are not made for conserved amino acid residues, or are not made for amino acid residues present within a conserved motif.
[0017]
Alternatively, variant IFN-β nucleotide sequences can be made by mutations introduced randomly across all or part of the IFN-β coding sequence, such as saturation mutagenesis. The resulting mutants can then be screened for biological activity of IFN-β to identify mutants that retain activity. Following mutagenesis, the encoded protein can be recombinantly expressed and the activity of the protein can be determined using standard assay techniques described herein.
[0018]
Biologically active variants of IFN-β are generally at least 80%, more preferably relative to a reference IFN-β polypeptide (eg, native human IFN-β) that serves as a basis for comparison. Has about 90 to about 95% or more and most preferably about 96% to about 99% or more amino acid sequence identity. “Sequence identity” means within a polypeptide molecule that acts as a reference when the variant polypeptide, as well as a particular contiguous segment of the variant's amino acid sequence, is aligned and compared to the amino acid sequence of the reference molecule. Means the same amino acid residues found in
[0019]
For purposes of optimal alignment of two sequences for purposes of sequence identity determination, can a contiguous segment of a variant amino acid sequence have additional amino acid residues relative to the amino acid sequence of the reference molecule? Or it may have a deletion of amino acid residues. A contiguous segment used to compare against a reference amino acid sequence comprises at least 20 contiguous amino acid residues. Corrections for increasing sequence identity associated with the insertion of gaps in the variant amino acid sequence can be made by assigning gap penalties. Methods of sequence alignment are well known in the art.
[0020]
Thus, the determination of percent identity between any two sequences can be accomplished using a mathematical algorithm. An example of one preferred but non-limiting mathematical algorithm utilized for sequence comparisons is Myers and Miller (1988) Compute. Appl. Biosci. 4: 11 to 7 algorithm. Such an algorithm is used in the ALIGN program (version 2.0). This program is part of the GCG alignment software package. A table of PAM120 weight residues, a gap length penalty of 12, and a gap penalty of 4 can be used for the ALIGN program when comparing amino acid sequences. Another preferred non-limiting mathematical algorithm for use in comparing two sequences is the algorithm of Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, which is described in Karlin and Altshcul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Such an algorithm is described in Altschul et al. (1990) J. MoI. Mol. Biol. 215: 403-410, incorporated into NBLAST and XBLAST programs. A BLAST amino acid sequence search can be performed using the XBLAST program. Here, score = 50 and word length = 3. As a result, an amino acid sequence similar to the target polypeptide is obtained. To obtain a gapped alignment for comparison purposes, a gapped BLAST is described in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternatively, PSI-BLAST can be used to perform an interleave search that detects distant relationships between molecules. Altschul et al. (1997) See above. When utilizing BLAST, Gapped BLAST, or PSI-BLAST programs, default parameters may be used. http: // www. ncbi. n1m. nih. See gov. Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D .; C. See also the ALIGN program (Dayhoff (1978)) and the program in the Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) (eg, the GAP program). Here, the default parameters of this program are used.
[0021]
When considering the ratio of amino acid sequence identity, some amino acid residue positions may differ as a result of conservative amino acid substitutions that do not affect the properties of the protein function. In these cases, percent sequence identity can account for similarities in amino acids that have been upwardly modified and conservatively substituted. Such modifications are well known in the art. See, for example, Myers and Miller (1988) Compute. Appl. Biosci. 4: 11-17.
[0022]
Biologically active IFN-β variants encompassed by the present invention also include, for example, IFN-β polypeptides covalently crosslinked to polyethylene glycol (PEG) or albumin. These covalently hybrid IFN-β molecules have certain desired pharmaceutical properties (eg, increased serum half-life after administration to a patient). A method for making a PEG-IFN adduct involves chemically modifying monomethoxypolyethylene glycol to make an activating compound that reacts with IFN-β. Methods for making and using PEG-linked polypeptides are described, for example, in Delgado et al. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9: 249-304. Methods for making albumin fusion polypeptides include fusion of a polypeptide of interest (eg, IFN-β) and an albumin coding sequence and are described in US Pat. No. 5,876,969, which Which is incorporated herein by reference. These hybrid IFN-β molecules react with impurities present in USP mannitol and are more stable when formulated with highly purified mannitol.
[0023]
Biologically active variants of IFN-β encompassed by the present invention should retain IFN-β activity (particularly the ability to bind to the IFN-β receptor). In some embodiments, the IFN-β variant is at least about 25%, about 50%, about 75%, about 85%, about 90% of a reference IFN-β polypeptide (eg, native human IFN-β). %, About 95%, about 98%, about 99% or higher biological activity. Also included are IFN-β variants that have increased activity relative to that of a reference IFN-β polypeptide. The biological activity of the IFN-β variant can be measured by any method known in the art. Examples of such assays can be found below: Fellous et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 3082-3086; Czerniecki et al. (1984) J. Org. Virol. 49 (2): 490-496; Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5562-5666; Branca et al. (1981) Nature 277: 221-223; Williams et al. (1979) Nature 282: 582-586; Herberman et al. (1979) Nature 277: 221-223; Anderson et al. (1982) J. Am. Biol. Chem. 257 (19): 11301-1304; and the IFN-β potency assay described herein (see Example 2).
[0024]
The IFN-β of the formulations of the present invention can be derived from any animal species including, but not limited to: birds, dogs, cows, pigs, horses and humans. Preferably, the IFN-β is derived from a mammalian species when the formulation is to be used in the treatment of a mammalian IFN-β disorder, more preferably it is treated for such a disorder It is derived from the same species of mammal as the mammal.
[0025]
Non-limiting examples of IFN-β polypeptides and IFN-β variant polypeptides encompassed by the present invention are shown below: Nagata et al. (1980) Nature 284: 316-320; Goeddel et al. (1980) Nature 287: 411-416; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731-741; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 2848-2852; EP028033Bl and EP109748Bl. See also: U.S. Pat. Nos. 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844; 4,753,795; 4,769,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,314; 5,545,723; and 5,814,485. These disclosures are incorporated herein by reference. These citations also provide guidance regarding residues and regions of the IFN-β polypeptide that can be altered without loss of biological activity.
[0026]
In one embodiment of the invention, the IFN-β in the stabilized pharmaceutical formulation is a native mature IFN-β polypeptide. In another embodiment, the IFN-β in these formulations is a mature IFN-β polypeptide and the cysteine found at amino acid 17 of the native mature sequence is replaced with serine as discussed above. . However, the present invention is directed to variants in which IFN-β within the stabilized pharmaceutical formulation is any biologically active IFN-β polypeptide or described elsewhere herein. Other embodiments are included.
[0027]
In some embodiments of the invention, IFN-β is produced recombinantly. By “recombinantly produced IFN-β” is intended IFN-β that has biological activity comparable to native mature IFN-β and has been prepared by recombinant DNA technology. IFN-β can be produced by culturing host cells transformed with an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding an IFN-β polypeptide. The host cell is a cell that can transcribe the nucleotide sequence and produce the desired protein, and can be prokaryotic (eg, E. coli) or eukaryotic (eg, yeast, insect or Mammalian cells). An example of recombinant production of IFN-β is given below: Mantei et al. (1982) Nature 297: 128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 967; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156, and U.S. Pat. Nos. 4,462,940; 5,702,699; and 5,814,485; which are incorporated herein by reference. See also US Pat. No. 5,795,779. Here, IFN-β-1a is produced recombinantly in Chinese hamster ovary (CHO) cells. This is also incorporated herein by reference. The human interferon gene has been cloned using recombinant DNA ("rDNA") technology and E. coli. (Nagola et al. (1980) Nature 284: 316; Goeddel et al. (1980) Nature 287: 411; Yelverton et al. (1981) Nuc. Acid Res. 9: 731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 2848). Alternatively, IFN-β can be produced by a transgenic animal or plant that has been genetically engineered to express the IFN-β protein of interest according to methods known in the art.
[0028]
Alternatively, IFN-β can be chemically synthesized by any of several techniques known to those skilled in the peptide art. For example, see: Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216-2220, Steward and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), and Barney and Merrifield (80). Gross and Meinhofer, Vol. 2 (Academic Press, New York, 1980), pp. 3-254 (which discusses solid phase peptide synthesis techniques); and Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin) and Gross and Meinhofer, eds. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 (Academic Press, New York) (this discusses classical solution synthesis). IFN-β can also be chemically prepared by the method of simultaneous multiple peptide synthesis. For example, see: Houghten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135; and US Pat. No. 4,631,211.
[0029]
Compositions encompassed by the present invention can have as little as about 0.01 mg / ml IFN-β to as much as about 15 mg / ml (weight / volume) IFN-β. In various embodiments, the IFN-β has a concentration of about 0.015 mg / ml to about 12.5 mg / ml, a concentration of about 0.025 mg / ml to about 10 mg / ml, about 0.05 mg / ml to about 8 mg. Concentration of about 0.075 mg / ml to about 6 mg / ml, concentration of about 0.1 mg / ml to about 4 mg / ml, concentration of about 0.125 mg / ml to about 2 mg / ml, Concentration from 175 mg / ml to about 1 mg / ml, concentration from about 0.2 mg / ml to about 0.5 mg / ml, concentration from about 0.225 mg / ml to about 0.3 mg / ml, and about 0.25 mg / ml Present at a concentration of.
[0030]
In some embodiments, the formulations of the present invention include a pharmaceutically acceptable carrier. By “pharmaceutically acceptable carrier” is intended a carrier conventionally used in the art to facilitate storage, administration, and / or the healing effect of a therapeutic ingredient. The carrier may also reduce any unwanted side effects of IFN-β. A suitable carrier should be stable, i.e. not capable of reacting with other ingredients in the formulation. This should not produce significant local or systemic adverse effects in the recipient at the dosages and concentrations used for treatment. Such carriers are generally known in the art. Suitable carriers for the present invention are albumin, gelatin, collagen, polysaccharide, monosaccharide, polyvinyl-pyrrolidone, polylactic acid, polyglycolic acid, polymeric amino acid, non-volatile oil, ethyl oleate, liposome, glucose, sucrose, lactose It is a large stable polymer conventionally used such as mannose, dextrose, dextran, cellulose, sorbitol, polyethylene glycol (PEG). Sustained release carriers such as hyaluronic acid may also be appropriate. In particular, Prisell et al. (1992) Int. J. et al. Pharmaceu. 85: 51-56, and U.S. Pat. No. 5,166,331. Other acceptable ingredients in this composition include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable agents that modify isotonicity, water, salts, sugars, polyols, amino acids, and buffers. Is included. Examples of suitable buffering agents include phosphate, citrate, succinate, acetate, and other organic acids or salts thereof, and salts that modify isotonicity (eg, sodium chloride, sodium phosphate , Sodium sulfate, potassium chloride, etc.) and may also contain the above-mentioned buffers.
[0031]
In some embodiments of the invention, the pharmaceutically acceptable carrier is human albumin. The human albumin can be naturally occurring human albumin or can be recombinantly produced human albumin. These two forms are collectively referred to herein as “human albumin”. Formulations encompassed by the present invention can have as little as about 0.01% (weight / volume) human albumin to as much as about 15% (weight / volume) human albumin. In various embodiments, the human albumin has a concentration of about 0.025% to about 12.5%, a concentration of about 0.05% to about 10%, a concentration of about 0.1% to about 9%, about 0% .25% to about 8% concentration, about 0.5% to about 7% concentration, about 0.6% to about 2% concentration, about 0.7% to about 1.75% concentration, about 0 Present at a concentration of .75% to about 1.5%, a concentration of about 1.2% to about 1.3%, and a concentration of about 1.25%.
[0032]
The pharmaceutical composition may further comprise a solubilizer or solubility enhancer. A compound containing a guanidinium group (most preferably arginine) is a suitable solubility enhancer for IFN-β. Examples of such solubility enhancers include the amino acid arginine and amino acid analogs of arginine that retain the ability to enhance the solubility of IFN-β. Such analogs include, without limitation, dipeptides and tripeptides including arginine. Further suitable solubilizers are discussed below: U.S. Pat. Nos. 4,816,440; 4,894,330; 5,004,605; 5,183,746; No. 5,643,566; and Wang et al. (1980) J Parental Drug Assoc. 34: 452-462, which are incorporated herein by reference.
[0033]
Non-limiting examples of solubilizers encompassed by the present invention include surfactants (surfactants) having a hydrophobic hydrophilic balance suitable for solubilizing IFN-β. Strong natural or synthetic anionic surfactants such as alkali metal salts and alkali metal alkyl sulfates of fatty acids can be used. Such agents usually contain 10 to 14 carbon atoms. Sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium laurate are particularly preferred solubilizers. Examples of other solubilizers that may be used in the compositions of the present invention include, but are not limited to: sodium dodecyl sulfonate, sodium decyl sulfate, sodium tetradecyl sulfate, sodium tridecyl sulfonate, myristic acid Sodium, sodium caproylate, sodium dodecyl N-sarcosate, and sodium tetradecyl N-sarcosate. Classical stabilization of pharmaceuticals with surfactants or emulsifiers is described, for example, in the following: Levine et al. (1991) J. MoI. Parental Sci. Technol. 45 (3): 160-165. Additional suitable surfactants are discussed below: US Pat. Nos. 4,507,281; 4,816,440; and 5,183,746. These are incorporated herein by reference.
[0034]
In addition to the agents disclosed above, other stabilizers (eg, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or one of its salts (eg, disodium EDTA) may be added to further enhance the stability of the liquid pharmaceutical composition. EDTA acts as a scavenger of metal ions known to catalyze many oxidation reactions and thus provides additional stabilizers.
[0035]
When an IFN-β formulation is used for delivery to a mammal (eg, a human), the isotonicity of the composition is also a consideration. Accordingly, in one embodiment, a composition for an injectable solution of IFN-β provides isotonicity that is the same as or similar to that of a patient's serum or body fluid. To achieve isotonicity, a salt (eg, sodium chloride, potassium chloride, or phosphate buffer) can be added to the solution at an appropriate concentration.
[0036]
The pH of the formulation is also a consideration. The stabilized IFN-β formulation of the present invention has a pH in the range of about 3.0 to about 9. Suitable pH ranges include, for example, about 4.0 to about 8.8, about 5.0 to about 8.6, about 6.0 to about 8.4, about 6.8 to about 8.2, about 6.9 to about 8.0, about 7.0 to about 7.8, about 7.1 to about 7.7, about 7.2 to about 7.6, and about 7.3 to about 7.5. Includes.
[0037]
A pharmaceutically effective amount of a stabilized liquid IFN-β formulation or a reconstituted stabilized lyophilized IFN-β pharmaceutical formulation of the present invention is administered to a subject. By “pharmaceutically effective amount” is intended an amount useful in the treatment, prevention or diagnosis of a disease or condition. Typical routes of administration include oral administration, nasal delivery, pulmonary delivery, and parenteral administration (including transdermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraarterial and intraperitoneal injection or infusion). Is not limited to them. In one such embodiment, administration is by injection, preferably subcutaneous injection. Injectable forms of the compositions of this invention include, but are not limited to, solutions, suspensions and emulsions. Typically, a therapeutically effective amount of IFN-β is a composition of about 0.01 μg / kg to about 5 mg / kg, preferably about 0.05 μg / kg to about 1000 μg / kg, more preferably about 0.1. From 1 μg / kg to about 500 μg / kg, even more preferably still from about 0.5 μg / kg to about 30 μg / kg.
[0038]
In one embodiment, a stabilized pharmaceutical composition comprising IFN-β is formulated in unit dosage and can be in injectable or injectable form such as a solution, suspension or emulsion. Further, the composition can be stored frozen or prepared in a dry form (eg, lyophilized powder). This can be reconstituted into a liquid solution, suspension or emulsion prior to administration by any of a variety of methods, including oral or parenteral routes of administration. Stabilized pharmaceutical compositions can be sterilized by membrane filtration and stored in unit dose or multiple dose containers such as enclosed vials or ampoules. Additional methods for formulating pharmaceutical compositions generally known in the art are disclosed herein unless they adversely affect the beneficial effects of the highly purified mannitol disclosed. It can be used to further enhance the storage stability of the pharmaceutical composition. A complete discussion of the selection of formulations and pharmaceutically acceptable carriers, stabilizers, etc. can be found at: Reminington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18th ed., Mack Pub. Co., Eaton). , Pennsylvania), which is incorporated herein by reference.
[0039]
In some embodiments, the liquid composition of the invention is packaged in a syringe (a “pre-filled” syringe of the invention). Next, in one embodiment, the prefilled syringe containing the composition of the present invention can be frozen. This frozen pre-filled syringe is useful for storage or transport purposes.
[0040]
The following examples are provided for purposes of illustration and not limitation.
[0041]
(Experiment)
Example 1: Development of an IFN-β pharmaceutical formulation with increased stability
I. Introduction
IFN-β pharmaceutical formulations containing dextrose as an excipient are known in the art. When such formulations are incubated at temperatures above 37 ° C., dextrose in these formulations forms a covalent adduct with IFN-β, which is RP-HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography). ). IFN-β formulated with USP mannitol does not form a RP-HPLC detectable covalent adduct under the same conditions. However, USP mannitol contains impurities that, together with IFN-β, form adduct species that are detected by electrospray mass spectrometry. The nature of the impurities in USP mannitol is not known. The formation of these adducts (or degradation products) is considered pharmaceutically undesired and even considered pharmaceutically unacceptable. This is because current guidelines for polypeptide-based pharmaceuticals emphasize the importance of minimizing the formation of degradation products in the formulation. Degradation products are considered undesirable or unacceptable. Because they increase the chances that the peptide-based medicament will produce unwanted side effects. The novel findings of the present invention show an increase in stability when IFN-β is formulated with highly purified mannitol, so that its reducing activity is formulated with highly unpurified mannitol. It is less than 20 ppm compared to when it is done. A further novel finding of the present invention is that purification of USP mannitol by extraction with methanol, carbon treatment, ultrafiltration and recrystallization yields a mannitol preparation with a reducing activity of less than 20 ppm.
[0042]
II. Method
IFN-β-1b for use in these experiments is described essentially in US Pat. Nos. 4,462,940 and 5,702,699, which are incorporated by reference. E. produced in E. coli. Sodium dodecyl sulfate and salt were chromatographed from IFN-β; and IFN-β-1b was combined with a solution of human albumin at pH 11.5-12.0. The pH of the solution was adjusted to 7.5 with HCl. A solution containing excipients ((mannitol or dextrose) was then added to a final concentration of 1.25% The final concentration of human albumin in the formulation was 1.25% w / v.
[0043]
IFN-β-1b from these formulations was prepared for mass spectrometry by RP-HPLC. This method enables quantification of glucosylated IFN-β-1b after separation as a separated peak (B1) in the chromatogram. The detection limit for glucosylated IFN-β-1b with this method is 0.02 mg / ml. If the amount of this peak is less than 0.02 mg / ml, the two peak areas are summed and compared to the unformulated IFN-β reference to obtain the total content of IFN-β-1b. If this peak area exceeds 0.02 mg / ml, its concentration is independently determined and reported.
[0044]
The following equipment and its respective manufacturer's instruction manual were used for the analysis.
[0045]
Solvent delivery system: Waters 626 Gradient Pump
Injection system: Waters 717 and
Polypropylene autosampler vial (with Teflon septa)
Autosampler temperature control set to 4 ° C and refrigerated
84% acetonitrile is used as a needle wash.
[0046]
Column heater: Waters 600
Set column heater to 40 ° C
Column: BAKERBOND Wide-Pore Butyl C4 RP-Column, 300
[0047]
The column was connected in the direction of solvent flow as indicated in the column label and placed in a column heater.
[0048]
Detector: Waters 486 UV Detector.
[0049]
Set the wavelength to 214 nm.
[0050]
Does not attenuate the data system input.
[0051]
Data system: P.I. E. Nelson Turbochrom Data System
Lyophilized IFN-β formulation samples were reconstituted with 1.20 ml of 0.54% sodium chloride, mixed by gentle inversion, and incubated at ambient temperature for 30 ± 5 minutes. The calibrator is an unprescribed IFN-β reference. The calibrator stock solution is diluted to about 0.5 mg / ml, and the concentration of the diluted calibrator solution is determined by UV absorption (six averages). The final concentration of the diluted calibrator solution is the average of the UV absorbance readings divided by 1.7 (IFN-β-1b extinction coefficient). Diluted calibrator solution concentration is determined by absorption for three significant forms. The calibrator solution was then diluted to 0.25 mg / ml for use as a working calibrator solution.
[0052]
The autosampler was programmed to inject at 70 min intervals with 20 μl per injection. The data system voltage range was 1 volt, the sampling rate was 1 point per second, and the acquisition time was 70 minutes. Eluent A was 0.1% TFA (trifluoroacetic acid, HPLC grade) and Eluent B was 84% acetonitrile (HPLC grade) and 0.084% TFA (HPLC grade). The elution flow rate was set to 1.0 ml / min (70% eluent A and 30% eluent B) and the column was equilibrated for 1 hour. After equilibrating the detector baseline and system, the gradient blank was analyzed. Analysis began when there was no significant peak in the second gradient blank.
[0053]
The IFN-β concentration is determined from the sum of the areas of the peaks corresponding to unmodified IFN-β (“B” peak) and glucosylated IFN-β (“B1” peak). For example, if the calibrator solution is 0.25 mg / ml unprescribed IFN-β, IFN-β concentration (mg / ml) = (test sample total peak area B1 + B / calibrator total peak area B1 + B) × 0.25 mg / Ml.
[0054]
Electrospray mass spectral (ES-MS) data was obtained using fractions from this chromatography. Each peak fraction was collected and concentrated prior to analysis. Electrospray mass spectra were obtained on an
[0055]
The reducing activity of mannitol was determined by a modification of the USP protocol. This protocol is based on Cu in alkaline solution in the presence of bicinchoninic acid (BCA, Pierce, prepared according to manufacturer's instructions). 2+ Measure the decrease in. BCA is Cu 1+ And the complex has a blue color with a peak absorption (A) at 562 nm.
[0056]
Two mannitol samples (500 μl of 150 mg / ml mannitol solution) were assayed for each condition. A standard curve was generated using serial dilutions of glucose solution using known reducing activity. 500 μl of the prepared BCA solution was added to each test sample, standard sample and blank and incubated at 60 ° C. for 40 minutes. The glucose standard was fitted to a linear curve, and the reducing activity (ppm) of the mannitol test sample was calculated as ((A of mannitol sample 562 / Slope of standard curve) / (mannitol content mg / ml (1000)) × 10 6 ).
[0057]
III. Results and Discussion
Glucosylation was detected in the dextrose formulation using mass spectrometry as a multiplier of 162 daltons added to the molecular weight of IFN-β-1b. Analysis of the IFN-β-1b peptide suggested that these adducts arise from the reaction of protein lysine residues with reducing sugars (Amadori reaction). FIG. 1 compares the formulated bulk RP-HPLC chromatogram of a dextrose formulation against a lyophilized formulation stored at 50 ° C. for 1 week. This figure shows that IFN-β-1b in the dextrose formulation readily reacts at 50 ° C. to produce the B1 peak in the lyophilized state. The formulated bulk ES-MS (FIG. 2) does not have a peak associated with glucose adduct (plus 162). In contrast, the mass spectrum of the incubated lyophilized dextrose formulation (FIG. 3) shows extensive modifications. Thus, glucose reacts with IFN-β-1b to form a species detected by RP-HPLC, whose overall structure is confirmed by ES-MS.
[0058]
In contrast, the IFN-β-1b formulation made with USP mannitol does not form a species that is detectable by RP-HPLC as peak B1. FIG. 4 compares the mannitol formulated bulk against a lyophilized formulation that is held at 50 ° C. for 7 days. Apparently, the peak B1 is not formed. However, the bulk mass spectrum formulated in FIG. 5 shows the presence of a peak at 200040, and the mass spectrum of the incubated lyophilized mannitol formulation in FIG. 6 has a new peak at 20201. The amount of adduct formed with mannitol cannot be quantified by ES-MS. However, the signal of this adduct is often near the detection limit of the instrument. The mechanism of formation of these peaks is not known. The reaction of IFN-β-1b with mannitol does not form a species such as a species formed with dextrose or a species formed with glucose, and peak B1 is not formed. Thus, this data indicates that a purer form of mannitol is required to interfere with the formation of the IFN-β-1b adduct.
[0059]
Mannitol extracted with methanol to reduce impurities was then tested for its effect on the stability of IFN-β-1b. IFN-β-1b was formulated with three different lots of methanol extracted mannitol and the formulated bulk and final container test samples were assayed using the RP-HPLC and ES-MS assays described above. . FIG. 7 shows the mass spectrum of IFN-β-1b formulated with untreated mannitol, and FIG. 8 shows IFN-β formulated with the same lot of mannitol purified using methanol. -1b shows the mass spectrum. All three lots of mannitol showed similar patterns. FIG. 17 shows that more than half of the reducing activity is removed by the methanol treatment. Obviously, the methanol treatment removes impurities that form a complex with IFN-β-1b, but some may not be completely removed by this treatment.
[0060]
Three additional steps were added to the purification process to reduce residual impurities in mannitol. These additional steps are carbon treatment, ultrafiltration and recrystallization. Three lots of methanol extraction, carbon extraction, ultrafiltration and recrystallized mannitol were tested as described above. The color reduction activity assay demonstrated that the reduction activity content was reduced to about 10 ppm by further purification steps (see FIG. 17, samples 7-9). The formulation was prepared using highly purified mannitol. The mass spectrum (FIG. 9) of the formulation prepared with highly purified mannitol and run the same day as a negative control is not present in the formulated bulk (FIG. 10) prepared without mannitol. No peak was shown. A mass spectrum of a formulation prepared with USP mannitol (Figure 11) was also run on the same day as a positive control. Thus, further processing of mannitol yields a product that has low reducing activity and does not appear to react with IFN-β-1b in ES-MS.
[0061]
Example 2: Stability of an IFN-β formulation containing highly purified mannitol: a short-term accelerated study
I. Introduction
Experimental formulations of IFN-β-1b were prepared using dextrol and mannitol as described above, and accelerated stability studies were performed to compare these formulations. The stability of the formulation was tested under two different conditions. The first was to provide the formulation against high temperature stress, and the second was to measure stability during long-term storage at room temperature. In a formulation containing highly purified mannitol, no change is seen after 3 months at 25 ° C. and the efficacy of the formulation is after 3 months storage at 37 ° C. or 1 month storage at 50 ° C. Also remained essentially unchanged.
[0062]
II. Method
Samples of each formulation were stored at 8 ° C, 25 ° C, or 37 ° C for 3 months. In addition, at 2 months, samples were taken from each temperature and stored at 50 ° C. for an additional month. The purpose of the 50 ° C shift is to exacerbate the possible changes that could have occurred during the first two months of storage, thus placing the original at 8 ° C by placing it at 25 ° C or 37 ° C for 2 months Allows better determination of whether the product will decompose more rapidly when returned to storage temperature.
[0063]
The specific activity of IFN-β-1b was assayed as follows. A549 human lung cancer cells (ATCC CCL 185) and mouse encephalomyocarditis virus (EMC strain (ATCC VR-129B)) were obtained from the American Type Culture Collection. Formulation samples were reconstituted with 1.2 ml diluent (0.54% NaCl), serially diluted with growth / assay medium, and added to 96 well assay plates along with IFN-β-1b standards. The volume of IFN-β diluted in each well was 100 μl. In growth / assay medium (Eagle's MEM with Earle salt and 2.2 g / L sodium bicarbonate, 8.9% calf serum, 1.79 mM L-glutamine, 89 U / ml penicillin, and 89 μg streptomycin / ml) 1x10 for A549 cells 4 Added at cell / well concentration. The plate was then humidified at 37 ° C. ± 2 ° C., 5 ± 1% CO 2 Incubated in an incubator. At the end of this incubation, cells were infected with EMC virus at a multiplicity of infection between 5 and 16. The plate was then humidified for 24 ± 1 hour at 37 ± 2 ° C., 5 ± 1% CO. 2 Incubated in incubator. The cells were stained with preheated (37 ° C.) MTT (3- [4,5-dimethylthiazolyl-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide, 5 mg / ml, 50 μl / well). And incubated for 3.5-4.5 hours as before. The medium was aspirated from the cells and 100 μl of staining solubilization solution (81% v / v 2-propanol, 3% w / v sodium dodecyl sulfate, 0.04N HCl) was added to each well. The plates were then incubated in the dark at ambient temperature for 30-60 minutes. The plate was then shaken on a microplate shaker for 8 ± 3 minutes. Finally, the absorbance at 570 nm of each well was measured with a microplate spectrophotometer. The activity of the IFN-β activity standard was fitted to a linear regression curve and the activity of the test sample was determined from this curve. The specific activity of each sample was calculated based on the mass of the sample used.
[0064]
RP-HPLC analysis of IFN-β-1b concentration was performed as described above. The additive formulation was also monitored in a reduced SDS-PAGE Western blot as an apparent increase in the molecular weight of the IFN-β-1b band.
[0065]
III. Results and Discussion
The potency (specific activity) of the mannitol formulation was kept essentially unchanged during this study. On the other hand, the efficacy of dextrose formulations was increased. One month exposure to a temperature of 37 ° C. had no effect on efficacy (see FIGS. 14 and 15). For the mannitol IFN-β-1b formulation, the amount of glycosylated IFN-β-1b remained below the limit of detection, even at 50 ° C., throughout this study. In contrast, glycosylation was detected in dextrose formulations after 2 months at 37 ° C. and 2 weeks at 50 ° C., but not after 3 months storage at 25 ° C. Extensive glycosylation modified the chromatogram to be too many to measure the total IFN-β-1b content. Adduct formation in this dextrose formulation was also detected in reduced SDS-PAGE Western blots after 2 months storage at 37 ° C or 1 month storage at 50 ° C. In contrast, no change was observed in the SDS-PAGE Western blot for the mannitol formulation at any storage condition.
[0066]
Example 3: Long-term stability of an IFN-β formulation containing highly purified mannitol
Three lots (N006, N005 and N009) of IFN-β-1b formulations containing highly purified mannitol were stored at 4 ° C., 25 ° C. or 30 ° C., and their stability was increased over 3 years. Assays were performed at monthly intervals and at 6 month intervals for an additional year. Stability was assayed by the method described above.
[0067]
All three lots remained effective throughout 24 months at 4 ° C and 30 ° C. Data is presented in FIGS. Furthermore, all three lots demonstrated that peak B1 (glucosylated IFN-β species) did not exceed 0.02 mg / ml at all temperatures and time points.
[0068]
One skilled in the art can recognize or ascertain using no more than routine experimentation many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein for IFN-β. Furthermore, those skilled in the art are able to apply the above experiments and formulations provided by way of example using IFN-β to proteins in general (most specifically pharmaceutical proteins), using what does not go beyond conventional experiments Pharmaceutical proteins that can be recognized or confirmed include, but are not limited to, the following proteins: human growth hormone, all interferons, all interleukins, colony stimulating factor (GM-CSF) , G-CSF, M-CSF), β-glucocerebrosidase, thyrotropin, etanercept, monoclonal antibodies (eg, abciximab, basiliximab, palivizumab, rituximab, and transtumumab), blood factors (eg, , Factor VIIa and Factor VIII), enzymes (eg urokinase, asparginase, anistreplase, and alteplase). Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.
[0069]
All publications and patent applications mentioned in this specification are indicative of the level of ordinary skill in the art to which this invention pertains. All publications and patent applications are incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually mentioned to be incorporated by reference.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a comparison of RP-HPLC chromatograms for dextrose formulated IFN-β bulk and lyophilized powder incubated at 50 ° C. for 1 week. A formulation held at 50 ° C. of the glucosylated IFN-β adduct in the formulation is seen as the appearance of the second peak (B1) (approximately in fraction 48), after which (approximately the fraction The main IFN-β peak (at 49-50) follows. See Example 1.
FIG. 2 shows the mass spectrum for bulk dextrose formulated IFN-β. Several small peaks were detectable in addition to the main IFN-β peak at 19878 am (atomic mass units). See Example 1.
FIG. 3 shows a mass spectrum for a sample of dextrose formulated IFN-β lyophilized from a bulk composition and stored at 50 ° C. for one week. In contrast to FIG. 2, the main peak corresponds to the IFN-β adduct. See Example 1.
FIG. 4 shows a comparison of RP-HPLC chromatograms for USP mannitol formulated IFN-β bulk and lyophilized powder incubated at 50 ° C. for 1 week. No glucosylated IFN-β adduct formulation (B1 peak appearance), which is kept at 50 ° C. in the formulation, is found. See Example 1.
FIG. 5 shows a mass spectrum of USP mannitol formulated IFN-β bulk. IFN-β is detected as a peak at 19880 am. See Example 1.
FIG. 6 shows the mass spectrum of USP mannitol formulated IFN-β lyophilized and incubated at 50 ° C. for 1 week. The formation of additional peaks (indicating adducts) can be found in the spectrum. See Example 1.
FIG. 7 shows the mass spectrum of unpurified mannitol formulated IFN-β. The formation of multiple additional peaks (indicating adducts) can be found in this spectrum. See Example 1.
FIG. 8 shows a mass spectrum of IFN-β formulated with methanol extracted mannitol from the same lot used in FIG. The size and number of adduct peaks were substantially reduced. See Example 1.
FIG. 9 shows the mass spectrum of an IFN-β formulation containing highly purified (methanol extraction, carbon treatment, ultrafiltration, and recrystallization) mannitol. Only three small peaks are seen in addition to the main peak showing unmodified IFN-β. See Example 1.
FIG. 10 shows the mass spectrum of IFN-β formulated in the absence of mannitol. From this spectrum, it is found that the main secondary peaks present in FIG. 9 are not formed by interacting with highly purified mannitol, as they also appear in the absence of excipients. Can be done. See Example 1.
FIG. 11 shows the mass spectrum of IFN-β formulated with USP mannitol, performed on the same day as FIG. 9 above. This spectrum confirms that IFN-β formulated with USP mannitol forms additional peaks (adducts). This peak is not present in IFN-β formulations containing highly purified mannitol. See Example 1.
FIG. 12 shows stability assessment data for an IFN-β dextrose formulation as described in Example 2.
FIG. 13 shows stability assessment data for an IFN-β formulation containing highly purified mannitol as described in Example 2.
FIG. 14 shows stability assessment data for lot 006 of an IFN-β formulation containing highly purified mannitol as described in Example 3.
FIG. 15 shows stability assessment data for lot 008 of an IFN-β formulation containing highly purified mannitol as described in Example 3.
FIG. 16 shows stability assessment data for lot 009 of an IFN-β formulation containing highly purified mannitol as described in Example 3.
FIG. 17 shows that reducing activity is present in various mannitol samples. Sample 1-3 is USP mannitol that has not been subjected to methanol extraction, carbon filtration, or ultrafiltration. Sample 4-6 is USP mannitol extracted with methanol. Sample 7-9 is then mannitol extracted with methanol, carbon treated, ultrafiltered and recrystallized.
Claims (68)
該IFN−βは、組み換えヒトIFN−βであり、該組み換えヒトIFN−βは、0.01mg/ml〜15mg/mlの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、0.25(重量/容積)%〜5(重量/容積)%の濃度で存在し、該組成物のpHは、3.0〜9.0の範囲にあり、そして
該組成物は、0.01(重量/容積)%〜15(重量/容積)%の濃度でヒトアルブミンをさらに含有し、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、
組成物。A composition comprising IFN-β and highly purified mannitol, comprising:
The IFN-β is recombinant human IFN-β, the recombinant human IFN-β is 0 . The highly purified mannitol, present at a concentration of 01 mg / ml to 15 mg / ml, is 0 . Present in a concentration of 25 (weight / volume)% to 5 (weight / volume)%, and the pH of the composition is 3 . 0-9. In the range of 0 and the composition is 0 . 01 (weight / volume)% to 1 5 (weight / volume)% of further containing human albumin at a concentration, mannitol purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm,
Composition.
該IFN−βは、組み換えヒトIFN−βであり、該組み換えヒトIFN−βは、0.01mg/ml〜15mg/mlの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、0.25(重量/容積)%〜5(重量/容積)%の濃度で存在し、該組成物のpHは、3.0〜9.0の範囲にあり、該組成物は、0.01(重量/容積)%〜15(重量/容積)%の濃度でヒトアルブミンおよび該組成物を等張性とするのに充分な塩化ナトリウムをさらに含有し、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、
組成物。A composition comprising IFN-β and highly purified mannitol, comprising:
The IFN-β is recombinant human IFN-β, the recombinant human IFN-β is 0 . The highly purified mannitol, present at a concentration of 01 mg / ml to 15 mg / ml, is 0 . Present in a concentration of 25 (weight / volume)% to 5 (weight / volume)%, and the pH of the composition is 3 . 0-9. In the range of 0, the composition is 0 . 01 (weight / volume)% to 1 5 (weight / volume)% concentration in further contain sufficient sodium chloride to the isotonic human albumin and the composition, mannitol purified to the high degree of Having a reducing activity of less than 20 ppm,
Composition.
該IFN−βは、組み換えヒトIFN−βであり、該組み換えヒトIFN−βは、0.05mg/ml〜1mg/mlの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、0.25(重量/容積)%〜2.5(重量/容積)%の濃度で存在し、該組成物のpHは、6.8〜8.2の範囲にあり、そして該組成物は、0.25(重量/容積)%〜2.5(重量/容積)%の濃度でヒトアルブミンをさらに含有し、該高度に精製されたマンニトー ルは、20ppm未満の還元活性を有する、
組成物。A composition comprising IFN-β and highly purified mannitol, comprising:
The IFN-β is recombinant human IFN-β, the recombinant human IFN-β is 0 . The highly purified mannitol, present at a concentration of 05 mg / ml to 1 mg / ml, is 0 . 25 (weight / volume)% -2 . Present at a concentration of 5 (weight / volume)%, the pH of the composition is 8-8 . 2 and the composition is 0 . 25 (weight / volume)% -2 . 5 further containing human albumin at a concentration (weight / volume)% mannitol Le purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm,
Composition.
該IFN−βは、組み換えヒトIFN−βであり、該組み換えヒトIFN−βは、0.25mg/mlの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、1.25(重量/容積)%の濃度で存在し、該組成物のpHは、7.3〜7.5の範囲にあり、そして該組成物は、1.25(重量/容積)%の濃度でヒトアルブミンをさらに含有し、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、
組成物。A composition comprising IFN-β and highly purified mannitol, comprising:
The IFN-β is recombinant human IFN-β, the recombinant human IFN-β is 0 . The highly purified mannitol present at a concentration of 25 mg / ml is 1 . Present at a concentration of 25 (weight / volume)%, the pH of the composition is 7 . 3-7 . 5 and the composition is 1 . 25 (weight / volume)% concentration further containing human albumin, mannitol purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm,
Composition.
IFN−βまたはその生物学的に活性な改変体および高度に精製されたマンニトールを、該IFN−βまたはその改変体を安定化するに充分な量で含む処方物を生産する工程を包含し、ここで、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、方法。A method of producing a formulation of IFN-β or a biologically active variant thereof characterized by improved stability, the method comprising:
IFN-beta or a biologically active variant thereof and highly purified mannitol, comprising the step of producing a formulation in an amount sufficient to stabilize the IFN-beta or variants thereof, here, mannitol purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm, the method.
a)クロマトグラフィーによって該IFN−βからドデシル硫酸ナトリウムおよび塩を取り除く工程;
b)該IFN−βと、ヒトアルブミンの溶液とを、11.5〜12.0のpHで合わせる工程;
c)該溶液のpHをHClで7.5に調整する工程;および
d)高度に精製されたマンニトールの溶液を加える工程、
を包含し、ここで、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、方法。A method of producing a formulation of IFN-β or a biologically active variant thereof, the method comprising the following steps:
a) removing sodium dodecyl sulfate and salts from the IFN-β by chromatography;
b) combining the IFN-β with a solution of human albumin at a pH of 1 1.5 to 1 2.0;
c) adjusting the pH of the solution to 7.5 with HCl; and d) adding a solution of highly purified mannitol;
It encompasses, where, mannitol purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm, the method.
該組成物中に、該IFN−βまたはその改変体を安定化するのに充分な量の高度に精製されたマンニトールを取り込ませる工程、
を包含し、ここで、該高度に精製されたマンニトールは、20ppm未満の還元活性を有する、方法。A method of increasing the stability of IFN-β or a variant thereof in a pharmaceutical composition comprising:
Incorporating into the composition an amount of highly purified mannitol sufficient to stabilize the IFN-β or a variant thereof;
It encompasses, where, mannitol purified to the high degree has a reducing activity of less than 20 ppm, the method.
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