JP4078425B2 - Sample substrate holder and method of using the same - Google Patents
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Description
本発明は、試料基板ホルダに関し、特に試料を付与する試料基板の表面近傍を観察に適した試料基板ホルダ及びその利用方法に関する。 The present invention relates to a sample substrate holder, and more particularly to a sample substrate holder suitable for observing the vicinity of the surface of a sample substrate to which a sample is applied and a method of using the sample substrate holder.
従来、固−液界面近傍の観察は、液量が少ない場合には、試料基板材料の表面に液滴を落とし、それを背面から観察することで行われている。また、細胞と基板材料との接着状態を観察するような場合は、十分な液量を長期にわたって保持する必要があり、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられている（特許文献１、２、３参照）。 Conventionally, the observation of the vicinity of the solid-liquid interface is performed by dropping a droplet on the surface of the sample substrate material and observing it from the back when the amount of liquid is small. Moreover, when observing the adhesion state between the cells and the substrate material, it is necessary to maintain a sufficient amount of liquid over a long period of time, and a culture dish or the like having a surface treated on the bottom surface is used (Patent Document 1). 2, 3).
従来、次のような構成のものが利用されている。
１）細胞と基板材料との相互作用を制御する場合、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられている。例えば、温度応答性高分子で全面被覆した基材表面で細胞を培養し、温度変化によって培養細胞を剥離回収する構成は知られている（特許文献１参照）。又、温度応答性分子でパターン状に被覆した基材表面で細胞を培養し、温度制御によって複数種の細胞パターンに沿って共培養する構成が知られている（特許文献２参照）。
Conventionally, the following configuration is used.
1) When controlling the interaction between a cell and a substrate material, a culture dish or the like having a surface treated on the bottom surface is used. For example, a configuration is known in which cells are cultured on the surface of a substrate that is entirely covered with a temperature-responsive polymer, and the cultured cells are peeled and recovered by temperature change (see Patent Document 1). In addition, a configuration is known in which cells are cultured on a substrate surface coated with a temperature-responsive molecule in a pattern, and co-cultured along a plurality of cell patterns by temperature control (see Patent Document 2).
２）平板状の基板にスピンコートや均一なプラズマ照射を含む様々な表面処理を施した構成が用いられている。例えば、温度応答性ポリマーの支持体への被覆方法として、電子線照射、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応、混練する構成が知られている（特許文献３参照）。 2) A structure in which a flat substrate is subjected to various surface treatments including spin coating and uniform plasma irradiation is used. For example, as a method of coating a support with a temperature-responsive polymer, electron beam irradiation, γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, organic polymerization reaction, and kneading are known (see Patent Document 3). .
３）スライドガラスなどの表面に接着あるいは粘着によって仕切りを張り合わせ、平板状の基板表面を容器部（容器）の底壁（底面）とするキュベットが利用化されている（特許文献４、５参照）。
細胞と基板材料との相互作用などを観察する場合、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられているが、底面はディッシュと一体になっており、表面処理の手法は限られてしまう。 When observing the interaction between cells and substrate materials, etc., a culture dish with surface treatment on the bottom surface is used, but the bottom surface is integrated with the dish, and surface treatment techniques are limited. .
一方、平板状の基板は、スピンコートや均一なプラズマ照射を含む様々な表面処理法に適応可能であるが、そのままの状態で固−液界面を観察するには、必要量の試料液体をその上に安定に保持することは困難である。 On the other hand, a flat substrate can be applied to various surface treatment methods including spin coating and uniform plasma irradiation. However, in order to observe the solid-liquid interface as it is, a necessary amount of sample liquid is added. It is difficult to keep it stable on top.
スライドガラスなどの表面に接着あるいは粘着によって仕切りを張り合わせ、平板状の基板表面を容器底面とするキュベットが既に実用化されているが、あくまでアッセイを簡便に行うことを目的としたもので、材料表面に対する接着あるいは粘着による張り合わせでは、様々な表面処理に適用することは難しい。 Cuvettes with a flat plate surface on the bottom of the container have already been put into practical use by attaching partitions to the surface of glass slides, etc., but the purpose of this is simply to perform the assay. It is difficult to apply to various surface treatments by bonding or sticking to each other.
近年、組織工学や細胞工学などの分野において、特に細胞と基板材料との相互作用の精密な解析は重要な課題であり、基板材料の表面近傍の簡便な観察を実現する装置が、こうした分野の研究現場から強く求められている。本発明は、上記従来の問題を解決する新規な試料基板ホルダを実現することを課題とするものである。 In recent years, precise analysis of the interaction between cells and substrate materials has been an important issue in fields such as tissue engineering and cell engineering, and devices that enable easy observation of the vicinity of the surface of substrate materials have been developed in these fields. There is a strong demand from research sites. An object of the present invention is to realize a novel sample substrate holder that solves the above-described conventional problems.
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、平板状基板をそれが容器部の底壁となるようクランプ固定し、必要量の試料液体を内部に安定に保持できる試料基板ホルダを設計製作、これを用いて基板材料−試料液体界面近傍を簡便に観察しうることを見いだし、この知見に基づいて本発明をなすに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors can clamp and fix the flat substrate so that it becomes the bottom wall of the container portion, and can stably hold a necessary amount of sample liquid inside. The sample substrate holder was designed and manufactured, and it was found that the vicinity of the substrate material-sample liquid interface could be easily observed using this, and the present invention was made based on this knowledge.
具体的には、本発明は上記課題を解決するために、底部開口内周縁にフランジを有し、該フランジに試料基板を載置して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とし、上記基板の表面に付与された試料の観察が可能な構成であることを特徴とする試料基板ホルダを提供する。 Specifically, in order to solve the above-mentioned problem, the present invention has a flange on the inner periphery of the bottom opening, and the sample substrate is placed on the flange and fixed, whereby the sample substrate is used as a bottom wall. Alternatively, the present invention provides a sample substrate holder characterized in that two or more container portions can be formed and the sample applied to the surface of the substrate can be observed.
さらに、本発明は上記課題を解決するために、下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置して上部パーツを下部パーツに対して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とする試料基板ホルダを提供する。
Further, in order to solve the above-mentioned problems, the present invention is a sample substrate holder that includes a lower part and an upper part, and is capable of attaching and detaching a sample substrate, and is provided on the inner periphery of the bottom opening of the lower part. A flange on which a sample substrate can be placed is formed, and the sample substrate is placed on the flange and the upper part is fixed to the lower part, thereby making the sample substrate a
さらに、本発明は上記課題を解決するために、下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置し、パッキン及び筒部材を介して上記上部パーツを下部パーツに固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能としたことを特徴とする請求項１記載の試料基板ホルダ。
Further, in order to solve the above-mentioned problems, the present invention is a sample substrate holder that includes a lower part and an upper part, and is capable of attaching and detaching a sample substrate, and is provided on the inner periphery of the bottom opening of the lower part. A flange on which a sample substrate can be placed is formed, the sample substrate is placed on the flange, and the upper part is fixed to the lower part via a packing and a cylindrical member. 2. The sample substrate holder according to
さらに、本発明は上記課題を解決するために、試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を培養し、観察し、又は培養及び観察をすることを特徴とする試料基板ホルダの利用方法を提供する。 Furthermore, in order to solve the above-mentioned problems, the present invention fixes a substrate provided with cells as a sample to the lower part of the sample substrate holder as a bottom wall, and cultures, observes, or cultures and observes the cells. A method of using a sample substrate holder is provided.
さらに、本発明は上記課題を解決するために、試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を下方から観察することを特徴とする試料基板ホルダの利用方法を提供する。 Further, in order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a sample substrate holder characterized by fixing a substrate to which a sample cell is attached as a bottom wall to a lower portion of the sample substrate holder, and observing the cell from below. Provide usage.
本発明に係る試料基板ホルダよると、あらゆる表面処理を施した試料基板表面と試料液体の界面近傍を簡便に観察することが可能となる。 With the sample substrate holder according to the present invention, it is possible to easily observe the vicinity of the interface between the sample substrate surface and the sample liquid subjected to any surface treatment.
本発明に係る基板ホルダを実施するための最良の形態を実施例に基づいて図面を参照して、以下説明する。 The best mode for carrying out a substrate holder according to the present invention will be described below with reference to the drawings based on the embodiments.
本発明に係る試料基板ホルダ１は、図１（ｂ）に示すような容器部７を有する。試料基板３を、それが容器部７の底壁となるようにクランプで固定する構造を有し、容器部７の内部で試料基板３上に必要量の試料液体を安定に保持しつつ、試料基板３と試料液体の界面近傍を簡便に観察することを可能にするものである。
The
試料基板ホルダ１は、図１（ａ）に示すように、その下部パーツ１’に開口２を有する。この開口２の内周縁に沿ってフランジ２’が形成されている。試料基板３を、フランジ２’上に載置して試料基板ホルダ１の底部にはめ込み、開口２を封止する底壁とすることができる。
As shown in FIG. 1A, the
さらに、試料基板３の上からパッキン４を介して筒状パーツ５、上部パーツ６の順に載せ、下部パーツ１’と上部パーツ６をボルト６’をねじ込んでクランプ（締め込み）し、筒状パーツ５をパッキン４を介して試料基板３に押しつけて固定できる。これにより、試料基板３を底壁とし、筒状パーツ５およびパッキン４を内壁とする容器部７が構成される。
Further, the cylindrical part 5 and the
試料基板ホルダ１の全体形状および開口２の形状は、一般的な培養ディッシュと同様に円状であってもよく、また顕微鏡の観察ステージへの固定が便利なように矩形状であってもよい。
The overall shape of the
さらに、パッキン４、筒状パーツ５、上部パーツ６の一部または全部は一体化されていてもよく、下部パーツ１’と上部パーツ６のクランプ（締め込み）による固定は、ねじ、バネ、挟み込み、接着、引圧、磁力など何によってもよい。
Furthermore, the packing 4, the cylindrical part 5, and the
また、本発明に係る試料基板ホルダ１は、試料基板３を取り付けることにより、図２ａに示すように、一般的な培養ディッシュと同様１つの容器部８を形成する構成であってもよく、また、図２ｂに示すように、プレートリーダなどによる解析に便利なように多数の容器部９を形成する構成であってもよい。
In addition, the
本発明の試料基板ホルダ１に固定される試料基板３は、ガラス、プラスチック、無機結晶など様々な材質のものが使用可能であり、培養前に容器部８を形成する際に、クランプ固定されるため、キャスト法、スピンコート法、化学修飾、表面グラフト重合、ＣＶＤ、プラズマ照射、ラビングなど、材料表面に施される処理を選ばない。
The sample substrate 3 fixed to the
上部パーツ６及び下部パーツ１’の試料基板ホルダ１を構成する材料としては、金属、ガラス、セラミクス、樹脂が使用可能であり、その材料によって様々な有機溶剤や酸・アルカリ溶液、細胞培養培地を試料液体に用いること、試料基板ホルダ１全体にオートクレーブ、紫外線照射、オゾン処理といった滅菌処理を施すことも可能である。
As the material constituting the
図３は、本発明の実施例の変形例であり、表面が平滑な試料基板１０を光導波用プリズム１１と一体に組み合わせることにより、界面のごく近傍のみにおける情報を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を含む全反射減衰（ＡＴＲ）法を用いて検出することも可能とする構成である。
FIG. 3 shows a modification of the embodiment of the present invention. By combining the
（作用）
以上の構成から成る本発明に係る試料基板ホルダ１の作用を以下に説明する。具体的には、試料基板ホルダ１を利用した細胞の培養法および観察法について説明する。
(Function)
The operation of the
まず、本発明の試料基板ホルダ１に任意の表面処理を施した試料基板３を、それが容器部７の底壁となるよう固定、これを細胞培養のための容器とする。この容器に上に述べた必要な滅菌処理を施し、培地とともに培養する細胞を容器部７内に播種する。
First, a sample substrate 3 obtained by subjecting the
播種された細胞は試料基板３の表面上で培養され、細胞が基板３の表面と相互作用する様子は、任意のタイミングで倒立型の光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型レーザー顕微鏡などを用いて、上方又は下方から観察することができる。 The seeded cells are cultured on the surface of the sample substrate 3, and the state in which the cells interact with the surface of the substrate 3 is determined using an inverted optical microscope, a fluorescence microscope, a scanning laser microscope, etc. at an arbitrary timing. It can be observed from above or below.
なお、図３に示す変形例では、表面が平滑な試料基板１０を光導波用プリズム１１と一体に組み合わせることにより、界面のごく近傍のみにおける情報を全反射減衰ATR法を用いて検出することも可能である。
In the modification shown in FIG. 3, by combining the
光導波用プリズム１１に導かれたプローブ光１２が、試料基板ホルダ１の容器部に満たされた試料液体１３と試料基板１０の界面で全反射する際に、界面から数１０〜数１００ｎｍの範囲に近接場光が発生する。それが近接場光が発生している領域に存在する物体によって散乱され、上方及び下方のいずれか一方又は両方から検出器１３（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型レーザー顕微鏡等）によって検出される。
When the
（実験例）
さらに、本発明に係る試料基板ホルダ１８を利用した実験例を図４を参照して説明する。ステンレス製の矩形下部パーツ１４および上部パーツ１５、パイレックス（登録商標）ガラス製の筒状パーツ１６を製作し、テフロン（登録商標）製のＯリングをパッキン１７とし、光応答性材料で表面処理を施したガラス基板を試料基板１８として内部で細胞培養が可能な容器部１９を構成した。このような試料基板ホルダ１８を６セット用意した。
(Experimental example)
Further, an experimental example using the
組上がった試料基板ホルダ１をオートクレーブで滅菌したのち、培地・血清とともに足場依存性細胞をそれぞれの容器部１９内部に播種、ポリメチルペンテン製のふた２０でふたをして、容器部１９内で培養した。
After the assembled
それらにおいて、試料基板１８が試料基板ホルダ１に完全に固定されていること、下部パーツ１４が矩形で顕微鏡ステージに一意的に固定されることにより、適時、容器部１９から取り出された各試料基板ホルダ１について、試料基板１８上の特定の視野をその都度、位置再現性が良く顕微鏡で観察することができた。
In each of them, the
以上、本発明に係る試料基板ホルダ１を実施例に基づいて説明したが、本発明はこのような実施例に限定されることなく、特許請求の範囲記載の技術的事項の範囲内で、いろいろな実施の形態があることは言うまでもない
The
本発明に係る試料基板ホルダは以上の構成であるから、細胞と基板材料との相互作用の精密な解析のために基板材料の表面近傍の簡便な観察技術が望まれている組織工学や細胞工学などの分野において、特に適している。 Since the sample substrate holder according to the present invention is configured as described above, a simple observation technique near the surface of the substrate material is desired for precise analysis of the interaction between the cell and the substrate material. It is particularly suitable for such fields.
１ 試料基板ホルダ
１’ 下部パーツ
３ 試料基板
７、８、９、１９ 容器部
２ 下部パーツの開口
２’ 開口のフランジ
１０ 試料基板
１１ 光導波用プリズム
１２ プローブ光
１３ 試料液体
１４ 矩形下部パーツ
１５ 上部パーツ
１６ 筒状パーツ
１７ パッキン
１８ 試料基板ホルダ
２０ ふた
1 Sample substrate holder
1 'Lower part
3 Sample substrate
7, 8, 9, 19 Container part
2 Opening of the lower part
2 'Open flange
10 Sample substrate
11 Optical waveguide prism
12 Probe light
13 Sample liquid
14 Rectangular lower part
15 Upper parts
16 Tubular parts
17 Packing
18 Sample substrate holder
20 lids
Claims (2)
上記下部パーツの底部開口内周縁に上記試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置して上記上部パーツを上記下部パーツに対して固定することで、該試料基板を底壁とした容器部を形成可能とし、
上記試料基板は、光導波用プリズムと一体に組み合わせて成り、上記試料基板の表面に付与された試料の観察が可能な構成であることを特徴とする試料基板ホルダ。 A sample substrate holder that includes a lower part and an upper part and is capable of attaching and detaching a sample substrate,
A flange capable of mounting the sample substrate is formed on the inner periphery of the bottom opening of the lower part, and the upper substrate is fixed to the lower part by mounting the sample substrate on the flange. By this, it is possible to form a container part with the sample substrate as a bottom wall,
A sample substrate holder, wherein the sample substrate is integrally combined with an optical waveguide prism, and is configured to allow observation of a sample applied to the surface of the sample substrate.
上記光導波用プリズムによって導いたプローブ光を、上記試料基板の表面に付与された試料と試料基板の界面で全反射させて、該界面から近接場光を発生させることを特徴とする試料基板ホルダの利用方法。A sample substrate holder characterized in that the probe light guided by the optical waveguide prism is totally reflected at the interface between the sample and the sample substrate applied to the surface of the sample substrate to generate near-field light from the interface. How to use
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| JP2005151866A (en) | 2005-06-16 |
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