JP4118930B2 - Microorganism weighing method - Google Patents
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Description
本発明は、検査対象に付着した微生物を採取する手段であり、これらを発色及び発光、蛍光発光させ、検査対象に存在する生細胞及び死細胞あるいは特定の微生物を効率よく捕集し、検出し、測定するための微生物計量方法に関するものである。 The present invention is a means for collecting microorganisms adhering to a test object, and these are colored, luminescent and fluorescent, and efficiently collect and detect live and dead cells or specific microorganisms present in the test object. The present invention relates to a microorganism weighing method for measuring .
従来、この種の微生物採取手段としては、ポンプの作動による圧力変化によって微生物を含み得る液状検体から微生物をろ過してフィルタ上に微生物を捕集した後、ユニットを分解してピンセットのような細かい作業を行うことができる道具を用いて採取した微生物が付着しているフィルタを回収して測定するものがあった。 Conventionally, as this type of microorganism collecting means, after filtering microorganisms from a liquid sample that can contain microorganisms by pressure change due to the operation of a pump and collecting the microorganisms on a filter, the unit is disassembled and fine like tweezers There was one that collected and measured the filter to which the collected microorganisms were attached using a tool capable of performing work.
このような従来の微生物採取手段では、微生物の採取にポンプなど大掛かりな装置を必要としている。また、異物などの影響が直接あるような検体の場合、異物除去過程を別途必要としている。さらにフィルタ上に採取した微生物を検査するためにフィルタのみを回収する必要がある。この作業にはピンセットなど細かい作業を行うための道具を必要としているため、効率を低下し、大量のサンプルを処理することができない。さらにポンプを使用するため機器が大きな物となり、食品検査工程など、作業スペースが狭い場所ではできるものではない。これらは、迅速性が求められる微生物検査において、ある程度の検査時間及び技術を必要とする。従って、誰もが簡便に迅速に行うことができるというものではないという課題がある。 Such a conventional microorganism collecting means requires a large device such as a pump for collecting microorganisms. Further, in the case of a sample that is directly affected by foreign matter, a foreign matter removal process is required separately. Furthermore, it is necessary to collect only the filter in order to inspect the microorganisms collected on the filter. Since this work requires tools for performing fine work such as tweezers, the efficiency is lowered and a large amount of samples cannot be processed. Furthermore, since a pump is used, the equipment becomes large, and this is not possible in a place with a small work space such as a food inspection process. These require a certain amount of testing time and technique in microbial testing that requires rapidity. Therefore, there is a problem that not everyone can easily and quickly carry out.
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物採取用フィルタを暗色のフィルタとすることで、背景(バックグランド)の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる微生物計量方法を提供することを目的としている。 The present invention solves such a conventional problem, and by using a dark filter as a microorganism collection filter, it is possible to accurately measure microorganisms while suppressing light emission in the background (background). The object is to provide a method for measuring microorganisms .
また、微生物採取用フィルタ上にある種の成分からなる薄膜を形成することで、背景(バックグランド)の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる微生物計量方法を提供することを目的としている。 Another object of the present invention is to provide a microorganism measuring method capable of accurately measuring microorganisms by suppressing a light emission of a background (background) by forming a thin film made of a certain component on a filter for collecting microorganisms. It is said.
また、薄膜の膜厚を適切な値とすることで、薄膜を形成することの効果をより確実なものとする微生物計量方法を提供することを目的としている。 Further, by making the film thickness of the thin film with an appropriate value, that aims to provide a microorganism metering method of the effect of forming a thin film and more reliable.
本発明の微生物計量方法は、微生物採取用フィルタを暗色のフィルタとしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、背景(バックグランド)が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる微生物計量方法が得られる。 The microorganism weighing method of the present invention is characterized in that the microorganism collection filter is a dark filter. And according to this invention, the microorganisms measuring method which can suppress effectively that a background (background) light-emits and inhibits accurate microorganism measurement is obtained.
また、フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成したことを特徴とする。そして、本発明によれば、背景(バックグランド)が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる微生物計量方法が得られる。 In addition, a thin film containing at least one metal component selected from gold, copper, chromium, platinum and palladium is formed on the filter. And according to this invention, the microorganisms measuring method which can suppress effectively that a background (background) light-emits and inhibits accurate microorganism measurement is obtained.
また、薄膜の膜厚を10乃至50nmとしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、薄膜を形成することの効果をより確実なものとした微生物計量方法が得られる。 The thin film has a thickness of 10 to 50 nm. Then, according to the present invention, Ru to obtain the effect more reliable and microorganisms weighing of forming a thin film.
本発明によれば、微生物採取用フィルタ上に捕集した微生物を発色させ、発色を検出することによって微生物を計量する際、背景(バックグランド)が発光することを効果的に抑制することで正確な計数ができる微生物計量方法が提供される。 According to the present invention, when microorganisms collected on a filter for collecting microorganisms are colored and the microorganisms are measured by measuring the color development, the background (background) is effectively suppressed from emitting light. microorganisms weighing method that can Do not count Ru is provided.
以下に本発明の微生物計量方法を図面を用いて説明する。しかしながら本発明は以下の説明に何ら限定されるものではない。 The microorganism weighing method of the present invention will be described below with reference to the drawings. However, the present invention is not limited to the following description.
図1(a)は微生物採取キットの一態様の断面図である。微生物採取キットAは微生物採取チップBと吸引ろ過手段Cとからなる。微生物採取チップBは基本構成として前段にあるプレフィルタとしての異物除去用フィルタ1と後段にある暗色(例えば黒色)の微生物採取用フィルタ2(例えば白色のフィルタ上に炭素薄膜を形成したもの)とからなる。異物除去用フィルタ1の孔径は異物を極力除去するために5乃至20μmとされ、微生物採取用フィルタ2の孔径は微生物を確実に捕集するために0.2乃至0.8μmとされている。ここで孔径は最小孔径を意味するものとする。微生物採取チップBは液状検体注入容器3を有し、異物除去用フィルタ1は液状検体注入容器3の底部としてなる。微生物採取用フィルタ2は台座4の上に配置され、台座4は台座保持部材5に保持されている。台座保持部材5に保持された台座4には中空針6が一体成形されている。液状検体注入容器3と台座保持部材5は着脱自在に嵌合するようになっている。吸引ろ過手段Cは陰圧管7であり、陰圧管7の口部はゴム栓8で封止されている。
1 (a) is a cross-sectional view of one embodiment of a micro-organism collection kit. The microorganism collection kit A includes a microorganism collection chip B and suction filtration means C. The microbe collection chip B has a basic configuration of a foreign
微生物採取用フィルタ2を暗色のフィルタとすることで、背景(バックグランド)が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる。また、フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成してもよい。これらの成分は300乃至550nm程度の波長の励起光に対する分光反射率が低いという性質を有するので、微生物採取用フィルタ2を暗色のフィルタとし、さらにフィルタ上に上記の薄膜を形成すれば、効果はより向上する(アルミニウムや銀は上記の波長の励起光に対する分光反射率が高いので採用できない)。薄膜は、一種の金属成分からなるものの他、合金、金属酸化物、金属炭化物、金属窒化物、金属炭窒化物などからなるものであってもよい。また、積層薄膜であってもよい。薄膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンスパッタリング法、イオンプレーティング法などの公知の気相成長法が好適に採用される。薄膜の膜厚は10乃至50nmとすることが望ましい。10nmを下回ると薄膜を形成することの効果が十分に発揮されない恐れがある一方、50nmを超えるとフィルタの孔が目詰まりを起し、フィルタ本来の機能に影響を及ぼす恐れがあるからである。
By using the
液状検体は、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合はそれ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合はそれをホモジナイズして液状検体を調製したり、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。このようにして準備された液状検体を微生物採取チップBの液状検体注入容器3に注入する。その後、陰圧状態の陰圧管7の口部のゴム栓8に中空針6を突き刺し、図1(b)に示したように中空針6にゴム栓8を貫通させることで液状検体は吸引ろ過される。なお、台座保持部材5の下部は中空針6を確実に陰圧管7のゴム栓8に突き刺すためのガイドとしての機能を持たせるためや取扱者が中空針6で怪我をしないように伸長されている。
The liquid sample itself is a liquid sample when the test object is a liquid sample such as drinking water. If the object to be inspected is a solid sample such as vegetables or meat, homogenize it to prepare a liquid specimen, or collect microorganisms from the surface using a cotton swab, etc., and use this as a physiological saline solution. Release to make liquid specimen. When a cooking utensil such as a cutting board is an object to be inspected, microorganisms are collected from the surface using a cotton swab or the like and released into physiological saline or the like to obtain a liquid sample. The liquid specimen thus prepared is injected into the liquid specimen injection container 3 of the microorganism collection chip B. Thereafter, the
液状検体が異物除去用フィルタ1を通過した際、微生物よりも大きな異物は異物除去用フィルタ1に捕集され除去される。異物除去用フィルタ1の前段に大型の異物、例えば、野菜屑や繊維などを捕集するためのフィルタを設け、異物の除去を目的としたフィルタを積層形態にしてもよい。異物除去用フィルタ1を通過した液状検体は微生物採取用フィルタ2に到達し、液状検体に微生物が含まれている場合、微生物は微生物採取用フィルタ2に捕集される。なお、微生物採取用フィルタ2と台座4との境界面には液状検体が微生物採取用フィルタ2の全面に満遍なく行き渡るように溝が設けてある。これにより微生物採取用フィルタ2の局部に微生物が集中して捕集されるような現象を抑制することができる。
When the liquid specimen passes through the foreign
液状検体注入容器3と台座保持部材5は着脱自在に嵌合するようになっているので、微生物採取用フィルタ2上に微生物を捕集した後、液状検体注入容器3は取り外し、図1(c)に示したように微生物採取用フィルタ2を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動することが可能である。
Since the liquid sample injection container 3 and the
なお、異物除去用フィルタの前段に別途液状検体注入容器を設けてもよい。 In addition, a liquid specimen injection container may be separately provided in the front stage of the foreign matter removing filter.
なお、陰圧管の口部のゴム栓の中心部を薄層としてもよい。 The central part of the rubber stopper at the mouth of the negative pressure tube may be a thin layer.
なお、液状検体の調製は別途試験管などを使用して行えばよいが、予め液状検体注入容器3に生理食塩水などを注入しておき、そこに綿棒などを用いて採取された微生物を遊離させて液状検体としてもよい。 The liquid sample may be prepared separately using a test tube or the like. However, physiological saline or the like is injected into the liquid sample injection container 3 in advance, and the microorganisms collected using a cotton swab or the like are released. It is good also as a liquid specimen.
なお、液状検体注入容器3と台座保持部材5は着脱自在に嵌合するようになっているが、両者の接合はネジを用いて行ってもよい。また、両者は製造当初は一体成形されたものであってもよく、外周に渡る適当な位置に両者の分離を容易にするための分離溝を設けておき、この分離溝を利用して両者を分離するようにしてもよい。
The liquid sample injection container 3 and the
なお、中空針はゴム栓を貫通し、陰圧管内部に到達するものであれば、長さに制限を持つものではない。 The hollow needle is not limited in length as long as it penetrates the rubber stopper and reaches the inside of the negative pressure tube.
図2(a)は微生物採取キットのその他の態様の断面図である。微生物採取キットDは微生物採取チップEと吸引ろ過手段Fとからなる。微生物採取チップEが図1(a)に示した微生物採取チップBと異なる点は、液状検体注入容器13の上にその開口部を覆う綿棒51が付いた蓋52を備えていることである。微生物採取キットに綿棒を付属させておくことで、表面にキズが多い検査対象や調理場の角など、形状の複雑な検査対象からのサンプリングを容易かつ簡便なものとすることができる。さらに微生物採取チップEのように綿棒51を蓋52と一体化することで形状を単純化することができる。図2(a)に示したように液状検体注入容器13の中に予め生理食塩水53を注入しておくとともに、綿棒51を生理食塩水53に浸る長さのものにしておけば、綿棒52を用いて検査対象から微生物を採取した後、蓋52を液状検体注入容器13に被せて微生物採取チップEを上下左右に振とうすることにより綿棒51に付着していた微生物を生理食塩水53に遊離させて液状検体を調製することが容易となる。
2 (a) is a sectional view of another embodiment of the micro-organism collection kit. The microorganism collection kit D includes a microorganism collection chip E and suction filtration means F. The difference between the microorganism collection chip E and the microorganism collection chip B shown in FIG. 1A is that a
微生物を生理食塩水53に遊離した後は、図2(b)に示したように中空針16にゴム栓18を貫通させることで液状検体は吸引ろ過され、微生物採取用フィルタ12上に微生物が捕集される。その後、図1(c)に示したのと同様にして液状検体注入容器13を取り外し、微生物採取用フィルタ12を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動して計測を行う。
After releasing the microorganisms into the
なお、綿棒は蓋とは必ずしも一体化されている必要はない。 Note that the cotton swab need not be integrated with the lid.
なお、綿棒は必ずしも生理食塩水に漬かる長さのものである必要はなく、振とうすることで綿棒に付着していた微生物を生理食塩水に遊離させることができるものであればどのような長さのものであってもよい。 Note that the swab does not necessarily have a length soaked in physiological saline, and any length can be used as long as the microorganism attached to the cotton swab can be released into the physiological saline by shaking. It may be the same.
なお、綿棒は微生物採取キットの製造当初から生理食塩水に浸っていてもよい。その場合、生理食塩水で綿棒が濡れているため、特に乾燥した検体対象からの微生物の採取を有効に行うことができる。 The cotton swab may be immersed in physiological saline from the beginning of the microorganism collection kit. In that case, since the cotton swab is wet with physiological saline, it is possible to effectively collect microorganisms from a particularly dry specimen.
なお、綿棒に付着した微生物の生理食塩水への遊離を別途試験管などで行って液状検体を調製し、調製された液状検体を液状検体注入容器に注入するようにしてもよい。 Alternatively, the liquid specimen may be prepared by separately releasing the microorganisms adhering to the cotton swab into the physiological saline using a test tube or the like, and the prepared liquid specimen may be injected into the liquid specimen injection container.
以上のようにして微生物採取用フィルタ上に捕集された微生物は種々の方法により検出することができるとともに計量することができるが、以下には生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出し計量する方法を説明する。 The microorganisms collected on the filter for collecting microorganisms as described above can be detected and weighed by various methods. In the following, the microorganisms are identified as live cells and / or dead cells. A method for simultaneously detecting and weighing microorganisms will be described.
第一の微生物計量方法は、生死細胞を発色させる第1の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第2の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第3の化合物との中で1種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも1種類以上の第4の化合物を液状検体に接触させ、微生物が液状検体に含まれている場合には微生物を染色した後、微生物採取チップを用いて微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する方法である。この方法によれば、生死細胞、生細胞、死細胞、特定微生物が異なる波長で発色するので、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出することができる。 The first microorganism measuring method includes: a first compound that develops viable and dead cells; a second compound that develops dead cells with a wavelength different from the color development; and a third compound that develops live cells with a wavelength different from the color development; Among them, at least one or more types of the fourth compound that develops color at a wavelength different from the color developed by reacting with one or a plurality of species and a specific microorganism-derived substance is brought into contact with the liquid specimen, and the microorganism is contained in the liquid specimen. If the microorganisms are stained, the microorganisms are collected on a filter for collecting microorganisms using a microorganism collection chip, and then identified as live cells and / or dead cells based on the wavelength difference and color development amount. This is a method for simultaneously detecting microorganisms. According to this method, viable and dead cells, live cells, dead cells, and specific microorganisms develop colors at different wavelengths, so that the specific microorganisms are detected simultaneously with either or both of live and dead cells from the wavelength difference and color development amount. be able to.
発色は例えば蛍光によるものが挙げられる。この場合、第1の化合物を核酸結合性の化合物とすることで生死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる。また、第2の化合物を核酸結合性の化合物とすることで死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる。また、第3の化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることでその発色量の相違により生きている微生物のみを計量することができる。この際、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでその反応性から微生物の生死を判別できる。また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでその反応性から特定微生物の生死を判別できる。 Examples of color development include fluorescence. In this case, by using the first compound as a nucleic acid binding compound, it is possible to measure the living and dead cells with high accuracy at the single cell level. In addition, by using the second compound as a nucleic acid-binding compound, dead cells can be accurately measured at a single cell level. Moreover, by making the third compound a compound that develops color by reacting with a microorganism-derived substance, only living microorganisms can be measured due to the difference in the amount of color development. At this time, by making the microorganism-derived substance an enzyme protein, the viability of the microorganism can be discriminated from its reactivity. Moreover, the life and death of a specific microorganism can be discriminate | determined from the reactivity by making a specific microorganism origin substance into an enzyme protein.
微生物を蛍光染色するために使用される生死細胞を発色させる第1の化合物としては、例えば、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(誘導体であってもよい)のような生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発色する化合物が挙げられる。死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第2の化合物としては、例えば、プロピデュームイオダイド(誘導体であってもよい)のような死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発色する化合物が挙げられる。生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第3の化合物としては、例えば、6−カルボキシフルオレセインジアセテート、2’,7’ジクロロフルオレセインジアセテート、6−(N−スクシンイミジルオキシカルボニル)−3’,6’−0,0’−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸4−アジドフルオレセイン(これらは誘導体であってもよい)のような細胞内に浸透し、生細胞内に存在する酵素タンパク質、例えば、エステラーゼによって分解されることで発色する化合物が挙げられる。特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する第4の化合物としては、例えば、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシド、4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド(これらは誘導体であってもよい)が挙げられる。これらは、大腸菌や大腸菌群が生産する酵素タンパク質であるβ−グルクロニダーゼやβ−ガラクトシダーゼと特異的に反応することによって分解されて4−メチルウンベリフェロンを生成する。4−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。 Examples of the first compound that develops viable and dead cells used for fluorescent staining of microorganisms include life and death such as 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (which may be a derivative). A compound that penetrates non-specifically from the cell membrane surface and develops color by specifically binding to a nucleic acid present in the cell. Examples of the second compound that develops color of dead cells at a wavelength different from that of the color development include, for example, nonspecific penetration from the membrane surface of dead cells such as propidium iodide (which may be a derivative) Examples thereof include compounds that develop color by specifically binding to nucleic acids present therein. Examples of the third compound that develops viable cells at a wavelength different from that of the color development include 6-carboxyfluorescein diacetate, 2 ′, 7 ′ dichlorofluorescein diacetate, 6- (N-succinimidyloxycarbonyl)- Penetration into cells such as 3 ′, 6′-0,0′-diacetylfluorescein, dihydrorhodamine, fluorescein diacetate, 4-azidofluorescein diacetate (these may be derivatives) and in living cells And compounds that develop color when decomposed by an esterase. Examples of the fourth compound that develops color at a wavelength different from the color development by reacting with a specific microorganism-derived substance include 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside, 4-methylumbelliferyl-β-D- Glucuronides (these may be derivatives). These are decomposed by specifically reacting with β-glucuronidase and β-galactosidase which are enzyme proteins produced by Escherichia coli and coliforms to produce 4-methylumbelliferone. 4-Methylumbelliferone is excited by ultraviolet light and emits fluorescence.
第1乃至第4の化合物は、例えば、生理食塩水に溶解された状態で使用され、液状検体に添加されることで、微生物が液状検体に含まれている場合には微生物を染色しうる。生理食塩水に溶解された状態の第1乃至第4の化合物は、その適量を点眼剤容器などに収容して用時に液状検体に添加できるようにしてもよい。なお、染色時間は検査対象の種類や液状検体の容量などに応じて適宜設定されるべきものである。 The first to fourth compounds are used, for example, in a state dissolved in physiological saline, and can be added to a liquid sample to stain the microorganism when the microorganism is contained in the liquid sample. An appropriate amount of the first to fourth compounds dissolved in physiological saline may be stored in an eye drop container or the like so that they can be added to a liquid specimen at the time of use. It should be noted that the staining time should be appropriately set according to the type of test object and the volume of the liquid sample.
染色された微生物を含む液状検体を本発明の微生物採取キットを用いて吸引ろ過することにより、微生物採取チップにおける微生物採取用フィルタ上に染色された微生物を捕集する。この際、例えば、染色された微生物を含む液状検体にポリソルベート80などの界面活性剤を添加しておけば、異物除去用フィルタに捕集される異物に付着してしまって微生物採取用フィルタに捕集されないような微生物も、効率よく異物除去用フィルタを通過させて微生物採取用フィルタに捕集することができる。さらに液状検体にポリペプトンなどの培地成分を添加しておけば、操作中における微生物の活性を維持することができる。界面活性剤とともに培地成分を含有する液剤、例えば、LP希釈液「ダイゴ」(日本製薬社製の商品名)はこのような目的を達成するために好適に使用される。吸引ろ過を行った後は、図1(c)に示したような微生物採取用フィルタ2を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動して計測を行う。染色された微生物を含む液状検体にグリセリンなどの多価アルコールを添加しておけば、微生物採取用フィルタ表面が乾燥してしまうことによる微生物の失活や発光の減退を防止することができる。
The liquid specimen containing the stained microorganism is suction filtered using the microorganism collection kit of the present invention, whereby the stained microorganism is collected on the microorganism collection filter in the microorganism collection chip. At this time, for example, if a surfactant such as polysorbate 80 is added to a liquid specimen containing stained microorganisms, it adheres to the foreign matter collected by the foreign matter removal filter and is captured by the microorganism collection filter. Microorganisms that are not collected can be efficiently passed through the foreign matter removing filter and collected in the microorganism collecting filter. Further, if a medium component such as polypeptone is added to the liquid specimen, the activity of the microorganism during the operation can be maintained. A liquid agent containing a medium component together with a surfactant, for example, LP diluent “DAIGO” (trade name, manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) is preferably used to achieve such an object. After the suction filtration, the measurement is performed by moving only the portion including the
なお、微生物採取チップにおいて、第1乃至第4の化合物を担持させたフィルタを微生物採取用フィルタの前段に設置するようなことも可能である。 In the microorganism collection chip, it is also possible to place a filter carrying the first to fourth compounds in front of the microorganism collection filter.
図3は微生物計量装置の一態様を示す概念図である。この微生物計量装置は、光源104、光源集光手段としてのレンズ110、受光部111を含む。光源104から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ112で分光する。分光された励起光はプリズム113を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ110を経て検査台116に設置された微生物採取用フィルタ2を含む部位、即ち、微生物採取用フィルタ2と台座4と台座保持部材5と中空針6とからなる組合せ体の微生物採取用フィルタ2の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム113を透過する。その際、蛍光はプリズム113をそのまま透過し、受光部111に到達する。受光部111に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ114を経て、受光部111に内蔵された光電変換素子115に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、この微生物計量装置は検査台116を移動する手段を備えており、微生物採取用フィルタ2の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
FIG. 3 is a conceptual diagram showing one embodiment of the microorganism weighing device. This microorganism weighing device includes a
光電変換素子115に到達した蛍光は、微生物判断手段105において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。
The fluorescence that has reached the
光源104より発生した励起光は、レンズ110によって集光されるが、その際、レンズ110によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺0.2μm乃至7.0μm程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺100μm乃至500μm程度の範囲を指し示す。
The excitation light generated from the
レンズ110によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、2秒乃至300秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
The irradiation time of the excitation light collected by the
発光を検出する際、光源104の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルタ112によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルタ112は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する化合物に対応できる。また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルタ114を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する化合物に対応できる。
When detecting light emission, if the wavelength range of the
光源104としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルタ112および蛍光分光フィルタ114を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルタ112および蛍光分光フィルタ114を使用する必要がある場合がある。
Examples of the
プリズム113およびレンズ110は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される化合物などにも対応できる。微生物採取用フィルタ2を含む部位を設置する検査台116は回転能を有する。レンズ110により集光された励起光は、微生物採取用フィルタ2の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ110により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検査台116の回転速度を変化させることによって、レンズ110により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された化合物が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
The
図3に示したように検査台116は微生物採取用フィルタ2を含む部位を嵌合させるための陥没部分(装置溝)を有し、ここに微生物採取用フィルタ2を含む部位をそのまま組み込むことができる形状としてある。なお、この際、例えば、検査台116に、微生物採取用フィルタ2がその上に位置するように金属平板を設け、微生物採取用フィルタ2が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台116上で微生物採取用フィルタ2が凹凸なく平滑に保持されるようにすれば、微生物採取用フィルタ2に捕集された微生物の定量をより確実なものにすることができる。
As shown in FIG. 3, the inspection table 116 has a depressed portion (apparatus groove) for fitting a portion including the
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ110によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
It should be noted that by providing a means for recognizing the condensed position, the position of the excitation light collected by the
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。 Note that the minute fixed area to which the excitation light is irradiated is not limited to a polygon including a square, but may be a circle, an ellipse, or the like as long as the sample can be irradiated.
なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。 It is also possible to use a diffraction grating or the like as means for separating excitation light or fluorescence.
なお、検査台116の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ110の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
Although the fluorescence afterimage and afterglow are prevented by adjusting the rotation speed of the examination table 116, it is also possible to prevent afterimage and afterglow by adjusting the moving speed of the
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、微生物採取用フィルタ2上の軌道を把握するものであればよい。
The means for recognizing the condensed position does not necessarily need to directly recognize the condensing position of the excitation light, and may be any means that can grasp the trajectory on the
第二の微生物計量方法は、微生物採取チップを用いて微生物を含み得る液状検体から微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後、捕捉された微生物に生死細胞を発色させる第1の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第2の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第3の化合物との中で1種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも1種類以上の第4の化合物を接触させ、微生物を染色した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する方法である。この方法によれば、液状検体の容量が多い場合であっても微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後で微生物を染色するので、第1乃至第4の化合物の使用量は少量で、生細胞や死細胞や特定微生物を精度よく簡単に計量することができる。 The second microorganism weighing method uses a microorganism collection chip to collect microorganisms from a liquid specimen that may contain microorganisms on a microorganism collection filter, and then causes the captured microorganisms to develop viable and dead cells to develop color and death. By reacting with one or more types of a second compound that causes cells to develop color at a wavelength different from the color development and a third compound that causes live cells to develop color at a wavelength different from the color development, a substance derived from a specific microorganism After contacting at least one or more types of fourth compounds that develop color at a wavelength different from the color development and staining the microorganism, the living organism and / or dead cell and the specific microorganism are simultaneously used from the wavelength difference and color development amount. It is a method of detection. According to this method, even if the volume of the liquid specimen is large, the microorganism is stained after collecting the microorganism on the microorganism collection filter. Therefore, the amount of the first to fourth compounds used is small, Live cells, dead cells and specific microorganisms can be accurately and easily measured.
液状検体に墨汁を添加することで微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集する際にフィルタ上を黒くすることにより、背景(バックグランド)や異物の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる。墨汁は必ずしも液状検体に添加しなければならないわけではなく、微生物が捕集された微生物採取用フィルタの上から添加してもよい。 By adding black ink to a liquid sample and collecting microorganisms on a filter for collecting microorganisms, the background of the background and foreign matter can be suppressed by blackening the filter to accurately measure microorganisms. Can do. The ink is not necessarily added to the liquid specimen, but may be added from above the microorganism collecting filter on which the microorganisms are collected.
図4は微生物計量装置の正常状態確認検査用検体の一態様の斜視図(一部透過図)である。この正常状態確認検査用検体151は、その表面に所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体154が固定されるとともに所定個数の傾き高さ確認マーク155が印刷されている基材(例えば樹脂フィルム)152とその支持枠153からなる。
Figure 4 shows an embodiment of a perspective view of a normal state confirmation test sample of microorganisms metering device (partly transparent view). The
基材の表面に固定する発光体としては、高分子蛍光粒子や染色した微生物などが挙げられる。高分子蛍光粒子は長期間にわたって安定で均一な発光を維持するので、装置の状態の確認を正確に繰り返して何度も行うことができ、しかも人体に対する安全性が確保されている点において利用価値が高い。高分子蛍光粒子は、ポリスチレンやスチレン−ジビニルベンゼンなどを材質とする粒子であって、粒子を重合する際に特定波長の励起光によって発光する蛍光染料を添加して製造されるものであり、種々のものが市販されている。高分子蛍光粒子は0.1乃至1.0μmの粒子径のものを使用することが望ましい。小さすぎるとその個数を精度よく計測することが困難になったり、後述するように基材として微生物採取用フィルタを採用した場合、フィルタの孔から高分子蛍光粒子が落下するので検査用検体としての加工性が悪くなったりする一方、大きすぎると発光強度が強すぎることにより計測精度に影響を及ぼす恐れがあるからである。高分子蛍光粒子は、単一種類の高分子蛍光粒子を固定してもよいし、例えば、350乃至400nmの波長の励起光によって青色発光する高分子蛍光粒子と、500乃至550nmの波長の励起光によって赤色発光する高分子蛍光粒子といったように、異なる波長の励起光によって異なる色彩で発光する複数種類の高分子蛍光粒子を固定してもよい。 Examples of the illuminant to be fixed on the surface of the substrate include polymer fluorescent particles and stained microorganisms. Polymer fluorescent particles maintain stable and uniform light emission over a long period of time, making it possible to check the status of the device repeatedly and repeatedly, and in terms of ensuring safety to the human body. Is expensive. Polymer fluorescent particles are particles made of polystyrene, styrene-divinylbenzene, etc., and are manufactured by adding fluorescent dyes that emit light by excitation light of a specific wavelength when the particles are polymerized. Are commercially available. The polymeric fluorescent particles preferably have a particle diameter of 0.1 to 1.0 μm. If it is too small, it will be difficult to accurately measure the number, or if a filter for collecting microorganisms is used as the base material as will be described later, the polymer fluorescent particles will fall from the hole in the filter. This is because, while the workability is deteriorated, if it is too large, the emission intensity is too strong, which may affect the measurement accuracy. The polymer fluorescent particle may be a single type of polymer fluorescent particle fixed. For example, the polymer fluorescent particle emits blue light by excitation light having a wavelength of 350 to 400 nm, and excitation light having a wavelength of 500 to 550 nm. A plurality of types of polymer fluorescent particles that emit light in different colors by excitation light having different wavelengths may be fixed, such as polymer fluorescent particles that emit red light.
染色した微生物を基材の表面に固定する場合、固定する微生物は、検査目的とする微生物が生菌であるか死菌であるかその両方であるかによって、生菌、死菌、生死混合菌の中から適宜選択される(例えば、検査目的とする微生物が死菌である場合には死菌計量用光源の正常状態を確認する必要があるので死菌を基材に固定しなければならない)。生菌や生死混合菌を固定する場合は、操作上における人体への安全性を確保しなければならないことに留意すべきである。 When immobilizing dyed microorganisms on the surface of a substrate, the microorganisms to be immobilized depend on whether the microorganisms to be tested are viable or dead or both, viable, dead, or dead / live mixed bacteria (For example, if the microorganism to be tested is dead, it is necessary to confirm the normal state of the light source for measuring dead bacteria, so the dead bacteria must be fixed to the substrate) . It should be noted that when fixing live or dead / live mixed bacteria, safety to the human body in operation must be ensured.
基材は樹脂フィルムの他、ガラス、紙、金属などであってもよい。また、微生物採取用フィルタを基材として使用してもよい。微生物採取用フィルタを基材として使用すれば、特定波長の励起光によって発光する発光体をろ過することで、当該発光体を、容易にフィルタ上に捕集、即ち、基材の表面に固定することができる。基材は暗色(例えば黒色)とすることが望ましい。背景(バックグランド)の発光を抑制して、装置の状態の確認を正確に行うことができるようにするためである。また、特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成すれば、これらの成分は300乃至550nm程度の波長の励起光に対する分光反射率が低いという性質を有するので、基材を暗色とし、さらに特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材上に上記の薄膜を形成すれば、効果はより向上する(アルミニウムや銀は上記の波長の励起光に対する分光反射率が高いので採用できない)。また、このような薄膜を形成すれば、発光体の発光強度の調整、例えば、発光強度が強すぎる場合に発光強度を弱めることが可能になるとともに、基材の表面に固定した発光体の脱落などを防止することも可能になる。薄膜は、一種の金属成分からなるものの他、合金、金属酸化物、金属炭化物、金属窒化物、金属炭窒化物などからなるものであってもよい。また、積層薄膜であってもよい。薄膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンスパッタリング法、イオンプレーティング法などの公知の気相成長法が好適に採用される。薄膜の膜厚は10乃至1000nmとすることが望ましく、20乃至100nmとすることがより望ましい。10nmを下回ると薄膜を形成することの効果が十分に発揮されない恐れがある一方、1000nmを超えると基材の表面に固定した発光体の個数を精度よく計測することや発光体の発光強度の調整が困難になるからである。 The substrate may be glass, paper, metal, etc. in addition to the resin film. Moreover, you may use the filter for microorganism collection as a base material. If the filter for collecting microorganisms is used as a base material, the light emitting body that emits light by excitation light having a specific wavelength is filtered, so that the light emitting body is easily collected on the filter, that is, fixed to the surface of the base material. be able to. The substrate is preferably dark (for example, black). This is because it is possible to accurately check the state of the apparatus by suppressing the light emission of the background (background). In addition, if a thin film containing at least one metal component selected from gold, copper, chromium, platinum, and palladium is formed on a base material on which a light emitter that emits light with excitation light having a specific wavelength is fixed, these components are used. Has a low spectral reflectance with respect to excitation light having a wavelength of about 300 to 550 nm, so that the base material is dark and the above-mentioned light emitting body that emits light by excitation light having a specific wavelength is fixed on the surface. If a thin film is formed, the effect is further improved (aluminum and silver cannot be employed because they have a high spectral reflectance with respect to the excitation light having the above wavelength). In addition, when such a thin film is formed, it is possible to adjust the light emission intensity of the light emitter, for example, to reduce the light emission intensity when the light emission intensity is too strong, and to remove the light emitter fixed to the surface of the substrate. It is also possible to prevent such a situation. The thin film may be made of an alloy, a metal oxide, a metal carbide, a metal nitride, a metal carbonitride, or the like in addition to a kind of metal component. Moreover, a laminated thin film may be sufficient. As a method for forming the thin film, a known vapor phase growth method such as a vacuum deposition method, an ion sputtering method, or an ion plating method is preferably employed. The thickness of the thin film is preferably 10 to 1000 nm, and more preferably 20 to 100 nm. If the thickness is less than 10 nm, the effect of forming a thin film may not be sufficiently exhibited. On the other hand, if the thickness exceeds 1000 nm, the number of light emitters fixed on the surface of the substrate can be accurately measured and the light emission intensity of the light emitter can be adjusted. This is because it becomes difficult.
図5は図4に示した表面に所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体154が固定されるとともに所定個数の傾き高さ確認マーク155が印刷されている樹脂フィルム152の正面図である。発光体154を染色した微生物とする場合、微生物の染色は、例えば、上記の生死細胞を発色させる第1の化合物や死細胞を発色させる第2の化合物や生細胞を発色させる第3の化合物を適宜用いて行えばよい。発光体154は図3に示したような微生物計量装置により検出することができる。この正常状態確認検査用検体を使用して所定個数の発光体を検出することができることを確認した後、液状検体の微生物計量を行う。所定個数の発光体を検出することができたならば、装置は正常状態にあることを意味する。一方、所定個数の発光体を検出することができなかったならば、装置は正常状態にないことを意味するので、装置の調整などを行う必要がある。
FIG. 5 is a front view of the
図5に示した樹脂フィルム152の表面には所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体154が固定されている他、4個の傾き高さ確認マーク155が印刷されている。4個の傾き高さ確認マーク155に光を照射し、その反射光の出力レベルが均等かどうかを調べることにより、例えば、図3に示した微生物計量装置における検査台116の傾きの有無などを検査することができる。また、出力レベルが規定値通りかどうかを調べることにより、検査台116が規定高さとなっているかどうかなどを検査することができる。
On the surface of the
なお、微生物計量装置の正常状態確認検査用検体の形状については特段の制限があるわけではないが、例えば、図3に示した微生物計量装置における検査台116が有する陥没部分(装置溝)に微生物採取用フィルタ2を含む部位と同様に組み込むことができる形状とすることが望ましい。また、検査台116に、正常状態確認検査用検体151の基材152がその上に位置するように金属平板を設け、基材152が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台116上で基材152が凹凸なく平滑に保持されるようにして、装置の正常状態の確認をより確実なものにしてもよい。
Incidentally, although not have particular limitation on the shape of the normal state checking test sample of microorganisms metering device, for example, a recessed portion (device groove) having the inspection table 116 in a microorganism weighing apparatus shown in FIG. 3 It is desirable to have a shape that can be incorporated in the same manner as the part including the
本発明は、微生物計量方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。 The present invention has industrial applicability in that it can provide a microbial weighing method .
A、D 微生物採取キット
B、E 微生物採取チップ
C、F 吸引ろ過手段
1 異物除去用フィルタ
2、12 微生物採取用フィルタ
3、13 液状検体注入容器
4 台座
5 台座保持部材
6、16 中空針
7、17 陰圧管
8、18 ゴム栓
51 綿棒
52 蓋
53 生理食塩水
151 微生物計量装置の正常状態確認検査用検体
152 特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材(樹脂フィルム)
153 支持枠
154 特定波長の励起光によって発光する発光体
155 傾き高さ確認マーク
A, D Microorganism collection kit B, E Microorganism collection chip C, F Suction filtration means 1 Foreign
153
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