JP4084099B2

JP4084099B2 - Method for producing N-acetylheparosan fraction

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Publication number: JP4084099B2
Application number: JP2002180538A
Authority: JP
Inventors: 博菊池; 登紀子坂井; 定雄館林; 喜義鈴木; 卓嗣金子
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: JP2004018840A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液等の未精製または粗精製のＮ−アセチルヘパロサン溶液から得られる高純度で均一な、すなわち、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサン、該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべてD体を示すものとする。
Ｎ−アセチルヘパロサンはβ-Dグルクロニル-1,4-α-Ｎ−アセチル-Ｄグルコサミニル(1,4)）の二糖単位の繰り返し構造を特徴とするグリコサミノグリカンであり、大腸菌のある種の細菌によって産生され、抗原Ｋ５と呼ばれるきょう膜多糖としても知られている(Eur. J. Chem 1981,vol116,359-364)。この多糖はヘパリンの前駆物質であるとされており、Ｎ−アセチルヘパロサンが一部脱Ｎ−アセチル化された後に硫酸化され、グルクロン酸がイズロン酸に変換されたのち、イズロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンの特定の部分がランダムに硫酸化されることによりヘパリンとなる。ヘパリンは有用な抗凝固作用及び抗血栓作用をもち医薬品として用いられている。しかしながら、一般的には原料をウシやブタなどの動物の臓器に頼らざるを得ないため病原性ウイルスやプリオンタンパク質の汚染の危険性を避けがたいという難点がある。
【０００３】
動物臓器に頼らないヘパリンあるいはヘパリン類似物質は上記の通り有用性が高く、その工業的な製造について鋭意研究がなされている。例えば大腸菌K５の培養液よりＮ−アセチルヘパロサンを得たのち化学的に硫酸化を施し、抗凝固活性を有する擬似ヘパリンを作成する試みがなされている（特開平5-271305）。
【０００４】
外にも大腸菌Ｋ５の培養液からＮ−アセチルヘパロサンを精製する試みは種々なされている。Vannらは培養液中にセタボロン（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド hexadecyltrimethylammonium bromide）を加えＮ−アセチルヘパロサンを回収し、続いて塩化カルシウム溶液中でＮ−アセチルヘパロサンを抽出し、フェノール抽出を繰り返して精製する方法を報告している(Eur. J. Biochem 1981)。この方法により50Lの培養液から1〜3グラムのＮ−アセチルヘパロサンが精製される(Methods in Enzymology, 1994)。
【０００５】
又、Manzoniらは大腸菌K５の培養液を限外ろ過装置により濃縮し、エタノールを添加することによりＮ−アセチルヘパロサンを沈殿せしめ、プロナーゼで消化した後、透析とエタノールを添加することによる沈殿工程を繰り返して精製する方法を報告している(J. Bioactive compatible polymers 1996)。更に、彼らは培地組成と培養装置の改良をおこない1Lの培養液から350-400mgのＮ−アセチルヘパロサンの製造を可能にした。このＮ−アセチルヘパロサンは不純物であるタンパク質を12-16%含有していると報告されている(Biotechnology letters 2000)。これら従来の精製例の中には、大腸菌を不活性化させる目的で熱処理を行っている場合もあるが、本発明のようなＮ−アセチルヘパロサンの回収率を増加させる意図で熱処理を行った例はない。
【０００６】
従来の方法では、培養液を精製した後、種々の複雑な工程によってのみＮ−アセチルヘパロサンを精製するより他になかった。精製しうるＮ−アセチルヘパロサンの量は培養液１Ｌあたり350-400mg程度であるが、その精製品中にはタンパク質が12-16%と比較的大量に含まれ、例えば医薬品のような高純度を要求される用途には適さない。また、従来報告されているＮ−アセチルヘパロサンの分子量分布は特開平5-271305あるいはJ. Bioactive compatible polymers(1996) vol.11 p301に示されるごとく単分散ではなく、複数のピークを有する多分散の様相を呈している。分子量がある一定の範囲に限定されることはＮ−アセチルヘパロサンの物性をより一定に保てるという利点があり、また期待される生理活性がより均一のものとなる可能性を強める。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサンおよび該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記実状に鑑み鋭意検討を重ねた結果、比較的簡便な手法でもって分子量分散度の低いＮ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を回収率よく精製することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を有する溶液からＮ−アセチルヘパロサン画分を製造する方法であって、該溶液に対してアルカリ処理した後、中和処理し、有機酸塩の存在下でアルコール分画を行って画分を得る、Ｎ−アセチルヘパロサン画分の製造方法。
〔２〕Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液が、Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液に由来する溶液である、〔１〕の製造方法。
〔３〕Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌がＫ５菌株である、〔２〕の製造方法。
〔４〕Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液に由来する溶液が、該大腸菌の培養液に対して８０〜１２１℃の熱処理を行った後、固液分離を行って得られる上清である、〔２〕と〔３〕の製造方法。
〔５〕Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液に由来する溶液が、該大腸菌の培養液に対して８０〜１２１℃の熱処理を行った後、固液分離を行って得られる上清において、さらに、Ｎ−アセチルヘパロサン画分と低分子成分を分離する膜処理が施されることにより、該低分子成分が除去された溶液である、〔２〕〜〔４〕の製造方法。
〔６〕熱処理の温度が９０〜１２１℃である、〔４〕と〔５〕の製造方法。
〔７〕有機酸塩が酢酸ナトリウムである、〔１〕〜〔６〕の製造方法。
〔８〕酢酸ナトリウムの溶液における終濃度が、５〜１５％（重量／容量）である、〔７〕の製造方法。
〔９〕アルコールがエタノールである、〔１〕〜〔８〕の製造方法。
〔１０〕エタノールの溶液における終濃度が、３０〜５０％（容量／容量）である、〔９〕の製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン
Ｎ−アセチルヘパロサンは天然の多糖類であり、他の多糖類と同様、一定範囲の分子量を有する分子の集合体である。このため、その重量平均分子量の測定は、多糖類の分子量測定の通常の方法、例えば、ゲルろ過、光散乱、立体排除クロマトグラフィー、極限粘度、沈降平衡などの方法を用いて行うことができる。本発明のＮ−アセチルヘパロサンの重量平均分子量は、後述する高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィー法で測定を行った場合、３５、０００〜４５，０００の範囲を示す。
【００１１】
以下、本明細書中において、重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に、高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて測定を行った場合の分子量（Biochem. Biophys. Acta., 1117, 60-70, 1992）を表す。
また、後述する多角度光散乱法で測定した場合、重量平均分子量の範囲は、50,000〜70,000である。
【００１２】
本発明のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を示す方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー法による重量平均分子量（Ｍｗ）を同様の方法で測定した数平均分子量（Ｍｎ）で割る（重量平均分子量／数平均分子量；Ｍｗ／Ｍｎ）方法、積分値を用いる方法などが挙げられる。
【００１３】
本発明のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度は、重量平均分子量／数平均分子量で計算した場合、１．１〜１．９である。
尚、数平均分子量はゲルろ過クロマトグラフィ法による重量平均分子量の測定と同様の方法を用いて行い、得られた数値をデータ解析ソフトウェアにて解析を行うことにより得られる。
【００１４】
（２）Ｎ−アセチルヘパロサン画分
本発明のＮ−アセチルヘパロサン画分は、（１）に記載した特定の平均分子量および特定の分子量分散度を示す本発明のＮ−アセチルヘパロサンを含む高純度かつ均一な調製物であり、核酸含量は０．１％以下、かつ、遊離アミン含量は０．０３μＭ／ｍｇ以下である調製物である。
【００１５】
核酸含量の測定は、紫外および可視部の分光光度測定法やエチジウムブロマイド（EtBr）比色定量法などを用いて行うことができるが、EtBr比色定量法を用いた測定法によることが好ましい。遊離アミンの定量はYoshizawaらに報告された2,4,6-TNBS方法（Biochemica et Biophysica Acta.(1967)141, 358-365）を用いて測定することができる。
【００１６】
（３）Ｎ−アセチルヘパロサン画分の製造法
本発明の特定の物性を有するＮ−アセチルヘパロサン画分は、下記段階Ａ〜Ｅによって製造することができる。
（段階Ａ）大腸菌の培養
Ｎ−アセチルヘパロサン画分を調製するには、例えばＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌（Escherichia coli）を培養し、培養物から精製する方法によることができる。本発明で用いるＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌（Escherichia coli）は特に限定されるものではないが、例えば、Ｋ５菌株もしくは該菌株と実質的に同一の性質を有する菌株などが挙げられ、Ｋ５菌株としては、当業者が容易に入手可能な標準菌株を使用することができる。
【００１７】
例えば、E.coli. SEBR3282株（CNCM No.I-1013）、Bi626-42株；012:K5(L):NM）（ATCC （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）No.23508）、O10:K5(L):H4（ATCC No. 23506）などが挙げられ、E.coli.O10:K5(L):H4（ATCC No.23506）を用いることが特に好ましい。
【００１８】
また、培養に用いる培地は、大腸菌の培養に適した炭素源、窒素源、その他消泡剤等を含むものであればよく、特にグリセリンに富んだ培地を使用することが好ましい。
【００１９】
大腸菌の培養条件は培養液中にＮ−アセチルヘパロサンが蓄積される条件であれば特に限定されないが、通常、１５〜４０℃で１５〜２４時間、好ましくは３７℃、１５時間の条件が挙げられる。
【００２０】
（段階Ｂ）熱処理および固液分離
段階Ａで得られた培養液をそのまま熱処理し、次いで固液分離を行う。この熱処理は、Ｎ−アセチルヘパロサンが分解せず、収率向上に寄与する方法および温度条件で行う限り限定されないが、通常、80〜200℃の温度条件で加熱すればよく、例えば、オートクレーブで行うことがで出来る。オートクレーブで熱処理する場合、熱処理条件は、90-121℃で5-30分間が好ましく、121℃で5-20分間がより好ましい。この熱処理によって培養液からより多くのＮ−アセチルヘパロサン画分を精製することが可能となる。
【００２１】
熱処理後、通常は常温となるまで冷却または放冷し、固液分離処理を行う。固液分離は菌体等の固形物を除去できる方法であれば限定されず、遠心分離によっても良いし、適当なろ過助剤を用いたろ過に依っても良い。
【００２２】
（段階Ｃ）膜処理
培養液に含まれる不必要なアミノ酸や塩類などの低分子成分を除去するため、膜処理を行う。本発明においては、膜処理はＮ−アセチルヘパロサン画分と培養液中の低分子成分を分離できる膜および処理方法を用いて行えばよく、例えば、限外ろ過により行うことができ、分子量10000カットの膜を用いた限外ろ過が好ましい。場合によっては市販のセルロース製等の透析チューブによる透析によっても同様の効果を得られる。
【００２３】
（段階Ｄ）アルカリ処理
Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液等に段階Ａ〜Ｃの処理を施した粗精製のＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液などのＮ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液をアルカリ溶液に接触させる。この処理によりＮ−アセチルヘパロサン画分の純度が格段に上昇する。
【００２４】
アルカリ溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられ、これらをＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液に添加することにより溶液のpHを13以上にする。この中でも、水酸化ナトリウム溶液を用いることが特に好ましい。
【００２５】
アルカリ溶液の濃度は終濃度0.1N以上が好ましく、0.5Nがより好ましい。又、アルカリ処理する際に40℃になるように加熱しかつ、十分に撹拌されることが好ましい。又、pH13以上の強塩基性条件下ではβエルミネーション反応によってＮ−アセチルヘパロサン構造が破壊されるおそれがあるため、反応時間は１時間以下とすることが好ましい。１時間以上の反応を行っても得られるＮ−アセチルヘパロサン画分の純度に変化はないが、収率が低下する恐れがある。
【００２６】
このように処理されたＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液は速やかに塩酸などの酸溶液で中和する。ここで、難溶解性の不純物が生じる場合には、ろ過、遠心等の固液分離手段によって不純物の除去を行うか、もしくはラジオライト（昭和化学工業（株））などの珪藻土をろ過助剤とする加圧または減圧ろ過を実施する。
【００２７】
（段階Ｅ）アルコール分画
上記段階Ｄで得られた溶液について、アルコール分画を行いタンパク質、核酸等の不純物を除去する。アルコール分画は、多糖類の分画法として公知の方法、すなわち、一定濃度の塩を添加溶解した後、その塩を含む溶液を撹拌しつつアルコールを徐々に添加することによって行われる。
【００２８】
この際添加する塩は有機酸塩であれば特に限定されないが、とりわけ酢酸ナトリウムが好ましい。特に、酢酸ナトリウムの場合、溶液の終濃度が5〜15%（重量/容量%）となるように添加することが好ましい。これよりも低い塩濃度では不純物の除去程度が低下する傾向にある。
【００２９】
又、使用するアルコールはエタノール、メタノール、イソアミルアルコールなどが挙げられるが、特にエタノールが好ましい。さらに、エタノールを用いる場合、溶液の終濃度が30〜50%（容量/容量%）となるように添加することが好ましく、30%が更に好ましい。これ以上のエタノールを添加すると、回収量は多くなるが分子量分散度並びに蛋白質含有量、核酸含有量が高くなる傾向にある。
エタノール分画後、遠心分離等の固液分離手段により上清と沈殿部分を分離し、沈殿部分を適当量の水に溶解して脱塩を行う。
【００３０】
大量処理に適した脱塩方法としては、適当な濃度のアルコールでの分画、すなわち終濃60%-80%になるように前述の沈殿溶解液にアルコールを添加し、遠心分離して上清を除去する工程を繰り返す方法が挙げられる。通常この操作を２〜３回繰り返すことにより、十分な脱塩効果が得られる。
しかしながら最終精製品の用途に応じて透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法適宜組み合わせて脱塩を行うこともできる。
【００３１】
尚、上述の個々の工程は上述の順序で行うことがもっとも好ましいが、目的に応じて順序を入れ替えることも可能である。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例1］
＜大腸菌K5菌株の培養＞
菌株は、E.coli serotype 010:K5(L):H4（ATCC No.23506）を用い、下記の条件にて培養を行った。
【００３３】
カザミノ酸2%、酵母エキス0.5%、グルコース0.2%、アデカノールLG-109（商品名；旭電化工業（株））100ppmになるように水道水3Lに溶解し121℃、20分間、1.2気圧の滅菌を行い、培地を調製した。この培地に20%グリセロール保存菌液を1ml植え付け通気量1vvm 、撹拌速度500rpm、37℃で15時間培養した。
【００３４】
＜熱処理工程＞
15時間培養後、培養液を121℃、15分、1.2気圧でオートクレーブし、常温になるまで自然放冷させ、10000×g、４℃で35分間遠心分離し、熱処理培養上清約2.7Lを得た。
【００３５】
＜限外ろ過工程＞
熱処理培養上清を分画分子量10000のスパイラルフィルターカートリッジ（日本ミリポア（株））に通液して限外ろ過し、更に上清の10倍容の水を追加しながら限外ろ過を継続し、熱処理培養上清の濃縮並びに低分子画分の除去を行った。
【００３６】
＜アルカリ処理工程＞
培養上清６ロット分(約16L)を前記工程で処理して約900mLに濃縮したものに39分の１容量の20N 水酸化ナトリウム水溶液を加え、40℃に保温しつつ撹拌を続けた。１時間後濃塩酸で中和し、不溶性の不純物をラジオライト#500（昭和化学工業（株））を用いてろ過してろ液を回収した。
【００３７】
＜エタノール分画工程＞
ろ液に終濃度15%となるように酢酸ナトリウム（特級；和光純薬工業（株））を溶解した。この溶液を撹拌しつつ、終濃度30%になるようにエタノール（特級；和光純薬工業（株））を少量ずつ滴下し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分の沈殿を得た。
滴下終了後から更に5分間撹拌した後、5000×gで15分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し、沈殿を得た。
【００３８】
＜脱塩工程＞
沈殿を少量の水に溶解し、終濃度60%になるようにエタノールを撹拌しながら加えた。更に5分間撹拌した後、5000×gで15分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分の沈殿を得た。この作業を更にもう一回繰り返した。
【００３９】
更に終濃度80%になるようにエタノールを撹拌しながら加えた。更に5分間撹拌した後、5000×gで15分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し沈殿を得た。
沈殿を適当量の水に溶解し、凍結乾燥に付し、4ｇのＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥品を得た。
【００４０】
［実施例２］
〈更に高純度のＮ−アセチルヘパロサン画分を得るための工程〉
痕跡量混入しているおそれのある金属イオン等の遊離イオンを除去するため、実施例１で得たＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥品を以下の工程によって更に精製した。
【００４１】
すなわち、陽イオン交換樹脂ダイヤイオンPK220および陰イオン交換樹脂ダイヤイオンSA-12A（いずれも三菱化学（株））各30mlをそれぞれ2N塩酸および2N水酸化ナトリウム水溶液で再生し、十分量の純水で洗浄した。
【００４２】
次いで、実施例１で得たＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥標品を1%になるように純水で溶解し、上記の陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂のカラムに、この順に連続して流速10ml/minで通液し、通過後の溶液を速やかに水酸化ナトリウム水溶液で中和し、0.22μmのフィルターでろ過し、凍結乾燥した。高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分の回収率は96%であった。
【００４３】
［実施例３］
〈Ｎ−アセチルヘパロサンの物性試験〉
実施例２で得られた高純度のＮ−アセチルヘパロサン画分及び該画分中に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの物性を以下の方法で測定した。
【００４４】
（ゲルろ過クロマトグラフィーによる重量平均分子量および数平均分子量の測定）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる重量平均分子量の測定は、Araiらの方法（Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992）に準拠して測定した。分子量が既知のコンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量39100、18000、8050；いずれも生化学工業（株））およびヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量104000；生化学工業（株））を標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出時間により重量平均分子量を決定した。
【００４５】
カラムは、TSK gel G4000PW_XL、G3000PW_XLおよびG2500PW_XL（各φ7.8×300mm、東ソー（株））を連結したものを用いた。溶媒は0.2mol/L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6ml/分とし、検出器は示差屈折率検出器（RI-8020、東ソー（株））を用いた。その結果得られたクロマトグラフィーのパターンを図1に示す。得られた数値をデータ解析ソフトウェア（GPC-8020 東ソー（株））で解析した結果、ゲルろ過クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量（Mw）は44,710、また、数平均分子量（Mn）は36,714であった。
【００４６】
（分子量分散度の計算）
図1の結果をもとにデータ解析ソフトウェア（GPC-8020；東ソー（株））で解析した結果、分子量分散度(重量平均分子量／数平均分子量（Mw/Mn）)は1.212であった。
【００４７】
（多角度光散乱による重量平均分子量測定）
多角度光散乱法による分子量は、検出器に示差屈折率検出器（Shodex RI-71、昭和電工（株））及び多角度光散乱検出器（WyattＤDAWN EOS；Wyatt Technology Corporation）を使用し、ASTRAソフトウエア（Wyatt Technology Corporation）のジムプロットモジュールを用いて解析を行い決定した。
【００４８】
カラムはSB-806HQ（φ8×300ｍｍ；昭和電工（株））2本を連結し、溶媒は0.2mol/L硝酸ナトリウム溶液を用いて、流速は0.6ml/分とした。データ取り込み間隔は１秒間に二回とした。
【００４９】
光散乱検出器の測定電圧値(LS)は
(LS)＝（dn/dc）² X 濃度Ｘ重量平均分子量Ｘ K_LS
→重量平均分子量＝(LS) / ｛（dn/dc）² X 濃度Ｘ K_LS｝
dn/dc=試料１ｇあたりの屈折率増加分(mgl/g)
K_LS=装置定数（トルエンにより校正）
【００５０】
濃度は示差屈折率検出器の測定電圧値(RI)より以下の式により求めた。
(RI)= (dn/dc) X 濃度 X K_RI
→濃度= (RI) / ｛(dn/dc) X K_RI｝
ここでK_RIは示差屈折率検出器の装置定数でプルランにより校正した。
【００５１】
Ｎ−アセチルヘパロサンのdn/dcはヒアルロン酸により求められた定数0.159ml/gを用いて計算した。
その結果、多角度光散乱法によって測定したＮ−アセチルヘパロサンの重量平均分子量は約63000であった。
【００５２】
（核磁気共鳴(NMR)スペクトルによる構造解析）
Ｎ−アセチルヘパロサンのプロトンおよび^１３C炭素NMRスペクトルの結果を図2および図3に示す。これらの結果は実施例２で得られた高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンがＮ−アセチルヘパロサン構造を有することを強く指示するものであった。
【００５３】
（セルロースアセテート膜電気泳動）
セルロースアセテート膜電気泳動をHataらの方法(Anal. Biochem 45,462-468 (1972) )に準じて行い、Ｎ−アセチルヘパロサンの純度を確認した。
【００５４】
すなわち、セルロースアセテート膜（富士写真フィルム（株））に実施例２で得られたＮ−アセチルヘパロサン画分10mg/ml水溶液1μLを1cmの長さの線上に塗布し、0.1Mピリジン−蟻酸水溶液(pH3)を泳動用緩衝液として電流0.5mA/cmで30分間泳動した。泳動後、セルロースアセテート膜を2%酢酸を含む0.5%アルシアンブルー水溶液で１５分間染色し、2%酢酸で脱色した。
このようにして得られたＮ−アセチルヘパロサンのバンドの位置はヒアルロン酸（生化学工業（株））の泳動位置とほぼ同一かつ単一バンドであった。
【００５５】
（カルバゾール定量）
D-グルクロノラクトン 20μg/ml水溶液を標準品として使用し、カルバゾール硫酸法（Bitter-Muir法，T. Bitter, H. Muir, Anal. Biochem. J, 4, 330-334 (1962)）でウロン酸含量を測定した。Ｎ−アセチルヘパロサンの呈色値は同量のヒアルロン酸の呈色値を100％としたとき89.5％であった。
【００５６】
（核酸）
ＥｔＢｒ比色定量法によって実施例２の高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分の核酸含量を測定したところ、０．０９％であった。
【００５７】
（タンパク質定量）
ウシ血清アルブミンを標準物としたLowry法（Lowry J.ら, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)）によって実施例２のＮ−アセチルヘパロサン画分中のタンパク質の含量を測定したところ、2.38％であった。
【００５８】
（遊離アミンの定量）
遊離アミンの定量はYoshizawaらにより報告された2,4,6-TNBS法(Biochemica et Biophysica Acta. (1967)141, 358-365 )により行った。標準品としてＮ−アセチルD-グルコサミンを用いた。実施例２のＮ−アセチルヘパロサン画分中に含まれる遊離アミンのモル数は0.026μM/mgであった。
【００５９】
［実施例４］
〈熱処理を行った場合と行わなかった場合の培養上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量〉
熱処理を行った場合と行わなかった場合の培養上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量を比色定量法により比較した。
【００６０】
すなわち培養液を４等分し、121℃ 5分、90℃ 30分、80℃ 30分の熱処理を行ったもの、および熱処理をしなかったものを同様に遠心分離して培養上清を得た。これら培養上清中のヘパロサン量をHomer K. A. ら（Analytical Biochemistry 214,435-441 1993）の方法に準じて比色定量した。標準品は実施例２の高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分を用いた。
結果を以下の表1に示す。
【００６１】
【表１】

【００６２】
熱処理、特に121℃ 5分間の熱処理を行った場合において、多くのＮ−アセチルヘパロサン画分を培養上清中に回収できることが確認された。該上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量は熱処理しない場合の約1.7倍であった。
【００６３】
［実施例５］
〈アルカリ処理を行った場合と行わなかった場合におけるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較〉
アルカリ処理を行った場合と行わなかった場合におけるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較は以下の様におこなった。すなわち、大腸菌K5菌株を実施例１に準じて培養し、その培養液を121℃ 5分間熱処理した後、遠心分離し熱処理培養上清を得、次いで分子量１万カットの膜を用いた限外ろ過に供し、低分子画分を除去した。この溶液を２等分し、片方には最終濃度0.5Nになるように20N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、40℃で一時間攪拌した。１時間後室温に冷却し塩酸で中和した。
【００６４】
次に、培養液量に対し15％重量の酢酸ナトリウム（和光純薬（株））を溶解した後４等分し、それぞれに終濃度30％、40％、50％、60％になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿せしめた（表２中、2-A、2-B、2-C、2-Dに対応）。
【００６５】
また、２等分したもう一方についてはアルカリ処理は行わず、上記と同様に培養液量に対し15%重量の酢酸ナトリウムを溶解し、同様の操作を行い、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿せしめた（表２中、1-A、1-B、1-C、1-Dに対応）。
【００６６】
沈殿物を回収し適当量の水に溶解し、上述の分子量分布を求める際と同条件で高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を調べた。結果を図４に示す。
尚、それぞれのサンプルの名称は表２の通りである。
【００６７】
【表２】

【００６８】
0.5Nの水酸化ナトリウムに培養液を接触させるいわゆる、アルカリ処理を実施した後、15％重量/容量の酢酸ナトリウムで中和し、終濃度30%のエタノールを添加して回収した沈殿物(2-A)は、単分散の示差屈折率を与えた。
【００６９】
2-Aをへパリナーゼ（生化学工業（株））で分解し、同様に液体クロマトグラフィー（TSLgel G4000PW_XL、G3000PW_XLおよびG2500PW_XL（各φ7.8×300mm、東ソー（株））を連結したもの）で分析したところ約27分から33分にかけてのピークが消失したことから2-Aの本態はヘパリン骨格を有する物質であることが証明された。
【００７０】
［実施例６］
〈アルカリ処理条件ならびに分画条件によるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の変化〉
アルカリ処理条件ならびに分画条件によるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を比較するために以下の実験を行った。
【００７１】
実施例１に準じて得た大腸菌K5菌株の培養液を121℃ 5分間熱処理した後、遠心分離し培養上清を得た。この培養上清を実施例１に準じて分子量１万カットの限外ろ過に供し、低分子画分を除去した。この溶液を３画分に分け、うち２画分には最終濃度0.5N、0.1Nになるように20N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、残り１画分には何も添加せずに40℃で一時間攪拌した。
【００７２】
１時間後室温に冷却し、水酸化ナトリウムを添加した画分については塩酸で中和した。各画分をさらに２つに分割し、0.4％(重量/容量)の塩化ナトリウム（和光純薬工業（株））あるいは15％(重量/容量)の酢酸ナトリウム（和光純薬工業（株））を溶解した。
【００７３】
0.4％(重量/容量)の塩化ナトリウムを添加した場合には30%、40%、50%、66%、15%(重量/容量)の酢酸ナトリウムを添加した場合には20%、30%、40%、50%の終濃度になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿させた。
【００７４】
沈殿物を遠心分離にて回収し、適当量の水に溶解して高速液体クロマトグラフィー分析（上述の分子量分布を求める際と同条件）により、Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を求めた。コントロールとしてエタノールを添加しない検体を同様に分析した。結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】

【００７６】
表中、NaOHは水酸化ナトリウムを、NaClは塩化ナトリウムを、AcONaは酢酸ナトリウムを、EtOHはエタノールをそれぞれ示す。
【００７７】
アルカリを添加する工程を実施しなければ、いずれの塩あるいはエタノール濃度でも分子量分散度は5以上となった。
表３中で分子量分散度が２以下となるのは0.1Nあるいは0.5Nのアルカリ処理工程を実施したもので、かつ15%(重量/容量)の酢酸ナトリウムを添加し終濃度30〜50%エタノールで分画した場合である。
【００７８】
特開平5-271305（先行技術）で開示されているＮ−アセチルヘパロサンの製造法は本発明と同じくアルカリ処理工程とエタノールにより分画する工程を含むが、アルカリ処理工程は終濃度0.1Nの水酸化ナトリウムを添加するものであり、エタノール分画によりＮ−アセチルヘパロサンを回収する工程は0.4%（重量/容量）の塩化ナトリウムを添加し、終濃度66%のエタノールを添加する条件である。
【００７９】
表３に示されるごとく、前記先行技術の条件で得られるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度は2.103であり、本発明の15%（重量/容量）酢酸ナトリウムを添加してＮ−アセチルヘパロサン画分を回収せしめる工程では終濃度30〜50％の少量の添加エタノールによって、画分中のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度2以下を達成できるのに対し、塩化ナトリウムを添加塩とする場合には他のエタノール濃度、あるいは0.5Nアルカリ処理工程を実施することによっても分子量分散度２以下を達成することはできなかった。
【００８０】
［実施例７］
〈酢酸ナトリウム添加量とＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較〉
実施例５と同様の実験を、酢酸ナトリウム添加量を変化させて行った。
実施例５と同様にして培養上清をアルカリ処理後中和し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を得た。各画分をさらに3つにわけ5,10,15％(重量/容量)の酢酸ナトリウム（和光純薬工業（株））を溶解した。続けて30%,40%,50%の終濃度になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿させた。
【００８１】
沈殿物を遠心分離にて回収し、適当量の水に溶解して高速液体クロマトグラフィー分析（上述の分子量分布を求める際と同条件）により、Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を求めた。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】

【００８３】
終濃度0.5Nのアルカリ処理を実施した場合においては15％（重量/容量）酢酸ナトリウム添加でかつ終濃度30〜50%エタノール添加する条件においてはもちろんのこと、10%あるいは5%（重量/容量）酢酸ナトリウム添加によっても終濃度30〜50%エタノール添加によって分子量分散度２以下のＮ−アセチルヘパロサン含む画分を回収できることが示された。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、従来の煩雑な手法を簡略化でき、コストを引き下げ、回収量を増大し、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサンおよび該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３によるN−アセチルヘパロサンの高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布を示す図である。
【図２】N−アセチルヘパロサンのプロトン^１３Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図３】N−アセチルヘパロサンの^１３Ｃ−NMRを示す図である。
【図４】実施例５によるN−アセチルヘパロサンの高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a highly pure and uniform N-acetylhepa having a low molecular weight dispersibility obtained from an unpurified or crude N-acetylheparosan solution such as a culture solution of E. coli having N-acetylheparosan producing ability. The present invention relates to a rosin, an N-acetylheparosan fraction containing the N-acetylheparosan with high purity, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In the following description of the sugars and sugar residues in the present specification, all optical isomers indicate D forms unless otherwise specified.
N-acetylheparosan is a glycosaminoglycan characterized by the repeating structure of the disaccharide unit of β-D glucuronyl-1,4-α-N-acetyl-D glucosaminyl (1,4) It is also known as a capsular polysaccharide produced by a species of bacteria and called antigen K5 (Eur. J. Chem 1981, vol 116, 359-364). This polysaccharide is considered to be a precursor of heparin. N-acetylheparosan is partially de-N-acetylated and then sulfated, and glucuronic acid is converted to iduronic acid. A specific part of acetylglucosamine is heparinized by being randomly sulfated. Heparin has a useful anticoagulant action and antithrombotic action and is used as a pharmaceutical product. However, in general, the raw material must be relied on the organs of animals such as cattle and pigs, so there is a difficulty in avoiding the risk of contamination with pathogenic viruses and prion proteins.
[0003]
As described above, heparin or a heparin-like substance that does not depend on animal organs is highly useful, and extensive research has been conducted on its industrial production. For example, after obtaining N-acetylheparosan from a culture solution of Escherichia coli K5, an attempt has been made to produce pseudo-heparin having an anticoagulant activity by chemically sulfating (JP-A-5-271305).
[0004]
In addition, various attempts have been made to purify N-acetylheparosan from the culture solution of Escherichia coli K5. Vann et al. Added cetabolone (hexadecyltrimethylammonium bromide) to the culture solution to recover N-acetylheparosan, and then extracted N-acetylheparosan in calcium chloride solution and purified by repeated phenol extraction. Has been reported (Eur. J. Biochem 1981). This method purifies 1-3 grams of N-acetylheparosan from 50 L of culture (Methods in Enzymology, 1994).
[0005]
In addition, Manzoni et al. Concentrated the culture solution of Escherichia coli K5 with an ultrafiltration device, precipitated N-acetylheparosan by adding ethanol, digested with pronase, and then precipitated by adding dialysis and ethanol. Has been reported (J. Bioactive compatible polymers 1996). Furthermore, they improved the medium composition and the culture equipment, and made it possible to produce 350-400 mg of N-acetylheparosan from 1 L of the culture solution. This N-acetylheparosan is reported to contain 12-16% of protein which is an impurity (Biotechnology letters 2000). Among these conventional purification examples, heat treatment may be performed for the purpose of inactivating Escherichia coli, but heat treatment was performed with the intention of increasing the recovery rate of N-acetylheparosan as in the present invention. There is no example.
[0006]
In the conventional method, after purifying the culture solution, N-acetylheparosan is purified only by various complicated steps. The amount of N-acetylheparosan that can be purified is about 350-400 mg per liter of culture solution, but the purified product contains a relatively large amount of protein (12-16%). Is not suitable for applications that require In addition, the molecular weight distribution of N-acetylheparosan reported heretofore is not monodispersed as shown in JP-A-5-271305 or J. Bioactive compatible polymers (1996) vol.11 p301, but polydisperse having a plurality of peaks. It looks like this. Limiting the molecular weight to a certain range has the advantage that the physical properties of N-acetylheparosan can be kept more constant, and increases the possibility that the expected physiological activity becomes more uniform.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
  Accordingly, an object of the present invention is to provide N-acetylheparosan having a low molecular weight dispersity and an N-acetylheparosan fraction containing the N-acetylheparosan in high purity.Manufacturing methodIs to provide.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have obtained a highly recoverable N-acetylheparosan fraction containing N-acetylheparosan having a low molecular weight dispersity with high purity by a relatively simple method. The present invention was completed by succeeding in purification.
[0009]
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for producing an N-acetylheparosan fraction from a solution containing N-acetylheparosan and a microorganism-derived component, wherein the solution is subjected to alkali treatment, neutralized, A method for producing an N-acetylheparosan fraction, wherein an alcohol fraction is obtained in the presence to obtain a fraction.
[2] The production method of [1], wherein the solution containing N-acetylheparosan and a microorganism-derived component is a solution derived from a culture solution of Escherichia coli having N-acetylheparosan producing ability.
[3] The production method of [2], wherein the Escherichia coli having the ability to produce N-acetylheparosan is K5 strain.
[4] A solution derived from a culture solution of E. coli having N-acetylheparosan-producing ability is obtained by subjecting the E. coli culture solution to a heat treatment at 80 to 121 ° C., followed by solid-liquid separation. The production method of [2] and [3], which is clean.
[5] A solution derived from a culture solution of E. coli having N-acetylheparosan-producing ability is obtained by subjecting the E. coli culture solution to a heat treatment at 80 to 121 ° C., followed by solid-liquid separation. The method according to [2] to [4], which is a solution from which the low-molecular component is further removed by performing a membrane treatment for separating the N-acetylheparosan fraction and the low-molecular component in Kiyoi .
[6] The production method of [4] and [5], wherein the temperature of the heat treatment is 90 to 121 ° C.
[7] The production method of [1] to [6], wherein the organic acid salt is sodium acetate.
[8] The production method of [7], wherein the final concentration in the solution of sodium acetate is 5 to 15% (weight / volume).
[9] The production method of [1] to [8], wherein the alcohol is ethanol.
[10] The production method of [9], wherein the final concentration in the ethanol solution is 30 to 50% (volume / volume).
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) N-acetylheparosan
N-acetylheparosan is a natural polysaccharide and, like other polysaccharides, is an aggregate of molecules having a certain range of molecular weight. For this reason, the measurement of the weight average molecular weight can be performed using the usual methods of measuring the molecular weight of polysaccharides, for example, methods such as gel filtration, light scattering, steric exclusion chromatography, limiting viscosity, sedimentation equilibrium and the like. The weight average molecular weight of the N-acetylheparosan of the present invention is in the range of 35,000 to 45,000 when measured by gel filtration chromatography using high performance liquid chromatography described later.
[0011]
Hereinafter, in the present specification, the weight average molecular weight (Mw) is the molecular weight (Biochem. Biophys. Acta., 1117, in particular) when measured using a gel filtration chromatography method using high performance liquid chromatography. 60-70, 1992).
Moreover, the range of a weight average molecular weight is 50,000-70,000 when it measures by the multi-angle light scattering method mentioned later.
[0012]
As a method for indicating the molecular weight dispersity of N-acetylheparosan of the present invention, the weight average molecular weight (Mw) by gel filtration chromatography is divided by the number average molecular weight (Mn) measured by the same method (weight average molecular weight / (Number average molecular weight; Mw / Mn) method, method using an integral value, and the like.
[0013]
The molecular weight dispersity of the N-acetylheparosan of the present invention is 1.1 to 1.9 when calculated by weight average molecular weight / number average molecular weight.
The number average molecular weight is obtained by using the same method as the measurement of the weight average molecular weight by gel filtration chromatography and analyzing the obtained numerical value with data analysis software.
[0014]
(2) N-acetylheparosan fraction
The N-acetylheparosan fraction of the present invention is a highly pure and uniform preparation containing the N-acetylheparosan of the present invention exhibiting the specific average molecular weight and the specific molecular weight dispersity described in (1), The preparation has a nucleic acid content of 0.1% or less and a free amine content of 0.03 μM / mg or less.
[0015]
The nucleic acid content can be measured using ultraviolet and visible spectrophotometric methods, ethidium bromide (EtBr) colorimetric method, or the like, preferably by a measuring method using EtBr colorimetric method. Quantification of free amine can be measured using the 2,4,6-TNBS method (Biochemica et Biophysica Acta. (1967) 141, 358-365) reported to Yoshizawa et al.
[0016]
(3) Method for producing N-acetylheparosan fraction
The N-acetylheparosan fraction having specific physical properties of the present invention can be produced by the following steps A to E.
(Step A) Cultivation of E. coli
The N-acetylheparosan fraction can be prepared, for example, by culturing Escherichia coli having N-acetylheparosan-producing ability and purifying from the culture. Escherichia coli having the ability to produce N-acetylheparosan used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include K5 strain or a strain having substantially the same properties as the strain, As the K5 strain, a standard strain readily available to those skilled in the art can be used.
[0017]
For example, E.coli. SEBR3282 strain (CNCM No.I-1013), Bi626-42 strain; 012: K5 (L): NM) (ATCC (American Type Culture Collection) No.23508), O10: K5 (L): H4 (ATCC No. 23506) and the like, and it is particularly preferable to use E. coli.O10: K5 (L): H4 (ATCC No. 23506).
[0018]
Moreover, the culture medium used for culture should just contain the carbon source suitable for culture | cultivation of colon_bacillus | E._coli, a nitrogen source, another antifoamer, etc., It is preferable to use the culture medium especially rich in glycerol.
[0019]
The culture conditions of E. coli are not particularly limited as long as N-acetylheparosan is accumulated in the culture solution, but usually the conditions are 15 to 40 ° C. for 15 to 24 hours, preferably 37 ° C. and 15 hours. It is done.
[0020]
(Step B) Heat treatment and solid-liquid separation
The culture solution obtained in step A is directly heat-treated, and then solid-liquid separation is performed. This heat treatment is not limited as long as it is carried out by a method and temperature conditions that do not decompose N-acetylheparosan and contribute to yield improvement, but it is usually sufficient to heat at a temperature condition of 80 to 200 ° C. You can do it. When heat treatment is performed in an autoclave, the heat treatment condition is preferably 90 to 121 ° C. for 5 to 30 minutes, more preferably 121 ° C. for 5 to 20 minutes. This heat treatment makes it possible to purify more N-acetylheparosan fraction from the culture solution.
[0021]
After the heat treatment, it is usually cooled or allowed to cool to room temperature, and solid-liquid separation treatment is performed. Solid-liquid separation is not limited as long as it is a method capable of removing solids such as bacterial cells, and may be performed by centrifugation or may be performed by filtration using an appropriate filter aid.
[0022]
(Step C) membrane treatment
Membrane treatment is performed to remove unnecessary low-molecular components such as amino acids and salts contained in the culture solution. In the present invention, the membrane treatment may be carried out using a membrane and a treatment method capable of separating the N-acetylheparosan fraction and low molecular components in the culture solution. For example, the membrane treatment can be performed by ultrafiltration and has a molecular weight of 10,000. Ultrafiltration using a cut membrane is preferred. In some cases, the same effect can be obtained by dialysis using a commercially available dialysis tube made of cellulose or the like.
[0023]
(Step D) alkali treatment
Contains N-acetylheparosan and a microorganism-derived component such as a solution containing a crudely purified N-acetylheparosan fraction obtained by subjecting a culture solution of Escherichia coli having N-acetylheparosan-producing ability to steps A to C. The solution to be contacted with an alkaline solution. This treatment markedly increases the purity of the N-acetylheparosan fraction.
[0024]
Examples of the alkaline solution include sodium hydroxide, potassium hydroxide, barium hydroxide, calcium hydroxide, and the like. The pH of the solution is adjusted to 13 or more by adding these to a solution containing the N-acetylheparosan fraction. Among these, it is particularly preferable to use a sodium hydroxide solution.
[0025]
The concentration of the alkaline solution is preferably a final concentration of 0.1N or more, more preferably 0.5N. Further, it is preferable that the mixture is heated to 40 ° C. and sufficiently stirred during the alkali treatment. In addition, since the N-acetylheparosan structure may be destroyed by the β-ermination reaction under strongly basic conditions of pH 13 or higher, the reaction time is preferably 1 hour or shorter. There is no change in the purity of the N-acetylheparosan fraction obtained even when the reaction is carried out for 1 hour or longer, but the yield may decrease.
[0026]
The solution containing the N-acetylheparosan fraction thus treated is immediately neutralized with an acid solution such as hydrochloric acid. Here, if hardly soluble impurities are produced, the impurities are removed by solid-liquid separation means such as filtration or centrifugation, or diatomaceous earth such as Radiolite (Showa Chemical Industry Co., Ltd.) is used as a filter aid. Apply pressure or vacuum filtration.
[0027]
(Stage E)alcoholFractionation
The solution obtained in the above step D is subjected to alcohol fractionation to remove impurities such as proteins and nucleic acids. Alcohol fractionation is performed by a method known as a polysaccharide fractionation method, that is, by adding and dissolving a salt at a constant concentration, and then gradually adding alcohol while stirring the solution containing the salt.
[0028]
The salt to be added is not particularly limited as long as it is an organic acid salt, but sodium acetate is particularly preferable. In particular, in the case of sodium acetate, it is preferable to add so that the final concentration of the solution is 5 to 15% (weight / volume%). If the salt concentration is lower than this, the degree of impurity removal tends to decrease.
[0029]
Examples of the alcohol used include ethanol, methanol, and isoamyl alcohol, and ethanol is particularly preferable. Further, when ethanol is used, it is preferably added so that the final concentration of the solution is 30 to 50% (volume / volume%), more preferably 30%. When more ethanol is added, the recovery amount increases, but the molecular weight dispersity, protein content, and nucleic acid content tend to increase.
After ethanol fractionation, the supernatant and the precipitate are separated by solid-liquid separation means such as centrifugation, and the precipitate is dissolved in an appropriate amount of water for desalting.
[0030]
As a desalting method suitable for large-scale processing, fractionation with an appropriate concentration of alcohol, that is, alcohol is added to the above-mentioned precipitation lysate so that the final concentration becomes 60% -80%, and the supernatant is obtained by centrifugation. The method of repeating the process of removing is mentioned. Usually, a sufficient desalting effect is obtained by repeating this operation 2 to 3 times.
However, desalting can be performed by appropriately combining methods such as dialysis, ultrafiltration and ion exchange chromatography according to the use of the final purified product.
[0031]
The individual steps described above are most preferably performed in the order described above, but the order may be changed according to the purpose.
[0032]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to a following example, unless the summary is exceeded.
[Example 1]
<Culture of E. coli K5 strain>
The strain was E. coli serotype 010: K5 (L): H4 (ATCC No. 23506) and cultured under the following conditions.
[0033]
2% casamino acid, 0.5% yeast extract, 0.2% glucose, Adecanol LG-109 (trade name: Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) dissolved in 3 L of tap water to make 100 ppm, sterilized at 121 ° C for 20 minutes at 1.2 atmospheres The medium was prepared. Into this medium, 1 ml of 20% glycerol-preserving bacterial solution was planted and cultured at 37 ° C. for 15 hours at an aeration rate of 1 vvm, a stirring speed of 500 rpm.
[0034]
<Heat treatment process>
After culturing for 15 hours, the culture solution is autoclaved at 121 ° C for 15 minutes and 1.2 atmospheres, allowed to cool to room temperature, centrifuged at 10,000 xg for 35 minutes at 4 ° C, and about 2.7 L of heat-treated culture supernatant is obtained. Obtained.
[0035]
<Ultrafiltration process>
The heat-treated culture supernatant was passed through a spiral filter cartridge (Nippon Millipore) with a molecular weight cut off of 10,000, and ultrafiltered. Further, ultrafiltration was continued while adding 10 times the volume of the supernatant, The heat-treated culture supernatant was concentrated and the low molecular fraction was removed.
[0036]
<Alkali treatment process>
Six lots of culture supernatant (about 16 L) were treated in the above step and concentrated to about 900 mL, and 1/39 volume of 20N sodium hydroxide aqueous solution was added, and stirring was continued while keeping the temperature at 40 ° C. After 1 hour, the solution was neutralized with concentrated hydrochloric acid, and insoluble impurities were filtered using Radiolite # 500 (Showa Chemical Industry Co., Ltd.) to collect the filtrate.
[0037]
<Ethanol fractionation process>
Sodium acetate (special grade; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in the filtrate to a final concentration of 15%. While stirring this solution, ethanol (special grade; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added dropwise little by little to obtain a final concentration of 30% to obtain a precipitate of the N-acetylheparosan fraction.
After completion of the dropwise addition, the mixture was further stirred for 5 minutes, and then centrifuged at 5000 × g for 15 minutes, and the supernatant was separated by decantation to obtain a precipitate.
[0038]
<Desalting step>
The precipitate was dissolved in a small amount of water, and ethanol was added with stirring to a final concentration of 60%. After further stirring for 5 minutes, the mixture was centrifuged at 5000 × g for 15 minutes, and the supernatant was separated by decantation to obtain a precipitate of the N-acetylheparosan fraction. This operation was repeated once more.
[0039]
Further, ethanol was added with stirring to a final concentration of 80%. After further stirring for 5 minutes, the mixture was centrifuged at 5000 × g for 15 minutes, and the supernatant was separated by decantation to obtain a precipitate.
The precipitate was dissolved in an appropriate amount of water and freeze-dried to obtain 4 g of N-acetylheparosan fraction freeze-dried product.
[0040]
[Example 2]
<Step for obtaining a higher-purity N-acetylheparosan fraction>
In order to remove free ions such as metal ions that may be mixed in trace amounts, the N-acetylheparosan fraction lyophilized product obtained in Example 1 was further purified by the following steps.
[0041]
In other words, 30 ml each of cation exchange resin Diaion PK220 and anion exchange resin Diaion SA-12A (both Mitsubishi Chemical Corporation) were regenerated with 2N hydrochloric acid and 2N sodium hydroxide aqueous solution, respectively, with sufficient amount of pure water. Washed.
[0042]
Next, the lyophilized N-acetylheparosan fraction obtained in Example 1 was dissolved in pure water so as to be 1%, and continuously added to the anion exchange resin and cation exchange resin columns in this order. Then, the solution was passed at a flow rate of 10 ml / min, and the solution after passing through was quickly neutralized with an aqueous sodium hydroxide solution, filtered through a 0.22 μm filter, and lyophilized. The recovery rate of the high-purity N-acetylheparosan fraction was 96%.
[0043]
[Example 3]
<Physical property test of N-acetylheparosan>
The high-purity N-acetylheparosan fraction obtained in Example 2 and the physical properties of N-acetylheparosan contained in the fraction were measured by the following methods.
[0044]
(Measurement of weight average molecular weight and number average molecular weight by gel filtration chromatography)
The weight average molecular weight was measured by gel filtration chromatography according to the method of Arai et al. (Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992). High performance liquid chromatography using sodium chondroitin sulfate with known molecular weight (weight average molecular weight 39100, 18000, 8050; all from Seikagaku Corporation) and sodium hyaluronate (weight average molecular weight 104000; Seikagaku Corporation) as standard products The weight average molecular weight was determined by the elution time in gel filtration chromatography using chromatography.
[0045]
Column is TSK gel G4000PW_XL, G3000PW_XLAnd G2500PW_XL(Each φ7.8 × 300 mm, Tosoh Corporation) was used. The solvent used was a 0.2 mol / L sodium chloride solution, the flow rate was 0.6 ml / min, and the detector was a differential refractive index detector (RI-8020, Tosoh Corporation). The resulting chromatographic pattern is shown in FIG. As a result of analyzing the obtained values with data analysis software (GPC-8020 Tosoh Corporation), the weight average molecular weight (Mw) measured by gel filtration chromatography was 44,710, and the number average molecular weight (Mn) was 36,714. there were.
[0046]
(Calculation of molecular weight dispersion)
As a result of analysis with data analysis software (GPC-8020; Tosoh Corporation) based on the results of FIG. 1, the molecular weight dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight (Mw / Mn)) was 1.212.
[0047]
(Weight average molecular weight measurement by multi-angle light scattering)
The molecular weight by the multi-angle light scattering method uses a differential refractive index detector (Shodex RI-71, Showa Denko KK) and a multi-angle light scattering detector (WyattDDAWN EOS; Wyatt Technology Corporation) as detectors. The analysis was performed using a Jim Plot module of Wyatt Technology Corporation.
[0048]
Two columns, SB-806HQ (φ8 × 300 mm; Showa Denko KK), were connected, the solvent was 0.2 mol / L sodium nitrate solution, and the flow rate was 0.6 ml / min. The data acquisition interval was twice per second.
[0049]
The measured voltage value (LS) of the light scattering detector is
(LS) = (dn / dc)²   X concentration X weight average molecular weight X K_LS
→ weight average molecular weight = (LS) / {(dn / dc)²   X concentration X K_LS}
dn / dc = refractive index increment per gram of sample (mgl / g)
K_LS= Device constant (calibrated with toluene)
[0050]
The concentration was determined from the measured voltage value (RI) of the differential refractive index detector according to the following formula.
(RI) = (dn / dc) X concentration X K_RI
→ Concentration = (RI) / {(dn / dc) X K_RI}
Where K_RIWas calibrated by pullulan with the device constant of the differential refractive index detector.
[0051]
The dn / dc of N-acetylheparosan was calculated using a constant of 0.159 ml / g obtained from hyaluronic acid.
As a result, the weight average molecular weight of N-acetylheparosan measured by the multi-angle light scattering method was about 63000.
[0052]
(Structural analysis by nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum)
N-acetylheparosan proton and¹³The results of the C carbon NMR spectrum are shown in FIG. 2 and FIG. These results strongly indicated that N-acetylheparosan contained in the high-purity N-acetylheparosan fraction obtained in Example 2 had an N-acetylheparosan structure.
[0053]
(Cellulose acetate membrane electrophoresis)
Cellulose acetate membrane electrophoresis was performed according to the method of Hata et al. (Anal. Biochem 45, 462-468 (1972)) to confirm the purity of N-acetylheparosan.
[0054]
That is, a cellulose acetate membrane (Fuji Photo Film Co., Ltd.) was coated with 1 μL of a 10 mg / ml aqueous solution of the N-acetylheparosan fraction obtained in Example 2 on a 1 cm long line, and a 0.1 M pyridine-formic acid aqueous solution. Electrophoresis was carried out at a current of 0.5 mA / cm for 30 minutes using (pH 3) as a buffer for electrophoresis. After electrophoresis, the cellulose acetate membrane was stained with 0.5% alcian blue aqueous solution containing 2% acetic acid for 15 minutes and decolorized with 2% acetic acid.
The position of the N-acetylheparosan band thus obtained was almost the same as the migration position of hyaluronic acid (Seikagaku Corporation) and was a single band.
[0055]
(Carbazole determination)
D-glucuronolactone 20μg / ml aqueous solution is used as a standard product, and uron by carbazole sulfate method (Bitter-Muir method, T. Bitter, H. Muir, Anal. Biochem. J, 4, 330-334 (1962)). The acid content was measured. The color value of N-acetylheparosan was 89.5% when the color value of the same amount of hyaluronic acid was taken as 100%.
[0056]
(Nucleic acid)
Example 2 by EtBr colorimetric determinationHigh purityThe nucleic acid content of the N-acetylheparosan fraction was measured and found to be 0.09%.
[0057]
(Protein quantification)
The protein content in the N-acetylheparosan fraction of Example 2 was determined by the Lowry method (Lowry J. et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)) using bovine serum albumin as a standard. It was 2.38% when measured.
[0058]
(Quantification of free amine)
Free amines were quantified by the 2,4,6-TNBS method (Biochemica et Biophysica Acta. (1967) 141, 358-365) reported by Yoshizawa et al. N-acetyl D-glucosamine was used as a standard product. The number of moles of free amine contained in the N-acetylheparosan fraction of Example 2 was 0.026 μM / mg.
[0059]
[Example 4]
<Amount of N-acetylheparosan contained in the culture supernatant with and without heat treatment>
The amount of N-acetylheparosan contained in the culture supernatant with and without heat treatment was compared by a colorimetric method.
[0060]
That is, the culture broth was divided into four equal parts, and those that had been heat-treated at 121 ° C for 5 minutes, 90 ° C for 30 minutes, and 80 ° C for 30 minutes and those that had not been heat-treated were similarly centrifuged to obtain culture supernatants . The amount of heparosan in these culture supernatants was colorimetrically determined according to the method of Homer K. A. et al. (Analytical Biochemistry 214, 435-441 1993). As a standard product, the high-purity N-acetylheparosan fraction of Example 2 was used.
The results are shown in Table 1 below.
[0061]
[Table 1]

[0062]
It was confirmed that many N-acetylheparosan fractions can be recovered in the culture supernatant when heat treatment, particularly at 121 ° C. for 5 minutes, is performed. The amount of N-acetylheparosan contained in the supernatant was about 1.7 times that without heat treatment.
[0063]
[Example 5]
<Comparison of molecular weight dispersity of N-acetylheparosan with and without alkali treatment>
Comparison of the molecular weight dispersion of N-acetylheparosan with and without alkali treatment was performed as follows. That is, Escherichia coli K5 strain was cultured according to Example 1, and the culture was heat-treated at 121 ° C. for 5 minutes, then centrifuged to obtain a heat-treated culture supernatant, and then ultrafiltration using a membrane with a molecular weight of 10,000 cut The low molecular fraction was removed. This solution was divided into two equal parts, and 20N sodium hydroxide aqueous solution was added to one side so as to have a final concentration of 0.5N, followed by stirring at 40 ° C. for 1 hour. After 1 hour, the mixture was cooled to room temperature and neutralized with hydrochloric acid.
[0064]
Next, 15% by weight of sodium acetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in the culture solution and divided into 4 equal parts, so that the final concentrations are 30%, 40%, 50%, and 60%, respectively. Ethanol was added with stirring to precipitate the N-acetylheparosan fraction (corresponding to 2-A, 2-B, 2-C, 2-D in Table 2).
[0065]
Further, the other half was not subjected to alkali treatment, and 15% by weight sodium acetate was dissolved in the same amount as in the above, and the same operation was performed to precipitate the N-acetylheparosan fraction. (Corresponding to 1-A, 1-B, 1-C, 1-D in Table 2).
[0066]
The precipitate was collected and dissolved in an appropriate amount of water, and the molecular weight distribution was examined by high performance liquid chromatography under the same conditions as those for obtaining the molecular weight distribution described above. The results are shown in FIG.
The names of the samples are as shown in Table 2.
[0067]
[Table 2]

[0068]
After carrying out so-called alkali treatment in which the culture solution is brought into contact with 0.5N sodium hydroxide, the precipitate is neutralized with 15% weight / volume sodium acetate and added with ethanol at a final concentration of 30% (2 -A) gave the monodisperse differential refractive index.
[0069]
2-A is decomposed with heparinase (Seikagaku Corporation) and liquid chromatography (TSLgel G4000PW)_XL, G3000PW_XLAnd G2500PW_XL(Analysis of φ7.8 × 300mm, Tosoh Co., Ltd.), the peak from about 27 minutes to 33 minutes disappeared, indicating that 2-A is a substance with a heparin skeleton. Proven.
[0070]
[Example 6]
<Change in molecular weight dispersion of N-acetylheparosan depending on alkali treatment and fractionation conditions>
In order to compare the molecular weight dispersion of N-acetylheparosan according to alkali treatment conditions and fractionation conditions, the following experiment was conducted.
[0071]
The culture solution of Escherichia coli K5 obtained according to Example 1 was heat-treated at 121 ° C. for 5 minutes and then centrifuged to obtain a culture supernatant. This culture supernatant was subjected to ultrafiltration with a molecular weight of 10,000 cut according to Example 1 to remove the low molecular fraction. Divide this solution into 3 fractions, 20N aqueous solution of sodium hydroxide was added to 2 fractions to a final concentration of 0.5N and 0.1N, and the remaining 1 fraction was added at 40 ° C without adding anything. Stir for 1 hour.
[0072]
After 1 hour, the mixture was cooled to room temperature, and the fraction added with sodium hydroxide was neutralized with hydrochloric acid. Each fraction is further divided into two, 0.4% (weight / volume) sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or 15% (weight / volume) sodium acetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Was dissolved.
[0073]
When 0.4% (weight / volume) sodium chloride is added, 30%, 40%, 50%, 66%, 15% (weight / volume) sodium acetate is added, 20%, 30%, Ethanol was added with stirring to a final concentration of 40% and 50% to precipitate the N-acetylheparosan fraction.
[0074]
The precipitate is recovered by centrifugation, dissolved in an appropriate amount of water, and analyzed by high-performance liquid chromatography (same conditions as in the above-mentioned molecular weight distribution determination) to determine N-acetyl contained in the N-acetylheparosan fraction. The molecular weight dispersion of heparosan was determined. As a control, a sample to which no ethanol was added was analyzed in the same manner. The results are shown in Table 3.
[0075]
[Table 3]

[0076]
In the table, NaOH represents sodium hydroxide, NaCl represents sodium chloride, AcONa represents sodium acetate, and EtOH represents ethanol.
[0077]
If the step of adding alkali was not carried out, the molecular weight dispersity was 5 or more at any salt or ethanol concentration.
In Table 3, the molecular weight dispersity is 2 or less when 0.1N or 0.5N alkali treatment is performed, and 15% (weight / volume) sodium acetate is added to give a final concentration of 30-50% ethanol. This is the case of fractionation with.
[0078]
The method for producing N-acetylheparosan disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-271305 (prior art) includes an alkali treatment step and a fractionation with ethanol as in the present invention. The alkali treatment step has a final concentration of 0.1N. Sodium hydroxide is added, and the step of recovering N-acetylheparosan by ethanol fractionation is a condition in which 0.4% (weight / volume) sodium chloride is added and ethanol with a final concentration of 66% is added. .
[0079]
As shown in Table 3, the molecular weight dispersity of N-acetylheparosan obtained under the conditions of the prior art is 2.103, and 15% (weight / volume) sodium acetate of the present invention is added to add N-acetylheparosan. In the process of collecting fractions, when a small amount of added ethanol with a final concentration of 30-50% can achieve a molecular weight dispersity of 2 or less of N-acetylheparosan in fractions, sodium chloride is used as an added salt. In addition, the molecular weight dispersity of 2 or less could not be achieved even by carrying out another ethanol concentration or 0.5N alkali treatment step.
[0080]
[Example 7]
<Comparison of molecular weight dispersion of sodium acetate and N-acetylheparosan>
The same experiment as in Example 5 was performed by changing the amount of sodium acetate added.
In the same manner as in Example 5, the culture supernatant was neutralized after alkali treatment to obtain an N-acetylheparosan fraction. Each fraction was further divided into three, and 5,10,15% (weight / volume) sodium acetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved. Subsequently, ethanol was added with stirring to a final concentration of 30%, 40%, and 50% to precipitate the N-acetylheparosan fraction.
[0081]
The precipitate is recovered by centrifugation, dissolved in an appropriate amount of water, and analyzed by high-performance liquid chromatography (same conditions as in the above-mentioned molecular weight distribution determination) to determine N-acetyl contained in the N-acetylheparosan fraction. The molecular weight dispersion of heparosan was determined. The results are shown in Table 4.
[0082]
[Table 4]

[0083]
10% or 5% (weight / volume) in the condition of adding 15% (weight / volume) sodium acetate and final concentration of 30-50% ethanol when alkali treatment with final concentration of 0.5N is performed It was shown that the fraction containing N-acetylheparosan having a molecular weight dispersity of 2 or less can be recovered by adding sodium acetate with ethanol at a final concentration of 30-50%.
[0084]
【The invention's effect】
According to the present invention, conventional complicated methods can be simplified, the cost can be reduced, the recovery amount can be increased, and the N-acetylheparosan having a low molecular weight dispersity and the N-acetylheparosan containing the N-acetylheparosan in high purity can be obtained. Losan fraction can be provided.
[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing the molecular weight distribution of N-acetylheparosan according to Example 3 by high performance liquid chromatography.
Fig. 2 Proton of N-acetylheparosan¹³It is a figure which shows C-NMR.
[Fig. 3] N-acetylheparosan¹³It is a figure which shows C-NMR.
4 is a diagram showing the molecular weight distribution of N-acetylheparosan according to Example 5 by high performance liquid chromatography. FIG.

Claims

A method for producing an N-acetylheparosan fraction from a solution having N-acetylheparosan and a microorganism-derived component, wherein the solution is subjected to an alkali treatment and then neutralized in the presence of an organic acid salt. A method for producing an N-acetylheparosan fraction , which is obtained by performing alcohol fractionation.

Solution containing N- acetyl heparosan and microbial components, N- acetyl heparosan is a solution derived from a culture of E. coli having an ability to produce, the production of N- acetyl heparosan fractions according to claim 1 Way .

The method for producing an N-acetylheparosan fraction according to claim 2, wherein the Escherichia coli having the ability to produce N-acetylheparosan is K5 strain .

The solution derived from the culture solution of E. coli having the ability to produce N-acetylheparosan is a supernatant obtained by subjecting the E. coli culture solution to heat treatment at 80 to 121 ° C. and then performing solid-liquid separation. The method for producing an N-acetylheparosan fraction according to claim 2 or 3.

In a supernatant obtained by subjecting a solution derived from a culture solution of E. coli having N-acetylheparosan producing ability to heat treatment at 80 to 121 ° C. to the culture solution of E. coli, followed by solid-liquid separation, Furthermore, it is the solution from which this low molecular component was removed by performing the membrane process which isolate | separates a N-acetyl heparosan fraction and a low molecular component, The any one of Claims 2-4 A method for producing the N-acetylheparosan fraction.

The manufacturing method of the N-acetyl heparosan fraction of Claim 4 or 5 whose temperature of heat processing is 90-121 degreeC .

The method for producing an N-acetylheparosan fraction according to any one of claims 1 to 6, wherein the organic acid salt is sodium acetate.

The manufacturing method of the N-acetyl heparosan fraction of Claim 7 whose final concentration in the solution of sodium acetate is 5 to 15% (weight / volume) .

The method for producing an N-acetylheparosan fraction according to any one of claims 1 to 8, wherein the alcohol is ethanol.

The method for producing an N-acetylheparosan fraction according to claim 9, wherein the final concentration of the ethanol solution is 30 to 50% (volume / volume) .