JP4095815B2

JP4095815B2 - Novel trypsin inhibitor TU-5350 substance, its production and use

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Publication number: JP4095815B2
Application number: JP2002071791A
Authority: JP
Inventors: 昌和浦本; 清平沢; 保行手塚
Original assignee: TAMAGAWA ACADEMY & UNIVERSITY; Hokko Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: TAMAGAWA ACADEMY & UNIVERSITY; Hokko Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2022-03-15
Also published as: JP2003267998A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は消化酵素トリプシンに阻害活性を有してトリプシンインヒビターとして有用である新規ペプチド、TU-5350物質（以下、単にTU-5350物質と称することもある）に関し、またその製造法およびその用途に関するものである。
【０００２】
更に詳しく言えば、本発明は、ボーベリア属に属するTU-5350物質生産菌を培養して生産される新規ペプチド、TU-5350物質に関し、またこのTU-5350物質の製造法に関する。また本発明はTU-5350物質またはその塩を有効成分とする農園芸用殺虫剤、あるいはヒトのトリプシンの過剰蓄積に起因した疾病の治療用の医薬組成物に関する。しかもまた、本発明は、TU-5350物質の生産菌として有用である新規な微生物であるところの、ボーベリア・エスピー AB5350（Beauveria sp. AB5350）株に関するものである。
本発明の新規ペプチド、TU-5350物質は、植物に対する害虫、特にヨトウガに殺虫活性あるいは幼虫生育抑制活性を有することから、農園芸用殺虫剤として有用である。また、TU-5350物質は強力なトリプシン阻害活性を有することから、トリプシンの過剰蓄積が原因で引き起こされる疾病、例えば人間の急性膵炎の治療用の医薬として期待される。
【０００３】
【従来の技術】
マメ科植物、例えば大豆植物には、トリプシンインヒビターを含むいくつかのプロテアーゼインヒビターが存在することが知られている（Yamamotoら、J. Biochem. 94巻、849頁 (1983)）。植物におけるトリプシンインヒビターの役割はよくわかっていないが、そのトリプシンインヒビターは昆虫の発育を妨げることが報告されている(R. Johnsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86巻、9871頁 (1989))。しかし、植物におけるトリプシンインヒビターは約8,000〜20,000の大きい分子量を有する蛋白質であること、植物中のその生成量が微量であることから、植物から安価に製造することが難しい。このため、植物におけるトリプシンインヒビターは、その殺虫剤としての開発は行なわれていない。
【０００４】
一方、近年、マメ科植物のトリプシンインヒビター蛋白をコードする遺伝子を、異種植物に導入することにより、耐虫性植物を作る試みが行なわれている（R. Johnsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86巻、9871頁 (1989)、特開平11−075845号公報、等）。
【０００５】
また、トリプシンインヒビターは脊椎動物の膵臓、血漿、尿中に存在することが確認されており、消化酵素トリプシンの活性を阻害する蛋白質であるトリプシンインヒビターが知られる〔B. Kasselら、Methods Enzymol. 19巻; 844頁(1970)〕。このような医薬用途に用いられている蛋白質性のトリプシンインヒビターとしては、アプロチニン（牛の肺から抽出可能な物質）や、ウリナスタチン（ヒトの尿から抽出可能な物質）が知られている。アプロチニンおよびウリナスタチンは膵の自己消化が原因とされる急性膵炎の治療薬として使用されている。
【０００６】
しかし、従来知られている蛋白質性のトリプシンインヒビターは、分子量が大きい物質であるから、その製造における精製にはゲル濾過法等の複雑な方法を用いなければならず、操作が煩雑になる欠点がある。また、その蛋白質性トリプシンインヒビターのほとんどが動植物から抽出法により製造されており、価格も高価にならざるを得ない。
【０００７】
微生物は抗生物質の製造において使用されていることから明らかなように、微生物の使用は生理活性物質の大量生産に適している。しかし、微生物が生産するトリプシンインヒビターとしては、現在までにわずかな物質しか知られておらず、そのトリプシン阻害効果も充分なものではなかった。その例としては、アンチパイン(H. Sudaら、J. Antibiotics, 25巻、263頁(1972))およびロイペプチン(H. Umezawaら、Chem. Pharm. Bull. 17巻、1986頁(1969))などがあげられる。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】
上述のように、トリプシンインヒビターは、農業場面に限らず医薬用途としても有用な物質である。したがって、新規で安全な殺虫活性物質は農業場面で待望されており、さらには、急性膵炎に有効な治療薬は少なく、それらの新規な物質とその利用場面の開発が強く望まれている。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、上記の課題に対応する望ましい性質をもつ新規で有用なトリプシンインヒビターを微生物の培養により提供することにあり、またそのような新規なトリプシンインヒビターの製造法を確立することにあり、それらによって、従来技術に伴う課題を解決しようとするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決することを目的として研究を重ねた。その一環として、種々の土壌および植物などから微生物を分離し、その微生物が培養液中に生産するトリプシン阻害活性を示す物質を収得することについて鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、糸状菌の一種であるボーベリア属に属する新規な菌株を培養し、その培養液中にトリプシン阻害活性を示す物質が生産されていることを発見した。そこで、研究の結果として、該微生物の培養物からトリプシン阻害活性物質を分離・精製・単離することに成功した。該物質はその化学構造および生物活性の対象、効果などを含めた諸性質の点で既知物質と一致しない新規なペプチド物質であることを確認し、これをTU-5350物質と称することにした。また、該TU-5350物質は、中程度の分子量を持つペプチドであるが、熱に対して比較的安定であり、濃縮など熱処理を要する工程でも失活しない。また、高分子蛋白の精製単離に通常用いられるゲル濾過法は該TU-5350物質の精製工程で必要とせず、低分子物質を精製単離する一般的方法で効率良く回収及び精製単離することができるという、TU-5350物質の安価な製造法が提供できることが判明した。
【００１１】
すなわち、第１の本発明としては、FERM P−18715号の受託番号で寄託されてあるボーベリア・エスピーAB5350株により生産され、トリプシンに対する阻害活性を有し且つ下記の物理化学性状と下記のアミノ酸配列部分構造を有する新規ペプチド、TU-5350物質を提供するものである。
(1) 外観；白色粉末
(2) 比旋光度（[α]_Ｄ ²⁵）； −268°(c 0.07、H₂O)：
(3) 融点； 270〜280℃（分解）
(4) 分子量； 3697.5
(5) 紫外線吸収スペクトル（H₂O）；
λ_max nm(ε) 223(83677)、280(10563、肩吸収)
(6) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠剤法）；
υ_max (cm^-1) 3100〜3650、2926、1645、1541
(7) 構成アミノ酸の種類は下記の14種である：
Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Ile、Leu、Phe、Lys、Trp、Arg、Gln
(8) 本TU-5350物質は34個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有し、そのN末端の部分構造は下記の配列を有する：
（N末端）Ser−Gly−Ile−Cys−Trp−Arg−Ala−Cys−Phe−Pro−Ser−Pro−Pro−Ser−Cys−Pro−Glu−Gly−Leu−Glu−Ala−Glu−Gln−Lys−*
但し、上記の式中で * は未確定の10個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を表す。
(9) 基質としてカゼインを用いた場合にトリプシンの酵素活性を50％阻害するのに要する本物質の濃度(IC₅₀値)が8.0μg／mlである。
【００１２】
また、第２の本発明によると、ボーベリア属に属する前記の新規ペプチド、TU-5350物質の生産菌を培地中で培養し、その培養物から前記のTU-5350物質を採取することを特徴とする、ペプチド、TU-5350物質の製造法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、第２の本発明によるTU-5350物質の製造法について説明する。
本発明の方法で用いられるTU-5350物質の生産菌は、TU-5350物質またはその塩を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生物でもよい。具体的な例としては、本発明者らが神奈川県足柄下郡の土壌より新たに分離したボーベリア属の菌株AB5350があり、この菌株は本発明の方法に最も有効に用いられるTU-5350物質生産菌の一例である。
【００１４】
このAB5350株の菌学的性質を以下に記載する。
(1) 各培地における生育状態
AB5350株のコーンミール寒天培地上における生育は良好であり、25℃、12日間培養で得られる集落の直径は40〜42mmに達する。集落はビロード状〜やや粉状を呈し、集落表面は淡白色で、裏面も淡白色を呈する。菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は直径が1.5〜5.0μｍで、無色、平滑であり、分枝する。AB5350株は、25℃で約１週間ほど培養すると、集落表面がやや粉状を呈し、分生子の形成が観察される。分生子柄は気生菌糸から直接、あるいは短い柄から生じ、分生子柄の基部は亜球形状あるいはフラスコ状にふくらんでいる。分生子柄の大きさは4.0〜10.0×2.0〜3.0μｍである。分生子柄の先端は細く伸び、分生子形成に従ってジグザグ状を呈し、分生子柄の先端は長さ6.0〜20.0μｍ、幅1.0〜1.5μｍである。分生子は単細胞で、無色、平滑、球形あるいは幅広いだ円形を呈し、大きさが2.0〜4.0×1.5〜3.0μｍであり、分生子柄の小突起状に出芽形成するシンポジオ型分生子である。
【００１５】
麦芽エキス培地上におけるAB5350株の生育は、コーンミール寒天培地上に比べやや遅く、25℃、12日間の培養で集落の直径は21〜22mmに達する。集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は白色で、裏面は淡黄白色〜淡白色を呈する。
ポテト・デキストロース寒天培地上でのAB5350株の生育は、麦芽エキス培地上における生育と同等で、25℃、12日間の培養で集落の直径は24〜25mmに達する。集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は白色で、裏面は淡黄白色〜淡白色を呈する。
(2) 生理的性質
▲１▼生育温度
麦芽エキス寒天培地を用いて、5℃、10℃、15℃、20℃、24℃、27℃、30℃および37℃の各温度で培養した結果、AB5350株は10℃〜30℃まで何れの温度でも生育したが、5℃および37℃では生育しなかった。生育最適温度は24℃〜27℃と思われる。
▲２▼生育pH
pHを3、4、5、6、7、8、9および10に調整した麦芽エキス液体培地を用いて、25℃で培養した結果、AB5350株はpH3〜10まで生育した。最適生育pHは、6〜8と思われる。
【００１６】
以上の菌学的性質から、AB5350株の分類学上の位置をジェイ・エイ・フォン・アークス著、ザ・ジェネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレイティング・イン・ピュア・カルチャー、第３版、ジェイ・クレイマー社、バダッツ、1981年（J. A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 3rd ed., J. Cramer, Vaduz, 1981）に従って検索した。その結果、本菌株はボーベリア属に属することが認められ、本発明者らは、AB5350株をボーベリア・エスピー・AB5350（Beauveria sp. AB5350）と命名した。
【００１７】
なお、AB5350株は独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成14年2月19日、FERM P-18715号として受託されている。
【００１８】
以上、TU-5350物質生産菌の一例としてのAB5350株について説明したが、一般的には、菌類の菌学上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではないことがよく知られている。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジンおよびエチルメタンスルホネート等）または遺伝子組換えを用いる人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、ボーベリアに属し、TU-5350物質を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。
【００１９】
TU-5350物質の製造にあたって、本発明の方法では、まず、ボーベリア属に属するTU-5350物質生産菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地中で培養する。TU-5350物質生産菌の培養においては、微生物の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。栄養源としては、TU-5350物質生産菌が資化しうる炭素源および窒素源、ならびに無機塩などを適当な組成で含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
【００２０】
資化しうる炭素源としては、グルコース、シュクロース、ガラクトース、デキストリン、グリセロール、澱粉、水飴、糖蜜、動・植物油等を利用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などを使用できる。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、TU-5350物質生産菌の発育を助け、TU-5350物質の生産を促進するような無機物および（または）有機物を適当に添加することができる。
【００２１】
培養方法としては、好気的条件での培養法、特に深部液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15〜30℃であるが、多くの場合24〜30℃で培養する。TU-5350物質の生産は培地や培養条件によって異なるが、振とう培養、タンク培養とも２〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。培養液中のTU-5350物質の蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から発酵生産物を採取する一般的な方法に準じてTU-5350物質の採取を行うのがよい。これらの培地の組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて、好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選択する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００２２】
このようにして得られた培養物中に蓄積されたTU-5350物質は、前述した物理化学的性状を有するので、その性状にしたがって培養物から回収し、分離精製することが可能である。特に、以下の方法により効率的に分離精製することができる。
すなわち、蓄積したTU-5350物質を培養物中から採取するに際しては、通常の生理活性物質を培養物中から採取する方法が適用される。すなわち、培養物から濾過または遠心分離により菌体を分離し、得られた培養ろ液から、イオン交換樹脂、合成吸着樹脂、シリカゲル、シラナイズドシリカゲル、アルミナ、セルロース、珪藻土、ゲル濾過剤、活性炭等を用いるカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理あるいは逆層カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどを行うことによってTU-5350物質を分離することができる。
【００２３】
第３の本発明によると、新規な微生物として、前記のペプチド、TU-5350物質を生産できる特性を持ち、かつFERM P − 18715 号の受託番号で寄託されてあるボーベリア・エスピー株AB5350株が提供される。
【００２４】
第４の本発明によると、前記のペプチド、TU-5350物質またはその塩を、有効成分として含有する、農園芸用殺虫剤が提供される。TU-5350物質を農園芸用殺虫剤の有効成分として用いる場合には、その使用目的に応じて単体でも用いることができるが、生物効果を助長、あるいは安定化するためにTU-5350物質を適当な担体および補助剤と混和して成る組成物を調製し、これを適当な製剤とし、これを直接使用するかまたは必要に応じて水で希釈して用いる。
【００２５】
前記のペプチド、TU-5350物質またはその塩は、急性膵炎治療剤等の医薬品として期待される。TU-5350物質またはその塩を医薬に有効成分として使用する場合には、単独でも投与できるが、通常は担体、賦形剤と混合して散剤、錠剤、軟膏剤、注射剤、経口剤、坐剤等の製剤として投与する。配合される担体、賦形剤は製薬学的に許容されるものであればいずれでもよく、その種類および組成は投与経路や投与方法によって適宜選択する。投与量は、年齢、体重等によって異なるが、通常は一日あたり成人に対して前記のU5350物質の1mg〜1,000mg程度を経口的あるいは非経口的（例えば静脈に注射）に投与する。
【００２６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは単なる一例であって、これによって本発明が限定されるものではない。また、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段が用いられることは言うまでもなく可能なことであり、有効な手段となり得る。なお、実施例中に部とあるのは重量部を示している。
【００２７】
実施例１
本例は、TU-5350物質の醗酵的製造例を例示する。
TU-5350物質生産菌の培養に用いた生産培地は、ブドウ糖 2.0％、デキストリン 1.0％、ポリペプトン 0.5％、マルトエキス 0.5％、酵母エキス 0.2％、炭酸カルシウム 0.3％、Ｖ８ジュース（Cambel）の組成からなる（pH6.5）。
前記の生産培地100mlを分注した500ml容量バッフル付き三角フラスコ50本（培地５Ｌ分）を121℃で20分間滅菌した。滅菌された培地にフラスコ１本あたりボーベリア・エスピーAB5350株（FERM P−18715号）の斜面寒天培養菌体の1〜2白金耳を植菌した。
【００２８】
その後、ロータリーシェーカー（200rpm）上で、25℃で４日間、回転振とう培養した。培養終了後、得られた培養液を濾過することにより、培養濾液５Ｌを得た。トリプシン阻害活性のある培養濾液をDiaion HP-20カラムに吸着させ、蒸留水、30％メタノール水で洗浄後、80％メタノール水で溶出させた。溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥して粉末を得た(収量；2.245g；トリプシンの酵素活性を50％阻害する該粉末の濃度 IC₅₀＝300μg/ml)。
【００２９】
次に、前記の粉末を水に溶解させ、その水溶液を中性の状態でAmberlite IRC-50(H⁺)（登録商標）カラムに通してTU-5350物質を吸着させた。カラムを蒸留水で洗浄後、0.5N-NH₄OHで溶出させ、溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥によって粗精製粉末を得た(収量；450mg：トリプシンの酵素活性を50％阻害する該粉末の濃度 IC₅₀＝60μg/ml)。
更に、この粗精製粉末を水に溶解し、その水溶液をMCI GEL CHP-20P（登録商標）カラムに通して活性物質を吸着させ、蒸留水、35％メタノール水で洗浄後、55％メタノール水、80％メタノール水で段階的に溶出させた。トリプシン阻害活性物質は、55％メタノール水から80％メタノール水に移動層溶媒をきり代えるあたりで溶出された。その溶出液活性画分を減圧下に濃縮、乾燥して白色粉末を得た(収量；140mg；IC₅₀＝16μg/ml)。
【００３０】
その白色粉末を最終的に、CAPCELL PAC C₁₈（10φ×250mm）カラム（登録商標）による分取HPLCにかけることによって単一なTU-5350物質に精製された(収量；23.38mg）。TU-5350物質の純品は、トリプシンの酵素活性を50％阻害する濃度 IC₅₀が5.2μg/mlであった。
HPLC分析条件を以下に記す。
展開溶媒：0.01％TFA（トリフルオロ酢酸）を含む20％アセトニトリル水、
流速：1.6ml/min
検出光：UV235nm
溶出時間： 17.5分
このように精製単離したTU-5350物質は、上記HPLC及び各種機器分析の結果、単一の純粋物質であることが確認された。
【００３１】
なお、各精製段階におけるTU-5350物質の純度の指標は、トリプシン阻害活性の力価、すなわち後記のトリプシン阻害率(％)を測定すことから算出した。
また、培養濾液からの単一な精製したTU-5350物質の収率は、60％であった。トリプシン阻害率（％）の測定方法は後記の試験例１に例示した。
【００３２】
【試験例】
次に、本発明のTU-5350物質の生理活性を下記の試験例により説明する。
試験例１トリプシンに対するTU-5350物質の酵素阻害活性の試験
トリプシンは蛋白分解酵素の一種であり、例えば水に難溶なカゼインに作用させると、カゼインが加水分解により水に易溶なアミノ酸あるいは低分子ペプチドまで消化分解される。カゼインの白濁した水溶液にトリプシンを作用させた場合に、反応前のカゼインの白濁液がトリプシンと反応後、半透明な水溶液になる。このような性質を利用して、トリプシンの酵素活性の阻害試験法を構築した。
【００３３】
すなわち、カゼインを寒天に封じ込めた寒天平板培地(カゼイン平板培地)を作成し、次に、トリプシンを染み込ませた抗生物質力価検定用ろ紙ディスク(直径8mm)をカゼイン平板培地におき、37℃で約一日作用させると、ろ紙ディスクの周辺のカゼインが消化分解し、半透明で円形の酵素反応ゾーンが形成する。トリプシンの酵素活性の阻害試験は、予め供試のトリプシンインヒビターを添加して一定時間トリプシンに作用させて得た反応液を、抗生物質力価検定用ろ紙ディスク(直径8mm)に染み込ませ、そのろ紙ディスクを上記カゼイン平板培地上におき、平板培地上に形成される半透明で円形の酵素反応ゾーンの直径を測定する。トリプシンインヒビターの無添加の場合の試験区（対照区）の酵素反応ゾーンの直径と、トリプシンインヒビターの添加の場合の試験区（処理区）の酵素反応ゾーンの直径を比較することでトリプシンの残存活性の評価を行った。
【００３４】
以下に、本試験例で行った試験方法を詳記する。
カゼイン平板培地は、１Ｌの20mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）にカゼイン500mgを懸濁させ、更に500mMの塩化カルシウム10mlと寒天15ｇを加え、120℃で20分加圧滅菌後、シャーレに20ml分注して調製された。
【００３５】
トリプシンインヒビターとトリプシンとの反応液の調製は次のように行った。すなわち、1M 塩化カルシウム 20μL、0.2M トリス−塩酸緩衝液（pH7.5） 20μLに100μg/ml濃度のトリプシン（ブタすい臓、和光純薬製）20μLを加えて酵素溶液を調製し、このトリプシン溶液に対して、供試のトリプシンインヒビターを蒸留水で適当に希釈したトリプシンインヒビター水溶液140μLを加えた。その混合液の全量をトリス−塩酸緩衝液で200μLにした後、37℃で15分間保温してトリプシンとトリプシンインヒビターを反応させた（インヒビター添加試験区）。他方、前記のトリプシン溶液に対してトリプシンインヒビター無添加の蒸留水140μLを加えて37℃で15分間保温してトリプシン含有の反応溶液（対照液）を調製し、これをコントロール（無添加試験区）とした。また、陽性比較対照区として、トリプシンインヒビターとして知られているロイペプチン（Leupeptin；和光純薬製）、大豆トリプシンインヒビター(和光純薬製)及びニワトリ卵白トリプシンインヒビター(和光純薬製)を用いて同様に試験した。
【００３６】
次に、37℃で15分間保温後すぐの上記のトリプシンインヒビターとトリプシンとの反応溶液40μLを正確にはかりとり、これを直径8mmのろ紙ディスクに染みこませ、このろ紙ディスクを上記カゼイン平板培地上におき、37℃で20時間保温して、カゼインにトリプシンを作用させた。
20時間保温後、カゼイン平板培地上でろ紙ディスク周辺に形成される半透明で円形の酵素反応ゾーンの直径を計測した。酵素反応ゾーンの直径から、ペーパーディスクの直径（8mm）を引いた直径の差の値は残存トリプシン活性と比例関係にある。従って、インヒビターを添加した処理試験区の酵素反応ゾーンの直径と、インヒビター無添加であったコントロール試験区の酵素反応ゾーンの直径とを比べることによって、阻害されなかったトリプシンの残存活性が算出されるので、次の計算式からトリプシンインヒビターによるトリプシンの酵素活性の阻害率（％）を求めることができた。
【００３７】
トリプシン酵素活性の阻害率(％)＝100−{〔インヒビター添加試験区の酵素反応ゾーンの直径からペーパーディスクの直径（8mm）を引いた値〕÷〔インヒビター無添加試験区の酵素反応ゾーンの直径からペーパーディスクの直径（8mm）を引いた値〕}×100
また、トリプシン酵素活性の阻害率（％）は一定の濃度範囲のトリプシンインヒビター濃度の対数値と比例関係にあるので、トリプシンインヒビターの種々の濃度におけるトリプシン酵素活性の阻害率を求め、それらのデータを作図することによって、トリプシンの活性を50％阻害するのに要するトリプシンインヒビター濃度（IC₅₀値）を算定した。得られた試験結果の一例を次の表１に示す。

大豆及びニワトリ卵白トリプシンインヒビターは、それらの分子量が不明のためモル濃度でのIC_５０値を記載しなかった。
【００３８】
試験例２ヨトウガ幼虫にたいする殺虫及び生育抑制試験
本試験においては、供試幼虫としてヨトウガ孵化幼虫を用い、餌にトリプシンインヒビターとしての本発明のTU-5350物質を加え、摂餌によりTU-5350物質を幼虫にとりこませた。このことによって得られる殺虫効果及び幼虫の生育抑制効果を、肉眼的に観察する方法で試験した。試験方法は以下のとおりである。
【００３９】
人工飼料(インセクタLF、日本農産工業株式会社製の商品名)にTU-5350物質を濃度1000ppmの配合濃度になるように加えた。そのTU-5350物質添加飼料１ｇを直径3.5cmのプラスチックシャーレに入れた。そのシャーレにヨトウガ孵化直後幼虫を20頭／シャーレの割合で放虫し、27℃で８日間飼育した（処理区）。８日後に、殺虫活性及び幼虫の生育抑制活性を調査した。この調査に当って、生存している幼虫の体重を測定し、TU-5350物質の無添加区（無処理区：コントロール）の幼虫の体重と比較することによって幼虫生育抑制活性を評価した。得られた結果の一例を次の表２に示した。
【００４０】

表２に示すように、無処理区の生存虫数が15頭であるが、これに対し処理区では７頭である。TU-5350物質は、明らかにヨトウガ幼虫に対し殺虫活性を示した。また、処理区における生存幼虫の体重平均が、無処理区の平均体重の３分の１以下であり、TU-5350物質はヨトウガ幼虫に明らかな生育抑制効果を示した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の新規トリプシンインヒビター、AB5350物質は、以上に述べたようにトリプシン阻害活性をもち且つ殺虫活性又は昆虫生育抑制活性を有することから、新規な農園芸用殺虫剤および医薬として有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel peptide, TU-5350 substance (hereinafter also referred to simply as TU-5350 substance), which has an inhibitory activity on the digestive enzyme trypsin and is useful as a trypsin inhibitor, and relates to a production method and use thereof Is.
[0002]
More specifically, the present invention relates to a novel peptide TU-5350 substance produced by culturing a TU-5350 substance-producing bacterium belonging to the genus Bobelia, and to a method for producing this TU-5350 substance. The present invention also relates to an agricultural and horticultural insecticide containing TU-5350 substance or a salt thereof as an active ingredient, or a pharmaceutical composition for treating diseases caused by excessive accumulation of human trypsin. Moreover, the present invention relates to a strain of Beauveria sp. AB5350, which is a novel microorganism useful as a TU-5350 substance-producing bacterium.
The novel peptide TU-5350 substance of the present invention is useful as an agricultural and horticultural insecticide because it has insecticidal activity or larval growth-inhibiting activity on plant pests, especially mung beetles. In addition, since the TU-5350 substance has a strong trypsin inhibitory activity, it is expected as a medicament for the treatment of diseases caused by excessive accumulation of trypsin, for example, human acute pancreatitis.
[0003]
[Prior art]
It is known that there are several protease inhibitors in legumes such as soybean plants (Yamamoto et al., J. Biochem. 94, 849 (1983)), including trypsin inhibitors. Although the role of trypsin inhibitors in plants is not well understood, it has been reported that trypsin inhibitors interfere with insect development (R. Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9871 ( 1989)). However, a trypsin inhibitor in a plant is a protein having a large molecular weight of about 8,000 to 20,000, and its production amount in the plant is very small, so that it is difficult to produce it from a plant at a low cost. For this reason, trypsin inhibitors in plants have not been developed as insecticides.
[0004]
On the other hand, in recent years, attempts have been made to produce insect-resistant plants by introducing a gene encoding a tryptic inhibitor protein of a leguminous plant into a heterologous plant (R. Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sci). USA, 86, 9871 (1989), JP-A-11-075845, etc.).
[0005]
In addition, it has been confirmed that trypsin inhibitors are present in vertebrate pancreas, plasma, and urine, and trypsin inhibitors that are proteins that inhibit the activity of the digestive enzyme trypsin are known [B. Kassel et al., Methods Enzymol. 19 Volume; 844 (1970)]. As proteinaceous trypsin inhibitors used for such pharmaceutical use, aprotinin (a substance extractable from bovine lung) and ulinastatin (a substance extractable from human urine) are known. Aprotinin and urinastatin are used as a treatment for acute pancreatitis caused by autologous digestion of the pancreas.
[0006]
However, since the known proteinaceous trypsin inhibitor is a substance having a large molecular weight, a complicated method such as a gel filtration method must be used for purification in the production thereof, and the operation is complicated. is there. In addition, most of the proteinaceous trypsin inhibitors are produced from animals and plants by extraction, and the price must be high.
[0007]
As is apparent from the fact that microorganisms are used in the production of antibiotics, the use of microorganisms is suitable for mass production of physiologically active substances. However, as a trypsin inhibitor produced by microorganisms, only a few substances have been known so far, and the trypsin inhibitory effect has not been sufficient. Examples include antipine (H. Suda et al., J. Antibiotics, 25, 263 (1972)) and leupeptin (H. Umezawa et al., Chem. Pharm. Bull. 17, 1986 (1969)). Can be given.
[0008]
[Problems to be Solved by the Invention]
As described above, trypsin inhibitor is a useful substance not only for agricultural use but also for pharmaceutical use. Therefore, new and safe insecticidal active substances are expected in the agricultural scene, and furthermore, there are few therapeutic agents effective for acute pancreatitis, and development of these novel substances and their use scenes is strongly desired.
[0009]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel and useful trypsin inhibitor having desirable properties corresponding to the above-mentioned problems by culturing microorganisms, and to establish a method for producing such a novel trypsin inhibitor. Therefore, it is intended to solve the problems associated with the prior art.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted research for the purpose of solving the above problems. As part of this effort, we conducted extensive research on the isolation of microorganisms from various soils and plants, and the acquisition of substances exhibiting trypsin inhibitory activity produced by the microorganisms in the culture solution. As a result, the present inventors have cultivated a novel strain belonging to the genus Bobelia, which is a type of filamentous fungus, and found that a substance exhibiting trypsin inhibitory activity is produced in the culture solution. Thus, as a result of research, the inventors succeeded in separating, purifying, and isolating trypsin inhibitory active substances from the culture of the microorganism. The substance was confirmed to be a novel peptide substance that does not match the known substance in terms of various properties including its chemical structure and target of biological activity, effects, etc., and this substance was designated as TU-5350 substance. The TU-5350 substance is a peptide having a medium molecular weight, but is relatively stable to heat and does not deactivate even in a process requiring heat treatment such as concentration. Moreover, the gel filtration method usually used for purification and isolation of high molecular protein is not required in the purification process of the TU-5350 substance, and it is efficiently recovered, purified and isolated by a general method for purifying and isolating low molecular weight substances. It has been found that an inexpensive method for producing TU-5350 material can be provided.
[0011]
That is, as the first present invention, it is produced by Boberia sp. AB5350 strain deposited under the deposit number of FERM P-18715, has inhibitory activity against trypsin, has the following physicochemical properties and the following amino acid sequence: A novel peptide having a partial structure, TU-5350 substance, is provided.
(1) Appearance; White powder
(2) Specific rotation ([α] _D ²⁵ ); -268 ° (c 0.07, H ₂ O):
(3) Melting point: 270-280 ° C (decomposition)
(4) Molecular weight; 3697.5
(5) UV absorption spectrum (H ₂ O);
λ _max nm (ε) 223 (83677), 280 (10563, shoulder absorption)
(6) Infrared absorption spectrum (KBr tablet method);
υ _max (cm ^-1 ) 3100-3650, 2926, 1645, 1541
(7) There are 14 types of constituent amino acids:
Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Ile, Leu, Phe, Lys, Trp, Arg, Gln
(8) This TU-5350 substance has an amino acid sequence consisting of 34 amino acid residues, and its N-terminal partial structure has the following sequence:
(N-terminal) Ser-Gly-Ile-Cys-Trp-Arg-Ala-Cys-Phe-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro-Glu-Gly-Leu-Glu-Ala-Glu-Gln- Lys− *
However, in the above formula, * represents an amino acid sequence consisting of 10 undefined amino acid residues.
(9) When casein is used as a substrate, the concentration (IC ₅₀ value) of this substance required to inhibit the enzyme activity of trypsin by 50% is 8.0 μg / ml.
[0012]
According to a second aspect of the present invention, the above-mentioned novel peptide belonging to the genus Boberia, TU-5350 substance-producing bacteria is cultured in a medium, and the TU-5350 substance is collected from the culture. A method for producing a peptide, TU-5350 substance, is provided.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, a method for producing the TU-5350 substance according to the second present invention will be described.
The microorganism producing TU-5350 substance used in the method of the present invention may be any microorganism as long as it has an ability to produce TU-5350 substance or a salt thereof. As a specific example, there is genus Beauveria strains AB5350 which the present inventors have newly isolated from soil, Kanagawa Ashigara lower gun, this strain most effectively TU-5350 substance production used in the method of the present invention It is an example of a bacterium.
[0014]
The mycological properties of this AB5350 strain are described below.
(1) Growth state in each medium
The AB5350 strain grows well on corn meal agar, and the diameter of the colonies obtained by culturing at 25 ° C. for 12 days reaches 40 to 42 mm. The village is velvety to slightly powdery, the village surface is pale white, and the back is also pale white. The mycelium has a septum and extends in and on the medium. The mycelium has a diameter of 1.5 to 5.0 μm, is colorless and smooth, and is branched. When the AB5350 strain is cultured at 25 ° C. for about one week, the settlement surface is slightly powdery and the formation of conidia is observed. The conidia pattern arises directly from the aerial hyphae or from a short pattern, and the base of the conidia pattern swells in the shape of a subsphere or flask. The size of the conidia pattern is 4.0 to 10.0 × 2.0 to 3.0 μm. The tip of the conidia pattern extends thinly and presents a zigzag shape according to conidia formation, and the tip of the conidia pattern has a length of 6.0 to 20.0 μm and a width of 1.0 to 1.5 μm. Conidia are single cells that are colorless, smooth, spherical or have a wide oval shape, are 2.0-4.0 × 1.5-3.0 μm in size, and are symposium-type conidia that bud and form into conidial stalks.
[0015]
The growth of AB5350 strain on the malt extract medium is slightly slower than that on the corn meal agar medium, and the colony diameter reaches 21-22 mm after 12 days of culture at 25 ° C. The settlement is fluffy to wooly, the settlement surface is white, and the back is pale yellowish white to pale white.
Growth of AB5350 strain on potato-dextrose agar medium is equivalent to growth on malt extract medium, and the diameter of the colony reaches 24-25 mm after culturing at 25 ° C. for 12 days. The settlement is fluffy to wooly, the settlement surface is white, and the back is pale yellowish white to pale white.
(2) Physiological properties (1) Growth temperature As a result of culturing at 5 ° C, 10 ° C, 15 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 27 ° C, 30 ° C and 37 ° C using malt extract agar medium, The AB5350 strain grew at any temperature from 10 ° C to 30 ° C, but did not grow at 5 ° C or 37 ° C. The optimum temperature for growth seems to be 24 ° C to 27 ° C.
(2) Growth pH
As a result of culturing at 25 ° C. using a malt extract liquid medium adjusted to pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10, AB5350 strain grew to pH 3-10. The optimal growth pH appears to be 6-8.
[0016]
Based on the above mycological characteristics, the taxonomic position of the AB5350 strain was written by Jay A von Arks, The General of Funjai, Sporrating in Pure Culture, 3rd edition, Jay J. Searched according to Kramer, Badats, 1981 (JA von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 3rd ed., J. Cramer, Vaduz, 1981). As a result, it was confirmed that this strain belongs to the genus Boberia, and the present inventors named the AB5350 strain as Beauveria sp. AB5350 (Beauveria sp. AB5350).
[0017]
The AB5350 strain was filed with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Biological Deposit Center and was commissioned as FERM P-18715 on February 19, 2002.
[0018]
The AB5350 strain as an example of a TU-5350 substance-producing bacterium has been described above. In general, it is well known that the mycological properties of fungi are very easy to change and are not constant. Fungi are natural or commonly used UV irradiation, X-ray irradiation, mutagenic agents (eg, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and ethyl methanesulfonate) or artificial recombination using genetic recombination. It is a well-known fact that mutation is performed by means of mutation. All strains belonging to Beauveria and capable of producing TU-5350 substance, including such natural mutants and artificial mutants, can be used in the present invention.
[0019]
In producing the TU-5350 substance, in the method of the present invention, first, a TU-5350 substance-producing bacterium belonging to the genus Boberia is cultured in a medium containing nutrients that can be used by ordinary microorganisms. In culturing the TU-5350 substance-producing bacterium, a normal culturing method used for culturing microorganisms is applied. As a nutrient source, any natural or synthetic medium can be used as long as the medium contains a carbon source and a nitrogen source that can be assimilated by the TU-5350 substance-producing bacterium, an inorganic salt, and the like in an appropriate composition.
[0020]
As an assimilating carbon source, glucose, sucrose, galactose, dextrin, glycerol, starch, starch syrup, molasses, animal / vegetable oil, and the like can be used. As the nitrogen source, soy flour, wheat germ, corn steep liquor, cotton seed meal, meat extract, peptone, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used. In addition, it is effective to add inorganic salts capable of generating sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions as required. In addition, inorganic substances and / or organic substances that help the growth of TU-5350 substance-producing bacteria and promote the production of TU-5350 substance can be appropriately added.
[0021]
As a culture method, a culture method under aerobic conditions, particularly a deep liquid culture method is most suitable. A suitable temperature for culturing is 15 to 30 ° C., but in many cases, culturing is performed at 24 to 30 ° C. Production of TU-5350 substance varies depending on the culture medium and culture conditions, but the accumulation reaches the maximum in 2 to 10 days for both shaking culture and tank culture. The culture should be stopped when the accumulated amount of TU-5350 substance in the culture reaches the maximum, and TU-5350 substance should be collected according to the general method for collecting fermentation products from the culture. . The culture conditions such as the composition of the culture medium, the liquidity of the culture medium, the culture temperature, the stirring speed, and the aeration rate are conveniently adjusted or selected so as to obtain preferable results according to the type of strain used and external conditions. . When there is foaming in liquid culture, antifoaming agents such as silicon oil, vegetable oil and surfactant are conveniently used.
[0022]
Since the TU-5350 substance accumulated in the culture thus obtained has the physicochemical properties described above, it can be recovered from the culture according to the properties and separated and purified. In particular, it can be efficiently separated and purified by the following method.
That is, when collecting the accumulated TU-5350 substance from the culture, a method of collecting a normal physiologically active substance from the culture is applied. That is, the bacterial cells are separated from the culture by filtration or centrifugation, and from the obtained culture filtrate, ion exchange resin, synthetic adsorption resin, silica gel, silanized silica gel, alumina, cellulose, diatomaceous earth, gel filter agent, activated carbon, etc. The TU-5350 substance can be separated by performing adsorption / desorption treatment of the active substance by column chromatography or thin layer chromatography using high-performance liquid chromatography or high performance liquid chromatography using a reverse layer column.
[0023]
According to a third aspect of the present invention, as a novel microorganism, wherein the peptide has a property capable of producing TU-5350 substance, and FERM P - deposited under 18,715 No. accession number Oh Ru by Beauveria sp. Strain AB5350 strain Provided.
[0024]
According to the fourth aspect of the present invention, there is provided an agricultural and horticultural insecticide containing the peptide, TU-5350 substance or a salt thereof as an active ingredient. When TU-5350 substance is used as an active ingredient in agricultural and horticultural insecticides, it can be used alone depending on the purpose of use, but TU-5350 substance is suitable for promoting or stabilizing biological effects. A composition is prepared by mixing with a suitable carrier and adjuvant, and this is used as a suitable preparation, which is used directly or diluted with water as necessary.
[0025]
Before SL peptides, TU-5350 substance or its salt is expected as pharmaceuticals such as acute pancreatitis therapeutic agent. When the TU-5350 substance or a salt thereof is used as an active ingredient in medicine, it can be administered alone, but it is usually mixed with a carrier or excipient, and powder, tablet, ointment, injection, oral preparation, suppository It is administered as a pharmaceutical preparation. Any carrier and excipient may be used as long as they are pharmaceutically acceptable, and the type and composition thereof are appropriately selected depending on the administration route and administration method. The dose varies depending on the age, body weight, etc., but usually, about 1 mg to 1,000 mg of the U5350 substance is orally or parenterally (for example, injected into a vein) per day for an adult.
[0026]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, this is merely an example, and the present invention is not limited thereto. Also, it goes without saying that many variations or modification means not exemplified here can be used, and can be effective means. In the examples, “parts” indicates parts by weight.
[0027]
Example 1
This example illustrates an example of fermentative production of TU-5350 material.
Production medium used for the culture of the TU-5350 substance producing microorganism is glucose 2.0%, dextrin 1.0%, polypeptone 0.5%, 0.5% malt extract, 0.2% yeast extract, calcium carbonate 0.3%, the composition of the V8 juice (Cambel) (PH 6.5).
Fifty Erlenmeyer flasks with 500 ml capacity baffles into which 100 ml of the production medium was dispensed (for 5 L of medium) were sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. One or two platinum loops of slanted agar culture cells of Bobelia sp. AB5350 strain (FERM P-18715) were inoculated per flask in a sterilized medium.
[0028]
Thereafter, the cells were cultured on a rotary shaker (200 rpm) at 25 ° C. for 4 days with rotary shaking. After completion of the culture, the obtained culture solution was filtered to obtain 5 L of a culture filtrate. The culture filtrate having trypsin inhibitory activity was adsorbed on a Diaion HP-20 column, washed with distilled water and 30% methanol water, and eluted with 80% methanol water. The eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain a powder (yield; 2.245 g; concentration of the powder that inhibits the enzyme activity of trypsin by 50% IC ₅₀ = 300 μg / ml).
[0029]
Next, the powder was dissolved in water, and the aqueous solution was passed through an Amberlite IRC-50 (H ⁺ ) (registered trademark) column in a neutral state to adsorb the TU-5350 substance. The column was washed with distilled water and eluted with 0.5N-NH ₄ OH. The eluate was concentrated under reduced pressure, and then a crude purified powder was obtained by freeze-drying (yield; 450 mg: the powder that inhibits the enzyme activity of trypsin by 50% Concentration of IC ₅₀ = 60 μg / ml).
Further, this crudely purified powder is dissolved in water, the aqueous solution is passed through an MCI GEL CHP-20P (registered trademark) column to adsorb the active substance, washed with distilled water and 35% methanol water, 55% methanol water, Elute stepwise with 80% aqueous methanol. The trypsin inhibitory active substance was eluted at the time of changing the moving bed solvent from 55% methanol water to 80% methanol water. The eluate active fraction was concentrated and dried under reduced pressure to obtain a white powder (yield; 140 mg; IC ₅₀ = 16 μg / ml).
[0030]
The white powder was finally purified to a single TU-5350 material (yield; 23.38 mg) by subjecting it to preparative HPLC on a CAPCELL PAC C ₁₈ (10φ × 250 mm) column®. The pure TU-5350 substance had an IC ₅₀ concentration of 5.2 μg / ml, which inhibits trypsin enzyme activity by 50%.
The HPLC analysis conditions are described below.
Developing solvent: 20% acetonitrile water containing 0.01% TFA (trifluoroacetic acid),
Flow rate: 1.6ml / min
Detection light: UV235nm
Elution time: 17.5 minutes As a result of the above HPLC and various instrumental analyzes, it was confirmed that the TU-5350 substance purified and isolated in this way was a single pure substance.
[0031]
The purity index of the TU-5350 substance at each purification stage was calculated by measuring the titer of trypsin inhibitory activity, that is, the trypsin inhibition rate (%) described later.
The yield of single purified TU-5350 material from the culture filtrate was 60%. The method for measuring the trypsin inhibition rate (%) is exemplified in Test Example 1 described later.
[0032]
[Test example]
Next, the physiological activity of the TU-5350 substance of the present invention will be described with reference to the following test examples.
Test Example 1 Test of enzyme inhibitory activity of TU-5350 substance against trypsin Trypsin is a kind of proteolytic enzyme. For example, when acting on casein, which is hardly soluble in water, casein is hydrolyzed and easily dissolved in water. It is digested to molecular peptides. When trypsin is allowed to act on a cloudy aqueous solution of casein, the cloudy solution of casein before the reaction becomes a translucent aqueous solution after reacting with trypsin. Utilizing these properties, a method for testing the inhibition of trypsin enzyme activity was constructed.
[0033]
That is, an agar plate medium (casein plate medium) containing casein in agar was prepared, and then an antibiotic titer filter paper disk (diameter 8 mm) soaked with trypsin was placed in the casein plate medium at 37 ° C. When operated for about a day, casein around the filter paper disk is digested and decomposed to form a translucent, circular enzyme reaction zone. Inhibition test of trypsin enzyme activity was carried out by impregnating a filter paper disk (diameter 8 mm) for antibiotic titration with a reaction solution obtained by adding a trypsin inhibitor in advance and allowing it to act on trypsin for a certain period of time. The disc is placed on the casein plate medium, and the diameter of the translucent and circular enzyme reaction zone formed on the plate medium is measured. Residual activity of trypsin by comparing the diameter of the enzyme reaction zone in the test group (control group) without addition of trypsin inhibitor and the diameter of the enzyme reaction zone in the test group (treatment group) with addition of trypsin inhibitor Was evaluated.
[0034]
The test methods performed in this test example are described in detail below.
Casein plate medium was prepared by suspending 500 mg of casein in 1 L of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), adding 10 ml of 500 mM calcium chloride and 15 g of agar, and autoclaving at 120 ° C for 20 minutes. Prepared by dispensing 20 ml.
[0035]
The reaction solution of trypsin inhibitor and trypsin was prepared as follows. Specifically, 20 μL of 1 M calcium chloride, 20 μL of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added to 20 μL of 100 μg / ml concentration of trypsin (pig pancreas, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare an enzyme solution. On the other hand, 140 μL of a trypsin inhibitor aqueous solution in which the test trypsin inhibitor was appropriately diluted with distilled water was added. The total amount of the mixed solution was adjusted to 200 μL with Tris-HCl buffer, and incubated at 37 ° C. for 15 minutes to react trypsin and trypsin inhibitor (inhibitor addition test group). On the other hand, 140 μL of distilled water without addition of trypsin inhibitor is added to the above trypsin solution and incubated at 37 ° C. for 15 minutes to prepare a trypsin-containing reaction solution (control solution), which is a control (no-addition test group). It was. In addition, as a positive comparison control group, leupeptin (Leupeptin; manufactured by Wako Pure Chemical Industries), soy trypsin inhibitor (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and chicken egg white trypsin inhibitor (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Tested.
[0036]
Next, 40 μL of the above trypsin inhibitor / trypsin reaction solution immediately after incubation at 37 ° C. for 15 minutes is accurately weighed and soaked in an 8 mm diameter filter paper disc, and the filter disc is placed on the casein plate medium. And kept at 37 ° C. for 20 hours to allow trypsin to act on casein.
After incubating for 20 hours, the diameter of the translucent and circular enzyme reaction zone formed around the filter paper disk on the casein plate medium was measured. The difference between the diameter of the enzyme reaction zone minus the diameter of the paper disk (8 mm) is proportional to the residual trypsin activity. Therefore, the residual activity of trypsin that was not inhibited is calculated by comparing the diameter of the enzyme reaction zone of the treatment test group to which the inhibitor was added with the diameter of the enzyme reaction zone of the control test group to which no inhibitor was added. Therefore, the inhibition rate (%) of the enzyme activity of trypsin by the trypsin inhibitor could be obtained from the following calculation formula.
[0037]
Inhibition rate of trypsin enzyme activity (%) = 100 − {[diameter of the enzyme reaction zone in the inhibitor addition test group minus the diameter of the paper disk (8 mm)] ÷ [diameter of the enzyme reaction zone in the test group without addition of the inhibitor] Minus the diameter of the paper disc (8mm)]} × 100
In addition, since the inhibition rate (%) of trypsin enzyme activity is proportional to the logarithm of the concentration of trypsin inhibitor in a certain concentration range, the inhibition rate of trypsin enzyme activity at various concentrations of trypsin inhibitor was determined and the data was obtained. The concentration of trypsin inhibitor (IC ₅₀ value) required to inhibit trypsin activity by 50% was calculated by plotting. An example of the test results obtained is shown in Table 1 below.

Soybeans and chicken egg white trypsin inhibitors did not describe IC ₅₀ values at molar concentrations because their molecular weights were unknown.
[0038]
Test Example 2 Insecticidal and growth inhibition test for mushroom larvae In this test, mushroom hatching larvae were used as test larvae, TU-5350 substance of the present invention as a trypsin inhibitor was added to the feed, and TU-5350 substance was added by feeding. I was taken in by the larvae. The insecticidal effect and the larvae growth inhibitory effect obtained by this were tested by a method of visually observing. The test method is as follows.
[0039]
TU-5350 substance was added to artificial feed (Insector LF, trade name manufactured by Nippon Agricultural Industry Co., Ltd.) to a blending concentration of 1000 ppm. 1 g of the TU-5350 substance-added feed was placed in a plastic petri dish having a diameter of 3.5 cm. Immediately after hatching, larvae were released to the petri dish at a rate of 20 petri dishes per day, and were reared at 27 ° C. for 8 days (treatment section). After 8 days, the insecticidal activity and the larvae growth inhibitory activity were investigated. In this investigation, the larvae growth inhibitory activity was evaluated by measuring the body weight of surviving larvae and comparing it with the body weight of the TU-5350 substance-free group (untreated group: control). An example of the obtained results is shown in Table 2 below.
[0040]

As shown in Table 2, the number of surviving insects in the untreated group is 15, whereas this is 7 in the treated group. The TU-5350 substance clearly showed insecticidal activity against the larvae of the moth. In addition, the weight average of the live larvae in the treated group was 1/3 or less of the average weight of the untreated group, and the TU-5350 substance showed a clear growth inhibitory effect on the larvae of the moth.
[0041]
【The invention's effect】
Since the novel trypsin inhibitor AB5350 of the present invention has trypsin inhibitory activity as described above and has insecticidal activity or insect growth inhibitory activity, it is useful as a novel agricultural and horticultural insecticide and medicine.

Claims

TU-5350, a novel peptide produced by Boberia sp. AB5350 strain deposited under the deposit number of FERM P-18715, having inhibitory activity against trypsin and having the following physicochemical properties and the following amino acid sequence partial structure: material.
(1) Appearance; White powder
(2) Specific rotation ([α] _D ²⁵ ); -268 ° (c 0.07, H ₂ O):
(3) Melting point: 270-280 ° C (decomposition)
(4) Molecular weight; 3697.5
(5) UV absorption spectrum (H ₂ O);
λ _max nm (ε) 223 (83677), 280 (10563, shoulder absorption)
(6) Infrared absorption spectrum (KBr tablet method);
υ _max (cm ^-1 ) 3100-3650, 2926, 1645, 1541
(7) There are 14 types of constituent amino acids:
Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Ile, Leu, Phe, Lys, Trp, Arg, Gln
(8) This TU-5350 substance has an amino acid sequence consisting of 34 amino acid residues, and its N-terminal partial structure has the following sequence:
(N-terminal) Ser-Gly-Ile-Cys-Trp-Arg-Ala-Cys-Phe-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro-Glu-Gly-Leu-Glu-Ala-Glu-Gln- Lys− *
However, in the above formula, * represents an amino acid sequence consisting of 10 undefined amino acid residues.
(9) When casein is used as a substrate, the concentration (IC ₅₀ value) of this substance required to inhibit the enzyme activity of trypsin by 50% is 8.0 μg / ml.

A microorganism belonging to the genus Beauveria and capable of producing the novel peptide TU-5350 substance according to claim 1 is cultured in a medium, and the novel peptide, TU-5350 substance is produced and accumulated in the culture. The method according to claim 1, wherein the TU-5350 substance is collected from the culture and then cultured.

A strain of Beauveria sp. AB5350, which has the property of producing the novel peptide TU-5350 substance according to claim 1 and has been deposited under a deposit number of FERM P-18715.

An agricultural and horticultural insecticide comprising the novel peptide according to claim 1, TU-5350 substance or a salt thereof as an active ingredient.