JP4047482B2 - Substance measurement sensor - Google Patents

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臭気物質等の各種物質の測定用センサーに関する。
【0002】
【従来の技術】
カビ臭物質等の臭気を検出するための臭気センサーとして、遺伝子工学的手法により作製された微生物センサーが知られている(特開平8−242857号公報)。この微生物センサーは、カンファーヒドロキシラーゼオペロン(camオペロン)中のオペレーター/プロモーター領域と、該領域の下流に挿入され、該領域の制御を受ける遺伝子であって、その発現を検出することができるレポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子群を含む組換えベクターにより形質転換された微生物から成る。なお、camオペロンは、カンファー(樟脳)を唯一の炭素源として生育可能なシュードモナスキプチダのCAMプラスミド由来のオペロンであり、カンファー分解の初発段階に働くものである。被検試料中にカンファーなどの臭気物質が存在すると、該臭気物質が上記オペレーター/プロモーター領域に作用してその下流のレポーター遺伝子が発現されるので、臭気物質を検出することができる。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
上記公知の微生物センサーは、認識物質に対する特異性が高く、微生物である材料を際限なく増やすことができるため材料費が安価である等の利点を有する。しかしながら、微生物センサーは、センサー自体が微生物であることから取り扱いが不便であり、また、培養時間を要するために測定時間がかかるという問題がある。また、検出感度がより一層向上すればより好ましいことは言うまでもない。
【0004】
従って、本発明の目的は、微生物に比較して取り扱いが簡便で、培養が不要で測定に要する時間が短く、かつ、従来の微生物センサーよりも高感度で臭気物質等の物質を測定することができる物質測定用センサーを提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップ表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成るセンサーを用いることにより、簡便に、短時間で、高感度に物質を測定することができることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップの、測定時に光を入射させる側と反対側の表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成る物質測定用センサーを提供する。
【0007】
【発明の実施の形態】
表面プラズモン共鳴(SPR)法は、センサーチップ(ガラス基板上に、金等の金属を蒸着したもの)の下面に接触している溶液等の媒質の屈折率が変化すると、該金属薄膜の上面にプリズムを通して種々の角度で入射する光の反射光のうち、強度の低下した反射光の角度が変化することを利用して、媒質の屈折率の変化を測定する方法である(笠井献一、蛋白質 核酸 酵素、Vol.37 No.15(1992), pp.2977-2984)。特定の角度で反射する反射光の強度が低下するのは、ガラスと金属薄膜との界面で発生するエバネッセント波と、金属薄膜表面に生じる表面プラズモンと呼ばれる表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使われ、反射光として戻る分が減るために起きる。化学反応に関与する反応物質の一方をセンサーチップの下面に結合しておくと、該反応物質がもう一方の反応物質と反応することによりセンサーチップ下面に接触する媒質の屈折率が変化するので、強度が低下した反射光の角度(この角度は「共鳴角」と呼ばれる)が化学反応の進行に応じて時々刻々と変化する。従って、共鳴角の変化をリアルタイムに測定することにより、化学反応の進行をリアルタイムに観察することができる。このため、SPRは化学反応速度論の研究に用いられ、また、生化学分野では抗原抗体反応の解析等に用いられている。
【0008】
本発明のセンサーは、上記SPR装置を利用したものである。SPR装置自体は市販されているので、市販品を利用することができる。本発明のセンサーでは、SPR装置のセンサーチップの下側(すなわち、測定時に光が入射する側の反対側)表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸が結合されている。結合される核酸としては、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合するものであればいかなる核酸も用いることができる。このような核酸の好ましい例として、当該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子を包含するオペロン中のオペレーター配列を挙げることができる。例えば、カンファーリプレッサータンパク質と結合する、camオペロン中のオペレーターを挙げることができる。camオペロン中のオペレーターの塩基配列は公知であり、Aramaki, H., et al., (1993) J. Bacteriol., 175, 7828-7833, 及びFujita, M. et al., (1993) J. Bacteriol, 175, 6953-6958に記載されている。camオペロン中のオペレーターには、camオペロン中のcamR遺伝子によりコードされるリプレッサータンパク質が結合する。さらに、環境中の微生物のオペロンの代謝するものであれば、自然に存在する有機物の他に、人間が人工的に作り出して環境に放出したものなど、また、ベンゼン、キシレン、トルエン、ナフタレン、フェノールなどの有害な有機物、メチル水銀など有機重金属などと結合するリプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含む微生物オペロンはすでに知られているので、これらのオペロン中のオペレーター配列も用いることができる。なお、オペレーター配列において1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であって当該リプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸も用いることができる。特に、リプレッサータンパク質が結合するためには、完全なオペレーター配列が必要なわけではなく、その一部分だけ存在すればよいので、このようなオペレーターの部分配列も好ましく用いることができる。例えば、camオペロンの好ましいオペレーター部分配列の例として、配列表の配列番号1に示す塩基配列を挙げることができる。なお、言うまでもなく、配列番号1に示される配列において1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸も好ましく用いることができる。
【0009】
核酸をSPR装置のセンサーチップ表面に結合することは、ジスルフィド化合物を用いるSA膜法(Taizo UDA et al.,(1995) DENKI KAGAKU, 63, NO.12, 1160-1166)、チオール膜法、L−B膜法(安田隆一ほか(1997)電子情報通信学会論文誌C-II Vol. J80-C-II No.1 pp.1-7)等のそれ自体公知の方法により行なうことができる。これらのうち、SA膜法は、核酸の固定化が容易であり、センサーチップの再利用が可能であるので好ましい。これらの方法により、核酸の一端をセンサーチップ表面に結合させることができ、核酸の該端部以外の部分は何物とも接触していないので、センサーチップ表面に固定化された核酸は、リプレッサータンパク質と自由に結合することができる。なお、SA膜法により、配列番号1に示される配列を有するDNAを、ガラス基板に金蒸着したセンサーチップに結合させる方法の具体例が下記実施例に詳述されている。センサーチップ表面に結合させる核酸の量は、特に限定されず、試料中の物質が測定できる量であればいずれの量であってもよいが、通常1mm2当たり500〜2000 pmol程度である。
【0010】
測定にあたっては、測定すべき物質を含むかもしれない試料に上記リプレッサータンパク質を加えたものを、上記センサーチップの下側表面と接触させると共に、センサーチップの上面に種々の角度の光を一点に向けて入射させ(すなわち、光は全体として楔形になる)、その反射光の強度を測定することにより上記した共鳴角をリアルタイムに測定する。もし、試料中に測定すべき物質が含まれていると、該物質がリプレッサータンパク質と結合するので、リプレッサータンパク質はセンサーチップに固定化された上記核酸とは結合できず、従って、共鳴角は測定の前後でほとんど変化しない。一方、試料中に測定すべき物質が含まれていない場合には、リプレッサータンパク質が上記核酸と結合するので、共鳴角が大きく増加する。そして、共鳴角の増加の程度は、含まれる物質の量に依存するから、共鳴角の増加を測定することにより、試料中の物質の検出のみならず定量が可能になる。従って、本明細書において、「測定」とは、検出と定量の両者を包含する。なお、センサーチップに光を入射させる操作や反射光を測定する操作は、市販のSPR装置の取り扱い説明書に従って容易に行なうことができる。リプレッサータンパク質としてcamRタンパク質を用い、臭気物質であるカンファーを測定する場合の上記の測定原理を図1に模式的に示す。
【0011】
なお、試料に加えるリプレッサータンパク質の終濃度は、特に限定されず、測定しようとする物質の存在量の予想範囲に照らして適宜選択することができるが、通常、1〜1000 mM程度が好ましく、さらに好ましくは5〜200 mM 程度である。また、リプレッサータンパク質自体は、これをコードする遺伝子を公知の方法によりクローニングすることができるので、遺伝子工学的手法により大量に調製することができる(下記実施例参照)。
【0012】
なお、リプレッサータンパク質は、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものであればよく、必ずしも天然のリプレッサータンパク質と同一である必要はない。すなわち、天然のリプレッサータンパク質のアミノ酸配列の中の1若しくは複数のアミノ酸が置換し、欠失し、又は1若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたものであって、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。従って、天然のリプレッサータンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質であって、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。
【0013】
このような修飾リプレッサータンパク質として、例えば、下記実施例では、CamRのアミノ末端に6残基のヒスチジンのタグを付加したものが用いられているが、このようなものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。リプレッサータンパク質のアミノ末端に複数のヒスチジン残基を付加することにより、Ni-NTA(Ni-ニトリロ三酢酸(Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA))カラムによって分離精製する方法によって容易に高純度のタンパク質を大量に分離精製することができる。本方法は、リプレッサータンパク質を先ず他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、次いで、融合部をFactor Xa等により切断してリプレッサータンパク質を精製する場合に、イオン交換カラムを用いて精製する方法と較べ、融合される他のタンパク質や、切れ残った融合タンパク質の混入もないため純度が高く、回収率が高くなる。また、アミノ末端にヒスチジンが付加された融合タンパク質はFactor Xaによる消化が著しく高まり、少ない酵素量(以前の1/5量)で切れ残りがほとんどなくなる。このため、リプレッサータンパク質のアミノ末端に複数のヒスチジン残基を付加してNi-NTAカラムによる精製を行うことにより、高価なFactor Xa の使用量が少なくて済むためコストを低くすることができるという利点も得られる。なお、この場合、付加するヒスチジン残基の数としては4〜8個程度が好ましい。
【0014】
なお、核酸としてcamオペロンのオペレーター又はその部分配列を用い、リプレッサータンパク質としてcamRタンパク質を用いる場合には、測定をカルシウムイオンの存在下で行なうと、オペレーター又はその部分配列とcamRとの結合がスムースに進むので好ましい。この場合、カルシウムイオンの濃度は、特に限定されないが、1〜10mM程度が好ましい。
【0015】
本発明のセンサーを用いて測定される物質は、センサーチップに結合される核酸の種類及びリプレッサータンパク質の種類により異なるが、例えば、センサーチップに結合される核酸として、camオペロンのオペレーター配列又はその部分配列を用い、リプレッサータンパク質としてカンファーリプレッサータンパク質を用いる場合には、カンファー、2−メチル−イソボルネオール及びイソボルネオール等のカビ臭物質を挙げることができる。また、上記のように、環境中の微生物のオペロンの代謝するものであれば、自然に存在する有機物の他に、人間が人工的に作り出して環境に放出したものなど、また、ベンゼン、キシレン、トルエン、ナフタレン、フェノールなどの有害な有機物、メチル水銀など有機重金属などの測定に適用することもできる。被検試料としては、その中に含まれる物質を測定したいいずれの試料であってもよく、例えば水道水のような飲料水や、海洋や河川、池などの水等を試料として、その中に含まれる臭気物質等の物質を測定することができる。
【0016】
なお、CamRタンパク質に反応する臭気物質はカンファーを含め、モノテルペンと言う化合物に属する。モノテルペンは大多数の植物や果物の香り物質としてや、いくつかの種の昆虫のフェロモンとしても知られている。CamRタンパク質はカンファーのみならず類似の構造をした、多数の二環性のモノテルペンに反応する(特開平8-242857号公報)。また、数種のCamRの変異型に反応するモノテルペンの種類は変異型によって異なる。変異型の中には選択性があり、カンファーのみしか反応しないもの(特開平10−52276号公報)、二環性のモノテルペンのみならず、一環性や開環性のモノテルペンに反応するものなどがある(特開平10−28591号公報)。これらの変異型のCamRタンパク質を野生型同様に本方法に用いることによって、カンファーの分析の他に植物 ( 食品を含む ) の香りを分析するためにセンサーとしても応用可能である。
【0017】
CamRタンパク質の野生型はカンファーの構造と良く似た、上水道におけるかび臭物質である2-メチルイソボルネオールにも反応する。また、変異型のあるものはセスキテルペンに属するもう一つの上水道のかび臭物質ジェオスミンに反応する(特開平10−28591号公報)。そのため、本発明のセンサーはかび臭物質を分析するための水質試験に用いることもできると考えられる。
【0018】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例においては、断りのない限り、Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratry Pressに記載された方法に従った。
【0019】
実施例1
(A)(1) CamR の大量生産用プラスミドの構築
CamRの大量生産用プラスミドの構築は、マルトース結合タンパク質と試料の融合タンパク質として発現させ、アミロースレジンカラムを用いてアフィニティー精製するための、大腸菌発現ベクターpMal-c2 (New England Biolabs,INC.)を用いた。ただし、MalE-CamR融合タンパク質からCamRの精製は次の二つの方法のいずれかによって行った。一つはイオン交換カラムクロマトによる方法(実施例1)であり、もう一方はCamRのアミノ末端に6残基のヒスチジンのタグを付加し(PCRによって導入)、このHis-tagged CamRをNi-ニトリロ三酢酸(Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)) カラムクロマト によって精製する方法(実施例2)を取った。
【0020】
表面プラズモン共鳴反応は反応させる分子の分子量が大きければ、大きいほど共鳴角度が大きくなり、感度が高くなる。また、CamRはDNAに結合する時2量体で結合する(Aramaki, H.前掲)。
【0021】
これらSPRの原理やCamRの性質を考慮に入れ、マルトース結合遺伝子に連結するcamR遺伝子はそれぞれ1つ(1xcamR)、連結したものに加えて、2つ(2xcamR)または3つ(3xcamR)タンデムに連結して、分子量を大きくしてSPR反応を高めるように構築した。camR遺伝子の間には4つのアミノ酸(グリシン)残基をPCRによって導入した。
【0022】
1)1xcamRの構築(図2)
PCRに用いるためのcamR-Ntプライマー 5'-ATGGACATCAAGCAGAGCTTG-3'はT4 ポリヌクレオチドキナーゼ処理して5'-OH基をリン酸化した。PCRはpLC87(特開平8−242857号公報、FERM P-14818)を鋳型にして、リン酸化したcamR-Ntプライマーとr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて行った。増幅した断片はEco RIで切断した上で、アガロースゲル電気泳動し、1037 bpの断片を分離回収した。この断片をpMal-C2のXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをp1xcamRとして、1xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【0023】
2)2xcamRの構築(図3〜5)
pLC87を鋳型にしてcamR-NtプライマーとHind IIIサイトを導入したHin-r2プライマー5'-CCAAGCTTGGCTTTTTGCAGGGCCAAGTCTTGTGTGTACCCT-3'を用いて増幅した。増幅した断片はHind IIIで消化した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して513bpの断片を分離および回収した。(これをA断片とする)。
【0024】
pLC87をEco RIで切断した後にアガロースゲル電気泳動し、分離回収して得た1383 bpの断片を、pBluescript II SK-(STRATAGENE)のEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドpSK+LC87はEco RIとSph Iで消化した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、626 bpの断片を分離して回収した。ゲルから回収して得た断片は次の5回の連続PCRによって5'側にHind IIIサイトと4つのアミノ酸(グリシン)残基の導入のための最初の鋳型に用いた。1回目のPCRはHin 21プライマー 5'-GGTGGAGGTGGAATGGACATCAAGCAGAGCTTGCTGCACGCA-3'とRVプライマー 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'を用いて10 サイクル増幅した。2回目のPCRはHin 22プライマー 5'-ATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAATGGACATCAAGCAGAGC-3'とRVプライマーを用いて、1回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 cycles 行った。3回目のPCRはHin 23プライマー 5'-GCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAATGGAC-3'とRVプライマーを用いて、2回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 サイクル行った。4回目のPCRはHin 24プライマー 5'-ATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGA-3'とRVプライマーを用いて、3回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 サイクル行った。5回目のPCRはHin 25プライマー 5'-CCAAGCTTGACATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAG-3'とRVプライマーを用いて、4回目のPCR反応液1μlを鋳型にして25サイクル行った。増幅した断片はHind IIIとBgl IIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、183bpの断片を 分離および回収した。(これをB-1断片とした)
【0025】
pSK+LC87はBgl IIとEco RIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、905 bpの断片を分離および回収した。(これをB-2断片とした)
【0026】
B-1断片とB-2断片は連結してpBluscript II KS-のEco RIとHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドpKS+Hin25はEco RIとHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動して、1088 bpの断片を分離および回収した。(これをC断片とした)
【0027】
pMal-C2はHind IIIで切断した後にKlenow DNA polymeraseを用いて平滑化させた。これを自己ライゲイションして、Hind IIIサイトを破壊したプラスミドは大腸菌に導入した。この形質転換体からプラスミドを調製しpMal-C2 / Hind IIIbを得た。
【0028】
A断片とC断片は連結して、pMal-C2 / Hind IIIbのXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをp2xcamRとして、2xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【0029】
3)3xcamRの構築(図6〜7)
pKS+Hin25を鋳型にしてHinr2プライマー とRVプライマーを用いてPCRを行った。増幅した断片はHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、565 bpの断片を分離および回収した。回収した断片をpBluscript II KS-のHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpKS+Hin25-Hinr2はHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、565 bpの断片を分離および回収した。(これをD断片とした)
【0030】
D断片はp2xcamRのHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドの順方向のものをp3xcamRとして3xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【0031】
4)PCR
PCRは断わりのない限り次の条件で行った。PCR反応は94 ℃で 2 分を1 サイクル、94 ℃で30秒、60 ℃で 30 秒、70 ℃で1 分を25 サイクルで行った。各(アデノシン、チミン、グアノシン、シトシン)デオキシヌクレオチド三リン酸は終濃度が200 μMになるように添加した。プライマーはそれぞれ20 pmol 用いた。MgCl2は終濃度が1 mMになるように添加した。DNA ポリメラーゼはKOD DNA ポリメラーゼ(TOYOBO CO.,LTD)を 1単位用いた。各鋳型のプラスミドDNA は1 ngを用いた。
【0032】
(2) CamR の大量生産用プラスミドを保有する大腸菌からの CamR の精製
1) マルトース結合タンパク質(MalE)とCamRタンパク質の融合タンパク質の精製
それぞれのCamR大量生産用プラスミドは大腸菌XL1-blueに導入した。得られた組換え体はそれぞれ、XL1-blue+1xCamR、XL1-blue+2xCamR、XL1-blue+3xCamRと名付け、以下の実験に用いた。
【0033】
- 85℃でグリセロール溶液に保存した各々の形質転換体は100μg / mlのアンピシリン(Amp)入りの1xLB寒天培地に画線し、37 ℃で一晩静置培養した。単一のコロニーは20 mlのAmp入りの1xLB液体培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。翌日10 mlの培養液をAmp入りの1Lのグルコースリッチ1 x LB培地に植え継ぎ30℃でOD600 nmが0.5になるまで110 rpmで振とう培養した。終濃度が0.3 mMになるようにIPTGを添加し、さらに2時間培養した。培養液を500 ml 容のチューブに移し4℃、5,000 rpm、5 分遠心して集菌した。培地を捨て、菌体は50 ml容のチューブに移し,次の操作まで-85 ℃で保存した。菌体は1 mlのカラムバッファー (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-メルカプトエタノール)にパスツールピペットを用いて懸濁した。その後、菌体は10 ml 容の超音波破砕機用プラスチック製チューブに移した。20 秒間超音波破砕を行い、1分冷却した。この操作を10 回行った。その細胞破壊液は1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、4 ℃、15,000 rpm、20 分遠心した。上清(粗抽出物)は新しいマイクロチューブに移した。15 mlのアミロースレジン(New England biolabs, Inc)を2.5 x 10 cmの column に注いだ。カラムを400 ml のカラムバッファーで洗った。粗抽出物(2.5 μg/μl)を約1ml/minの流速でロードした。600 mlのカラムバッファーで洗った。60 mlの10 mMのマルトース入りのカラムバッファーで融合タンパク質を溶出させた。3 mlずつフラクションを回収した。タンパクを含むフラクションをプールした。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、適量をfactor Xaの消化に用いた。
【0034】
2) MalEとCamR融合タンパク質からのCamRタンパク質の精製
イオン交換カラムクロマト法による精製法
1 mg/mlのタンパク質溶液 1mlは1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、4μgのFactor Xaを加え16 ℃で一晩インキュベートして、消化した。消化した10 mgのタンパク質はUltracent-10を用いてTNbuffer ( 20 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 8.0)に交換した。 6 mlのTSKgel DEAE-トヨパール650Medium(東ソー(株))を50 ml容のチューブに加えた。これに20 mlのTNbufferを加え混合した。室温で1時間静置し、分離させた。上清を捨て繰り返えした。1x10 cm カラムは5 mlのbed volumeを与え、DEAEレジンを注いだ。15 mlのTNbufferでカラムを洗った。factor Xaで消化し、バッファーで交換したタンパク質をカラムに加えた。30 mlの同じバッファーでカラムを洗った。カラムは最初のバッファー濃度が25 mM NaClから最後のバッファー濃度が500 mM NaCl (それぞれ25 mlで20 mM Tris-HCl, pH 8.0を含む)のグラジエントをかけた。1 mlずつフラクションを回収した。回収したタンパク質はUltracent-10を用いてカラムバッファーに交換するとともに濃縮した。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、その後0.5 ml容マイクロチューブに分注し、SPR実験に使用するまで - 85℃保存した。
【0035】
(3) SPR を用いたカンファーの測定法
1) SPR装置
表面プラズモン共鳴方式を採用した生体分子の相互作用を測定する装置はいくつかの機械のメーカーから製造販売されている。本実施例では日本レーザー電子株式会社のNL-SPR670-E(1チャンネルバッチ式)を用いた。以下SPR装置と略す。このSPR装置は光源として感度が高い半導体レーザー光を使用している。また、リガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法、チオール膜法、L-B膜法などを選択することが可能である。リガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法を用いた場合は固定化が容易であり、センサーチップである金蒸着ガラス基板の再利用が可能であるために、ランニングコストがかからない。金蒸着ガラス基盤はメーカーより入手可能である。このことから本実施例ではリガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法を採用した。なお、本実施例はDNAの固定化が可能であれば他のSPRの装置にも適用可能である。
【0036】
2) ジスルフィド化合物を用いるSA膜の作製
ジスルフィド化合物を用いるSA膜の作製法は日本レーザー電子株式会社の方法に従い、下記のように行った。
【0037】
(i)アセトンを直径10 ml のガラス製のプレートに加えた。これにセンサーチップである金蒸着ガラス基盤を浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。(ii)10 mMの4,4-Ditho butyric acid(DBA)エタノール溶液を終濃度が10μMになるように、さらにエタノールで1000倍希釈した。希釈した溶液を別のガラス製のプレートに加えた。これにアセトンで洗浄したセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌した。その後、室温で30 分静置した。この反応によってジスルフィド化合物の金表面への結合がなされる。(iii)エタノールを別のガラス製のプレートに加えた。これに(ii)のセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。エタノールを捨て、繰り返した。(iv) 25 mgの水溶液カルボジイミドと15 mgのN-ヒドロキシスクシンイミドを10 mlの90 %の1,4-ジオキサンに溶解した溶液を作製し、別のガラス製のプレートに加えた。これに(iii)のセンサーチップをエタノールで洗浄したものを浸し、穏やかに撹拌した。その後、室温で15 分静置した。この反応によってセンサーチップはアミノ基をもったリガンドが結合できるように、活性化される。(v)超純水を別のガラス製のプレートに加える。これに上記のように活性化したセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。(vi)超純水で洗浄したセンサーチップはSPR装置に取り付けるまで、ペーパータオルの上に置き乾かした。
【0038】
3) センサーチップに固定化するオペレーターDNAの調製
(i) オペレーターDNA配列
CamRリプレッサータンパク質の結合するオペレーターDNA配列部位はAramaki H., et al.,(上掲)によって明らかにされている。本実施例ではこの部位の内の27塩基をオペレーター配列として用いた。 センス 鎖は5'-GCTCAGTATATCGCAGATATAGGGCCT-3'で ありアンチセンス 鎖は5'-AGGCCCTATATCTGCGATATACTGAGC-3'である。これら2つのオリゴヌクレオチドDNAは合成時に5'末端にアミノ基を導入し、活性化したセンサーチップに化学的に結合できるようにした。また合成したオリゴヌクレオチドDNAの精製はHPLCで行った。オリゴヌクレオチドDNAの合成は本条件で日本ジェノシスバイオテクノロージー株式会社で依託製造されたものを用いた。
【0039】
(ii)DNAのアニーリング
それぞれ5μlずつの50 pmolのセンス鎖およびアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドDNAはTE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)に溶解した。これを0.5 ml容マイクロチューブに加えて混合し、95 ℃で10 分加温し変成させた。その後室温で20 分静置し、アニーリングさせた。なお、アニーリング後のDNAは、後述する方法によりSA膜に結合させた。
【0040】
4) 精製したCamRタンパク質とセンサーチップに固定化したDNAの結合
0.5 ml 容のマイクロチューブにそれぞれ、9 μlの各種の濃度に精製したCamR-MalE 融合タンパク質(1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE)またはCamR 精製タンパク質(2xCamR)と1μlの10 x CamR 結合バッファー(200 mM HEPES (pH8.0), 10 mM MEDTA,100 mM 2-メルカプトエタノール, 50 mM CaCl2)および2 μlのカラムバッファーを加えた。この溶液を室温で10 分以上、SPR装置にかけるまで放置した。溶液をDNAを固定化したセンサーチップに加えた。
【0041】
5) 精製したCamRタンパク質とカンファーの結合反応
100 mg / ml にエタノールに溶解して調製したカンファーエタノール溶液は、CamRタンパク質を溶解したカラムバッファーで100 fg/mlまで段階希釈した。0.5 ml 容のマイクロチューブに9 μlの各種の濃度に精製したCamRタンパク質(2xCamR)を加えた。次に1μlの10 x CamR 結合バッファーと2 μlの結合バッファーで希釈した各々の濃度のカンファー(1 μg/ml 〜100 fg/mlまで)を加え、混合し、室温で10 分以上、SPR装置にかけるまで放置した。コントロールとして、等量のCamRタンパク質(2xCamR)とカラムバッファーのみを添加した試料を用いた。これをDNAを固定化したセンサーチップに加えた。
【0042】
6) SPR装置の操作手順
(i)SPR装置は使用する1 時間前に、電源を入れ安定化させた。(ii)活性化させたセンサーチップは装置のプリズムの中央に顕微鏡用の屈折液(Cargille社製, 屈折率1.518)を一滴、滴下した上に静かに置き、止め金で動かないように固定した。(iii)20μlのTEを加えた。共鳴角が安定するまで約 1 分静置した。(iv)10μlのTE をマイクロピペットで吸って捨て、10 μl( 100 pmol ) のアニーリングさせたDNA溶液を加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 3分静置した。(v)DNA溶液 10μl をマイクロピペットで吸って捨て、20 μlのカラムバッファーを加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 3 分静置した。(vi)カラムバッファーをマイクロピペットで20μl 吸って捨て、カラムバッファーに溶解した5μlの10 mg/ml のBSA(超純水に溶解したウシ血清アルブミン)溶液を加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 5 分静置した。ここでBSAはチップ表面状のDNAの結合していない空サイトをブロックして、CamRタンパク質の非特異的結合を防ぐために添加した。(vii)BSA溶液をマイクロピペットで 5 μl 吸って捨てた。10μl のグリシン-HCl (pH 1.0)溶液を添加し、約30 秒静置し、すばやくマイクロピペットで10 μl 吸って 捨て、カラムバッファーで共鳴角が安定するまで10 μlずつピペッティングして、バッファー交換を行った。グリシン-HCl (pH 1.0)溶液はフリーのBSAを除くために加えた。共鳴角は一定のラインまで低下し、安定するまで静置した。(viii)次に、マイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、10μの1 x CamR 結合バッファーを加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 1 分静置した。この時の共鳴角はCamRタンパク質を加える前の値として記録した。(ix) 4)または5)で調製したCamRタンパク質試料を10μl 加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 1分静置した。この時の共鳴角はCamRタンパク質を加えた後の値として記録した。(x)マイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、10μlのグリシン-HCl (pH 1.0)溶液を添加し、約 30 秒静置した。すばやくマイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、共鳴角が安定するまで10 μlずつピペッティングして、バッファー交換を行った。その後、溶液はマイクロピペットで吸って捨てた。グリシン-HCl (pH 1.0)溶液はDNAに結合したCamRタンパク質を解離させて、センサーチップを再生するために加えた。
【0043】
(xi) グリシン- HCl ( pH 1.0 )溶液によって再生したセンサーチップを用いて、別の試料で(viii)、(ix)、(x)を繰り返し行った。(xii)各々の濃度のカンファーとCamRタンパク質の結合反応試料を加えてから、安定するまでの一定時間のSPR反応のデータを一つのグラフに合わせ、カンファーの定量性を調べた。
【0044】
7) センサーチップの再利用
SPRに使用したセンサーチップは次の手順に従った超音波洗浄によって、表面に結合したDNA、タンパク質およびカンファー等を洗浄して除き、再利用した。(i) 200 ml 容ビーカーに100 mlのアセトンを加え、これに使用したセンサーチップを入れ超音波洗浄機のバスにビーカーの上に重しを乗せて置き、20 分洗浄した。(ii)洗浄後、センサーチップをペーパータオルの上に置き、乾かし次のSPR実験に使用した。
【0045】
(B)結果
構築したプラスミドのマルトース結合タンパク質とCamRタンパク質をコードする遺伝子領域を含む塩基配列を図8〜14に示す。
【0046】
CamRタンパク質は上記した精製法によって、単一の分子まで精製することができた。
【0047】
図15はアニーリングさせたDNAを100 pmol 用いてセンサーチップに固定化させ、それぞれ10 mMのアミロースレジンカラムを用いて精製したCamR-MalE 融合タンパク質(1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE)または融合タンパク質をfactor Xa で消化後、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した10 mMのCamRタンパク質(2xCamR)を用いてSPR実験を行った場合の共鳴角の時間的変化を示す。同じ試料を用いて3回繰り返し実験を行っている。一枚のセンサーチップを用いた連続実験の結果を示す。なお、図15中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表1に示す通りである。
【0048】
【表1】

Figure 0004047482
【0049】
図16は図15で示された結果の内、それぞれ 1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3xCamR-MalE融合タンパク質のDNAに対する結合実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示したものである。
【0050】
図17は図15で示された結果の内、それぞれ 1 x CamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【0051】
図18はアニーリングさせたDNAを100 pmol 用いてセンサーチップに固定化させ、それぞれ 5 mMのアミロースレジンカラムを用いて精製した2 x CamR-MalE 融合タンパク質または融合タンパク質をfactor Xa で消化後、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した5 mMの2 x CamRタンパク質を用いてSPR実験を行った場合の共鳴角の時間的変化を示す。同じ試料を用いて3回繰り返し実験を行っている。一枚のセンサーチップを用いた連続実験である。なお、図18中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表2に示す通りである。
【0052】
【表2】
Figure 0004047482
【0053】
図19は図18で示された結果の内、 2 x CamR-MalE 融合タンパク質, および2 x CamRのDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【0054】
図20は濃度の違う5 mMおよび10 mMの2 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【0055】
図21は図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性調べた実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示したものである。
【0056】
図22は図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性を調べた実験で、ある時間の共鳴角の3 回の結果を平均化して示したものである。
【0057】
センサーに用いるCamRタンパク質は構築した大量発現用プラスミドを保有する組換え体(XL1-blue+1xCamR、XL1-blue+2xCamR、XL1-blue+3xCamR)を培養して、マルトース結合タンパク質の融合タンパク質として大量発現させる系によって、容易に精製することができた。CamRタンパク質は本精製法によって際限なく得ることが可能である。また精製したCamRタンパク質は- 20 ℃または- 85 ℃で長期間保存可能であり、4 ℃でも2週間以上安定である。
【0058】
図18に示されるように、SPRによるカンファーの測定はリアルタイムにデータを得ることができ、これに要した時間はDNAの固定から検出まで、一つのサンプルを20分未満で終了することができた。センサーチップはglycine-HCl (pH 1.0)溶液を用いて再生することができ、一枚のチップで10 回以上繰り返し使用することができた。また、センサーチップは超音波洗浄することによって再利用することができた。
【0059】
同じサンプルを繰り返し行った場合、ほぼ同じ共鳴角が得られ、再現性が得られた(図15および18)。カンファーを加えないCamRタンパク質のみのコントロールの共鳴角はカンファーを添加したもの (1 ng/ml および10μg/ml )より大きな値を示した(図21および図22)。この結果より、本実施例の原理で予測したように、カンファーに結合したCamRはカンファーの濃度依存的にDNAの結合が阻害されることが示された。
【0060】
図19よりSPRを用いて調べたCamRタンパク質のDNAの結合性は、CamRタンパク質がMalEタンパク質との融合タンパク質の状態より分離されたCamRタンパク質のみを用いた方が強いことが知られた。これはCamRタンパク質のMalEタンパク質との融合タンパク質の状態ではMalEタンパク質によって、DNAに結合するためのコンフォメーションを取ることが阻害されるためであると考えられる。このことからSPRに供するCamRタンパク質はfactor Xaで切断した後に、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製したものを用いた方が、臭気物質の検出感度の向上が見込まれた。
【0061】
図20より5 mMと10 mMの2xCamR-MalE 融合タンパク質の共鳴角を比較すると、5 mMのものより10 mMのものの方が共鳴角が高く、CamRタンパク質の濃度が高いほど共鳴角が高くなる傾向が見られた。これはSPRを用いた分子間の相互作用を分析する反応において結合する物質濃度が高いほどレスポンスが大きくなる事実と一致する。
【0062】
図21および図22より臭気物質カンファーは10 pg/ml〜100 ngの間の濃度を定量検出することができた。検出限界は100 fg/ml〜10 pg/mlの間であるが、正確な値は得られていない。この感度のレベルはヒトが鼻で感じることができるよりも10〜100倍高く、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた場合と同等またはそれ以上である。
【0063】
本実施例に用いている材料のDNAおよびCamRタンパク質は物質であり、取り扱いや実験場所に制限を受けない。感度はcamオペロンを微生物の発光遺伝子オペロンを用いた系の場合が1 ng / mlの検出限度(開発者らの以前のデータ)であったものが、本研究のSPR方法の場合が10 pg / mlである。従って、検出感度は本研究のSPRを用いた方法の方が、発光遺伝子を用いた方法より100 倍高い。測定時間は発光遺伝子を用いた場合20 時間要したものが、本研究のSPRを用いた方法は20分未満であり、大幅に測定時間を短縮することができる。
【0064】
実施例2
(A)(1) CamR の大量生産用プラスミドの構築
1) His-tagged CamRの構築(図23)
PCRに用いるためのHtnt-2プライマー5'-ATGCATCACCATCACCATCACATGGACATCAAG-3'はT4 ポリヌクレオチドキナーゼ処理してリン酸化した。1回目のPCRはpLC87を鋳型にして、Htnt-1プライマー5'-ATCACCATCACATGGACATCAAGCAGAGCTTGCTG-3'とr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて10サイクル行った。2回目のPCRは1回目のPCR反応液1μlを鋳型にして、リン酸化したHtnt-2プライマーとr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて25サイクル行った。増幅した断片はEco RIで切断した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、1058 bpの断片を分離回収した。この断片をpMal-c2のXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpHis-tagged camRとして、His-tagged CamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【0065】
(2) CamR の大量生産用プラスミドを保有する大腸菌からの CamR の精製
1) マルトース結合タンパク質(MalE)とCamRタンパク質の融合タンパク質の精製
CamR大量生産用プラスミドは大腸菌XL1-blueに導入した。得られた組換え体はDH5α+His-tagged CamRと名付け、以下、実施例1と同様にしてFactor XaによりMalEとCamRとに切断した。
【0066】
2) Ni-NTAカラムクロマト法による精製法
1 mg/ml のタンパク質溶液 1 ml は1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、4μgのFactor Xa (New England biolabs, Inc)を加え16 ℃で一晩インキュベートして、消化した。消化した10 mgのタンパク質はCentriplus 10 (Amicon,Inc.)を用いて溶解バッファー (50 mM NaH2PO4 pH8.0, 300 mM NaCl, 10 mMイミダゾール) に交換した。5 mlのNi-NTA Superflow レジン (QIAGEN)を1x10 cm のカラムに注いだ。カラムを40 mlの溶解バッファーで平衡化させた。溶解バッファーに交換したタンパク質を0.5 ml/minの流速でカラムに加えた。カラムを40 mlの溶解バッファーで洗った。カラムを40 mlの洗浄バッファー (50 mM NaH2PO4, pH8.0, 300 mM NaCl, 20 mMイミダゾール) で洗った。カラムに40 mlの溶出バッファー (50 mM NaH2PO4, pH8.0, 300 mM NaCl, 250 mMイミダゾール)を加えHis-tagged CamRを溶出させた。1 mlずつフラクションを回収した。回収したタンパク質はCentriplus 10 (Amicon,Inc.)を用いてカラムバッファー ( 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-メルカプトエタノール)に交換するとともに濃縮した。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、その後0.5 ml容マイクロチューブに分注し、SPR実験に使用するまで - 85℃保存した。
【0067】
(3) カンファーによる CamR の解離実験
実施例1と同様にして、DNAの固定→buffer交換→BSAによるブロッキング→グリシンHCl (pH1.0)によるフリーのBSAの洗い→CamR結合バッファーによる平衡化の一連の操作を行った。その後、10μlの10 mM CamR溶液を加えた。安定したところでエタノールに溶解した20 mMカンファー溶液をカラムバッファーで希釈した1pg/ml〜100ng/mlまでの濃度のカンファーを2μl 加えた。コントロールとして2 μlのカラムバッファーを添加した試料を用いた。この実験は2回行った。
【0068】
(4) CamR 二量体形成のモニタリング実験
実施例1と同様にして、DNAの固定→buffer交換→BSAによるブロッキング→グリシンHCl (pH1.0)によるフリーのBSAの洗い→CamR結合バッファーによる平衡化の一連の操作を行った。その後、10μlの10 mM CamR溶液を加え、20 分以上静置した。
【0069】
(5) かび臭物質 2-MIB の定量
カンファーと同様に上水におけるかび臭物質 2-メチルイソボルネオール(2-MIB)の定量性や検出限界を求める実験を行った。2-MIBはエタノールに溶解して20 mg/mlの濃度の保存液を調製した。この保存液は蒸留水で希釈し1 pg/ml〜10μg/mlの濃度に調製した。実験にはこの2-MIBの希釈液と10 mM His-tagged CamRの混合液10 μlを用いた。
【0070】
(B) 実験結果
1) 構築したプラスミドのマルトース結合タンパク質とCamRタンパク質をコードする遺伝子領域を含む塩基配列を図24,25に示す。
【0071】
2)MalE-CamR融合タンパク質からのCamRの精製は、CamRのアミノ末端に6 残基のヒスチジンを付加して発現したタンパク質をNi-NTAカラムによって分離精製する方法によって容易に高純度のタンパク質を大量に分離精製することができた。本方法はイオン交換カラムを用いて精製する方法と較べ、MalEやFactor Xaによって切れ残った融合タンパク質の混入もないため純度が高く、回収率も高かった。また、アミノ末端にヒスチジンが付加された融合タンパク質はFactor Xaによる消化が著しく高まり、少ない酵素量(以前の1/5量)で切れ残りがほとんどなくなった。このため、本方法によるCamRの生産および精製法は高価なFactor Xa の使用量が少なくて済むためコストを低くすることができることも有益である。
【0072】
3) カンファーによるDNAからCamRの解離度を調べる実験は図26に示す共鳴角の減少量の値を用いた。この結果、1 pg/ml 〜 100 ng/mlの濃度のカンファーを添加した場合の共鳴角の減少度はbufferのみのコントロールの減少度と同程度かこれより低く、著しく大きくなることはなかった。このため、カンファー添加によるDNAからCamRの解離現象を検出することはできなかった。従って、臭気物質によってDNAからCamRが解離する現象をもとに臭気物質量を測定する方法は適用できないことが示された(図27、28)。なお、図27中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表3に示す通りである。
【0073】
【表3】
Figure 0004047482
【0074】
4)CamRタンパク質のDNAの結合性は予めCamRタンパク質とカンファーまたは2-MIBを結合させた混合試料をDNAに結合させたところ、カンファーまたは2-MIBの添加量に応じた結合が示された(図31)。また、この場合の共鳴角の変化量はカンファーまたは2-MIBの濃度の違いを十分に捕らえることができた。従って、かび臭物質の検出にはCamRタンパク質のかび臭物質によるDNAへの結合阻害度から求める方法が適している。本方法によってSPRを応用したかび臭バイオセンサーの基本原理が完成した。
【0075】
5)実施例1又は実施例2で作製した、MalE-1xCamR融合タンパク質、His tagged CamR、MalE-2xCamR融合タンパク質、2xCamRタンパク質、MalE-3xCamR融合タンパク質のDNAの結合性はHis-tagged CamRが圧倒的に高いDNA結合を示した(図29)。ただし、コントロールはCamRを加えないバッファーのみの試料であり、また濃度は2xCamRタンパク質が5 mMであり、他は10 mMの濃度のタンパク質である。また、値は3回の平均値である。この結果はMalEまたはタンデムに繋がった際のCamRの構造がDNA結合を阻害しているためであると考えられ、そのため以後の実験にはNi-NTAカラムによって精製した単独のCamRタンパク質を用いた。
【0076】
6)CamRタンパク質のDNA結合状態の時間変化をSPRでモニターした所、約10 分までは一つの右上がりのDNA結合曲線が検出されたが、その後にもう一つの右上がりの曲線が検出された(図30)。Aramakiら(上掲)は、CamRがDNAに結合する際、二量体で結合すると報告している。この考察から推測すると、最初の反応は1つ目のCamRがDNAに結合した反応であり、次の反応は、2つ目のCamRが1つ目のCamRとDNAに結合した反応であるかも知れない。すなわち、CamRのDNAの結合はCamRが二量体となってからDNAに結合するのではなく、一つのCamRが結合した後に、DNAの上でもう一つのCamRが結合すると考えられる。本研究の臭気物質の測定には一つ目の反応を用いている。しかしながら、今後、2つ目の反応を用いて臭気物質を測定すれば、トータルの反応は大きくなり、感度の向上に役立つかも知れない。
【0077】
7)上水におけるかび臭物質2-メチルイソボルネオール(2-MIB)を本センサーによって測定したところ、1 ng/L〜10 mg/Lまで定量的に検出することができた(図31)。このレベルはヒトの鼻の約数十倍であり、ガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)法と同程度である。
【0078】
【発明の効果】
以上のように、本発明により、微生物に比較して取り扱いが簡便で、培養が不要で測定に要する時間が短く、かつ、従来の微生物センサーよりも高感度で臭気物質等の物質を測定することができる物質測定用センサーが提供された。
【0079】
【配列表】
Figure 0004047482
Figure 0004047482
【0083】
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【0084】
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【0085】
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【0086】
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【0087】
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【0088】
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【0089】
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【0090】
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Figure 0004047482
【0091】
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【0092】
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【0093】
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【0094】
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【0095】
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【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のセンサーを用いた測定方法の原理を説明するための模式図である。
【図2】本発明の実施例で作製した、camRタンパク質の単量体とMalEタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるp1xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図3】本発明の実施例で作製した、camRタンパク質の二量体とMalEタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるp2xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図4】図3の続きを示す図である。
【図5】図4の続きを示す図である。
【図6】本発明の実施例で作製した、camRタンパク質の三量体とMalEタンパク質との融合タンパク質発現するベクターであるp3xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図7】図6の続きを示す図である。
【図8】 p1xcamRベクター中の、camRタンパク質の単量体とMalEタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図9】図8の続きを示す図である。
【図10】 p2xcamRベクター中の、camRタンパク質の二量体とMalEタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図11】図10の続きを示す図である。
【図12】 p3xcamRベクター中の、camRタンパク質の三量体とMalEタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図13】図12の続きを示す図である。
【図14】図13の続きを示す図である。
【図15】実施例1で行なった、SPR実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図16】図15で示された結果の内、それぞれ同濃度の1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3xCamR-MalE融合タンパク質のDNAに対する結合実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示した図である。
【図17】図15で示された結果の内、それぞれ 1 x CamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。コントロールはタンパク質の溶解に用いたバッファーのみを添加したものである。
【図18】本発明の実施例において、各種濃度のカンファーを測定したSPR実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図19】図18で示された結果の内、2 x CamR-MalE 融合タンパク質, および2 x CamRのDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。
【図20】本発明の実施例において、濃度の違う5 mMおよび10 mMの2 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。
【図21】図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性調べた実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示した図である。
【図22】図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性を調べた実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。
【図23】本発明の実施例で作製した、ヒスチジンが6個連続して成るタグを含むcamRタンパク質の単量体とMalEタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるpHis-tagged CamRを構築する方法を説明するための図である。
【図24】 pHis-tagged CamRベクター中の、camRタンパク質の単量体とMalEタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図25】図24の続きを示す図である。
【図26】実施例2において、試料液にカンファーを加える前後の共鳴角の変化を示す図である。
【図27】実施例2で行なったSPR実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図28】実施例2で行なったSPR実験における、添加したカンファー濃度と共鳴角との関係を示す図である。
【図29】本発明の実施例で作製した、各種リプレッサータンパク質とcamオペロンDNAとの結合性を示す図である。
【図30】実施例2において行った、CamR二量体形成のモニタリング実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図31】実施例2において行った、2−メチルイソボルネオールの測定実験により得られた、2−メチルイソボルネオールの濃度と共鳴角との関係を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor for measuring various substances such as odor substances.
[0002]
[Prior art]
As an odor sensor for detecting an odor such as a mold odor substance, a microbial sensor produced by a genetic engineering technique is known (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 8-242857). This microbial sensor includes an operator / promoter region in a camphor hydroxylase operon (cam operon) and a reporter gene that is inserted downstream of the region and is controlled by the region, and the expression of which can be detected. For example, a microorganism transformed with a recombinant vector containing a β-galactosidase gene or a luciferase gene group. The cam operon is an operon derived from the CAM plasmid of Pseudomonas keptida that can grow using camphor (camphor) as the sole carbon source, and acts at the initial stage of camphor degradation. When an odorous substance such as camphor is present in the test sample, the odorous substance acts on the operator / promoter region and a downstream reporter gene is expressed, so that the odorous substance can be detected.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The known microbial sensor has advantages such as high specificity with respect to a recognition substance and an increase in the number of materials that are microorganisms without limit, so that the material cost is low. However, the microbial sensor is inconvenient to handle because the sensor itself is a microorganism, and has a problem that it takes a measurement time because it requires a culture time. Needless to say, it is more preferable if the detection sensitivity is further improved.
[0004]
Therefore, the object of the present invention is to measure substances such as odorous substances with a higher degree of sensitivity than conventional microorganism sensors, which is easier to handle than microorganisms, does not require culturing, has a short measurement time, and is more sensitive than conventional microorganism sensors. It is to provide a sensor for measuring substances.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research, the inventor of the present application has achieved a simple and short by using a sensor formed by binding a nucleic acid that binds to a repressor protein that binds to a substance to be measured on the surface of a sensor chip of a surface plasmon resonance apparatus. The inventors have found that substances can be measured with high sensitivity over time, and the present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention is a substance obtained by binding a nucleic acid that binds to a repressor protein that binds to a substance to be measured on the surface of the sensor chip of the surface plasmon resonance apparatus opposite to the side on which light is incident during measurement. Provide a sensor for measurement.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The surface plasmon resonance (SPR) method is performed when the refractive index of a medium such as a solution in contact with the lower surface of a sensor chip (a metal substrate such as gold deposited on a glass substrate) changes. This is a method for measuring the change in the refractive index of a medium by utilizing the change in the angle of the reflected light with reduced intensity among the reflected light incident at various angles through the prism (Seiichi Kasai, Protein Nucleic acid enzyme, Vol.37 No.15 (1992), pp.2977-2984). The intensity of the reflected light reflected at a specific angle decreases because resonance occurs when the wave number of the surface wave called surface plasmon generated on the surface of the metal thin film coincides with the evanescent wave generated at the interface between the glass and the metal thin film, This occurs because part of the energy of the light is used to excite surface plasmons and reduces the amount returned as reflected light. If one of the reactants involved in the chemical reaction is bound to the lower surface of the sensor chip, the refractive index of the medium that contacts the lower surface of the sensor chip changes as the reactant reacts with the other reactant, The angle of the reflected light with reduced intensity (this angle is called “resonance angle”) changes from moment to moment as the chemical reaction proceeds. Therefore, the progress of the chemical reaction can be observed in real time by measuring the change in the resonance angle in real time. For this reason, SPR is used for the study of chemical reaction kinetics, and in the field of biochemistry, it is used for analysis of antigen-antibody reaction.
[0008]
The sensor of the present invention utilizes the above SPR device. Since the SPR device itself is commercially available, a commercially available product can be used. In the sensor of the present invention, a nucleic acid that binds to a repressor protein that binds to a substance to be measured is bound on the lower surface of the sensor chip of the SPR device (that is, on the opposite side of the light incident side during measurement). Yes. As the nucleic acid to be bound, any nucleic acid can be used as long as it binds to the repressor protein that binds to the substance to be measured. A preferred example of such a nucleic acid is an operator sequence in an operon including a gene encoding the repressor protein. An example is an operator in the cam operon that binds to a camphor repressor protein. The nucleotide sequence of the operator in the cam operon is known, and Aramaki, H., et al., (1993) J. Bacteriol., 175, 7828-7833, and Fujita, M. et al., (1993) J. Bacteriol, 175, 6953-6958. Repressor proteins encoded by the camR gene in the cam operon bind to the operator in the cam operon. Furthermore, if the operon of microorganisms in the environment is metabolized, in addition to organic substances that exist naturally, those that are artificially created by humans and released to the environment, benzene, xylene, toluene, naphthalene, phenol Since microbial operons containing genes encoding repressor proteins that bind to harmful organic substances such as organic heavy metals such as methylmercury are already known, operator sequences in these operons can also be used. A nucleic acid having a sequence in which one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in the operator sequence and which binds to the repressor protein can also be used. In particular, in order for a repressor protein to bind, a complete operator sequence is not required, and only a part of the operator sequence needs to be present. Therefore, such a partial sequence of an operator can also be preferably used. For example, as an example of a preferable operator partial sequence of the cam operon, there can be mentioned the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Needless to say, a nucleic acid having a sequence in which one or a plurality of nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which binds to a camphor repressor protein is also preferably used. be able to.
[0009]
Nucleic acid binding to the sensor chip surface of the SPR device is based on the SA membrane method using disulfide compounds (Taizo UDA et al., (1995) DENKI KAGAKU, 63, NO.12, 1160-1166), thiol membrane method, L -B membrane method (Ryuichi Yasuda et al. (1997) IEICE Transactions C-II Vol. J80-C-II No.1 pp.1-7) can be used by a method known per se. Among these, the SA membrane method is preferable because nucleic acid can be immobilized easily and the sensor chip can be reused. By these methods, one end of the nucleic acid can be bound to the surface of the sensor chip, and no part other than the end of the nucleic acid is in contact with anything, so the nucleic acid immobilized on the surface of the sensor chip is not repressor. It can freely bind to proteins. A specific example of a method for bonding DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 to a sensor chip deposited with gold on a glass substrate by the SA film method is described in detail in the following examples. The amount of nucleic acid to be bound to the surface of the sensor chip is not particularly limited and may be any amount as long as the substance in the sample can be measured, but is usually 1 mm.2It is about 500 to 2000 pmol per unit.
[0010]
In the measurement, a sample that may contain a substance to be measured added with the repressor protein is brought into contact with the lower surface of the sensor chip, and light at various angles is placed on the upper surface of the sensor chip. The resonance angle is measured in real time by measuring the intensity of the reflected light. If the sample contains a substance to be measured, the substance binds to the repressor protein, so the repressor protein cannot bind to the nucleic acid immobilized on the sensor chip. Hardly changes before and after the measurement. On the other hand, when the substance to be measured is not contained in the sample, the repressor protein binds to the nucleic acid, so that the resonance angle is greatly increased. Since the degree of increase of the resonance angle depends on the amount of the substance contained, measuring the increase of the resonance angle enables not only detection of the substance in the sample but also quantification. Therefore, in this specification, “measurement” includes both detection and quantification. Note that the operation of making light incident on the sensor chip and the operation of measuring reflected light can be easily performed according to the instruction manual of a commercially available SPR device. FIG. 1 schematically shows the above measurement principle in the case of measuring camphor, which is an odorous substance, using camR protein as a repressor protein.
[0011]
In addition, the final concentration of the repressor protein added to the sample is not particularly limited and can be appropriately selected in light of the expected range of the amount of the substance to be measured. Usually, about 1 to 1000 mM is preferable, More preferably, it is about 5 to 200 mM. In addition, the repressor protein itself can be prepared in a large amount by a genetic engineering technique because the gene encoding it can be cloned by a known method (see Examples below).
[0012]
The repressor protein may be any one that can bind to the substance to be measured and the nucleic acid, and is not necessarily the same as the natural repressor protein. That is, one or more amino acids in the amino acid sequence of a natural repressor protein are substituted, deleted, or one or more amino acids are inserted or added, and the substance to be measured and the above Those capable of binding to a nucleic acid are also encompassed by the “repressor protein” referred to in the present invention. Accordingly, a fusion protein of a natural repressor protein and another protein that can bind to the substance to be measured and the nucleic acid is also included in the “repressor protein” referred to in the present invention.
[0013]
As such a modified repressor protein, for example, in the following examples, a protein in which a 6-residue histidine tag is added to the amino terminus of CamR is used. Included in “pressor protein”. By adding multiple histidine residues to the amino terminus of the repressor protein, high purity can be easily achieved by separation and purification using Ni-NTA (Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)) column. In this method, the repressor protein is first expressed as a fusion protein with other proteins, and then the repressor protein is purified by cleaving the fusion portion with Factor Xa or the like. Compared with the method of purification using an ion exchange column, there is no contamination with other proteins to be fused or uncut fusion protein, resulting in higher purity and higher recovery, and addition of histidine at the amino terminus. The digested fusion protein is significantly digested by Factor Xa, and there is almost no uncut residue with a small amount of enzyme (previous 1/5) For this reason, by adding multiple histidine residues to the amino terminus of the repressor protein and purifying with a Ni-NTA column, the amount of expensive Factor Xa used can be reduced, thereby reducing the cost. In this case, the number of histidine residues to be added is preferably about 4 to 8.
[0014]
In the case where the operator of the cam operon or a partial sequence thereof is used as the nucleic acid and the camR protein is used as the repressor protein, the binding between the operator or the partial sequence thereof and camR is smooth when the measurement is performed in the presence of calcium ions. This is preferable. In this case, the concentration of calcium ions is not particularly limited, but is preferably about 1 to 10 mM.
[0015]
The substance measured using the sensor of the present invention varies depending on the type of nucleic acid bound to the sensor chip and the type of repressor protein. For example, as the nucleic acid bound to the sensor chip, the operator sequence of the cam operon or its When a partial sequence is used and a camphor repressor protein is used as a repressor protein, mold odor substances such as camphor, 2-methyl-isoborneol and isoborneol can be exemplified. In addition, as described above, if the operon of microorganisms in the environment is metabolized, in addition to naturally occurring organic substances, humans artificially created and released to the environment, benzene, xylene, It can also be applied to the measurement of harmful organic substances such as toluene, naphthalene and phenol, and organic heavy metals such as methylmercury. The test sample may be any sample for which the substance contained therein is to be measured, for example, drinking water such as tap water, water such as the ocean, rivers, ponds, etc. Substances such as contained odor substances can be measured.
[0016]
The odor substance that reacts with the CamR protein belongs to a compound called monoterpene, including camphor. Monoterpenes are also known as scents for the majority of plants and fruits and as pheromones for some species of insects. CamR protein reacts not only with camphor but also with many bicyclic monoterpenes having a similar structure (JP-A-8-242857). In addition, the type of monoterpene that reacts with several types of CamR mutants varies depending on the mutant type. Some mutants have selectivity and react only with camphor (Japanese Patent Laid-Open No. 10-52276), react with not only bicyclic monoterpenes but also mono- and ring-opening monoterpenes (Japanese Patent Laid-Open No. 10-28591). By using these mutant CamR proteins in this method as in the wild type, in addition to the analysis of camphor, it can also be applied as a sensor to analyze the scent of plants (including food).
[0017]
The wild-type CamR protein also reacts to 2-methylisoborneol, a musty odorant in the waterworks, much like the structure of camphor. Some of the mutants react with geosmin, another musty odorous substance belonging to sesquiterpenes (JP-A-10-28591). Therefore, it is considered that the sensor of the present invention can be used for a water quality test for analyzing musty odor substances.
[0018]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples. In the following examples, the methods described in Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press were used unless otherwise specified.
[0019]
Example 1
(A) (1)CamR Of plasmid for mass production
The construction of a plasmid for mass production of CamR uses the E. coli expression vector pMal-c2 (New England Biolabs, INC.), Which is expressed as a maltose binding protein-sample fusion protein and affinity purified using an amylose resin column. It was. However, the purification of CamR from the MalE-CamR fusion protein was performed by one of the following two methods. One is a method by ion exchange column chromatography (Example 1), and the other is a 6-residue histidine tag added to the amino terminus of CamR (introduced by PCR), and this His-tagged CamR is converted into Ni-nitrilo. A method (Example 2) for purification by column chromatography using triacetic acid (Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)) was employed.
[0020]
In the surface plasmon resonance reaction, the greater the molecular weight of the molecule to be reacted, the greater the resonance angle and the higher the sensitivity. CamR also binds in dimers when bound to DNA (Aramaki, H. supra).
[0021]
Taking these SPR principles and CamR properties into consideration, each camR gene linked to a maltose-linked gene is linked to one (1xcamR), two linked (2xcamR) or three (3xcamR) tandems. Thus, it was constructed to increase the SPR reaction by increasing the molecular weight. Four amino acid (glycine) residues were introduced between the camR genes by PCR.
[0022]
1) Construction of 1xcamR (Figure 2)
The camR-Nt primer 5′-ATGGACATCAAGCAGAGCTTG-3 ′ for use in PCR was treated with T4 polynucleotide kinase to phosphorylate the 5′-OH group. PCR was performed using phosphorylated camR-Nt primer and r7 primer 5′-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3 ′ using pLC87 (JP-A-8-242857, FERM P-14818) as a template. The amplified fragment was cleaved with Eco RI and then subjected to agarose gel electrophoresis, and a 1037 bp fragment was separated and recovered. This fragment was inserted into the Xmn I and Eco RI sites of pMal-C2. The obtained plasmid was used as p1xcamR as a plasmid for mass expression of 1xCamR.
[0023]
2) Construction of 2xcamR (Figs. 3-5)
Hind-r2 primer 5'-CC introduced with camR-Nt primer and Hind III site using pLC87 as a templateAAGCTTAmplification was performed using GGCTTTTTGCAGGGCCAAGTCTTGTGTGTACCCT-3 ′. The amplified fragment was digested with Hind III and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 513 bp fragment. (This is the A fragment).
[0024]
After cleaving pLC87 with Eco RI, agarose gel electrophoresis was performed, and the 1383 bp fragment obtained by separation and recovery was converted into pBluescript II SK.-Inserted into the Eco RI site of (STRATAGENE). The obtained plasmid pSK + LC87 was digested with Eco RI and Sph I and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 626 bp fragment. The fragment recovered from the gel was used as the first template for the introduction of a Hind III site and 4 amino acid (glycine) residues 5 ′ by the following 5 successive PCRs. First PCR is Hin 21 primer 5'-GGTGGAGGTGGAATGGATen cycles were amplified using CATCAAGCAGAGCTTGCTGCACGCA-3 ′ and RV primer 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′. Second PCR is Hin 22 primer 5'-ATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAATGGACATCAAGCAGAGC-3 ′ and RV primer were used for 10 cycles using 1 μl of the first PCR reaction solution as a template. 3rd PCR is Hin 23 primer 5'-GCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAUsing ATGGAC-3 ′ and RV primer, 10 cycles were performed using 1 μl of the second PCR reaction solution as a template. 4th PCR is Hin 24 primer 5'-ATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGAUsing -3 ′ and RV primers, 10 cycles were performed using 1 μl of the third PCR reaction solution as a template. 5th PCR is Hin 25 primer 5'-CCAAGCTTUsing GACATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAG-3 ′ and RV primer, 25 cycles were performed using 1 μl of the 4th PCR reaction solution as a template. The amplified fragment was cleaved with Hind III and Bgl II, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 183 bp fragment. (This was called B-1 fragment)
[0025]
pSK + LC87 was cleaved with Bgl II and Eco RI, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 905 bp fragment. (This was called B-2 fragment)
[0026]
The B-1 and B-2 fragments were ligated and inserted into the Eco RI and Hind III sites of pBluscript II KS-. The obtained plasmid pKS + Hin25 was cleaved with Eco RI and Hind III and subjected to agarose gel electrophoresis to separate and recover a 1088 bp fragment. (This was C fragment)
[0027]
pMal-C2 was cut with HindIII and then blunted using Klenow DNA polymerase. This was self-ligated and the plasmid that disrupted the Hind III site was introduced into E. coli. A plasmid was prepared from this transformant to obtain pMal-C2 / Hind IIIb.
[0028]
The A fragment and the C fragment were ligated and inserted into the Xmn I and Eco RI sites of pMal-C2 / Hind IIIb. The obtained plasmid was used as p2xcamR as a plasmid for mass expression of 2xCamR.
[0029]
3) Construction of 3xcamR (Figs. 6-7)
PCR was performed using pKS + Hin25 as a template and using Hinr2 primer and RV primer. The amplified fragment was cleaved with Hind III, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 565 bp fragment. The recovered fragment was inserted into the Hind III site of pBluscript II KS-. PKS + Hin25-Hinr2 was cleaved with Hind III, and the resulting plasmid was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover a 565 bp fragment. (This was D fragment)
[0030]
The D fragment was inserted into the Hind III site of p2xcamR. The resulting plasmid in the forward direction was used as a plasmid for mass expression of 3xCamR as p3xcamR.
[0031]
4) PCR
PCR was performed under the following conditions unless otherwise noted. The PCR reaction was performed at 94 ° C for 2 minutes for 1 cycle, 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 70 ° C for 1 minute for 25 cycles. Each (adenosine, thymine, guanosine, cytosine) deoxynucleotide triphosphate was added to a final concentration of 200 μM. 20 pmol of each primer was used. MgCl2Was added to a final concentration of 1 mM. As a DNA polymerase, 1 unit of KOD DNA polymerase (TOYOBO CO., LTD) was used. 1 ng of plasmid DNA for each template was used.
[0032]
(2)CamR From Escherichia coli, which has a plasmid for mass production of CamR Purification
1) Purification of maltose binding protein (MalE) and CamR protein fusion protein
Each plasmid for mass production of CamR was introduced into E. coli XL1-blue. The obtained recombinants were named XL1-blue + 1xCamR, XL1-blue + 2xCamR, and XL1-blue + 3xCamR, respectively, and used for the following experiments.
[0033]
Each transformant stored in a glycerol solution at -85 ° C was streaked on a 1xLB agar medium containing 100 µg / ml ampicillin (Amp) and incubated at 37 ° C overnight. Single colonies were inoculated into 1 ml LB liquid medium containing 20 ml of Amp and cultured overnight at 37 ° C with shaking. The next day, 10 ml of the culture solution was transferred to 1 L glucose-rich 1 × LB medium containing Amp and cultured at 30 ° C. with shaking at 110 rpm until the OD600 nm reached 0.5. IPTG was added so that the final concentration was 0.3 mM, and further cultured for 2 hours. The culture was transferred to a 500 ml tube and collected by centrifugation at 4 ° C, 5,000 rpm for 5 minutes. The medium was discarded, and the cells were transferred to a 50 ml tube and stored at -85 ° C until the next operation. The cells were suspended in 1 ml column buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol) using a Pasteur pipette. Thereafter, the cells were transferred to a 10 ml volume plastic crusher tube. The mixture was sonicated for 20 seconds and cooled for 1 minute. This operation was performed 10 times. The cell disruption solution was transferred to a 1.5 ml microtube and centrifuged at 4 ° C., 15,000 rpm for 20 minutes. The supernatant (crude extract) was transferred to a new microtube. 15 ml of amylose resin (New England biolabs, Inc) was poured into a 2.5 x 10 cm column. The column was washed with 400 ml column buffer. The crude extract (2.5 μg / μl) was loaded at a flow rate of about 1 ml / min. Washed with 600 ml column buffer. The fusion protein was eluted with 60 ml of column buffer containing 10 mM maltose. Fractions were collected in 3 ml portions. Fractions containing protein were pooled. The protein was quantified using protein assay kit I (BIO-RAD Laboratories), and an appropriate amount was used for the factor Xa digestion.
[0034]
2) Purification of CamR protein from MalE and CamR fusion protein
Purification by ion exchange column chromatography
1 ml of a 1 mg / ml protein solution was transferred to a 1.5 ml microtube, 4 μg Factor Xa was added, and the mixture was incubated overnight at 16 ° C. for digestion. The digested 10 mg protein was replaced with TNbuffer (20 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 8.0) using Ultracent-10. 6 ml of TSKgel DEAE-Toyopearl 650 Medium (Tosoh Corp.) was added to a 50 ml tube. To this, 20 ml of TNbuffer was added and mixed. The mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour and separated. The supernatant was discarded and repeated. The 1x10 cm column gave a 5 ml bed volume and was poured with DEAE resin. The column was washed with 15 ml TNbuffer. Protein digested with factor Xa and exchanged with buffer was added to the column. The column was washed with 30 ml of the same buffer. The column was gradient from an initial buffer concentration of 25 mM NaCl to a final buffer concentration of 500 mM NaCl (25 ml each containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.0). Fractions were collected 1 ml each. The recovered protein was exchanged to a column buffer using Ultracent-10 and concentrated. Protein was quantified using Protein Assay Kit I (BIO-RAD Laboratories), then dispensed into 0.5 ml microtubes and stored at -85 ° C until used for SPR experiments.
[0035]
(3)SPR Method for measuring camphor
1) SPR device
Devices that measure the interaction of biomolecules using the surface plasmon resonance method are manufactured and sold by several machine manufacturers. In this example, NL-SPR670-E (1-channel batch type) manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. was used. Hereinafter abbreviated as SPR device. This SPR device uses semiconductor laser light having high sensitivity as a light source. In addition, it is possible to select an SA membrane method using a disulfide compound, a thiol membrane method, an LB membrane method, or the like for immobilization of a ligand. When the SA membrane method using a disulfide compound is used to immobilize the ligand, the immobilization is easy, and the gold-deposited glass substrate, which is the sensor chip, can be reused, so there is no running cost. Gold-deposited glass substrates are available from the manufacturer. Therefore, in this example, the SA membrane method using a disulfide compound was adopted for immobilization of the ligand. The present embodiment can be applied to other SPR devices as long as DNA can be immobilized.
[0036]
2) Preparation of SA membrane using disulfide compound
The SA film using a disulfide compound was produced as follows according to the method of Nippon Laser Electronics Co., Ltd.
[0037]
(i) Acetone was added to a glass plate having a diameter of 10 ml. A gold-deposited glass substrate, which is a sensor chip, was immersed in this, and gently stirred and washed. (ii) A 10 mM 4,4-Ditho butyric acid (DBA) ethanol solution was further diluted 1000 times with ethanol to a final concentration of 10 μM. The diluted solution was added to another glass plate. A sensor chip washed with acetone was immersed in this and gently stirred. Then, it left still at room temperature for 30 minutes. By this reaction, the disulfide compound is bonded to the gold surface. (iii) Ethanol was added to another glass plate. The sensor chip of (ii) was immersed in this, gently stirred and washed. Ethanol was discarded and repeated. (iv) A solution of 25 mg aqueous carbodiimide and 15 mg N-hydroxysuccinimide dissolved in 10 ml 90% 1,4-dioxane was prepared and added to another glass plate. The sensor chip (iii) washed with ethanol was immersed in this, and gently stirred. Then, it left still at room temperature for 15 minutes. By this reaction, the sensor chip is activated so that a ligand having an amino group can be bound thereto. (v) Add ultrapure water to another glass plate. This was immersed in the sensor chip activated as described above, gently stirred and washed. (vi) The sensor chip washed with ultrapure water was placed on a paper towel and dried until it was attached to the SPR device.
[0038]
3) Preparation of operator DNA to be immobilized on the sensor chip
(i) Operator DNA sequence
The operator DNA sequence site to which the CamR repressor protein binds has been identified by Aramaki H., et al., (Supra). In this example, 27 bases out of this site were used as operator sequences. The sense strand is 5'-GCTCAGTATATCGCAGATATAGGGCCT-3 'and the antisense strand is 5'-AGGCCCTATATCTGCGATATACTGAGC-3'. These two oligonucleotide DNAs were introduced with an amino group at the 5 ′ end during synthesis so that they could be chemically bound to the activated sensor chip. The synthesized oligonucleotide DNA was purified by HPLC. Oligonucleotide DNA was synthesized under the same conditions as that produced by Japan Genosys Biotechnology Co., Ltd.
[0039]
(ii) DNA annealing
5 μl each of 50 pmol of the sense strand and antisense strand oligonucleotide DNA was dissolved in TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). This was added to a 0.5 ml microtube, mixed, and heated at 95 ° C. for 10 minutes for denaturation. Then, it was allowed to stand at room temperature for 20 minutes for annealing. The annealed DNA was bound to the SA membrane by the method described later.
[0040]
4) Binding of purified CamR protein and DNA immobilized on sensor chip
In a 0.5 ml microtube, each 9 μl of purified CamR-MalE fusion protein (1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE) or 1 μl of 10 x 10 x CamR binding buffer (200 mM HEPES (pH 8.0), 10 mM MEDTA, 100 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM CaCl2) And 2 μl of column buffer. This solution was allowed to stand for 10 minutes or more at room temperature until it was put on the SPR apparatus. The solution was added to a sensor chip on which DNA was immobilized.
[0041]
5) Binding reaction between purified CamR protein and camphor
A camphor ethanol solution prepared by dissolving in 100 mg / ml in ethanol was serially diluted to 100 fg / ml with a column buffer in which CamR protein was dissolved. 9 μl of purified CamR protein (2 × CamR) was added to a 0.5 ml microtube. Next, add each concentration of camphor (from 1 μg / ml to 100 fg / ml) diluted with 1 μl of 10 x CamR binding buffer and 2 μl of binding buffer, mix and mix at room temperature for at least 10 minutes. I left it until I put it. As a control, a sample to which only equal amounts of CamR protein (2 × CamR) and column buffer were added was used. This was added to a sensor chip on which DNA was immobilized.
[0042]
6) Operation procedure of SPR device
(i) The SPR device was turned on and stabilized one hour before use. (ii) Activated sensor chip was placed in the center of the prism of the device with a drop of refraction liquid for microscope (Cargille, refractive index 1.518) and placed gently, and fixed so that it does not move with a clasp. . (iii) 20 μl of TE was added. It was allowed to stand for about 1 minute until the resonance angle was stabilized. (iv) 10 μl of TE was sucked and discarded with a micropipette, and 10 μl (100 pmol) of the annealed DNA solution was added. The resonance angle increased, and then the mixture was allowed to stand for about 3 minutes until a certain resonance angle was reached. (v) 10 μl of the DNA solution was sucked with a micropipette and discarded, and 20 μl of column buffer was added. The resonance angle increased, and then the mixture was allowed to stand for about 3 minutes until a certain resonance angle was reached. (vi) 20 μl of column buffer was sucked with a micropipette and discarded, and 5 μl of 10 mg / ml BSA (bovine serum albumin dissolved in ultrapure water) solution dissolved in the column buffer was added. The resonance angle increased, and then the mixture was allowed to stand for about 5 minutes until a certain resonance angle was reached. Here, BSA was added to block non-specific binding of CamR protein by blocking empty sites on the chip surface where DNA was not bound. (vii) BSA solution was sucked with a micropipette and discarded. Add 10 μl of glycine-HCl (pH 1.0) solution, let stand for about 30 seconds, quickly aspirate 10 μl with a micropipette and discard, and pipette 10 μl at a time until the resonance angle becomes stable with the column buffer. Went. Glycine-HCl (pH 1.0) solution was added to remove free BSA. The resonance angle decreased to a certain line and was allowed to stand until stable. (viii) Next, 10 μl was sucked and discarded with a micropipette, and 10 μl of 1 × CamR binding buffer was added. The resonance angle increased, and then the mixture was allowed to stand for about 1 minute until a certain resonance angle was reached. The resonance angle at this time was recorded as a value before adding the CamR protein. (ix) 10 μl of the CamR protein sample prepared in 4) or 5) was added. The resonance angle increased, and then left to stand for about 1 minute until a certain resonance angle was reached. The resonance angle at this time was recorded as a value after adding CamR protein. (x) 10 μl was sucked with a micropipette and discarded, 10 μl of glycine-HCl (pH 1.0) solution was added and allowed to stand for about 30 seconds. Immediately suck and discard 10 μl with a micropipette, and pipette 10 μl at a time until the resonance angle is stable, and exchange the buffer. The solution was then aspirated with a micropipette and discarded. A glycine-HCl (pH 1.0) solution was added to dissociate the CamR protein bound to DNA and regenerate the sensor chip.
[0043]
(xi) Using a sensor chip regenerated with a glycine-HCl (pH 1.0) solution, (viii), (ix), and (x) were repeated with another sample. (xii) Quantitative determination of camphor was performed by combining the SPR reaction data for a certain time from the addition of each concentration of camphor and CamR protein binding reaction sample to stabilization.
[0044]
7) Reuse of sensor chip
The sensor chip used for SPR was reused after washing and removing DNA, protein, camphor, etc. bound to the surface by ultrasonic cleaning according to the following procedure. (i) 100 ml of acetone was added to a 200 ml beaker, the sensor chip used for this was added, and a weight was placed on the beaker in the bath of an ultrasonic washing machine and washed for 20 minutes. (ii) After washing, the sensor chip was placed on a paper towel, dried and used for the next SPR experiment.
[0045]
(B) Result
The base sequences including the gene region encoding the maltose binding protein and CamR protein of the constructed plasmid are shown in FIGS.
[0046]
The CamR protein could be purified to a single molecule by the purification method described above.
[0047]
Fig. 15 shows that the annealed DNA was immobilized on a sensor chip using 100 pmol, and purified using a 10 mM amylose resin column (1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE). ) Or a fusion protein after digestion with factor Xa, followed by SPR experiment using 10 mM CamR protein (2 × CamR) separated and purified using DEAE ion exchange column chromatography. The experiment was repeated three times using the same sample. The result of the continuous experiment using one sensor chip is shown. The contents of the operations for the numbers indicated by the arrows in FIG. 15 are as shown in Table 1 below.
[0048]
[Table 1]
Figure 0004047482
[0049]
Figure 16 shows typical results of binding experiments for DNA of 1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, and 3xCamR-MalE fusion proteins from the results shown in Figure 15, respectively. Is superimposed on a single graph.
[0050]
FIG. 17 shows the results of the binding shown in FIG. 15 for 1 x CamR-MalE, 2 x CamR-MalE, and 3 x CamR-MalE fusion proteins. The results are shown averaged.
[0051]
Figure 18 shows 100 pmol of annealed DNA immobilized on a sensor chip, each digested with 2 x CamR-MalE fusion protein or fusion protein purified using a 5 mM amylose resin column with factor Xa, followed by DEAE ions Fig. 6 shows the change in resonance angle with time when an SPR experiment was performed using 5 mM 2 x CamR protein separated and purified using exchange column chromatography. The experiment was repeated three times using the same sample. This is a continuous experiment using a single sensor chip. The contents of the operations for the numbers indicated by the arrows in FIG. 18 are as shown in Table 2 below.
[0052]
[Table 2]
Figure 0004047482
[0053]
Fig. 19 shows the result of binding of 2 x CamR-MalE fusion protein and 2 x CamR to the DNA of the results shown in Fig. 18, averaging the results of three resonance angles over a period of time. is there.
[0054]
FIG. 20 shows the results of averaging three resonance angles over a period of time in a binding experiment of 5 mM and 10 mM 2 × CamR-MalE fusion proteins with different concentrations to DNA.
[0055]
Fig. 21 shows the results of Fig. 18, in which the quantitative properties of camphor were examined using purified 2 x CamR protein and camphor at concentrations of 100 fg / ml, 1 ng / ml, and 10 μg / ml. A typical example of the results is extracted, and a response curve over a certain period of time is superimposed on a single graph.
[0056]
Figure 22 shows the results shown in Figure 18. Using the purified 2 x CamR protein, camphor quantification was investigated using camphors at concentrations of 100 fg / ml, 1 ng / ml, and 10 μg / ml. In the experiment, three results of the resonance angle for a certain time are averaged.
[0057]
The CamR protein used for the sensor is cultured in a recombinant (XL1-blue + 1xCamR, XL1-blue + 2xCamR, XL1-blue + 3xCamR) containing the constructed plasmid for mass expression, and expressed in large quantities as a maltose-binding protein fusion protein. The system could be easily purified. CamR protein can be obtained indefinitely by this purification method. The purified CamR protein can be stored for a long time at -20 ° C or -85 ° C, and is stable for more than 2 weeks at 4 ° C.
[0058]
As shown in Fig. 18, the measurement of camphor by SPR was able to obtain data in real time, and the time required for this could be completed in less than 20 minutes from DNA fixation to detection . The sensor chip could be regenerated using a glycine-HCl (pH 1.0) solution and could be used repeatedly more than 10 times with a single chip. The sensor chip could be reused by ultrasonic cleaning.
[0059]
When the same sample was repeated, almost the same resonance angle was obtained, and reproducibility was obtained (FIGS. 15 and 18). The resonance angle of the control with only CamR protein without addition of camphor was larger than that with addition of camphor (1 ng / ml and 10 μg / ml) (FIGS. 21 and 22). From this result, it was shown that CamR binding to camphor inhibited DNA binding depending on the concentration of camphor, as predicted by the principle of this example.
[0060]
From FIG. 19, it was known that the CamR protein DNA binding property examined using SPR was stronger when using only the CamR protein separated from the state of the fusion protein with the MalE protein. This is considered to be because in the state of the fusion protein of CamR protein with MalE protein, the MalE protein inhibits the conformation for binding to DNA. From this, it was expected that the CamR protein used for SPR was cut with factor Xa and then separated and purified using DEAE ion exchange column chromatography to improve the detection sensitivity of odorous substances.
[0061]
From Fig. 20, when comparing the resonance angle of 5 mM and 10 mM 2xCamR-MalE fusion protein, the resonance angle of 10 mM is higher than that of 5 mM, and the higher the concentration of CamR protein, the higher the resonance angle. It was observed. This is consistent with the fact that the higher the concentration of the substance bound in the reaction analyzing the interaction between molecules using SPR, the greater the response.
[0062]
From FIG. 21 and FIG. 22, the odorant camphor could quantitatively detect concentrations between 10 pg / ml and 100 ng. The detection limit is between 100 fg / ml and 10 pg / ml, but accurate values are not obtained. This level of sensitivity is 10 to 100 times higher than humans can feel in the nose, and is equivalent to or better than when using a gas chromatograph mass spectrometer.
[0063]
The material DNA and CamR protein used in this example are substances, and are not limited by the handling or experimental location. The sensitivity was 1 ng / ml in the case of the operon of the luminescence gene operon of the microorganism and the detection limit of 10 pg / ml in the case of the SPR method of this study. ml. Therefore, the detection sensitivity using the SPR method in this study is 100 times higher than that using the luminescent gene. The measurement time required 20 hours when using a luminescent gene, but the method using SPR in this study is less than 20 minutes, and the measurement time can be greatly shortened.
[0064]
Example 2
(A) (1)CamR Of plasmid for mass production
1) Construction of His-tagged CamR (Fig. 23)
Htnt-2 primer 5′-ATGCATCACCATCACCATCACATGGACATCAAG-3 ′ for use in PCR was phosphorylated by treatment with T4 polynucleotide kinase. The first PCR was performed for 10 cycles using pLC87 as a template and using Htnt-1 primer 5′-ATCACCATCACATGGACATCAAGCAGAGCTTGCTG-3 ′ and r7 primer 5′-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3 ′. The second PCR was performed for 25 cycles using 1 μl of the first PCR reaction solution as a template and phosphorylated Htnt-2 primer and r7 primer 5′-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3 ′. The amplified fragment was cleaved with Eco RI and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and a 1058 bp fragment was separated and recovered. This fragment was inserted into the Xmn I and Eco RI sites of pMal-c2. The obtained plasmid was used as pHis-tagged camR and a plasmid for mass expression of His-tagged CamR.
[0065]
(2)CamR From Escherichia coli, which has a plasmid for mass production of CamR Purification
1) Purification of maltose binding protein (MalE) and CamR protein fusion protein
The plasmid for mass production of CamR was introduced into E. coli XL1-blue. The obtained recombinant was named DH5α + His-tagged CamR, and then cut into MalE and CamR by Factor Xa in the same manner as in Example 1.
[0066]
2) Purification by Ni-NTA column chromatography
1 ml of a 1 mg / ml protein solution was transferred to a 1.5 ml microtube, 4 μg of Factor Xa (New England biolabs, Inc) was added, and the mixture was incubated overnight at 16 ° C. for digestion. Digested 10 mg of protein was prepared using Centriplus 10 (Amicon, Inc.) and lysis buffer (50 mM NaH2POFour pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole). 5 ml of Ni-NTA Superflow resin (QIAGEN) was poured onto a 1x10 cm column. The column was equilibrated with 40 ml lysis buffer. Protein exchanged into lysis buffer was added to the column at a flow rate of 0.5 ml / min. The column was washed with 40 ml lysis buffer. The column was washed with 40 ml wash buffer (50 mM NaH2POFour, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole). 40 ml elution buffer (50 mM NaH2POFour, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole) was added to elute His-tagged CamR. Fractions were collected 1 ml each. The recovered protein was exchanged with a column buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol) using Centriplus 10 (Amicon, Inc.) and concentrated. Protein was quantified using Protein Assay Kit I (BIO-RAD Laboratories), then dispensed into 0.5 ml microtubes and stored at -85 ° C until used for SPR experiments.
[0067]
(3)By camphor CamR Dissociation experiment
In the same manner as in Example 1, a series of operations of DNA fixation → buffer exchange → blocking with BSA → washing free BSA with glycine HCl (pH 1.0) → equilibrium with CamR binding buffer was performed. Then 10 μl of 10 mM CamR solution was added. When stabilized, 2 μl of camphor having a concentration of 1 pg / ml to 100 ng / ml, which was obtained by diluting 20 mM camphor solution dissolved in ethanol with column buffer, was added. As a control, a sample to which 2 μl of column buffer was added was used. This experiment was performed twice.
[0068]
(Four) CamR Monitoring experiment of dimer formation
In the same manner as in Example 1, a series of operations of DNA fixation → buffer exchange → blocking with BSA → washing free BSA with glycine HCl (pH 1.0) → equilibrium with CamR binding buffer was performed. Thereafter, 10 μl of 10 mM CamR solution was added and allowed to stand for 20 minutes or more.
[0069]
(Five) Musty odor substances 2-MIB Quantification of
As with camphor, experiments were conducted to determine the quantitativeness and detection limit of the musty odorous substance 2-methylisoborneol (2-MIB) in drinking water. 2-MIB was dissolved in ethanol to prepare a stock solution having a concentration of 20 mg / ml. This stock solution was diluted with distilled water to a concentration of 1 pg / ml to 10 μg / ml. In the experiment, 10 μl of a mixture of this 2-MIB dilution and 10 mM His-tagged CamR was used.
[0070]
(B) Experimental results
1) The nucleotide sequences including the gene region encoding the maltose binding protein and CamR protein of the constructed plasmid are shown in FIGS.
[0071]
2) Purification of CamR from the MalE-CamR fusion protein can be achieved easily by separating and purifying the protein expressed by adding 6 residues of histidine to the amino terminus of CamR using a Ni-NTA column. Could be separated and purified. Compared with the method of purification using an ion exchange column, this method has high purity and high recovery rate because there is no contamination with fusion protein left uncut by MalE or Factor Xa. In addition, the fusion protein with histidine added to the amino terminus was significantly digested by Factor Xa, and the remaining amount of the enzyme was reduced by a small amount of enzyme (1/5 of the previous amount). For this reason, the production and purification method of CamR according to the present method is advantageous in that the cost can be reduced because the amount of expensive Factor Xa used is small.
[0072]
3) In the experiment for examining the degree of dissociation of CamR from DNA by camphor, the value of decrease in resonance angle shown in FIG. 26 was used. As a result, when the camphor with a concentration of 1 pg / ml to 100 ng / ml was added, the decrease in the resonance angle was the same as or lower than the decrease in the control with buffer alone, and it did not increase significantly. For this reason, the dissociation phenomenon of CamR from DNA by addition of camphor could not be detected. Therefore, it was shown that the method of measuring the amount of odorous substances based on the phenomenon that CamR is dissociated from DNA by odorous substances cannot be applied (FIGS. 27 and 28). The contents of the operation for the numbers indicated by the arrows in FIG. 27 are as shown in Table 3 below.
[0073]
[Table 3]
Figure 0004047482
[0074]
4) As for the binding property of CamR protein DNA, when a mixed sample in which CamR protein and camphor or 2-MIB were previously bound was bound to DNA, binding according to the amount of camphor or 2-MIB added was shown ( FIG. 31). In addition, the amount of change in the resonance angle in this case sufficiently captured the difference in the concentration of camphor or 2-MIB. Therefore, for detection of musty odor substances, a method of determining from the degree of inhibition of binding of CamR protein to DNA by musty odor substances is suitable. The basic principle of musty odor biosensor using SPR was completed by this method.
[0075]
5) His-tagged CamR has overwhelming DNA binding of the MalE-1xCamR fusion protein, His tagged CamR, MalE-2xCamR fusion protein, 2xCamR protein, and MalE-3xCamR fusion protein prepared in Example 1 or Example 2. Showed high DNA binding (FIG. 29). However, the control is a sample of only buffer without adding CamR, and the concentration is 2 mM of 2xCamR protein, and the other is 10 mM of protein. Moreover, a value is an average value of 3 times. This result is thought to be because the structure of CamR when linked to MalE or tandem inhibits DNA binding. For this reason, a single CamR protein purified by a Ni-NTA column was used in subsequent experiments.
[0076]
6) When the time-dependent change in the DNA binding state of the CamR protein was monitored by SPR, one upward-sloping DNA binding curve was detected until about 10 minutes, and then another upward-sloping curve was detected. (FIG. 30). Aramaki et al. (Supra) report that when CamR binds to DNA, it binds dimerically. Presuming from this consideration, the first reaction may be a reaction in which the first CamR binds to DNA, and the next reaction may be a reaction in which the second CamR binds to the first CamR and DNA. Absent. That is, the binding of CamR DNA does not bind to DNA after CamR becomes a dimer, but after one CamR binds, another CamR binds on the DNA. The first reaction is used to measure odorous substances in this study. However, if the odorous substance is measured using the second reaction in the future, the total reaction will increase, which may help improve sensitivity.
[0077]
7) When the musty odor substance 2-methylisoborneol (2-MIB) in clean water was measured by this sensor, it could be quantitatively detected from 1 ng / L to 10 mg / L (FIG. 31). This level is about several tens of times that of the human nose, which is similar to the gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS) method.
[0078]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is easy to handle compared to microorganisms, does not require culture, has a short measurement time, and measures substances such as odorous substances with higher sensitivity than conventional microorganism sensors. A sensor for measuring substances was provided.
[0079]
[Sequence Listing]
Figure 0004047482
Figure 0004047482
[0083]
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[0084]
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[0085]
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[0086]
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[0087]
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[0090]
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[0091]
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[0092]
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[0093]
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[0094]
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[0095]
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Figure 0004047482
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the principle of a measurement method using a sensor of the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining a method for constructing p1xcamR, which is a vector expressing a fusion protein of a camR protein monomer and MalE protein, which was prepared in an example of the present invention.
FIG. 3 is a diagram for explaining a method for constructing p2xcamR, which is a vector that expresses a fusion protein of a dimer of camR protein and a MalE protein produced in an example of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a continuation of FIG. 3;
FIG. 5 is a diagram showing a continuation of FIG. 4;
FIG. 6 is a diagram for explaining a method of constructing p3xcamR, which is a vector expressing a fusion protein of a camR protein trimer and a MalE protein, which was prepared in an example of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing a continuation of FIG. 6;
FIG. 8 is a view showing a region encoding a fusion protein of a monomer of camR protein and a MalE protein in the p1xcamR vector and a base sequence in the vicinity thereof, together with an amino acid sequence encoded by the region.
FIG. 9 is a diagram showing a continuation of FIG. 8;
FIG. 10 is a view showing a region encoding a fusion protein of a dimer of camR protein and MalE protein in the p2xcamR vector and a base sequence in the vicinity thereof, together with an amino acid sequence encoded by the region.
FIG. 11 is a diagram showing a continuation of FIG. 10;
FIG. 12 is a view showing a region encoding a fusion protein of a camR protein trimer and a MalE protein in the p3xcamR vector and a base sequence in the vicinity thereof together with an amino acid sequence encoded by the region.
FIG. 13 is a diagram showing a continuation of FIG. 12;
FIG. 14 is a diagram showing a continuation of FIG. 13;
15 is a graph showing the relationship between time and resonance angle in an SPR experiment performed in Example 1. FIG.
FIG. 16 shows a typical example of the results of binding experiments to DNA of the same concentration of 1 × CamR-MalE, 2 × CamR-MalE, and 3xCamR-MalE fusion protein, respectively, with the same concentration. It is the figure which showed the response curve of time superimposed on one graph.
FIG. 17 is a graph showing the results of FIG. 15, in which binding of 1 × CamR-MalE, 2 × CamR-MalE, and 3 × CamR-MalE fusion protein to DNA was repeated three times at a certain resonance angle. It is the figure which averaged and showed the result. In the control, only the buffer used for protein dissolution was added.
FIG. 18 is a graph showing the relationship between time and resonance angle in an SPR experiment in which various concentrations of camphor were measured in an example of the present invention.
FIG. 19 is a graph showing an average of three results at a certain resonance angle in a binding experiment for 2 x CamR-MalE fusion protein and 2 x CamR DNA among the results shown in FIG. It is.
FIG. 20 shows averaged results of three resonance angles over a period of time in binding experiments of 5 mM and 10 mM 2 × CamR-MalE fusion proteins with different concentrations in DNA in an example of the present invention. FIG.
21. Among the results shown in FIG. 18, the quantitative properties of camphor were examined using camphor at concentrations of 100 fg / ml, 1 ng / ml, and 10 μg / ml using purified 2 × CamR protein. It is the figure which extracted the typical example of the result of the experiment, and overlapped and showed the response curve of a fixed time on one graph.
FIG. 22 shows the quantitative results of camphor using the purified 2 x CamR protein and the camphor concentrations of 100 fg / ml, 1 ng / ml, and 10 μg / ml. It is the figure which averaged and showed the result of 3 times of the resonance angle of a certain time in the experiment.
FIG. 23 constructs pHis-tagged CamR, which is a vector that expresses a fusion protein of a monomer of camR protein containing a tag consisting of 6 consecutive histidines and a MalE protein, produced in an example of the present invention. It is a figure for demonstrating a method.
FIG. 24 is a view showing a region encoding a fusion protein of a monomer of camR protein and a MalE protein in the pHis-tagged CamR vector and a base sequence in the vicinity thereof together with the amino acid sequence encoded by the region.
FIG. 25 is a diagram showing a continuation of FIG. 24;
FIG. 26 is a diagram showing a change in resonance angle before and after adding camphor to a sample solution in Example 2.
27 is a graph showing the relationship between time and resonance angle in the SPR experiment performed in Example 2. FIG.
28 is a graph showing the relationship between added camphor concentration and resonance angle in the SPR experiment performed in Example 2. FIG.
FIG. 29 is a view showing the binding properties between various repressor proteins and cam operon DNA prepared in Examples of the present invention.
30 is a graph showing the relationship between time and resonance angle in a CamR dimer formation monitoring experiment conducted in Example 2. FIG.
FIG. 31 is a graph showing the relationship between the concentration of 2-methylisoborneol and the resonance angle obtained by a 2-methylisoborneol measurement experiment performed in Example 2.

Claims (8)

表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップの、測定時に光を入射させる側と反対側の表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成る物質測定用センサー。A sensor for measuring a substance, wherein a nucleic acid that binds to a repressor protein that binds to a substance to be measured is bound to the surface of the sensor chip of the surface plasmon resonance device opposite to the side on which light is incident upon measurement. 前記核酸は、前記リプレッサータンパク質と結合するオペレーター配列又は該配列において1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であって前記リプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸である請求項1記載のセンサー。The nucleic acid has an operator sequence that binds to the repressor protein or a sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted, or added in the sequence and binds to the repressor protein. The sensor according to claim 1, which is a nucleic acid. 前記核酸は、カンファーヒドロキシラーゼオペロンのオペレーター配列又は該配列において1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する核酸である請求項2記載のセンサー。The nucleic acid is a nucleic acid that binds to a camphor repressor protein, wherein the operator sequence of the camphor hydroxylase operon or a sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in the sequence. 2. The sensor according to 2. 前記核酸は、配列表の配列番号1で示される塩基配列又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸である請求項3記載のセンサー。The nucleic acid is a nucleic acid having a sequence in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a plurality of nucleotides is deleted, substituted, inserted or added and binds to a camphor repressor protein. The sensor according to claim 3. 前記核酸は、配列表の配列番号1で示される塩基配列を有する核酸である請求項4記載のセンサー。The sensor according to claim 4, wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 前記測定すべき物質は、臭気物質である請求項1ないし5のいずれか1項に記載のセンサー。The sensor according to any one of claims 1 to 5, wherein the substance to be measured is an odor substance. 前記臭気物質は、カンファー、2−メチルイソボルネオール、イソボルネオール又はジェオスミンである請求項6記載のセンサー。The sensor according to claim 6, wherein the odor substance is camphor, 2-methylisoborneol, isoborneol or geosmin. 前記リプレッサータンパク質は、天然のリプレッサータンパク質にのアミノ末端に複数のヒスチジンの繰返しから成るタグが付されたものである請求項1ないし7のいずれか1項に記載のセンサー。The sensor according to any one of claims 1 to 7, wherein the repressor protein is obtained by adding a tag comprising a plurality of histidine repeats to the amino terminus of a natural repressor protein.
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