JP4091137B2

JP4091137B2 - Immunosuppressant

Info

Publication number: JP4091137B2
Application number: JP00652497A
Authority: JP
Inventors: 昌弘梶川; 昌昭亀野; 伸二室崎; 博昭日下
Original assignee: キリンフードテック株式会社
Priority date: 1997-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: JPH10194976A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重篤な副作用のない免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果たしており、その主要な機構は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化し、これの異物を排除する能力を高めることである。しかし、自己免疫疾患や、臓器移植の拒否反応などの治療、抑制においては、免疫応答を抑制することが必要であり、そのために免疫抑制剤が使用される。
現在、免疫抑制剤としては、抗原非特異性のステロイド剤や核酸合成系に作用する薬剤が多く使用されているが、これらは、重篤な副作用を生ずることがある。また、シクロスポリン等、臓器移植の拒否反応の抑制に使用される免疫抑制剤にも、様々な副作用を伴うものがある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、重篤な副作用なしに優れた免疫抑制作用を示す免疫抑制剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖類および免疫に関する研究を進める上で、加熱処理した直鎖のβ−１,３グルカンが、リンパ球抑制作用を示すことを見いだした。
かかる加熱処理β−１,３グルカンは、免疫担当細胞が抗原特異的および抗原非特異的な刺激を受けたときのＢおよびＴリンパ球の活性化を抑制する作用を有する。すなわち、該加熱処理β−１,３グルカンを脾臓細胞の培養系に添加すると、マイトジェン刺激を加えずに培養したときの生細胞数および細胞代謝活性はそれほど損なわず、Ｂリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときのリンパ球の生細胞数、特に、Ｂリンパ球の生細胞数の増加および細胞代謝活性の上昇を強度に抑制し、Ｔリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときの細胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。
この抑制作用は、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働くことから、従来の免疫抑制剤が示した非特異性な作用とは異なることを示しており、また、Ｂリンパ球の活性化を強度に抑制することから、近年提案された免疫抑制剤のＴリンパ球に対する選択的な作用とも異なることを示している。
そのため、公知のステロイド剤に認められる様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はないと考えられる。
また、該加熱処理β−１,３グルカンはＢリンパ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用であると考えられる。
【０００５】
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、加熱処理されたβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤を提供するものである。
用いるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分解物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸加水分解物や、β−１,３−グルカナーゼのような酵素による加水分解物で、数平均分子量が３４０から４０００の範囲にあるものが好ましい。加熱処理としては、水溶液中で８０℃以上での加熱が好ましい。
本発明の免疫賦活剤は、副作用がなく、常用に適しており、免疫抑制用の医薬として好適である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、加熱処理に供されるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であり、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligenes）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。
以下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明する。
カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免疫抑制活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
【０００７】
本明細書における数平均分子量は、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定したものである。
測定装置としては、東ソー（株）製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。
検出器：ＲＩ−８０２２
ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ
カラムオーブン：ＣＯ−８０２０
脱気装置：ＳＤ−８０２２
オートサンプラー：ＡＳ−８０２０
測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０cm）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００μlを用いた。溶出は純水で行った。
一方、分子量既知のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、この較正曲線を基に、東ソー（株）のＧＰＣ−ＬＡＬＬＳプログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分子量として換算した。
【０００８】
酸加水分解は、例えば、１〜８５重量％程度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱することにより行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナトリウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を得、必要に応じて、活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱によるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
酵素による加水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で所定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素処理することにより行うことができる。ついで、酵素を失活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
【０００９】
得られた加水分解物は、水溶液の状態で加熱処理に付される。加熱処理は、一般に、８０℃以上、好ましくは、９０〜１２０℃にて、通常、１０〜３０分間加熱することにより行う。加熱手段は、特に限定するものではなく、加熱後、直ちに室温まで冷却する。
【００１０】
加熱処理されたカードラン加水分解物は、そのまま本発明の免疫抑制剤として使用できる。また、自体公知の医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合して、免疫抑制用の医薬とすることができる。
用いる、医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該免疫抑制剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。また、免疫抑制剤の形態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて、種々の固体や液体の形態とすることができる。
本発明の免疫抑制剤は、経口投与、非経口投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加水分解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gである。
本発明の免疫抑制剤は、ステロイド剤に認められる様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はなく、また、本発明はＢリンパ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用である。
【００１１】
【実施例】
つぎに、実施例および試験例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
実施例１
酵素によるカードラン加水分解物の調製
カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これを４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１０００mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥した。
このものはＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量が３４０（プルラン換算値）であった。
このものを、水溶液中で、１００℃にて、１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１２】
実施例２
蟻酸によるカードラン加水分解物の調製
カードラン３０グラムを８５％蟻酸３０００ml中に分散し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーターで濃縮した後、５ＮＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下したので、２ＮＮaＯＨを添加して７に戻した。このものをビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。
このものをＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約２８００であった。
このものを、水溶液中で１００℃にて１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１３】
試験例１
実施例１で得た酵素分解カードランおよび実施例２で得た蟻酸分解カードランを用いて、マウス脾臓リンパ球増殖反応に対する酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品の作用を調べることにより、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品のリンパ球代謝活性上昇およびリンパ球増殖の抑制効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１４週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０⁶／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝生理食塩水を１００℃、１０分間加熱して冷却した液（対照）あるいは酵素分解カードランを８mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加熱して冷却した液、蟻酸分解カードランを８mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加熱して冷却した液をそれぞれ１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養し、培養後の生細胞数と細胞代謝活性を調べた。
【００１４】
生細胞数の測定は、培養細胞液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後に、培養細胞液２００マイクロリットルにＲ−フィコエリトリンで標識したマウスＢリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＣＤ４５Ｒ抗体を１マイクログラム、フルオロセインイソチオシアネートで標識したマウスＴリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＴ細胞レセプター（アルファ／ベータ）抗体を１マイクログラム、および死細胞を特異的に染色する７−アミノアクチノマイシンＤを１マイクログラム加え、５℃で３０分間放置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、フローサイトメーターで総細胞に占めるＢリンパ球およびＴリンパ球の割合ならびにＢリンパ球およびＴリンパ球に占める死細胞の割合を測定し、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の生細胞数を算出した。
細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、マイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝活性を求めた。
表１にその結果を示す。
【００１５】
【表１】

【００１６】
表１に示すごとく、無刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を軽度にしか減少させず細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、Ｂリンパ球刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を大幅に減少させ細胞代謝活性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれも細胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。この様に、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品のいずれにも、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用が認められた。
【００１７】
試験例２
ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオースおよびラミナリヘキサオース（焼津水産化学）の各試薬を用いて、マウス脾臓リンパ球増殖反応に対する加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースの作用を調べることにより、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースのリンパ球代謝活性上昇抑制効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０⁶／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝生理食塩水を１２１℃、２０分間加熱して冷却した液（対照）あるいはラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオースを８mg／mlの濃度あるいは１mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１２１℃、２０分間加熱して冷却した液、をそれぞれ１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１日間培養し、培養後の細胞代謝活性を調べた。
【００１８】
細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭ１１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で２日放置後、マイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝活性を求めた。
表２にその結果を示す。
【００１９】
【表２】

【００２０】
表２に示すごとく、無刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、Ｂリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlおよび０．４mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制したが、０．４mg／mlの濃度においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオースのみが細胞代謝活性の上昇を部分抑制した。この様に、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用を示し、特に、Ｂリンパ球に対する作用が強く、また、リンパ球抑制活性は加熱処理ラミナリビオースおよび加熱処理ラミナリトリオースが強かった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、重篤な副作用のない、優れた免疫抑制剤が提供される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunosuppressant without serious side effects.
[0002]
[Prior art]
The in vivo immune system plays an important role in defense against microorganisms such as bacteria, yeast, mold, and viruses, and defense against tumors. The main mechanism is that T lymphocytes and B lymphocytes are these microorganisms. Or stimulating tumors by recognizing them through the antigen receptor and activating them in an antigen-specific manner to enhance their ability to eliminate foreign substances. However, in the treatment and suppression of autoimmune diseases and organ transplant rejection, it is necessary to suppress the immune response, and an immunosuppressant is used for this purpose.
Currently, many non-antigen steroids and drugs that act on nucleic acid synthesis systems are used as immunosuppressive agents, but these may cause serious side effects. In addition, some immunosuppressive agents used to suppress organ transplant rejection, such as cyclosporine, have various side effects.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an immunosuppressive agent that exhibits an excellent immunosuppressive action without serious side effects.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have found that a heat-treated linear β-1,3 glucan exhibits a lymphocyte inhibitory action in conducting research on saccharides and immunity.
Such heat-treated β-1,3 glucan has an action of suppressing the activation of B and T lymphocytes when immunocompetent cells receive antigen-specific and non-antigen-specific stimuli. That is, when the heat-treated β-1,3 glucan is added to a spleen cell culture system, the number of living cells and cell metabolic activity when cultured without mitogenic stimulation are not significantly impaired, and under B lymphocyte mitogenic stimulation. Increase in the number of viable lymphocytes when cultured, in particular, increase in the number of viable B lymphocytes and increase in cell metabolic activity, and increase in cell metabolic activity when cultured under T lymphocyte mitogen stimulation Was suppressed to strength.
This inhibitory action works more selectively when lymphocytes are activated, indicating that it is different from the nonspecific action exhibited by conventional immunosuppressive agents, and the activity of B lymphocytes. It is shown that it is different from the selective action on T lymphocytes of recently proposed immunosuppressive agents.
Therefore, there are no side effects such as various side effects observed in known steroids, serious side effects such as hematopoiesis observed in drugs acting on the nucleic acid synthesis system, and side effects such as kidney damage and liver damage observed in cyclosporine and FK506. it is conceivable that.
In addition, since the heat-treated β-1,3 glucan strongly suppresses the activation of B lymphocytes, autoimmune diseases such as malignant lymphoma, systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis caused by abnormal B lymphocytes or allergies Very useful in the treatment of disease. Furthermore, since it also suppresses the activation of T lymphocytes, it is considered useful for preventing organ transplant rejection.
[0005]
This invention is completed based on this knowledge, Comprising: The immunosuppressive agent which uses the linear saccharide | sugar which consists of the heat-processed (beta) -1, 3- glucoside bond as an active ingredient is provided.
Curdlan hydrolyzate is mentioned as a linear saccharide | sugar which consists of (beta) -1,3-glucoside bond to be used. In particular, acid hydrolysates, especially formic acid hydrolysates and hydrolysates by enzymes such as β-1,3-glucanase, having a number average molecular weight in the range of 340 to 4000 are preferred. As the heat treatment, heating at 80 ° C. or higher in an aqueous solution is preferable.
The immunostimulant of the present invention has no side effects, is suitable for regular use, and is suitable as a pharmaceutical for immunosuppression.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, as a linear saccharide comprising a β-1,3-glucoside bond to be subjected to heat treatment, an oligosaccharide or polysaccharide linked by a β-1,3-glucoside bond without branching a glucose molecule As a typical example, a hydrolyzate of curdlan, which is a polysaccharide having a β-1,3-glucoside bond, produced by a bacterium of the genus Alkaligenes or Agrobacterium. Can be mentioned.
Hereinafter, the present invention will be described using a curdlan hydrolyzate as an example.
The hydrolyzate of curdlan can be prepared by a polysaccharide hydrolysis method known per se. However, due to the immunosuppressive activity of the obtained hydrolyzate, organic acids such as formic acid and acetic acid, inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid are used. In particular, it is preferably carried out with an enzyme such as formic acid or β-1,3-glucanase, and those having a number average molecular weight in the range of 340 to 4000 are preferred.
[0007]
The number average molecular weight in this specification is measured by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.
As a measuring device, a high performance liquid chromatography device manufactured by Tosoh Corporation was used.
Detector: RI-8022
Pump: CCPM-II
Column oven: CO-8020
Deaeration device: SD-8022
Autosampler: AS-8020
A TSK gel column (G-OLIGO-PW or G-3000PWXL, 7.8 φmm × 30 cm) was used as a measurement column, and measurement was performed at a flow rate of 0.6 to 0.7 ml / min and a temperature of 40 ° C. A 0.02% aqueous solution of the sample was prepared and 200 μl thereof was used. Elution was performed with pure water.
On the other hand, pullulan standards with a known molecular weight are measured in the same way to create a calibration curve. Based on this calibration curve, the molecular weight distribution is calculated by Tosoh Corporation's GPC-LALLS program and Microsoft Corporation's calculation program "Excel". The function was obtained and converted as the number average molecular weight.
[0008]
For example, the acid hydrolysis is performed by heating a 0.5 to 5.0% by weight aqueous solution of curdlan containing about 1 to 85% by weight of acid at 70 to 100 ° C. for 10 minutes to 3 hours. Can do. The hydrolysis reaction solution is neutralized with an alkali agent such as sodium hydroxide, centrifuged to obtain a supernatant, and known per se such as activated carbon treatment, dialysis, solvent fractionation, removal of formyl group by heating, etc. The desired hydrolyzate is obtained by purifying by the above method.
Hydrolysis with an enzyme can be performed, for example, by subjecting a 0.5 to 3% by weight aqueous solution of curdlan to an enzyme treatment at a pH and temperature suitable for the enzyme used for a predetermined time. Next, after inactivating the enzyme, the supernatant is obtained by centrifugation, and the desired hydrolyzate can be obtained by purifying it by a known method such as activated carbon treatment, dialysis, solvent fractionation, etc., if necessary. It is done.
[0009]
The obtained hydrolyzate is subjected to heat treatment in the form of an aqueous solution. The heat treatment is generally performed by heating at 80 ° C. or higher, preferably 90 to 120 ° C., usually for 10 to 30 minutes. The heating means is not particularly limited, and is immediately cooled to room temperature after heating.
[0010]
The heat-treated curdlan hydrolyzate can be used as it is as an immunosuppressant of the present invention. Moreover, it can combine with a well-known pharmaceutical carrier or excipient | filler by a well-known method, and can be set as the pharmaceutical for immunosuppression.
The pharmaceutical carrier or excipient used is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the specific use of the immunosuppressive agent. Further, the form of the immunosuppressant is not particularly limited, and various solid and liquid forms can be used depending on the specific application.
The immunosuppressive agent of the present invention may be administered either orally or parenterally, and its dosage is 4 mg to 40 g per day as the solid content of curdlan hydrolyzate.
The immunosuppressive agent of the present invention includes various side effects observed in steroids, serious side effects such as hematopoietic organs observed in drugs acting on nucleic acid synthesis systems, kidney damage and liver damage observed in cyclosporine and FK506, etc. In addition, since the present invention strongly suppresses the activation of B lymphocytes, the present invention is effective in the treatment of autoimmune diseases or allergic diseases such as malignant lymphoma, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis caused by abnormalities of B lymphocytes. Very useful for treatment. Furthermore, since it suppresses the activation of T lymphocytes, it is useful for preventing organ transplant rejection.
[0011]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Preparation of curdlan hydrolyzate by enzyme 4 g of curdlan was dispersed in 200 ml of 0.05M acetic acid buffer, and 18 units / ml of agaric enzyme were added. This was heated to 40 ° C., incubated for 4 hours, and then kept in a boiling water bath for 15 minutes to inactivate the enzyme. Subsequently, the precipitate was removed by cooling and centrifuging, and the supernatant was adsorbed on activated carbon packed in a column having a diameter of 5 cm and a height of 30 cm, washed with 1000 ml of water, and further washed with 2000 ml of 4% ethanol. Subsequently, the adsorbed component was eluted with 2000 ml of 20% ethanol, concentrated with an evaporator, and freeze-dried.
This had a number average molecular weight of 340 (as calculated as pullulan) as measured by HPLC.
This was heated in an aqueous solution at 100 ° C. for 10 minutes and then cooled to obtain an immunosuppressive agent.
[0012]
Example 2
Preparation of curdlan hydrolyzate with formic acid 30 grams of curdlan was dispersed in 3000 ml of 85% formic acid, heated to 90 ° C. and held for 20 minutes. Subsequently, the whole container was exposed to cold water, cooled to room temperature, concentrated with an evaporator, neutralized with 5N NaOH to pH 7, and centrifuged. The supernatant was heated in a boiling water bath for 120 minutes in order to remove the formyl group. At this time, since the pH was lowered, 2N NaOH was added to return to 7. This was placed in a Visking tube and dialyzed overnight against 10 liters of pure water, and the dialyzed solution was lyophilized.
The number average molecular weight when this was measured by HPLC was about 2800 in terms of pullulan.
This was heated in an aqueous solution at 100 ° C. for 10 minutes and then cooled to obtain an immunosuppressant.
[0013]
Test example 1
Using the enzyme-degrading curdlan obtained in Example 1 and the formic acid-degrading curdlan obtained in Example 2, the effects of the enzyme-degrading curdlan heat-treated product and the formic acid-degrading curdlan heat-treated product on mouse spleen lymphocyte proliferation reaction are investigated. By the above, the lymphocyte metabolic activity increase and the inhibitory effect on lymphocyte proliferation of the enzyme-degraded curdlan heat-treated product and the formic acid-degraded curdlan heat-treated product were verified.
The spleen was aseptically removed from a mouse (C57BL / 6, female, 14 weeks old), spleen was crushed in RPMI1640 medium, and passed through a 200 mesh sieve to obtain a spleen cell suspension. After the number of cells in the spleen cell suspension was measured with an automatic hemocytometer, the number of cells was adjusted to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml in RPMI 1640 medium, and 100 microliters per well were seeded in a 96-well tissue culture plate. . A solution obtained by dissolving B lymphocyte proliferation stimulating substance lipopolysaccharide in RPMI 1640 medium at a concentration of 200 microgram / ml, and a solution obtained by dissolving T lymphocyte proliferation stimulating substance concanavalin A in RPMI 1640 medium at a concentration of 8 microgram / ml. Alternatively, RPMI1640 medium was added to each spleen cell suspension seeded at 50 microliters per well to form a B lymphocyte stimulation group, a T lymphocyte stimulation group, and an unstimulation group. In these three groups, phosphate buffered saline was heated at 100 ° C. for 10 minutes and cooled (control) or enzyme-degraded curdlan was dissolved in phosphate buffered saline at a concentration of 8 mg / ml at 100 ° C. Add 10 microliters per well of a solution that has been heated and cooled for 10 minutes, a solution of formic acid-degraded curdlan dissolved in phosphate buffered saline at a concentration of 8 mg / ml and heated at 100 ° C. for 10 minutes. The cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 2 days, and the number of viable cells and cell metabolic activity after the culture were examined.
[0014]
The number of viable cells was determined by measuring the number of cells in the cultured cell solution with an automatic hemocytometer, and then adding 1 anti-mouse CD45R antibody as a specific antibody against mouse B lymphocytes labeled with R-phycoerythrin in 200 microliters of cultured cell solution. 1 microgram of anti-mouse T cell receptor (alpha / beta) antibody, a specific antibody against mouse T lymphocytes labeled with fluorescein isothiocyanate, and 7-aminoactinomycin D that specifically stains dead cells 1 microgram was added and allowed to stand at 5 ° C. for 30 minutes, followed by washing with RPMI 1640 medium, and the ratio of B lymphocytes and T lymphocytes to total cells and the number of dead cells occupying B lymphocytes and T lymphocytes with a flow cytometer. Measure the ratio and calculate the number of live B lymphocytes and T lymphocytes It was.
Cell metabolic activity was determined by dissolving a solution of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide in RPMI 1640 medium at a concentration of 5 mg / ml 3 hours before the end of the culture. Add 10 microliters per well, add 50 microliters of 20% sodium dodecyl sulfate solution per well at the end of the culture, leave at 37 ° C for 1 day, and then measure the absorbance of the culture with a microplate reader to measure cell metabolism. Activity was sought.
Table 1 shows the results.
[0015]
[Table 1]

[0016]
As shown in Table 1, in the non-stimulated group, both the enzyme-degraded curdlan heat-treated product and the formic acid-degraded curdlan heat-treated product decreased the number of viable B lymphocytes only slightly and had little effect on cell metabolic activity. In the B lymphocyte stimulation group, both the enzyme-degraded curdlan heat-treated product and the formic acid-degraded curdlan heat-treated product significantly reduced the number of viable B lymphocytes and completely suppressed the increase in cell metabolic activity. did. In the T lymphocyte stimulation group, both the enzyme-degraded curdlan heat-treated product and the formic acid-degraded curdlan heat-treated product strongly suppressed the increase in cell metabolic activity. Thus, both the enzyme-degraded curdlan heat-treated product and the formic acid-degraded curdlan heat-treated product acted more selectively when lymphocytes were activated, and a strong inhibitory action was observed.
[0017]
Test example 2
Laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose, laminaripentaose and laminarihexaose (Yaizu Suisan Chemical) are used to heat-treat laminaribiose and heat-treated lamina for mouse spleen lymphocyte proliferation reaction By examining the effects of ritriose, heat-treated laminaritetraose, heat-treated laminaripentaose, heat-treated laminarihexaose, heat-treated laminaribiose, heat-treated laminaritriose, heat-treated laminaritetraose, heat-treated The effects of treatment-treated laminaripentaose and heat-treated laminarihexaose on lymphocyte metabolic activity increase were examined.
The spleen was aseptically removed from a mouse (C57BL / 6, female, 18 weeks old), spleen was crushed in RPMI1640 medium, and passed through a 200 mesh sieve to obtain a spleen cell suspension. After the number of cells in the spleen cell suspension was measured with an automatic hemocytometer, the number of cells was adjusted to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml in RPMI 1640 medium, and 100 microliters per well were seeded in a 96-well tissue culture plate. . A solution obtained by dissolving B lymphocyte proliferation stimulating substance lipopolysaccharide in RPMI 1640 medium at a concentration of 200 microgram / ml, and a solution obtained by dissolving T lymphocyte proliferation stimulating substance concanavalin A in RPMI 1640 medium at a concentration of 8 microgram / ml. Alternatively, RPMI1640 medium was added to each spleen cell suspension seeded at 50 microliters per well to form a B lymphocyte stimulation group, a T lymphocyte stimulation group, and an unstimulation group. In these three groups, phosphate buffered saline was heated at 121 ° C for 20 minutes and cooled (control) or laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose, laminaripentaose, laminarihexaose. 50 microliters per well of a solution that has been dissolved in phosphate buffered saline at a concentration of 8 mg / ml or 1 mg / ml, heated at 121 ° C. for 20 minutes, and cooled, is added to each well, and 5% carbon dioxide at 37 ° C. The cells were cultured in an incubator for 1 day, and the cell metabolic activity after the culture was examined.
[0018]
Cell metabolic activity was determined by dissolving a solution of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide in RPM11640 medium at a concentration of 5 mg / ml 3 hours before the end of the culture. Add 10 microliters per well, add 50 microliters of 20% sodium dodecyl sulfate solution per well at the end of the culture, leave it at 37 ° C for 2 days, and then measure the absorbance of the culture with a microplate reader to measure cell metabolism. Activity was sought.
Table 2 shows the results.
[0019]
[Table 2]

[0020]
As shown in Table 2, in the unstimulated group, the heat-treated laminaribiose, the heat-treated laminaritriose, the heat-treated laminaritetraose, the heat-treated laminaripentaose, and the heat-treated laminarihexaose are all cell metabolic activities. In the B lymphocyte stimulation group, heat-treated laminaribiose, heat-treated laminaritriose, heat-treated laminaritetraose, heat-treated laminaripentaose, heat-treated laminarihexaose Both completely suppressed the increase in cell metabolic activity at concentrations of 2 mg / ml and 0.4 mg / ml. In the T lymphocyte stimulation group, heat-treated laminaribiose, heat-treated laminaritriose, heat-treated laminaritetraose, heat-treated laminaripentaose and heat-treated laminarihexaose are all cells at a concentration of 2 mg / ml. Although the increase in metabolic activity was completely suppressed, only the heat-treated laminaribiose and heat-treated laminaritriose partially inhibited the increase in cell metabolic activity at a concentration of 0.4 mg / ml. In this way, heat-treated laminaribiose, heat-treated laminaritriose, heat-treated laminaritetraose, heat-treated laminaripentaose, and heat-treated laminarihexaose are all selected when lymphocytes are activated. In particular, it showed a strong suppressive action, particularly strong action on B lymphocytes, and lymphocyte suppressive activity was strong in heat-treated laminaribiose and heat-treated laminaritriose.
[0021]
【The invention's effect】
According to the present invention, an excellent immunosuppressive agent free from serious side effects is provided.

Claims

An immunosuppressant comprising a curdlan hydrolyzate having a heat-treated number average molecular weight in the range of 340 to 4000 as an active ingredient.

The immunosuppressive agent according to claim 1, wherein the hydrolyzate is an acid hydrolyzate.

The immunosuppressive agent according to claim 2, wherein the hydrolyzate is a hydrolyzate by formic acid .

Immunosuppressive agent according to claim 1 wherein the hydrolyzate according hydrolyzate beta-1,3-glucanase.

The immunosuppressive agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the heat treatment is performed at a temperature of 80 ° C or higher in an aqueous solution .

The immunosuppressive agent according to any one of claims 1 to 5, wherein the immunosuppressive effect is a lymphocyte inhibitory effect .