JP4089292B2 - Urethane-modified ε-polylysine, chemically-modified urethanized ε-polylysine and chemically-modified ε-polylysine, and methods for producing them. - Google Patents
Urethane-modified ε-polylysine, chemically-modified urethanized ε-polylysine and chemically-modified ε-polylysine, and methods for producing them. Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウレタン化ε-ポリリジン、化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンおよび化学修飾ε-ポリリジン並びにこれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε-ポリリジンは、リジン同士が、そのε位のアミノ基と、隣り合うリジンのヒドロキシカルボニル基と酸アミド結合によって結合した高分子化合物である。ε-ポリリジンは、必須アミノ酸であるリジンのポリマーであることから安全性が高く、また、カチオン含量が高いので、抗菌性などの特異な物性を有する。ε-ポリリジンはその特異な物性から、トイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料などへの用途が期待される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ε-ポリリジンのその特異な物性の用途を拡大する、もしくはε-ポリリジンに新たな機能を付与する有効な手段として、ε-ポリリジン分子の末端に存在するＣ末端部位を利用して化学修飾することが挙げられる。しかしながら、ε-ポリリジン分子にはアミノ基が複数存在することから、Ｃ末端部位を選択的に化学修飾することは困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは従来技術が有する課題に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、ε-ポリリジンをウレタン化したウレタン化ε-ポリリジンであれば、該Ｃ末端部位を選択的に化学修飾することが可能であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００５】
本発明の目的は、ε-ポリリジン分子の末端に存在するＣ末端部位を選択的に化学修飾する際に有効な、中間体（ウレタン化ε-ポリリジンおよび化学修飾ウレタン化ε-ポリリジン）とその製造方法、さらに該中間体を用いた化学修飾ε-ポリリジンの製造方法を提供することにある。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、
（α）アルキルオキシカルボニル化剤を用いて下記式(４)で表されるε-ポリリジンをウレタン化することにより、下記式(１)で表されるウレタン化ε-ポリリジンを得る工程（但し、アルキルは、メチル、エチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミルから選ばれた１種以上である。）
（β）下記式(１)で表されるウレタン化ε-ポリリジンのＣ末端部を、１級または２級のアミン、リチウムアルコキシドまたはリチウムチオレートを用いてウレタン化ε-ポリリジンを化学修飾することにより、下記式(２)で表される化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを得る工程
（γ）下記式(２)で表される化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを無機酸または有機酸を用いて脱アルキルオキシカルボニル化することにより、下記式(３)で表される化学修飾ε-ポリリジンを得る工程
を有する下記式(３)で表される化学修飾ε-ポリリジンの製造方法である。
【０００７】
下記式(１)および式(２)において、アミノ基の６６モル％以上がＲ1ＯＣＯ基で保護されていれば本発明の効果を奏する。ここでいうアミノ基のモル％とは、下記式(４)で表されるε-ポリリジンが有する全アミノ基を１００モル％とした場合に、Ｒ1ＯＣＯ基で保護されているアミノ基の割合をモル％で表したものである。また、Ｒ1ＯＣＯ基で保護されているアミノ基の割合は、より好ましくは７０モル％以上、さらに好ましくは８０モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上であり、最も好ましくは１００モル％である。
【０００８】
Ｒ1ＯＣＯ基で保護されているアミノ基の割合を調整するためには、アルキルオキシカルボニル化剤を用いて下記式(４)で表されるε-ポリリジンをウレタン化する際の条件を変えればよい。たとえば、アルキルオキシカルボニル化剤を適切に選択することやアルキルオキシカルボニル化剤の量を適切に選択することで、Ｒ1ＯＣＯ基で保護されているアミノ基の割合を調整することができる。
【０００９】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【００１３】
Ｒ1は、メチル、エチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミルから選ばれた１種以上であるが、特にｔ-ブチル、t-アミルであることが好ましい。
【００１４】
Ｒ３およびＲ４のアルキルは、アミル、１−メチルブチル、３，３−ジメチルブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、（１−プロピル）ノニル、ドデシル、（１−ブチル）テトラデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ブトキシプロピル、ノルボルニル、アダマンチル、１−イミダゾイルプロピル、３，３，５−トリメチルシクロヘキシルに例示される飽和脂肪族、ヘキシル−２−エン、（１−メチル）ヘキシル−２−エン、（１−メチル）テトラデシル−５−インに例示される不飽和脂肪族を挙げられる。
【００１５】
Ｒ３およびＲ４のアリールは、ブチルフェニル、sec-ブチルフェニル、オクチルフェニル、デシルフェニル、ドデシルフェニル、テトラデシルフェニル、ヘキサデシルフェニル、トリフルオロフェニル、ベンジルオキシフェニル、９−オキシフルオレニル、アセチルフェニル、フェナントレン−９−イル、４−トリフルオロメチルフェニル、１−ナフチル、２−クロロピリジル、Ｎ、Ｎ−ジメチルフェニル、フェニルアミノフェニル、４−トリフルオロメチル−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル、を挙げられる。
【００１６】
Ｒ３およびＲ４のアラルキルは、ベンジル、１，２−ジフェニルエチル、フルオロベンジル、１−ナフチルエチル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２−フェニルエチルを挙げられる。
【００１７】
本発明の出発原料であるε-ポリリジンは、その生産方法により限定されるものではないが、微生物が生産するε-ポリリジンであることが好ましい。例えば、特許第１２４５３６１号に記載のストレプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを、その組成が、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、および硫酸鉄・７水和物０．０３重量％であり、ｐＨが６．８に調整された培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取することによって得られる。また、それを酸、アルカリまたは酵素により適当な分子量に分解したε-ポリリジンも挙げられる。
【００１８】
（α）ウレタン化ε - ポリリジンを得る工程
アルキルオキシカルボニル化剤を用いて上記式(４)で表されるε-ポリリジンをウレタン化することにより、上記式(１)で表されるウレタン化ε-ポリリジンを得る。
ε-ポリリジンを重量で２０から２００倍量（好ましくは５０から１００倍量）のメタノールに溶解後、ε-ポリリジンに対し、塩基を３当量加える。この溶液に、最初に加えたε-ポリリジンのアミノ基に対してアルキルオキシカルボニル化剤を０．７から１．１当量（好ましくは１．０から１．１当量）加え、３から１２時間還流した後、減圧濃縮する。次いでここに、最初に加えたε-ポリリジンに対して重量で２０から２００倍量（好ましくは５０から１００倍量）の非プロトン性溶媒（例えば、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、好ましくはクロロホルム）を加えた後、再度ε-ポリリジンに対して塩基を３当量とアルキルオキシカルボニル化剤を０．７から１．１当量（好ましくは１．０から１．１当量）加え、３から１２時間還流する。冷却後、有機層を水、飽和食塩水の順で洗浄する。有機層を乾燥後、濾過し、得られた濾液を濃縮する。この濃縮液に、最初に加えたε-ポリリジンに対してヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素系溶媒を重量で２０から２００倍量加えて固化させることにより、ウレタン化ε-ポリリジンを得る。
【００１９】
ここで塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ-メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ−[５，４，０]−ウンデカ−7−エン、１，５−ジアザビシクロ−[４，３，０]−ノナ−５−エン、１，４−ジアザビシクロ[２，２，２]−オクタンが挙げられる。
【００２０】
アルキルオキシカルボニル化剤としては、ジアルキルジカルボナート、ハロゲン化炭酸アルキル、アルキルオキシカルボニルアジド、アルキル炭酸エステル類が挙げられる。アルキル炭酸エステル類はアルキルオキシカルボニルｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルオキシカルボニルN−コハク酸イミドエステル、アルキルオキシカルボニルN−フタル酸イミドエステルであることが好ましい。また、アルキルオキシカルボニル化剤のアルキルはメチル、エチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミルなどが挙げられる。アルキルオキシカルボニル化剤のアルキルはｔ-ブチルであることが好ましい。
【００２１】
（β）化学修飾ウレタン化ε - ポリリジンを得る工程
上記式(１)で表されるウレタン化ε-ポリリジンのＣ末端部を用いてウレタン化ε-ポリリジンを化学修飾することにより、上記式(２)で表される化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを得る。
１級または２級のアミンを用いて修飾した場合は、アミド体が得られる。また、リチウムアルコキシドまたはリチウムチオレートを用いて修飾した場合は、エステル体またはチオエステル体が得られる。
【００２２】
（アミド体の化学修飾ウレタン化ε - ポリリジン）
ウレタン化ε-ポリリジンを重量で２０から２００倍量（好ましくは５０から１００倍量）のメタノールに溶解後、１級または２級のアミンをウレタン化ε-ポリリジンに対して１から２００当量（好ましくは８０から１２０当量）加え、３から１２時間還流した後減圧濃縮する。次いで、この濃縮液を最初に加えたウレタン化ε-ポリリジンに対して重量で２０から２００倍量（好ましくは３０から５０倍量）の非プロトン性溶媒（例えば、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、好ましくはクロロホルム）に溶解させる。更に、この溶解液に、最初に加えたウレタン化ε-ポリリジンに対して重量で２０から２００倍量の炭化水素系溶媒（例えば、ヘキサン、ヘプタン）を加えて固化させることにより、アミド体の化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを得る。
【００２３】
１級または２級のアミンとしては、以下のものを挙げることができる。オクチルアミン、ドデシルアミン、ステアリルアミンに例示される飽和脂肪族１級アミン類、アリルアミン、オクタ−７−エニル−２−アミン、ドデカ−６‐エニル−１−アミン、オクタデク−１０−エニル−５−アミンに例示される不飽和脂肪族１級アミン類、ベンジルアミン、ｐ‐メチルベンジルアミン、ｐ−スチリルメチルアミン、フェネチルアミンに例示される芳香族置換脂肪族１級アミン、エチレンジアミン、１，６−ジアミノヘキサン、ポリアリルアミンに例示される1級ポリアミン類、グリシンフェニルエステル、ロイシン−ｔ‐ブチルエステルに例示されるアミノ酸エステル類、ジエチルアミン、ジアリルアミン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、３−メチレンピロリジンなど２級アミン類が挙げられる。
【００２４】
（エステル体またはチオエステル体の化学修飾ウレタン化ε - ポリリジン）
ウレタン化ε-ポリリジンを重量で１０から２００倍量（好ましくは２０から３０倍量）のクロロホルムに溶解する。この溶解液に、最初に加えたウレタン化ε-ポリリジンに対して１から２００当量（好ましくは１０から３０当量）のリチウムアルコキシドまたはリチウムチオレートを、これらに対して重量で１から２０倍量の非プロトン性溶媒（例えば、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、好ましくは２から３倍量のクロロホルム）に溶解させた溶液を加え、２０℃で1日攪拌する。有機層を水、飽和食塩水の順で洗浄し、有機層を乾燥後、濾過し、得られた濾液を濃縮する。この濃縮液に、最初に加えたウレタン化ε-ポリリジンに対して重量で２０から２００倍量（好ましくは３０から５０倍量）の非プロトン性溶媒（例えばクロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、好ましくはクロロホルム）を加え溶解させる。次いでここに、最初に加えたウレタン化ε-ポリリジンに対して重量で２０から２００倍量の炭化水素系溶媒（例えばヘキサン、ヘプタン）を加えて固化させることにより、エステル体またはチオエステル体の化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを得る。
【００２５】
リチウムアルコキシドまたはリチウムチオレートとしては、以下のものを挙げることができる。
リチウムアルコキシドとしては、ヘキサン−１−オール、ドデカン−４−オール、オクタデシル−５−オールに例示される飽和脂肪族アルコール類、ヘキサ−２−エン−１−オール、オクタ−３−エン−２−オール、ペンタデカ−６−イン−２−オールに例示される不飽和脂肪族アルコール類、ベンジルアルコール、ナフト−１−イル−メチルアルコールに例示される芳香族置換脂肪族アルコール類、グルコース、ポリビニルアルコールに例示されるポリオール類のリチオ化物が挙げられる。
【００２６】
リチウムチオレートとしては、ヘキサン−１−チオール、ドデカン−４−チオール、オクタデシル−５−チオールに例示される飽和脂肪族アルコール類、アリルチオール、ヘキサ−２−エン−１−チオール、オクタ−３−エン−２−チオール、ペンタデカ−６−イン−２−チオールに例示される不飽和脂肪族チオール類、ベンジルチオール、ナフト−１−イル−メチルチオールに例示される芳香族置換脂肪族チオール類のリチオ化物が挙げられる。
【００２７】
（γ）化学修飾ε - ポリリジンを得る工程
上記式(２)で表される化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを脱アルキルオキシカルボニル化することにより、上記式(３)で表される化学修飾ε-ポリリジンを得る。
化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを重量で１０から１００倍量の１から１２Ｎ塩酸（好ましくは３Ｎ塩酸５０倍量）および重量で１０から１００倍量（好ましくは５０倍量）のメタノールとともに２時間攪拌する。次いでここに、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、アセトニトリルから選ばれる溶媒１種を最初に加えた化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンに対して重量で５０から５００倍量（好ましくはメタノール１００倍量）加えて固化させることにより、化学修飾ε-ポリリジンの塩酸塩を得る。また、メタノール等を加えて、固化させる前に、イオン交換水で洗浄すると化学修飾ε-ポリリジンが得られる。
さらに、無機酸である塩酸に代えて、有機酸を用いて同様の操作を行うと、化学修飾ε-ポリリジンの無機酸塩の代わりに、化学修飾ε-ポリリジンの有機酸塩が得られる。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を示すがこれらは本発明を限定するものではない。
図１，６で示した1Ｈ−ＮＭＲチャートは、以下の条件で測定した。
周波数 ： 400MHｚ
装置名 ： JEOL製GSX400
フリップ角 ： 45°
パルス待ち時間 ： 5秒
溶媒 ： DMSO-d6
【００２９】
図２，４，７で示した1Ｈ−ＮＭＲチャートは、以下の条件で測定した。
周波数 ： 90MHｚ
装置名 ： JEOL製EX90A
フリップ角 ： 45°
パルス待ち時間 ： 7.55秒
溶媒 ： D2O（重水）
【００３０】
図３，５，８で示したイオン会合クロマトグラフィーによる重合度分析結果は、以下のＨＰＬＣ条件で行った。
装置 ：ＨＰ１１００（ヒューレットパッカード社）
カラム：L-Column ODS φ4.6×250nm(化学物質評価研究機構)
溶離液：（A）10nM NaH2PO4・2H2O+100nm NaClO4・H2O
＋10nm オクチル硫酸ナトリウム(pH 2.6)
(B) 20nm NaH2PO4・2H2O+100nm NaClO4・H2O
＋10nm オクチル硫酸ナトリウム(pH 2.6)/CH3CN =50/50
溶出条件：
カラム温度：５０℃
注入量 ：２０μL
検出 ：ダイオード・アレイ検出器（ｓｉｇ＝２１５ｎｍ）
【００３１】
実施例１ ．（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル化ε−ポリリジンの製造）
２００ｍＬナス型フラスコ内にe-ポリリジン１１．４ｗｔ％水溶液１０ｍＬを加え、減圧下水を留去した。ここにメタノールを２０ｇ加え、加熱、超音波により完全溶解させた後、メタノールを減圧下留去した。これにメタノール７０ｇを加え、１時間加熱還流させた後、室温まで冷却した。さらにトリエチルアミン５ｇを加え１分間攪拌し、次いでジ−ｔ−ブチルジカルボナート３ｇを加え、５時間還流させた。減圧下溶媒を留去し、クロロホルム２０ｇを加え、加熱、超音波により完全溶解させた後、トリエチルアミン３ｇ、ジ−ｔ−ブチルジカルボナート１ｇを加えて５時間還流した。これを室温まで冷却し、水、飽和食塩水２回の順で分液操作を行った。有機層に硫酸マグネシウムを加え乾燥後、セライトで濾過し、得られた濾液を10ml程度まで濃縮した。これにヘキサン７０ｍＬを加えて固化させた。これを耐薬メンブランフィルターを用いて濾過し、濾別した結晶部を減圧下乾燥して白色粉状の化合物であるＮ−ｔ−ブトキシカルボニル化ε−ポリリジンを２．０４ｇ得た。本化合物の1Ｈ−ＮＭＲチャートを図１に示す。
【００３２】
実施例１で得られた白色粉体がｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護されたε−ポリリジンであることを確認するため、以下の操作を行った。
実施例１で得られた白色粉体２０ｍｇに１２Ｎ−ＨＣｌ水溶液１ｍＬを加え、結晶が完全に溶解したところで、メタノール１ｍＬ、アセトン２．５ｍＬを加えた。これを氷冷下攪拌しながらアセトン０．５ｍＬを加えることにより析出物を得た。析出物をメンブランフィルターで濾過後減圧下乾燥し、白色粉体１０ｍｇを得た。
標準品の1Ｈ−ＮＭＲチャート（図２）およびイオン会合クロマトグラフィー（図３）と本粉体の1Ｈ−ＮＭＲチャート（図４）およびイオン会合クロマトグラフィー（図５）とを比較することにより、この白色粉体（１０ｍｇ）がε−ポリリジン塩酸塩であることを確認した。
【００３３】
実施例２．（化学修飾ウレタン化ε−ポリリジンの製造例その１）
１００ｍＬナス型フラスコに、実施例１で得られた白色粉体１ｇ、ステアリルアミンを１ｇ、メタノール３５ｇを加え、５時間加熱還流した。これを室温まで冷却し、減圧下メタノールを留去して無色の結晶を得た。これをクロロホルム２０ｇに溶解し、さらに、ヘキサン５０ｇを加え、無色の結晶を析出させ、耐薬メンブランフィルターを用いて濾過した。結晶部を温ヘキサン５０ｇで２度洗浄後、結晶部を減圧下乾燥させ、無色の結晶０．９７８ｇを得た。
【００３４】
実施例３．（化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンの製造例その２）
２５ｍＬナス型フラスコに、実施例１で得られた白色粉体１００ｍｇ、クロロホルム１０ｇを加え、５０℃に加熱し溶解させた。別途１０ｍＬナス型フラスコに水酸化リチウム２ｍｇ、（２−ヒドロキシメチル）メタクリレート８８ｍｇ、ジメチルホルムアミド５ｇを加え、1時間攪拌し、これを２５ｍＬナス型フラスコに滴下した。１日攪拌した後、減圧下溶媒を留去し、再度クロロホルム２ｇに溶解し、さらに、ヘキサン５ｇを加え、無色の結晶を析出させ、耐薬メンブランフィルターを用いて濾過した。結晶部を温ヘキサン５ｇで２度洗浄後、結晶部を減圧下乾燥させ、無色の結晶９２．８ｍｇを得た。本化合物の1Ｈ−ＮＭＲチャートを図６に示す。
【００３５】
実施例４．（化学修飾ε-ポリリジンの製造例 （脱保護））
５０ｍＬナス型フラスコに実施例２で得た無色の結晶１００ｍｇ、メタノール８ｇ、３Ｎ塩酸３ｇを入れ室温で1時間攪拌した。減圧下溶媒を留去、メタノール８ｇを加え、さらに減圧下留去し、得られた薄膜状物を水１００ｍｇ、メタノール２００ｍｇの混合溶液に溶解した。これに攪拌下アセトン２ｇを滴下して結晶を析出させた。耐薬メンブランフィルターで濾過し、減圧下乾燥させることで無色の結晶であるステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩、７０ｍｇを得た。
本結晶（ステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩）の1Ｈ−ＮＭＲチャート（図７）を、e-ポリリジン標準品の1Ｈ−ＮＭＲチャート（図２）と比較することにより、ステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩であることを確認した。また、これのイオン会合クロマトグラフィーを図８に示す。
【００３６】
（化学修飾ε-ポリリジンの抗菌作用）
実施例４で得られたステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩の抗菌性を以下の方法に従って試験した。
普通ブイヨン培地４．５ｍＬに、表１に示した各濃度（6.3〜200ppm）の１０倍に調整した実施例４のステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩溶液を０．５ｍＬ加え、滅菌ピペットで大腸菌（Escherichia coli IFO13500）を、培地中の生菌数が１０3個／ｍＬレベルの濃度となるように調整し試験菌液（α）を得た。
また上記と同様に、菌を黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO12732）に変えて、培地中の生菌数が１０3個／ｍＬレベルの濃度となるように調整し試験菌液（β）を得た。試験菌液（α）、（β）それぞれにつき、表１に示した７種類、６種類の濃度のものを調整した。
この試験菌液全１３種類につき、温度３６±１℃の条件で１１０時間培養を行った。培養終了後、縣濁具合をε-ポリリジンのみを添加した場合を対照として菌の増殖を判断した。その結果を表１に示す。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の製造方法は、従来困難であったε-ポリリジンのＣ末端部位を選択的に化学修飾することを可能にした。また、本発明の製造方法により、従来得ることが困難であったウレタン化ε-ポリリジン、化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを容易に製造することが可能となった。
本発明の化学修飾ε-ポリリジンは、Ｃ末端部位のみが化学修飾されていることからε-ポリリジンのその特異な物性を保ちつつ、新たな機能が付与される。そのため、その用途を拡大することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル化ε−ポリリジンの1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図２】標準品の1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図３】標準品のイオン会合クロマトグラフィー。
【図４】本粉体の1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図５】本粉体のイオン会合クロマトグラフィー。
【図６】本化合物の1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図７】ステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩の1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図８】ステアリル化ε−ポリリジンアミド塩酸塩のイオン会合クロマトグラフィー。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to urethanized ε-polylysine, chemically modified urethanized ε-polylysine, chemically modified ε-polylysine and methods for producing them.
[0002]
[Prior art]
ε-Polylysine is a polymer compound in which lysines are bonded to each other by an acid amide bond with an amino group at the ε position and a hydroxycarbonyl group of an adjacent lysine. Since ε-polylysine is a polymer of lysine, which is an essential amino acid, it is highly safe, and since it has a high cation content, it has specific physical properties such as antibacterial properties. Because of its unique physical properties, ε-polylysine is expected to be used for toiletries, cosmetics, feed additives, pharmaceuticals, agricultural chemicals, food additives, electronic materials and the like.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Chemical modification using the C-terminal site at the end of ε-polylysine molecule as an effective means to expand the use of ε-polylysine for its unique physical properties or to give ε-polylysine a new function Is mentioned. However, since the ε-polylysine molecule has a plurality of amino groups, it has been difficult to selectively chemically modify the C-terminal site.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made extensive studies in view of the problems of the prior art. As a result, it was found that the urethanized ε-polylysine obtained by urethanizing ε-polylysine can selectively chemically modify the C-terminal portion, and the present invention was completed based on this finding. .
[0005]
An object of the present invention is to provide intermediates (urethanized ε-polylysine and chemically modified urethanized ε-polylysine) effective in selectively chemically modifying the C-terminal site present at the end of the ε-polylysine molecule and the production thereof. And a method for producing chemically modified ε-polylysine using the intermediate.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention
(Α) Step of obtaining urethanized ε-polylysine represented by the following formula (1) by urethanizing ε-polylysine represented by the following formula (4) using an alkyloxycarbonylating agent (provided that alkyl are methyl, ethyl, isobutyl, t- butyl, 1 or more selected t-Ami le or al.)
(Β) Chemically modifying the urethanized ε-polylysine with a primary or secondary amine, lithium alkoxide or lithium thiolate at the C-terminal part of the urethanized ε-polylysine represented by the following formula (1) The step of obtaining a chemically modified urethanized ε-polylysine represented by the following formula (2) (γ) The chemically modified urethanized ε-polylysine represented by the following formula (2) is removed using an inorganic acid or an organic acid. A method for producing a chemically modified ε-polylysine represented by the following formula (3), which comprises a step of obtaining a chemically modified ε-polylysine represented by the following formula (3) by alkyloxycarbonylation.
[0007]
In the following formulas (1) and (2), if 66 mol% or more of the amino groups are protected by the R 1 OCO group, the effect of the present invention is exhibited. The mol% of the amino group here means the ratio of the amino group protected by the R 1 OCO group when the total amino group of the ε-polylysine represented by the following formula (4) is 100 mol%. Is expressed in mol%. Further, the ratio of the amino group protected by the R 1 OCO group is more preferably 70 mol% or more, further preferably 80 mol% or more, particularly preferably 90 mol% or more, and most preferably 100 mol%. is there.
[0008]
In order to adjust the proportion of the amino group protected by the R 1 OCO group, the conditions for urethanizing ε-polylysine represented by the following formula (4) using an alkyloxycarbonylating agent can be changed. Good. For example, the proportion of the amino group protected by the R 1 OCO group can be adjusted by appropriately selecting the alkyloxycarbonylating agent or appropriately selecting the amount of the alkyloxycarbonylating agent.
[0009]
[Formula 4]
[Chemical formula 5]
[Chemical 6]
[Chemical 7]
[0013]
R 1 is methyl, ethyl, isobutyl, t- butyl, t-but is Ami Le whether we selected one or more, and particularly preferably t-butyl, t-amyl.
[0014]
R 3 and R 4 alkyl are amyl, 1-methylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, (1-propyl) nonyl, dodecyl, (1-butyl) tetradecyl, Saturated aliphatics exemplified by hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, butoxypropyl, norbornyl, adamantyl, 1-imidazolylpropyl, 3,3,5-trimethylcyclohexyl, hexyl-2-ene, (1-methyl) hexyl-2- And unsaturated aliphatic groups exemplified by ene and (1-methyl) tetradecyl-5-yne.
[0015]
Aryl of R 3 and R 4 is butylphenyl, sec-butylphenyl, octylphenyl, decylphenyl, dodecylphenyl, tetradecylphenyl, hexadecylphenyl, trifluorophenyl, benzyloxyphenyl, 9-oxyfluorenyl, acetylphenyl Phenanthrene-9-yl, 4-trifluoromethylphenyl, 1-naphthyl, 2-chloropyridyl, N, N-dimethylphenyl, phenylaminophenyl, 4-trifluoromethyl-2,3,5,6-tetrafluoro Phenyl.
[0016]
Aralkyl of R 3 and R 4 includes benzyl, 1,2-diphenylethyl, fluorobenzyl, 1-naphthylethyl, 2,4,6-trimethoxybenzyl, 2-phenylethyl.
[0017]
The ε-polylysine that is the starting material of the present invention is not limited by its production method, but is preferably ε-polylysine produced by a microorganism. For example, the composition of Streptomyces alpras subspecies lysinopolymeras described in Japanese Patent No. 1245361 is 5% by weight of glucose, 0.5% by weight of yeast extract, 1% by weight of ammonium sulfate, and 0% of dipotassium hydrogen phosphate. 0.08 wt%, potassium dihydrogen phosphate 0.136 wt%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05 wt%, zinc sulfate heptahydrate 0.004 wt%, and iron sulfate heptahydrate It is obtained by culturing in a medium having a concentration of 0.03% by weight and a pH adjusted to 6.8, and separating and collecting ε-polylysine from the obtained culture. Moreover, the epsilon polylysine which decomposed | disassembled it to the appropriate molecular weight with the acid, alkali, or enzyme is also mentioned.
[0018]
(Alpha) urethanization epsilon - by urethanization of ε- polylysine represented by the above formula (4) using the process <br/> alkyloxycarbonyl agent to obtain a polylysine, is represented by the above formula (1) To obtain urethanized ε-polylysine.
After ε-polylysine is dissolved in 20 to 200 times (preferably 50 to 100 times) methanol by weight, 3 equivalents of base are added to ε-polylysine. To this solution, 0.7 to 1.1 equivalents (preferably 1.0 to 1.1 equivalents) of an alkyloxycarbonylating agent is added to the amino group of ε-polylysine added first, and refluxed for 3 to 12 hours. And concentrated under reduced pressure. Next, the aprotic solvent (for example, chloroform, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, dioxane) having a weight of 20 to 200 times (preferably 50 to 100 times) by weight with respect to the first added ε-polylysine is then added. , Preferably chloroform), and then again add 3 equivalents of base to ε-polylysine and 0.7 to 1.1 equivalents (preferably 1.0 to 1.1 equivalents) of alkyloxycarbonylating agent, Reflux for 3 to 12 hours. After cooling, the organic layer is washed with water and then saturated brine. The organic layer is dried and then filtered, and the resulting filtrate is concentrated. A urethanized ε-polylysine is obtained by adding 20 to 200 times the weight of a hydrocarbon solvent such as hexane or heptane to the concentrated ε-polylysine initially added and solidifying the concentrated solution.
[0019]
Here, as the base, triethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, 1,8-diazabicyclo- [5,4,0] -undec-7-ene, 1,5-diazabicyclo- [4,3,0] -nona Examples include -5-ene and 1,4-diazabicyclo [2,2,2] -octane.
[0020]
Examples of the alkyloxycarbonylating agent include dialkyl dicarbonates, halogenated alkyl carbonates, alkyloxycarbonyl azides, and alkyl carbonates. The alkyl carbonates are preferably alkyloxycarbonyl p-nitrophenyl ester, alkyloxycarbonyl N-succinic acid imide ester, and alkyloxycarbonyl N-phthalic acid imide ester. The alkyl alkyloxycarbonyl agents are methyl, ethyl, isobutyl, t- butyl, t-etc. Ami, Le and the like. Alkyl alkyloxycarbonyl agent is preferably a t- butyl Le.
[0021]
(Beta) chemically modified urethanization epsilon - by chemically modifying the urethanization ε- polylysine with a C-terminal portion of the urethanization ε- polylysine represented by step <br/> above equation to obtain a polylysine (1), A chemically modified urethanized ε-polylysine represented by the above formula (2) is obtained.
When it is modified with a primary or secondary amine, an amide is obtained. Moreover, when it modifies using lithium alkoxide or lithium thiolate, an ester body or a thioester body is obtained.
[0022]
(Chemically modified urethane-modified amide ε - polylysine)
After dissolving urethanized ε-polylysine in 20 to 200 times by weight (preferably 50 to 100 times) of methanol, primary or secondary amine is equivalent to 1 to 200 equivalents to urethanized ε-polylysine (preferably 80 to 120 equivalents), refluxed for 3 to 12 hours, and concentrated under reduced pressure. Then, the concentrated solution is added to the urethanized ε-polylysine initially added with 20 to 200 times (preferably 30 to 50 times) aprotic solvent (for example, chloroform, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, Dimethylacetamide, dioxane, preferably chloroform). Furthermore, by adding 20 to 200 times the amount of hydrocarbon solvent (for example, hexane, heptane) by weight with respect to the first urethanized ε-polylysine added to the solution, and solidifying the amide chemistry. A modified urethanized ε-polylysine is obtained.
[0023]
Examples of the primary or secondary amine include the following. Saturated aliphatic primary amines exemplified by octylamine, dodecylamine, stearylamine, allylamine, octa-7-enyl-2-amine, dodec-6-enyl-1-amine, octadec-10-enyl-5 Unsaturated aliphatic primary amines exemplified by amines, benzylamine, p-methylbenzylamine, p-styrylmethylamine, aromatic substituted aliphatic primary amines exemplified by phenethylamine, ethylenediamine, 1,6-diamino Primary amines exemplified by hexane and polyallylamine, amino acid esters exemplified by glycine phenyl ester and leucine-t-butyl ester, secondary amines such as diethylamine, diallylamine, pyrrolidine, piperidine, azepane and 3-methylenepyrrolidine Is mentioned.
[0024]
(Chemically modified urethanized ε - polylysine ester or thioester )
Urethane ε-polylysine is dissolved in 10 to 200 times (preferably 20 to 30 times) chloroform by weight. To this solution, 1 to 200 equivalents (preferably 10 to 30 equivalents) of lithium alkoxide or lithium thiolate with respect to the first urethanized ε-polylysine added, 1 to 20 times the weight of these. A solution dissolved in an aprotic solvent (for example, chloroform, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, dioxane, tetrahydrofuran, preferably 2 to 3 times the amount of chloroform) is added and stirred at 20 ° C. for 1 day. The organic layer is washed with water and saturated brine in this order. The organic layer is dried and then filtered, and the resulting filtrate is concentrated. A 20 to 200-fold amount (preferably 30 to 50-fold amount) of aprotic solvent (for example, chloroform, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide) by weight with respect to the first urethanized ε-polylysine added to the concentrate. , Dioxane, preferably chloroform). Next, by adding 20 to 200 times by weight of a hydrocarbon solvent (for example, hexane, heptane) and solidifying the urethanized ε-polylysine added first, the ester or thioester is chemically modified. A urethanized ε-polylysine is obtained.
[0025]
Examples of the lithium alkoxide or lithium thiolate include the following.
Examples of the lithium alkoxide include saturated aliphatic alcohols exemplified by hexane-1-ol, dodecan-4-ol, and octadecyl-5-ol, hexa-2-en-1-ol, and octa-3-en-2- All unsaturated fatty alcohols exemplified by pentadeca-6-in-2-ol, benzyl alcohol, aromatic substituted aliphatic alcohols exemplified by naphth-1-yl-methyl alcohol, glucose, polyvinyl alcohol Examples include lithiated products of the exemplified polyols.
[0026]
Examples of the lithium thiolate include saturated aliphatic alcohols exemplified by hexane-1-thiol, dodecane-4-thiol, and octadecyl-5-thiol, allyl thiol, hexa-2-ene-1-thiol, octa-3- Lithio of unsaturated aliphatic thiols exemplified by en-2-thiol, pentadec-6-in-2-thiol, benzylthiol, aromatic substituted aliphatic thiols exemplified by naphth-1-yl-methylthiol A compound.
[0027]
(Gamma) chemically modified epsilon - by de-alkyloxycarbonyl the chemical modification urethanization ε- polylysine represented by step <br/> above equation to obtain a polylysine (2), represented by the formula (3) A chemically modified ε-polylysine is obtained.
Stir the chemically modified urethanized ε-polylysine with 10 to 100 times by
Further, when the same operation is performed using an organic acid instead of hydrochloric acid which is an inorganic acid, an organic acid salt of chemically modified ε-polylysine is obtained instead of the inorganic acid salt of chemically modified ε-polylysine.
[0028]
【Example】
Examples are shown below, but these do not limit the present invention.
The 1 H-NMR chart shown in FIGS. 1 and 6 was measured under the following conditions.
Frequency: 400MHz
Device name: JEOL GSX400
Flip angle: 45 °
Pulse waiting time: 5 seconds Solvent: DMSO-d6
[0029]
The 1 H-NMR charts shown in FIGS. 2, 4 and 7 were measured under the following conditions.
Frequency: 90MHz
Device name: EX90A made by JEOL
Flip angle: 45 °
Pulse waiting time: 7.55 seconds Solvent: D 2 O (heavy water)
[0030]
The results of analyzing the degree of polymerization by ion association chromatography shown in FIGS. 3, 5 and 8 were performed under the following HPLC conditions.
Apparatus: HP1100 (Hewlett-Packard Company)
Column: L-Column ODS φ4.6 × 250nm (National Institute for Chemical Evaluation)
Eluent: (A) 10 nM NaH 2 PO 4 · 2H 2 O + 100 nm NaClO 4 · H 2 O
+ 10nm sodium octyl sulfate (pH 2.6)
(B) 20nm NaH 2 PO 4・ 2H 2 O + 100nm NaClO 4・ H 2 O
+ 10nm Sodium octyl sulfate (pH 2.6) / CH 3 CN = 50/50
Elution conditions:
Column temperature: 50 ° C
Injection volume: 20 μL
Detection: Diode array detector (sig = 215 nm)
[0031]
Example 1. (Production of Nt-butoxycarbonylated ε-polylysine)
In a 200 mL eggplant-shaped flask, 10 mL of an e-polylysine 11.4 wt% aqueous solution was added, and water was distilled off under reduced pressure. 20 g of methanol was added thereto, and after complete dissolution by heating and ultrasonic waves, methanol was distilled off under reduced pressure. 70 g of methanol was added thereto, and the mixture was heated to reflux for 1 hour and then cooled to room temperature. Further, 5 g of triethylamine was added and stirred for 1 minute, and then 3 g of di-t-butyl dicarbonate was added and refluxed for 5 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, 20 g of chloroform was added, and after complete dissolution by heating and ultrasonic waves, 3 g of triethylamine and 1 g of di-t-butyl dicarbonate were added and refluxed for 5 hours. This was cooled to room temperature and subjected to a liquid separation operation in the order of water and saturated brine twice. Magnesium sulfate was added to the organic layer, dried, filtered through celite, and the resulting filtrate was concentrated to about 10 ml. 70 mL of hexane was added to this and solidified. This was filtered using a chemical resistant membrane filter, and the separated crystal part was dried under reduced pressure to obtain 2.04 g of Nt-butoxycarbonylated ε-polylysine as a white powdery compound. A 1 H-NMR chart of this compound is shown in FIG.
[0032]
In order to confirm that the white powder obtained in Example 1 was ε-polylysine protected with a t-butyloxycarbonyl group, the following operation was performed.
To 20 mg of the white powder obtained in Example 1, 1 mL of 12N-HCl aqueous solution was added. When the crystals were completely dissolved, 1 mL of methanol and 2.5 mL of acetone were added. The precipitate was obtained by adding acetone 0.5mL, stirring this under ice-cooling. The precipitate was filtered through a membrane filter and dried under reduced pressure to obtain 10 mg of white powder.
By comparing the standard 1 H-NMR chart (FIG. 2) and ion association chromatography (FIG. 3) with the 1 H-NMR chart (FIG. 4) and ion association chromatography (FIG. 5) of this powder. The white powder (10 mg) was confirmed to be ε-polylysine hydrochloride.
[0033]
Example 2 (Production example 1 of chemically modified urethanized ε-polylysine)
To a 100 mL eggplant-shaped flask, 1 g of the white powder obtained in Example 1, 1 g of stearylamine, and 35 g of methanol were added and heated to reflux for 5 hours. This was cooled to room temperature, and methanol was distilled off under reduced pressure to obtain colorless crystals. This was dissolved in 20 g of chloroform, and 50 g of hexane was further added to precipitate colorless crystals, followed by filtration using a chemical resistant membrane filter. The crystal part was washed twice with 50 g of warm hexane, and then the crystal part was dried under reduced pressure to obtain 0.978 g of colorless crystals.
[0034]
Example 3 (Production example of chemically modified urethanized ε-polylysine part 2)
To a 25 mL eggplant-shaped flask, 100 mg of the white powder obtained in Example 1 and 10 g of chloroform were added and heated to 50 ° C. to dissolve. Separately, 2 mg of lithium hydroxide, 88 mg of (2-hydroxymethyl) methacrylate, and 5 g of dimethylformamide were added to a 10 mL eggplant-shaped flask and stirred for 1 hour, and this was dropped into a 25 mL eggplant-shaped flask. After stirring for 1 day, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was again dissolved in 2 g of chloroform. Further, 5 g of hexane was added to precipitate colorless crystals, which were filtered using a chemical resistant membrane filter. The crystal part was washed twice with 5 g of hot hexane, and then the crystal part was dried under reduced pressure to obtain 92.8 mg of colorless crystals. A 1 H-NMR chart of this compound is shown in FIG.
[0035]
Example 4 (Production example of chemically modified ε-polylysine (deprotection))
A 50 mL eggplant-shaped flask was charged with 100 mg of the colorless crystals obtained in Example 2, 8 g of methanol, and 3 g of 3N hydrochloric acid, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was distilled off under reduced pressure, 8 g of methanol was added, further distilled off under reduced pressure, and the obtained thin film was dissolved in a mixed solution of 100 mg of water and 200 mg of methanol. Under stirring, 2 g of acetone was added dropwise to precipitate crystals. Filtration through a chemical resistant membrane filter and drying under reduced pressure yielded 70 mg of stearylated ε-polylysineamide hydrochloride as colorless crystals.
A 1 H-NMR chart of the crystals (stearylated ε- polylysine hydrochloride) (Fig. 7), by comparing the e- polylysine the 1 H-NMR chart of standard (Figure 2), stearylated ε- polylysine It was confirmed that it was an amide hydrochloride. Moreover, the ion association chromatography of this is shown in FIG.
[0036]
(Antimicrobial action of chemically modified ε-polylysine)
The antibacterial properties of the stearylated ε-polylysine amide hydrochloride obtained in Example 4 were tested according to the following method.
0.5 mL of the stearylated ε-polylysine amide hydrochloride solution of Example 4 adjusted to 10 times each concentration (6.3 to 200 ppm) shown in Table 1 was added to 4.5 mL of ordinary broth medium, and E. coli ( Escherichia coli IFO13500) was adjusted so that the number of viable bacteria in the medium would be a concentration of 10 3 cells / mL, to obtain a test bacterial solution (α).
In the same manner as above, the bacterium was changed to Staphylococcus aureus IFO12732 and the number of viable bacteria in the medium was adjusted to a concentration of 10 3 / mL to obtain a test bacterial solution (β). . For each of the test bacterial solutions (α) and (β), the concentrations of 7 types and 6 types shown in Table 1 were prepared.
All 13 types of the test bacterial solutions were cultured for 110 hours at a temperature of 36 ± 1 ° C. After completion of the culture, the growth of the bacteria was judged using as a control the case where only ε-polylysine was added. The results are shown in Table 1.
【The invention's effect】
The production method of the present invention makes it possible to selectively chemically modify the C-terminal site of ε-polylysine, which has been difficult in the past. Further, the production method of the present invention makes it possible to easily produce urethanized ε-polylysine and chemically modified urethanized ε-polylysine, which have been difficult to obtain in the past.
Since the chemically modified ε-polylysine of the present invention is chemically modified only at the C-terminal site, a new function is imparted while maintaining the specific physical properties of ε-polylysine. Therefore, the application can be expanded.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a 1 H-NMR chart of Nt-butoxycarbonylated ε-polylysine.
[Figure 2] 1 H-NMR chart of standard products.
FIG. 3 Standard ion association chromatography.
FIG. 4 is a 1 H-NMR chart of the present powder.
FIG. 5: Ion association chromatography of this powder.
FIG. 6 is a 1 H-NMR chart of the present compound.
FIG. 7 is a 1 H-NMR chart of stearylated ε-polylysineamide hydrochloride.
FIG. 8: Ion association chromatography of stearylated ε-polylysine amide hydrochloride.
Claims (10)
（α）ε-ポリリジンを、アルキルオキシカルボニル化剤を用いて請求項１に記載の式（１）で表されるウレタン化しウレタン化ε-ポリリジンを得る工程。（但し、アルキルは、メチル、エチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミルから選ばれた１種以上である。）
（β）ウレタン化ε-ポリリジンのＣ末端部を、１級または２級のアミン、リチウムアルコキシドまたはリチウムチオレートを用いて化学修飾することを特徴とする請求項７に記載の式（２）で表される化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを得る工程。
（γ）化学修飾ウレタン化ε-ポリリジンを無機酸または有機酸を用いて脱アルキルオキシカルボニル化することにより、化学修飾ε-ポリリジンを得る工程。The manufacturing method of chemically modified (epsilon) -polylysine represented by Formula (3) of Claim 8 which has the process of following ((alpha))-((gamma)).
(Α) A step of urethanizing ε-polylysine represented by formula (1) according to claim 1 to obtain urethanized ε-polylysine using an alkyloxycarbonylating agent. (Where alkyl is methyl, ethyl, isobutyl, t- butyl, 1 or more selected t-Ami le or al.)
(Β) The C-terminal part of urethanized ε-polylysine is chemically modified with a primary or secondary amine, lithium alkoxide or lithium thiolate, Obtaining the chemically modified urethanized ε-polylysine represented.
(Γ) A step of obtaining chemically modified ε-polylysine by dealkyloxycarbonylating chemically modified urethanized ε-polylysine with an inorganic acid or an organic acid.
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