JP4109146B2 - Lotus monkey polyhedrosis virus, embedded body and pest control material - Google Patents

Description

図１及び表１に示すように、Ａタイプ（特定のタイプ又は第１のタイプ）のＮＰＶは、例えば、ａ〜ｚ（クローンＡ−１）、又はａ〜ｚ及びα（クローンＡ−９）の２６〜２７本前後の染色バンド（ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡ断片）が明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐ（本発明者らの測定によれば１５．４ｋｂｐ）より長いＤＮＡ断片が認められないことに最も大きな特徴がある。次に、このＮＰＶは、２．２〜３．４ｋｂのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴がある。続いて、このＮＰＶは、８〜１２ｋｂｐのＤＮＡ断片が特に密に存在していることに特徴があり、最後に３．４〜１５．４ｋｂｐ及び１．０〜２．２ｋｂｐの２カ所にＤＮＡ断片の集中が認められることに特徴がある。
【００１２】
なお、前記及び以下の記載において、ＤＮＡ断片が認められない（検出できない）とは、前記電気泳動パターンにおいて、２ｋｂｐ以下の染色バンドが目視又はデンシトメータ等の定量装置にて確実に検出される条件で、該ＤＮＡ断片が目視又は前記定量装置にて検出できないことを意味する。また、このＡタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンには、例えば図１のクローンＡ−１とクローンＡ−９との間に見られるようなクローン間での若干の個体差が存在する。
【００１３】
ＢタイプのＮＰＶは、例えば、ａ〜ｙ（クローンＢ−１）又はａ〜ｚ（クローンＢ−９）の２５〜２６本前後の染色バンドが明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片（本発明者らの測定によれば約１９ｋｂｐ）が明確に認められることに最も大きな特徴があり、この特徴により前記ＡタイプのＮＰＶと容易に区別される。次に、このＮＰＶは、５．９〜６．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴があり、続いて２．６〜４．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに特徴があり、続いて１．０〜１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに特徴がある。最後に、このＮＰＶは、６．９〜１２．９ｋｂｐ、４．５〜５．９ｋｂｐ及び１．７〜２．６ｋｂｐの３カ所にＤＮＡ断片の集中が認められることに特徴がある。また、このＢタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンには、例えば図１に示されるクローンＢ−１とクローンＢ−９との間に見られるようなクローン間での若干の個体差が存在する。
【００１４】
Ｃタイプ（第２のタイプ）のＮＰＶは、本発明者らが今回初めて発見したウイルスであって、岐阜県内に生息するハスモンヨトウ罹病虫から単離されたものである。このＮＰＶは、例えば、ａ〜ｚ（クローンＣ−３）の２６本の染色バンドが明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片（本発明者らの測定によれば約１９ｋｂｐ）が明確に認められることに最も大きな特徴があり、この特徴により前記ＡタイプのＮＰＶと容易に区別される。次に、このＮＰＶは、４．７〜６．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴があり、続いて全体にＤＮＡ断片の長さが分散していることに特徴がある。即ち、このＣタイプのＮＰＶは、４．７〜５．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）という特徴により前記ＢタイプのＮＰＶと容易に区別される。また、このＣタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンにも、クローン間での若干の個体差が存在する。
【００１５】
これらＡ〜ＣタイプのＮＰＶはいずれも、宿主としてのハスモンヨトウに感染するウイルスであり、該宿主の生体内で増殖した後に宿主を死滅させる殺虫能力を有している。前記ハスモンヨトウは、大豆葉等を食い荒らす農作物の害虫である。このハスモンヨトウは、卵から幼虫、蛹、成虫と変態を繰り返すライフサイクルに従って成長する昆虫であり、幼虫の時期に最も大きな農業被害を引き起こす。前記幼虫としては、脱皮を重ねる毎に発育齢が１つずつ加齢するようになっており、１齢から６齢までの各ステージが存在する。このハスモンヨトウは、４齢以降の老齢幼虫に生育するに従ってＮＰＶ等の病原ウイルスに対する抵抗性が増大して感染されにくくなる。さらに、４齢以降では摂食量が急激に増加して農業被害を飛躍的に拡大させる。また、野外のハスモンヨトウは、休眠することなく活動するとともに、環境温度に依存しながら昆虫独自のライフサイクルを繰り返す。そのため、野外のハスモンヨトウは、発育齢が揃っている場合が極めて少なく、農業被害を軽減させるためには大量の害虫防除資材の散布が必要である。
【００１６】
また、このハスモンヨトウの近縁種としてはスポドプテラ・リトラリス（Spodoptera littoralis）が挙げられ、同じスポドプテラ属の昆虫としてはスポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）が挙げられる。Ａ〜ＣタイプのＮＰＶは、スポドプテラ・リトラリスに対する感染致死能力を備えている。また、Ａタイプ及びＢタイプのＮＰＶは、スポドプテラ・エクシグア及びスポドプテラ・フルギペルダ由来の培養細胞内にインビトロ（in vitro）で多角体を形成させることが確認されている。
【００１７】
前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、ハスモンヨトウ幼虫の体腔内に侵入しやすい性質、つまり感染が成立しやすい性質を有している。ＣタイプのＮＰＶは、ＡタイプのＮＰＶと比べて、ハスモンヨトウ幼虫の体腔内に若干侵入しにくいが、一旦幼虫の体腔内に侵入した後には該体腔内で著しく高い増殖能力を発揮する。
【００１８】
また、前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、３齢以前のハスモンヨトウ幼虫（比較的免疫系の働きが弱い幼虫）に対する感染が著しく成立しやすいうえ、該幼虫に対して致死させる作用が最も強い。しかしながら、このＡタイプのＮＰＶでは、４齢以降の幼虫（比較的免疫系の働きが強い幼虫）に対して感染は成立しやすいと考えられるが、宿主体腔内の免疫系の働きによって排除されやすく、宿主を致死させる作用はＣタイプのＮＰＶと比べて若干弱まる。また、ＣタイプのＮＰＶは、感染成立後の増殖能力が格段に優れていることから、３齢及び４齢幼虫の宿主免疫系によって排除されるおそれが少なく、４齢幼虫を致死させる作用はＡタイプ及びＢタイプよりも優れている。
【００１９】
一方、前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の細胞内で多量のポリヘドリン（polyhedrin）蛋白質を発現して核内に多数の包埋体を形成させる能力に優れている。このＡタイプのＮＰＶは、ＣタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の体細胞全体への感染の拡大作用は弱い。ＣタイプのＮＰＶは、ＡタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後、該宿主の細胞核内での包埋体の形成作用が弱い。このＣタイプのＮＰＶは、Ａタイプ及びＢタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の体細胞全体に素早く感染を拡大させて宿主の摂食活動を始めとする活動全般を停止させる作用が顕著に高い。
【００２０】
特に、これら各タイプのＮＰＶは、前記各効果が著しく容易かつ効果的に高められることから、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであるのが最も好ましい。前記インビトロクローニング法は、単層培養された昆虫由来の培養細胞に対してＮＰＶを感染させた後、プラーク法等の公知のクローニング技術を用いて単一のＮＰＶクローンを単離するものである。前記プラーク法としては、例えば、Hink and Vail（Journal of Invertebrate Pathology, 22, P158-174, 1983）の方法が挙げられる。
【００２１】
実施形態の包埋体は、インビトロクローニング法によりクローニングされた単一のＮＰＶクローンを感染源として、ハスモンヨトウ幼虫の生体内に接種した後、その幼虫の生体内で前記ＮＰＶを大量に増殖させることによって得られるものであり、前記ＮＰＶの単一クローンが大量に含有されている。この包埋体としては、前記ＮＰＶが高含有されたハスモンヨトウの死虫、又は該死虫の破砕物を濾過した濾過物の形態で用いられる。なお、前記感染源を幼虫の生体内に接種する際には、経口感染又は体腔内に注入する方法が採用されるが、包埋体を効率的に得るためには体腔内に注入する方法が好適に用いられる。
【００２２】
実施形態の害虫防除資材（農薬）は、ハスモンヨトウに対する生物的防除を行うことにより、ハスモンヨトウの摂食活動による農業被害を抑えるために用いられるものである。この害虫防除資材は、ハスモンヨトウに対する生物的防除を行う有効成分としてウイルスからなる成分（ウイルス成分）が含有されている。なお、この害虫防除資材中には、必要に応じて、ウイルス以外の成分（非ウイルス成分）も同時に含有されていても構わない。前記ウイルス成分としては、上記ＮＰＶの単一クローン、複数のクローン又は複数のタイプのＮＰＶが用いられる。この害虫防除資材は、大量のＮＰＶを容易に取り扱うことができるうえ保存性及び散布後の残留性に優れていることから、前記包埋体を含有させるのが好ましく、ＮＰＶの単一クローンからなる包埋体を１種類又は複数種類含有させるのが最も好ましい。また、前記非ウイルス成分としては、ハスモンヨトウ幼虫に対する経口感染の成立を増進させるための経口感染増進剤（スチルベン系の蛍光漂白剤等）や展着剤、紫外線によるＮＰＶの不活化を防ぐための添加剤等が挙げられる。
【００２３】
前記ウイルス成分としてＡタイプのＮＰＶのみを含有する害虫防除資材は、複数のタイプのＮＰＶが含有されている害虫防除資材と比較して、ハスモンヨトウ幼虫、特に３齢以前の幼虫に対する致死能力（致死率）が飛躍的に向上している。ウイルス成分としてＣタイプのＮＰＶを含有する害虫防除資材は、前記Ａタイプ及び／又はＢタイプのＮＰＶからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材と比較して、発育齢が不揃いなハスモンヨトウ幼虫集団全体に対してその活動を鈍化させやすくなっており、農作物の摂食被害を容易に抑える働きがある。
【００２４】
一方、ウイルス成分としてＡタイプ及びＣタイプのＮＰＶを含有する害虫防除資材（Ｂタイプは含有されていても構わない）は、前記両タイプの利点をともに発揮する。即ち、この害虫防除資材は、ＡタイプのＮＰＶがハスモンヨトウ幼虫に対する感染の成立を促進させた後、ＣタイプのＮＰＶが同幼虫の生体内での感染の拡大を促進させる。前記ＣタイプのＮＰＶによる感染の拡大は、前記ＡタイプのＮＰＶの感染によって極めて容易となる。また、ウイルス成分としてＡタイプ及びＣタイプのＮＰＶのみを含有する害虫防除資材（Ｂタイプは含有されていない）は、前記両タイプの利点を最も効果的に発揮する。
【００２５】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 実施形態のＣタイプのＮＰＶは、本発明者らの鋭意研究の結果、今回新たに発見されたタイプの野生のＮＰＶである。このＮＰＶは、上記非特許文献１に開示されているような公知のウイルスとは異なるゲノムＤＮＡを持ったものであるうえ、それら公知のウイルスとは異なる性質を有している。特に、このＮＰＶは、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を備えていることから、該幼虫の生物的防除に有用である。即ち、このＮＰＶは、前記感染拡大能力によって、ハスモンヨトウに対し極めて迅速にその摂食活動を停止させることから、農業被害を容易かつ効果的に抑えることができる。さらに、このＮＰＶは、３齢以前の幼虫ばかりでなく、４齢ハスモンヨトウ幼虫に対しても致死効果が高いことから、野外圃場等において発育齢の不揃いなハスモンヨトウ幼虫集団に対する致死率を容易に高めることができ、害虫防除資材として利用したときの生物的防除効果を容易に高めることができる。
【００２６】
・ ＡタイプのＮＰＶのみからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材は、３齢以前の幼虫に対する致死率が顕著に高いＡタイプのＮＰＶのみから構成されていることから、該ＮＰＶによる感染致死能力が著しくシャープに発揮され、ハスモンヨトウの生物的防除（特に完全駆除）に極めて高い効果を発揮する。またこのとき、他のタイプのＮＰＶが感染することにより瀕死状態ではあるが致死を免れ得る害虫の個体数を減らす効果も発揮され得る。
【００２７】
・ Ａタイプ及びＣタイプのＮＰＶからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材は、前記両タイプの利点をともに発揮する画期的な生物的防除を行うことができる。この害虫防除資材は、散布後速やかにＣタイプのＮＰＶによるハスモンヨトウ幼虫の摂食活動を停止させるとともに、所定期間経過後にはＡタイプのＮＰＶによってハスモンヨトウの完全駆除をほぼ達成することができ、農業被害を著しく効果的に抑えることが容易である。なお、この害虫防除資材中のＣタイプのＮＰＶは、害虫の摂食活動の早期停止が主目的であることから、ＡタイプのＮＰＶと等量又はそれ以下の濃度比（個包埋体／ｍｌ）で配合されているのが好ましいが、特に限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜ＮＰＶのクローニング及び同定＞
ＮＰＶのクローニングには、農林水産省、大学及び公立試験場等で保存されていた株（岐阜県以外の日本各地で採取されたもの）、並びに岐阜県内の圃場で採集した野外ハスモンヨトウ感染罹病虫より分離した病原ウイルスからなる１８種類のサンプルを用いた。これら各サンプルは、通常複数種類のＮＰＶクローンが混在していることから、Hink and Vailのプラーク法を取り入れたインビトロクローニング法を用いて単一のクローンとなるように分離（クローニング）した。
【００２９】
即ち、まず、１×１０⁶個のTUAT-SpLi-221細胞を直径３５ｍｍの培養シャーレで単層培養した。なお、前記TUAT-SpLi-221細胞は、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したIPL-41培地（Weissら、In Vitro, 17, P495-502, 1981）にて２８℃で培養された。次に、前記培養シャーレ内の培養液を取り除いた後、上記各サンプル（サンプル液）を１シャーレあたり４００ｍｌ加え、室温で１時間攪拌しサンプル液中のＮＰＶを昆虫細胞に吸着させた。その後、前記培養シャーレ内のサンプル液を取り除き、０．７５％のアガロースと１０％のＦＢＳとを含むIPL-41培地を３ｍｌ重層した。５日後、生じたプラークをパスツールピペットで採取して少量のIPL-41培地に懸濁させた。以上の操作を３回繰り返すことにより、２２８個のＮＰＶクローンがクローニングされた。
【００３０】
これらＮＰＶクローンからLavinaら（Biological Control, 20, P39-47, 2001）の方法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩによって制限酵素処理した後にアガロースゲル電気泳動を行ったところ、３３種類の遺伝子型に分類された。その一部を図１に示す。これら３３種類の遺伝子型は、その電気泳動パターンの特徴から大きく３種類のタイプ（Ａ〜Ｃタイプ）に分類され得ることが判明し、日本国内には少なくとも３タイプのＮＰＶが存在することが明らかになった。
【００３１】
前記Ａタイプは、その電気泳動パターンより、Cherry and Summers（Journal of Invertebrate Pathology,46,P289-295,1985）の報告にある、主に地中海沿岸地域に分布する近縁種のスポドプテラ・リトラリス核多角体病ウイルスと極めて高い類似性があることが判明した。前記Ｂタイプは、その電気泳動パターンより、非特許文献１及びLavinaら（Biological Control, 20, P39-47, 2001）の報告にある、アジアで分離報告されたＮＰＶと極めて高い類似性があることが判明した。一方、前記Ｃタイプは、これまで報告されているＮＰＶの電気泳動パターンとは全く異なる新しいタイプのウイルスであることが判明した。また、このＣタイプのクローンは、岐阜県内の罹病虫からのみ分離された。そして、Ａタイプに属するクローンをＡ−１〜Ａ−２０、Ｂタイプに属するクローンをＢ−１〜Ｂ−１０、Ｃタイプに属するクローンをＣ−１〜Ｃ−３と命名した。
【００３２】
＜包埋体の作製＞
前記３３種類のＮＰＶのクローンは、ゲノム変異の可能性を最小限に止めるため、前記培養細胞系にて最小限の回数で小規模に増殖させた後、該細胞を含む培養液を3,000rpmで遠心分離して沈澱を回収し、少量の水に懸濁させた。この懸濁液を人工飼料に加え、４齢程度のハスモンヨトウ幼虫に食下し、感染致死した個体を回収した。さらに、前記致死個体をホモゲナイズし、１００メッシュ程度のナイロンメッシュにより濾過して頭部や体毛等の大きな夾雑物を取り除いた後、3,000rpmの遠心上清を得ることにより粗精製した後、少量の界面活性剤（0.02％程度のTween 80）を含む滅菌水に懸濁することによって包埋体を得た。最後に、前記包埋体の濃度（個包埋体／ｍｌ）を、顕微鏡を用いて血球計算盤によりカウントした。
【００３３】
＜ＮＰＶクローンの殺虫能力の比較１＞
各タイプから任意のクローンとしてＡ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３を選び、昆虫生体を用いて殺虫能力を比較した。即ち、まず、これら各クローンを５×１０⁶個包埋体／ｍｌの濃度に調整した後にその希釈系列を作製し、Hughes and Wood（Journal of Invertebrate Pathology, 37, P154-159, 1981）のドロップレットフィーディング法により累代飼育した３齢ハスモンヨトウ幼虫３０匹ずつに経口接種して感染させた。感染１４日後までの死亡個体数をカウントし、各クローンについて、全個体数に対する累積死亡個体数の割合である累積死亡率（％）を求めた。そして、同じ試験を複数回行い、累積死亡率のデータをもとにFinney（Probit analysis,Cambridge University Press,UK,P333）のプロビット法により、５０％のハスモンヨトウ個体を致死させる半致死濃度（ＬＣ₅₀値）を算出した。
【００３４】
その結果、Ａ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３のＬＣ₅₀値は、それぞれ７．０×１０⁴、４．４×１０⁴、１．９×１０⁶、１．８×１０⁶及び７．３×１０⁵個包埋体／ｍｌであった。従って、インビトロクローニング法によってクローニングされたＡタイプのＮＰＶクローン（Ａ−１及びＡ−９）は、Ｂ及びＣタイプのＮＰＶと比べて１０倍以上高い致死能力があることが判明した。また、ＣタイプのＮＰＶはＢタイプのＮＰＶよりも高い致死能力があることも判明した。
【００３５】
＜ＮＰＶクローンの増殖能力の比較１＞
前記各クローンについて、昆虫生体を用いて増殖能力を比較した。即ち、まず、各クローンを前記ドロップレットフィーディング法により累代飼育した４齢ハスモンヨトウ幼虫に経口接種して感染させた。感染２４，４８，７２，９６及び１２０時間後にハスモンヨトウから体液を採取し、該体液に含まれるＮＰＶの出芽ウイルスの濃度（タイター）をプラーク法によりカウントし、図２に示した。その結果、ＡタイプのＮＰＶの感染極初期（１〜２日）における増殖能力が突出して高いことが確認された。また、ＣタイプのＮＰＶは、感染３日以降ではＡ及びＢタイプと比べて、出芽ウイルスタイターが１０³〜１０⁴倍程度高くなっていることが示され、その後も昆虫が致死に至るまで該タイターの濃度が継続的に維持されていたことも示された。
【００３６】
＜ＮＰＶクローンの増殖能力及び殺虫能力の比較２＞
前記各クローンを累代飼育した４齢幼虫に１００PFU／個体となるように注射により体腔内に注入し、７２時間後にハスモンヨトウから体液を採取し、該体液に含まれるＮＰＶの出芽ウイルス濃度（タイター）をプラーク法によりカウントした。その結果、Ａ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３の出芽ウイルス濃度は、それぞれ２．９×１０⁵、７．８×１０⁵、２．７×１０⁵、１．１×１０⁵及び２．５×１０⁸PFU／ｍｌであった。従って、４齢幼虫に対する１００PFU／個体という極めて少量のウイルスを注入することにより、全てのＮＰＶクローンの増殖が認められた。さらに、ＣタイプのＮＰＶは他のタイプに比べ１０³倍程高いウイルス量が検出された。
【００３７】
また、同条件でＮＰＶを注射されたハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求めて図３に示した。図３の結果より、ＣタイプのＮＰＶは、他のタイプのＮＰＶと比べて１日以上も早くハスモンヨトウを致死させたことが示された。さらに、このＣタイプのＮＰＶでは、注入３日後から宿主の摂食停止が観察され、高い食害軽減効果が発揮され得ることが示された。また、Ａ〜Ｃの全てのタイプのＮＰＶにおいて、該ウイルスの注入量が極めて少量であっても、体腔内へ直接注入することにより、８日程度の短い期間でほぼ全ての個体を死滅させることが可能であることも示された。この結果は、上記ＮＰＶクローンの殺虫能力の比較１において、経口感染で致死に至らなかった個体は、感染を免れていたためであったと考えられる。
【００３８】
＜ＮＰＶクローンミックスの殺虫能力＞
Ａ−１及びＣ−３のＮＰＶクローン、又はＡ−９及びＣ−３のＮＰＶクローンを同濃度となるように混合したＮＰＶクローンミックスを作製した後、５×１０⁶個包埋体／ｍｌの濃度に調整した。また、Ａ−１、Ａ−９又はＣ−３のＮＰＶクローンをそれぞれ５×１０⁶個包埋体／ｍｌの濃度に調整した。次に、これらＮＰＶクローンを、上記ドロップレットフィーディング法により累代飼育した３齢ハスモンヨトウ幼虫に経口接種して感染させた。感染後２４時間毎にハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求め、図４に示した。また、同じ試験を図５に示される各クローンについて行った結果を図５に示した。
【００３９】
図４より、Ａ＋ＣタイプのＮＰＶクローンミックスの累積死亡率の経時変化は、Ａタイプ又はＢタイプのクローン単独に比べて、感染後早期に死亡する個体の割合が顕著に高くなった。また、Ｃタイプ単独を経口感染させた場合の累積死亡率は、感染後１４日経っても５０％程度であったが、前記Ａ＋ＣタイプのＮＰＶクローンミックスでは感染１０日前後でほぼ全個体が死亡していたことが示された。一方、図５ではいずれも２週間経過しても累積死亡率が５０％以下と低かったことが示された。従って、ＡタイプとＣタイプとからなるＮＰＶクローンミックスが害虫防除に著しく適していることが示された。
【００４０】
＜野外圃場模擬試験＞
野外圃場の大豆に対する各ＮＰＶクローンの殺虫特性は、ポット栽培された大豆葉を用いたバイオアッセイにより条件を単純化して予想確認できる。まず、図６及び図７に示される各ＮＰＶクローンを１０⁶、１０^6.5、１０⁷又は１０^7.2個包埋体／ｍｌの濃度となるように調整した。なお、図６及び図７の凡例中の括弧内に示される数値は、前記濃度の対数値を表している。次に、ガラス温室にて５０日間ポット栽培された大豆から葉を採取し、前記各ＮＰＶクローンの溶液（０．０３％の展着剤を含む）に浸漬させて風乾した。続いて、累代飼育した３齢又は４齢ハスモンヨトウ幼虫に前記大豆葉を３日間摂食させた後、清浄な人工飼料インセクタＬＦ（日本農産工業社製）を与えて、プラスチックカップ内にて個別飼育した。飼育（感染）開始後からハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求めた。３齢ハスモンヨトウ幼虫とともに飼育した結果を図６に示し、４齢ハスモンヨトウ幼虫とともに飼育した結果を図７に示す。また、前記個別飼育開始から６日目の累積死亡率を棒グラフにまとめたものを図８に示す。
【００４１】
その結果、ＮＰＶクローン１０^7.2個包埋体／ｍｌ以下の濃度において、最終的な累積死亡率に関してはＣタイプよりもＡタイプの方が高いが、致死に至るまでの時間ではＡタイプよりもＣタイプの方が早いことが分かる。特に、ＣタイプのＮＰＶは、４齢ハスモンヨトウ幼虫を感染致死させる能力がＡタイプと比べて顕著に高く、４齢の幼虫に対しても有効な害虫防除資材として利用できることが示された。従って、全ての個体に感染が成立する条件又は同じ致死率を引き起こす濃度では、Ａタイプに比べＣタイプによる致死時間の減少が見込まれる。さらに、その効果は３齢に比べ４齢でより顕著に高められ、食害の高くなる４齢以降での有効性が確かめられた。
【００４２】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
【００４３】
・ 請求項１に記載のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであることを特徴とする害虫防除資材。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスによれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。
【００４５】
請求項２に記載の発明の包埋体によれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。請求項３に記載の発明の包埋体によれば、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる害虫防除資材を容易に提供することができる。
【００４６】
請求項３に記載の発明の害虫防除資材によれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。請求項４に記載の発明の害虫防除資材によれば、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断した電気泳動パターンを示す。
【図２】 実施例の増殖能力の比較１の試験結果を示すグラフ。
【図３】 実施例の殺虫能力の比較２の試験結果を示すグラフ。
【図４】 実施例のクローンミックスの殺虫能力の試験結果を示すグラフ。
【図５】 実施例のクローンミックスの殺虫能力の試験結果を示すグラフ。
【図６】 実施例の３齢幼虫に対する野外圃場模擬試験結果を示すグラフ。
【図７】 実施例の４齢幼虫に対する野外圃場模擬試験結果を示すグラフ。
【図８】 実施例の野外圃場模擬試験における６日目の累積死亡率を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention includes a spodoptera nucleopolyhedrovirus having a strong insecticidal ability against Spodoptera litura, which causes feeding damage to agricultural products in a field, etc., an embedded body of the virus, and the virus It relates to pest control materials.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, this type of virus has been classified into four types based on the characteristics of infectivity, growth characteristics, polyhedron protein, DNA restriction enzyme pattern and DNA hybridization for several types of insect cell lines. A Japanese cynomolgus polyhedrosis virus is known (see Non-Patent Document 1). On the other hand, as a pest control material using this kind of virus, a material obtained by collecting and artificially proliferating a cynomolgus nucleopolyhedrosis virus from a suspicious scab of a dragonfly captured in a field or the like in the field is used.
[0003]
[Non-Patent Document 1]
Susumu Maeda, Yukuo Mukohara and Atsushi Kondo, Characteristically distinct isolates of the nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura, Journal of General Virology, UK, November 1990, 71, p. . 2631-2639.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional pest control material, since the virus contained in the insects infected with Spodoptera litura in the field is used almost as it is, the type and the mixing ratio of the virus are uncertain, and the fluctuation of quality is severe. Moreover, the biological control effect was not constant. For this reason, it is difficult to say that this pest control material exhibited a sufficiently enhanced pest control effect.
[0005]
The present invention has been made paying attention to the problems existing in the prior art as described above. The objective is to provide a novel cynomolgus nucleopolyhedrovirus, an embedding body thereof, and a pest control material that can easily exhibit a high ability to spread infection against cynomolgus larvae after establishment of infection. Another object is to provide an embedding body that can easily provide a pest control material capable of performing biological control extremely effectively against Spodoptera litura. Another object is to provide a pest control material that is capable of performing biological control extremely effectively against Spodoptera litura.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
  In order to achieve the above-described object, at least 26 species of the genus Spodoptera nucleopolyhedrovirus of the invention according to claim 1 are obtained when genomic DNA is cleaved with an EcoRI restriction enzyme.DNA fragments were observed, and the lengths of the DNA fragments were 19.6, 13.7, 13.0, 11.5, 8.6, 8.6, 7.7, 7.7, 7.0, respectively. 7.0, 6.4, 4.7, 4.7, 4.4, 4.0, 3.6, 3.6, 3.2, 2.7, 2.7, 2.3, 2. 1, 1.9, 1.5, 1.3, 1.2 kbpC-3 strain of Lotus japonicus nuclear polyhedrosis virusIt is.
[0007]
  An embedding body according to a second aspect of the present invention contains the scorpion carp nuclear polyhedrosis virus according to the first aspect..
[0008]
  Claim3The pest control material according to the invention described in claim 1 contains the lotus moth nuclear polyhedrosis virus according to claim 1..
[0009]
  Claim4The pest control material of the invention described inClaim 1A pest control material containing a virus component consisting of the second type of Japanese scorpion nucleopolyhedrovirus and the second type of spleen nucleopolyhedrosis virus, wherein When DNA is cut with EcoRI restriction enzyme,At least 20DNA fragment is observedThe lengths of the DNA fragments are 15.4, 11.8, 11.0, 10.6, 9.8, 9.4, 8.6, 5.5, 4.7, 4.6, 4 and 4, respectively. .4, 4.0, 3.4, 2.2, 1.8, 1.6, 1.4, 1.3, 1.1, 1.0 kbp.It is characterized by this.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described in detail.
Wild Japanese dragonfly nuclear polyhedrosis virus (Nuclear Polyhedrosis Virus (Baculoviridae subgroup A), hereinafter referred to as NPV) inhabiting in Japan is classified into three types A to C described below. These three types of NPV are classified by being represented by different electrophoresis patterns when analyzed by a restriction enzyme cleavage analysis method of genomic DNA. That is, these three types of NPV have different electrophoretic patterns as shown in FIG. 1 when agarose gel electrophoresis is performed after genomic DNA is completely cleaved with EcoRI restriction enzyme. The length and type of each staining band found in the electrophoresis pattern shown in FIG. 1 are shown in Table 1 below.
[0011]
[Table 1]

As shown in FIG. 1 and Table 1, A type (specific type or first type) NPV is, for example, a to z (clone A-1), or a to z and α (clone A-9). No. 26-27 staining bands (EcoRI-cleaved DNA fragments) of FIG. This NPV has the greatest feature that no DNA fragment longer than 16 kbp (15.4 kbp according to the measurement by the present inventors) is observed. Next, this NPV has a great feature in that a DNA fragment of 2.2 to 3.4 kb is not recognized (cannot be detected). Subsequently, this NPV is characterized in that DNA fragments of 8 to 12 kbp are particularly dense, and finally DNA fragments at two locations of 3.4 to 15.4 kbp and 1.0 to 2.2 kbp. It is characterized by being able to concentrate.
[0012]
In the above and the following description, a DNA fragment is not recognized (cannot be detected) is a condition in which a staining band of 2 kbp or less can be reliably detected visually or by a quantitative device such as a densitometer in the electrophoresis pattern. This means that the DNA fragment cannot be detected visually or with the quantitative device. Further, in the electrophoresis pattern of NPV belonging to this A type, there are some individual differences between clones as seen, for example, between clone A-1 and clone A-9 in FIG.
[0013]
B type NPV has an electrophoresis pattern in which, for example, about 25 to 26 stained bands of a to y (clone B-1) or a to z (clone B-9) are clearly confirmed. . This NPV has the greatest feature that a DNA fragment longer than 16 kbp (about 19 kbp according to the measurement by the present inventors) is clearly recognized, and is easily distinguished from the A type NPV by this feature. Next, this NPV is greatly characterized in that a DNA fragment of 5.9 to 6.9 kbp is not observed (cannot be detected), and subsequently a DNA fragment of 2.6 to 4.5 kbp is not observed (detection) It is characterized in that a DNA fragment of 1.0 to 1.7 kbp is not observed (cannot be detected). Finally, this NPV is characterized in that DNA fragments are concentrated at three sites of 6.9 to 12.9 kbp, 4.5 to 5.9 kbp, and 1.7 to 2.6 kbp. In addition, in the electrophoresis pattern of NPV belonging to this B type, there are some individual differences between clones as seen, for example, between clone B-1 and clone B-9 shown in FIG.
[0014]
The C-type (second type) NPV is a virus that the present inventors have discovered for the first time, and has been isolated from a diseased insect of the Japanese common cutworm inhabiting Gifu Prefecture. For example, this NPV has an electrophoresis pattern in which 26 stained bands of a to z (clone C-3) are clearly confirmed. This NPV has the greatest feature that a DNA fragment longer than 16 kbp (about 19 kbp according to the measurement by the present inventors) is clearly recognized, and is easily distinguished from the A type NPV by this feature. Next, this NPV is characterized by the fact that a 4.7 to 6.4 kbp DNA fragment is not observed (cannot be detected), and then the length of the DNA fragment is dispersed throughout. is there. That is, the C-type NPV is easily distinguished from the B-type NPV by the feature that a 4.7 to 5.9 kbp DNA fragment is not detected (cannot be detected). There are also some individual differences among clones in the electrophoresis pattern of NPV belonging to this C type.
[0015]
Any of these AC type NPV is a virus that infects Spodoptera litura as a host, and has an insecticidal ability to kill the host after growing in the living body of the host. The lotus beetle is a pest of agricultural crops that eats and damages soybean leaves and the like. This lotus beetle is an insect that grows according to a life cycle that repeats larvae, pupae, adults and metamorphosis from eggs, and causes the greatest agricultural damage during the larval period. As the larvae, the growth age is increased one by one every time molting is repeated, and there are stages from 1 to 6 years of age. This Lotus moth is more resistant to infection by increasing resistance to pathogenic viruses such as NPV as it grows in old larvae after the age of 4 years. Furthermore, after 4 years of age, the amount of food intake increases rapidly, greatly expanding agricultural damage. In addition, the field clover is active without sleeping and repeats its own life cycle depending on the environmental temperature. For this reason, the field lotus leaves are very rarely matured, and a large amount of pest control material must be sprayed to reduce agricultural damage.
[0016]
Spodoptera littoralis is an example of a close relative of the Spodoptera littoralis, and Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda are examples of the same species of the genus Spodoptera. AC type NPV has the ability to infect and kill Spodoptera litoralis. In addition, it has been confirmed that A-type and B-type NPVs form polyhedra in vitro in cultured cells derived from Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda.
[0017]
The A-type NPV has a property that it easily invades the body cavity of the Spodoptera litura larvae, that is, a property that infection tends to be established, as compared with the B-type and C-type NPV. C-type NPV is slightly less likely to penetrate into the body cavity of the scallop larvae than A-type NPV, but once it has entered the body cavity of the larvae, it exhibits a remarkably high proliferation ability within the body cavity.
[0018]
In addition, the A-type NPV is significantly more susceptible to infection with the moth larvae of 3 years old (larvae with a relatively weak immune system) than the B-type and C-type NPV. The most lethal action. However, in this type A NPV, infection is considered to be easily established for larvae after 4 years of age (larvae with a relatively strong immune system function), but they are easily excluded by the immune system function in the host body cavity. The action of killing the host is slightly weaker than that of C-type NPV. In addition, since the C-type NPV is remarkably excellent in the proliferation ability after the infection is established, there is little risk of being eliminated by the host immune system of the third and fourth instar larvae. Superior to Type and B type.
[0019]
On the other hand, the A-type NPV expresses a large amount of polyhedrin protein in the cells of the host after the establishment of infection to the host, compared with the B-type and C-type NPV, and a large number of them in the nucleus. Excellent ability to form embedded bodies. The A-type NPV has a weaker spread effect on the whole somatic cells of the host after the establishment of the infection to the host than the C-type NPV. C-type NPV has a weaker effect of forming an embedded body in the cell nucleus of the host after infection of the host is established, compared to A-type NPV. Compared with A type and B type NPV, this C type NPV spreads the infection to the whole somatic cells of the host quickly after the establishment of infection to the host, and overall activities including feeding activities of the host. The action of stopping is remarkably high.
[0020]
In particular, each of these types of NPV is most preferably cloned by an in vitro cloning method, since each of the above effects is remarkably easily and effectively enhanced. In the in vitro cloning method, a single NPV clone is isolated using a known cloning technique such as a plaque method after infecting NPV with insect-derived cultured cells that have been subjected to monolayer culture. Examples of the plaque method include the method of Hink and Vail (Journal of Invertebrate Pathology, 22, P158-174, 1983).
[0021]
The embedding body of the embodiment is obtained by inoculating a single NPV clone cloned by an in vitro cloning method into a living body of a Spodoptera litura larvae and then proliferating the NPV in a large amount in the living body of the larvae. The obtained NPV single clone is contained in a large amount. As this embedding body, it is used in the form of the filtered material which filtered the dead insect of the Spodoptera litura which highly contained the said NPV, or the crushed material of this dead insect. Incidentally, when inoculating the infection source into the larvae body, oral infection or a method of injecting into the body cavity is adopted, but in order to obtain an embedded body efficiently, a method of injecting into the body cavity is used. Preferably used.
[0022]
The pest control material (agrochemical) of the embodiment is used for suppressing agricultural damage caused by feeding activity of the Japanese common cutworm by performing biological control on the common cutworm. This insect pest control material contains a virus component as an active ingredient that performs biological control against Spodoptera litura. In addition, in this pest control material, components other than viruses (non-viral components) may be simultaneously contained as necessary. As the virus component, a single clone, a plurality of clones or a plurality of types of NPV are used. This pest control material can easily handle a large amount of NPV, and is excellent in preservability and persistence after spraying. Therefore, it is preferable to contain the embedded body, and consists of a single clone of NPV. It is most preferable to include one or more kinds of embedded bodies. In addition, as the non-viral component, an oral infection enhancer (such as a stilbene-based fluorescent bleaching agent) or a spreader for promoting the establishment of oral infection against the Japanese pearl moth larvae, an additive for preventing inactivation of NPV by ultraviolet rays Agents and the like.
[0023]
The pest control material containing only the A-type NPV as the virus component is more effective in killing cedar moth larvae, particularly larvae before the age of 3 (lethal rate) than the pest control materials containing multiple types of NPV. ) Has improved dramatically. The pest control material containing C-type NPV as a viral component is applied to the entire scorpion moth larvae population that is unevenly grown compared to the pest control material containing a viral component consisting of the A-type and / or B-type NPV. On the other hand, it is easy to slow down its activities, and it has the function of easily suppressing the damage of eating crops.
[0024]
On the other hand, a pest control material containing the A type and C type NPV as the virus component (the B type may be contained) exhibits the advantages of both types. That is, this pest control material promotes the spread of infection in the living body of the larva after the A-type NPV promotes the establishment of the infection to the Japanese moth larvae. The spread of infection by the C-type NPV is greatly facilitated by the infection of the A-type NPV. Moreover, the pest control material (only B type is not contained) which contains only A type and C type NPV as a virus component exhibits the advantage of both said types most effectively.
[0025]
The effects exhibited by the above embodiment will be described below.
-C type NPV of embodiment is a wild NPV of the type newly discovered this time as a result of the present inventors' earnest research. This NPV has a genomic DNA different from that of known viruses as disclosed in Non-Patent Document 1, and has properties different from those of known viruses. In particular, this NPV is useful for biological control of larvae because it has a high ability to spread the infection against Spodoptera litura after the establishment of infection. In other words, the NPV can stop the feeding activity on the Japanese squirrel extremely quickly due to the ability to spread the infection, so that the agricultural damage can be easily and effectively suppressed. Furthermore, since this NPV has a high lethal effect not only on larvae before the third instar but also on the fourth instar scorpion larvae, it can easily increase the mortality rate for the populations of the cedar moth larvae whose developmental ages are not uniform in the field. The biological control effect when used as a pest control material can be easily enhanced.
[0026]
-The pest control material containing a virus component consisting only of A-type NPV is composed only of A-type NPV, which has a markedly high lethality against larvae before the third instar, so that the infectious lethal capacity by the NPV is It is remarkably sharp and has a very high effect on the biological control (especially complete control) of the Japanese cypress. At this time, the effect of reducing the number of insect pests that are moribund but can be lethal can be exhibited by infection with other types of NPV.
[0027]
-The pest control material containing the virus component consisting of A type and C type NPV can perform epoch-making biological control that exhibits the advantages of both types. This insect pest control material stops feeding activity of Cyprus litura larvae by C-type NPV immediately after spraying, and can achieve almost complete extermination of C. elegans by A-type NPV after a predetermined period of time. Can be suppressed remarkably effectively. The C-type NPV in the pest control material is mainly intended to stop the feeding activity of the pests at an early stage. Therefore, the concentration ratio is equal to or less than that of the A-type NPV (individual inclusion body / ml). However, it is not particularly limited.
[0028]
【Example】
Hereinafter, examples and comparative examples embodying the embodiment will be described.
<Cloning and identification of NPV>
For NPV cloning, isolates from strains preserved at the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, universities and public test sites (collected in various places in Japan other than Gifu Prefecture), and from field squirrels infected with field moths collected in fields in Gifu Prefecture 18 samples of the pathogenic virus were used. Since each of these samples usually contains a plurality of types of NPV clones, they were separated (cloned) into single clones using an in vitro cloning method incorporating the Hink and Vail plaque method.
[0029]
That is, first, 1 × 10⁶Individual TUAT-SpLi-221 cells were cultured in a monolayer in a culture dish having a diameter of 35 mm. The TUAT-SpLi-221 cells were cultured at 28 ° C. in IPL-41 medium (Weiss et al., In Vitro, 17, P495-502, 1981) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). . Next, after removing the culture solution in the culture dish, 400 ml of each sample (sample solution) was added per dish and stirred at room temperature for 1 hour to adsorb NPV in the sample solution to insect cells. Thereafter, the sample solution in the culture dish was removed, and 3 ml of IPL-41 medium containing 0.75% agarose and 10% FBS was overlaid. After 5 days, the resulting plaque was collected with a Pasteur pipette and suspended in a small amount of IPL-41 medium. By repeating the above operation three times, 228 NPV clones were cloned.
[0030]
Genomic DNA was extracted from these NPV clones by the method of Lavina et al. (Biological Control, 20, P39-47, 2001), subjected to restriction enzyme treatment with EcoRI, and then subjected to agarose gel electrophoresis, and classified into 33 genotypes. It was done. A part of it is shown in FIG. These 33 types of genotypes can be roughly classified into three types (A to C types) from the characteristics of their electrophoretic patterns, and it is clear that there are at least three types of NPV in Japan. Became.
[0031]
The type A is a closely related species of Spodoptera litoralis nuclear polymorphism mainly distributed in the Mediterranean coastal area as reported by Cherry and Summers (Journal of Invertebrate Pathology, 46, P289-295, 1985). It was found to be very similar to the somatic disease virus. The B type has a very high similarity to the NPV reported and separated in Asia as reported in Non-Patent Document 1 and Lavina et al. (Biological Control, 20, P39-47, 2001). There was found. On the other hand, the C type was found to be a new type of virus that is completely different from the electrophoretic pattern of NPV reported so far. This C type clone was isolated only from diseased insects in Gifu Prefecture. The clones belonging to the A type were named A-1 to A-20, the clones belonging to the B type were named B-1 to B-10, and the clones belonging to the C type were named C-1 to C-3.
[0032]
<Production of embedded body>
In order to minimize the possibility of genomic variation, the 33 types of NPV clones were grown on the cultured cell line at a minimum number of times with a minimum number of times, and then the culture medium containing the cells was 3,000 rpm. The precipitate was collected by centrifugation and suspended in a small amount of water. This suspension was added to an artificial feed and ate by a 4 year old spinner moth larva, and an infected and dead individual was collected. Furthermore, after homogenizing the lethal individuals and filtering through a nylon mesh of about 100 mesh to remove large contaminants such as the head and body hair, the crude individuals were roughly purified by obtaining a centrifugal supernatant at 3,000 rpm, An embedding body was obtained by suspending in sterilized water containing a surfactant (about 0.02% Tween 80). Finally, the concentration of the embedded body (individual embedded body / ml) was counted with a hemocytometer using a microscope.
[0033]
<Comparison of insecticidal ability of NPV clone 1>
A-1, A-9, B-1, B-9, and C-3 were selected as arbitrary clones from each type, and insecticidal ability was compared using an insect organism. First, each of these clones is 5 × 10⁶After adjusting the concentration to individual embedding body / ml, the dilution series was prepared, and the 3rd instar scorpion larvae were reared by the droplet feeding method of Hughes and Wood (Journal of Invertebrate Pathology, 37, P154-159, 1981). 30 animals were orally inoculated and infected. The number of dead individuals until 14 days after infection was counted, and the cumulative death rate (%), which is the ratio of the cumulative number of dead individuals to the total number of individuals, was determined for each clone. The same test was repeated several times, and the half-lethal concentration (LC) that killed 50% of Spodoptera litura by the probit method of Finney (Probit analysis, Cambridge University Press, UK, P333) based on the cumulative mortality data.₅₀Value).
[0034]
As a result, LC of A-1, A-9, B-1, B-9 and C-3₅₀Each value is 7.0x10^Four4.4 × 10^Four1.9 × 10⁶1.8 × 10⁶And 7.3 × 10^FiveIndividual embedding body / ml. Therefore, it was found that the A type NPV clones (A-1 and A-9) cloned by the in vitro cloning method have a lethality more than 10 times higher than the B and C type NPV. It has also been found that C-type NPV has a higher lethal ability than B-type NPV.
[0035]
<Comparison 1 of NPV clone growth ability>
About each said clone, the growth capability was compared using the insect living body. That is, first, each clone was orally inoculated and infected with a 4th-year-old Spodoptera litura larvae bred in succession by the droplet feeding method. Body fluid was collected from Spodoptera litura 24, 48, 72, 96 and 120 hours after infection, and the concentration (titer) of NPV budding virus contained in the body fluid was counted by the plaque method and shown in FIG. As a result, it was confirmed that the proliferation ability of the A type NPV in the very initial infection (1-2 days) was outstandingly high. In addition, C-type NPV has a budding virus titer of 10 compared to A and B types after 3 days of infection.^Three-10^FourIt was shown to be about twice as high, and thereafter the titer concentration was maintained continuously until the insects were lethal.
[0036]
<Comparison 2 of NPV clone growth ability and insecticidal ability>
Inoculated into the body cavity by injection into 4th-instar larvae that had been each of the clones raised to 100 PFU / individual, and after 72 hours, body fluid was collected from Spodoptera litura, and the budding virus concentration (titer) of NPV contained in the body fluid was collected. Counted by plaque method. As a result, the budding virus concentrations of A-1, A-9, B-1, B-9 and C-3 were 2.9 × 10 respectively.^Five7.8 × 10^Five2.7 × 10^Five1.1 × 10^FiveAnd 2.5 × 10⁸PFU / ml. Therefore, by injecting a very small amount of virus of 100 PFU / individual against 4th instar larvae, growth of all NPV clones was observed. Furthermore, C type NPV is 10% more than other types.^ThreeAbout twice as much viral load was detected.
[0037]
Moreover, the number of dead individuals of Spodoptera litura injected with NPV under the same conditions was counted, and the cumulative mortality (%) was determined and shown in FIG. From the results of FIG. 3, it was shown that C-type NPV killed Spodoptera litura more than one day earlier than other types of NPV. Furthermore, in this C type NPV, the host's feeding cessation was observed 3 days after the injection, and it was shown that a high damage reduction effect could be exhibited. Moreover, in all types of NPV of A to C, even if the injection amount of the virus is very small, almost all individuals can be killed in a short period of about 8 days by direct injection into the body cavity. It was also shown that this is possible. This result is considered to be due to the fact that the individuals who were not lethal by oral infection in the comparative insecticidal ability 1 of the NPV clones escaped the infection.
[0038]
<Insecticidal ability of NPV clone mix>
After preparing an NPV clone mix in which A-1 and C-3 NPV clones, or A-9 and C-3 NPV clones were mixed at the same concentration, 5 × 10 5⁶The concentration was adjusted to individual embedding body / ml. Each of A-1, A-9, and C-3 NPV clones is 5 × 10 5⁶The concentration was adjusted to individual embedding body / ml. Next, these NPV clones were orally inoculated and infected with 3rd-year-old Spodoptera litura larvae bred in succession by the above-described droplet feeding method. Every 24 hours after infection, the number of dead Spodoptera litura was counted, and the cumulative mortality (%) was determined, and is shown in FIG. Moreover, the result of having done the same test about each clone shown by FIG. 5 was shown in FIG.
[0039]
From FIG. 4, the time-dependent change in the cumulative mortality of the A + C type NPV clone mix was significantly higher in the proportion of individuals who died early after infection than the A type or B type clone alone. In addition, the cumulative mortality rate when orally infecting C type alone was about 50% even 14 days after infection, but almost all individuals died around 10 days after infection with the A + C type NPV clone mix. Was shown. On the other hand, FIG. 5 shows that the cumulative mortality rate was as low as 50% or less even after 2 weeks. Therefore, it was shown that the NPV clone mix which consists of A type and C type is remarkably suitable for pest control.
[0040]
<Field farm simulation>
The insecticidal properties of each NPV clone against soybeans in the field can be predicted and confirmed by simplifying the conditions by a bioassay using soybean leaves grown in pots. First, each NPV clone shown in FIG. 6 and FIG.⁶10^6.510⁷Or 10^7.2It adjusted so that it might become the density | concentration of an individual embedding body / ml. The numerical values shown in parentheses in the legends of FIGS. 6 and 7 represent the logarithmic values of the concentrations. Next, leaves were collected from soybeans cultivated in a glass greenhouse for 50 days, immersed in each NPV clone solution (containing 0.03% of a spreading agent) and air-dried. Subsequently, after feeding the soybean leaves for 3 days to the 3rd or 4th-year-old Spodoptera litura larvae that were bred in succession, they were given a clean artificial feed insector LF (manufactured by Nippon Agricultural Industry Co., Ltd.) and individually bred in plastic cups. did. From the start of breeding (infection), the number of dead Japanese scorpions was counted to determine the cumulative mortality rate (%). FIG. 6 shows the results of breeding with the 3rd-instar spodoptera larvae, and FIG. 7 shows the results of breeding with the 4-year-old Spodoptera litura larvae. Further, FIG. 8 shows a summary of the cumulative mortality on the sixth day from the start of the individual breeding in a bar graph.
[0041]
As a result, NPV clone 10^7.2At a concentration below 1 embedding body / ml, the final cumulative mortality rate is higher for the A type than for the C type, but the C type is faster than the A type for the time to death. I understand. In particular, C-type NPV has a markedly higher ability to infect and kill 4th-year-old Lotus larvae than A-type larvae, and can be used as an effective insect control material for 4th-year-old larvae. Therefore, at the conditions at which infection is established in all individuals or at a concentration that causes the same lethality, the lethal time due to the C type is expected to be reduced compared to the A type. Furthermore, the effect was remarkably enhanced at 4 years of age compared to 3 years of age, and the effectiveness after 4 years of age when the food damage was high was confirmed.
[0042]
  Furthermore, the technical idea that can be grasped from the embodiment is described below..
[0043]
  ・Claim 1The Japanese boxworm nucleopolyhedrovirus is characterized by being cloned by an in vitro cloning method.HarmInsect control material.
[0044]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present invention has the following effects.
According to the Lotus carp nucleopolyhedrovirus of the invention described in claim 1, it is possible to easily exhibit a high infection spreading ability against the Lotus carp larvae after the infection is established.
[0045]
According to the embedded body of the invention described in claim 2, it is possible to easily exhibit a high infection spreading ability with respect to the Spodoptera litura after the infection is established. According to the embedded body of the invention described in claim 3, it is possible to easily provide a pest control material capable of performing biological control extremely effectively against Spodoptera litura.
[0046]
  Claim3According to the insect pest control material of the invention described in the above, it is possible to easily exhibit a high infection spreading ability against the pearl moth larvae after the infection is established. Claim4According to the pest control material of the invention described in <3>, biological control can be performed extremely effectively against Spodoptera litura.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an electrophoresis pattern obtained by digesting genomic DNA with EcoRI.
FIG. 2 is a graph showing the test results of Comparative Example 1 for the proliferation ability of Examples.
FIG. 3 is a graph showing the test results of Comparative Example 2 for insecticidal ability of Examples.
FIG. 4 is a graph showing the test results of insecticidal ability of the clone mix of Example.
FIG. 5 is a graph showing the test results of insecticidal ability of the clone mix of Example.
FIG. 6 is a graph showing the results of a field farm simulation test for third-instar larvae of Examples.
FIG. 7 is a graph showing the results of a field farm simulation test for 4th instar larvae of Examples.
FIG. 8 shows the cumulative mortality rate on day 6 in the field farm simulation test of the example.

Claims (4)

When genomic DNA was digested with EcoRI restriction enzyme, at least 26 kinds of DNA fragments were observed, and the sizes of the DNA fragments were 19.6, 13.7, 13.0, 11.5, 8.6, respectively. 8.6, 7.7, 7.7, 7.0, 7.0, 6.4, 4.7, 4.7, 4.4, 4.0, 3.6, 3.6, 3.6, 3. C-3 strains of Spodoptera nucleopolyhedrovirus, which is 2, 2.7, 2.7, 2.3, 2.1, 1.9, 1.5, 1.3, 1.2 kbp.   The embedding body containing the Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus according to claim 1.   A pest control material containing the Lotus carp nucleopolyhedrovirus according to claim 1.   It is a pest control material containing the virus component which consists of the spodoptera nucleopolyhedrovirus of claim 1 and a second type of scabbard nucleopolyhedrovirus, which comprises the second type of Spodoptera nucleopolyhedron. In the disease virus, when genomic DNA is cut with EcoRI restriction enzyme, at least 20 kinds of DNA fragments are observed, and the lengths of the DNA fragments are 15.4, 11.8, 11.0, 10.6, 9.8, 9.4, 8.6, 5.5, 4.7, 4.6, 4.4, 4.0, 3.4, 2.2, 1.8, 1.6, 1. The pest control material which is 4, 1.3, 1.1, 1.0 kbp.

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