JP4087446B2 - 細胞懸濁物を試験するための方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は細胞のサイズに関連するパラメーター、例えば容積、直径又は形状を決定するために細胞懸濁物のサンプルを分析する方法に関する。この方法において、これらの細胞は希釈した後に試験し、そしてサイズ測定値は環境条件、特に供給サンプルの浸透圧に対して補正する。
背景技術
血液サンプルの自動化試験は数多くの医学検査の重要なものとなっている。自動化装置のスピードおよび使い易さは病院での完全血液測定（CBS）を供する好適な方法にしている。サンプル中の細胞数の値を供するのと同様に、この装置は細胞の平均サイズを測定するために用いられる。
電子式粒子カウンターは典型的には制約されたフローにおける粒子を検出し、粒子サイズの尺度及び粒子の各粒状タイプについての計測数を供するセンサーを利用する。このセンサーは通常電場の変化、レーザー由来の光散乱の変化、電場密度又は磁束の変化、又は細胞もしくは細胞懸濁物及び／もしくは懸濁液の光学、音響もしくはその他の物理特性の変化を検出する。どのようなタイプのセンサーを使用しようと、それは粒子のサイズ、形状、軌道、数及びその他の特性の結果的であるシグナルを生成し、その一部は同時に測定されうる。粒子を検出方法として直流又は交流を利用する電子式粒子カウンターは電子式サイジング装置（以降EPSと称す）と呼ぶことができ、そして粒子がレストリクション（開口部）を通過する際の電圧パルスとして通常記録される電圧又は電流の特徴的な変化を供する。
電子式粒子サイジングは導性溶液の中に吊された２本の電極を頼りとし、それらは懸濁物の細胞又はその他の小粒子が横断する一本の導流路を除き互いと隔離されている。粒子がこの流路（開口部）を通過すると、この流路の物理特性は粒子のサイズに比例して一時的に変化する。このような変化の特性を測定することにより、粒子のサイズ及び濃度が決定される。これは赤血球、白血球及び血小板並びに任意の無細胞懸濁物に対して実施され、そして任意の手段（即ち、光学、NMR等）による細胞の更なる鑑別のために染色又はその他の技術と組合せることができる。
市販のEPS装置は細胞懸濁物を調製するのに等張性希釈液を使用せず、その代わりに高張性溶液、典型的には集団の平均血漿浸透圧よりも30〜50mOsm／kg高く設定されたリン酸緩衝食塩水（PBS）を使用する。個体間で自然の血漿浸透圧域が存在することがよく知られている。非硬質壁を有する全ての浸透性細胞に関し、細胞サイズはそれが懸濁されているバッファーの浸透圧により変化することも知られている。自動化細胞試験、例えばCBCを実施する場合、製造者は試験すべき患者の血漿の浸透圧とは既知の関係をもたずに単一の固定高張浸透圧で細胞を試験する。これは供されるサイズ評価の誤差の原因となり、なぜなら細胞は低張バッファー中で放置されると膨張し、そして高張バッファーの中では収縮するから、及び任意のバッファーの中で膨張する細胞の程度は患者に特異的であるからである。製造者は高張バッファーを利用することによりこの誤差要因を小さくしており、これは経時的な細胞サイズの変化（即ち、試験前の老化）を最小にするが、精度を犠牲にし、そして通常小さめの細胞サイズをもたらしてしまう。
本発明の方法は細胞をそのin vivo浸透圧で試験することにより上記の問題を解消し、これにより経時的な膨潤の可能性が最少限となり、且つ細胞のその浸透圧環境に関するin vivo条件が擬似化される。in vivo細胞サイズの最も正確なin vitro測定が、細胞をその血漿と同じ浸透圧のバッファーで試験すると可能となり、なぜならこれは不適正なバッファー浸透圧を調整するための「補正因子」の必要性を排除するからである。現存の技術において、このような補正因子は常に設定され、なぜなら個体の血漿浸透圧が未知であるから又は現存の試験において利用されていないからである。患者は時折り集団平均よりも50〜100mOsm／kg低い血漿浸透圧を有することがあると報告されているため及び製造者は平均よりも50mOsm／kgまで高いバッファーを使用するため、大きな誤差が時折り誘導される。このような大きな偏差は異常ではあるが、それは重篤な病気を有する患者で起こり易く、その者の誤差はひどい結果を生み出し易い。本方法はこの問題を二通りに解決する；それは患者の血漿浸透圧を測定し、そしてバッファー浸透圧を適合するように調整することによる、又は細胞を患者自身の血漿の中で試験することによる。
細胞、特に血液細胞は浸透剤として働くことが知られる。赤血球を囲む溶液の浸透圧を臨界レベルより低く下げることは細胞がまず膨潤し、次いで球形となり、そしてゴースト細胞が形成されることを引き起こし、それよりその内容物はゆっくりと放出されヘモグロビンのほぼ全てが周囲媒体へと放出される。溶血と呼ばれるこの過程は水により浸透圧的に、又は界面活性剤（例えば石けん）、ヘビ毒又はその他の化学品、熱、機械もしくは電気因子により誘導されうる。
溶血が起こる臨界浸透圧は赤血球細胞懸濁物のアリコートを例えばDE−Ａ−31303792に記載の如き段階又は連続式濃度変化を含みうる濃度勾配に委ねることにより決定し得る。
血漿の浸透圧は個体間で、そして往々にして個体内で経時的に異なることがあることが知られる。異常な浸透圧をもつ血漿を有する個体の血液サンプルを粒子サイジングにかけたとき、等張食塩水に希釈した際の細胞サイズに関して得られる値はin vivoでの細胞サイズと異なるであろう。本発明はかかる誤差を補正することを追求する。
発明の開示
本発明の第一観点に係る新規の方法において、細胞懸濁物を下記の工程にかける：
１）細胞懸濁物の一部を細胞懸濁物の細胞外液（血漿）と同じ浸透圧を有する希釈液で希釈する、そして
２）工程１で形成した希釈懸濁物中の細胞を、前記希釈懸濁物において懸濁したまま細胞サイズ測定にかける。
本発明のこの観点において、工程１に利用する希釈液は出発細胞懸濁物から分離した血漿より成ってよい。分離は例えば人的に又はその他の手段により実施してよい。この場合、正確に浸透圧補正された細胞サイズを作るよう血漿の浸透圧を決定する必要はない。しかしながら、血漿の代わりに、血漿のそれに等しい浸透圧を有する既知の組成の希釈液を用いて細胞サイズの対照測定を更に行うことが好ましく、これは血漿の浸透圧の決定を必要としうる。他方、サイズの対照測定は下記の工程５のように様々な浸透圧の希釈液の中での一連の測定より成ることがある。このことは外挿によるサイズ測定の決定を可能にする。これらの対照試験は工程１において希釈液として使用した血漿が測定工程２において得られる値に影響を及ぼさないことの確認を得ることを可能にする。もし値が異なるなら、更なる調査がなされる。
工程１の代わりに、出発細胞懸濁物の浸透圧を決定し、そして希釈液をその浸透圧にする。この希釈液は既知濃度の適当なバッファーを適量で用いることにより調製し得る（例えば、適量の低張及び高張流体を用いて）。浸透圧は例えば出発細胞懸濁物の血漿の浸透圧を、通常は細胞懸濁物の一部を細胞及び血漿へと分離した後に測定することにより決定される。浸透圧は他に、浸透圧に寄与する血漿中のほとんどの分子の濃度を測定する標準血液化学分析を利用して、又は標準浸透圧計を利用することにより計算できる。
工程２において実施される細胞サイズ測定より得られる値は血漿の浸透圧を本発明のこの観点の好適な態様において決定するために利用できる。この態様において、当該方法は更に下記の工程を含む：
３）細胞懸濁物の更なる部分を既知浸透圧の水性希釈液に希釈する；
４）この既知浸透圧希釈液中の細胞の細胞サイズを測定する；
５）細胞懸濁物の細胞に関する高張から低張に至る浸透圧変化に伴う細胞サイズ変化の関数を決定する；そして
６）工程５において決定した関数、工程２及び４において決定した細胞サイズ、並びに工程３において決定した希釈液の浸透圧を工程１において利用する血漿の浸透圧を計算するために用いる。
この方法の変法において、工程１におけるそのままの血漿の代わりに又はそれに加えて、既知の浸透圧を有する既知量（例えば１容量以上、又は通常は20容量以下、例えば２〜10容量）の希釈液により希釈した血漿を細胞の希釈液として用いる。そのままの血漿を利用する工程１に加えてこの工程を利用する場合、これは工程２において決定される細胞サイズ測定値についての検定を担い、それ故前記工程６において計算した血漿浸透圧について決定された値についての検定を担う。
この方法において、工程５で決定される関数はいく通りかの技術により決定され得る。そのうちの１つは、細胞懸濁物自体の細胞を関数の決定に用いることができうることである。この方法においては少なくとも下記の工程を実施する。
７）出発細胞懸濁物の一部を既知の高張（出発細胞懸濁物の血漿に対して）浸透圧の水性希釈液で希釈して高張希釈懸濁物を形成する；
８）高張希釈懸濁物中の細胞の細胞サイズを測定する；
９）細胞懸濁物の更なる一部を既知の浸透圧（出発細胞懸濁物の血漿の浸透圧に対して低張）の水性希釈液の中に希釈して低張希釈懸濁物を形成する；
10）低張希釈懸濁物中の細胞の細胞サイズを測定する；そして
11）工程８及び10における高張及び低張希釈細胞懸濁物について得られる細胞サイズ測定値並びに高張及び低張希釈液の浸透圧値を利用し、前記関数を計算する。
この関数は高張及び低張希釈液間での浸透圧域内では直線性がないことがあるため、この範囲においていくつかの異なる既知の浸透圧で希釈懸濁物についての細胞サイズ測定を実施するのが好ましい。好ましくは、この範囲は細胞が破裂寸前となる最大サイズを有する高張浸透圧を含む。
工程５の関数を決定するための別の技術において、出発細胞懸濁物のそれと似たタイプであるが、浸透圧変化によりよく測定された形状変化をする較正用細胞懸濁物を使用して関数を決定する。この較正用細胞懸濁物は様々な既知の濃度の低張及び高張希釈液を利用して希釈し、そしてサイズ測定にかける。この方法は英国特許出願第9526649.0，9526684.7及び9526720.9号のそれぞれに基づく優先権主張を伴う本願と同日出願の我々の国際特許出願に更に記載されている。これにより決定された関数が出発懸濁物の細胞は適用できるであろうかを確認するため、この試験は似たようなタイプのいくつかの対比細胞懸濁物に対して実施し、そして集団の平均をこの関数として用いてよい。
標準／対比細胞の関数を確認できたら、少なくとも２通りの既知の浸透圧に希釈した出発細胞懸濁物の細胞に対して細胞サイズ測定を実施することが好ましいことがある。好ましくは、その少なくとも一つは細胞が破裂することなくその最大サイズとなる低張浸透圧とし、なぜならこれは細胞懸濁物の細胞の相対定数の決定を最適化するからである。細胞サイズ測定は、細胞がその最大サイズを有しているものを含む連続的な低めの浸透圧希釈にかけた細胞懸濁物のいくつかのアリコートに対して実施するのが好都合でありうる。
工程１に利用した出発細胞懸濁物の血漿の浸透圧を決定するための本発明のこのような態様において利用する方法は他に未知の浸透圧の任意の希釈液の浸透圧を決定するためにも利用できうる。例えば、既知の比率の血漿と既知の比率の既知の浸透圧の希釈液とより成る希釈液を出発細胞懸濁物の一部を希釈するために用いたとき、この方法は血漿の浸透圧を決定するために利用できうる。この技術により、希釈液として利用するのに少なめの量の血漿ですみ、このことは血漿を供するのに必要な出発細胞懸濁物サンプルのサイズを小さくする。この方法は、事実、既知浸透圧のバッファーに対する細胞の応答も決定されることを条件に、様々な水性液の浸透圧の決定において利用するための浸透圧計として利用されうる。
細胞外媒体の浸透圧を決定するための別の方法において、一連の試験の希釈剤として、Ｏ型陰性赤血球であって予めその細胞についての浸透圧変化によるサイズ変化関数の決定されているもの又はその他の同等の非反応性細胞をそのまま、又は既知量の既知の浸透圧、好ましくはほぼ等張の浸透圧の希釈液で希釈してから使用する。後者の場合、較正用細胞を用い、浸透圧に対する細胞サイズ測定値の検量曲線を作成しておく。試験している細胞サンプル由来の媒体に懸濁したときのこれらの細胞（又はむしろ較正用細胞サンプル独立のアリコート）の細胞サイズ測定は、細胞外液の浸透圧の決定を可能にする。従って、たとえ浸透圧の変化する濃度勾配を設定できる自動装置を用いたときに細胞が最大サイズを有する濃度に至るまでの浸透圧範囲にわたって細胞サイズ測定を決定することが往々にして精度を高め、且つ単に好都合であるにしても、Ｏ−陰性細胞の単一の希釈において細胞サイズ測定の単一決定をするだけでよい。
希釈懸濁物及び対比細胞懸濁物又は較正用細胞懸濁物の一連のアリコートを一連の低い浸透圧環境にかけると、細胞サイズ測定のプロフィールが得られる。
細胞を一連の希釈浸透圧にかける任意の上記の態様において集めたデーターは、構築すべき希釈率に対する平均細胞サイズ測定値プロフィール又は個々の細胞もしくは一定数の細胞の細胞サイズ測定値の度数分布のプロフィールを可能にしうる。データーは細胞、細胞ベースで集めること及び結果を個々の細胞の集団の度数分布として報告することが、我々の同時係属出願第9526720.9号に記載の通り、好ましい。様々な一連の試験からのプロフィール（度数分布）、特に複数のプロフィール及び曲線の形状を互い同志対比させ、細胞外媒体の浸透圧又は浸透圧を決定すべきその他の希釈液の浸透圧を決定するための外挿を可能にすることができる。
この技術は媒体の浸透圧を、0.1又は更には0.01のmilliosmole付近まで値を言及できる精度にまで決定できうる。これは１又は２milliosmole付近までしか値を報告できない従来の浸透圧計よりも高精度である。慣用の浸透圧計を本方法に、工程５の測定のための張度の範囲を設定する前に媒体の浸透圧を評価するために利用してよい。
本発明の各観点において、出発細胞懸濁物は対応の細胞サイズ測定工程にかける前に二重希釈で希釈するのが好ましい。この二重希釈においては、各工程は少なくとも10容量、通常は少なくとも30容量、往々にして少なくとも50容量、例えば500又は1000容量以下で希釈する。総希釈率は4000〜25,000に通常範囲する。適当な希釈レベルは100容量で２回とする（即ち、全体で10,000）。
本発明の方法において、細胞懸濁物に対して行う細胞サイズ測定は細胞の少なくとも一のサイズパラメーターについてのデーターを供する。細胞の粒子サイズを決定するその他の方法、例えば光散乱の変化、又は光学もしくは音響もしくはその他の物理特性の変化を決定する方法を利用してよいが、測定は通常、好ましくはレストリクションを希釈懸濁物が通過する際の電場の変化を決定する電子式粒子サイジング技術を利用して決定する。センサー由来のシグナルは粒子のサイズ及び形状により主に影響され、その際の軌道、そして通常その数は我々の同日出願第9526652.4号記載の装置を利用してほぼ一定に保たれる。集めたデーターから、in vivo条件下での細胞のサイズ及び形状についての情報は上記の出願に記載の計算方法を利用して決定できる。
まとめると、本発明は真のin vivo細胞サイズを決定する三通りの方法を提供する。それらは：
１）血漿の浸透圧を決定し、そして同一の浸透圧のサンプル特異的バッファーの中でEPS測定（又はその他の細胞サイズ測定）を実施する。この血漿浸透圧は下記の通りにして決定し得る。
ａ）浸透圧計で血漿を測定する、
ｂ）全血液サンプルの浸透圧を測定し、そしてその浸透圧が粒子感受性であり、そして粒子（細胞）の数及びおよそのサイズがわかっているなら、浸透圧測定値に対するその効果を決定し、これにより補正された浸透圧が計算できる；
ｃ）浸透圧に寄与するほとんどの分子の濃度を測定する標準血液化学分析から浸透を決定する；
ｄ）下記（２）の技術を利用して浸透圧を決定する。
２）第二の方法においては、血漿の浸透圧は決定する必要がない。細胞懸濁物のアリコートを浸透圧／細胞サイズ曲線を作成するために試験し、そして細胞懸濁物の類似のアリコートを患者自身の血漿で部分的に又は全体的に希釈し、そして標準のサイジング技術を利用して（好ましくは同じ粒子サイジング装置を利用して）試験する。この第二試験由来のサイズ測定値を第一試験曲線と比較すると、in vivo血漿浸透圧が決定できる。この決定から、浸透圧補正サイズ測定が実現され、それは我々の同日出願第9526649.0号記載の技術により更に改善されうる。
２．ｂ）前段落に記載の方法は浸透圧／細胞サイズ曲線に載っている血漿及び標準サイズ測定のための一定希釈率を利用することにより、又は全血漿サンプルの代わりに希釈血漿を利用することにより改良されうる。更に、全曲線を描く必要はなく、そしてその一部、又は曲線上の一点のみが、曲線の関数が決定されていることを条件に、適正なサイズを決定するのに十分でありうる。
３）浸透圧補正サイズはそれ自体の血漿の中に懸濁された細胞の単一測定より完全に決定されうる。
【図面の簡単な説明】
添付図面は実施例の結果を示す。詳しくは、
図１は高張浸透圧から細胞が破裂する浸透圧を下まわる浸透圧での試験下での細胞のサンプルについての浸透圧に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す度数分布を示す。
図２は図１に示す結果に由来する平均細胞サイズ測定値を示す。
図３及び４は高張浸透圧から細胞が破裂する浸透圧を下まわる浸透圧での希釈率に対する較正用赤血球細胞のサンプルの度数分布及び平均細胞サイズ測定のプロフィールのそれぞれである検量曲線を示し、そして試験下の細胞のサンプルの既知量の細胞外媒体を含む媒体中に懸濁された較正用細胞の細胞サイズ測定値の決定の表示を含む。
詳細な説明
本発明を下記の実施例で更に説明する。
実施例１−試験する細胞懸濁物
血液サンプルの一部（サンプル容量0.1〜２μｌ）を290mOsm／kgの100容量（このサンプルの一部の容量当り）の緩衝食塩水により２回希釈し、200〜400mOsm／kgの範囲となるようにした。希釈懸濁物の連続アリコートを徐々に増大していく量の低張希釈に委ねた。本例においては、細胞を400mOsm／kg〜０mOsm／kg（又は２ｋΩ〜18.3ＭΩの当量抵抗値）の範囲に委ねるためこの低張希釈液は脱イオン水とする。更に希釈した懸濁物を電子式粒子サイズ吸光装置の測定チャンバーに通した（我々の同日出願第9526652.4号に記載）。開口部を通過する流速は毎秒約5000細胞とする（懸濁物、それ故細胞の約10％）。懸濁物の残り90％は廃液した。（別の態様において、例えばオリジナルのサンプルが極端に少ないとき、細胞の全て又は実質的に全てを細胞サイズ測定に委ね、そして開口部に通すことが所望されうる。）
開口部を通過する個々の細胞についての電気パルスは検出する各パルスの最大電圧を測定するアナログピーク検出回路により測定する。これはアナログパルスをデジタルデーターシグナルに変換させる。この検出器は細胞の開口部の通過の約10倍、即ち毎秒約５×10⁴回作動する。細胞電圧のデジタル変換は細胞の開口部の通過より早く実行される。これらのデーターはリアルタイムで分析及び表示される及び／又は対比分析のために保存される。他方、パルスは非常に高速なアナログ・デジタル変換器を利用して連続的にデジタル化してよく（１＜μＳの変換時間）、細胞が開口部を通過する際のデジタル値の対比によるピーク検出の必要性を排除する。
これらのデーターから、各細胞についての細胞サイズ測定パラメーターについての値が決定される。これらの値についての度数分布を懸濁液の浸透圧に対してプロットし、これは浸透圧値であってそれを下まわると細胞が反応してその最大サイズに達し、そして破裂する値に至るまでの全ての浸透圧値に関し、観察下の（又は試験中に測定されうる）アリコートのための緩衝食塩水及び水の量から計算する。度数分布を図１に示す。図２は図１からのデーターに関する浸透圧に対する平均細胞サイズ値を示す。
曲線の最大値は細胞がその最大細胞サイズ（cm_max）となる点である。この希釈率を超えると、又は浸透圧Ｏ_bを下まわると、細胞は破裂する。等張浸透圧では、細胞は細胞サイズ測定値cm_iを有する。
試験下のオリジナルの細胞懸濁物の細胞外媒体はバッファーの浸透圧、即ち高張Ｏ_yより高い浸透圧を有する。in vivoでの細胞の真の細胞サイズ測定値cm_yは血漿浸透圧で決定されたものよりも小さいであろう。同様に、オリジナル懸濁物の細胞外媒体は平均値（Ｏ_o）より低い。真のin vivo細胞サイズ決定（cm_o）は血漿浸透圧で決定した値よりも大きいであろう。
実施例２−検量曲線
Ｏ−陰性赤血球のサンプルを実施例１の試験下での細胞と同じ一般方法にかけ、図３に示す度数分布プロフィールを構築する。
実施例１で用いた血液サンプルの第二部を遠心分離により分離して細胞を細胞外液から除去した。次いで細胞外液を９倍容量の実施例１で用いた緩衝食塩水で希釈し、細胞サンプルの第一部を希釈する。この媒体を較正用Ｏ−陰性赤血球の一部を希釈するのに用い、そしてこれらの細胞の細胞サイズ測定値はcm_sとして決定された。この細胞サイズ測定値を有する細胞の浸透圧についての値を決定し、図４でＯ_sで示す。この値から、細胞外媒体の浸透圧を計算できる。この値は、図３及び４に示すプロフィールからサンプルの細胞についてのin vivo細胞サイズ測定値を決定するのに利用できる。
類似の結果が、ピーク電圧以外の電圧値が測定されるとき、例えば複数の間隔において各パルスの高さを決定するとき、及び／又は電圧／時間曲線下面積を測定するとき、達成されうる。このデーターは一般にデーターを細胞間ベースで集めるときにデジタルへと変換する。既知の細胞数の電圧を合計することにより平均細胞サイズのみを測定することが可能でありうるが、かかる技術の精度は本発明の方法において適正な結果を得るほどに十分ではないことがある。

Claims (16)

1. 細胞及び細胞外液血漿を含んで成る細胞懸濁物についての細胞サイズ測定方法であって、
   １）細胞懸濁物の細胞外液血漿の浸透圧を決定し；
   ２）細胞懸濁物の一部を上記決定された浸透圧を有する希釈液で希釈して、希釈懸濁物を形成し；そして
   ３）工程２で形成された希釈懸濁物中の細胞を希釈懸濁物の中で懸濁したまま細胞サイズ測定にかける；
   ことを含んで成り、ここで細胞外液血漿の浸透圧は：
   ｉ）細胞懸濁物の一部を浸透圧が既知の少なくとも一の水性希釈液に希釈し；
   ii）細胞の細胞サイズを上記浸透圧が既知の希釈液の中で測定し；
   iii）細胞懸濁物の細胞に関する高張から低張に至る浸透圧変化に基づく細胞サイズ変化の関数を決定し；そして
   iv）工程iii）で決定された関数、工程ii）で決定された細胞サイズ、及び工程ｉ）で用いた希釈液の浸透圧を利用し、工程ｉ）で用いた血漿の浸透圧を計算する；
   ことにより決定する；方法。
2. 工程iii）における関数を：
   ａ）出発細胞懸濁物の一部を既知の高張浸透圧の水性希釈液で希釈して高張希釈懸濁物を形成し；
   ｂ）高張希釈懸濁物中の細胞の細胞サイズを測定し；
   ｃ）細胞懸濁物の更なる部分を既知の低張浸透圧の水性希釈液で希釈して低張希釈懸濁物を形成し；
   ｄ）低張希釈懸濁物中の細胞の細胞サイズを測定し；そして
   ｅ）工程ｂ及びｄの高張及び低張希釈細胞懸濁物について得られた細胞サイズ測定値並びに低張及び高張希釈液の浸透圧値を利用し、前記関数を計算する；
   工程を実施することにより決定する、請求項１記載の方法。
3. 工程ｃ及びｄを異なる既知の低張浸透圧の希釈液で実施し、そして工程ａ及びｂを異なる既知の高張浸透圧の希釈液で実施する、請求項２記載の方法。
4. 細胞サイズ測定を細胞懸濁物の少なくとも２つの更なる部を少なくとも２通りの既知の低張浸透圧の希釈液で希釈し、そしてこの希釈した懸濁物それぞれにおける細胞を細胞サイズ測定にかけることにより実施する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 最大細胞サイズを決定する、請求項４記載の方法。
6. 最大細胞サイズが事前決定されており、そして未知の浸透圧の希釈液の浸透圧を決定するため、既知の浸透圧の希釈液の存在下で前記細胞サイズ測定値から構築した浸透圧に対する細胞サイズの検量曲線を、細胞懸濁物の更なる部分を既知量の未知の浸透圧の前記希釈液及び既知量の既知の浸透圧の希釈液により希釈し、そしてこれにより供される懸濁物中の細胞の細胞サイズを測定することにより利用する、請求項４記載の方法。
7. 前記希釈液が、細胞がその最大細胞サイズへと増大する浸透圧又はそれより低い浸透圧を有する少なくとも一の希釈液を含んで成る、請求項４記載の方法。
8. 前記細胞が血液細胞である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 細胞及び細胞外液血漿を含んで成る細胞懸濁物についての細胞サイズ測定方法であって、
   １）細胞懸濁物の細胞外液血漿の浸透圧を決定し；
   ２）細胞懸濁物の一部を上記決定された浸透圧を有する希釈液で希釈して、希釈懸濁物を形成し；そして
   ３）工程２で形成された希釈懸濁物中の細胞を希釈懸濁物の中で懸濁したまま細胞サイズ測定にかけ、ここで工程２で用いた希釈液は出発細胞懸濁物から分離した血漿より構成される；
   ことを含んで成る方法。
10. 水性液体の浸透圧を決定するための方法であって、既知量の液体を、任意的に既知量の既知の浸透圧の対照希釈液と混合して周囲媒体の浸透圧の変化によるサイズ変化の所定の依存性を有する細胞の一部を希釈し、この細胞希釈部を細胞サイズ測定にかけ、そして得られる細胞サイズ測定値を水性液体の浸透圧を計算するために利用する、方法。
11. 前記水性液体が血漿である、請求項10記載の方法。
12. 前記細胞がＯ−陰性血液細胞である、請求項10又は11記載の方法。
13. 細胞の複数の部を既知量の前記水性液体と既知量の既知の低張浸透圧の低張希釈液とをそれぞれが含む複数の部の増大する低張浸透圧対照希釈液に懸濁し、そして各希釈懸濁物についての細胞サイズ測定を実施し、そして水性液体の浸透圧の計算のために利用する、請求項10〜12のいずれか１項記載の方法。
14. 前記希釈懸濁物の少なくとも一つが細胞をその最大サイズへと増大させる浸透圧又はそれより低い浸透圧を有する、請求項13記載の方法。
15. 細胞及び細胞外液血漿を含んで成る細胞懸濁物についての細胞サイズ測定方法であって、当該細胞懸濁物を下記の工程にかける方法：
    １）細胞懸濁物の一部を希釈液で希釈して希釈懸濁物を形成し、ここで該希釈液は出発懸濁物から分離した血漿より構成され；そして
    ２）工程１で形成した希釈懸濁物中の細胞を、前記希釈懸濁物において懸濁したまま細胞サイズ測定にかける。
16. 細胞及び細胞外液懸濁物を含んで成る細胞懸濁物の浸透圧を決定する方法であって：
    １）出発細胞懸濁物から分離した血漿より構成される希釈液を用いて細胞懸濁物を希釈して希釈懸濁物を形成し；
    ２）工程１で形成された希釈懸濁物における細胞を複数の異なる濃度において細胞サイズ測定にかけ；
    ３）既知の浸透圧の対照希釈液を利用して細胞懸濁物の更なる部分を希釈して、希釈懸濁物を形成し；
    ４）工程３で形成した希釈懸濁物における細胞を複数の既知の濃度において細胞サイズ測定にかけ；そして
    ５）工程２及び４で得られた細胞サイズ測定値並びに工程３の対照希釈液の既知の浸透圧を利用して細胞懸濁物の細胞外液血漿の浸透圧を計算する；
    ことを含んで成り、ここで工程２及び４の両方において、細胞が最大細胞サイズに到達するように一連の異なる濃度にわたり希釈し、そして血漿の浸透圧は工程２及び４のそれぞれにおける最大細胞サイズに到達する濃度の変化と対照希釈液の既知の浸透圧とから計算する、方法。

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