JP4114958B2 - Nucleic acid hybrid detection method and probe used therefor - Google Patents

Description

上記一般式［Ｉ］において、
【００２６】
【化６】

は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅである。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げることができる。
【００２７】
Ｒ¹ 及びＲ² は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００２８】
Ｒ³ は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ¹ −、−Ｌ² −Ｌ³ −または−Ｌ⁴ −Ｌ⁵ −Ｌ⁶ −であり、Ｌ¹ 〜Ｌ⁶ はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ⁴ −（Ｒ⁴ はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００２９】
−Ｌ−としては、下記一般式 [II] 、[III] 、[IV]、 [Ｖ] または[VI]で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００３０】
【化７】

（上記一般式[II]中、Ｚは水素原子または置換もしくは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙げることができる。
【００３１】
【化８】

（上記一般式[III] 中、ｎは０、１または２であり、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３２】
【化９】

（上記一般式[IV]中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３３】
【化１０】

【００３４】
【化１１】

上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示したものを挙げることができる。
【００３５】
一般式［Ｉ］のＲ³ におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ⁵ （Ｒ⁵ は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ⁵ の複素環としては、
【００３６】
【化１２】

（Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子または窒素原子を、Ｙ^- はアニオンを表わす）等から誘導された基を挙げることができ、その置換基としては、例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げることができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例えば
【００３７】
【化１３】

等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げることができる。また、置換もしくは未置換芳香環としてはアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基等を挙げることができる。
【００３８】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００３９】
Ｙ^- はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ₄ ^-、過塩素酸イオン、ＨＯ₃ ＳＣＨ₂ ＣＯＯ^- 、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００４０】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。
【００４１】
標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬の一方または両方を一般式［Ｉ］の化合物から選択して利用することができる。核酸の検出においては、一般式［Ｉ］の化合物として、インターカレーターとして核酸の二重らせん構造に挿入されるものが好ましい。
【００４２】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ³ で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及び６位のいずれかがＲ³ で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ³ で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００４３】
電荷移動による変化を検出する場合においては、例えば、一般式［Ｉ］の化合物の中で電子供与性基を有するものが電子供与体として利用できる。そのような化合物としては、ピリリウム環またはピリリウム類似環の置換基を構成するアリール基として、低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等で置換されたアリール基を有するもの等を挙げることができ、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。この置換アリール基は、ピリリウム環あるいはピリリウム類似環に直接置換されていてもよいし、例えば低級アルキル基を置換して、低級アルアルキル基を構成するものでもよい。この電子供与体として利用できる化合物の一例を、後述の表１に示す。これらの化合物の中では、特に２−メチル−４、６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩、または２−メチル−４、６−ビス−（４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム塩を好ましいものとして挙げることができる。
【００４４】
表１の化合物に対して電子受容体となり得る化合物としては、例えば後述の表２に示す化合物を挙げることができる。
【００４５】
しかしながら、表１の化合物が電子供与体で、表２の化合物が電子受容体と規定されるものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれの酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、例えば、表１の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方を、あるいは表２の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方が選ばれることも十分に有り得る。更に、表１の化合物の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを、表２の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを設定することも可能である。
【００４６】
更に、電子供与体と電子受容体のセットを他の試薬系から選定し、メディエーター、センシタイザーとしてピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物を用いることも可能である。
【００４７】
エネルギー移動の場合には、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことが最も重要である。両者が二本鎖核酸に挿入される結果、エネルギー供与体とエネルギー受容体が近接することがエネルギー移動を引き起こすと考えられる。したがって、核酸との相互作用様式により供与体と受容体のセットの目安をつけることはできない。しかし、電子供与性基を持つピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物（表１に記載）は二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるので、エネルギー供与体として有利であると推定される。それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。また、エネルギー移動の場合も電荷移動の場合と同様、エネルギー供与体とエネルギー受容体の両方をピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物から選んでもよいし、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物とピリリウム化合物以外の試薬物質のセットを選ぶこともできる。
【００４８】
溶液中のハイブリダイゼーション反応の場合には、核酸がある長さで二本鎖を形成すれば、二重らせん構造をとることが期待される。本発明は、ハイブリッド体の有する二重らせん構造を利用して検出可能な変化を起し得る試薬物質を用い、該試薬物質の化学的変化を測定することで二重らせん構造の形成を検出する方法で、試薬物質の少なくともひとつにピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用い、且つ該試薬物質の少なくともひとつがプローブに結合されているような方法である。
【００４９】
ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物は
（ａ）二重らせん構造自体と反応（相互作用）して変化を起すもの、
（ｂ）二重らせん構造を介して相互作用する２種以上の試薬物質のうちの少なくともひとつであって、該相互作用に基づく変化を検出可能なもの
などが利用できる。
【００５０】
（ａ）の試薬物質としてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用いる場合は、プローブに該ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を結合し、該プローブと試料溶液とを反応させ、試料中に標的核酸が含まれている場合に形成するプローブと標的核酸とのハイブリッド体の有する二重らせん構造を、プローブに結合したピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物、あるいは核酸の構成成分の変化によって検出する。ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物と二重らせん構造との反応による変化の検出は、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の変化自体が測定可能である場合には、この変化を測定することで行い、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の変化が検出可能な別の変化を誘導するものであれば、この別の変化を測定することで行う。さらに核酸構成成分の変化を検出する場合には、核酸をヌクレオシドに分解し、直接ＨＰＬＣで分析したり、変化したヌクレオシドに対する抗体を作製し、該抗体等で検出することもできる。
【００５１】
二重らせん構造と相互作用するピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物としては、例えば、二重らせん構造を構成している核酸等の物質と反応して、それ自身が、あるいは核酸の構成成分側が検出可能な化学変化や構造的変異を起こすものや、これらの変化を、反応系に加えた第３の物質との反応により検出可能な変化を誘導して検出する方法が利用できる。
【００５２】
この相互作用としては、例えば、二重らせん構造をとる核酸の構成成分とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物との間の電荷移動などが利用できる。この場合、プローブに結合したピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物は、核酸塩基対に対し電子供与体または電子受容体となり得る物質が利用される。この相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後におけるピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物、核酸の構成成分、または、これらの物質と相互作用しうる第３の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００５３】
この電荷移動に基づく相互作用としては、後述の（ｂ）の試薬物質の場合と同様に、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられ、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介した電荷移動や、二重らせん構造への変化に伴うピリリウム化合物或いはピリリウム類似化合物、及び核酸の構成成分である電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく電荷移動が利用できる。
【００５４】
なお、二重らせん構造とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物での電荷移動が起こりにくい場合には、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーとして仂く物質を介在させてもよい。また、ピリリウム化合物以外のものをプローブに試薬物質として結合し、メディエーターあるいはセンシタイザーとしてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を利用することも可能である。
【００５５】
本発明においてはピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造と反応できる位置に配置されて、これらの相互作用が生じる必要がある。ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造と反応可能な位置に配置される方式としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込まれる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置される場合等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であるプローブと標的核酸とによって形成されたハイブリッド体の二重らせん構造に特異的に配置されることが本発明を効果的にするものである。
【００５６】
この場合のピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物としてインターカレーターを用いることは、二重らせん構造との反応をより安定なものとすることができる点でより好ましい。
【００５７】
これらの中では、後述の（ｂ）の場合と同様に、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。
【００５８】
二重らせん構造とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の相互作用の変化を検出する方法として、電子供与体の変化を検出する場合と電子受容体の変化を検出する方法がある。電子受容体の変化を検出する方法は、その検出手段に応じていくつかの種類に分類できる。
【００５９】
例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或いは、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、ＥＰＲにおけるスピン解消法も有効な検出手段である。更に、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起こし検出することも可能である。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。
【００６０】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体の変化で相互作用を検出しても良い。そして、基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利用できる。
【００６１】
ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造に対する電子供与体である場合は、これが光によって活性化されて電子を放出し電荷移動が開始される場合のほか、第三の物質として、電子供与体である試薬物質を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。
【００６２】
さらに、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造に対する電子受容体である場合は、これを活性化して、それに誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、何らかの開始剤であってもよい。
【００６３】
また、先に述べたように、第三の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーとして仂く物質が介在しても良い。また、試薬物質としてピリリウム化合物以外のものを用いる場合には、メディエーターあるいはセンシタイザーとしてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を利用することも可能である。
【００６４】
（ａ）のプローブに結合するピリリウムまたはピリリウム類似化合物としては、核酸の酸化還元電位に近い酸化還元電位を持つような化合物が利用できる。具体的には、電子供与体としては、表１に示すような電子供与性基を有する化合物、電子受容体としては、例えば、表２に挙げるような化合物が利用できる。しかし、このことは、表１に示す化合物を電子供与体、表２に示す化合物を電子受容体と規定するものではない。核酸の酸化還元電位との相対的な関係で決まるものである。したがって、表１に示す化合物の中から、電子供与体と電子受容体のセットを、表２の化合物の中から電子供与体と電子受容体のセットを選ぶことも十分可能である。このような化合物のなかで、特に、電子供与体としては、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイド、２，６−ジフェニル−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニルピリリウム アイオダイド、電子受容体としては、２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム アイオダイド、２，４，６−トリフェニルピリリウム アイオダイド、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム アイオダイド、及び、それらのチオピリリウム化合物を挙げることができる。また、電子供与体と電子受容体のセットをピリリウム化合物、及び、ピリリウム類似化合物と他の試薬物質との組み合わせとして選ぶこともできる。
【００６５】
次に、（ｂ）の試薬物質を用いる方法について説明する。この（ｂ）の試薬物質としてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用いる方法は、一本鎖から二本鎖、つまり、二重らせんへの構造変化にともない、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を含む二種以上の試薬物質間の電荷移動により起る変化を測定することでハイブリッド体を検出するものである。電荷移動による検出には、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を含む二種以上の試薬物質が必要で、その中には、少なくとも電子供与体と電子受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後における電子供与体、電子受容体、または、これらの物質と相互作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００６６】
電子供与体と電子受容体の相互作用として、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者には、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重らせん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄ）では、核酸を構成する塩基、リン酸部分、或いは、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられる。いずれの場合もそれらの相互作用が、二重らせんを形成したことに由来するものであればその形態はなんら限定されない。
【００６７】
核酸塩基間のスタッキングを介する場合とは、二重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子供与体と電子受容体の距離が本来相互作用できないほど離れている時、電子供与体から放出された電子が、核酸塩基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々隣接する核酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体にまで電子を到達させるというものである。また、逆に、電子受容体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それが連鎖的に行われて最終的に電子供与体から電子が奪い取られるという機能も成り立つ。つまり、核酸塩基対が電荷移動におけるメディエーターとして機能している。
【００６８】
これに対し、電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく場合とは、二重らせん構造の形成によって電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用が可能な程度に近くなる場合のことを言う。例えば、電子供与体と電子受容体の両方が存在しても、溶液中でこれらの化合物の距離が十分に離れているような一本鎖の状態のときにはこれらが相互作用を起さないで、標的核酸とハイブリダイズして二重らせん構造が形成されてはじめて電子供与体と電子受容体が近接した場合に、これらの相互作用が生じるように設定すれば、二重らせん構造の形成をこれらの相互作用が生じたかどうかによって検出できる。
【００６９】
なお、二重らせん構造を介した電子供与体と電子受容体の間での電荷移動が起こりにくい場合には、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いはセンシタイザーと称される物質を介在させてもよい。
【００７０】
上記のように、本発明においては電子供与体と電子受容体を二重らせん構造と反応できる位置に配置させ、相互作用が生じさせる必要がある。試薬物質が二重らせん構造と反応可能な位置に配置させる方法としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込ませる場合、二重らせん構造の溝に埋め込ませる場合、または、二重らせん構造に寄り添う形で配置させる等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であるプローブと標的核酸とによって形成されたハイブリッド体の二重らせん構造に特異的に配置させることが本発明にとって本質的に必要なことである。
【００７１】
これらの中で、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。つまり、インターカレーターは、一般には、電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じような距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例えば、電子供与体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由して、一直線に電子受容体に向かって流れ得る。或いは、この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造を挟んだ反対側に電子受容体を配置すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基対から電子を引き抜き、この電子の引き抜きが他の核酸塩基対間に次々と生じて最終的に電子供与体から電子を引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。これらの点を考慮すると、スタッキングを介する電荷移動の場合には、電子供与体、電子受容体のうち、少なくともひとつがインターカレーターであることが好ましく、両者が共にインターカレーターである場合には、さらに電荷移動効率を上げることが可能であるのでより好ましい。また、インターカレーターは二重らせん構造を安定化させ、その融解温度を上昇させることが知られており、電子供与体や電子受容体がインターカレーターであることは、プローブと標的核酸間のハイブリッド体を安定化させるという点でも有利である。
【００７２】
二重らせん形成に伴う二種以上の試薬物質の相互作用の変化を検出する方法として、電子受容体の変化を検出する方法がある。この方法は、その検出手段に応じていくつかの種類に分類できる。電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或いは、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起こし検出することも可能である。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。
【００７３】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体の変化を検出して、相互作用を検出しても良い。そして、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適用できる。蛍光物質を電子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利用できる。
【００７４】
本発明では、電子供与体が光等によって活性化されて電子を放出し電荷移動が開始する場合のほか、第三の物質として、電子供与体を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。
【００７５】
さらに、電子受容体の方を活性化して、それに誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、何らかの開始剤があってもよい。
【００７６】
また、先に述べたように、電子供与体、電子受容体の他に、第三の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーと称される物質が介在しても良い。そして、これらの物質が二重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合していない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良い。
【００７７】
上述してきたような本発明の（ｂ）の方法で用いる試薬物質として、電子供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物としては表１に挙げるような化合物、電子受容体としては表２に示した化合物を挙げることができる。しかし、このことは、表１に示す化合物を電子供与体、表２に示す化合物を電子受容体と規定するものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれ酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、表１に示す化合物の中から、電子供与体と電子受容体のセットを、表２の化合物の中から電子供与体と電子受容体のセットを選ぶことも十分可能である。このような化合物の中で、特に、電子供与体としては、２，４-ビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニル）-６-メチルピリリウム アイオダイド、２，６-ジフェニル-４-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニルピリリウム アイオダイド、電子受容体としては、２，６-ジフェニル-４-メチルピリリウム アイオダイド、２，４，６-トリフェニルピリリウム アイオダイド、２，６-ビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニル）-４-フェニルピリリウム アイオダイド、及び、それらのチオピリリウム化合物を挙げることができる。
【００７８】
ピリリウム以外の試薬物質としては、スピンラベル化剤として、例えば、４，４-Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ-Ｎ-ｏｘｙｌ（ＤＤＸＸＬ）または、その誘導体、２，２，５，５-Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ-Ｎ-ｏｘｙｌ（ＰＲＯＸＬ）または、その誘導体を挙げることができる。
【００７９】
蛍光性インターカレーターとしてはそれぞれの誘導体を含み、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポリフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）等を挙げることができる。
【００８０】
また、他の一般的な蛍光色素としてはそれぞれの誘導体を含み、シアニン、アズレン、三核色素、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン、リボフラビン等を挙げることができる。
【００８１】
電子受容体と電子供与体の関係は、両者の酸化還元電位の関係で決まるものである。従って、本発明においては、電子供与体または電子受容体として一般に定義された物質が、その定義のとおりに用いられるのではなく、２種以上の試薬物質の個々の組合せにおいて、電子供与体及び電子受容体となり得る物質を適宣選択して用いる。
【００８２】
また、ピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物を電子供与体、あるいは、電子受容体として用いるのではなく、センシタイザーとして利用することも可能である。
【００８３】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合には二種以上の試薬物質には、少なくともエネルギー供与体とエネルギー受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリット体形成前後におけるエネルギー受容体、エネルギー供与体、または、これらの物質と相互作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００８４】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合にはエネルギー供与体の蛍光強度の減少、エネルギー受容体の蛍光強度の増大によりハイブリッド体を検出することができる。このような場合には二本鎖形成に伴って、プローブ上のエネルギー供与体とエネルギー受容体の距離が一本鎖の場合より距離が短くなり、相互作用が可能になってエネルギー移動が起こると考えられる。
【００８５】
エネルギー移動開始剤としては光が主に利用される。
【００８６】
エネルギー移動に用いられる試薬物質としては、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことを目安に選択することができる。ピリリウム化合物の中で、電子供与性基を持つピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物（表１に記載）は二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるので、エネルギー供与体として有利であると推定される。そして、それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。このようなエネルギー供与体、あるいは、エネルギー受容体となるような試薬物質の例を挙げると、蛍光性インターカレーターとしてはそれぞれの誘導体を含み、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポルフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）等を挙げることができる。
【００８７】
また、他の一般的な蛍光色素としてはそれぞれの誘導体を含み、シアニン、アズレン、三核色素、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン、リボフラビン等を挙げることができる。
【００８８】
これら電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体を本発明で用いる場合、電子供与体及び電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の、これらの一方または両方が反応系で何も結合していないフリーな状態で存在していると、二重らせん構造の有無に関係なく、両者間での相互作用が起こってしまい、バックグランドが上昇してＳ／Ｎ比が悪くなることがあるので、これらの一方または両方をプローブに結合させて用いるのが正確な検出をする上で好ましい。電子供与体や電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のプローブへの結合は、必要に応じて、例えば、（ＣＨ₂ ）_n のようなリンカーを介して行い、その際これらの相互作用が最も効率よくなされるようにこれらの位置関係等を配慮する。
【００８９】
最も望ましい形態としては、電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の両方がプローブに結合している場合であり、その場合には、相互作用する試薬物質間の位置関係が明瞭となるため、その相互作用の制御をプローブでのこれらの位置関係によって行うことができるので有利である。この場合、電子供与体を電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のプローブ上での距離は、用いる電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、近接効果を利用する場合には、電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の距離は、ハイブリッド体である二重らせん構造形成時に２０〜１２０オングストロームであることが好ましく、５０〜８０オングストロームであることがより好ましい。また、二重らせん構造を介した電荷移動を行う場合には、これらの距離は、それぞれの試薬物質が引き起こすＤＮＡの巻き戻し等の構造変化を考慮することが重要であり、その範囲は２０〜１２０オングストロームであることが好ましい。しかし、この距離は電子供与体と電子受容体が共にインターカレーターの場合、及び、どちらか一方あるいは共に主溝や副溝に入り込む場合とでは異なり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。ただし、短すぎる時には、核酸との相互作用を介さずに、電子供与体と電子受容体間での電荷移動が起こるため、より好ましくは、５０〜８０オングストロームであるといえる。
【００９０】
尚、プローブの長さは、標的核酸との良好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した二重らせん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選択される。電子供与体と電子受容体或いはエネルギ供与体、エネルギー受容体の両方をプローブに結合させる場合でこれらが近接していると二重らせん構造の存在しない場合でも相互作用を起こし得るものである場合には、両者の距離を考慮してプローブ長は決定されるが、その長さは、例えば、８塩基長以上、好ましくは１２塩基長以上とされる。
【００９１】
しかしながら、二重らせん構造の安定化には、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列ではより安定な二重らせん構造が形成される。また、ＫＣｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。また、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与する。従って、これらの安定化因子を適宜利用することによって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能である。
【００９２】
また、電子供与体、あるいは、電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の性質もプローブ選定上考慮しなければならない因子である。これらの試薬物質がインターカレーターである場合、二重らせんのどの配列にも同じ確率では入り込むのではなく、Ｇ−Ｃ塩基対を好むものと、Ａ−Ｔ塩基対を好むもの等それぞれの試薬物質によりその性質は異なる。したがって、プローブの配列の選定にはプローブと標的核酸とで構成される二重らせんの安定性のほかに、このような試薬物質の性質を加味することが重要である。
【００９３】
電子供与体と電子受容体との相互作用に基づく変化は、不可逆的なものであることが望ましい。すなわち、検出に供せられる電子供与体、或いは、電子受容体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積して検出することも可能であり、その場合感度の点で有利である。
【００９４】
電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体を本発明で用いる形態としては、一方のみプローブに結合している場合には、
ａ）プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時にもう一方も反応系に存在させておき、形成後相互作用を起こさせても、
ｂ）プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成後にもう一方を反応系に添加して、相互作用を起こさせてもよい。
【００９５】
両方ともプローブに結合している場合には、プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる際に、すでに両方とも反応系中に存在しており、二重らせん構造の形成後、相互作用を起こさせることとなる。
【００９６】
プローブに電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のセットであるピリリウム化合物、あるいは、ピリリウム類似化合物を含む試薬物質を結合させる形態として、本発明では、
ａ）プローブの一方に電子供与体或いはエネルギー供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を結合させ、二重らせんと特異的に相互作用するような電子受容体、エネルギー受容体を遊離の状態で加えても、
ｂ）プローブの一方に電子受容体或いはエネルギー受容体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を結合させておき、二重らせんを特異的に相互作用するような電子供与体、エネルギー供与体を遊離の状態で加えても、
ｃ）プローブの一方に電子供与体又はエネルギー供与体である試薬物質を結合させておき、二重らせん構造特異的に相互作用するような電子受容体又はエネルギー受容体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を遊離の状態で加えても、
ｄ）プローブの一方に電子受容体、エネルギー受容体である試薬物質を結合させておき、二重らせん構造特異的に相互作用するような電子供与体、エネルギー供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を遊離の状態で加えても、
ｅ）電子供与体と電子受容体、エネルギー供与体とエネルギー受容体のセットである２種類のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の両方をプローブに結合させても、
ｆ）電子供与体と電子受容体、エネルギー供与体とエネルギー受容体のセットであるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物と他の試薬物質の組みの両方をプローブに結合させてもよい。
【００９７】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
［１］２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート［化合物ａ］の合成
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更に７０％過塩素酸水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）から再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート［化合物ａ］を得た。
【００９８】
［２］スピンラベル化剤であるＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）を結合させた２０量体オリゴヌクレオチドプローブの作製
（１）４−アミノヘキシルアミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（４−アミノヘキシルアミノ−ＴＥＭＰＯ）の合成
４−オキソ−ＴＥＭＰＯの０．５ｍｍｏｌｅとヘキサメチレンジアミン二塩酸塩５ｍｍｏｌｅをメタノール３０ｍｌに溶解し、これにシアノ化ホウ素ナトリウム０．４ｍｍｏｌｅ、モレキュラーシーブ３Ａを加えて室温下２４時間攪拌して反応させた。次に、反応溶液をグラスフィルターで濾過しモレキュラーシーブを除去し、続いて濾液から溶媒を減圧下で除去した。次に得られた残留物に１Ｎ塩酸３０ｍｌを加えて溶解した後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で洗浄後、減圧下でクロロホルムを減圧下で留去した。得られた残留物に水を加え不溶物を濾過して得た濾液を再度減圧下で溶媒を留去し赤色の油状物を得た。
【００９９】
（２）オリゴヌクレオチドの合成
標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。５′未満ジメトキシトリチル基は自動合成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりである。
【０１００】
５′−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′
（３）スピンラベルオリゴヌクレオチドプローブの合成
上記（２）の工程で、合成したオリゴヌクレオチド（１μｍｏｌｅ）をＣＰＧサポートに結合させたままガスタイトシリンジに移した。以下の反応はシリンジ内で行なった。ＣＰＧサポートにカルボニル−Ｎ，Ｎ′−ジイミダゾール（ＣＤＩ）５０ｍｇを溶解したジオキサン１ｍｌを加え室温下１時間放置した。ジオキサンで洗浄後減圧乾燥し、続いて４−アミノヘキシルアミノ−ＴＥＭＰＯのＤＭＳＯ溶液（０．２Ｍ ０．４ｍｌ）を加え５５℃で２４時間放置した。ＤＭＳＯ、ジオキサン、メタノールの順で洗浄し減圧乾燥した。
【０１０１】
常法に従って濃アンモニア水によるスピンラベルオリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護を行ないＲＰＬＣによって精製した。
【０１０２】
［３］ＴＥＭＰＯプローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［２］で作製されたＴＥＭＰＯが導入されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。次に、この反応液に化合物ａを最終濃度５μＭになるように加え、以下に示すＥＳＲスペクトルの測定に供した。また、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡを用いずに上記と同様の操作を行い、ＥＳＲスペクトルの測定用のサンプル（プローブ単独）を得た。
【０１０３】
［４］ＥＳＲスペクトルの測定
ＥＳＲ測定は一つのサンプルにつき２０分間隔でスイープし、それを１００分間にわたって続けた。そして、強度比、および、線幅の時間変化を追った。ＥＳＲは日本電子社製、測定には、人工石英の扁平セルを用いた。
【０１０４】
ＥＳＲおよび光照射装置は以下の設定で行なった。
【０１０５】

光照射装置
モノクロメーター ５８０ｎｍ
Ｐｏｗｅｒ ｓｕｐｐｌｙ ８８．５Ｖ−８９Ｖ／２２Ａ
図１にＥＳＲシグナル強度比の経時変化、線幅の経時変化を示す。図１からわかるように、プローブ単独の場合には、光照射しても強度比及び線幅に変化は見られなかった。また、化合物ａ／プローブ／Ｍ１３ｍｐ１８の場合にも、光照射しなかった場合には、強度比、線幅に変化は見られなかった。
【０１０６】
これに対し、化合物ａ／プローブ／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに化合物ａとＤＮＡとが結合した時の吸収極大値である５８０ｎｍの光を照射した場合、時間と共にＥＳＲの強度比は減少した。また、線幅に変化が観測されなかったことから、ＥＳＲでの強度変化が化学変化によるものではないといえる。従って、プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡによって形成された二重らせん構造を介して化合物ａからプローブに結合させたＴＥＭＰＯへ電荷が移動した結果、ＴＥＭＰＯのスピンが解消されたことが確認された。つまり、Ｂ／Ｆ分離なしに、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体が検出できたことになる。
実施例２ ＨＰＬＣによる核酸塩基の変化の検出
［１］３′末端に化合物ａが結合したプローブの作製
（１）化合物ａのエステル化
化合物ａ４．３ｇ、カルボキシベンツアルデヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈殿を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、２−（４−カルボキシスチリル）−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート、［化合物ｂ］を得た。
【０１０７】
化合物ｂ１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌する。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈殿を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥する。得られた活性エステル体［化合物ｃ］をそのまま核酸との反応に用いた。
【０１０８】
（２）オリゴヌクレオチドの合成
実施例１と同様の配列を持つオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成機で合成した。オリゴヌクレオチドにはその有効な配列のほかに、後に、電子供与体、あるいは、電子受容体を結合させるためのリンカーとして５′末端にチオールリンカー、３′末端にアミノリンカーを結合させた。リンカーの結合にはそれぞれグレンリサーチ社の試薬５′チオール−モディファイヤー Ｃ６、及び、アミノ−モディファイアー ｄＴを用いた。ＣＰＧサポートからの切り出し、脱保護、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製は同社指定の方法により行なった。
【０１０９】
（３）化合物ｃとオリゴヌクレオチドとの反応
（２）で合成したオリゴヌクレオチド（１０Ｄ₂₆₀ ）を含む０．８ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ＝７．０）に化合物ｃ１ｍｇを含むアセトニトリル溶液０．２ｍｌを加え４０℃で２４時間放置した。ファルマシア社製ＮＡＰカラムで粗精製の後ＨＰＬＣで精製し、３′末端に化合物ａが結合したプローブ［化合物ｄ］を得た。
【０１１０】
［２］ハイブリッド体の吸収スペクトル
次に、この反応液の吸収スペクトルを測定した。３′末端標識プローブ［化合物ｄ］のみの吸収極大は、化合物ａの吸収極大である５４０ｎｍを示したが、プローブ・Ｍ１３ｍｐ１８のハイブリッド体は、吸収極大が５８０ｎｍにシフトした。このことは、化合物ａがインターカレーターであることを示すものである。
【０１１１】
［３］ハイブリッド体への光照射
そこで、励起波長として５８０ｎｍの可視光を、キセノンランプにバンドパスフィルターを組み合わせて照射した。照射時間は５分から５分間隔で２０分まで変化させた。
【０１１２】
［４］ＨＰＬＣによるヌクレオシド分析
光照射後のサンプルにＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅIII （宝酒造社製）、及び、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を加えて３７℃にて反応させ、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体の二本鎖部分を分解してヌクレオシドにした。
【０１１３】
次に、ヌクレオシドをＨＰＬＣにて分離した。逆相系のカラム（Ｗａｃｏｓｉｌ 和光純薬社製）を使用し、１０ｍＭトリエチルアミンアセテート溶液を含むメタノールのグラジエント（１０−４０％）にて溶出した。
【０１１４】
保持時間１０分以内にデオキシヌクレオシド４種（ｄＡ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＴ）はすべて溶出された。そのほかに、１３分に２５０ｎｍ、１９分に２８０ｎｍの吸収極大を持つ未知のピークが検出された。更に、その量は１０分までは照射量に比例して増大し、その後は一定となった。
【０１１５】
対照実験として、未標識プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体の溶液についても同様の実験を行った。照射するキセノンランプの照射時間を５分から２０分まで変化させて測定したが、これらの２つのピークは観測されなかった。未標識プローブと標識プローブとのＨＰＬＣのピーク強度の比較から、この未知のヌクレオシドはＧ−Ｃ塩基対が変化したものと考えられた。
【０１１６】
また標識プローブを用いても、ハイブリッド体に光照射を行わなかったサンプルではやはりこの２つのピークは見られなかった。
実施例３ 標識抗体との電荷移動によるハイブリッド体の検出
［１］標識抗体の作製
（１）抗体の作製
実施例２で得られた未知化合物２種を抗原として、常法に従いマウスを用いて抗体を作製した。
【０１１７】
（２）４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｅ］を合成した。
【０１１８】
（３）抗体の標識
化合物ｅ４．３ｇ、カルボキシベンツアルデヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈殿を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、４−（４−カルボキシスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｆ］を得た。
【０１１９】
化合物ｆ１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌する。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈殿を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥する。得られた活性エステル体［化合物ｇ］を抗体のアミノ基と反応させて、標識抗体を作製した。
【０１２０】
［２］ハイブリッド体の検出
実施例２で作製した３′末端に化合物ａが結合したプローブ［化合物ｄ］とＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体に５８０ｎｍの可視光を１０分間照射した。このハイブリッド体に［１］で作製した標識抗体を反応させた。
【０１２１】
このサンプルに再び、５８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、標識抗体を反応させる前に観測された６４０ｎｍの蛍光は消光し、かわりに４５０ｎｍに新たに、蛍光が現れた。このことは、ハイブリッド体に挿入された化合物ａと標識抗体上の化合物ｅの間で、電荷移動が起こったものと考えられる。
実施例４ ２種のピリリウム色素を結合したプローブによるＤＮＡハイブリッド体の検出
［１］３′末端に化合物ａ、５′末端に化合物ｅが結合したプローブの作製
（１）化合物ｅのスチリル化
上記化合物ｂの合成法と同じ方法により化合物ｅと、４−アミノベンツアルデヒドから、４−（４−アミノスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートを合成した［化合物ｈ］。
【０１２２】
無水マレイン酸１９６ｍｇを１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、化合物ｈ４５０ｍｇのクロロホルム溶液２ｍｌを加えた後１時間室温化で攪拌した。混合液を１５℃まで冷却し析出した沈殿を集めた。このマレイン酸付加物中間体［化合物ｉ］をそのまま次の反応に用いた。
【０１２３】
無水酢酸１０ｍｌに酢酸ナトリウム（無水）１ｇを加え溶解し、続いて化合物ｉ２５０ｍｇを加え激しく攪拌して溶解させた後、９０℃で３０分間攪拌を続けた。混合溶液を室温まで冷却し２０ｍｌ氷水に注ぎ、析出物を集め水で３回洗った後乾燥した。エタノールから再結晶して、４−（４−マレイミジルスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｊ］を得た。
【０１２４】
（２）化合物ｈのオリゴヌクレオチドの５′末端への導入反応
３′末端に化合物ａが結合したオリゴヌクレオチド［化合物ｄ］を含んだ０．８ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ＝７．０）に化合物ｊ１ｍｇのアセトニトリル溶液０．２ｍｌを加え４０℃で２４時間放置した。ファルマシア社製ＮＡＰカラムで粗精製の後ＨＰＬＣで精製した。これにより両末端ピリリウム色素標識オリゴヌクレオチドプローブ［化合物ｋ］を得た。
【０１２５】
［３］５′末端に化合物ｊが結合したプローブの作製（対照実験用）
両末端標識プローブ作製法と同様にして、３′末端に化合物ａが結合していないオリゴヌクレオチドを用いて、５′末端だけが化合物ｅで標識されたプローブを作製した［化合物ｌ］。
【０１２６】
［４］両末端標識プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［２］で作製された両末端に電子供与体と電子受容体が結合されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。
【０１２７】
［５］蛍光スペクトルの測定
次に、この反応液に化合物ａがＤＮＡに結合した時の吸収極大値である５８０ｎｍの可視光を、キセノンランプにバンドパスフィルターを組み合わせて照射した。蛍光の測定には大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて行った。
【０１２８】
化合物ｌとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体は、いずれの領域にも蛍光を持たなかった。それに対し、化合物ｋとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体は化合物ａに由来する６４０ｎｍの蛍光が消失し、代わりに４５０ｎｍに蛍光が出現した。このことは、化合物ａから化合物ｅに電荷が移動したものと考えられる。
【０１２９】
このスペクトルを図２に示す。
実施例５ １種のピリリウム色素を結合したプローブによるＤＮＡハイブリッド体の検出
実施例１と同様な方法により３′末端に化合物ａが結合したプローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体を作製した。これに、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム アイオダイド［化合物ｍ］を最終濃度が５μＭとなるように加えた。
【０１３０】
あらかじめ、化合物ｍとＤＮＡとの相互作用を調べた。化合物ｍは遊離の状態とＤＮＡ溶液中では、化合物ａと同様、吸収スペクトルの長波長変化を示し、インターカレーターと思われるが、その蛍光はＤＮＡ溶液中でも小さい。
【０１３１】
プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体に化合物ａの励起波長である５８０ｎｍの光を照射したところ、化合物ａがＤＮＡと相互作用して発する６４０ｎｍの蛍光は消光し、７２０ｎｍにあらたに蛍光が出現した。これは、化合物ａから化合物ｍへのエネルギー移動がおこったためと考えられる。
【０１３２】
【表１】

【０１３３】
【表２】

【０１３４】
【表３】

【０１３５】
【表４】

【０１３６】
【表５】

【０１３７】
【表６】

【０１３８】
【表７】

【０１３９】
【表８】

【０１４０】
【表９】

【０１４１】
【表１０】

【０１４２】
【表１１】

【０１４３】
【表１２】

【０１４４】
【表１３】

【０１４５】
【表１４】

【０１４６】
【表１５】

【０１４７】
【表１６】

【０１４８】
【表１７】

【０１４９】
【表１８】

【０１５０】
【表１９】

【０１５１】
【表２０】

【０１５２】
【表２１】

【０１５３】
【表２２】

【０１５４】
【表２３】

【０１５５】
【表２４】

【０１５６】
【表２５】

【０１５７】
【表２６】

【０１５８】
【表２７】

【０１５９】
【表２８】

【０１６０】
【表２９】

【０１６１】
【表３０】

【０１６２】
【表３１】

【０１６３】
【表３２】

【０１６４】
【表３３】

【０１６５】
【表３４】

【０１６６】
【表３５】

【０１６７】
【表３６】

【０１６８】
【表３７】

【０１６９】
【発明の効果】
本発明の標的核酸の検出方法は、Ｂ／Ｆ分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で不可欠であった過剰なプローブの除去、非特異吸着を除くための煩雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が不要となった。
【０１７０】
更に、正確なハイブリッド体でのみ信号変化が観測されるように試薬物質を選択することで、反応系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な二重らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出することが可能となる。
【０１７１】
また電子供与体、エネルギー供与体として用いるピリリウム或いはピリリウム類似化合物は、プローブに結合された一本鎖状態、或いは、遊離状態で用いる場合に、無蛍光であるという特徴があるため、従来の検出試薬に比べ高感度な検出が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の［４］におけるＥＳＲスペクトルを示す図
【図２】実施例４の［５］における蛍光スペクトルを示す図[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for detecting and identifying a desired base sequence of nucleic acids (DNA or RNA) such as viruses, microorganisms, animals and plants, and humans, or detecting the presence or absence of mutations in various base sequences.
[0002]
[Prior art]
Numerous various mutated genes have been found by the development of nucleic acid analysis technology, and various genetic diseases based on gene mutations are being elucidated. Among them, there are those in which bases in genes are partially deleted and those in which bases have been point-mutated, thereby causing mutations in proteins and causing various symptoms. ing. At present, these genetic diseases are mainly discovered by enzyme assay and immunological methods using antibodies after symptoms appear. It has been pointed out that it is important to detect the presence or absence of mutations at an early stage on genes before they appear.
[0003]
DNA diagnosis is not necessarily used for human genes, but can also be used for identification of infected bacteria.
[0004]
Conventionally, a method for identifying a bacterial species based on similarity based on the morphological and biochemical properties of the isolated bacteria has been employed. In this method, there is a problem that, in addition to the time required for culturing, the determination of properties differs depending on the test method, and the identification results differ depending on which properties are emphasized.
[0005]
Therefore, in recent years, in particular, in the field of detection and identification of causative bacteria in bacterial infections, attempts have been made to use DNA-DNA hybridization methods or DNA-RNA hybridization methods. This method extracts nucleic acid (DNA or RNA) from bacteria, focuses on a specific part of the nucleic acid derived from bacteria, and the base sequence having a high homology with the base sequence of the part is contained in the target nucleic acid sample. Is determined by the hybridization method to determine whether or not there are problematic bacteria in the sample.
[0006]
In recent years, the PCR method has also been used as a new method for detecting a specific sequence of a nucleic acid. In this method, a specific sequence in a target nucleic acid to be detected is selected, a primer necessary for amplification of this specific sequence is prepared, a PCR reaction is performed using the target nucleic acid as a template, and the presence or absence of the amplified specific sequence is detected. This makes it possible to detect the target nucleic acid. Nucleic acid detection sensitivity is improved by using the PCR method, and it is used for nucleic acid detection in various fields in place of the nucleic acid detection method using the hybridization method.
[0007]
However, when the specific sequence to be examined is clear by the PCR method, the presence or absence of the specific sequence can be examined for the first time by selecting the optimal primer for the amplification, and the primer binds to the target nucleic acid non-specifically. Or sequences that are otherwise not amplified are often created. In addition, genetic abnormalities such as defects in a certain target nucleic acid can be obtained by analyzing the length, but for abnormalities such as point mutations that do not change in length. Has the disadvantage of not knowing.
[0008]
Therefore, the hybridization method is not completely replaced by the PCR method, and a simple gene detection method by the hybridization method is still required.
[0009]
In the hybridization reaction, the probe DNA and the target DNA form a hybrid by hydrogen bonding at a portion of the complementary sequence. In a hybridization reaction, in order to form a hybrid accurately between complementary sequences, it is necessary to optimally select the reaction temperature and ionic strength. That is, if the temperature is too high, the probe cannot bind to a nucleic acid having a complementary sequence, and if it is too low, the probe binds to the nucleic acid non-specifically. In addition, for greater accuracy, lower the salt concentration of the solution or increase the temperature of the solution to remove unstable hydrogen bonds, non-specifically bound probes or mismatched probes It is important to wash away. Therefore, considerable trial and error is required to set appropriate reaction conditions and washing conditions.
[0010]
In the genetic diagnosis, the accuracy of removing a mismatch at a single base pair level is further required for the hybrid formation reaction and the setting of washing conditions.
[0011]
The hybridization reaction has been conventionally performed in a state where the target nucleic acid is immobilized on a carrier such as nitrocellulose. However, since this method is extremely complicated, development of a simple method such as hybridization in a solution has been expected. The biggest problem with conventional methods that do not fix nucleic acids is how to distinguish between probes that bind to the target nucleic acid and excess probes that do not bind (B / F separation). By the way. Furthermore, in this case as well, as in the hybridization reaction using the above-described immobilized nucleic acid, setting of appropriate reaction conditions and washing conditions for removing non-specific adsorption and mismatch of probes becomes an important issue.
[0012]
As a method for detecting a hybrid of a target nucleic acid and a probe without performing B / F separation, several detection methods using a fluorescence depolarization method have been proposed (JP-A-2-29596, (See JP-A-2-75958). In these methods, a fluorescently labeled single-stranded DNA probe is brought into contact with DNA in an analyte to form double-stranded DNA, and fluorescence polarization before and after double-stranded formation. And detecting whether the base sequence corresponding to the base sequence of the probe exists in the DNA in the sample. In this method, the fluorescent substance bound to the single-stranded probe becomes difficult to move when it becomes double-stranded, and the principle of detection is that the fluorescence anisotropy increases.
[0013]
However, in these methods, contaminants such as proteins are contained in the sample, and if they are non-specifically adsorbed to the probe DNA, the background of hybrid detection will be increased. A complicated operation of completely removing impurities is required. In addition, the pseudo-hybrid due to non-specific adsorption of probe DNA and base mismatch needs to be removed in advance as in the case of other solution systems. Furthermore, although B / F separation is not necessary, it is necessary to measure the fluorescence mutation that the probe concentration is comparable to the target DNA concentration.
[0014]
As a hybrid detection method using energy transfer, Gardullo has proposed three methods (Proc. Nat1. Acad. Sci. USA.85. 8790-8794). These use fluorescein and acridine orange as energy donors and rhodamine as energy acceptor. (I) Oligonucleotide labeled with 5 'with fluorescein and complementary with 5' labeled with rhodamine (Ii) hybridization of 5 ′ labeled oligonucleotides with fluorescein with complementary DNA, (iii) 5 ′ complementary DNA of rhodamine labeled oligonucleotides in the presence of acridine orange and Hybridization. This method is a phenomenon in which the excited state energy of a donor is transferred to a nearby acceptor when the excitation light and fluorescence of a nearby fluorescent chromophore overlap, resulting in a decrease in the lifetime of the donor, The quenching of donor fluorescence and the enhancement of acceptor fluorescence intensity are seen. Although it can be said that it is an epoch-making method in that a series of complicated operations can be omitted at a point in that it can determine the presence or absence of hybridization as a solution, it is lower in sensitivity by several orders of magnitude compared to existing hybridization, and is practical For this purpose, improvement of the fluorophore and dramatic progress of the detection system have been desired.
[0015]
Recently, there has been a report that when two kinds of dyes are mixed in a DNA double strand in a free state, charge transfer via DNA is detected between these dyes (J. Ame. Chem. Soc). 1992,1143656-3660). When an electron donor having fluorescence (ethidium bromide or acridine orange) is irradiated with light having a wavelength corresponding to each excitation wavelength, another dye (electron acceptor; N, N-dimethyl-2,7) is used. In the presence of -diazapyrenium dichloride), the fluorescence intensity decreases. Since both dyes are considered to be intercalators, electrons flow from the electron donor to the electron acceptor via the double helix of DNA. It is that. However, the degree of change is very small and it is not sensitive enough to be used for detecting hybrids. Furthermore, these dyes have fluorescence even in a free state, and it is necessary to always consider the fluorescence of the dye as a background even if a change in fluorescence intensity is detected.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
In addition to conventional hybridization methods in which target nucleic acids are immobilized, methods such as fluorescence depolarization that do not require B / F separation prevent the occurrence of non-specific adsorption and mismatch of probes, In many cases, a complicated process for removing specific adsorption or mismatch is required. In addition, the optimum conditions for these operations differ depending on the length of the probe or each base sequence, and therefore it is necessary to examine and set the conditions in each case. In particular, the position of the mismatched base on the probe is also an important factor affecting the stability of the hybrid, and depending on the position, the mismatched hybrid may not be removed. In view of this, a more complicated operation of setting hybridization reaction conditions according to individual cases is required.
[0017]
Although the detection system in a solution using charge transfer is a simple method compared to the case of immobilizing a target nucleic acid or a system that requires B / F separation, its sensitivity is very low and it can be put to practical use. Not as much as you can. Furthermore, the dye used in the conventional example has fluorescence even in a free state, and even if a change in fluorescence intensity is detected, is it an interaction between the electron donor and the electron acceptor via DNA? It is difficult to determine whether it is simply quenching by a solvent or the influence of the presence of impurities. In addition, when the electron donor and the electron acceptor exist in a free state as in the conventional example, the interaction between the two occurs regardless of the presence or absence of the double helix structure, and the background becomes There is a problem that the S / N ratio deteriorates due to a rise.
[0018]
The present invention has been made in view of the above problems in the prior art, and in order to solve the problem caused by the free dye, at least one of an electron donor and an electron acceptor is bound to a probe, and a nucleic acid is interposed. A method for detecting a target nucleic acid that eliminates unnecessary interactions, eliminates the need for B / F separation in the detection of hybrids, has a simplified process, and obtains good measurement sensitivity, and a probe used therefor It is to provide.
[0019]
Another object of the present invention is to provide a target nucleic acid detection method capable of accurately detecting only a desired hybrid even when a mismatched hybrid exists, and a probe used therefor.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
The method for detecting a nucleic acid hybrid of the present invention is made by paying attention to the fact that a pyrylium compound or a pyrylium analog compound salt causes charge transfer via a double-stranded nucleic acid, and the pyrylium compound or pyrylium analog compound, and When a target nucleic acid is present in the sample solution by binding an electron donor / electron acceptor set consisting of a reagent substance other than a pyrylium compound to at least one of the probes and adding the probe to the sample solution The double-helix structure of the hybrid of the probe and the target nucleic acid obtained in 1) is detected.
[0021]
The method of the present invention detects the formation of a double helix structure associated with the formation of a hybrid, and does not require B / F separation. Furthermore, in the present invention, by setting conditions that can detect only an accurate double helix structure, it becomes possible to detect the formation of a desired nucleic acid hybrid as it is even if non-specific adsorption or mismatch occurs, improving measurement accuracy. It is possible to make it. In addition, this invention is applied when nucleic acids form a regular double helix structure, such as DNA-DNA hybridization and DNA-RNA hybridization.
[0022]
Furthermore, by binding the reagent substance to the probe, the interaction between the reagent substances not involving nucleic acids can be eliminated, and the S / N ratio can be improved. In addition, by using a pyrylium compound or a pyrylium-like compound whose fluorescence characteristics change greatly between the free state and when bound to a nucleic acid, the fluorescence from the pyrium compound or pyrylium-like compound bound to the probe is free or bound to the probe. The background can be excluded.
[0023]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0024]
The pyrylium compound or the pyrylium-like compound used in the present invention can be represented by the following general formula [I].
[0025]
[Chemical formula 5]

In the above general formula [I],
[0026]
[Chemical 6]

Represents a heterocycle, and X is O, S, Se or Te. Examples of the heterocyclic ring include 5-membered and 6-membered rings such as a pyrylium ring or a pyrylium-like ring.
[0027]
R¹ And R² Each independently represents a hydrogen atom, halogen atom, sulfonate group, amino group, styryl group, nitro group, hydroxyl group, carboxyl group, cyano group, substituted or unsubstituted lower alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or An unsubstituted lower aralkyl group or a substituted or unsubstituted cycloalkyl group is shown.
[0028]
R^Three Is -A or -LA. L is -L¹ -, -L² -L^Three -Or -L^Four -L^Five -L⁶ -And L¹ ~ L⁶ Each independently represents — (CH═CH) —, a divalent group derived from a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted lower alkylene group, or —CH═R.^Four -(R^Four Represents a ring structure having an oxo group. Examples of the divalent group derived from a substituted or unsubstituted aryl group include a phenylene group, and may be bonded at any position of ortho, meta, and para. Examples of the lower alkylene group include a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, and examples of the substituent include a group represented by -LA. Examples of the ring structure having an oxo group include heterocycles, aromatic rings, aliphatic rings and the like having at least an oxo group.
[0029]
As -L-, preferred is a group represented by the following general formula [II], [III], [IV], [V] or [VI].
[0030]
[Chemical 7]

(In the above general formula [II], Z represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and n is 0, 1 or 2.) When Z is an alkyl group, For example, the group defined by the above-mentioned -LA can be mentioned.
[0031]
[Chemical 8]

(In the above general formula [III], n is 0, 1 or 2, and Φ represents a substituted or unsubstituted o-, m- or p-phenylene group.)
[0032]
[Chemical 9]

(In the general formula [IV], Φ represents a substituted or unsubstituted o-, m-, or p-phenylene group.)
[0033]
Embedded image

[0034]
Embedded image

Examples of the substituent of the phenylene group in the above general formula include those exemplified above.
[0035]
R of general formula [I]^Three A in the formula is a substituted or unsubstituted aryl group, —CH═R^Five (R^Five Represents a substituted or unsubstituted heterocyclic ring, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group or a substituted or unsubstituted aromatic ring). R^Five As the heterocycle of
[0036]
Embedded image

(M and N are each independently an oxygen atom, a sulfur atom or a nitrogen atom,^- Represents an anion) and the like, and examples of the substituent include a substituted or unsubstituted aryl group. The substituted or unsubstituted cycloalkyl group may be saturated or unsaturated, for example
[0037]
Embedded image

And groups derived from those capable of constituting a resonance system. Examples of the substituted or unsubstituted aromatic ring include an azulene ring. Examples of the substituent of these groups include a lower alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, and the like.
[0038]
R of a pyrylium ring containing X or an analogous ring thereof¹ , R² , R^Three A hydrogen atom bonded to a carbon atom to which is not bonded is a halogen atom, sulfonate group, amino group, styryl group, nitro group, hydroxyl group, carboxyl group, cyano group, substituted or unsubstituted lower alkyl group, substituted or It may be substituted with an unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted lower aralkyl group.
[0039]
Y^- Represents an anion, such as BF_Four ^-, Perchlorate ion, HO_Three SCH₂ COO^- Or halogen ions such as chlorine ions, bromine ions, iodine ions, fluorine ions, or compounds having an anionic function such as aliphatic hydrocarbons and aromatic sulfonates, and further Zn, Ni, Cu, Pt, Co And complex ions of transition metals such as Pd.
[0040]
When the group further substituted with the various substituents listed above is a halogen atom, examples of the halogen atom include Cl, Br, and I. The lower alkyl group may be linear or branched, and preferably has about 1 to 4 carbon atoms.
[0041]
One or both of at least two kinds of reagents that can constitute a reaction system that generates a change based on the interaction mediated by the target substance can be selected from the compounds of the general formula [I] and used. In the detection of nucleic acid, the compound of general formula [I] is preferably an intercalator that is inserted into the double helix structure of the nucleic acid.
[0042]
Among the compounds of the general formula [I], those in which the heterocyclic ring containing X is substituted with two or more substituted or unsubstituted aryl groups are preferable. For example, such a compound in the case where the heterocycle containing X is a 6-membered ring,
(1) The 2- and 4-positions of the 6-membered ring containing X are substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, and any of the 3-, 5- and 6-positions is R^Three Is replaced by,
(2) 3- and 5-positions of the 6-membered ring are substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, and either the 2-position, 4-position or 6-position is R^Three Is replaced by,
(3) The 2- and 6-positions of the 6-membered ring are substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, and any of the 3-, 4- and 5-positions is R^Three Is replaced by,
And so on. Introducing a substituted or unsubstituted aryl group at such a position is preferable for obtaining good properties as an intercalator for nucleic acid base pairs. Furthermore, it is more preferable that the heterocyclic ring containing X is substituted with two or more substituted or unsubstituted aryl groups so that these substitution positions are not adjacent to each other.
[0043]
In the case of detecting a change due to charge transfer, for example, a compound having an electron donating group among the compounds of the general formula [I] can be used as an electron donor. Examples of such compounds include those having an aryl group substituted with an amino group substituted with a lower alkyl group (lower alkylamino group) as an aryl group constituting a substituent of a pyrylium ring or a pyrylium-like ring. As the lower alkylamino group, those in which a dimethylamino group, a diethylamino group or the like is substituted at the para position are preferable. This substituted aryl group may be directly substituted with a pyrylium ring or a pyrylium-like ring, or may be substituted with a lower alkyl group to constitute a lower aralkyl group, for example. An example of a compound that can be used as the electron donor is shown in Table 1 described later. Among these compounds, in particular, 2-methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium salt, or 2-methyl-4,6-bis- (4-N, N- A preferred example is dimethylaminophenyl) thiopyrylium salt.
[0044]
Examples of compounds that can be electron acceptors for the compounds in Table 1 include the compounds shown in Table 2 below.
[0045]
However, the compounds in Table 1 are not defined as electron donors, and the compounds in Table 2 are not defined as electron acceptors. An electron donor and an electron acceptor are relatively determined by their respective oxidation-reduction potentials and the like, and cannot be uniquely determined. Therefore, for example, it is possible that both an electron donor and an electron acceptor are selected from the group of compounds in Table 1, or both an electron donor and an electron acceptor are selected from the group of compounds in Table 2. Furthermore, a set of an electron donor and an electron acceptor is combined with a combination of a pyrylium compound exhibiting the properties of Table 1 and another reagent, and an electron donor is combined with a combination of a pyrylium compound exhibiting the properties of Table 2 and another reagent It is also possible to set a set of electron acceptors.
[0046]
Furthermore, it is also possible to select a set of electron donor and electron acceptor from other reagent systems and use a pyrylium compound or a pyrylium-like compound as a mediator or sensitizer.
[0047]
In the case of energy transfer, it is most important that the energy levels of the energy donor and energy acceptor are close. As a result of both being inserted into the double-stranded nucleic acid, the proximity of the energy donor and energy acceptor is thought to cause energy transfer. Therefore, it is not possible to establish a standard for the set of donor and acceptor depending on the mode of interaction with nucleic acid. However, since the pyrium compound having an electron donating group or a pyrylium-like compound (described in Table 1) has a high fluorescence intensity when inserted into a double-stranded nucleic acid and is considered to be stable in an excited state, the energy donor It is estimated that it is advantageous as. It is preferable to select an energy acceptor suitable for each fluorescence energy level. In the case of energy transfer, as in the case of charge transfer, both the energy donor and the energy acceptor may be selected from a pyrylium compound or a pyrylium-like compound, or a reagent substance other than a pyrylium compound or a pyrylium-like compound and a pyrylium compound. You can also choose a set.
[0048]
In the case of a hybridization reaction in solution, a double helix structure is expected if the nucleic acid forms a double strand with a certain length. The present invention uses a reagent substance capable of causing a detectable change using the double helix structure of a hybrid, and detects the formation of a double helix structure by measuring a chemical change of the reagent substance. In this method, a pyrylium compound or a pyrylium-like compound is used as at least one of the reagent substances, and at least one of the reagent substances is bound to the probe.
[0049]
Pyrylium compounds or pyrylium analogs are
(A) one that reacts (interacts) with the double helix structure itself to cause a change,
(B) At least one of two or more kinds of reagent substances that interact via a double helix structure, which can detect a change based on the interaction
Etc. are available.
[0050]
When a pyrylium compound or a pyrylium-like compound is used as the reagent substance in (a), the target nucleic acid is contained in the sample by binding the pyrylium compound or the pyrylium-like compound to the probe and reacting the probe with the sample solution. In this case, the double helix structure of the hybrid of the probe and target nucleic acid formed is detected by a change in the component of the pyrylium compound or pyrylium analog compound bound to the probe or the nucleic acid. Detection of a change due to a reaction between a pyrylium compound or a pyrylium-like compound and a double helix structure is performed by measuring this change when the change of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound itself is measurable. If the change in the pyrylium-like compound induces another detectable change, this change is measured. Furthermore, when detecting a change in a nucleic acid component, the nucleic acid can be decomposed into nucleosides and directly analyzed by HPLC, or an antibody against the changed nucleoside can be prepared and detected with the antibody or the like.
[0051]
As a pyrylium compound or a pyrylium-like compound that interacts with the double helix structure, for example, it reacts with a substance such as a nucleic acid constituting the double helix structure, and can detect itself or a component side of the nucleic acid. A method that detects a chemical change or a structural mutation, or a method that detects these changes by inducing a detectable change by reaction with a third substance added to the reaction system can be used.
[0052]
As this interaction, for example, charge transfer between a component of a nucleic acid having a double helix structure and a pyrylium compound or a pyrylium-like compound can be used. In this case, as the pyrylium compound or pyrylium-like compound bound to the probe, a substance that can be an electron donor or an electron acceptor for a nucleobase pair is used. This interaction may be due to, for example, a change in the chemical structure, electronic state of the pyrilium compound or pyrylium-like compound, a component of the nucleic acid, or a third substance that can interact with these substances, an electronic state, or , Detected as a change in signal derived from the changed material.
[0053]
As the interaction based on the charge transfer, as in the case of the reagent substance (b) described later, a so-called through space and a through bond can be considered. For example, the interaction is based on stacking of nucleic acid base pairs. Charge transfer based on the proximity effect of an electron donor and an electron acceptor that are constituents of a nucleic acid and a pyrylium compound or a pyrylium-like compound accompanying a change to a double helix structure and a nucleic acid can be used.
[0054]
In addition, when charge transfer between the double helix structure and the pyrylium compound or the pyrylium-like compound hardly occurs, a mediator that mediates charge transfer between them or a substance that acts as a sensitizer may be interposed. Good. It is also possible to bind a substance other than a pyrylium compound to a probe as a reagent substance and use a pyrylium compound or a pyrylium-like compound as a mediator or a sensitizer.
[0055]
In the present invention, it is necessary that a pyrylium compound or a pyrylium-like compound is disposed at a position where it can react with a double helix structure and these interactions occur. As a method in which a pyrylium compound or a pyrylium-like compound is arranged at a position where it can react with a double helix structure, when intercalating between nucleobase pairs, when embedded in a groove of a double helix structure, It can be used when it is arranged so as to be close to the double helix structure. In either case, the present invention is effectively arranged by being specifically arranged in the double helix structure of the hybrid formed by the single-stranded probe and the target nucleic acid.
[0056]
In this case, it is more preferable to use an intercalator as a pyrylium compound or a pyrylium-like compound because the reaction with the double helix structure can be made more stable.
[0057]
Among these, as in the case of (b) described later, the intercalator is most advantageous when using charge transfer via stacking.
[0058]
As a method for detecting a change in the interaction between a double helix structure and a pyrylium compound or a pyrylium-like compound, there are a method for detecting a change in an electron donor and a method for detecting a change in an electron acceptor. Methods for detecting changes in electron acceptors can be classified into several types depending on the detection means.
[0059]
For example, it can be regarded as the appearance or change of a new absorption spectrum such as a charge transfer absorption band. A system in which the solution is colored or discolored as a result of charge transfer can directly detect the change with eyes, and is more effective as a simple system. Luminescent systems such as fluorescence and phosphorescence can also be used. In this case, a reaction in which fluorescence or phosphorescence is newly generated or a reaction in which the emitted light disappears as a result of interaction can be used. The spin elimination method in EPR is also an effective detection means. Furthermore, a method in which the electron acceptor chemically changes to another substance as a result of charge transfer and detects it can also be used. At this time, it is also possible to add a third substance to the changed substance later and cause chemiluminescence to be detected by the chemical reaction between the two substances. When a protein such as an enzyme or an antibody is used as the third substance, a detection method using bioluminescence can be used.
[0060]
As a detection method, in addition to the change in the electron acceptor, the interaction may be detected by a change in the electron donor. Basically, most of the methods used for electron acceptors can be applied as they are. When a fluorescent substance is used as an electron donor, it is possible to detect a direct change such as fluorescence quenching by using a substance whose fluorescence quantum yield decreases with charge transfer. Furthermore, a method of visualization in combination with several reactions can also be used.
[0061]
If the pyrylium compound or pyrylium-like compound is an electron donor for a double helix structure, it is activated by light to release electrons and initiate charge transfer, and as a third substance, an electron donor There may be a substance that stimulates the reagent substance to generate electrons.
[0062]
Further, when the pyrylium compound or the pyrylium-like compound is an electron acceptor for a double helix structure, it may be activated to induce electrons to be extracted from the electron acceptor. The initiator may be any initiator in addition to light, as in the case of the electron donor.
[0063]
Further, as described above, a mediator that mediates charge transfer or a substance that acts as a sensitizer may be interposed as the third substance. In addition, when a substance other than a pyrylium compound is used as a reagent substance, a pyrylium compound or a pyrylium-like compound can be used as a mediator or a sensitizer.
[0064]
As the pyrylium or pyrylium-like compound that binds to the probe of (a), a compound having a redox potential close to the redox potential of the nucleic acid can be used. Specifically, compounds having an electron donating group as shown in Table 1 can be used as the electron donor, and compounds shown in Table 2 can be used as the electron acceptor. However, this does not define the compounds shown in Table 1 as electron donors and the compounds shown in Table 2 as electron acceptors. It is determined by the relative relationship with the redox potential of the nucleic acid. Therefore, it is sufficiently possible to select an electron donor and electron acceptor set from the compounds shown in Table 1 and an electron donor and electron acceptor set from the compounds shown in Table 2. Among such compounds, 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium iodide, 2,6-diphenyl-4-N, N- is particularly preferable as an electron donor. Dimethylaminophenylpyrylium iodide, 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium iodide, 2,4,6-triphenylpyrylium iodide, 2,6-bis (N, N-dimethylamino) as an electron acceptor Mention may be made of (phenyl) -4-phenylpyrylium iodide and their thiopyrylium compounds. Moreover, the set of an electron donor and an electron acceptor can be selected as a combination of a pyrylium compound, and a pyrylium analog and another reagent substance.
[0065]
Next, a method using the reagent substance (b) will be described. The method of using a pyrylium compound or a pyrylium-like compound as the reagent substance of (b) includes two or more kinds including a pyrylium compound or a pyrylium-like compound as the structure changes from a single strand to a double strand, that is, a double helix. The hybrid is detected by measuring the change caused by the charge transfer between the reagent substances. Detection by charge transfer requires two or more reagent substances including a pyrylium compound or a pyrylium-like compound, including at least an electron donor and an electron acceptor set. The interaction between the two is, for example, a change in the chemical structure of the electron donor, the electron acceptor, or a third substance that can interact with these substances before and after the formation of the hybrid, a change in the electronic state, or It is detected as a change in the signal derived from the changed substance.
[0066]
As the interaction between the electron donor and the electron acceptor, a so-called through space and a through bond can be considered. The former includes, for example, the case where the electron donor and the electron acceptor interact through the stacking of nucleobase pairs, and the proximity effect between the electron donor and the electron acceptor accompanying the change to the double helix structure. And the case of being based. In the latter (through bond), the transfer of charges including the base, the phosphate moiety, or the sugar moiety constituting the nucleic acid can be considered. In any case, the form of the interaction is not limited as long as the interaction is derived from the formation of a double helix.
[0067]
It is released from the electron donor when the distance between the electron donor and the electron acceptor placed at a position capable of reacting with the double helix structure is so large that they cannot interact with each other. The electrons are successively transferred to adjacent nucleobase pairs via an electron cloud spreading on the nucleobase pairs, and finally reach the electron acceptor. On the contrary, the electron acceptor withdraws electrons from the nucleic acid base pair, which is performed in a chain manner, and finally the electrons are taken away from the electron donor. That is, the nucleic acid base pair functions as a mediator in charge transfer.
[0068]
On the other hand, the case based on the proximity effect between the electron donor and the electron acceptor is a case where the distance between the electron donor and the electron acceptor is close enough to allow these interactions due to the formation of a double helix structure. Say that. For example, even when both an electron donor and an electron acceptor are present, they do not interact when they are in a single-stranded state in which the distance between these compounds is sufficiently long in solution. If the electron donor and the electron acceptor are close to each other only when they are hybridized with the target nucleic acid to form a double helix structure, these interactions can be established. It can be detected by whether or not an interaction has occurred.
[0069]
In addition, when charge transfer between the electron donor and the electron acceptor via the double helix structure is difficult to occur, a substance called a mediator or a sensitizer that mediates charge transfer between them May be interposed.
[0070]
As described above, in the present invention, it is necessary to arrange an electron donor and an electron acceptor at a position where they can react with the double helix structure to cause an interaction. The reagent substance can be placed at a position where it can react with the double helix structure, such as when intercalated between nucleic acid base pairs, embedded in a groove of a double helix structure, or double helix. For example, it can be arranged so as to be close to the structure. In any case, it is essential for the present invention to specifically arrange in the double helix structure of the hybrid formed by the single-stranded probe and the target nucleic acid.
[0071]
Of these, intercalators are most advantageous when utilizing charge transfer via stacking. In other words, an intercalator is generally a planar compound with a spread of electrons, and is located on the extended line of the nucleobase pair stack at a position parallel to the nucleobase pair at a distance similar to the distance between the nucleobase pairs. Oriented to For example, if an intercalator is used as an electron donor and an electron acceptor is placed on the opposite side of the double helix structure, electrons released from the electron donor are sent to adjacent nucleobase pairs, which are It can flow in a straight line toward the electron acceptor via the electron cloud of nucleobase pairs. Or, conversely, if an intercalator is used as the electron acceptor and the electron acceptor is placed on the opposite side of the double helix structure, electrons are drawn from adjacent nucleobase pairs by electron holes on the electron acceptor. In some cases, the extraction of electrons occurs one after another between other nucleic acid base pairs, and finally the electrons are extracted from the electron donor to cause charge transfer. In view of these points, in the case of charge transfer via stacking, it is preferable that at least one of the electron donor and the electron acceptor is an intercalator, and when both are intercalators, It is more preferable because the charge transfer efficiency can be increased. In addition, intercalators are known to stabilize the double helix structure and raise its melting temperature. The fact that an electron donor or electron acceptor is an intercalator is a hybrid between a probe and a target nucleic acid. It is also advantageous in that it stabilizes.
[0072]
As a method for detecting a change in interaction between two or more kinds of reagent substances due to double helix formation, there is a method for detecting a change in an electron acceptor. This method can be classified into several types according to the detection means. Like a charge transfer absorption band, it can also be regarded as the appearance or change of a new absorption spectrum. A system in which the solution is colored or discolored as a result of charge transfer can directly detect the change with eyes, and is more effective as a simple system. Luminescent systems such as fluorescence and phosphorescence can also be used. In this case, a reaction in which fluorescence or phosphorescence is newly generated or a reaction in which the emitted light disappears as a result of interaction can be used. In addition, a method in which the electron acceptor chemically changes to another substance as a result of charge transfer and detects it can be used. At this time, it is also possible to add a third substance to the changed substance later and cause chemiluminescence to be detected by the chemical reaction between the two substances. When a protein such as an enzyme or an antibody is used as the third substance, a detection method using bioluminescence can be used.
[0073]
As a detection method, in addition to the change in the electron acceptor, the change in the electron donor may be detected to detect the interaction. And basically, most of the methods used in the case of electron acceptors can be applied as they are. When a fluorescent substance is used as an electron donor, it is possible to detect a direct change such as fluorescence quenching by using a substance whose fluorescence quantum yield decreases with charge transfer. Furthermore, a method of visualization in combination with several reactions can also be used.
[0074]
In the present invention, in addition to the case where the electron donor is activated by light or the like to emit electrons and charge transfer starts, there is a third substance that stimulates the electron donor to generate electrons. May be.
[0075]
Further, the electron acceptor may be activated and induced to draw electrons from the electron acceptor. As the initiator, as in the case of the electron donor, there may be some initiator in addition to light.
[0076]
Further, as described above, in addition to the electron donor and the electron acceptor, a mediator that mediates charge transfer or a substance called a sensitizer may be interposed as a third substance. . Then, these substances may interact with the double helix to promote charge transfer to the electron donor and electron acceptor that are not directly bonded to the double helix.
[0077]
As the reagent substance used in the method (b) of the present invention as described above, the compounds shown in Table 1 are listed as the pyrium compound or pyrylium-like compound as the electron donor, and Table 2 is shown as the electron acceptor. A compound can be mentioned. However, this does not define the compounds shown in Table 1 as electron donors and the compounds shown in Table 2 as electron acceptors. The electron donor and the electron acceptor are relatively determined by the redox potential or the like, and cannot be uniquely determined. Therefore, it is sufficiently possible to select an electron donor and electron acceptor set from the compounds shown in Table 1 and an electron donor and electron acceptor set from the compounds shown in Table 2. Among such compounds, in particular, as an electron donor, 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium iodide, 2,6-diphenyl-4-N, N— Dimethylaminophenylpyrylium iodide, 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium iodide, 2,4,6-triphenylpyrylium iodide, 2,6-bis (N, N-dimethylamino) as an electron acceptor Mention may be made of phenyl) -4-phenylpyrylium iodide and their thiopyrylium compounds.
[0078]
As a reagent substance other than pyrylium, as a spin labeling agent, for example, 4,4-dimethyloxyzolidine-N-oxyl (DDXXL) or a derivative thereof, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-N-oxyl (PROXL) or And derivatives thereof.
[0079]
Examples of the fluorescent intercalator include respective derivatives, and examples thereof include acridine, anthracene, pyrene, ethidium bromide, proflavine, porphyrin, thiazole orange dimer (TOTO), and oxazole yellow (YOYO).
[0080]
Other common fluorescent dyes include their respective derivatives, and include cyanine, azulene, trinuclear dyes, dansyl, fluorescein, eosin, rhodamine, riboflavin and the like.
[0081]
The relationship between the electron acceptor and the electron donor is determined by the relationship between the redox potentials of the two. Thus, in the present invention, substances generally defined as electron donors or electron acceptors are not used as defined, but in individual combinations of two or more reagent substances, A substance that can be a receptor is properly selected and used.
[0082]
In addition, a pyrylium compound or a pyrylium-like compound can be used as a sensitizer instead of being used as an electron donor or an electron acceptor.
[0083]
When utilizing energy transfer as an interaction, the two or more reagent materials include at least a set of energy donors and energy acceptors. The interaction between the two is, for example, the change in the chemical structure of the energy acceptor, energy donor, or third substance that can interact with these substances before and after the formation of the hybrid, the change in the electronic state, or It is detected as a change in the signal derived from the changed substance.
[0084]
When energy transfer is used as the interaction, the hybrid can be detected by decreasing the fluorescence intensity of the energy donor and increasing the fluorescence intensity of the energy acceptor. In such a case, as the double strand formation, the distance between the energy donor and the energy acceptor on the probe becomes shorter than in the case of a single strand, and interaction becomes possible and energy transfer occurs. Conceivable.
[0085]
Light is mainly used as the energy transfer initiator.
[0086]
The reagent substance used for energy transfer can be selected based on the fact that the energy levels of the energy donor and the energy acceptor are close. Among pyrylium compounds, pyrylium compounds having an electron-donating group or pyrylium-like compounds (described in Table 1) have high fluorescence intensity when inserted into a double-stranded nucleic acid, and the excited state is considered to be stable. It is presumed that it is advantageous as an energy donor. It is preferable to select an energy acceptor suitable for each fluorescence energy level. Examples of such reagent substances that can be energy donors or energy acceptors include the respective derivatives as fluorescent intercalators, such as acridine, anthracene, pyrene, ethidium bromide, proflavine, porphyrin, Examples include thiazole orange dimer (TOTO) and oxazole yellow (YOYO).
[0087]
Other common fluorescent dyes include their respective derivatives, and include cyanine, azulene, trinuclear dyes, dansyl, fluorescein, eosin, rhodamine, riboflavin and the like.
[0088]
When these electron donors and electron acceptors or energy donors and energy acceptors are used in the present invention, the electron donor and the electron acceptor or energy donor and / or energy acceptor are used in the reaction system. If they exist in a free state that is not bonded, the interaction between the two will occur regardless of the presence or absence of the double helix structure, and the background will rise and the S / N ratio will deteriorate. Therefore, it is preferable to use one or both of them bound to a probe for accurate detection. The electron donor, the electron acceptor or the energy donor, and the binding of the energy acceptor to the probe may be performed, for example, (CH₂ )_n In this case, the positional relationship and the like are taken into consideration so that these interactions are most efficiently performed.
[0089]
The most desirable form is when both the electron donor and the electron acceptor or energy donor and energy acceptor are bound to the probe, in which case the positional relationship between the interacting reagent substances is clear. Therefore, it is advantageous that the interaction can be controlled by these positional relationships in the probe. In this case, the distance of the electron donor to the electron acceptor or energy donor and the energy acceptor probe is appropriately selected according to the type of electron donor to be used and the electron acceptor or energy donor or energy acceptor. However, for example, when the proximity effect is used, the distance between the electron donor and the electron acceptor or the energy donor and the energy acceptor is 20 to 120 angstroms when the double helix structure is formed as a hybrid. Is preferable, and it is more preferable that it is 50-80 angstrom. In addition, when performing charge transfer via a double helix structure, it is important that these distances take into account structural changes such as DNA unwinding caused by each reagent substance, and the range thereof is 20 to 20%. 120 angstroms is preferred. However, this distance is different from the case where both the electron donor and the electron acceptor are intercalators and the case where one or both of them enter the main groove or the sub groove, and is not necessarily limited to this range. However, when it is too short, charge transfer occurs between the electron donor and the electron acceptor without involving the interaction with the nucleic acid, so that it is more preferably 50 to 80 Å.
[0090]
The length of the probe is appropriately selected in each case so that good hybridization with the target nucleic acid is possible and a stable double helix structure is obtained. When an electron donor and an electron acceptor or both an energy donor and an energy acceptor are bound to a probe, and if they are close to each other, they can interact even in the absence of a double helix structure. The probe length is determined in consideration of the distance between them, and the length is, for example, 8 bases or more, preferably 12 bases or more.
[0091]
However, in addition to the probe length, the base sequence itself, the salt concentration and the ionic strength of the reaction system greatly affect the stabilization of the double helix structure. Since the GC base pair has more hydrogen bonds than the AT base pair, a more stable double helix structure is formed in a sequence with many GCs. In addition, it is said that the melting point temperature of DNA increases by 30 ° C. when the molar concentration of KCl is increased from 0.01M to 1M. In addition, the presence of intercalators greatly contributes to stability. Therefore, it is also possible to use a probe having a length of less than 8 bases by appropriately using these stabilizing factors.
[0092]
In addition, the properties of the electron donor, or the electron acceptor, energy donor, and energy acceptor are factors that must be taken into consideration when selecting a probe. When these reagent substances are intercalators, they do not enter any sequence of the double helix with the same probability, but each reagent substance such as those that prefer GC base pairs and those that prefer AT base pairs. Depending on the nature. Therefore, in selecting the probe sequence, it is important to consider the properties of such a reagent substance in addition to the stability of the double helix composed of the probe and the target nucleic acid.
[0093]
Desirably, the change based on the interaction between the electron donor and the electron acceptor is irreversible. That is, if the electron donor or the electron acceptor used for detection changes irreversibly, it is also possible to accumulate and detect the change, which is advantageous in terms of sensitivity.
[0094]
As a form using an electron donor and an electron acceptor or an energy donor and an energy acceptor in the present invention, when only one is bound to a probe,
a) When the double helix structure is formed by hybridization between the probe and the target nucleic acid, the other is also present in the reaction system, and the post-formation interaction is caused.
b) After forming a double helix structure by hybridization between the probe and the target nucleic acid, the other may be added to the reaction system to cause interaction.
[0095]
When both are bound to the probe, both of them already exist in the reaction system when the probe and the target nucleic acid are hybridized, and after the formation of the double helix structure, the interaction occurs. Become.
[0096]
In the present invention, as a form in which an electron donor and an electron acceptor or energy donor, a pyrylium compound that is a set of energy acceptors, or a reagent substance containing a pyrylium-like compound is bound to a probe,
a) An electron acceptor or energy acceptor that specifically interacts with a double helix is added in a free state by binding an electron donor or energy donor pyrylium compound or a pyrylium-like compound to one of the probes. Even
b) An electron acceptor or an energy acceptor that is an electron acceptor or energy acceptor is bound to one of the probes, and the electron donor or energy donor that interacts specifically with the double helix is released. Even if you add in
c) An electron donor or energy donor reagent substance bound to one of the probes, and an electron acceptor or energy acceptor pyrylium compound or pyrylium-like compound that interacts specifically with the double helix structure Can be added free
d) An electron acceptor, an energy acceptor reagent substance bound to one of the probes, and an electron donor that interacts specifically with the double helix structure, an energy donor pyrylium compound, or a pyrylium-like compound Can be added free
e) Even if both of two kinds of pyrylium compounds or pyrylium analogs which are a set of an electron donor and an electron acceptor, an energy donor and an energy acceptor are bound to the probe,
f) A combination of an electron donor and an electron acceptor, a combination of an energy donor and an energy acceptor, a pyrylium compound or a pyrylium analog, and another reagent substance may be bound to the probe.
[0097]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Example 1
[1] 2-Methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium perchlorate [compounda]
100 ml of acetic anhydride and 30 ml of concentrated sulfuric acid were mixed while being cooled, and the resulting mixture was heated for 3 hours while being kept at 80 ° C. with a water bath. Thereto were added 20 ml of acetic anhydride and 30 ml of p-dimethylaminoacetophenone at room temperature, and then the temperature was raised to 45 ° C. and stirred for 24 hours to cause a reaction. When an equal amount of ethanol was added to the reaction solution, the mixture was cooled and a 70% aqueous perchloric acid solution was further added, crude crystals were precipitated. The crude crystals were collected by filtration and recrystallized from a mixed ethanol / ether system (volume ratio, 1: 4) to give 2-methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl). Pyrylium perchlorate [compounda] Was obtained.
[0098]
[2] Preparation of 20-mer oligonucleotide probe to which TEMPO (4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine) as a spin labeling agent is bound
(1) Synthesis of 4-aminohexylamino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (4-aminohexylamino-TEMPO)
0.5 mmole of 4-oxo-TEMPO and 5 mmole of hexamethylenediamine dihydrochloride were dissolved in 30 ml of methanol. To this, 0.4 mmole of sodium cyanoborohydride and molecular sieve 3A were added, and the mixture was reacted at room temperature for 24 hours with stirring. . Next, the reaction solution was filtered through a glass filter to remove the molecular sieve, and then the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure. Next, 30 ml of 1N hydrochloric acid was added to the obtained residue to dissolve it, and then extracted with chloroform. After the chloroform layer was washed with water, chloroform was distilled off under reduced pressure. Water was added to the obtained residue, insoluble matter was filtered off, and the filtrate was again distilled off under reduced pressure to obtain a red oil.
[0099]
(2) Oligonucleotide synthesis
A 20-mer oligonucleotide having a base sequence partially complementary to M13mp18 DNA (single strand) as a target DNA was synthesized using an ABI 381A DNA automatic synthesizer. The dimethoxytrityl group below 5 'was removed on an automated synthesizer. The base sequence is as follows.
[0100]
5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3 '
(3) Synthesis of spin-label oligonucleotide probe
In the step (2), the synthesized oligonucleotide (1 μmole) was transferred to a gas tight syringe while bound to the CPG support. The following reaction was performed in a syringe. 1 ml of dioxane in which 50 mg of carbonyl-N, N′-diimidazole (CDI) was dissolved was added to the CPG support, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing with dioxane and drying under reduced pressure, 4-aminohexylamino-TEMPO in DMSO (0.2 M 0.4 ml) was added, and the mixture was allowed to stand at 55 ° C. for 24 hours. DMSO, dioxane and methanol were washed in that order and dried under reduced pressure.
[0101]
The spin-label oligonucleotide was excised and deprotected with concentrated aqueous ammonia according to a conventional method, and purified by RPLC.
[0102]
[3] Formation reaction of hybrid of TEMPO probe and M13mp18 DNA
0.2 μM of the oligonucleotide probe introduced with TEMPO prepared in [2] above and 0.2 μM of M13mp18 DNA (Takara Shuzo) in 1 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) / 145 mM NaCl / 5 mM KCl And then gradually cooled to room temperature to prepare a probe / target DNA hybrid. Next, a compound is added to the reaction solution.aWas added to a final concentration of 5 μM and subjected to the measurement of the ESR spectrum shown below. Further, the same operation as described above was carried out without using M13mp18 DNA to obtain a sample for measuring ESR spectrum (probe alone).
[0103]
[4] Measurement of ESR spectrum
ESR measurements were swept at 20 minute intervals per sample and continued for 100 minutes. Then, the intensity ratio and the line width with time were followed. ESR was manufactured by JEOL Ltd., and an artificial quartz flat cell was used for measurement.
[0104]
The ESR and light irradiation device were set as follows.
[0105]

Light irradiation device
Monochromator 580nm
Power supply 88.5V-89V / 22A
FIG. 1 shows the change over time in the ESR signal intensity ratio and the change over time in the line width. As can be seen from FIG. 1, in the case of the probe alone, no change was observed in the intensity ratio and the line width even when irradiated with light. Also compoundsaIn the case of / probe / M13mp18, no change was observed in the intensity ratio and the line width when no light was irradiated.
[0106]
In contrast, compoundsa/ Probe / compound to M13mp18 DNAaWhen irradiation with light of 580 nm, which is an absorption maximum value when DNA and DNA were bound, the intensity ratio of ESR decreased with time. In addition, since no change in the line width was observed, it can be said that the intensity change in ESR is not due to a chemical change. Thus, the compound via the double helix structure formed by the probe and M13mp18 DNAaIt was confirmed that the spin of TEMPO was eliminated as a result of the charge transfer from TEMPO to TEMPO bound to the probe. That is, the probe / target DNA hybrid could be detected without B / F separation.
Example 2 Detection of Nucleobase Changes by HPLC
[1] Compound at the 3 'endaOf probes with bound
(1) CompoundaEsterification
CompoundaA mixture of 4.3 g, 2 g of carboxybenzaldehyde, 1 drop of 70% perchloric acid and 10 ml of acetic acid was refluxed for 1 hour, and then the deposited precipitate was collected and recrystallized from the above ethanol / ether mixture system. (4-Carboxystyryl) -4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium perchlorate, [compoundb] Was obtained.
[0107]
Compoundb170 mg was dissolved in 5 ml of dry DMF and 50 μl of dry pyridine was added. After adding 128 mg of DSC (disuccimidyl carbonate), the mixture is stirred for 20 hours at room temperature in the dark. 150 ml of diethyl ether is added to the reaction mixture, and the deposited precipitate is collected, washed with diethyl ether and dried. Obtained active ester compound [compoundc] Was used for the reaction with nucleic acid as it was.
[0108]
(2) Oligonucleotide synthesis
Oligonucleotides having the same sequence as in Example 1 were synthesized with an automatic DNA synthesizer. In addition to its effective sequence, the oligonucleotide was later linked with a thiol linker at the 5 'end and an amino linker at the 3' end as a linker for binding an electron donor or electron acceptor. Reagents 5 'thiol-modifier C6 and amino-modifier dT manufactured by Glen Research were used for the linkers, respectively. Cutting out from CPG support, deprotection, and purification by high performance liquid chromatography (HPLC) were performed by the method specified by the company.
[0109]
(3) CompoundcReaction of oligonucleotides with oligonucleotides
Oligonucleotide synthesized in (2) (10D₂₆₀ ) Compound in 0.8 ml phosphate buffer solution (0.1 M pH = 7.0)c0.2 ml of acetonitrile solution containing 1 mg was added and left at 40 ° C. for 24 hours. Crude purification with Pharmacia NAP column followed by HPLC, compound at 3 'endaConjugated probe [compoundd] Was obtained.
[0110]
[2] Absorption spectrum of hybrid
Next, the absorption spectrum of this reaction solution was measured. 3 'end labeled probe [compoundd] Only absorption maximum is compoundaThe absorption maximum of the probe / M13mp18 hybrid was shifted to 580 nm. This means that the compoundaIs an intercalator.
[0111]
[3] Light irradiation to hybrid
Thus, visible light having an excitation wavelength of 580 nm was irradiated in combination with a xenon lamp and a bandpass filter. The irradiation time was changed from 5 minutes to 20 minutes at 5 minute intervals.
[0112]
[4] Nucleoside analysis by HPLC
Exonuclease III (Takara Shuzo) and alkaline phosphatase (Takara Shuzo) are added to the sample after light irradiation and reacted at 37 ° C. to decompose the double-stranded portion of the probe / target DNA hybrid to form a nucleoside. did.
[0113]
Next, the nucleosides were separated by HPLC. Using a reverse phase column (Wakosil Wako Pure Chemical Industries), elution was performed with a methanol gradient (10-40%) containing a 10 mM triethylamine acetate solution.
[0114]
All four deoxynucleosides (dA, dG, dC, dT) were eluted within a retention time of 10 minutes. In addition, an unknown peak having an absorption maximum of 250 nm at 13 minutes and 280 nm at 19 minutes was detected. Further, the amount increased in proportion to the irradiation amount up to 10 minutes and became constant thereafter.
[0115]
As a control experiment, a similar experiment was also performed on a solution of a hybrid of an unlabeled probe / target DNA. Measurement was performed while changing the irradiation time of the irradiating xenon lamp from 5 minutes to 20 minutes, but these two peaks were not observed. From the comparison of the HPLC peak intensities of the unlabeled probe and the labeled probe, it was considered that this unknown nucleoside had a changed GC base pair.
[0116]
Even when a labeled probe was used, these two peaks were not observed in the sample in which the hybrid was not irradiated with light.
Example 3 Detection of Hybrid by Charge Transfer with Labeled Antibody
[1] Preparation of labeled antibody
(1) Production of antibodies
Using two unknown compounds obtained in Example 2 as antigens, antibodies were prepared using mice according to a conventional method.
[0117]
(2) Synthesis of 4-methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate
A. T.A. Balaban et al., Tetrahedron,20119 (1964), 4-methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate [compounde] Was synthesized.
[0118]
(3) Antibody labeling
CompoundeAfter refluxing a mixed solution of 4.3 g, carboxybenzaldehyde 2 g, 1 drop of 70% perchloric acid and 10 ml of acetic acid for 1 hour, the deposited precipitate was collected and recrystallized from the above ethanol / ether mixture system. (4-Carboxystyryl) -2,6-diphenylpyrylium perchlorate [compoundf] Was obtained.
[0119]
Compoundf170 mg was dissolved in 5 ml of dry DMF and 50 μl of dry pyridine was added. After adding 128 mg of DSC (disuccimidyl carbonate), the mixture is stirred for 20 hours at room temperature in the dark. 150 ml of diethyl ether is added to the reaction mixture, and the deposited precipitate is collected, washed with diethyl ether and dried. Obtained active ester compound [compoundg] Was reacted with the amino group of the antibody to prepare a labeled antibody.
[0120]
[2] Detection of hybrid
Compound prepared at the 3 ′ end prepared in Example 2aConjugated probe [compoundd] And M13mp18 hybrid were irradiated with visible light at 580 nm for 10 minutes. This hybrid was reacted with the labeled antibody prepared in [1].
[0121]
This sample was again irradiated with visible light of 580 nm, and the fluorescence was observed with IMUC-7000 manufactured by Otsuka Electronics. As a result, the fluorescence at 640 nm observed before reacting the labeled antibody was quenched, and instead, fluorescence appeared again at 450 nm. This means that the compound inserted in the hybridaAnd compounds on labeled antibodieseIt is considered that charge transfer occurred between the two.
Example 4 Detection of a DNA hybrid using a probe bound with two types of pyrylium dyes
[1] Compound at the 3 'endaCompound at the 5 'endeOf probes with bound
(1) CompoundeOf styryl
The above compoundbCompound by the same method aseAnd 4- (4-aminostyryl) -2,6-diphenylpyrylium perchlorate was synthesized from 4-aminobenzaldehyde [compoundh].
[0122]
Compound 196mg maleic anhydride dissolved in 10ml chloroformhAfter adding 2 ml of 450 mg chloroform solution, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was cooled to 15 ° C. and the deposited precipitate was collected. This maleic acid adduct intermediate [compoundi] Was used as such for the next reaction.
[0123]
1 g of sodium acetate (anhydrous) is added to 10 ml of acetic anhydride and dissolved, followed by compoundiAfter adding 250 mg and stirring vigorously to dissolve, stirring was continued at 90 ° C. for 30 minutes. The mixed solution was cooled to room temperature and poured into 20 ml ice water, and the precipitate was collected, washed with water three times and dried. 4- (4-maleimidylstyryl) -2,6-diphenylpyrylium perchlorate [compound, recrystallized from ethanolj] Was obtained.
[0124]
(2) CompoundhReaction of 5 'end of oligonucleotide
Compound at the 3 'endaBound oligonucleotide [compounddIn 0.8 ml phosphate buffer solution (0.1 M pH = 7.0)j0.2 ml of 1 mg acetonitrile solution was added and left at 40 ° C. for 24 hours. It was purified by HPLC after crude purification with a Pharmacia NAP column. As a result, both ends of the pyrium dye-labeled oligonucleotide probe [compoundk] Was obtained.
[0125]
[3] Compound at 5 'endjOf a probe with bound to (for control experiments)
Compound at the 3 'end in the same way as the method for preparing both end-labeled probesaUsing an oligonucleotide to which is not bound, only the 5 'end is a compoundeA probe labeled with [Compound 1] was prepared.
[0126]
[4] Formation reaction of hybrid between both end-labeled probe and M13mp18 DNA
0.2 μM of the oligonucleotide probe in which an electron donor and an electron acceptor are bound to both ends prepared in the above [2] and 0.2 μM of M13mp18 DNA are added to a 1 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) / 145 mM NaCl. The mixture was heated to 80 ° C. in / 5 mM KCl, and then gradually cooled to room temperature to prepare a probe / target DNA hybrid.
[0127]
[5] Measurement of fluorescence spectrum
Next, a compound is added to the reaction solution.aVisible light of 580 nm, which is the absorption maximum when sigma was bound to DNA, was irradiated in combination with a xenon lamp and a bandpass filter. The fluorescence was measured with IMUC-7000 manufactured by Otsuka Electronics.
[0128]
CompoundlAnd the hybrid of M13mp18 did not have fluorescence in any region. In contrast, compoundskAnd a hybrid of M13mp18 is a compoundaThe fluorescence at 640 nm derived from was lost, and fluorescence appeared at 450 nm instead. This means that the compoundaFrom compoundseIt is probable that the charge has moved to.
[0129]
This spectrum is shown in FIG.
Example 5 Detection of a DNA hybrid by a probe bound with one kind of pyrylium dye
Compound at the 3 'end by the same method as in Example 1aA hybrid of the probe bound with M13mp18 DNA was prepared. Further, 2,6-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -4-phenylpyrylium iodide [compoundmWas added to a final concentration of 5 μM.
[0130]
Pre-compoundmThe interaction between DNA and DNA was examined. CompoundmIn the free state and DNA solution, the compoundaSimilar to, it shows a long wavelength change in the absorption spectrum and seems to be an intercalator, but its fluorescence is small even in the DNA solution.
[0131]
Compound in probe / target DNA hybridaWhen irradiated with light of 580 nm which is the excitation wavelength ofaFluorescence at 640 nm emitted by interacting with DNA was quenched, and new fluorescence appeared at 720 nm. This is a compoundaFrom compoundsmIt is thought that energy transfer to
[0132]
[Table 1]

[0133]
[Table 2]

[0134]
[Table 3]

[0135]
[Table 4]

[0136]
[Table 5]

[0137]
[Table 6]

[0138]
[Table 7]

[0139]
[Table 8]

[0140]
[Table 9]

[0141]
[Table 10]

[0142]
[Table 11]

[0143]
[Table 12]

[0144]
[Table 13]

[0145]
[Table 14]

[0146]
[Table 15]

[0147]
[Table 16]

[0148]
[Table 17]

[0149]
[Table 18]

[0150]
[Table 19]

[0151]
[Table 20]

[0152]
[Table 21]

[0153]
[Table 22]

[0154]
[Table 23]

[0155]
[Table 24]

[0156]
[Table 25]

[0157]
[Table 26]

[0158]
[Table 27]

[0159]
[Table 28]

[0160]
[Table 29]

[0161]
[Table 30]

[0162]
[Table 31]

[0163]
[Table 32]

[0164]
[Table 33]

[0165]
[Table 34]

[0166]
[Table 35]

[0167]
[Table 36]

[0168]
[Table 37]

[0169]
【The invention's effect】
The target nucleic acid detection method of the present invention has the advantage that B / F separation is not necessary. As a result, many operations such as removal of excessive probes, complicated treatments for removing non-specific adsorption, and examination of the conditions, which are indispensable in the conventional method, are no longer necessary.
[0170]
Furthermore, by selecting a reagent substance so that signal changes are observed only in the correct hybrid, even if a mismatch occurs in the reaction system, the hybrid forms an accurate double helix structure. It becomes possible to detect only.
[0171]
In addition, pyrilium or pyrylium-like compounds used as electron donors and energy donors are characterized by being non-fluorescent when used in a single-stranded state bound to a probe or in a free state. High-sensitivity detection is now possible.
[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing an ESR spectrum in [4] of Example 1. FIG.
2 is a graph showing the fluorescence spectrum of [4] in Example 4. FIG.

Claims (10)

A process of adding a nucleic acid probe to a sample solution and reacting them, and a process of detecting a double helix structure of a hybrid of a nucleic acid probe and a target nucleic acid obtained when the target nucleic acid is present in the sample solution; A method for detecting a nucleic acid hybrid having
The process of detecting the double helix structure of the hybrid of the nucleic acid probe and the target nucleic acid in the detection method,
Two reagent substances that cause a detectable change by interaction through a double helix structure coexist in the sample solution,
By measuring a change based on the interaction between the two reagent substances, which occurs through the double helix structure of the hybrid of the nucleic acid probe and the target nucleic acid, which is formed when the target nucleic acid is present, It uses a method to detect the helical structure,
Both of the two types of reagent substances used in the detection method are pyrylium compounds or pyrylium-like compounds,
The two kinds of reagent substances are respectively bonded to the two ends of the nucleic acid probe via a linker,
The change based on the interaction between the two reagent substances is a change based on charge transfer between the two reagent substances,
Charge transfer between the two reagent substances is performed through stacking of base pairs constituting a double helix structure in the hybrid,
In the charge transfer, one of the two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound functions as an electron acceptor, while the remaining one type corresponds to one of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor. Function as an electron donor,
Two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound are inserted into a double helix structure of a hybrid of the nucleic acid probe and the target nucleic acid as an intercalator,
Charge transfer between the two reagent materials is induced by selectively photoexciting the electron donor,
One type of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron donor is
The following general formula [A1]:

[A1]
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium salt compound represented by the following general formula [ A2]:

[A2]
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a pyrylium compound selected from the group consisting of 2,6-diphenyl-4-N, N-dimethylaminophenylpyrylium salt compounds And
One kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor is
The following general formula [A3]:

[A3]
(Wherein, X is O or S, and Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and a 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium salt compound represented by A thiopyrylium compound; and the following general formula [A4]:

[A4]
(Wherein, X represents O or S, and Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and their thiopyrylium A method for detecting a nucleic acid hybrid, which is a pyrylium compound or a thiopyrylium compound selected from the group consisting of compounds. As one kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor,
The following general formula [A3 ′]:

[A3 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium salt compound; and the following general formula [A4 ′]:

[A4 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and a pyrylium compound selected from the group consisting of 2,4,6-triphenylpyrylium salt compounds represented by The method according to claim 1. As one kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron donor,
The following general formula [A1 ′]:

[A1 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium salt compound 3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that The method according to claim 1, wherein the change based on the interaction between the two reagent substances is optically detectable. The method according to claim 1, wherein the change based on the interaction between the two kinds of reagent substances can be detected by light irradiation. A target nucleic acid detection probe having a sequence for hybridization with a target nucleic acid,
At least the nucleic acid probe has
Used in the detection of the double helix structure of the hybrid of the nucleic acid probe and the target nucleic acid,
Two types of pyrylium compounds or pyrylium-like compounds, which produce a detectable change by interaction through a double helix structure in the hybrid formed, are each attached to the two ends of the nucleic acid probe via a linker. And
The change based on the interaction between the two kinds of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound is a change based on charge transfer between the two kinds of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound,
Charge transfer between two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound is performed through stacking of base pairs constituting a double helix structure in the hybrid,
In the charge transfer, one of the two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound functions as an electron acceptor, while the remaining one type corresponds to one of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor. Function as an electron donor,
Two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound are inserted into a double helix structure of a hybrid of the nucleic acid probe and the target nucleic acid as an intercalator,
Charge transfer between the two types of the pyrylium compound or the pyrylium-like compound is induced by selectively photoexciting the electron donor,
One type of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron donor is
The following general formula [A1]:

[A1]
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium salt compound represented by the following general formula [ A2]:

[A2]
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a pyrylium compound selected from the group consisting of 2,6-diphenyl-4-N, N-dimethylaminophenylpyrylium salt compounds And
One kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor is
The following general formula [A3]:

[A3]
(Wherein, X is O or S, and Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and a 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium salt compound represented by A thiopyrylium compound; and the following general formula [A4]:

[A4]
(Wherein, X represents O or S, and Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and their thiopyrylium A probe for detecting a nucleic acid hybrid, which is a pyrylium compound or a thiopyrylium compound selected from the group consisting of compounds. As one kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor,
The following general formula [A3 ′]:

[A3 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,6-diphenyl-4-methylpyrylium salt compound; and the following general formula [A4 ′]:

[A4 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), and a pyrylium compound selected from the group consisting of 2,4,6-triphenylpyrylium salt compounds represented by The nucleic acid probe according to claim 6. As one kind of pyrylium compound or pyrylium-like compound that functions as the electron donor,
The following general formula [A1 ′]:

[A1 ']
(Wherein Y ⁻ represents ClO ₄ ⁻ or I ⁻ ), a 2,4-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -6-methylpyrylium salt compound represented by The nucleic acid probe according to claim 6 or 7, characterized in that Occurs in one of a pyrylium compound or a pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor that is bound to the nucleic acid probe.
Due to the interaction through the double helix structure in the hybrid, the detectable change based on the charge transfer is
The nucleic acid probe according to any one of claims 6 to 8, which is optically detectable. Occurs in one of a pyrylium compound or a pyrylium-like compound that functions as the electron acceptor that is bound to the nucleic acid probe.
The detectable change due to the interaction through the double helix structure in the hybrid is:
The nucleic acid probe according to any one of claims 6 to 9, which can be detected by light irradiation.

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