JP4102573B2

JP4102573B2 - Method for producing cyclic tetrasaccharide

Info

Publication number: JP4102573B2
Application number: JP2002041576A
Authority: JP
Inventors: 光渡辺; 真之中野; 倫夫久保田; 恵温福田; 俊雄三宅
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2022-02-19
Also published as: JP2003235596A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端の何れか一方が非還元性末端で他方が還元性末端であって、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・イクイバレント（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ＝ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、低分子、低粘度で、甘味及び反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変し悪臭を発生し、得られる製品の品質を劣化し易いとの欠点を有することが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランスアミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシル結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かした各種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、及び特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、このトレハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デキストリンは工業的規模で生産され、それらの特性を生かした各種用途に利用されているものの、斯かる非還元性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。
【０００３】
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（ＥｕｒｏｐｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合とで交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（以下、本明細書では本糖質を「環状四糖」と略称することもある。）が生成することが示されている。斯かる環状構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用を有するとともに、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく各種用途に利用、加工できることが期待される。
【０００４】
しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。
【０００５】
斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際特許公開番号ＷＯ０１／９０３３８Ａ１明細書で開示したように、土壌からの分離菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するα−イソマルトシル転移酵素産生微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株およびＡ１９株が、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を産生することを見出し、豊富で安価に供給される澱粉を原料とする澱粉部分分解物に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、高収率で環状四糖を生成できることを見出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、両酵素を併用した環状四糖又はこれを含む糖質及びその製造方法、併せて、これら方法により得られる環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、環状四糖の製造方法として、更なる新規な方法の提供が望まれる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環状四糖の新規製造方法を提供することを課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、環状四糖を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、先に見いだしたバチルス属、アルスロバクター属などの細菌とは全く異なるサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が、菌体中に環状四糖を著量生成することを発見した。
【０００８】
本発明者等は、酵母を培養し、この培養物から環状四糖を採取することによる環状四糖の新規製造方法を確立し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の酵母は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖産生能を有するサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であればよく、その由来は問わない。例えば、サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が有利に用いられ、例えば、ＩＦＯ０３０４、ＡＴＣＣ９７６３などや、更には、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母などからの酵母であってもよい。
【００１０】
本発明の酵母の培養に用いる培地は、酵母が生育でき、環状四糖を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、酵母が生育に利用できる物であればよく、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、Ｌ−ソルビトール、糖蜜など糖質、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物や、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
【００１１】
培養は、通常、温度４乃至４０℃、好ましくは１０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは２乃至９から選ばれる条件で行われる。培養時間は酵母が増殖し環状四糖を産生しうる時間であればよく、好ましくは１０時間乃至５００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はなく、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００１２】
このようにして酵母を培養した後、この培養物から環状四糖を回収する。環状四糖は、主に酵母菌体中に認められ、菌体そのものを環状四糖含有物として採取することも、培養物全体を環状四糖含有物として用いることもできる。菌体を回収するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。また、公知の方法によって、環状四糖を菌体から抽出、さらに、精製して、利用することもできる。抽出する方法としては、水抽出、熱水抽出、アルコールなど溶媒抽出、細胞壁分解酵素など酵素処理、超音波やフレンチプレスなどの破砕処理、ガラスビーズやアルミナなどを用いた磨砕処理などが採用される。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状四糖を利用せず夾雑物質を資化又は分解する微生物、例えば、乳酸菌、酢酸菌、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などによる残存している還元性糖質の分解除去などの方法を１種または２種以上を組み合わせた精製方法が有利に採用できる。
【００１３】
このようにして得られた環状四糖またはこれの含量を向上させた水溶液は、通常、環状四糖を、固形物当り、１ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）以上、望ましくは１０％以上含有する水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００１４】
更には、本発明における環状四糖の結晶を製造するには、通常、前記の精製方法を用いた、望ましくは環状四糖を、固形物当り約４０％以上含有する水溶液が用いられる。結晶の形態として、５乃至６含水結晶を製造する場合には、通常、この水溶液を環状四糖の過飽和水溶液、例えば、濃度約４０％乃至９０％水溶液とし、これを助晶缶にとり、約０．１乃至２０％の種結晶共存下で、過飽和を保つ温度、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、結晶を含有するマスキットを製造する。１含水結晶や無水結晶を晶出させる場合には、一般的には、更に高濃度、高温度での過飽和条件が採用される。マスキットから結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。また、１含水結晶や無水結晶は５乃至６含水結晶を脱水又は乾燥させて製造することもできる。このようにして製造される本発明の環状四糖結晶又はこれの高含有粉末は、上品で温和な低甘味を有する非還元性乃至低還元性の白色粉末で、耐酸性、耐熱性に優れた安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも少なく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、吸湿性も低く、粉末状物の付着、固結を防止できる。
【００１５】
また、環状四糖自体は、包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化が防止されることから、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れており、保香剤、安定剤などとして好適である。この際、必要ならば、他の環状糖質、例えば、環状デキストリン類、分岐環状デキストリン類、環状デキストラン類、環状フラクタン類などを併用して、安定化を強化することも有利に実施できる。
【００１６】
更に、環状四糖自体は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。換言すれば、環状四糖を摂取すれば、糖質としての重量、容量があるので、満腹感が得られるものの実質的に消化されず、低カロリー食品素材、ダイエット食品素材として好適である。また、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００１７】
更に、環状四糖自体は、耐酸性、耐アルカリ性、耐熱性に優れた無毒、無害の天然甘味料である。
【００１８】
また環状四糖自体は、安定な甘味料であることにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、安定性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性、蛋白質変性防止性、脂質劣化防止性などの性質を具備している。
【００１９】
従って、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物は、甘味料、難醗酵性食品素材、難消化性食品素材、低う蝕性食品素材、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、固結防止剤、保香剤、澱粉老化防止剤、蛋白質変性防止剤、脂質劣化防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、そのままで、又は必要に応じて、公知材料と適宜併用して、各種組成物、例えば、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などに有利に利用できる。公知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、薬効成分などが適宜利用できる。
【００２０】
本発明の環状四糖又はこれを含む含有物は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース（α，α）、蜂蜜、メープルシュガー、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と併用して使用することも、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロースなどの高甘味度甘味料などと併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして利用することも好適である。
【００２１】
また、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００２２】
また、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、風味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２３】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、粉末みりん、粉末アルコール、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のたれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料へ甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、醸造酒、果実酒、ウィスキー、清酒、ビール、発泡酒、リキュール、カクテル、スピリッツ類、焼酎などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、アミノ酸含有飲料、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、風味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
【００２４】
また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上又はカロリーを低減させるなどの目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００２５】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、化粧品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、クマザサエキス、モモの葉エキス、ビワの葉エキス、ユズの皮エキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、化粧品、医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００２６】
以上述べたような各種組成物に環状四糖又はこれを含む含有物を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、環状四糖の種々の特性、とりわけ包接作用、呈味改良、風味改良などを発揮させるためには、環状四糖として、固形物当たり０．１％未満では不充分で、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
【００２７】
以下、本発明の実施例を述べる。
【００２８】
【実施例１】
＜酵母からの環状四糖の調製＞
グルコース１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『粉末酵母エキス−Ｓ』、日本製薬株式会社製）０．３ｗ／ｖ％、麦芽抽出物（商品名『ＭａｌｔＥｘｔｒａｃｔ、Ｂａｃｔｏ』、ディフコ社製）０．３ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、酵母サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ９７６３を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで７２時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００２９】
スクロース３０ｗ／ｖ％、アスパラギン１水和物０．３ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム七水和物０．３ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地をｐＨ５．５に調整した後、３ｌ容三角フラスコに１．６ｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、種培養液２００ｍｌを接種し、温度２７℃で２５日間静置培養した。この培養液に、予めオートクレーブ（１２０℃、２０分間）した濃度６６．７％のスクロース水溶液６００ｇを加えて、さらに温度２７℃で１４日間静置培養を続けた。得られた培養液約１８ｌを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）して、湿菌体重量として酵母菌体約８４ｇを回収した。
【００３０】
得られた酵母湿菌体（約８４ｇ）に８０ｖ／ｖ％エタノール水溶液６７２ｍｌを加え懸濁し、温度８５℃で還流抽出を３０分間行った後、珪藻土濾過して濾過液を回収した。得られた濾液をエバポレーターで減圧濃縮してエタノールを留去し、さらに水約６００ｍｌを加えた後、エタノール臭が無くなるまで約３００ｍｌに減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶物を除去した後、再度減圧濃縮して濃縮抽出液約５０ｍｌを得た。
【００３１】
得られた濃縮抽出液（約５０ｍｌ）に濃度１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌを加え、温度約１００℃で１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ分解した後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、エバポレーターで減圧濃縮して、固形分濃度約１１ｗ／ｖ％の濃縮液約３ｍｌを得た。この濃縮液を分取用高速液体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱＲ−３５５−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液には水を用いてカラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させ、溶出時間約３２分乃至３９分の溶出液約２１０ｍｌを回収し、エバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥して固形分として約２４０ｍｇの糖質粉末を得た。
【００３２】
得られた糖質粉末について、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＬＰＣ）で純度を分析したところ、溶出時間約１１．１分に溶出ピークを示す糖質の本糖質粉末中の純度は約９８．２％であり、高純度の糖質標品であることがわかった。また、対照として国際特許公開番号ＷＯ０１／９０３３８Ａ１明細書の実験２３に記載の方法で調製した環状四糖を用いて同様にＨＰＬＣを行ったところ、同一の溶出時間の約１１．１分に溶出ピークを示すことも判明した。尚、ＨＰＬＣは、カラムにＯＤＳＡＱ−３０３カラム（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）を、溶離液に水を用いてカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００３３】
得られた糖質標品について、高速原子衝撃法による質量分析（通称ＦＡＢ−ＭＳ）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であり、環状四糖の質量数と同じであることが判明した。
【００３４】
また、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、得られた糖質の構成糖はＤ−グルコースであり、環状四糖の構成糖と同じであることも判明した。
【００３５】
さらに、得られた糖質標品を用いて核磁気共鳴法（以下、ＮＭＲと略称する）を行ったところ、図１に示す^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図２に示す^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを環状四糖標品のものと異同を比較したところ、実質的に同一であることが判明した。
【００３６】
以上のことから、酵母菌体から抽出・精製した糖質がサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖であることが判明した。
【００３７】
【実施例２】
＜酵母含有物からの環状四糖の調製＞
市販の酒粕（兵庫県加東郡滝野町、山田酒造食品（株）製造）１ｋｇに８０ｖ／ｖ％エタノール水溶液約６ｌを加え懸濁し、温度８５℃で還流抽出を３０分間行った後、珪藻土濾過して濾過液を回収した。得られた濾液をエバポレーターで減圧濃縮してエタノールを留去し、さらに水約３ｌを加えた後、エタノール臭が無くなるまで減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶物を除去した後、再度減圧濃縮して、固形分を約５８ｇ含む抽出液約１０００ｍｌを得た。
【００３８】
得られた抽出液をｐＨ５．０、温度５０℃に調整し、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ』天野製薬製造）を固形分１ｇ当たり１０，０００単位を加え、温度５０℃で２４時間保持した後、温度約１００℃で１０分間加熱し、水冷し、珪藻土濾過して不溶物を除去した。得られた濾過液に水酸化ナトリウム２３ｇを加え溶解させた後、温度約１００℃で１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ分解した後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、エバポレーターで減圧濃縮して、固形分として約２ｇを含む糖液約１３．９ｍｌを得た。
【００３９】
得られた糖液を２回に分けて分取用高速液体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱＲ−３５５−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液に水を用いてカラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させ、示差屈折計ＥＲＣ−７５３０（エルマ社製造）でモニターして溶出時間約３４分乃至３６分の溶出液約１８０ｍｌ（約９０ｍｌ×２回）を回収し、エバポレーターで減圧濃縮して、真空乾燥して約２２７ｍｇの糖粉末を得た。得られた糖粉末について、実施例１で用いたのと同様のＨＰＬＣで分析したところ、糖組成として環状四糖の純度が約９７．５％であることが判明した。
【００４０】
得られた糖粉末を蓋付き遠心管（１．５ｍｌ容）に移し、それに水０．２５ｍｌを加え、加熱して完全に溶解させた後、密栓して室温で２４時間放置したところ、結晶が析出した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、２分間）して、結晶と蜜を分離し、結晶を回収し、温度６０℃で常圧乾燥して約１２０ｍｇの結晶粉末を得た。得られた結晶粉末について、実施例１に記載のＨＰＬＣで分析したところ、糖組成として環状四糖の純度が約９９％以上で極めて高純度であることが判明した。さらに、粉末Ｘ線回折法で分析したところ、得られた粉末Ｘ線回折スペクトルが環状四糖５乃至６含水結晶のものと一致することがわかり、得られた結晶粉末が環状四糖５乃至６含水結晶であることが判明した。
【００４１】
【発明の効果】
以上、説明したように、本発明によれば、酵母の培養菌体よりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を製造することが可能となる。
【００４２】
従って、本発明の確立は、これまで酵素法のみが知られていたサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造方法に加え、サッカロマイセス属に属する酵母を用いた培養物からの新規な製造方法を提供し、その製造法の幅を広げ、必要に応じて製造方法を使い分けることを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母サッカロマイセスセレビシアエＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図２】酵母サッカロマイセスセレビシアエＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D- The present invention relates to a method for producing a cyclic tetrasaccharide having a structure of glucopyranosyl- (1 →).
[0002]
[Prior art]
  Amylose, amylodextrin, maltodextrin, maltooligosaccharide, isomaltoligosaccharide, and the like are known as saccharides containing glucose as a constituent sugar, for example, a partially decomposed starch produced using starch as a raw material. These carbohydrates are usually non-reducing at either end of the molecule.sexIt is known that the other end is a reducing end and the other is reducing. In general, in the partially decomposed starch, the magnitude of the reducing power per solid is expressed as dextrose equivalence (DE). Those having a large value are usually low in molecular weight, low in viscosity, strong in sweetness and reactivity, easily cause aminocarbonyl reaction with substances having amino groups such as amino acids and proteins, brown and generate bad odor. It is known to have the disadvantage that the quality of the resulting product is easily degraded. In order to improve such a defect, a method for reducing or eliminating the reducing power without changing glucose, which is a constituent sugar of the partially decomposed starch, has long been desired. For example, as disclosed in “Journal of American Chemical Society”, Vol. 71, pages 353 to 358 (1949), macerans amylase is applied to starch. There is known a method for producing α-, β-, or γ-cyclic dextrin in which 6 to 8 molecules of glucose are α-1,4 glucosyl-linked by acting. At present, these cyclic dextrins are produced from starch on an industrial scale, and are used in various applications taking advantage of their non-reducing properties, tastelessness, inclusion ability and the like. In addition, as previously disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 7-143766 and 7-213283, the applicant of the present invention converts a non-reducing carbohydrate-forming enzyme into a partially decomposed starch such as maltooligosaccharide. Also known is a method of producing trehalose in which two molecules of glucose are α, α-linked by acting a trehalose releasing enzyme. At present, this trehalose is produced from starch on an industrial scale, and is used for applications that make use of its non-reducing, mild and high-quality sweetness characteristics. As described above, α, α-trehalose having a glucose polymerization degree of 2, α-, β-, and γ-cyclic dextrin having a glucose polymerization degree of 6 to 8 are industrially used as non-reducing carbohydrates having glucose as a constituent sugar. Although produced on a scale and used for various applications that take advantage of these characteristics, the types of such non-reducing carbohydrates are limited, and a wide variety of non-reducing carbohydrates or low-reducing carbohydrates The establishment of
[0003]
  On the other hand, recently, a new cyclic tetrasaccharide having glucose as a constituent sugar has been reported. That is, in “European Journal of Biochemistry”, Vol. 226, 641 to 648 (1994), mainly glucose residues are α-1,3 bonds and α-1, With 6 bondssoCyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- by reacting alternan with alternating hydrolase alternanase. (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →} cyclic tetrasaccharide (hereinafter referred to as “cyclic tetrasaccharide” in this specification) The cyclic tetrasaccharide having such a cyclic structure is a non-reducing saccharide, exhibits inclusion ability, and stabilizes volatile organic substances. It is expected that it can be used and processed for various purposes without causing an aminocarbonyl reaction and without worrying about browning and deterioration.
[0004]
However, it is not only difficult to obtain the raw material alternan or the enzyme alternanase necessary for the production of the cyclic tetrasaccharide, but the microorganisms that produce such an enzyme are not readily available.
[0005]
  Under such circumstances, the present inventors belong to the genus Bacillus and Arthrobacter genus isolated from soil as previously disclosed in International Patent Publication No. WO01 / 90338 A1. α-Isomaltosyltransferase-producing microorganisms C9 strain, C11 strain, N75 strain and A19 strain are α-isomaltosylglucosaccharide producing enzymes and α-isomaltosyltransferases.ProduceHigh yields are obtained by allowing α-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme and α-isomaltosyltransferase to act on starch partial degradation products made from starch that is abundant and inexpensively supplied. Found that it is possible to produce a cyclic tetrasaccharide, and elucidated various properties of α-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme and α-isomaltosyltransferase, established its production method, and further used both enzymes together Cyclic tetrasaccharides or saccharides containing the same and methods for producing the same, as well as compositions such as foods, drinks, cosmetics, and pharmaceuticals containing the cyclic tetrasaccharides obtained by these methods or saccharides containing the cyclic tetrasaccharides were established. However, it is desired to provide a further new method for producing a cyclic tetrasaccharide.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel method for producing a cyclic tetrasaccharide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have extensively searched for microorganisms that produce cyclic tetrasaccharides. As a result, surprisingly, it was discovered that yeast belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces), which is completely different from the bacteria such as Bacillus genus and Arthrobacter genus previously found, produces a significant amount of cyclic tetrasaccharide in the microbial cell did.
[0008]
The inventors of the present invention established a novel method for producing a cyclic tetrasaccharide by culturing yeast and collecting the cyclic tetrasaccharide from the culture, thereby completing the present invention.
[0009]
  The yeast of the present invention is a cyclo{→ 6) -α-D-Glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-Glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-Glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-Glucopyranosyl- (1 →}Any yeast may be used as long as it belongs to the genus Saccharomyces having the structure: For example, Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae is advantageously used. For example, yeasts such as IFO0304, ATCC9763, and baker's yeast, beer yeast, wine yeast, sake yeast, shochu yeast, and the like may be used.
[0010]
The medium used for culturing the yeast of the present invention may be any nutrient medium that can grow yeast and produce cyclic tetrasaccharide, and may be either a synthetic medium or a natural medium. Any carbon source may be used as long as yeast can be used for growth. For example, carbohydrates such as D-glucose, D-fructose, lactose, sucrose, mannitol, L-sorbitol, molasses, plant-derived starch and phytoglycogen, Glycogen and pullulan derived from animals and microorganisms, partial decomposition products thereof, organic acids such as citric acid and succinic acid, and alcohols such as ethanol can also be used. The concentration of these carbon sources in the medium is appropriately selected depending on the type of carbon source. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen-containing materials such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract and meat extract. Moreover, as an inorganic component, calcium salt, magnesium salt, potassium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, zinc salt, iron salt, copper salt, molybdenum salt, cobalt salt etc. are used suitably, for example. Furthermore, amino acids, vitamins and the like are also used as necessary.
[0011]
The culture is usually performed under conditions selected from a temperature of 4 to 40 ° C., preferably 10 to 37 ° C., pH 4 to 10, preferably 2 to 9. The culture time may be a time that allows yeast to grow and produce a cyclic tetrasaccharide, and is preferably 10 hours to 500 hours. Moreover, there is no restriction | limiting in particular in the dissolved oxygen concentration of a culture solution, Usually, 0.5-20 ppm is preferable. For this purpose, means such as adjusting the amount of aeration, stirring, adding oxygen to the aeration, and increasing the pressure in the fermenter are adopted. The culture method may be either batch culture or continuous culture.
[0012]
After culturing the yeast in this way, the cyclic tetrasaccharide is recovered from this culture. Cyclic tetrasaccharides are mainly found in yeast cells, and the cells themselves can be collected as cyclic tetrasaccharide-containing materials, or the entire culture can be used as cyclic tetrasaccharide-containing materials. A known solid-liquid separation method is employed to recover the cells. For example, a method of centrifuging the culture itself, a method of filtering and separating using a precoat filter or the like, a method of separating by membrane filtration such as a flat membrane or a hollow fiber membrane, and the like are appropriately employed. Further, the cyclic tetrasaccharide can be extracted from the cells and further purified for use by a known method. As extraction methods, water extraction, hot water extraction, solvent extraction such as alcohol, enzyme treatment such as cell wall degrading enzyme, crushing treatment such as ultrasonic wave or French press, grinding treatment using glass beads or alumina, etc. are adopted. The As a purification method, a known method may be appropriately employed. For example, decolorization with activated carbon, desalting with H-type or OH-type ion exchange resin, ion-exchange column chromatography, activated carbon column chromatography, silica gel column chromatography. Such as fractionation by column chromatography such as alcohol, fractionation with an organic solvent such as alcohol and acetone, separation with a membrane having an appropriate separation performance, and further, microorganisms that assimilate or decompose contaminants without using cyclic tetrasaccharides, for example, A purification method combining one or more kinds of methods such as fermentation treatment with lactic acid bacteria, acetic acid bacteria, yeast, etc., and decomposition and removal of remaining reducing carbohydrates by alkali treatment can be advantageously employed.
[0013]
The cyclic tetrasaccharide thus obtained or an aqueous solution with an improved content thereof usually contains the cyclic tetrasaccharide at 1 w / w% (hereinafter, unless otherwise specified) per solid. w / w% is abbreviated as%.) More preferably, it is an aqueous solution containing 10% or more, and is usually concentrated to obtain a syrup-like product. Furthermore, it is optional to dry it into a powdered product.
[0014]
Furthermore, in order to produce the crystal of the cyclic tetrasaccharide in the present invention, an aqueous solution containing preferably about 40% or more of the cyclic tetrasaccharide based on the above-described purification method, desirably, the cyclic tetrasaccharide is used. When 5 to 6 hydrous crystals are produced as crystals, this aqueous solution is usually a supersaturated aqueous solution of a cyclic tetrasaccharide, for example, an aqueous solution having a concentration of about 40% to 90%. In the coexistence of 1 to 20% of seed crystals, the mixture is gradually cooled with stirring at a temperature that maintains supersaturation, preferably in the range of 10 to 90 ° C., to produce a mass kit containing crystals. In the case of crystallizing one hydrous crystal or anhydrous crystal, supersaturation conditions at a higher concentration and higher temperature are generally employed. As a method for producing crystals or honey-containing crystals containing the same from a mass kit, for example, a known method such as a honey method, a block pulverization method, a fluid granulation method, or a spray drying method may be employed. One hydrous crystal or anhydrous crystal can also be produced by dehydrating or drying 5 to 6 hydrous crystals. The thus-produced cyclic tetrasaccharide crystal of the present invention or a high-content powder thereof is a non-reducing or low-reducing white powder having an elegant and mild low sweetness and excellent in acid resistance and heat resistance. Other materials that are stable carbohydrates and rarely turn brown or produce off-flavors even when mixed and processed with other materials, especially amino acids, oligopeptides, and proteins. There is little damage. Further, the hygroscopic property is low, and adhesion and consolidation of the powdery material can be prevented.
[0015]
In addition, since the cyclic tetrasaccharide itself has an inclusion ability, it prevents volatilization of fragrance components, active ingredients, and quality deterioration, and is extremely excellent in stabilizing and maintaining fragrance components and active ingredients. And is suitable as a fragrance, a stabilizer and the like. At this time, if necessary, other cyclic carbohydrates such as cyclic dextrins, branched cyclic dextrins, cyclic dextrans, cyclic fructans and the like can be advantageously used to enhance the stabilization.
[0016]
Furthermore, since cyclic tetrasaccharide itself is not decomposed by amylase or α-glucosidase, it is not digested and absorbed even when taken orally, and it is difficult to ferment by intestinal bacteria, and is used as an extremely low-calorie water-soluble dietary fiber. be able to. In other words, if a cyclic tetrasaccharide is ingested, there is a weight and capacity as a saccharide, so that a feeling of fullness is obtained, but it is not substantially digested and is suitable as a low-calorie food material or diet food material. In addition, it can be used as a sweetener that is not easily fermented by caries-causing bacteria and that is unlikely to cause caries.
[0017]
Furthermore, the cyclic tetrasaccharide itself is a non-toxic and harmless natural sweetener excellent in acid resistance, alkali resistance and heat resistance.
[0018]
In addition, since cyclic tetrasaccharide itself is a stable sweetener, it can be advantageously used as a tablet or sugar-coated tablet in combination with a binder such as pullulan, hydroxyethyl starch, and polyvinylpyrrolidone in the case of crystalline products. it can. In addition, osmotic pressure controllability, shaping, shine imparting, moisture retention, viscosity, water separation prevention, anti-caking property, aroma retention, stability, anti-crystallization of other sugars, difficult fermentation, starch It has properties such as anti-aging, protein denaturation prevention, and lipid degradation prevention.
[0019]
Therefore, the cyclic tetrasaccharide of the present invention or a content containing the same is a sweetener, a hardly fermentable food material, an indigestible food material, a low caries food material, a low calorie food material, a taste improver, and a flavor improver. Agent, quality improver, anti-caking agent, anti-caking agent, flavoring agent, starch anti-aging agent, protein denaturation inhibitor, lipid degradation inhibitor, stabilizer, excipient, inclusion agent, powdered substrate, etc. As it is or as needed, it can be advantageously used in various compositions such as foods, foods, foods, feeds, foods, cosmetics, and pharmaceuticals by appropriately combining with known materials. As known materials, for example, flavoring agents, coloring agents, flavoring agents, reinforcing agents, emulsifiers, antioxidants, ultraviolet inhibitors, medicinal components, and the like can be used as appropriate.
[0020]
The cyclic tetrasaccharide of the present invention or a content containing it can be used as it is as a seasoning for sweetening. If necessary, for example, flour, glucose, fructose, isomerized sugar, sugar, maltose, trehalose (α, α), honey, maple sugar, erythritol, xylitol, sorbitol, maltitol, dihydrochalcone, stevioside, α-glycosyl It can also be used in combination with other sweeteners such as stevioside, rakanka sweets, glycyrrhizin, thaumatin, L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, saccharin, acesulfame K, sucralose, glycine, alanine, etc. It can also be used by mixing with a bulking agent such as starch or lactose. Especially in combination with low-calorie sweeteners such as erythritol, xylitol, maltitol and high-sweetness sweeteners such as α-glycosyl stevioside, thaumatin, L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, saccharin, acesulfame K, sucralose, etc. It is also suitable to use as a low calorie sweetener or diet sweetener.
[0021]
In addition, the powder or crystalline product of the cyclic tetrasaccharide of the present invention or an inclusion containing the same may be used as it is or mixed with a filler, excipient, binder, etc. It is also optional to use it in various shapes such as a short bar, plate, cube and tablet.
[0022]
In addition, the sweetness of the cyclic tetrasaccharide of the present invention or the inclusion containing it is well matched with various substances having other tastes such as acidity, salt to taste, astringency, umami, bitterness, acid resistance, heat resistance Since it has great properties, it can be advantageously used for sweetening and taste improvement of general foods and drinks, flavor improvement, and quality improvement.
[0023]
  For example, soy sauce, powdered soy sauce, miso, powdered miso, moromi, castor, powdered mirin, powdered alcohol, sprinkle, mayonnaise, dressing, vinegar, vinegared vinegar, powdered sushi vinegar, Chinese soup, tempura soup, noodle soup, sauce, ketchup, grilled meat Sweet sauce, taste improver, flavor improver, quality to various seasonings such as sauce, curry roux, stew element, soup element, dashi element, compound seasoning, mirin, new mirin, table sugar, coffee sugar It can also be advantageously implemented as an improving agent. In addition, for example, Japanese rice cakes such as rice crackers, hail, rice cakes, fertilizers, rice cakes, manju, oirou, chanterelles, sheep cake, water sheep cake, nishikitama, jelly, castella, rice cake, bread, biscuits, crackers, cookies, pie , Pudding, butter cream, custard cream, cream puff, waffle, sponge cake, donut, chocolate, chewing gum, caramel, nougat, candy and other Western confectionery, ice cream, sorbet and other ice confectionery, fruit syrup pickles, syrup Fruit, paste such as peanut paste, fruit paste, fruits such as jam, marmalade, syrup pickles, sugar cane, processed foods of vegetables, pickles such as Fukujin pickles, bedara pickles, thousand pieces pickles, pickled pickles, takan pickles Raw, pickled Chinese cabbage Fish products such as pickles, ham and sausage, fish products such as fish ham, fish sausage, sea cucumber, chikuwa, tempura, sea urchin, squid salt, vinegar kumbu, suki-meme, dried puffer fish, cod, Thailand , Various delicacies such as shrimp and rice fields, seaweed made with seaweed, wild vegetables, sea bream, small fish, shellfish, boiled beans, potato salad, side dish foods such as kombu rolls, dairy products, fish meat, livestock meat, fruits , Bottled vegetables, canned food, synthetic liquor,Brewed sake, Fruit liquor, whiskey, sake, beer, sparkling liquor, liqueur, cocktail, spirits, shochu and other alcoholic beverages, coffee, cocoa, juice, carbonated beverages, lactic acid beverages, lactic acid bacteria beverages, pudding mix, hot cakes Presented in sweet foods such as mixed foods, instant juices, instant coffee, instant shirako, instant soups, and other foods such as baby foods, therapeutic foods, drinks, amino acid-containing beverages, peptide foods, frozen foods It can be advantageously carried out for taste improvement, flavor improvement and quality improvement.
[0024]
In addition, livestock, poultry, etc. can also be used for the purpose of improving palatability such as feed and feed for breeding animals such as bees, cormorants and fish, or reducing calories. In addition, tobacco, toothpaste, lipstick, lip balm, oral solution, tablets, troches, liver oil drops, mouth fresheners, mouth fragrances, gargles, etc. It can be advantageously used as a sweetener for various compositions such as, as a taste improver, as a taste corrector, and as a quality improver, stabilizer and the like.
[0025]
As a quality improver and stabilizer, it can be advantageously applied to various physiologically active substances that are easily lost such as active ingredients and activities, or health foods, cosmetics, and pharmaceuticals containing the same. For example, interferon-α, -β, -γ, Tsumore necrosis factor-α, -β, macrophage migration inhibitory factor, colony stimulating factor, transfer factor, lymphokine-containing solution such as interleukin II, insulin, growth hormone, prolactin Hormone-containing liquids such as erythropoietin, egg cell stimulating hormone, BCG vaccine, Japanese encephalitis vaccine, measles vaccine, polio vaccine, seedling, tetanus toxoid, hub antitoxin, human immunoglobulin-containing liquid, penicillin, erythromycin, black Antibiotic-containing solutions such as lambphenicol, tetracycline, streptomycin, kanamycin sulfate, thiamine, riboflavin, L-ascorbic acid, liver oil, carotenoid, ergosterol, tocopherol Vitamin-containing liquids such as lipase, esterase, urokinase, protease, β-amylase, isoamylase, glucanase, lactase and other enzyme-containing liquids, ginseng extract, suppon extract, chlorella extract, aloe extract, kumazasa extract, peach leaf extract , Loquat leaf extract, yuzu peel extract, propolis extract and other extracts, viable pastes such as viruses, lactic acid bacteria and yeast, and various physiologically active substances such as royal jelly are stable without losing their active ingredients and activities. High quality liquid, pasty or solid health foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc. can be easily produced.
[0026]
As a method of including the cyclic tetrasaccharide or the inclusion containing the same in various compositions as described above, it may be included in the process until the product is completed, for example, mixing, kneading, dissolution, melting, Known methods such as dipping, infiltration, spraying, coating, coating, spraying, pouring, crystallization and solidification are appropriately selected. The amount is less than 0.1% per solid as a cyclic tetrasaccharide in order to exhibit various characteristics of the cyclic tetrasaccharide, in particular, inclusion, taste improvement, flavor improvement, etc. It is preferable to contain 0.1% or more, desirably 1% or more.
[0027]
Examples of the present invention will be described below.
[0028]
[Example 1]
<Preparation of cyclic tetrasaccharide from yeast>
Glucose 1.0 w / v%, polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5 w / v%, yeast extract (trade name “Powdered Yeast Extract-S”, Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.3 w / v%, malt extraction The product (trade name “Mal Extract, Bacto”, manufactured by Difco) 0.3 w / v% and water was adjusted to pH 6.0, and then 100 ml each was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and 120 ° C. in an autoclave. This was sterilized for 20 minutes, cooled, inoculated with yeast Saccharomyces cerevisiae ATCC9763, and subjected to rotary shaking culture at 27 ° C. and 230 rpm for 72 hours as a seed culture.
[0029]
A liquid medium consisting of sucrose 30 w / v%, asparagine monohydrate 0.3 w / v%, magnesium sulfate heptahydrate 0.3 w / v%, monopotassium phosphate 0.1 w / v%, and water is adjusted to pH 5 After adjusting to 0.5, put 1.6 l each in a 3 l Erlenmeyer flask, sterilize by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, cool to 27 ° C., inoculate with 200 ml of seed culture, and at 27 ° C. The culture was stationary for 25 days. To this culture solution, 600 g of a 66.7% aqueous sucrose solution that had been autoclaved (120 ° C., 20 minutes) in advance was added, and static culture was further continued at a temperature of 27 ° C. for 14 days. About 18 l of the obtained culture solution was centrifuged (10,000 rpm, 20 minutes), and about 84 g of yeast cells were collected as the wet cell weight.
[0030]
The obtained wet yeast cells (about 84 g) were suspended by adding 672 ml of an 80 v / v% aqueous ethanol solution, refluxed at a temperature of 85 ° C. for 30 minutes, and then filtered through diatomaceous earth to collect the filtrate. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure with an evaporator to distill off ethanol, and further about 600 ml of water was added, followed by concentration under reduced pressure to about 300 ml until the ethanol odor disappeared. The obtained concentrated solution was filtered through diatomaceous earth to remove insoluble matters, and then concentrated again under reduced pressure to obtain about 50 ml of a concentrated extract.
[0031]
After adding 50 ml of 1M sodium hydroxide aqueous solution to the concentrated extract (about 50 ml) and heating at a temperature of about 100 ° C. for 1 hour, the mixed reducing sugars were alkali-decomposed, neutralized with hydrochloric acid, The solution was desalted with an exchange resin and concentrated under reduced pressure with an evaporator to obtain about 3 ml of a concentrated solution having a solid content of about 11 w / v%. This concentrated liquid is injected into a preparative high performance liquid chromatography column ODS-AQ R-355-15AQ (inner diameter 50 mm, length 500 mm, manufactured by YMC Co., Ltd.), and water is used as the eluent. Elution is carried out under conditions of a temperature of 35 ° C. and a flow rate of 30 ml / min, and about 210 ml of an eluate having an elution time of about 32 to 39 minutes is collected, concentrated under reduced pressure by an evaporator, and vacuum dried to obtain about 240 mg of a saccharide powder Got.
[0032]
When the purity of the obtained saccharide powder was analyzed by high performance liquid chromatography (HLPC), the saccharide having an elution peak at an elution time of about 11.1 minutes had a purity of about 98.2 in the present saccharide powder. %, Which was found to be a high-purity carbohydrate preparation. As a control, HPLC was performed in the same manner using a cyclic tetrasaccharide prepared by the method described in Experiment 23 of International Patent Publication No. WO01 / 90338 A1, and it was eluted at about 11.1 minutes with the same elution time. It was also found to show a peak. For HPLC, an ODS AQ-303 column (inner diameter 4.6 mm, length 250 mm, manufactured by YMC Corporation) was used as the column, water was used as the eluent, the column temperature was 40 ° C., and the flow rate was 0.5 ml / Detection was performed under the condition of min, and detection was performed using a differential refractometer RI-8012 (manufactured by Tosoh Corporation).
[0033]
When the obtained carbohydrate preparation was subjected to mass spectrometry by a fast atom bombardment method (commonly called FAB-MS), a proton-added molecular ion having a mass number of 649 was remarkably detected, and the mass number of the present carbohydrate was 648, It was found to be the same as the mass number of the cyclic tetrasaccharide.
[0034]
In addition, hydrolysis was performed using sulfuric acid according to a conventional method, and the constituent sugar was examined by gas chromatography. As a result, only D-glucose was detected, and the constituent sugar of the obtained carbohydrate was D-glucose. It was also found that the sugar is the same as the constituent sugar.
[0035]
Furthermore, when a nuclear magnetic resonance method (hereinafter abbreviated as NMR) was performed using the obtained carbohydrate preparation, it is shown in FIG.¹H-NMR spectrum and shown in FIG.¹³C-NMR spectra were obtained, and when these spectra were compared with those of the cyclic tetrasaccharide preparation, they were found to be substantially the same.
[0036]
From the above, the carbohydrate extracted and purified from the yeast cells is cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-. It was found to be a cyclic tetrasaccharide having a structure of glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →}.
[0037]
[Example 2]
<Preparation of cyclic tetrasaccharide from yeast content>
About 6 liters of 80v / v% ethanol aqueous solution was added to 1 kg of commercially available sake lees (Takino-cho, Kato-gun, Hyogo, manufactured by Yamada Shuzo Foods Co., Ltd.). The filtrate was recovered. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure using an evaporator to distill off ethanol, and further about 3 l of water was added, followed by concentration under reduced pressure until the ethanol odor disappeared. The resulting concentrated solution was filtered through diatomaceous earth to remove insoluble matters, and then concentrated again under reduced pressure to obtain about 1000 ml of an extract containing about 58 g of a solid content.
[0038]
The obtained extract was adjusted to pH 5.0 and temperature 50 ° C., α-glucosidase (trade name “Transglucosidase L” manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was added at 10,000 units per gram of solid content, and the temperature was 50 ° C. for 24 hours. After being held, it was heated at a temperature of about 100 ° C. for 10 minutes, cooled with water, and filtered through diatomaceous earth to remove insoluble matters. After 23 g of sodium hydroxide was added and dissolved in the obtained filtrate, the mixture was heated at a temperature of about 100 ° C. for 1 hour to alkalily decompose the mixed reducing sugar, neutralized with hydrochloric acid, and desalted with an ion exchange resin. The solution was concentrated under reduced pressure using an evaporator to obtain about 13.9 ml of a sugar solution containing about 2 g as a solid content.
[0039]
The obtained sugar solution is divided into two portions and injected into a preparative high-performance liquid chromatography column ODS-AQ R-355-15AQ (inner diameter 50 mm, length 500 mm, manufactured by YMC Corporation), and eluent The column was eluted with water at a column temperature of 35 ° C. and a flow rate of 30 ml / min, and was monitored with a differential refractometer ERC-7530 (manufactured by Elma). (90 ml × 2 times) was collected, concentrated under reduced pressure with an evaporator, and vacuum dried to obtain about 227 mg of sugar powder. When the obtained sugar powder was analyzed by HPLC similar to that used in Example 1, it was found that the purity of the cyclic tetrasaccharide as the sugar composition was about 97.5%.
[0040]
The resulting sugar powder was transferred to a centrifuge tube with a lid (1.5 ml volume), added with 0.25 ml of water, heated and completely dissolved, then sealed and allowed to stand at room temperature for 24 hours. Precipitated. Centrifugation (10000 rpm, 2 minutes) separated crystals and nectar, collected crystals, and dried at normal temperature at a temperature of 60 ° C. to obtain about 120 mg of crystal powder. The obtained crystal powder was analyzed by HPLC described in Example 1. As a result, it was found that the cyclic tetrasaccharide had a purity of about 99% or more as a sugar composition and was extremely high purity. Furthermore, analysis by powder X-ray diffraction revealed that the obtained powder X-ray diffraction spectrum was consistent with that of the hydrous crystals of cyclic tetrasaccharide 5 to 6, and the obtained crystal powder was cyclic tetrasaccharide 5 to 6 It was found to be water-containing crystals.
[0041]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α is obtained from cultured yeast cells. It becomes possible to produce a cyclic tetrasaccharide having a structure of -D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →}.
[0042]
Therefore, the establishment of the present invention is based on cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α- In addition to a method for producing a cyclic tetrasaccharide having a structure of D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →}, a novel method for producing from a culture using yeast belonging to the genus Saccharomyces It is possible to provide a wide range of manufacturing methods and to selectively use the manufacturing methods as required.
[Brief description of the drawings]
[Figure 1]FermentationNuclear magnetic resonance spectra of cyclic tetrasaccharides obtained from cultured microbial cells of the mother Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 (¹It is a figure which shows (H-NMR spectrum).
[Figure 2]FermentationNuclear magnetic resonance spectra of cyclic tetrasaccharides obtained from cultured microbial cells of the mother Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 (¹³It is a figure which shows (C-NMR spectrum).

Claims

Cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →} Yeast belonging to the genus Saccharomyces having the structure of cyclic tetrasaccharide production having the structure of A culture in which a cyclic tetrasaccharide having a structure of (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →} was produced, and from this culture, cyclo { → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 →} A cyclic tetrasaccharide having the structure Cyclo {→ 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-D -Manufacturing method of cyclic tetrasaccharide which has a structure of glucopyranosyl- (1->}.

The method for producing a cyclic tetrasaccharide according to claim 1, wherein the yeast belonging to the genus Saccharomyces is Saccharomyces cerevisiae.

The method for producing a cyclic tetrasaccharide according to claim 1 or 2, wherein the culture is yeast or a yeast-containing product.