JP4060929B2

JP4060929B2 - Bioactive peptide

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Publication number: JP4060929B2
Application number: JP05839998A
Authority: JP
Inventors: 幸一鈴木; 弘正田中; 研二佐藤
Original assignee: Iwate Prefectural Government
Current assignee: Iwate Prefectural Government
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1998-03-10
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2018-03-10
Also published as: JPH11255799A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫の休眠成虫から得られる新規な生理活性ペプチド又はその塩に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌その他の異物を昆虫に接種したり、単に昆虫の体表を傷つけるなどの物理的刺激を加えると、体液中に様々な抗菌性ペプチドが誘導されることが知られているが、一方、誘導とは関係なく本来的に昆虫の体液中に存在する抗菌性ペプチドも知られている［Rao, A. G. : Mol. Plant-Microbe Interact., 8 : 6 (1995)］。これらの抗菌性ペプチドは、抗体生産能を持たない昆虫にとって、細菌（グラム陰性細菌、グラム陽性細菌等）や菌類（かび、きのこ等）による感染を防ぐために重要な役割を担っているものと考えられている。
【０００３】
昆虫起源の抗菌性ペプチドのうち抗菌類活性を示し化学構造と諸性質が明らかにされているものには、例えば、センチニクバエ（Sarcophaga peregrina）由来の抗菌類タンパク質［Antifungal Protein (AFP)］［Iijima, R. et al. : J. Biol. Chem., 268 : 12055 (1993)］、Holotrichia diomphalia（コガネムシ科に属する昆虫）由来のホロトリシン３（Holotricin３）［Lee, S. Y. et al. : Biol. Pharm. Bull., 18 : 1049 (1995)］、チャイロコメノゴミムシダマシ（Teneblio molitor）由来のテネシン３（Tenecin 3）［Jung, Y. H. et al. : Mol. Cells, 5 : 287 (1995)］、およびショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のドロソマイシン（Drosomycin）［Fehlbaum, P. et al. : J. Biol. Chem., 269 : 33159 (1994)］がある。
【０００４】
また、植物においても、種子、花、葉その他の組織における抗菌類ペプチドの存在が明らかにされ、その多くが分離・精製され化学構造と諸性質が明らかにされている［Rao, A. G. : Mol. Plant-Microbe Interact., 8 : 6 (1995)およびBroekaert, W. F. et al. : Plant Physiol., 108 : 1353 (1995)］。植物起源の抗菌類ペプチドは、植物の病原性菌類に対する防御機構に関与するペプチドの一つとして役立っているものと考えられている。
しかしながら、これまでに知られている全ての昆虫由来の抗菌性ペプチドは、代謝活性が活発な発育期にある幼虫、蛹または成虫から見出されたものであり、発育が停止し代謝活性が著しく低下した状態にある休眠中の幼虫、蛹または成虫からの抗菌性ペプチドは全く知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、休眠中の昆虫からの生理活性ペプチド又はその塩を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、甲虫目コレオプテラ（Coleoptera）に属する昆虫、とりわけコガタルリハムシ（Gastrophysa atrocyanea）の休眠成虫に特異的に存在する新規なペプチドを分離・精製することに成功し、さらに、このペプチドが意外にも植物病原性菌類に対して発育阻止活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の生理活性ペプチド又はその塩である。
(a) 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含む生理活性ペプチド
(b) 配列番号１で表わされるアミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ抗菌活性をもたらす生理活性ペプチド
【０００８】
さらに、本発明は、甲虫目に属する昆虫の磨砕物又は体液から前記生理活性ペプチド又はその塩を採取することを特徴とする生理活性ペプチド又はその塩の製造方法である。甲虫目に属する昆虫としては、例えばコガタルリハムシ（Gastrophysa atrocyanea）が挙げられる。
さらに、本発明は、前記生理活性ペプチド又はその塩を有効成分として含む抗菌剤である。
さらに、本発明は、前記生理活性ペプチド又はその塩に対する抗体である。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の生理活性ペプチドは、上述のように、既に報告されている他の昆虫起源の抗菌性ペプチドとは異なり、発育が停止し代謝活性が著しく低下した状態にある休眠期間の成虫中に存在するものである。そして、本発明の生理活性ペプチドは、各種植物病原菌に対して広い抗菌スペクトルを有する新規な抗菌性ペプチドである。また、本発明の生理活性ペプチドは、昆虫、特に甲虫目に属する昆虫の休眠成虫の全体、胸腹部又は脂肪体と適当な溶媒との磨砕物、あるいは体液から採取することにより得ることができる。
【００１１】
１．ペプチドの精製
本発明の生理活性ペプチド又はその塩（「本ペプチド」ともいう）の採取源となる生物は昆虫であり、なかでも甲虫目コレオプテラ（Coleoptera）に属する昆虫が好ましい。甲虫目に属する昆虫としては、例えばハムシ科（Chrysomelidae）、コガネムシ科(Scarabaeidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)に属する昆虫が挙げられる。そして、ハムシ科に属する昆虫としてはコガタルリハムシ（Gastrophysa atrocyanea）、キスジノミハムシ(Phyllotreta striolata)などが挙げられ、コガネムシ科に属する昆虫としてはコガネムシ(Mimela splendens)やタイワンカブトムシ(Oryctes rhinoceros)などが挙げられ、ゴミムシダマシ科に属する昆虫としてはチャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)やコタヌストモドキ(Tribolium castaneum)などが挙げられる。
【００１２】
これらの昆虫の中では、特にコガタルリハムシが好ましい。なお、コガタルリハムシは、タデ科（Polygonaceae）の雑草、例えばエゾノギシギシ（Rumex obtusifolius）を好んで摂食する日本土着の昆虫であり、春になって休眠から覚醒した越冬成虫がこの雑草の葉に産卵し、孵化した幼虫は葉を食害しつつ成長して蛹となり、初夏に発生した新成虫は土に潜って休眠に入り、翌春まで越夏越冬することが知られている［内藤篤ら：「21雑草の生物的防除」，石井象二郎編昆虫学最近の進歩：312ページ,東京大学出版会(1981)］。
【００１３】
本発明の生理活性ペプチド又はその塩の採取源として対象となる昆虫は、前記昆虫の成虫であって休眠中のものが好ましい。「成虫」とは、発育の最終段階にある昆虫の形態を有するものであり、かつ、完成した運動機能、代謝機能、生理機能および生殖機能を有するものを意味する。また、「休眠」とは、内分泌機構の支配による自律的な発育休止状態のことをいう。従って、昆虫の発育にとって不利な環境条件（例えば、夏季、冬期、乾季）においては、昆虫が自らの発育を積極的に停止させ、休眠中の昆虫の運動機能と代謝機能は著しく低下している。本発明では、特に休眠中のコガタルリハムシ成虫が好ましい。
【００１４】
本発明の生理活性ペプチド又はその塩は、上記昆虫（休眠中の成虫）の全体、胸腹部または脂肪体と適当な抽出溶媒との磨砕物、あるいは体液を遠心分離して細胞を除去し、得られた上清を分離・精製工程に付すことにより得ることができる。
昆虫の全体、胸腹部または脂肪体と適当な抽出溶媒とを混合して磨砕するには、公知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、数頭の昆虫の体全体又は胸腹部若しくは脂肪体を乳鉢等に入れてすりつぶし、抽出溶媒を混合することにより磨砕物の懸濁液を得る。抽出溶媒としては、例えば、生理食塩水、酢酸、メチルアルコール等の水溶液等が挙げられる。
【００１５】
昆虫の体液は公知の任意の方法を用いて採取することができる。例えば、はさみ等を用いて内臓を損傷させずに皮膚を切り裂くことにより、あるいは腹足をハサミ等で切断することにより、又は腹足の基部に針を突き刺すことにより、浸出した体液を適当な容器に採取することができる。
本発明の生理活性ペプチド又はその塩の分離・精製には、一般のタンパク質やペプチドの分画と精製に慣用される様々な方法が適用される。例えば、前記磨砕物の懸濁液又は体液を遠心分離にかけ、細胞残骸や組織残骸を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、本発明の生理活性ペプチドを単離精製することができる。
【００１６】
本発明において、特にコガタルリハムシの休眠成虫を用いる場合は、例えば、TSK ODS-80Tsゲル（東ソー株式会社製）による逆相クロマトグラフィーによって活性成分を含む画分を分取し、この分取した画分について再び同ゲルによる逆相クロマトグラフィーを行い、活性成分を単一な物質に精製する方法が好適である。
精製されたペプチド又はその塩が抗菌活性を有するか否かの確認は、アルタナリア菌（Alternaria alternata）、灰色かび病菌（Botorytis cinerea）、いもち病菌（Magnaporthe grisea）などの植物病原菌の胞子の発芽が本発明のペプチドにより抑制されるか否かを調べることにより行うことができる。本発明では、例えば96穴マイクロプレートを使用する方法［Cammue, B. P. A. et al. : J. Biol. Chem., 267 : 2228 (1992)］によって行うことができるがこれに限定されるものではない。
【００１７】
すなわち、公知の濾過滅菌済み合成培地［Cammue, B. P. A. et al. : J. Biol. Chem., 267 : 2228 (1992)）］に胞子を懸濁させて得られる胞子懸濁液を96穴マイクロプレートの各穴に入れた後、本発明のペプチドを添加してインキュベートし、所定時間（例えば0時間目と48時間後）における595nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（BIO-RAD製、Model 3550-UV）を用いて測定する。得られた測定値（吸光度の経時変化）から、菌体の発育阻止率を計算する。
【００１８】
発育阻止率（%）は、以下の式により算出することができる。
発育阻止率（%）＝［(ΔC−ΔT)］／ΔC×100
ここで、ΔCは対照試料（本発明のペプチドを含まない被検液）における吸光度の変化（例えば48時間後の吸光度から0時間における吸光度を引いた値）、ΔTは被検液における吸光度の変化である。
【００１９】
なお、上記抗菌活性の測定方法は、本発明のペプチド又はその塩を精製する途中において、クロマトグラフィーの各画分が抗菌活性を有しているか否かを確認するためにも用いることができる。
精製後のペプチドの配列は、エドマン分解法等の公知手法を用いて決定することができる。通常は、島津製作所の自動アミノ酸分析装置により配列決定が行われる。
【００２０】
本発明のペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に例示するが、本発明のペプチドが抗菌活性を有する限り、当該アミノ酸配列の一部に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。ここで抗菌活性とは、静菌活性及び殺菌活性のいずれをも意味するものであり、対象となる菌を死滅させる活性及び増殖を抑制する活性の両者を含む。
【００２１】
一旦本発明のペプチドのアミノ酸配列が決定されると、その後は、通常行われているペプチド化学合成により本発明の生理活性ペプチド又はその塩を得ることができる。また、前記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩についても化学合成により得ることができる。
本発明のペプチド又はその塩としては、生理学的に許容される酸付加塩または塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
【００２２】
塩は、塩酸などの適切な酸、あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製し得る。なお、処理温度は０〜100℃であるが、室温が好ましい。
なお、本発明のペプチドの生化学的、物理化学的性質は、質量分析、核磁気共鳴、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等により分析することができる。
【００２３】
２．本発明のペプチドの化学合成
本発明のペプチド又はその塩の化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の常法手段によって合成できる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC 法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。
すなわち、本発明のペプチド又はその塩を構成し得るアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチド又はその塩が合成される。縮合方法や保護基の脱離としては、公知のいずれの手法を用いてもよい[例えばBodanszky, M and M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)、Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)、泉屋信夫他, ペプチド合成の基礎と実験, 丸善(1975)等を参照]。
【００２４】
反応後は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明のペプチド又はその塩を精製することができる。
また、本発明のペプチド又はその塩は、C末端が通常カルボキシル（-COOH)基又はカルボキシレート(-COO^-)であるが、C末端がアミド(-CONH₂)又はエステル(-COOR)であってもよい。ここで、エステルにおけるRとしては、炭素数１〜12のアルキル基、炭素数３〜10のシクロアルキル基、炭素６〜12のアリール基、炭素数７〜12のアラルキル基などが挙げられる。
さらに、本発明のペプチド又はその塩には、N末端のアラニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖ペプチドなどの複合ペプチド等も含まれる。
【００２５】
３．本発明のペプチドの遺伝子工学的手法による生産
本発明においては、本発明のペプチドを遺伝子工学的に設計し、得ることができる。
(1) 本発明のペプチドをコードするDNAの取得
本発明のペプチドをコードするDNA（「ダイアポジン遺伝子」又は「ダイアポジンDNA」ともいう）は、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記昆虫の細胞、組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAから得られるいずれのものでもよい。従って、例えば、本発明のペプチドの一部のアミノ酸配列をもとに設計された部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いて、昆虫から得られたDNAを鋳型としてPCR法によって増幅することにより、ダイアポジンDNAを得ることができる。
【００２６】
また、昆虫から得られたDNAを適当なベクターに組込み、これと、例えば³²P等で標識したダイアポジンDNA断片又は標識した合成DNAとのハイブリダイゼーションによってダイアポジンDNAを選別することができる。ハイブリダイゼーションは、公知の手法又はそれに準ずる手法に従って行うことができる[例えば Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]。
さらに、前記昆虫の細胞、組織より全RNA又はmRNA画分を調製し、これらのRNAを用いたRT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)によって増幅することもできる。
【００２７】
本発明のダイアポジンDNAとしては、当該ダイアポジンをコードするDNA、又はダイアポジンDNAの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ本発明のペプチド又はその塩と同質の活性をもたらすペプチドをコードするものが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が１〜1000mM、好ましくは10〜300mMであり、温度が40〜70℃、好ましくは65℃での条件をいう。
本発明では、ダイアポジンDNAに変異を導入して発現させ、本発明のペプチド又はその塩と実質的に同質の変異ペプチド又はその塩を作製することもできる。この場合は、部位特異的突然変異誘発法（例えばMutant-K(宝酒造社）やMutant-G(宝酒造社）)などを用いて、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法によりDNAに変異を導入することができる。
【００２８】
(2) 組換えベクター及び形質転換体の作製
(i) 組換えベクターの作製
クローン化されたDNAは、そのまま又は所望により適当な制限酵素で消化し、あるいは適当なリンカーを連結して使用することができる。これらのDNAを適当なベクターに連結(挿入)することにより組換えベクターを得る。DNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pBluescript II SK+/-、pGEM4、pSP64、pSP65等が挙げられる。また、ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、M13mp19 、λgt10等が挙げられる。
【００２９】
ベクターにダイアポジンDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明におけるダイアポジンDNAは、そのDNAの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、ダイアポジンDNAのほか、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合配列、スプライシングシグナル、選択マーカー等を組み込んでもよい。この場合、ターミネーターとしてはSV40が挙げられ、リボソーム結合配列としてはlacZが挙げられ、選択マーカーとしてはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３０】
(ii)形質転換体の作製
本発明において、形質転換体は、発現用組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
ここで、宿主としては、ダイアポジンDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、若しくはリゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)若しくはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞若しくはCHO細胞等の動物細胞、又はSf9若しくはSf21等の昆虫細胞等が挙げられる。
【００３１】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、ダイアポジンDNAを含む組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ダイアポジンDNA、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモーター、P_Rプロモーターなどの、大腸菌又はファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００３２】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 69: 2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばYEp13、YEp24、YCp50等が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、GAPプロモーター等が挙げられる。
【００３３】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. and L.Guarente : Methods. Enzymol., 194：182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H. et al.:J. Bacteriol., 153: 163(1983)]等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNA1.1/Amp、pcDNA1.1(いずれもInvitrogen社)、pSI Vector、pCI Vector (いずれもPromega社)等が用いられる。この場合、プロモーターとしてヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００３４】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpVL1392、pVL1393(いずれもInvitrogen社)、pMBac(Stratagene社)、pBacPAK8/9(Clontech社)等が用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３５】
(iii) 本発明の生理活性ペプチドの生産
本発明の生理活性ペプチドは、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３６】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、NZアミン等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用いられる。
【００３７】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30℃で24〜96時間行う。培養期間中、ｐＨは5.0〜8.0に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００３８】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％CO₂存在下、20〜30℃で１〜７日行う。
培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium[Grace, T.C.C. Nature, 195:788, (1962)]に10％ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどが挙げられる。培地のpHは6.0〜7.0に調製し、通常25℃で１〜７日培養を行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
【００３９】
培養後、本発明のペプチド又はその塩が菌体内又は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕する。一方、本発明のペプチド又はその塩が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を得る。そして、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清中）から本発明の生理活性ペプチド又はその塩を単離精製することができる。
【００４０】
４. 抗菌剤
本発明の抗菌性ペプチド又はその塩は、その抗菌スペクトルが広いため、抗菌剤として有用である。さらに、本発明の抗菌性ペプチドは、植物病原菌に対してその抗菌作用を有するため、特に植物病原性菌類に対する抗菌剤として有用である。
また、本抗菌性ペプチド又はその塩は他の農薬と組み合わせた形態、例えば、殺菌剤(イネ害虫用殺虫剤等)との組み合わせによる殺虫殺菌剤、植物成長調整剤(イネ矮化剤等)との組み合わせによる殺菌植物調整剤としての形態等で使用することができる。すなわち、本抗菌性ペプチド又はその塩は、それ単独で、あるいは適当な液体、固体又は気体の担体と組み合わせて使用することができる。さらに必要に応じて、液化ガス、噴射剤(フレオン等)、表面活性剤(乳化剤、分散剤、消泡剤等)等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤、粒剤、液剤等の製剤として使用することもできる。
【００４１】
製剤に使用する液体担体としては、例えば、キシレン、トルエン、ベンゼン、アルキルナフタレン等の芳香族炭化水素；クロロベンゼン、クロロエチレン、塩化メチレン等の塩素化芳香族炭化水素；シクロヘキサン、パラフィン等の脂肪族炭化水素；鉱油留分；エタノール、ブタノール、グリコール等のアルコール及びこれらのエーテル類ならびにエステル；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶剤が挙げられ、これらの1種又は２種以上を混合して使用することができる。水が溶剤として用いられる場合、純水、または無機塩類(塩化ナトリウム、塩化カリウム等)、糖(グルコース、ショ糖等)若しくは糖アルコール(Ｄ-ソルビトール、Ｄ-マンニトール等)の水溶液を用いることができる。
【００４２】
また、製剤に使用する固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、高分子性天然物(結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等)が挙げられ、これらの1種又は２種以上を混合して使用することができる。
乳化剤、消泡剤、分散剤等として使用される表面活性剤としては、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート、アルブミン加水分解物、リグニン-亜硫酸廃液、メチルセルロース、アラビアゴム等が挙げられる。
【００４３】
有効成分である本発明の抗菌性ペプチドは、乳剤では0.1〜95重量％、水和剤では0.1〜60重量％、粒剤では0.1〜60重量％であるが、使用目的によってはこれらの濃度は適宜変更してもよい。乳剤、水和剤の場合には、使用に際して水で希釈して、0.0001〜10重量％とすることができ、好ましくは0.01〜１重量％とすることができる。
本発明の抗菌剤は、噴霧法、ミスト法、ダスト法、散布法、注入法等を用いて、植物病原菌に侵された植物に直接投与してもよく、あるいは植物病原菌による汚染土壌に直接投与してもよい。使用方法は、使用目的に基づいて選択されるが、いずれの場合にも本発明の抗菌性ペプチドが可能な限り均一に分散されることが望ましい。
本発明の抗菌剤の使用量は、その使用方法により異なるが、例えば、噴霧法の場合、10ａ当たり、有効成分量で１〜1000ｇ噴霧するのが好ましい。
【００４４】
本発明の抗菌性ペプチドを抗菌剤として使用すべき対象となる植物病原性菌類としては、アルタナリア菌、灰色かび病菌、いもち病菌等が挙げられる。これらの植物病原性菌は具体的には、アルタナリア菌はリンゴ(Malus domestica)、ナシ(Pyrus L.)、イチゴ(Fragaria ananassa)、及びタバコ(Nicotiana tabacum)等の栽培植物を侵す病原菌であり、灰色かび病菌はキュウリ(Cucumis sativus)、トマト(Lycopersicon esculentum)、ピーマン(Capsicum annum)、レタス(Lactuca sativa)、イチゴ(Fragaria ananassa)、ブドウ(Vitis L.)、スターチス(Limonium Mill.)、トルコギキョウ(Eustoma grandiflorum)、リンドウ(Gentiana L.)、タバコ(Nicotiana tabacum)、及びホップ(Humulus luplus)等の栽培植物を侵す病原菌であり、いもち病菌はイネ(Oryza sativa)などの栽培植物を侵す病原菌である。従って、これらの病原菌による病害を防除または予防することを目的として、前記植物に本発明ペプチドを含有する抗菌剤を使用することが好適である。
【００４５】
さらに、本発明の抗菌性ペプチドは、例えば、真菌性疾患に対する薬剤としても使用することができる。その場合は、投与の剤型及びその投与量については、被検体(ヒト及び動物を包含する)及び疾患の種類、症状等を勘案して、本発明による抗菌効果が認められる限り任意の選択が可能である。例えば投与量は、約0.001〜約10mg/kg体重であり、好ましくは、約0.025〜約0.5mg/kg体重である。
【００４６】
５．食品及び飼料添加物
さらに、本発明の抗菌性ペプチドは、胃や腸に存在するタンパク質分解酵素により容易に分解されるため、少なくとも結果的に経口投与されるときには、その毒性はほとんどないと考えられる。したがって、本発明の抗菌性ペプチドは、食品又は飼料添加物として利用することができる。例えば、本ペプチドを、固体のまま、または液体好ましくは水に適切な濃度になるように溶解し、食品または飼料に、例えば、混合、浸漬、塗布、噴霧等の方法で添加し得る。その結果、本ペプチドは、食肉、魚、野菜等の生鮮食品又は加工食品、あるいは豆粉、魚粉飼料等の飼料のかび等の発生を防ぐことができる。例えば有効成分である本発明抗菌性ペプチドを水溶液として用いる場合、0.0001〜１重量％、好ましくは0.001〜0.1重量％とすることができる。
【００４７】
６．本発明のペプチドをコードするDNAの植物体への導入
さらに、遺伝子工学的手法を用いて本発明の抗菌性ペプチドをコードするDNAを植物宿主に導入することによって、植物病原菌、特に植物病原性菌類に対する抵抗性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。従って、遺伝子工学的手法による栽培植物への本抗菌性ペプチド遺伝子の導入は、植物を植物病原性菌類から防護するための有効な手段となる。なお、遺伝子は、前記３.において調製されたDNAを用いることができる。
ここで、植物宿主とは、前記栽培植物の植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
【００４８】
植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、本発明のペプチドをコードするDNAは、採取した植物切片にベクターをアグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルボンバードメント法、又はポリエチレングリコール法で導入し、植物宿主を形質転換することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物を作製することもできる。
形質転換の結果得られるシュート、毛状根などは、細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。
【００４９】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、培養細胞に、本発明のペプチドをコードするDNAを有するベクターをエレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法若しくはパーティクルガン法、あるいはポリエチレングリコール法で導入し、以下、前記と同様にして細胞培養、組織培養、器官培養及び植物体を得ることができる。
【００５０】
７．本発明のペプチドに対する抗体
本発明においては、本発明のペプチドに対する抗体を作製することもできる。
「抗体」とは、抗原である本発明のペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片(例えば、FabまたはF(ab')₂断片)を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照]。
【００５１】
(1)本発明の抗菌ペプチドに対するポリクローナル抗体の作製
前記のようにして天然物から精製又は化学合成した本発明のペプチド又はその断片を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは、0.1〜10mgであり、アジュバントを用いるときは、１〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜60日後に、好ましくは、酵素免疫測定法(EIA； enzyme immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に、採血し、抗血清を得る。抗血清から、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５２】
(2)本発明の抗菌ペプチドに対するモノクローナル抗体の作製
(ｉ) 抗体産生細胞の採取
前記のようにして天然物から精製又は化学合成した本発明のペプチド又はその断片を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは、0.1〜10mgであり、アジュバントを用いるときは、１〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜10日後、好ましくは、３日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、抹消血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５３】
(ii)細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、 P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、Sp2/O、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００５４】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１×10⁹個/mlの抗体産生細胞と１×10⁸個/mlのミエローマ細胞とを等容量混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1,500ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００５５】
(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×10⁵個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５６】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって行うことができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００５７】
(iv)モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％CO₂濃度)で２〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×10⁷個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集する。
【００５８】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
このようにしてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が得られた後は、これをリガンドとして、固体担体に結合させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製し、そして該カラムを用い、前記の採取源又は他の採取源から、本発明のペプチドを精製することができる。さらにこれらの抗体は本発明のペプチドを検出するためにウエスタンブロッティングに用いることもできる。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕抗菌性ペプチドの分離・精製
6.25頭相当（約100mg）のコガタルリハムシ休眠成虫（１ヵ月後）を、300μlの90%メチルアルコール溶液（メチルアルコール：水：酢酸＝90：9：1）とともに氷冷下で磨砕した後、4℃で10,000×g／20分間の遠心分離に供した。得られた透明な上清を遠心乾燥して溶媒を除去し少量の超純水に再溶解した後、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡化しておいたTSK ODS-80Tsゲル（東ソー株式会社，4.6 × 250 mm）による一回目の逆相カラムクロマトグラフィーに供した。
【００６０】
溶出は、0.1%トリフルオロ酢酸でカラムを洗浄した後、0%→99.9%アセトニトリル／0.1%トリフルオロ酢酸（流出速度＝1ml／分）という溶出条件で行った。210nmでの吸光度を指標にして、各ピークに対応する画分を採取し、それぞれの画分の少量を遠心乾燥し、実施例３に記載の方法により抗菌活性の存在を確認した。その結果、抗菌活性を有する画分を得ることができた（図１、矢印のピーク＝600μl，保持時間＝約33分）。その活性画分をTris-TRICINE SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS電気泳動ともいう)にかけたところ、分子量7.9kDaの位置に主要バンドが検出された(図２、矢印)。
このようにして分子量7.9kDaのペプチドを含むことが明らかとなったピークについてそれを分取し、流出速度を0.5ml／分とした以外は一回目と同じ溶出条件で二回目の逆相カラムクロマトグラフィーに供した。
【００６１】
その結果、図３に示したように、矢印の部分に単一のピーク（600μl，保持時間＝約50分）が表れ、この画分をSDS電気泳動にかけたところ、分子量7.9kDaの純粋なペプチドが得られたことが確認された（図４、矢印）。この矢印のピークを分取し、遠心乾燥して溶媒を除去することにより、29.5mgのペプチドを得た。その少量について、実施例３に記載の方法により抗菌活性を調べたところ、高い抗菌活性の存在を確認し、前記の分子量7.9kDaのペプチドが本発明の抗菌ペプチドであることを同定した。このようにして得られた抗菌ペプチドをダイアポジン（diapausin）と命名した。
得られた精製抗菌ペプチドを遠心乾燥して溶媒を除去し、抗菌活性の測定［後述の実施例３参照］に供するまで−20℃に保存した。なお、本抗菌ペプチドはインシュリンを標準とするビシンコニン酸法[Smith, P.K. et al.:Anal. Biochem., 150:76(1985)]によって定量した。
【００６２】
〔実施例2〕ダイアポジンの生化学的性質の分析
(1) アミノ酸配列の分析
実施例１で分離・精製したダイアポジンをエドマン分解［Edman, P. : Acta Chem. Scand., 10 : 761 (1956)］にかけ、生じたPTH-アミノ酸をアミノ酸配列自動分析機（島津製作所製、PPSQ-21）によって分析した。なお、システイン（Cys）については、4-ビニルピリジンと反応させ［Krull, I. et al. : Anal. Biochem., 40 : 80 (1971)］、生じたS-ピリジルエチル−システンをアミノ酸配列自動分析機によって分析した。
その結果、41個のアミノ酸から成るダイアポジンのアミノ酸配列が下記のように決定された（配列番号１）。
【００６３】

【００６４】
アミノ酸配列に基づいて算出したダイアポジンの分子量4,467Daは、MALD-TOF MSスペクトルによるダイアポジンの平均分子量4,466Da（最大誤差0.1%）と一致した。
【００６５】
(2) 休眠成虫体内におけるダイアポジンの局在部位の分析
コガタルリハムシ休眠成虫（１ヵ月後）について、その全体、組織（脂肪体、消化管、脳および精巣）または体液を以下の方法で分析し、休眠成虫体内におけるダイアポジンの局在部位を調べた。
全体または各組織を３倍量（v/w）の試料用緩衝液［5mM EDTA, 1mM 弗化フェニルメチルスルフォニル (PMSF), 1mMベンズアミジン (benzamidine), 1μg/mlペプスタチンA (pepstatin A), 1μg/mlロイペプチン (leupeptin), 62.5mM Tris-HCl, pH 6.8］［Deutscher, M. P. : Methods in Enzymol., 182 : 83 (1990)］とともに氷冷下で磨砕し、4℃で10,000×g／20分間の遠心分離に供して上清を得た。また、休眠成虫（100頭）の体液を、あらかじめ体液の褐変化防止のためのフェニルチオ尿素粉末を入れた1.5mlチューブに氷冷下で採取した。採取した体液（約100μl）を4℃で10,000×g／20分間の遠心分離に供して血球成分を除去し、上清を得た。
【００６６】
このようにして得られた各上清（ペプチド試料）について、全体磨砕物（0.2頭相当）、体液（0.5頭相当）、脂肪体磨砕物（0.5頭相当）、消化管磨砕物（4頭相当）、脳磨砕物（４頭相当）、および精巣磨砕物（４頭相当）の上清を、16.5%ポリアクリルアミドゲル（縦80×横90mm，厚さ1mm，溝12箇所）によるTris-TRICINE SDS電気泳動［Laemmli, U. K. : Nature, 227 : 680 (1970)］に供した。
【００６７】
一方、実施例１において精製されたダイアポジンを、フロイント不完全アジュバント[日本生化学会編、新生化学実験講座12：３ページ、東京化学同人(1992)]とともに、白兎に注射し (0.1mg/匹)、30日後に追加免疫を行った。次に、追加免疫後40日目の白兎から採血し、硫安塩析の後、プロテインＡ-Sepharose(Pharmacia製)アフィニティークロマトグラフィーにかけ、抗体を精製した。得られた抗体を用いて、ウェスタンブロッティング［Towbin, H. T. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 4350 (1979)］によるダイアポジンの検出に供した。
【００６８】
なお、SDS電気泳動ゲル中のペプチドは、0.125%クーマジーブリリアントブルーR-250によって染色した。
その結果、図５に示したように、ダイアポジンの抗体と特異的に結合する分子量7.9kDaのペプチド（矢印）が、休眠成虫において体液と脂肪体に検出され、消化管、脳および精巣には検出されなかった。これらの結果より、分子量7.9kDaのペプチド（ダイアポジン）は、休眠成虫の主として体液と脂肪体に局在することが判明した。
【００６９】
(3) 成虫体内におけるダイアポジンの休眠前後における増減の分析
コガタルリハムシについて、6.25頭相当の休眠前成虫（羽化１日後）、休眠成虫（１ヵ月後）、または越冬成虫（４月下旬頃）の全体（約100mg）を(3)に記載の手法と同様にして、300μlの試料用緩衝液［5mM EDTA, 1mM 弗化フェニルメチルスルフォニル (PMSF), 1mMベンズアミジン (benzamidine), 1μg/mlペプスタチンA (pepstatin A), 1μg/mlロイペプチン (leupeptin), 62.5mM Tris-HCl, pH 6.8］とともに氷冷下で磨砕し、4℃で10,000×g／20分間の遠心分離に供した。
【００７０】
得られた上清（ペプチド試料）のタンパク量を、牛血清アルブミンを標準としてビシンコニン酸法で定量した。その後、タンパク量50μg相当の各上清を(２)に記載の手法と同じ条件でSDS電気泳動に供した。
その結果、図６に示したように、分子量7.9kDaのペプチド（ダイアポジン）（矢印）は、成虫体内において休眠前から休眠中にかけて出現し、越冬後には著しく減少することがわかった。
【００７１】
(4) 質量分析
実施例1で分離・精製したダイアポジンのMALD-TOF MSスペクトルを、質量分析機（島津製作所製、Kartos Kompact MALDI 4 V5.1.2. : + Linear High Power : 40）を使用し、Hillenkampらの方法［Hillenkamp, F. et al. : Anal. Chem., 63 : 1193A (1991)］で測定した。最大ピークの測定値からプロトン（H+）の質量＝１を除去して平均分子量を求めた。
その結果、SDS電気泳動によるダイアポジンの推定分子量は7.9kDaであったが、図７に示したように、分子量4467.3にピークが表れたことから、ダイアポジンの正確な平均分子量は4,466Da（最大誤差0.1%）であることが明らかとなった。なお、図７の2,233.8のピークはH2+によって荷電したダイアポジンのピークである。
【００７２】
〔実施例3〕ダイアポジンの抗菌活性の測定
植物病原性菌類に対する抗菌活性の測定は、96穴マイクロプレートを使用する方法［Cammue, B. P. A. et al. : J. Biol. Chem., 267 : 2228 (1992)］によって行った。すなわち、アルタナリア菌（Alternaria alternata）、灰色かび病菌（Botorytis cinerea）または、いもち病菌（Magnaporthe grisea）の胞子を濾過滅菌済み合成培地（Cammue, B. P. A. et al. : J. Biol. Chem., 267 : 2228 (1992)記載の２倍濃度）［K₂HPO₄(5mM), MgSO₄(100μM), CaCl₂(100μM), FeSO₄(10μM), CoCl₂(0.2μM), CuSO₄(0.2μM), Na₂MoO₄(4μM), H₃BO₃(1μM), KI (0.2μM), ZnSO₄(1μM), MnSO₄(0.2μM), グルコース (20g/l), L-アスパラギン (2g/l), L-メチオニン (40mg/l), myo-イノシトール (4mg/l), ビオチン (0.4mg/l), 塩酸チアミン (2mg/l), 塩酸ピリドキシン(0.4mg/l)］に懸濁させ、胞子懸濁液（2.5×10⁴胞子数/ml）を調製した。この胞子懸濁液（40μl）を96穴マイクロプレートの各穴に入れた後、実施例1で分離・精製したダイアポジンの水溶液（40μl）を加えて被検液とした。
【００７３】
対照として、ダイアポジンの水溶液の代わりに滅菌水（40μl）を加えたものを用いた。
その後、27℃でインキュベートし、0時間後と48時間後における595nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（BIO-RAD製、Model 3550-UV）を用いて測定した。得られた測定値から、菌体の発育阻止率を以下のように計算した。すなわち、対照における吸光度の変化（ΔC）から被検液における吸光度の変化（ΔT）を引き算して得られる数値のΔCに対する百分率、すなわち［(ΔC−ΔT)］／ΔC×100を算出して発育阻止率（％）とした。
被検液中の精製ダイアポジンの濃度を0〜800μg/mlと変化させたときの植物病原性菌類の発育阻止率を図８に示した。図８において、各点は［平均値（n＝2）±範囲］を表わす。図８から明らかなように、本発明のダイアポジンはA. alternata、 B. cinereaおよびM. griseaの３種病原性菌類に対して抗菌活性を示し、特にB. cinereaに対して強い抗菌活性を示すことがわかった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、抗菌活性を有する生理活性ペプチドが提供される。本発明の生理活性ペプチドは、植物病原菌、特に植物病原性菌類に対する殺菌剤として有用である。
【００７５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】逆相クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】 SDS電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】逆相クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】 SDS電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】 SDS電気泳動及びそれに続くウェスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。
【図６】 SDS電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】ダイアポジンの質量分析の結果を示す図である。
【図８】ダイアポジンの植物病原性菌類に対する抗菌活性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel physiologically active peptide or a salt thereof obtained from an insect dormant adult.
[0002]
[Prior art]
It is known that various antibacterial peptides are induced in body fluids when physical stimuli such as inoculating bacteria with insects or other foreign substances or simply damaging the body surface of insects are induced. Antibacterial peptides that are inherently present in the body fluid of insects are also known [Rao, AG: Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 6 (1995)]. These antibacterial peptides are considered to play an important role for preventing insects that do not have antibody-producing ability to prevent infection by bacteria (gram-negative bacteria, gram-positive bacteria, etc.) and fungi (molds, mushrooms, etc.). It has been.
[0003]
Among the antibacterial peptides derived from insects, the antibacterial activity and the chemical structure and properties of which have been clarified include, for example, the antibacterial protein (Atifungal Protein (AFP)) derived from Sarcophaga peregrina [Iijima , R. et al.: J. Biol. Chem., 268: 12055 (1993)], Holotricin 3 derived from Holotrichia diomphalia (Insectidae) [Lee, SY et al.: Biol. Pharm. Bull., 18: 1049 (1995)], Tenene 3 derived from Teneblio molitor (Tenecin 3) [Jung, YH et al .: Mol. Cells, 5: 287 (1995)], and Drosophila ( Drosomycin derived from Drosophila melanogaster [Fehlbaum, P. et al .: J. Biol. Chem., 269: 33159 (1994)].
[0004]
In plants, the presence of antibacterial peptides in seeds, flowers, leaves and other tissues has been clarified, and many of them have been isolated and purified, and their chemical structures and properties have been clarified [Rao, AG: Mol. Plant-Microbe Interact., 8: 6 (1995) and Broekaert, WF et al .: Plant Physiol., 108: 1353 (1995)]. Plant-derived antibacterial peptides are considered to be useful as one of the peptides involved in the defense mechanism against pathogenic fungi of plants.
However, all the antibacterial peptides derived from insects known so far have been found from larvae, pupae or adults in the developmental stage where metabolic activity is active, and the growth is stopped and the metabolic activity is remarkably high. No antibacterial peptides are known from dormant larvae, pupae or adults in a reduced state.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a physiologically active peptide or a salt thereof from a dormant insect.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have isolated a novel peptide that specifically exists in the dormant adults of the Coleoptera, particularly the insects belonging to the beetle leaf beetle (Gastrophysa atrocyanea). -It succeeded in refinement | purification, and also discovered that this peptide unexpectedly showed the growth inhibitory activity with respect to phytopathogenic fungi, and came to complete this invention.
[0007]
That is, the present invention is the following bioactive peptide (a) or (b) or a salt thereof.
(a) a bioactive peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(b) a physiologically active peptide comprising a sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and which provides antibacterial activity
[0008]
Furthermore, the present invention is a method for producing a physiologically active peptide or a salt thereof, which comprises collecting the physiologically active peptide or a salt thereof from a ground product or body fluid of an insect belonging to the order Coleoptera. Examples of insects belonging to the order Coleoptera include Gastrophysa atrocyanea.
Furthermore, the present invention is an antibacterial agent comprising the physiologically active peptide or a salt thereof as an active ingredient.
Furthermore, the present invention is an antibody against the physiologically active peptide or a salt thereof.
[0009]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As described above, the physiologically active peptide of the present invention is present in dormant adults in which the growth is stopped and the metabolic activity is significantly reduced, unlike the other antibacterial peptides of insect origin already reported. To do. The physiologically active peptide of the present invention is a novel antibacterial peptide having a broad antibacterial spectrum against various plant pathogens. In addition, the physiologically active peptide of the present invention can be obtained by collecting from the whole dormant adult insects belonging to the order of insects, particularly Coleoptera, thoracoabdominal region or fat body and a suitable solvent, or body fluid.
[0011]
1. Peptide purification
The organism from which the physiologically active peptide of the present invention or a salt thereof (also referred to as “the present peptide”) is collected is an insect, and an insect belonging to the order Coleoptera is particularly preferable. Examples of insects belonging to the order Coleoptera include insects belonging to the family Chrysomelidae, Scarabaeidae, and Tenebrionidae. Insects belonging to the beetle family include the beetle potato beetle (Gastrophysa atrocyanea), Kysujimi beetle (Phyllotreta striolata), and the insects belonging to the family Scarabaeidae include the beetle (Mimela splendens) and the Thai beetle (Oryctes rhinoceros). Examples of the insects belonging to the family include Tenebrio molitor and Tribolium castaneum.
[0012]
Among these insects, the leaf beetle is particularly preferable. The beetle leaf beetle is an indigenous Japanese insect that prefers to eat Polygonaceae weeds, for example, Rumex obtusifolius, and overwintering adults awakened from dormancy in the spring lay eggs on the leaves of this weed. It is known that the hatched larvae grow and become pupae while feeding on the leaves, and the new adults that emerged in early summer enter the diapause and go to dormancy, and overwinter over the next spring. [Atsushi Naito et al .: " “Biological control of 21 weeds”, edited by Jojiro Ishii. Recent progress in entomology: 312 pages, University of Tokyo Press (1981)].
[0013]
Insects to be used as a source for collecting the physiologically active peptide of the present invention or a salt thereof are preferably adult insects that are dormant. “Adult” means an insect that has the form of an insect in the final stage of development and has a completed motor function, metabolic function, physiological function, and reproductive function. In addition, “dormant” refers to an autonomous developmental suspending state under the control of the endocrine mechanism. Therefore, in environmental conditions that are unfavorable for insect growth (eg, summer, winter, dry season), insects actively stop their development, and the motor and metabolic functions of dormant insects are significantly reduced. . In the present invention, an adult beetle leaf beetle that is dormant is particularly preferred.
[0014]
The physiologically active peptide or salt thereof of the present invention is obtained by removing cells by centrifuging the whole insect (dormant adult), thoracoabdominal region or fat body and an appropriate extraction solvent, or body fluid. The obtained supernatant can be obtained by subjecting it to a separation / purification step.
Mixing and grinding the whole insect, thoracoabdominal region or fat body and an appropriate extraction solvent can be performed using any known technique. For example, the whole body of a few insects or the chest / abdomen or fat body are ground in a mortar or the like and mixed with an extraction solvent to obtain a suspension of the ground product. Examples of the extraction solvent include aqueous solutions of physiological saline, acetic acid, methyl alcohol, and the like.
[0015]
Insect body fluids can be collected using any known method. For example, by severing the skin without damaging the internal organs using scissors or the like, or by cutting the stomach foot with scissors or the like, or by piercing the needle at the base of the stomach foot, Can be collected.
Various methods commonly used for fractionation and purification of general proteins and peptides are applied to the separation and purification of the physiologically active peptide or salt thereof of the present invention. For example, the ground suspension or body fluid is centrifuged to remove cell debris and tissue debris, and then a general biochemical method used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, The physiologically active peptide of the present invention can be isolated and purified by using ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography or the like alone or in appropriate combination.
[0016]
In the present invention, in particular, when using a dormant adult beetle, for example, a fraction containing an active ingredient is fractionated by reverse phase chromatography using TSK ODS-80Ts gel (manufactured by Tosoh Corporation), and the fraction obtained is fractionated. It is preferable to perform reverse phase chromatography using the same gel again to purify the active ingredient into a single substance.
Whether the purified peptide or its salt has antibacterial activity is based on the germination of spores of phytopathogenic fungi such as Alternaria alternata, Botorytis cinerea and Magnaporthe grisea. This can be done by examining whether it is suppressed by the peptide of the invention. In the present invention, for example, a method using a 96-well microplate [Cammue, BPA et al .: J. Biol. Chem., 267: 2228 (1992)] can be used, but the present invention is not limited thereto.
[0017]
That is, a spore suspension obtained by suspending spores in a known filter-sterilized synthetic medium [Cammue, BPA et al .: J. Biol. Chem., 267: 2228 (1992)]] is a 96-well microplate. After adding the peptide of the present invention and incubating, the absorbance at 595 nm at a predetermined time (for example, 0 hour and 48 hours later) is measured with a microplate reader (BIO-RAD, Model 3550-UV). Use to measure. From the obtained measured value (change in absorbance over time), the growth inhibition rate of the bacterial cells is calculated.
[0018]
The growth inhibition rate (%) can be calculated by the following formula.
Growth inhibition rate (%) = [(ΔC−ΔT)] / ΔC × 100
Here, ΔC is the change in absorbance in the control sample (the test solution not containing the peptide of the present invention) (for example, the value obtained by subtracting the absorbance at 0 hour from the absorbance after 48 hours), and ΔT is the change in absorbance in the test solution. It is.
[0019]
The method for measuring antibacterial activity can also be used to confirm whether each fraction of chromatography has antibacterial activity during the purification of the peptide of the present invention or a salt thereof.
The sequence of the purified peptide can be determined using a known method such as Edman degradation. Usually, sequencing is performed by an automatic amino acid analyzer of Shimadzu Corporation.
[0020]
The amino acid sequence of the peptide of the present invention is exemplified in SEQ ID NO: 1. As long as the peptide of the present invention has antibacterial activity, mutations such as deletion, substitution, addition and the like may occur in a part of the amino acid sequence. For example, at least one of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids may be deleted, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 May be added with at least 1, preferably about 1-10 amino acids, more preferably 1-5 amino acids, or at least one of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably 1-10 Degree, more preferably 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids. Here, the antibacterial activity means both a bacteriostatic activity and a bactericidal activity, and includes both an activity for killing a target fungus and an activity for suppressing proliferation.
[0021]
Once the amino acid sequence of the peptide of the present invention has been determined, then the physiologically active peptide of the present invention or a salt thereof can be obtained by peptide chemical synthesis that is usually performed. A peptide consisting of an amino acid sequence having the mutation or a salt thereof can also be obtained by chemical synthesis.
The peptide of the present invention or a salt thereof is preferably a physiologically acceptable acid addition salt or basic salt. Acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, apple Examples thereof include salts with organic acids such as acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid. Examples of basic salts include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide and magnesium hydroxide, and salts with organic bases such as caffeine, piperidine, trimethylamine and pyridine. .
[0022]
Salts can be prepared using a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide. For example, it can be prepared by treatment using standard protocols in water or in a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane. The treatment temperature is 0 to 100 ° C., but room temperature is preferred.
The biochemical and physicochemical properties of the peptide of the present invention can be analyzed by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance, electrophoresis, high performance liquid chromatography and the like.
[0023]
2. Chemical synthesis of the peptides of the present invention
When the peptide of the present invention or a salt thereof is chemically synthesized, it can be synthesized by a conventional means of peptide synthesis. Examples thereof include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method. In addition, the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis.
That is, the amino acid that can constitute the peptide of the present invention or a salt thereof is condensed with the remaining part, and when the product has a protecting group, the protecting peptide is eliminated to synthesize the desired peptide or salt thereof. . Any known method may be used as the condensation method or elimination of the protecting group [for example, Bodanszky, M and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966), Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic. See Press, New York (1965), Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen (1975), etc.].
[0024]
After the reaction, the peptide of the present invention or a salt thereof can be purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
In the peptide of the present invention or a salt thereof, the C-terminal is usually a carboxyl (—COOH) group or a carboxylate (—COO). ^- ), But the C-terminus is an amide (-CONH ₂ ) Or ester (-COOR). Here, as R in ester, a C1-C12 alkyl group, a C3-C10 cycloalkyl group, a C6-C12 aryl group, a C7-C12 aralkyl group, etc. are mentioned.
Furthermore, the peptide of the present invention or a salt thereof includes those in which the amino group of the N-terminal alanine residue is protected with a protecting group, or complex peptides such as glycopeptides to which sugar chains are bound.
[0025]
3. Production of peptides of the present invention by genetic engineering techniques
In the present invention, the peptide of the present invention can be designed and obtained by genetic engineering.
(1) Acquisition of DNA encoding the peptide of the present invention
The DNA encoding the peptide of the present invention (also referred to as “diapodin gene” or “diapodin DNA”) is any one obtained from genomic DNA, genomic DNA library, insect cell, tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. It may be a thing. Therefore, for example, by using a synthetic DNA primer having a partial base sequence designed based on the partial amino acid sequence of the peptide of the present invention, amplifying the DNA obtained from an insect by a PCR method using a template, Diapodin DNA can be obtained.
[0026]
In addition, DNA obtained from insects is incorporated into a suitable vector, ³² Diapodin DNA can be selected by hybridization with a diapodin DNA fragment labeled with P or the like or a labeled synthetic DNA. Hybridization can be performed according to a known method or a method similar thereto [eg Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].
Further, a total RNA or mRNA fraction can be prepared from the insect cells and tissues and amplified by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) using these RNAs.
[0027]
The diapodin DNA of the present invention has a DNA sequence encoding the diapodin or a base sequence that hybridizes with the base sequence of the diapodin DNA under stringent conditions, and brings about the same quality of activity as the peptide of the present invention or a salt thereof. Examples include those encoding peptides. Here, stringent conditions refer to, for example, conditions in which the sodium concentration is 1-1000 mM, preferably 10-300 mM, and the temperature is 40-70 ° C., preferably 65 ° C.
In the present invention, mutations can be introduced into diapodin DNA and expressed to produce mutant peptides or salts thereof substantially the same quality as the peptides or salts thereof of the present invention. In this case, using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K (Takara Shuzo) or Mutant-G (Takara Shuzo)), etc., using a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto. Mutations can be introduced into DNA.
[0028]
(2) Production of recombinant vectors and transformants
(i) Production of recombinant vector
The cloned DNA can be used as it is or after digestion with an appropriate restriction enzyme if desired, or by linking an appropriate linker. A recombinant vector is obtained by ligating (inserting) these DNAs into an appropriate vector. The vector for inserting DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA and the like.
Examples of plasmid DNA include pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pBluescript II SK +/−, pGEM4, pSP64, and pSP65. Examples of the phage DNA include M13mp18, M13mp19, and λgt10.
[0029]
In order to insert diapodin DNA into a vector, first, a method in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or a multicloning site, and ligated to the vector is employed. The
The diapodin DNA in the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the DNA is exhibited. Therefore, in addition to promoters and diapodin DNA, enhancers, terminators, ribosome binding sequences, splicing signals, selection markers, and the like may be incorporated into the vector. In this case, the terminator includes SV40, the ribosome binding sequence includes lacZ, and the selection marker includes a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
[0030]
(ii) Production of transformant
In the present invention, a transformant can be obtained by introducing a recombinant expression vector into a host so that the target gene can be expressed.
Here, the host is not particularly limited as long as it can express diapodin DNA. For example, Escherichia coli such as Escherichia coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida, or Rhizobium meliloti genus Rhizobium meliloti And yeasts such as Saccharomyces cerevisiae or Schizosaccharomyces pombe, animal cells such as COS cells or CHO cells, or insect cells such as Sf9 or Sf21.
[0031]
When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, a recombinant vector containing diapodin DNA can be autonomously replicated in the bacterium, and at the same time, it is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, diapodin DNA, and a transcription termination sequence preferable. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained.
Any promoter may be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example trp promoter, lac promoter, P _L Promoter, P _R Promoters derived from E. coli or phage, such as promoters, are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.
[0032]
The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions [Cohen, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110 (1972)], electroporation method and the like can be mentioned.
When yeast is used as the host, YEp13, YEp24, YCp50, etc. are used as expression vectors. The promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast, and examples thereof include GAL1 promoter, GAL10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, GAP promoter and the like.
[0033]
The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, the electroporation method [Becker, DM and L. Guarente: Methods. Enzymol., 194: 182 ( 1990)], spheroplast method [Hinnen, A. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929 (1978)], lithium acetate method [Itoh, H. et al .: J. Bacteriol., 153: 163 (1983)].
When animal cells are used as hosts, for example, pcDNA1.1 / Amp, pcDNA1.1 (all from Invitrogen), pSI Vector, pCI Vector (all from Promega), etc. are used as expression vectors. In this case, a human cytomegalovirus early gene promoter or the like may be used as the promoter.
[0034]
Examples of methods for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
When insect cells are used as a host, expression vectors such as pVL1392, pVL1393 (all from Invitrogen), pMBac (Stratagene), pBacPAK8 / 9 (Clontech) and the like are used.
Examples of methods for introducing a recombinant vector into insect cells include the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like.
[0035]
(iii) Production of the physiologically active peptide of the present invention
The physiologically active peptide of the present invention can be obtained by culturing the transformant in a medium and collecting it from the culture.
The method of culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. Any medium that can be used may be a natural medium or a synthetic medium.
[0036]
As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, starch, maltose and dextrin, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, casamino acids, NZ An amine or the like is used.
Examples of inorganic substances that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, zinc sulfate, and cobalt chloride.
[0037]
The culture is usually performed at 30 ° C. for 24-96 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. During the culture period, the pH is maintained at 5.0 to 8.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the Lac promoter, culture a microorganism transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with an expression vector using the trp promoter. Sometimes indoleacrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
[0038]
As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, generally used RPMI1640 medium, DMEM medium, a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums, or the like is used.
Culture is usually 5% CO ₂ Performed at 20-30 ° C. for 1-7 days in the presence.
During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as necessary.
Grace's Insect Medium [Grace, TCC Nature, 195: 788, (1962)] with appropriate addition of additives such as 10% fetal bovine serum as a culture medium for transformants obtained using insect cells as hosts Etc. The pH of the medium is adjusted to 6.0 to 7.0, usually cultured at 25 ° C. for 1 to 7 days, and aeration or agitation is added as necessary.
[0039]
After the culture, when the peptide of the present invention or a salt thereof is produced in the cells or cells, the cells or cells are disrupted. On the other hand, when the peptide of the present invention or a salt thereof is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like to obtain a supernatant. Then, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, The bioactive peptide of the present invention or a salt thereof can be isolated and purified from (in a cell disruption solution, a culture solution, or a supernatant thereof).
[0040]
4. Antibacterial agent
The antibacterial peptide or salt thereof of the present invention is useful as an antibacterial agent because of its broad antibacterial spectrum. Furthermore, since the antibacterial peptide of the present invention has an antibacterial action against phytopathogenic fungi, it is particularly useful as an antibacterial agent against phytopathogenic fungi.
In addition, the antibacterial peptide or a salt thereof is in a form combined with other agricultural chemicals, for example, an insecticidal fungicide in combination with a fungicide (such as a rice pesticide), a plant growth regulator (such as a rice fungicide) and the like. It can be used in a form as a sterilizing plant regulator by a combination of That is, the antibacterial peptide or a salt thereof can be used alone or in combination with an appropriate liquid, solid or gaseous carrier. If necessary, liquefied gas, propellant (Freon etc.), surfactant (emulsifier, dispersant, antifoaming agent, etc.) etc. are added, emulsion, oil, wettable powder, powder, granule, liquid etc. It can also be used as a formulation.
[0041]
Examples of the liquid carrier used in the preparation include aromatic hydrocarbons such as xylene, toluene, benzene, and alkylnaphthalene; chlorinated aromatic hydrocarbons such as chlorobenzene, chloroethylene, and methylene chloride; and aliphatic carbonization such as cyclohexane and paraffin. Mineral oil fractions; alcohols such as ethanol, butanol and glycol and ethers and esters thereof; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; polar solvents such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile and water, and one of these Or 2 or more types can be mixed and used. When water is used as a solvent, pure water or an aqueous solution of inorganic salts (such as sodium chloride and potassium chloride), sugar (such as glucose and sucrose) or sugar alcohol (such as D-sorbitol and D-mannitol) should be used. it can.
[0042]
Examples of solid carriers used in the preparation include natural mineral powders such as kaolin, clay, talc, chalk, quartz, attapulgite, montmorillonite, and diatomaceous earth, synthetic mineral powders such as silicic acid, alumina, and silicate, and polymers. Natural products (crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.) can be used, and one or more of these can be used in combination.
Surfactants used as emulsifiers, antifoaming agents, dispersants, etc. include polyoxyethylene-fatty acid esters, polyoxyethylene-fatty alcohol ethers, alkylaryl polyglycol ethers, alkyl sulfonates, alkyl sulfates, aryl sulfonates , Albumin hydrolyzate, lignin-sulfite waste liquor, methylcellulose, gum arabic and the like.
[0043]
The antibacterial peptide of the present invention, which is an active ingredient, is 0.1 to 95% by weight in an emulsion, 0.1 to 60% by weight in a wettable powder, and 0.1 to 60% by weight in a granule. You may change suitably. In the case of emulsions and wettable powders, they can be diluted with water to use 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 1% by weight.
The antibacterial agent of the present invention may be directly administered to plants affected by phytopathogenic fungi using spraying method, mist method, dust method, spraying method, injection method or the like, or directly to soil contaminated by phytopathogenic fungi. May be. The method of use is selected based on the purpose of use, and in any case, it is desirable that the antimicrobial peptide of the present invention be dispersed as uniformly as possible.
Although the usage-amount of the antibacterial agent of this invention changes with the usage methods, for example, in the case of the spraying method, it is preferable to spray 1-1000g with an active ingredient amount per 10a.
[0044]
Examples of phytopathogenic fungi to which the antibacterial peptide of the present invention should be used as an antibacterial agent include Alternaria fungi, gray mold fungus, and blast fungus. These phytopathogenic bacteria are specifically pathogenic bacteria that invade cultivated plants such as apple (Malus domestica), pear (Pyrus L.), strawberry (Fragaria ananassa), and tobacco (Nicotiana tabacum), The gray mold fungus is cucumber (Cucumis sativus), tomato (Lycopersicon esculentum), pepper (Capsicum annum), lettuce (Lactuca sativa), strawberry (Fragaria ananassa), grape (Vitis L.), statice (Limonium Mill.), Eustoma Eustoma grandiflorum), gentian (Gentiana L.), tobacco (Nicotiana tabacum), and hops (Humulus luplus) and other pathogenic bacteria that invade cultivated plants such as rice blast (Oryza sativa) . Therefore, it is preferable to use an antibacterial agent containing the peptide of the present invention in the plant for the purpose of controlling or preventing diseases caused by these pathogenic bacteria.
[0045]
Furthermore, the antimicrobial peptide of this invention can be used also as a chemical | medical agent with respect to fungal disease, for example. In that case, the dosage form and dosage thereof can be arbitrarily selected as long as the antibacterial effect according to the present invention is recognized in consideration of the subject (including humans and animals) and the type of disease, symptoms, etc. Is possible. For example, the dosage is about 0.001 to about 10 mg / kg body weight, preferably about 0.025 to about 0.5 mg / kg body weight.
[0046]
5. Food and feed additives
Furthermore, since the antibacterial peptide of the present invention is easily degraded by proteolytic enzymes present in the stomach and intestines, at least as a result, it is considered that there is almost no toxicity. Therefore, the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a food or feed additive. For example, the present peptide can be dissolved in solid or in a liquid, preferably water, to an appropriate concentration, and added to food or feed, for example, by mixing, dipping, coating, spraying, or the like. As a result, the present peptide can prevent the occurrence of fungi such as fresh foods or processed foods such as meat, fish and vegetables, or feed such as soybean meal and fish meal feed. For example, when the antibacterial peptide of the present invention which is an active ingredient is used as an aqueous solution, it can be 0.0001 to 1% by weight, preferably 0.001 to 0.1% by weight.
[0047]
6). Introduction of DNA encoding the peptide of the present invention into a plant body
Furthermore, transgenic plants having resistance to phytopathogenic fungi, particularly phytopathogenic fungi can be produced by introducing DNA encoding the antimicrobial peptide of the present invention into a plant host using genetic engineering techniques. . Therefore, introduction of this antibacterial peptide gene into cultivated plants by genetic engineering techniques is an effective means for protecting plants from phytopathogenic fungi. As the gene, the DNA prepared in 3. above can be used.
Here, the plant host refers to the whole plant body of the cultivated plant, plant organs (e.g. leaves, petals, stems, roots, rhizomes, seeds, etc.), plant tissues (e.g. epidermis, phloem, soft tissue, xylem, fibers). Tube bundles etc.) or plant cultured cells.
[0048]
When a plant body, plant organ, or plant tissue is used as a host, the DNA encoding the peptide of the present invention is introduced into the collected plant section by introducing the vector using the Agrobacterium binary vector method, particle bombardment method, or polyethylene glycol method. And plant hosts can be transformed. Alternatively, a transformed plant can be produced by introducing it into protoplasts by electroporation.
Shoots, hairy roots, and the like obtained as a result of transformation can be used for cell culture, tissue culture, or organ culture, and by using conventionally known plant tissue culture methods, It can be regenerated into plants by administration or the like.
[0049]
When plant cultured cells are used as a host, transformation is carried out by applying a vector having DNA encoding the peptide of the present invention to the cultured cells using the electroporation method, the Agrobacterium binary vector method or the particle gun method, or polyethylene glycol. Thereafter, cell culture, tissue culture, organ culture and plant can be obtained in the same manner as described above.
[0050]
7). Antibody to the peptide of the present invention
In the present invention, an antibody against the peptide of the present invention can also be prepared.
“Antibody” refers to an entire antibody molecule or fragment thereof (eg, Fab or F (ab ′)) that can bind to an antigenic peptide of the present invention. ₂ Fragment), which may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
The antibody of the present invention can be produced by any of various methods. Methods for producing such antibodies are well known in the art [see, eg, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
[0051]
(1) Preparation of polyclonal antibody against antibacterial peptide of the present invention
The peptide of the present invention or a fragment thereof purified or chemically synthesized from a natural product as described above is used as an antigen and administered to mammals such as rats, mice, rabbits and the like. The dose of the antigen per animal is 0.1 to 10 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 μg when an adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or the like. Immunization intervals are not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, 6 to 60 days after the last immunization, preferably, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), etc., and the maximum antibody titer is determined. On the indicated day, blood is collected to obtain antiserum. When antibody purification is required from antiserum, purification is performed by appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or a combination thereof. be able to.
[0052]
(2) Production of monoclonal antibody against the antimicrobial peptide of the present invention
(i) Collection of antibody-producing cells
The peptide of the present invention or a fragment thereof purified or chemically synthesized from a natural product as described above is used as an antigen and administered to mammals such as rats, mice, rabbits and the like. The dose of the antigen per animal is 0.1 to 10 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 μg when an adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Immunization intervals are not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 10 days after the last immunization day, preferably 3 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
[0053]
(ii) Cell fusion
In order to obtain a hybridoma, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, thymine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred. Specific examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3X63-Ag.8.U1 (P3U1), Sp2 / O, and NS-I.
[0054]
Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion is performed at 1 × 10 6 in animal cell culture medium such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium. ⁹ 1 x 10 antibody-producing cells / ml ⁸ An equal volume of cells / ml myeloma cells is mixed, and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 daltons can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
[0055]
(iii) Selection and cloning of hybridomas
The target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment. As a method for this, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI-1640 medium containing fetal calf serum, and then 2 × 10 2 on a microtiter plate. ^Five Seed cells / well, add selective medium to each well, and then replace the selective medium appropriately and culture. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
[0056]
Next, it is screened whether the target antibody exists in the culture supernatant of the hybridoma which has proliferated. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be carried out according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and subjected to enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like.
Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established.
[0057]
(iv) Collection of monoclonal antibodies
As a method for collecting the monoclonal antibody from the established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.
In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium (for example, 37 ° C., 5% CO 2). ₂ The antibody is obtained from the culture supernatant.
In the case of the ascites formation method, the hybridoma is about 1 × 10 6 in the abdominal cavity of a mammal derived from a myeloma cell and the same species. ⁷ Individually administered, the hybridoma is proliferated in large quantities. And ascites or serum is collected after 1-2 weeks.
[0058]
In the above antibody collection method, when purification of the antibody is required, a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography or the like is appropriately selected or combined. Can be purified.
After the polyclonal antibody or the monoclonal antibody is obtained in this way, an affinity chromatography column is prepared by binding it to a solid support using this as a ligand, and the column is used to collect the above-mentioned collection source or other collections. From the source, the peptides of the invention can be purified. Furthermore, these antibodies can also be used for Western blotting to detect the peptides of the present invention.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Separation and purification of antibacterial peptide
6.25 equivalents (approx. 100 mg) of the adult beetle leaf beetle (one month later) was ground with 300 μl of 90% methyl alcohol solution (methyl alcohol: water: acetic acid = 90: 9: 1) under ice cooling, then 4 Centrifuge at 10,000 xg / 20 minutes at ° C. The obtained clear supernatant was centrifuged to remove the solvent, redissolved in a small amount of ultrapure water, and then TSK ODS-80Ts gel (Tosoh Corporation, 4.6 ×) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid. 250 mm) for the first reverse phase column chromatography.
[0060]
Elution was carried out under the elution conditions of 0% → 99.9% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid (flow rate = 1 ml / min) after washing the column with 0.1% trifluoroacetic acid. Using the absorbance at 210 nm as an index, fractions corresponding to each peak were collected, a small amount of each fraction was centrifuged and the presence of antibacterial activity was confirmed by the method described in Example 3. As a result, a fraction having antibacterial activity could be obtained (FIG. 1, arrow peak = 600 μl, retention time = about 33 minutes). The active fraction was subjected to Tris-TRICINE SDS polyacrylamide gel electrophoresis (also referred to as SDS electrophoresis), and a main band was detected at a molecular weight of 7.9 kDa (FIG. 2, arrow).
In this way, the peak that was found to contain a peptide with a molecular weight of 7.9 kDa was collected, and the second reversed-phase column chromatography was performed under the same elution conditions as the first except that the flow rate was 0.5 ml / min. It was used for graphy.
[0061]
As a result, as shown in FIG. 3, a single peak (600 μl, retention time = about 50 minutes) appears in the arrowed portion. When this fraction was subjected to SDS electrophoresis, a pure peptide having a molecular weight of 7.9 kDa was obtained. (Fig. 4, arrow) was confirmed. The peak indicated by the arrow was collected and centrifuged to remove the solvent, thereby obtaining 29.5 mg of peptide. When the antibacterial activity was examined for a small amount by the method described in Example 3, the presence of high antibacterial activity was confirmed, and the peptide having a molecular weight of 7.9 kDa was identified as the antibacterial peptide of the present invention. The antimicrobial peptide thus obtained was named diapausin.
The obtained purified antibacterial peptide was centrifugally dried to remove the solvent, and stored at −20 ° C. until it was used for measurement of antibacterial activity [see Example 3 described later]. The antibacterial peptide was quantified by the bicinchoninic acid method using insulin as a standard [Smith, PK et al .: Anal. Biochem., 150: 76 (1985)].
[0062]
[Example 2] Analysis of biochemical properties of diapodin
(1) Analysis of amino acid sequence
The diapodin separated and purified in Example 1 was subjected to Edman degradation [Edman, P .: Acta Chem. Scand., 10: 761 (1956)], and the resulting PTH-amino acid was analyzed by an amino acid sequence automatic analyzer (manufactured by Shimadzu Corporation, PPSQ). -21). Cysteine (Cys) was reacted with 4-vinylpyridine [Krull, I. et al .: Anal. Biochem., 40: 80 (1971)], and the resulting S-pyridylethyl-cystene was automatically amino acid sequenced. Analyzed by analyzer.
As a result, the amino acid sequence of diapodin consisting of 41 amino acids was determined as follows (SEQ ID NO: 1).
[0063]

[0064]
The molecular weight 4,467 Da of diapodin calculated based on the amino acid sequence coincided with the average molecular weight 4,466 Da (maximum error 0.1%) of diapodin according to the MALD-TOF MS spectrum.
[0065]
(2) Localization of diapodin in dormant adults
The whole, tissue (fatty body, gastrointestinal tract, brain and testis) or body fluid of the beetle leaf beetle (one month later) was analyzed by the following method, and the localization site of diapodin in the dormant adult body was examined.
Whole or each tissue in 3 volumes (v / w) of sample buffer [5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM benzamidine, 1 μg / ml pepstatin A, 1 μg / Milled with leupeptin, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8] [Deutscher, MP: Methods in Enzymol., 182: 83 (1990)] under ice-cooling, 10,000 xg / 20 min at 4 ° C The supernatant was obtained by centrifugation. In addition, body fluids of dormant adults (100 heads) were collected in a 1.5 ml tube containing phenylthiourea powder in advance to prevent browning of the body fluids under ice cooling. The collected body fluid (about 100 μl) was subjected to centrifugation at 10,000 × g / 20 minutes at 4 ° C. to remove blood cell components, and a supernatant was obtained.
[0066]
About each supernatant (peptide sample) thus obtained, whole ground product (equivalent to 0.2 heads), body fluid (equivalent to 0.5 heads), fat body ground product (equivalent to 0.5 heads), digestive tract ground product (equivalent to 4 heads) ), Brain grinds (corresponding to 4 heads), and testicular grinds (corresponding to 4 heads) were tris-TRICINE SDS using 16.5% polyacrylamide gel (length 80 x width 90 mm, thickness 1 mm, groove 12 locations) The sample was subjected to electrophoresis [Laemmli, UK: Nature, 227: 680 (1970)].
[0067]
On the other hand, the diapodin purified in Example 1 was injected into white rabbits together with Freund's incomplete adjuvant [Japan Biochemical Society, edited by Shinsei Kagaku Kenkyu 12: 3, Tokyo Kagaku Dojin (1992)] (0.1 mg / animal) Booster immunization was performed 30 days later. Next, blood was collected from white rabbits on the 40th day after the booster immunization, and after ammonium sulfate salting out, it was subjected to protein A-Sepharose (Pharmacia) affinity chromatography to purify the antibody. The obtained antibody was used for detection of diapodin by Western blotting [Towbin, HT et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350 (1979)].
[0068]
The peptide in the SDS electrophoresis gel was stained with 0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250.
As a result, as shown in FIG. 5, a peptide (arrow) having a molecular weight of 7.9 kDa that specifically binds to the diapodin antibody was detected in body fluids and fat bodies in dormant adults, and detected in the digestive tract, brain, and testis. Was not. From these results, it was found that a peptide having a molecular weight of 7.9 kDa (diapodin) is localized mainly in body fluids and fat bodies of dormant adults.
[0069]
(3) Analysis of increase and decrease of diapodin before and after dormancy in adults
For the beetle leaf beetle, the total amount (approximately 100 mg) of adults before dormancy (one day after emergence), dormant adults (one month later) or overwintering adults (around late April) equivalent to 6.25 heads is the same as the method described in (3). 300 μl of sample buffer [5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM benzamidine, 1 μg / ml pepstatin A, 1 μg / ml leupeptin, 62.5 mM Tris- HCl, pH 6.8] and ice-cooled and subjected to centrifugation at 4 ° C. at 10,000 × g / 20 minutes.
[0070]
The amount of protein in the obtained supernatant (peptide sample) was quantified by the bicinchoninic acid method using bovine serum albumin as a standard. Thereafter, each supernatant corresponding to a protein amount of 50 μg was subjected to SDS electrophoresis under the same conditions as described in (2).
As a result, as shown in FIG. 6, it was found that a peptide (diapodin) (arrow) having a molecular weight of 7.9 kDa appears from before dormancy to during dormancy in the adult body, and decreases significantly after overwintering.
[0071]
(4) Mass spectrometry
Using a mass spectrometer (Kartos Kompact MALDI 4 V5.1.2 .: + Linear High Power: 40) manufactured by Shimadzu Corporation, the MALD-TOF MS spectrum of diapodin separated and purified in Example 1 was analyzed by the method of Hillenkamp et al. Hillenkamp, F. et al .: Anal. Chem., 63: 1193A (1991)]. The average molecular weight was determined by removing the mass of proton (H +) = 1 from the measured value of the maximum peak.
As a result, the estimated molecular weight of diapodin by SDS electrophoresis was 7.9 kDa, but as shown in FIG. 7, since a peak appeared at a molecular weight of 4467.3, the exact average molecular weight of diapodin was 4,466 Da (maximum error 0.1). %). The peak at 2,233.8 in FIG. 7 is a diapodin peak charged by H2 +.
[0072]
[Example 3] Measurement of antibacterial activity of diapodin
The antibacterial activity against phytopathogenic fungi was measured by a method using a 96-well microplate [Cammue, BPA et al .: J. Biol. Chem., 267: 2228 (1992)]. That is, the spore of Alternaria alternata, gray rot fungus (Botorytis cinerea) or blast fungus (Magnaporthe grisea) is sterilized by filtration in a synthetic medium (Cammue, BPA et al.: J. Biol. Chem., 267: 2228). (Double concentration as described in (1992)) [K ₂ HPO _Four (5mM), MgSO _Four (100μM), CaCl ₂ (100μM), FeSO _Four (10μM), CoCl ₂ (0.2μM), CuSO _Four (0.2μM), Na ₂ MoO _Four (4μM), H _Three BO _Three (1μM), KI (0.2μM), ZnSO _Four (1μM), MnSO _Four (0.2μM), glucose (20g / l), L-asparagine (2g / l), L-methionine (40mg / l), myo-inositol (4mg / l), biotin (0.4mg / l), thiamine hydrochloride ( 2 mg / l), pyridoxine hydrochloride (0.4 mg / l)] and spore suspension (2.5 × 10 ^Four Spore count / ml) was prepared. This spore suspension (40 μl) was placed in each well of a 96-well microplate, and then an aqueous solution (40 μl) of diapodin separated and purified in Example 1 was added to prepare a test solution.
[0073]
As a control, a solution in which sterile water (40 μl) was added instead of an aqueous solution of diapodin was used.
Thereafter, the mixture was incubated at 27 ° C., and the absorbance at 595 nm at 0 and 48 hours was measured using a microplate reader (BIO-RAD, Model 3550-UV). From the measured values obtained, the cell growth inhibition rate was calculated as follows. That is, the percentage obtained by subtracting the change in absorbance (ΔT) in the test solution from the change in absorbance (ΔC) in the control was calculated as a percentage of ΔC, ie, [(ΔC−ΔT)] / ΔC × 100. The rejection rate (%) was used.
The growth inhibition rate of phytopathogenic fungi when the concentration of purified diapodin in the test solution is changed from 0 to 800 μg / ml is shown in FIG. In FIG. 8, each point represents [average value (n = 2) ± range]. As is clear from FIG. 8, the diapodin of the present invention exhibits antibacterial activity against three pathogenic fungi of A. alternata, B. cinerea and M. grisea, and particularly shows strong antibacterial activity against B. cinerea. I understood it.
[0074]
【The invention's effect】
According to the present invention, a physiologically active peptide having antibacterial activity is provided. The bioactive peptide of the present invention is useful as a bactericidal agent against phytopathogenic fungi, particularly phytopathogenic fungi.
[0075]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of reverse phase chromatography.
FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS electrophoresis.
FIG. 3 is a diagram showing the results of reverse phase chromatography.
FIG. 4 is a photograph showing the results of SDS electrophoresis.
FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of SDS electrophoresis and subsequent Western blotting.
FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS electrophoresis.
FIG. 7 is a diagram showing the results of diapodin mass spectrometry.
FIG. 8 is a graph showing antibacterial activity of diapodin against phytopathogenic fungi.

Claims

Antimicrobial agents comprising the bioactive peptide or the salt thereof of the following (a) or (b).
(a) a bioactive peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(b) a physiologically active peptide comprising a sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and which provides antibacterial activity