JP4111368B2 - Antibodies and polyalkylene glycol-conjugated liposomes - Google Patents
Antibodies and polyalkylene glycol-conjugated liposomes Download PDFInfo
- Publication number
- JP4111368B2 JP4111368B2 JP2000613404A JP2000613404A JP4111368B2 JP 4111368 B2 JP4111368 B2 JP 4111368B2 JP 2000613404 A JP2000613404 A JP 2000613404A JP 2000613404 A JP2000613404 A JP 2000613404A JP 4111368 B2 JP4111368 B2 JP 4111368B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- antibody
- mol
- lipid
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
- A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
技術分野
本発明は、リポソームに関する。より具体的には、抗体及び/又はポリアルキレングリコールが結合されており、優れた血中滞留性と治療効果を併せもつリポソームに関する。
背景技術
薬剤を特定部位に大量に輸送する手段として、リポソームに薬剤を封入し、その表面に抗体を結合する方法が提案されている。特に、癌治療の分野において、抗腫瘍剤を封入した抗体結合リポソームの有効性が数多く報告されている(Konno et al.,Cancer Tes.,47,4471,1987;特開昭58−134032号公報)。さらに、リポソームの問題点、すなわち封入物の漏出や、リポソームの凝集及び網内系器官での捕捉などを改善する方法として、リポソームにポリエチレングリコールを結合する方法が提案されている(特開平1−249717号公報、特開平2−149512号公報、Klibanovet,A.L.et al.,FEBS Lett.,268,235,1990)。
特開平4−346918号公報には、薬剤を内包するリポソーム表面のマレイミド基と、各々のチオール基を介して結合する蛋白質及びポリアルキレングリコール部分を含む化合物残基を有することを特徴とする薬剤含有蛋白質結合リポソームが開示されている。このリポソームは、リポソーム表面のマレイミド基に対して、抗体に結合したチオール基とポリアルキレングリコール部分を含む化合物に結合したチオール基とを反応させることによって製造され、従来のリポソームでみられたような肝臓、脾臓などの網内系での非特異的取り込みが抑制されており、選択的な化学療法を達成できるという特徴がある。
上記公報には、リポソームに結合するポリアルキレングリコール部分を含む化合物の量は具体的に説明されていないが、マレイミド基(マレイミド化脂質)1モルに対して0.1モル%から20モル%のチオール化抗体を反応させ、残存したマレイミド基に対して過剰量のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物、好ましくは2倍等量以上を加え抗体結合ポリアルキレングリコール修飾リポソームを得ることが記載されている(0016段落)。また、実施例に具体的に記載されたリポソームの製造方法では、全脂質100mgに対して5μモルのチオール化ポリエチレングリコール部分を含む化合物(換算すると全脂質に対して3.1モル%)を反応させており、脂質に対して大過剰のチオール化ポリエチレングリコール部分を含む化合物を反応させることにより、理論量(リポソーム表面に残存したマレイミド基の量)のポリエチレングリコールで修飾されたリポソームを得ているものと考えられる。
また、上記公報には、リポソームに結合する抗体の量も具体的に説明されていないが、マレイミド基(マレイミド化脂質)1モルに対して0.1モル%から20モル%のチオール化抗体(換算すると全脂質100mgに対して0.3〜60mg)を反応させることが説明されているが、実施例に具体的に記載されたリポソームの製造方法では、全脂質100mgに対して5mg(換算するとマレイミド化脂質に対して1.7モル%)の抗体を結合させており、上記公報には、それ以外の結合量についての具体的開示はない。
発明の開示
本発明者らは、特開平4−346918号公報に記載されたリポソームを基にして、さらに高い血中滞留性を有するとともに、安全性に優れたリポソームを提供すべく鋭意研究を行った。その結果、特開平4−346918号公報に記載されたリポソームにおいて、リポソームを修飾するポリアルキレングリコールの量を理論値(リポソーム表面に残存したマレイミド基の量)よりも低減させたところ、驚くべきことに、修飾量が理論値よりも少ないリポソームにおいても従来公知のリポソームとほぼ同等の血中滞留性が得られることを見出した。
また、本発明者らは、特開平4−346918号公報に記載されたリポソームを基にして、さらに高い治療効果を達成できるリポソームを提供すべく鋭意研究を行った。その結果、特開平4−346918号公報の実施例に記載されたリポソームにおいて、抗体の結合量を低減させたところ、驚くべきことに、上記公報の実施例に記載されたリポソームよりもはるかに高い治療効果を達成できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームにポリアルキレングリコール部分を含む化合物をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該化合物の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質1モルに対して15〜50モル%であるリポソーム;該化合物の結合量がマレイミド化脂質1モルに対して15〜30モル%である該リポソーム;該リポソームが、マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより得られるリポソームである該リポソーム;該化合物がリポソームの表面に結合した該リポソーム;ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである該リポソーム;該化合物が2つのポリエチレングリコール基を有する化合物である該リポソーム;ポリエチレングリコールの分子量が2,000〜7,000ダルトンである該リポソーム;ポリエチレングリコールの分子量が約5,000ダルトンである該リポソーム;リポソームの表面にさらに抗体が結合した該リポソームが提供される。
また、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに抗体をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該抗体の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質1モルに対して0.1〜2モル%であるリポソーム;該抗体の結合量がマレイミド化脂質1モルに対して0.4〜0.7モル%である該リポソーム;該リポソームが、マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより得られるリポソームである該リポソーム;抗体がGAH抗体である該リポソーム;抗体が抗体フラグメントがF(ab´)2である該リポソーム;リポソームの表面にさらにポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合した該リポソームが提供される。
また、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームにポリアルキレングリコール部分を含む化合物及び抗体をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該化合物の結合量及び該抗体の結合量が、リポソームに含まれるマレイミド化脂質1モルに対して15〜30モル%及び0.4〜0.7モル%であるリポソーム;該リポソームが、マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより得られるリポソームである該リポソーム;該化合物がリポソームの表面に結合した該リポソーム;ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである該リポソーム;該化合物が2つのポリエチレングリコール基を有する化合物である該リポソーム;ポリエチレングリコールの分子量が2,000〜7,000ダルトンである該リポソーム;ポリエチレングリコールの分子量が約5,000ダルトンである該リポソーム;該リポソームが、マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより得られるリポソームである該リポソーム;抗体がGAH抗体である該リポソーム;抗体が抗体フラグメントがF(ab´)2である該リポソームが提供される。
また、癌治療薬である該リポソーム;癌種が胃癌又は大腸癌である該癌治療薬:該リポソームを用いた癌治療方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、天然レシチン(例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン)やジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)、ジミリストイルフォスファチジルコリン(DMPC)、ジステアロイルフォスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(DOPC)、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジパルミトイルフォスファチジン酸(DPPA)、ジパルミトイルフォファチジルグリセロール(DPPG)、ジミリストイルフォスファチジン酸(DMPA)等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親媒性ジアルキルジメチルアンモニウム(dialkyl dimethylammnonium amphiphiles)、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等(Liposome Technology,2nd edition,vol.1,141,1993)、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル、ジアルキルポリグリセロールエーテル等(Liposome Technology,2nd edition,vol.1,141,1993)、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等(特表平6−508831号公報)などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの脂質は単独で、又は2種以上を組み合わせて用いることができ、さらにコレステロール等の非極性物質、DC−chol(3β−[N−(N’,N’−dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol)等のコレステロール誘導体と組み合わせ用いてもよい。
本発明のリポソームにおいては、ポリアルキレングリコールを含む化合物及び必要に応じて抗体などの蛋白質の結合のために、脂質成分の一部として、例えばマレイミド化フォスファチジルエタノールアミンなどのマレイミド化された脂質(本明細書において「マレイミド化脂質」と呼ぶ。)を用いる必要がある。全脂質に対するマレイミド化脂質の割合は、通常、約0.5〜10モル%である。
マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンの例で説明すると、この化合物はアミノ基に反応性を有するマレイミド含有化合物とフォスファチジルエタノールアミン(PE)のアミノ基との反応により得られる。該マレイミド含有化合物はカプロイル基、ベンゾイル基、フェニルブチリル基等の残基を含んでいてもよく、例えば、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド、N−サクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート、N−サクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)プロピオネート、N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド等を挙げることができる。PEとしてはジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン(DOPE)等のフォスファチジルエタノールアミン類が使用できるが、好ましくはDPPEである。脂質成分として、さらにステアリルアミン、ジセチルフォスフェートなどの荷電性物質を含んでいてもよい。また、本発明のリポソームは、ウイルスの一部または全部を組み込んだ融合リポソーム、例えばセンダイウイルスとリポソームを融合したリポソームであってもよい。
典型的なリポソームとしては、例えば、フォスファチジルコリン1モルに対して、コレステロールを0.3〜1モル、好ましくは0.4〜0.6モル、マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンを0.01〜0.2モル、好ましくは0.02〜0.1モル、さらに好ましくは0.02〜0.05モルを含む脂質組成物を用いることができ、フォスファチジン酸を加える場合には0.4モル以下、好ましくは0.15モル以下の脂質組成物を用いることができる。
本発明のリポソームの製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。また、本発明のリポソームの形態も特に限定されず、いかなる形態であってもよい。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え、機械的振盪を加えて形成するマルチラメラリポソーム(MLV);超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラメラリポソーム(SUV);界面活性剤除去法、逆相蒸発法(リポソーム、砂本順三ら、南江堂、1998)、MLVを均一孔径を有するメンブランから加圧により押し出すイクストゥルージョン法等によって得られるラージユニラメラリポソーム(LUV)のいずれであってもよい(Liposome Technology 2nd edition vol.1,141,1993)。リポソームの粒径は、例えば、300nm以下、好ましくは30から200nm程度である。
本発明のリポソームには医薬を封入することができる。医薬の種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)等の抗腫瘍剤;チモロール等のアドレナリン遮断剤;クロニジン等の高血圧剤;プロカインアミド等の制吐剤;クロロキニーネ等の抗マラリア剤;並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体;レニウム186、ヨード131、イットリウム90等の放射性物質;リシンA、ジフテリアトキシン、TNFなどの生理活性物質及びそれらをコードするDNAなどを用いることができる。もっとも、本発明のリポソームに封入可能な医薬はこれらに限定されることはない。
上記医薬の薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との塩、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、及びそれらの誘導体との塩が好ましい。本発明のリポソームに封入する医薬としては、抗腫瘍剤が好ましい。本発明のリポソームには、治療用の医薬のほか、診断用の医薬を封入することもできる。診断用の医薬としては、放射性元素、例えばインジウム、テクネシューム等のイメージング薬剤;ヨード、ガドリニウム等の造影剤;ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素;ユーロピウム誘導体などの蛍光体;N−メチルアクリジウム誘導体等の発光体などを挙げることができるが、これらに限定されるこはない。
これらの医薬をリポソームに導入する方法は特に限定されず、当業者に利用可能は方法はいずれも適用可能である。例えば、リポソーム形成時に水溶液として添加してリポソーム内部に封入してもよい。また、リポソーム形成後、ベジクル内外にpH勾配などの濃度勾配を形成し、このポテンシャルを駆動力としてイオン化可能な薬剤をリポソーム内部に取り込ませる方法(Cancer Res.,49,5922,1989;BBA,455,269,1976)などを用いることができる。
本発明のリポソームは、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物で修飾されており、さらに特定量の抗体で修飾されていることを特徴としている。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールなどを用いることができるが、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が2,000〜7,000ダルトン程度のもの、好ましくは約5,000ダルトン程度のものを用いることができる。
本発明のリポソームは、上記ポリアルキレングリコール部分を含む化合物がリポソーム表面のマレイミド化脂質にチオエーテル結合を介して結合した形態を有しているが、通常、ポリアルキレングリコールを含む化合物にチオール基を導入した後、この化合物をリポソームのマレイミド基と反応させることにより、ポリアルキレングリコールを結合させたリポソームを製造することができる。ポリアルキレングリコールを含む化合物としては、通常、ポリエチレングリコール基を有し、かつ末端をチオール化可能な化合物又は末端にメルカプト基を有する化合物を挙げることができる。具体的には、例えば、ポリアルキレングリコール基をトリアジンに結合した化合物、さらに該トリアジンがアミノ酸などにより置換された化合物を挙げることができる。この際、ポリアルキレングリコール基を2つ有する化合物(2本鎖)であってもよい。
ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いる場合には、例えば、モノメトキシポリオキシエチレンアミンと各種チオールカルボン酸とを脱水縮合する方法;モノメトキシポリオキシエチレンアミンにSPDPでピリジルジチオプロピオニル基を導入し、さらに還元する方法;モノメトキシポリオキシエチレンアミンにイミノチオランによりチオール基を導入する方法;モノメトキシポリオキシエチレンカルボン酸の活性エステルと各種チオールアミンを結合させる方法;ポリエチレングリコールトリアジン誘導体をチオールアミンと縮合する方法などを利用することができる。さらに具体的には、2,4−ビス(ポチエチレングリコール)−6−クロロ−s−トリアジン(活性化PEG2(生化学工業株式会社製))をシスチンと反応させ、さらに還元してシステイン結合活性化PEG2を得ることができる。
本発明のリポソームにおけるポリアルキレングリコール部分を含む化合物の導入量は特に限定されず、残存マレイミド化脂質に対して過剰に反応させてもよいが、ポリアルキレングリコールの好ましい導入量としては、全脂質に対して0.28〜0.90モル%程度、より好ましくは0.28〜0.56モル%程度、マレイミド化脂質に対しては15〜50モル%程度、より好ましくは15〜30モル%程度であり、DPPCに対して0.44〜1.45モル%程度、より好ましくは0.44〜0.89モル%程度である。
本発明のリポソームは蛋白質、すなわち抗体で修飾されていてもよい。蛋白質としては、例えば、抗体、FGF、EGFなどの種々の生理活性物質を用いることができるが、好ましくは抗体を用いることができる。抗体としては、抗体自体又は抗体フラグメント、又は抗体誘導体などを用いることができるが、抗体としては、抗体自体、又は抗体フラグメントのいずれを用いてもよい。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体自体及び抗体フラグメントのほか、誘導化又は修飾した抗体などを包含しており、最も広義に解釈しなければならない。また、抗体としては、治療対象となる組織、細胞、細菌、ウイルス等と反応性を有する抗体を利用することができる。例えば、各種動物のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト−マウスのキメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体などを用いることができる。異種動物の蛋白質ではない点から、ヒトモノクローナル抗体がより好ましい。抗体としては、特開平5−304987号公報に記載されたヒトモノクローナル抗体(GAH抗体)を好適に用いることができ、例えば、上記公報の例7に具体的に示された方法に従って、GAH抗体で修飾したリポソームを製造することができる。特開平5−304987号公報に記載のとおり、GAH抗体は、胃癌及び大腸癌に反応性を有するので、本願のリポソームは胃癌や大腸癌等の癌治療薬として有用である。抗体の種類と封入すべき医薬との組み合わせを適宜選択することにより、治療効果に優れたリポソームを製造することができる。
抗体にチオール基を付与した後、リポソームのマレイミド基と該チオール化抗体とを反応させることによって、リポソームを抗体で修飾することができる。抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対して、蛋白質のチオール化に通常用いるN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピネート(SPDP)(Carlsson,J.,et al.,Biochem.J.,173,723,1978)やイミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート(Traut,R.R.,et al.,Biochemistry,12,3266,1973)等の化合物を反応させる方法により行なうことができる。また、抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基として反応させることもでき、抗体活性の維持の点から内在性チオール基を用いる方法は好適である。
例えば、IgGを用いる場合はペプシン等の酵素でF(ab´)2化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られるFab´に生じるチオール基をリポソームとの結合反応に利用することができる(Martin,F.J.,et al.,Biochemistry,20,4229,1981)。IgMの場合には、ミラーらの方法(J.Biol.Chem.,257,286,1965)に準じ、緩和な条件でJ鎖を還元して得られるIgMsのFc部分のチオール基をリポソームとの結合に利用すればよい。特開平5−304987号に記載されたGAH抗体を用いる場合には、F(ab´)2を用いることが好適である。チオール基が付与された抗体などの蛋白質とマレイミド基を含むリポソームとの結合は、中性の緩衝液(pH6.5〜7.5)中で2〜16時間反応させることにより達成される。
本願の最も好ましい実施態様は、抗体及びポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合されたリポソームであり、これを製造するためには、まず、マレイミド基を有するリポソームに対して中性の緩衝液中でチオール化抗体を反応させる。例えば、リポソームを構成する全脂質100mgあたり0.5〜5.3mg、0.5〜4.5mg、好ましくは1.2〜2mgの抗体が結合するように、すなわちチオール化抗体をマレイミド基(マレイミド化脂質)1モルに対して、0.1モル%(具体的には0.17モル%)から約2モル%程度(具体的には1.5モル%、1.8モル%)、好ましくは0.4〜0.7モル%反応させればよい。ついで、残存しているマレイミド基に対してチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を反応させ、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合したリポソームを製造することができ、具体的には、マレイミド化脂質基1モルに対して、15モル%から50モル%、好ましくは15〜30モル%(全脂質に対して0.28〜0.90モル%、好ましくは0.28〜0.56モル%、DPPCを用いる場合には、DPPCに対して0.44〜1.45モル%、好ましくは0.44〜0.89モル%)のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を加え、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合したリポソームを製造することができる。
本発明のリポソームの好ましい態様により、医薬、好ましくはドキソルビシンなどの抗腫瘍剤が封入されており、ポリエチレングリコール部分を含む化合物と抗腫瘍抗体とが結合したリポソームが提供される。上記の医薬含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法(特表平2−502348号公報)、安定化剤を加え液剤として用いる方法(特開昭64−9331号公報)、凍結乾燥法(特開昭64−9931号公報)等により製剤化することができ、癌などの各種疾患の治療のために、血管内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の医薬の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として50mg/kg以下、好ましくは10mg/kg以下、より好ましくは5mg/kg以下で用いることができる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。
実施例1
(1)リポソームの調製及び薬物の封入
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)/コレステロール/ε−マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(MC−DPPE)(18/10/0.5モル比)からなる脂質混合物(1.6g)に0.3Mクエン酸緩衝液(pH4.0)16mLを添加し、水和した後、液体窒素と60℃の温浴で凍結融解を3回行ないマルチラメラリポソームを作製した。さらに押出し法により0.1μmに整粒した。このリポソーム溶液に1MNaOHを滴下して中和した後、60℃に加温し、20mg/mLのドキソルビシン(DXR、別名アドリアマイシン、ADM)水溶液を脂質100mgあたり0.5mL添加して封入した。
(2)抗体のチオール化及びリポソームへの結合(抗体結合リポソームの作製)
1mMEDTAを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に溶解したGAH抗体(特開平4−346918号公報、特開平5−304987号公報に記載のもの、胃癌及び大腸癌反応性モノクローナル抗体、3mg/mL、14.4mL)に3mg/mLのイミノチオランを92.4μL添加し、37℃で1時間反応させてチオール基を導入した(Biochemistry,12,3206,1973参照)。反応液をゲルろ過し、緩衝液を1mMEDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に交換した後、ドキソルビシン1mgあたり0.21mgのチオール化抗体(1.7mg/mL)を加えて25℃で1時間反応させ、リポソームに抗体を結合させた。
(3)ポリエチレングリコールのチオール化及びリポソームへの結合(PEG結合リポソームの作製)
特開平4−346918号公報の方法に従って、2,4−ビス(ポリエチレングリコール)−6−クロロ−s−トリアジンにシスチンを反応後、還元してチオール基を有するポリエチレングリコール(2本鎖型のPEG)を調製した。すなわち、シスチンを用いてチオール化PEG(30mg/mL、PEG分子量2000の2本鎖型(PEG2000)又はPEG分子量5000の2本鎖型(PEG5000))を製造し、上記の反応液1mLあたり0.18mL添加して、10℃で結合反応を行なった。反応開始後5〜240分後にサンプリングしてセファロースCL6Bカラムにアプライし、未反応のチオール化PEGを除いて反応を停止し、PEG量の異なるイムノリポソームを作製した。PEG非結合イムノリポソームは、PEG結合操作をしていないイムノリポソームを同様にセファロースCL6Bでゲルろ過することで作製した。
(4)抗体及びPEG結合リポソームの作製
上記(2)で調製した抗体結合リポソームに対し、上記(3)中のチオール化PEGを反応させることで抗体及びPEGの結合したリポソームを作製した。
(5)結合PEG量の定量
イムノリポソームに結合したPEG量はHPLC法により測定した。終濃度2%SDS溶液としたイムノリポソーム溶液を60℃で30分間加温し、リポソームを完全に可溶化した。GPCカラム(東ソー株式会社製、2000SWXL)を用い、pH7.5の緩衝液(25mMNaH2PO4、0.1%SDS、70%メタノール)で溶離してPEGを分離し、215nmで検出してエリア値から定量した。
(6)DXR定量
サンプル50μLを50%プロパノール/0.5M塩酸950μLに添加し、500nmの吸光度を測定してDXRを測定した。
(7)結合抗体量の定量
PEG量の定量と同様にして、GPCカラム(東ソー株式会社製、3000SWXL)を用い、pH7.0の緩衝液(25mMNaH2PO4、200mMNa2SO4、0.1%SDS)で溶離して抗体を分離し、抗体ピークの280nmで検出されるエリア値から定量した。
(8)脂質量の定量
脂質(DPPC及びコレステロールの総量)はHPLC法により定量した。L−カラムODS(化学品検査協会)4.6mm×250mmに負荷し、テトラヒドロフラン(THF)/アセトニトリル/水(2:1:1、V/V/V、0.1%トリフルオロ酢酸)で溶離した。215nmで検出を行ない、DPPCに由来するピーク及びコレステロールに由来するピークのエリア値から定量した。脂質定量用サンプルはリポソームサンプル1容に対して上記溶離液9容を加えて調製した。
実施例2:PEG結合リポソームの作製(体内動態試験)
実施例1の方法に従って、リポソームを構成する全脂質1モルに対して0〜約0.7モル%、DPPC1モルに対して0〜約1モル%、マレイミド化脂質1モルに対して0〜約40モル%のPEGを導入したリポソーム(DXR封入、抗体非結合、PEG2000又はPEG5000 結合)を調製した。
BALB/cAjcl雄性マウス(6週齢)を実験に使用した。各リポソームについて1群4匹とし、ブランクとして非処理マウス1匹を実験に供した。DXR量として2mg/kgとなるように尾静脈内にリポソームを投与した。投与16時間後、マウスにネンブタール注射液(大日本製薬株式会社製)を腹腔内投与し、麻酔下に開胸して採血し、血漿を分離してDXRの分析に供した。
血漿100μLに0.3M塩酸−50%エタノール(塩酸エタノール)1mLを加え、60℃で10分間加熱してDXRを抽出し、4℃に冷却して15000rpmで10分間遠心して上清を採取した。この試料を塩酸エタノールで4倍に希釈し、励起波長490nm、蛍光波長590nmの蛍光を測定した。塩酸エタノールで希釈した既知濃度のDXRを用いて検量線を作製し、血漿中のDXRを定量した。なお、マウス血漿からのDXR回収率は、DXR換算3.75μg/mL〜30μg/mLの範囲において95〜98%であった(参考文献:Cancer Res.,47,4471,1989)。
各リポソーム群についての血漿中DXR濃度の平均値(±標準偏差)を第1図に示す。リポソームの血中滞留性の指標となる血漿中DXR濃度は、PEG5000及びPEG2000ともに、リポソームに結合したPEG量に依存して増加することが確認された。
実施例3:PEG及び抗体結合リポソームの作製(体内動態試験)
実施例1の方法に従って、リポソーム全脂質に対して0〜0.6モル%、DPPCに対して0〜約1モル%、マレイミド化DPPEに対して0〜約30モル%のPEGを導入したリポソーム(DXR封入、抗体結合、PEG5000 結合)を調製した。
実施例2と同様にして血漿中のDXRを定量した。各リポソーム群についての血漿中DXR濃度の平均値(±標準偏差)を第2図に示す。血漿中DXR濃度は、リポソームに結合したPEG量に依存して増加したが、全脂質に対して約0.3モル%、DPPCに対して約0.5モル%、マレイミド化DPPEに対して約17モル%の導入量でプラトーに達することが確認できた。なお、リポソームからDXRが漏れた場合には、漏出したDXRは血中から速やかに焼失することが確認されているので、実施例2及3の結果に示された血漿中DXR濃度は、リポソームに封入されたDXRに由来するものであると考えられる。
実施例4:PEG及び抗体結合リポソームの作製(薬効試験、動態試験)
実施例1の方法に従って、リポソーム全脂質100mgに対して抗体を0.5、1.2、2.0、4.5、5.3、及び11.4mg結合させた下記のリポソーム2〜7(DXR封入、PEG5000 結合)を調製した。同様にして、抗体を結合していないリポソーム1を製造した。なお、PEG結合リポソームでは、PEG結合量範囲(>4.4mg/100mg脂質)において各リポソームの血中滞留性は同等であるため、以下に示す実験結果は抗体結合量に依存する。
胃癌細胞株MKN45をヌードマウスの背側2ヶ所(1×106細胞/1ヶ所)に皮下移植した。「薬効試験」においては、腫瘍の長径、短径の測定が可能な十分な大きさに達した時点に、抗体結合量の異なるリポソームの投与を開始した。リポソームの投与量は、1回あたり5.0mg/kg(DXR量換算)とし、陽性対照としてDXR投与群(5.0mg/kg)を設け、コントロール群には生理食塩水を投与した。全群につき、投与開始日(0日)、3日目、及び6日目に静脈内投与を行なった。
経時的に腫瘍径(長径、短径)を測定し、推定腫瘍重量(短径2×長径/2)を算定した。3回の投与終了後、19日目まで測定を継続した。各腫瘍の投与開始日の推定腫瘍重量を1.0として腫瘍増殖度を算出し、コントロール群、DXR投与群に対する各処置群の腫瘍増殖抑制効果を評価した。最終測定日(19日目)の各処置群について%T/C値(処置群の腫瘍増殖度/コントロール群の腫瘍増殖度×100)を算定し、各サンプルの抗体結合量との関係から、腫瘍増殖抑制効果が最大となる抗体結合量(最適値)を求めた。
その結果、コントロール群に対しては全ての処置群に有意な腫瘍増殖抑制効果が確認され、DXR投与群に対しては、第3図に示すように、結合抗体量が0.5〜5.3mg/100mg全脂質の範囲のサンプルに有意な腫瘍増殖抑制性効果が認められ、抗体結合量として2mg/100mg全脂質付近をピークとした腫瘍増殖抑制活性が認められた。
「動態試験」においては、マウスに抗体結合量の異なる上記リポソーム4〜7(2.0、4.5、5.3、及び11.4mg/100mg全脂質)を静脈内投与し(一群2〜3匹、1.0mg/kg、DXR量換算)、投与4時間後に各個体から血漿を採取した。実施例2と同様に蛍光測定法により血漿中のDXR量を測定した。各サンプル投与後の血漿中のDXR量を比較し、抗体結合量とDXR封入抗体結合リポソームの血中滞留性との関係を求めた。動態試験において抗体結合量2mg/100mg脂質以上の各サンプルについて、各サンプル投与後の血漿中DXR量と各サンプルの抗体結合量との関係を求めた(第4図)。その結果、抗体結合量が2mg/100mg脂質を上回ると、抗体結合量に依存して血中滞留性が低下することが認められた。
産業上の利用可能性
本発明のリポソームは、優れた血中滞留性を有しており、しかもポリアルキレングリコールの結合量が従来のリポソームに比べて少ないという特徴がある。したがって、本発明のリポソームは、ポリアルキレングリコールに起因する副作用を回避することができ、また、工業生産性の観点からも有利である。さらに、本発明のリポソームは、従来の抗体結合リポソームに比べて、優れた治療効果を達成できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
第1図は、リポソーム(DXR封入、抗体非結合)に結合したポリエチレングリコール量と血漿中DXR濃度との関係を示した図である。横軸はPEG量(DPPC1モルに対するモル%)を示す。全脂質に対するモル%及びマレイミド化DPPE1モルに対するモル%の換算値は、それぞれ0.16及び8.9(0.25);0.32及び17.8(0.5);0.48及び26.7(0.75);0.64及び35.6(1);並びに0.81及び45(1.25)である(カッコ内はDPPC1モルに対するモル%を示す)。
第2図は、リポソーム(DXR封入、抗体結合)に結合したポリエチレングリコール量と血漿中DXR濃度との関係を示した図である。横軸はPEG量(100mg脂質に対するPEG量(mg))を示す。DPPC1モルに対するモル%、全脂質に対するモル%、及びマレイミド化DPPE1モルに対するモル%の換算値は、それぞれ0.25、0.16、及び8(2.5);0.50、0.31、及び17(5);0.75、0.47、及び26(7.5);並びに1.0、0.62、及び34(10)である(カッコ内は100mg脂質に対するPEG量(mg)を示す)。
第3図は、リポソーム(DXR封入)に結合した抗体量と腫瘍抑制効果(%T/C)との関係を示した図である。
第4図は、抗体結合量を2mg/100mg脂質以上とした各サンプルについて血漿中DXR量(血中滞留性)と抗体結合量との関係を示した図である。Technical field
The present invention relates to liposomes. More specifically, the present invention relates to a liposome to which an antibody and / or polyalkylene glycol is bound, and has both excellent blood retention and therapeutic effect.
Background art
As a means for transporting a large amount of a drug to a specific site, a method of encapsulating the drug in a liposome and binding an antibody to the surface has been proposed. In particular, in the field of cancer treatment, the effectiveness of antibody-bound liposomes in which an antitumor agent is encapsulated has been reported (Konno et al., Cancer Tes., 47, 4471, 1987; Japanese Patent Laid-Open No. 58-134032). ). Further, as a method for improving the problems of liposomes, that is, leakage of inclusions, aggregation of liposomes and trapping in reticuloendothelial organs, a method of binding polyethylene glycol to liposomes has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 1-2001). 249717, JP-A-2-149512, Klibanovet, AL et al., FEBS Lett., 268, 235, 1990).
JP-A-4-346918 has a drug residue characterized by having a compound residue containing a maleimide group on the surface of a liposome encapsulating a drug, a protein bonded via each thiol group, and a polyalkylene glycol moiety. Protein-bound liposomes are disclosed. This liposome is produced by reacting a maleimide group on the liposome surface with a thiol group bound to an antibody and a thiol group bound to a compound containing a polyalkylene glycol moiety, as seen in conventional liposomes. Nonspecific uptake in the reticuloendothelial system such as the liver and spleen is suppressed, and selective chemotherapy can be achieved.
The above publication does not specifically describe the amount of the compound containing a polyalkylene glycol moiety bound to the liposome, but it is 0.1 mol% to 20 mol% with respect to 1 mol of maleimide group (maleimidated lipid). It is described that a compound containing an excessive amount of a thiolated polyalkylene glycol moiety with respect to the remaining maleimide group is reacted with a thiolated antibody to obtain an antibody-bound polyalkylene glycol-modified liposome by adding at least twice equivalent amount. (Paragraph 0016). In addition, in the method for producing liposomes specifically described in the examples, a compound containing 5 μmol of a thiolated polyethylene glycol moiety (100 mol in terms of total lipid in terms of total lipid) is reacted with 100 mg of total lipid. By reacting a compound containing a large excess of a thiolated polyethylene glycol moiety with the lipid, a liposome modified with a theoretical amount (the amount of maleimide groups remaining on the liposome surface) of polyethylene glycol is obtained. It is considered a thing.
Moreover, the amount of the antibody binding to the liposome is not specifically described in the above publication, but 0.1 mol% to 20 mol% of a thiolated antibody (moleimide group (maleimidated lipid) per mol) In terms of conversion, it is explained that 0.3 to 60 mg) is reacted with respect to 100 mg of total lipid. However, in the method for producing liposomes specifically described in Examples, 5 mg (when converted) is calculated with respect to 100 mg of total lipid. 1.7 mol% of antibody) is bound to maleimidated lipid, and the above publication does not specifically disclose the amount of other binding.
Disclosure of the invention
Based on the liposome described in JP-A-4-346918, the present inventors have intensively studied to provide a liposome having higher blood retention and excellent safety. As a result, in the liposome described in JP-A-4-346918, it was surprising that the amount of polyalkylene glycol for modifying the liposome was reduced from the theoretical value (the amount of maleimide groups remaining on the liposome surface). Furthermore, it was found that even in liposomes with a modified amount less than the theoretical value, blood retention similar to that of conventionally known liposomes can be obtained.
In addition, the present inventors have conducted intensive research to provide liposomes that can achieve higher therapeutic effects based on the liposomes described in JP-A-4-346918. As a result, in the liposome described in the example of JP-A-4-346918, when the amount of bound antibody was reduced, it was surprisingly much higher than the liposome described in the example of the above publication. It has been found that a therapeutic effect can be achieved. The present invention has been completed based on these findings.
That is, the present invention relates to a liposome in which a compound containing a polyalkylene glycol moiety is bound to a liposome in which a lipid terminal is partially maleimidated via a thioether group, and the amount of the compound bound is contained in the liposome. A liposome having a binding amount of 15 to 50 mol% with respect to 1 mol; the liposome having a binding amount of the compound of 15 to 30 mol% with respect to 1 mol of maleimidated lipid; and the maleimide group of the maleimidated lipid; The liposome which is a liposome obtained by reacting a compound containing a polyalkylene glycol moiety to which a thiol group is added; the liposome in which the compound is bound to the surface of the liposome; the liposome in which the polyalkylene glycol is polyethylene glycol; The compound is two polyethylene glycols The liposome having a molecular group; the liposome having a molecular weight of polyethylene glycol of 2,000 to 7,000 daltons; the liposome having a molecular weight of polyethylene glycol of about 5,000 daltons; and an antibody on the surface of the liposome. Bound liposomes are provided.
In addition, a liposome in which an antibody is bound via a thioether group to a liposome in which part of the lipid end is maleimidated, and the amount of the antibody bound is 0.1 to 1 mole of maleimide lipid contained in the liposome. 2 mol% liposome; the amount of the antibody bound to 0.4 to 0.7 mol% with respect to 1 mol of maleimidated lipid; the liposome containing a maleimide group-containing liposome and antibody-derived sulfur The liposome which is a liposome obtained by reacting with a group to form a thioether bond; the liposome wherein the antibody is a GAH antibody; the antibody is an antibody fragment of F (ab ′) 2 The liposome wherein the compound further comprising a polyalkylene glycol moiety is bound to the surface of the liposome.
Further, a liposome in which a compound containing a polyalkylene glycol moiety and an antibody are bonded via a thioether group to a liposome in which a part of a lipid end is maleimidized, wherein the binding amount of the compound and the binding amount of the antibody Liposomes containing 15-30 mol% and 0.4-0.7 mol% with respect to 1 mol of maleimidated lipid contained in the above; the polyalkylene glycol in which the liposome is added with maleimide groups and thiol groups of maleimidated lipids The liposome, which is a liposome obtained by reacting a compound containing a moiety; the liposome in which the compound is bound to the surface of the liposome; the liposome in which the polyalkylene glycol is polyethylene glycol; the compound having two polyethylene glycol groups The liposome which is a compound having poly; The liposome having a molecular weight of tylene glycol of 2,000 to 7,000 daltons; the liposome having a molecular weight of polyethylene glycol of about 5,000 daltons; a liposome having a maleimide group and a sulfur-containing group derived from an antibody; The liposome, which is a liposome obtained by reacting thioether to form a thioether bond; the liposome in which the antibody is a GAH antibody; the antibody in which the antibody fragment is F (ab ′) 2 The liposome is provided.
Also provided is a method for cancer treatment using the liposome, which is a cancer therapeutic agent; and the cancer therapeutic agent whose cancer type is gastric cancer or colorectal cancer.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Examples of the lipid constituting the liposome of the present invention include natural lecithin (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), distearoylphosphatidyl. Choline (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), Phospholipids such as dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA), dipalmitoyl phosphatidylglycerol (DPPG), dimyristoyl phosphatidic acid (DMPA), glycosphingolipids, glyceroglycolipids Glycolipids, fatty acids, amphiphilic dialkyldimethylammonium amphiphiles, polyglycerol alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl ethers (Liposome Technology, 2nd edition, vol. 1, 141, 1993), alkyl glycosides, alkyls Amphiphilic block co-polymers such as methyl glucamide, alkyl sucrose ester, dialkyl polyoxyethylene ether, dialkyl polyglycerol ether, etc. (Liposome Technology, 2nd edition, vol. 1, 141, 1993), polyoxyethylene-polylactic acid, etc. Coalescence etc. (Japanese National Publication No. 6-508831) etc. can be mentioned. It is not limited to these examples. These lipids can be used singly or in combination of two or more, and nonpolar substances such as cholesterol, DC-chol (3β- [N- (N ′, N′-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol), etc. It may be used in combination with other cholesterol derivatives.
In the liposome of the present invention, a maleimide lipid such as maleimidated phosphatidylethanolamine is used as part of the lipid component for binding of a compound containing polyalkylene glycol and, if necessary, a protein such as an antibody. (Referred to herein as “maleimidated lipids”). The ratio of maleimidized lipid to total lipid is usually about 0.5 to 10 mol%.
In the example of maleimidated phosphatidylethanolamine, this compound is obtained by the reaction of a maleimide-containing compound having reactivity with an amino group and the amino group of phosphatidylethanolamine (PE). The maleimide-containing compound may contain residues such as a caproyl group, a benzoyl group, and a phenylbutyryl group. For example, N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide, N-succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) ) Butyrate, N-succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) propionate, N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide and the like. As PE, phosphatidylethanolamines such as dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), dimyristoyl phosphatidylethanolamine (DMPE) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) can be used, but preferably Is DPPE. The lipid component may further contain a charged substance such as stearylamine and dicetyl phosphate. Further, the liposome of the present invention may be a fused liposome incorporating a part or all of the virus, for example, a liposome fused with Sendai virus and liposome.
Typical liposomes include, for example, 0.3 to 1 mol of cholesterol, preferably 0.4 to 0.6 mol, and 0.01 to 0.1 mol of maleimidated phosphatidylethanolamine per mol of phosphatidylcholine. A lipid composition containing -0.2 mol, preferably 0.02-0.1 mol, more preferably 0.02-0.05 mol can be used, and when adding phosphatidic acid, A lipid composition of 4 mol or less, preferably 0.15 mol or less can be used.
The method for producing the liposome of the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be applied. Moreover, the form of the liposome of the present invention is not particularly limited, and may be any form. For example, a multilamellar liposome (MLV) formed by adding an aqueous solution to a lipid thin film attached to a glass wall and applying mechanical shaking; small unilamellar liposomes obtained by sonication, ethanol injection, French press ( SUV); large unilamellar obtained by surfactant removal method, reverse phase evaporation method (liposome, Junzo Sunamoto et al., Nankodo, 1998), extrusion method of extruding MLV from a membrane having a uniform pore size, etc. It may be any of liposomes (LUV) (Liposome Technology 2nd edition vol. 1, 141, 1993). The particle size of the liposome is, for example, 300 nm or less, preferably about 30 to 200 nm.
A medicine can be encapsulated in the liposome of the present invention. The type of the medicine is not particularly limited, but for example, an antitumor agent such as doxorubicin (adriamycin), daunomycin, vinblastine, cisplatin, 5-fluorouracil (5-FU); an adrenergic blocker such as timolol; a hypertensive agent such as clonidine; procaine Antiemetics such as amides; antimalarial agents such as chloroquinine; and pharmaceutically acceptable salts and derivatives thereof; radioactive materials such as rhenium 186, iodine 131, yttrium 90; physiology such as ricin A, diphtheria toxin, TNF Active substances and DNA encoding them can be used. But the medicine which can be enclosed with the liposome of this invention is not limited to these.
As the pharmaceutically acceptable salt of the above-mentioned pharmaceutical, a salt with a pharmaceutically acceptable polyvalent anionic substance, for example, a salt with citrate, tartrate, glutamate, and derivatives thereof is preferable. . An antitumor agent is preferable as the pharmaceutical encapsulated in the liposome of the present invention. In addition to therapeutic drugs, diagnostic drugs can also be encapsulated in the liposomes of the present invention. Diagnostic drugs include radioactive elements, for example, imaging agents such as indium and techneum; contrast agents such as iodine and gadolinium; enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and β-galactosidase; phosphors such as europium derivatives; N- Examples thereof include, but are not limited to, a phosphor such as a methyl acridium derivative.
The method for introducing these drugs into the liposome is not particularly limited, and any method that can be used by those skilled in the art is applicable. For example, it may be added as an aqueous solution during liposome formation and encapsulated inside the liposome. In addition, after liposome formation, a concentration gradient such as a pH gradient is formed inside and outside the vesicle, and an ionizable drug is incorporated into the liposome using this potential as a driving force (Cancer Res., 49, 5922, 1989; BBA, 455). , 269, 1976).
The liposome of the present invention is modified with a compound containing a polyalkylene glycol moiety and further modified with a specific amount of antibody. As the polyalkylene glycol, for example, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol and the like can be used, but polyethylene glycol is preferably used. When polyethylene glycol is used, one having a molecular weight of about 2,000 to 7,000 daltons, preferably about 5,000 daltons can be used.
The liposome of the present invention has a form in which the compound containing the polyalkylene glycol moiety is bound to the maleimidated lipid on the surface of the liposome through a thioether bond. Usually, a thiol group is introduced into the compound containing the polyalkylene glycol. Thereafter, this compound is reacted with the maleimide group of the liposome to produce a liposome having a polyalkylene glycol bound thereto. Examples of the compound containing polyalkylene glycol usually include a compound having a polyethylene glycol group and capable of thiolation at the terminal or a compound having a mercapto group at the terminal. Specifically, for example, a compound in which a polyalkylene glycol group is bonded to a triazine, and a compound in which the triazine is substituted with an amino acid or the like can be given. In this case, the compound (double chain) which has two polyalkylene glycol groups may be sufficient.
When polyethylene glycol is used as the polyalkylene glycol, for example, a method of dehydrating condensation of monomethoxypolyoxyethyleneamine and various thiolcarboxylic acids; a pyridyldithiopropionyl group is introduced into monomethoxypolyoxyethyleneamine by SPDP; Method of reducing; Method of introducing thiol group into monomethoxypolyoxyethyleneamine by iminothiolane; Method of binding active ester of monomethoxypolyoxyethylenecarboxylic acid and various thiolamines; Method of condensing polyethylene glycol triazine derivative with thiolamine Etc. can be used. More specifically, 2,4-bis (potiethylene glycol) -6-chloro-s-triazine (activated PEG2 (manufactured by Seikagaku Corporation)) is reacted with cystine and further reduced to give cysteine binding activity. PEG2 can be obtained.
The amount of the compound containing the polyalkylene glycol moiety in the liposome of the present invention is not particularly limited, and may be excessively reacted with the remaining maleimidated lipid, but the preferable amount of polyalkylene glycol to be introduced is the total lipid. On the other hand, about 0.28 to 0.90 mol%, more preferably about 0.28 to 0.56 mol%, and about 15 to 50 mol%, more preferably about 15 to 30 mol%, for maleimidated lipid. And about 0.44 to 1.45 mol%, more preferably about 0.44 to 0.89 mol% with respect to DPPC.
The liposome of the present invention may be modified with a protein, that is, an antibody. As the protein, for example, various physiologically active substances such as antibodies, FGF and EGF can be used, and antibodies can be preferably used. As the antibody, an antibody itself, an antibody fragment, an antibody derivative, or the like can be used. As the antibody, either the antibody itself or an antibody fragment may be used. As used herein, the term “antibody” includes the antibody itself and antibody fragments, as well as derivatized or modified antibodies and the like, and should be interpreted in the broadest sense. As the antibody, an antibody reactive with a tissue, cell, bacteria, virus or the like to be treated can be used. For example, polyclonal antibodies from various animals, mouse monoclonal antibodies, human-mouse chimeric antibodies, human monoclonal antibodies and the like can be used. A human monoclonal antibody is more preferable because it is not a protein of a heterologous animal. As the antibody, a human monoclonal antibody (GAH antibody) described in JP-A-5-304987 can be suitably used. For example, according to the method specifically shown in Example 7 of the above publication, Modified liposomes can be produced. As described in JP-A-5-304987, the GAH antibody has reactivity with gastric cancer and colorectal cancer, and therefore the liposome of the present application is useful as a cancer therapeutic agent for gastric cancer and colorectal cancer. By appropriately selecting the combination of the type of antibody and the medicine to be encapsulated, a liposome having an excellent therapeutic effect can be produced.
After imparting a thiol group to the antibody, the liposome can be modified with the antibody by reacting the maleimide group of the liposome with the thiolated antibody. Giving a thiol group to an antibody is N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propinate (SPDP) (Carlsson, J., et al., Commonly used for protein thiolation with respect to the amino group of the antibody. Biochem. J., 173, 723, 1978), iminothiolane, mercaptoalkylimidates (Traut, RR, et al., Biochemistry, 12, 3266, 1973) and the like. . Moreover, the endogenous dithiol group of an antibody can be reduced and reacted as a thiol group, and a method using an endogenous thiol group is preferable from the viewpoint of maintaining antibody activity.
For example, when IgG is used, F (ab ′) with an enzyme such as pepsin 2 Furthermore, the thiol group generated in Fab ′ obtained by reduction with dithiothreitol or the like can be used for a binding reaction with a liposome (Martin, FJ, et al., Biochemistry, 20, 4229, 1981). ). In the case of IgM, the thiol group of the Fc part of IgMs obtained by reducing the J chain under mild conditions according to the method of Miller et al. (J. Biol. Chem., 257, 286, 1965) What is necessary is just to use for a coupling | bonding. When using the GAH antibody described in JP-A-5-304987, F (ab ') 2 Is preferably used. Binding of a protein such as an antibody provided with a thiol group and a liposome containing a maleimide group is achieved by reacting in a neutral buffer (pH 6.5 to 7.5) for 2 to 16 hours.
The most preferred embodiment of the present application is a liposome conjugated with an antibody and a compound containing a polyalkylene glycol moiety. In order to produce this, first, in a buffer neutral to the liposome having a maleimide group. React with thiolated antibody. For example, 0.5 to 5.3 mg, 0.5 to 4.5 mg, preferably 1.2 to 2 mg of an antibody is bound to 100 mg of total lipid constituting the liposome, that is, the thiolated antibody is treated with a maleimide group (maleimide 0.1 mol% (specifically 0.17 mol%) to about 2 mol% (specifically 1.5 mol%, 1.8 mol%), preferably 1 mol per mol May be reacted at 0.4 to 0.7 mol%. Next, the remaining maleimide group can be reacted with a compound containing a thiolated polyalkylene glycol moiety to produce a liposome in which the antibody and the compound containing the polyalkylene glycol moiety are bound. Specifically, 15 mol% to 50 mol%, preferably 15 to 30 mol% (0.28 to 0.90 mol%, preferably 0.28 to 0.56 mol based on total lipid) per mol of maleimidated lipid groups Mol%, when DPPC is used, a compound containing a thiolated polyalkylene glycol moiety in an amount of 0.44 to 1.45 mol%, preferably 0.44 to 0.89 mol% based on DPPC is added, and the antibody And a liposome containing a compound containing a polyalkylene glycol moiety can be produced.
According to a preferred embodiment of the liposome of the present invention, a medicine, preferably an antitumor agent such as doxorubicin is encapsulated, and a liposome in which a compound containing a polyethylene glycol moiety and an antitumor antibody are bound is provided. The above-mentioned drug-containing liposome is prepared by a known method, for example, a dehydration method (Japanese Patent Publication No. 2-502348), a method in which a stabilizer is added and used as a liquid (Japanese Patent Laid-Open No. 64-9331), a lyophilization method ( JP-A-64-9931) can be formulated and administered to patients by methods such as intravascular administration, intravesical administration, intraperitoneal administration, and local administration for the treatment of various diseases such as cancer. can do. The dose can be appropriately selected according to the type of the active ingredient pharmaceutical. For example, when administering a liposome encapsulating doxorubicin, the amount of the active ingredient is 50 mg / kg or less, preferably 10 mg / kg or less. Preferably, it can be used at 5 mg / kg or less.
Example
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to a following example.
Example 1
(1) Preparation of liposome and encapsulation of drug
To a lipid mixture (1.6 g) consisting of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) / cholesterol / ε-maleimidocaproyldipalmitoylphosphatidylethanolamine (MC-DPPE) (18/10 / 0.5 molar ratio) After adding 16 mL of 0.3 M citrate buffer (pH 4.0) to hydrate, multi-lamellar liposomes were prepared by performing freeze-thaw three times in liquid nitrogen and a 60 ° C. warm bath. Further, the particle size was adjusted to 0.1 μm by an extrusion method. The liposome solution was neutralized by dropwise addition of 1M NaOH, heated to 60 ° C., and added with 0.5 mL of a 20 mg / mL aqueous solution of doxorubicin (DXR, also known as adriamycin, ADM) per 100 mg of lipid.
(2) Thiolation of antibody and binding to liposome (production of antibody-bound liposome)
GAH antibody dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM EDTA (described in JP-A-4-346918 and JP-A-5-304987, gastric cancer and colon cancer reactive monoclonal antibody, 3 mg / 92.4 μL of 3 mg / mL iminothiolane was added to 1 mL (mL, 14.4 mL) and reacted at 37 ° C. for 1 hour to introduce a thiol group (see Biochemistry, 12, 3206, 1973). The reaction solution was subjected to gel filtration, and the buffer solution was exchanged with 0.1 M phosphate buffer solution (pH 6.0) containing 1 mM EDTA, and then 0.21 mg of thiolated antibody (1.7 mg / mL) was added per 1 mg of doxorubicin. The reaction was performed at 25 ° C. for 1 hour to bind the antibody to the liposome.
(3) Thiolation of polyethylene glycol and binding to liposomes (production of PEG-linked liposomes)
According to the method of JP-A-4-346918, 2,4-bis (polyethylene glycol) -6-chloro-s-triazine is reacted with cystine and then reduced to a polyethylene glycol having a thiol group (double-stranded PEG ) Was prepared. That is, using cystine, thiolated PEG (30 mg / mL, double-chain type with PEG molecular weight 2000 (PEG2000) or double-chain type with PEG molecular weight 5000 (PEG5000)) was prepared with a concentration of 0.000 per mL of the above reaction solution. 18 mL was added and a binding reaction was performed at 10 ° C. Samples were sampled 5 to 240 minutes after the start of the reaction, applied to a Sepharose CL6B column, the reaction was stopped by removing unreacted thiolated PEG, and immunoliposomes with different amounts of PEG were prepared. The non-PEG-conjugated immunoliposome was prepared by gel filtration of an immunoliposome not subjected to PEG-binding operation with Sepharose CL6B.
(4) Preparation of antibody and PEG-conjugated liposome
The antibody-bound liposome prepared in (2) above was reacted with the thiolated PEG in (3) above to prepare a liposome in which the antibody and PEG were bound.
(5) Quantification of the amount of conjugated PEG
The amount of PEG bound to the immunoliposome was measured by the HPLC method. The immunoliposome solution with a final concentration of 2% SDS was heated at 60 ° C. for 30 minutes to completely solubilize the liposomes. Using a GPC column (2000 SWXL, manufactured by Tosoh Corporation), a pH 7.5 buffer solution (25 mM NaH) 2 PO 4 , 0.1% SDS, 70% methanol) to separate PEG, detected at 215 nm and quantified from area values.
(6) DXR determination
DXR was measured by adding 50 μL of the sample to 950 μL of 50% propanol / 0.5 M hydrochloric acid and measuring the absorbance at 500 nm.
(7) Quantification of amount of bound antibody
In the same manner as the determination of the amount of PEG, a pH 7.0 buffer solution (25 mM NaH) was used using a GPC column (Tosoh Corporation, 3000SWXL). 2 PO 4 200 mM Na 2 SO 4 The antibody was separated by elution with 0.1% SDS) and quantified from the area value detected at 280 nm of the antibody peak.
(8) Quantification of lipid content
Lipid (total amount of DPPC and cholesterol) was quantified by HPLC method. Load L-column ODS (Chemicals Inspection Association) 4.6 mm x 250 mm and elute with tetrahydrofuran (THF) / acetonitrile / water (2: 1: 1, V / V / V, 0.1% trifluoroacetic acid) did. Detection was performed at 215 nm, and quantified from the area values of the peak derived from DPPC and the peak derived from cholesterol. A lipid quantification sample was prepared by adding 9 volumes of the eluent to 1 volume of liposome sample.
Example 2: Preparation of PEG-conjugated liposomes (pharmacokinetic study)
According to the method of Example 1, 0 to about 0.7 mol% with respect to 1 mol of the total lipid constituting the liposome, 0 to about 1 mol% with respect to 1 mol of DPPC, and 0 to about 1 mol with respect to 1 mol of maleimidated lipid. Liposomes (DXR encapsulated, non-antibody-bound, PEG2000 or PEG5000-bound) into which 40 mol% of PEG had been introduced were prepared.
BALB / cAjcl male mice (6 weeks old) were used in the experiments. For each liposome, there were 4 mice per group, and 1 untreated mouse was used for the experiment as a blank. Liposomes were administered into the tail vein so that the DXR amount was 2 mg / kg. Sixteen hours after administration, Nembutal injection (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was intraperitoneally administered to the mice, the thoracotomy was performed under anesthesia, blood was collected, plasma was separated and subjected to DXR analysis.
To 100 μL of plasma, 1 mL of 0.3 M hydrochloric acid-50% ethanol (hydrochloric acid ethanol) was added, heated at 60 ° C. for 10 minutes to extract DXR, cooled to 4 ° C., centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. This sample was diluted 4-fold with hydrochloric acid ethanol, and fluorescence with an excitation wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm was measured. A calibration curve was prepared using DXR of known concentration diluted with hydrochloric acid ethanol, and DXR in plasma was quantified. The DXR recovery rate from mouse plasma was 95 to 98% in the range of 3.75 μg / mL to 30 μg / mL in terms of DXR (reference document: Cancer Res., 47, 4471, 1989).
The average value (± standard deviation) of plasma DXR concentration for each liposome group is shown in FIG. It was confirmed that the DXR concentration in plasma, which is an index of liposome retention in blood, increased depending on the amount of PEG bound to the liposome for both PEG5000 and PEG2000.
Example 3: Preparation of PEG and antibody-bound liposomes (pharmacokinetic study)
In accordance with the method of Example 1, 0 to 0.6 mol% of liposome total lipid, 0 to about 1 mol% of DPPC, and 0 to about 30 mol% of PEG to maleimidated DPPE were introduced. (DXR encapsulation, antibody binding, PEG5000 binding) was prepared.
DXR in plasma was quantified in the same manner as in Example 2. The average value (± standard deviation) of plasma DXR concentration for each liposome group is shown in FIG. Plasma DXR concentrations increased depending on the amount of PEG bound to the liposomes, but were about 0.3 mol% for total lipid, about 0.5 mol% for DPPC, and about about 0.3 mol for maleimidated DPPE. It was confirmed that a plateau was reached with an introduction amount of 17 mol%. In addition, when DXR leaks from the liposome, it is confirmed that the leaked DXR is quickly burned out from the blood, so the plasma DXR concentration shown in the results of Examples 2 and 3 is in the liposome. It is thought to be derived from the enclosed DXR.
Example 4: Preparation of PEG and antibody-bound liposome (drug efficacy test, kinetic test)
According to the method of Example 1, 0.5, 1.2, 2.0, 4.5, 5.3, and 11.4 mg of the antibody bound to 100 mg of liposome total lipid, the following liposomes 2 to 7 ( DXR encapsulation, PEG5000 binding) was prepared. Similarly, liposome 1 to which no antibody was bound was produced. In the case of PEG-conjugated liposomes, the retention in blood of each liposome is equivalent in the PEG-bound amount range (> 4.4 mg / 100 mg lipid), so the experimental results shown below depend on the amount of antibody bound.
Gastric cancer cell line MKN45 was placed in two places on the dorsal side of nude mice (1 × 10 6 Cells / one place). In the “drug efficacy test”, administration of liposomes with different amounts of antibody binding was started when the tumor reached a sufficiently large size that allows measurement of the major axis and minor axis of the tumor. The dose of liposome was 5.0 mg / kg (converted to DXR amount) per dose, a DXR administration group (5.0 mg / kg) was provided as a positive control, and physiological saline was administered to the control group. For all groups, intravenous administration was performed on the administration start day (day 0), day 3, and day 6.
Measure tumor diameter (major axis, minor axis) over time and estimate tumor weight (minor axis) 2 X major axis / 2) was calculated. The measurement was continued until the 19th day after the completion of the 3 administrations. The degree of tumor growth was calculated by setting the estimated tumor weight on the administration start date of each tumor to 1.0, and the tumor growth inhibitory effect of each treatment group relative to the control group and the DXR administration group was evaluated. For each treatment group on the last measurement day (day 19), the% T / C value (tumor growth degree of treatment group / tumor growth degree of control group × 100) was calculated, and from the relationship with the amount of antibody binding of each sample, The amount of antibody binding (optimum value) that maximizes the tumor growth inhibitory effect was determined.
As a result, a significant tumor growth inhibitory effect was confirmed in all the treatment groups with respect to the control group, and as shown in FIG. A significant tumor growth inhibitory effect was observed in the samples in the range of 3 mg / 100 mg total lipid, and tumor growth inhibitory activity was observed with the antibody binding amount peaking around 2 mg / 100 mg total lipid.
In the “kinetic test”, the above-mentioned liposomes 4 to 7 (2.0, 4.5, 5.3, and 11.4 mg / 100 mg total lipid) having different antibody binding amounts are intravenously administered to mice (group 2 to 2). Three animals, 1.0 mg / kg, converted to DXR amount), and plasma was collected from each individual 4 hours after administration. The amount of DXR in plasma was measured by a fluorescence measurement method in the same manner as in Example 2. The amount of DXR in plasma after administration of each sample was compared, and the relationship between the amount of antibody binding and the blood retention of DXR-encapsulated antibody-bound liposomes was determined. In each kinetic test, for each sample having an antibody binding amount of 2 mg / 100 mg lipid or more, the relationship between the plasma DXR amount after administration of each sample and the antibody binding amount of each sample was determined (FIG. 4). As a result, when the antibody binding amount exceeded 2 mg / 100 mg lipid, it was recognized that the retention in the blood decreased depending on the antibody binding amount.
Industrial applicability
The liposome of the present invention has excellent blood retention and is characterized in that the amount of polyalkylene glycol bound is smaller than that of conventional liposomes. Therefore, the liposome of the present invention can avoid side effects caused by polyalkylene glycol, and is advantageous from the viewpoint of industrial productivity. Furthermore, the liposome of the present invention is characterized in that an excellent therapeutic effect can be achieved as compared with conventional antibody-bound liposomes.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of polyethylene glycol bound to liposomes (DXR encapsulated, non-antibody binding) and the DXR concentration in plasma. The horizontal axis represents the amount of PEG (mol% relative to 1 mol of DPPC). The conversions of mole percent to total lipid and mole percent to 1 mole of maleimidated DPPE are 0.16 and 8.9 (0.25); 0.32 and 17.8 (0.5); 0.48 and 26, respectively. 0.7 (0.75); 0.64 and 35.6 (1); and 0.81 and 45 (1.25) (in parentheses indicate mol% with respect to 1 mol of DPPC).
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the amount of polyethylene glycol bound to liposomes (DXR encapsulation, antibody binding) and the DXR concentration in plasma. The horizontal axis represents the amount of PEG (PEG amount (mg) relative to 100 mg lipid). The converted values of mol% with respect to 1 mol of DPPC, mol% with respect to total lipid, and mol% with respect to 1 mol of maleimidated DPPE are 0.25, 0.16, and 8 (2.5), respectively; 0.50, 0.31, And 17 (5); 0.75, 0.47, and 26 (7.5); and 1.0, 0.62, and 34 (10) (in parentheses, the amount of PEG relative to 100 mg lipid (mg) Showing).
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of antibody bound to liposomes (DXR inclusion) and the tumor suppressive effect (% T / C).
FIG. 4 is a graph showing the relationship between plasma DXR amount (retention in blood) and antibody binding amount for each sample with an antibody binding amount of 2 mg / 100 mg lipid or more.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11573899 | 1999-04-23 | ||
JP11573799 | 1999-04-23 | ||
PCT/JP2000/002596 WO2000064413A1 (en) | 1999-04-23 | 2000-04-20 | Antibody and polyalkylene glycol-bonded liposome |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP4111368B2 true JP4111368B2 (en) | 2008-07-02 |
Family
ID=26454194
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000613404A Expired - Fee Related JP4111368B2 (en) | 1999-04-23 | 2000-04-20 | Antibodies and polyalkylene glycol-conjugated liposomes |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080014255A1 (en) |
EP (2) | EP1174126B1 (en) |
JP (1) | JP4111368B2 (en) |
KR (1) | KR100699059B1 (en) |
CN (2) | CN1561968A (en) |
AT (1) | ATE328582T1 (en) |
AU (1) | AU766570B2 (en) |
CA (1) | CA2370043A1 (en) |
DE (1) | DE60028567T2 (en) |
ES (1) | ES2265340T3 (en) |
WO (1) | WO2000064413A1 (en) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8352400B2 (en) | 1991-12-23 | 2013-01-08 | Hoffberg Steven M | Adaptive pattern recognition based controller apparatus and method and human-factored interface therefore |
US7966078B2 (en) | 1999-02-01 | 2011-06-21 | Steven Hoffberg | Network media appliance system and method |
GB9915074D0 (en) * | 1999-06-28 | 1999-08-25 | Cortecs Plc | Ligand-binding composition |
JP5175020B2 (en) * | 2001-04-30 | 2013-04-03 | サイティミューン サイエンシーズ, インコーポレイテッド | Colloidal metal compositions and methods |
WO2003009870A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-02-06 | Mitsubishi Pharma Corporation | Remedies for mammary cancer |
KR100470535B1 (en) * | 2002-06-27 | 2005-02-22 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Immunoliposome conjugated with upa antibody |
CA2501222A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-10-21 | Mitsubishi Pharma Corporation | Antibody recognizing antigen |
EP1618897A4 (en) * | 2003-04-04 | 2010-09-29 | Eisai R&D Man Co Ltd | Lipid membrane structure containing anti-mt-mmp monoclonal antibody |
AU2004220325B2 (en) * | 2003-06-30 | 2011-05-12 | Domantis Limited | Polypeptides |
WO2006030602A1 (en) * | 2004-09-16 | 2006-03-23 | Mitsubishi Pharma Corporation | Diagnostic and/or remedy for ovary cancer |
JP5110880B2 (en) * | 2004-11-18 | 2012-12-26 | テルモ株式会社 | Pharmaceutical compositions, formulations and combination formulations |
US20090030187A1 (en) | 2005-03-14 | 2009-01-29 | Tous Guillermo I | Macromolecules comprising a thioether cross-link |
US20110096174A1 (en) * | 2006-02-28 | 2011-04-28 | King Martin T | Accessing resources based on capturing information from a rendered document |
US9814672B2 (en) * | 2007-03-09 | 2017-11-14 | Susan T. Laing | Echogenic vehicle for clinical delivery of plasminogen activator and other fibrin-binding therapeutics to thrombi |
US20100080773A1 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Sdg, Inc. | Orally Bioavailable Lipid-Based Constructs |
US8962015B2 (en) | 2007-09-28 | 2015-02-24 | Sdg, Inc. | Orally bioavailable lipid-based constructs |
US8846053B2 (en) | 2008-09-26 | 2014-09-30 | Sdg, Inc. | Orally bioavailable lipid-based constructs |
JP5593488B2 (en) | 2008-11-17 | 2014-09-24 | 独立行政法人国立がん研究センター | A novel cancer targeting treatment with a complex of a substance capable of binding specifically to a constituent of cancer stroma and an antitumor compound |
US9149432B2 (en) | 2010-03-19 | 2015-10-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Lipid vesicle compositions and methods of use |
RU2595872C2 (en) | 2010-03-19 | 2016-08-27 | Массачусетс Интитут Оф Текнолоджи | Composition of lipid vesicles and methods of application |
WO2013177565A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Insulin-pramlintide compositions and methods for making and using them |
US11077173B2 (en) | 2017-03-13 | 2021-08-03 | Sdg, Inc. | Lipid-based nanoparticles and methods using same |
WO2018169954A1 (en) | 2017-03-13 | 2018-09-20 | Sdg, Inc. | Lipid-based nanoparticles with enhanced stability |
AU2018243670A1 (en) | 2017-03-31 | 2019-10-31 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for targeting and killing ALPHA-V BETA-3-positive cancer stem cells (CSCs) and treating drug resistant cancers |
TW202104874A (en) | 2019-05-29 | 2021-02-01 | 學校法人早稻田大學 | Temperature responsive fluorescent particle for detecting biomolecule |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3220180B2 (en) * | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | Drug-containing protein-bound liposomes |
CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
US6787153B1 (en) * | 1991-06-28 | 2004-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
JP3351476B2 (en) * | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | Phospholipid derivatives and liposomes containing the same |
-
2000
- 2000-04-20 CN CNA2004100456646A patent/CN1561968A/en active Pending
- 2000-04-20 ES ES00917390T patent/ES2265340T3/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-20 CA CA002370043A patent/CA2370043A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-20 CN CNB008090564A patent/CN1198590C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-20 WO PCT/JP2000/002596 patent/WO2000064413A1/en active IP Right Grant
- 2000-04-20 DE DE60028567T patent/DE60028567T2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-20 AT AT00917390T patent/ATE328582T1/en not_active IP Right Cessation
- 2000-04-20 KR KR1020017013584A patent/KR100699059B1/en not_active IP Right Cessation
- 2000-04-20 AU AU38407/00A patent/AU766570B2/en not_active Ceased
- 2000-04-20 EP EP00917390A patent/EP1174126B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-20 JP JP2000613404A patent/JP4111368B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-20 EP EP05010025A patent/EP1563832A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-06-21 US US11/812,804 patent/US20080014255A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU3840700A (en) | 2000-11-10 |
WO2000064413A1 (en) | 2000-11-02 |
KR100699059B1 (en) | 2007-03-23 |
EP1174126B1 (en) | 2006-06-07 |
DE60028567D1 (en) | 2006-07-20 |
CN1355691A (en) | 2002-06-26 |
CN1561968A (en) | 2005-01-12 |
DE60028567T2 (en) | 2007-05-16 |
CA2370043A1 (en) | 2000-11-02 |
ES2265340T3 (en) | 2007-02-16 |
EP1563832A1 (en) | 2005-08-17 |
KR20020011977A (en) | 2002-02-09 |
ATE328582T1 (en) | 2006-06-15 |
CN1198590C (en) | 2005-04-27 |
EP1174126A1 (en) | 2002-01-23 |
EP1174126A4 (en) | 2002-09-04 |
US20080014255A1 (en) | 2008-01-17 |
AU766570B2 (en) | 2003-10-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4111368B2 (en) | Antibodies and polyalkylene glycol-conjugated liposomes | |
JP3220180B2 (en) | Drug-containing protein-bound liposomes | |
EP0912198B1 (en) | Immunoliposomes that optimize internalization into target cells | |
ES2296391T3 (en) | METHODS TO FORM LIPID MICROPARTICLES UNITED TO PROTEINS, AND THEIR COMPOSITIONS. | |
Zalipsky et al. | Long-circulating, polyethylene glycol-grafted immunoliposomes | |
Torchilin et al. | Targeted accumulation of polyethylene glycol‐coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium | |
US6027726A (en) | Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation | |
US20080241161A1 (en) | Remedy for mammary cancer | |
Harasym et al. | Clearance properties of liposomes involving conjugated proteins for targeting | |
US5780054A (en) | Methods for increasing the circulation half-life of protein-based therapeutics | |
WO2014046630A1 (en) | Tumor targeted liposomal drug delivery system | |
EP0903152B1 (en) | Bifunctional water-soluble polymer derivative and complex containing it | |
Kirpotin et al. | Building and characterizing antibody-targeted lipidic nanotherapeutics | |
Allen et al. | Targeted sterically stabilized liposomal drug delivery | |
JP4385152B2 (en) | Bivalent reactive water-soluble polymer derivative and complex containing the same | |
US20080069867A1 (en) | Diagnostic and/or Remedy for Ovarian Cancer | |
Tardi et al. | The development of liposomes for enhanced delivery of chemotherapeutics to tumors | |
Harasym | Antibody targeted liposomal systems | |
MXPA00010974A (en) | Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20031226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040223 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070427 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20071119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080205 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080402 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080403 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |