JP4043533B2

JP4043533B2 - Low molecular weight lipopolysaccharide

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Publication number: JP4043533B2
Application number: JP01212695A
Authority: JP
Inventors: 傳一水野; 源一郎杣; 孝志西沢
Original assignee: 水野傳一; 杣源一郎
Priority date: 1995-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2008-02-06
Anticipated expiration: 2023-02-06
Also published as: WO1996023002A1; JPH08198902A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、特定の理化学的性質および生物学的性質を有し、安全性が極めて高く（毒性が低い）、かつ生物活性の高い新規な低分子量リポポリサッカライドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リポポリサッカライド（lipopolysaccharide。以下ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペプチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖からなる複合化合物であり、Ｏ抗原およびエンドトキシンの活性成分として知られている［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第１８ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれるオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている（「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。
【０００３】
リピドＡの基本構造は多くの菌種に共通であり、基本骨格はβ−１、６結合のグルコサミニル・グルコサミンからなりＣ−１位およびＣ−４´位にそれぞれリン酸を結合している場合が多い。各アミノ基は３−ヒドロキシ脂肪酸を、水酸基は数種の飽和脂肪酸またはヒドロキシ脂肪酸を結合し、独特の糖脂質を形成しているが、脂肪酸の種類は菌種によって多少異なっている。少数例であるが基本骨格が全く異なり、２，３−ジアミノ−２、３−ジデオキシ−Ｄ−グルコースのみからなる例も報告されている（野間惟道編、「医科学大辞典第４９巻」、第８２ページ、講談社、１９８４年）。
【０００４】
Ｒコアの構造はサルモネラ属のようにそれに属する大部分の菌種に共通である場合と、大腸菌のように部分的に異なる数種の構造が知られている場合とがある［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２８３ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。一般にヘプトースと２−ケト−３−デオキシオクトネート（以下ＫＤＯと記載する）が多くのＲコアに共通の構成成分であり、ＫＤＯを介してリピドＡと結合しているが、菌種によっていずれか一方または双方が欠如しているＬＰＳの存在も知られている［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２９４〜２９５ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。
【０００５】
Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原としての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、または繰返し構造でないものも知られている。Ｏ特異多糖の生合成はＲコアのそれとは異なる遺伝子の支配を受けており、接合または形質導入により異なる菌種のＯ特異多糖を置換することが可能であり、菌の毒力およびワクチンの研究等に応用されている［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２６５〜２６７ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。
【０００６】
ＬＰＳは極めて多様な薬理作用を有しているが、例えば抗原およびＬＰＳを同時に投与した場合、免疫反応が増強されることから、ＬＰＳは現在ワクチン効果を高める補助剤（アジュバント）の一種として重用されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第３１２ページ、講談社、１９７３年）。
従来、多種多様なＬＰＳが報告されているが、一般にどのような方法で抽出したＬＰＳであっても、１０⁶〜１０⁷の極めて大きな分子量を有することが知られている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２１１ページ、講談社、１９７３年）。その後、比較的分子量の小さいＬＰＳも報告され、小麦由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量８，０００±１，０００または５，０００±２，０００、リン酸数１〜４／分子量８，０００、ヘキソサミン数６±２／分子量８，０００、脂肪酸数６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数５±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７号公報）、クロレラ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４０，０００〜９０，０００、リン酸数４±１／分子量１万、ヘキソサミン数７±１／分子量１万、脂肪酸数６±１／分子量１万、ＫＤＯ数２±１／分子量１万のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７号公報）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量３０，０００±５，０００、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±１／分子量３万のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００または９，０００±１，０００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量８，０００、脂肪酸数５／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４０，０００±１０，０００または８，０００±４，０００、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±１／分子量３万のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報）、セラチア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，０００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、エンテロバクター属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５００、リン酸数１〜２／分子量５，０００、ヘキソサミン数７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数１〜２／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数５±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００、リン酸数４／分子量６，０００、ヘキソサミン数１２／分子量６，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量６，０００のＬＰＳ（特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００または９，５００±１，５００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−１８７６４０）、アエロモナス・ヒドロフィア種菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，５００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数０．８±０．５／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−１４１８４９号公報）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００、リン数２／分子量５，０００、ヘキソサミン数２／分子量５，０００、ＫＤＯ数５／分子量５，０００［バイオセラピー(BIOTHERAPY)、第６巻、第３号、第３５７ページ、１９９２年］等が報告されている。前記のとおり分子量５，０００前後のＬＰＳは、既に報告されているが、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける主染色帯が、５，０００または６，０００であると同時に、分子量３万以上に相当する染色帯も存在していたのである。即ち、従来の分子量５，０００前後のＬＰＳは分子量３万以上のＬＰＳとの混合物であった。
【０００７】
ＬＰＳの用途についてはこの発明の発明者らにより、これまでに抗トキソプラズマ剤（特開平４−４９２４５９号公報）、コレステロール低下剤（特開平４−４９２４３号公報）、抗ヘルペス剤（特開平４−４９２４２号公報）、抗リュウマチ剤（特開平４−４９２４１号公報）、抗糖尿病剤（特開平４−４９２４４号公報）、抗消化性潰瘍剤（特開平４−４９２４０号公報）、免疫機能活性化剤（特開平４−９９４８１号公報、特開平６−１４１８４９号公報）、経口・経皮免疫機能促進剤（特開平４−１８７６４０号公報）、鎮痛剤（特開平６−４０９３７号公報）、発育促進剤（特開平３−１５５７７８号公報）、抗禁断症状剤（特開平６−６５０９２号公報）等が提案されている。
【０００８】
しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔII」、第１２１ページ、朝倉書店、１９８７年）。
一方、細菌の細胞壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノール−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・スタブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology and Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られているが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されているが、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およびイオン交換において精製された標品であり、高分子量ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子量ＬＰＳが混在していた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記の通り、従来報告されている低分子量のＬＰＳは、高分子量ＬＰＳを含む混合物であって、例えば免疫機能活性化剤等の薬剤成分として臨床的に用いるには、安全性の面からも、あるいは薬効性能の面からも必ずしも満足のいくものではなかった。。
【００１０】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来のＬＰＳに比して安全性が高く（すなわち、毒性が低く）、かつ生物活性の優れた新規なＬＰＳを提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者らは、前記のような課題を解決するため、鋭意研究をおこなった結果、従来報告されているＬＰＳとは異なる新規な低分子量ＬＰＳを発見し、しかもこの新規な低分子量ＬＰＳが、従来のＬＰＳに比べて極めて安全性が高く、かつ生物活性も従来のＬＰＳに比して優れていることを見い出し、この発明を完成した。
【００１３】
この発明は、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)から得られ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％（重量）以下であること
ｆ）核酸含量が、１％（重量）以下であること
を有する低分子量リポポリサッカライドの純度が９８％（重量）以上である低分子量リポポリサッカライドを提供する。
【００１４】
次にこの発明について詳述する。なお、以下の説明において、百分率の表示は、特に断りのない限り、重量による値である。
【００１５】
この発明の低分子量ＬＰＳは、パントエア・アグロメランス (Pantoea agglomerans)を、常法により培養し、培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例えば、熱フェノール法［オー・ウエストファール(O. Westphal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリー(Methods
in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic
Press)、１９６５年］、により抽出し、さらに、陰イオン交換樹脂により精製して製造できる。すなわち、微生物の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノールを除去し、限外瀘過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノＱ−セファロースまたはＱ−セファロースを使用する）により精製し、常法により脱塩する。
【００１６】
このようにして得られた精製ＬＰＳは特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公報、特開平４−９９４８１号公報および特開平５−１５５７７８号公報に開示される分子量５，０００から６，０００程度のＬＰＳと実質的に等しい。
さらに、得られた精製ＬＰＳを、例えばデオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下でゲル瀘過し、低分子量ＬＰＳを含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＰＳを除去することによって、高度に精製されたこの発明の新規な低分子量ＬＰＳを得ることができる。この界面活性剤存在下でのゲル瀘過の工程は、特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公報および特開平５−１５５７７８号公報に開示される分子量５，０００から６，０００程度のＬＰＳを更に高度に精製するためのものであり、この工程により混在する高分子量ＬＰＳが完全に排除されるのである。
【００１７】
以上の方法により製造されたこの発明の新規な低分子量ＬＰＳは、後記する試験例１に示すとおり、
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること
ｆ）核酸含量が、１％以下であること
という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なくとも９８％の純度を有している。しかしながら、使用目的によっては、精製の程度を低く（例えば、９０％）することもできる。
【００１８】
この発明の新規な低分子量ＬＰＳは、免疫機能活性化作用を有する医薬品、動物用薬品等として使用することもできる。
次に試験例を示し、この発明の低分子量ＬＰＳについてさらに詳しく説明する。試験例１
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの理化学的および生物学的性質を調べるために行った。
１）試料の調製
実施例１および参考例１と同一の方法により低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳをそれぞれ調製した。
２）試験方法
▲１▼分子量の測定
低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１０μｇを１．５ｍｌ容プラスチックチューブに秤取した。これとは別に、１８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メルカプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）および２２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０μｌを、前記各試料溶液に添加して十分混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷水中に浸して急冷した。
【００１９】
１０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシンおよび３．０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解して調製した泳動緩衝液をスラブゲル電気泳動槽（マリソル社製）に入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０Ｖに１時間、次いで、１５０Ｖに固定して、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続した。泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認した。▲２▼ヘキソサミン含有量の定量
ヘキソサミン含有量を、エルソン−モルガン(Elson-Morgan)法（日本生化学会編、「生化学実験講座」、第４巻、第３７７〜３７９ページ、第１版、東京化学同人出版、１９７６年）により次のとおり定量した。ＬＰＳを蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イワキガラス社製）に秤取し、これに１００μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し、のち４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨを７に調整した。その１００μｌを秤取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入れ、２００μｌの試薬Ａを加え、１０５℃で１．５時間加熱し、流水で冷却した。次いで、その１００μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加え、更に６７μｌの試薬Ｂを加え、室温で１時間放置し、５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線作成用標準試料としては０〜８００μｇ／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミン（和光純薬社製）を用いた。
試薬Ａ：７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの１．２５Ｎ炭酸ナトリウムとの混合液。
試薬Ｂ：１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒド、３０ｍｌの濃塩酸および３０ｍｌの９６％エタノールの混合液。
▲３▼ＫＤＯ含量の定量
ＫＤＯ含有量をジフェニルアミン法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第５８巻、第１号、第１２３〜１２９ページ、１９７４年］により次のとおり定量した。
【００２０】
５００ｍｇのジフェニルアミン（和光純薬社製）、５ｍｌのエタノール（和光純薬社製）、４５ｍｌの氷酢酸（和光純薬社製）、５０ｍｌの濃塩酸（和光純薬社製）を混合してＫＤＯ検出試薬を調製した。その５００μｌに、０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で各試料を含む２５０μｌの水溶液を混合し、１００℃の沸騰水浴中で３０分間加熱し、のち恒温水（２４〜２５℃）中で３０分間冷却し、分光光度計（日立製作所製。モデルＵ２０１０）により４２０、４７０、６３０、６５０ｎｍでの吸光度を測定した（測定値を各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０と記載する）。標準試料として、０．５μモルの濃度のＫＤＯアンモニウム塩（シグマ社製）水溶液２５０μｌを使用した。
【００２１】
検体試料および標準試料の４種の測定値から、式（１）によりＳ値を求め、検体試料および標準試料のＳ値をそれぞれＳ_tおよびＳ_sとした。次いで式（２）によりＫＤＯのモル数Ｘを算出した。

▲４▼リムラス活性の測定
リムラス活性とは、１９６８年にレヴィンにより創案されたカブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いたエンドトキシン定量法であるリムラステスト（鈴木郁生編、「医薬品の開発第１４巻、医薬品の品質管理及び試験法」、第２２７〜２４３ページ、廣川書店、１９９０年）で陽性を呈することを意味し、このリムラステストはＬＰＳ検出法として知られている。標準品として、３４５ｐｇ／ＥＵのイー・コリ(E. coli) ０１１１：Ｂ４を用いてトキシカラーシステム（生化学工業社製）を使用して測定した。
▲５▼タンパク質含量
タンパク質含量を、ローリー法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ(Journal of Biological Chemistry) 、第１９３巻、第６５ページ、１９５１年］により測定した。
▲６▼核酸含量
核酸含量を、ＯＤ（２６０ｎｍ−３００ｎｍ）での測定値（１ＯＤ＝４０μｇ）から定量した。
▲７▼純度
純度（％）は、次式により算出した。
【００２２】
純度＝［｛乾燥収量−（タンパク質含量＋核酸含量）｝／乾燥収量］×１００
３）試験結果
▲１▼分子量
分子量測定の結果は、図１に示すとおりである。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図であり、図中レーン１は同時に泳動させたタンパク質およびペプチド分子量マーカー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０．１ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤ、２．５６ｋＤ（ファルマシア社製）］、レーン２、３および４はＬＰＳ（２０μｇ、５μｇおよび１．２５μｇ）、レーン５、６、７および８は低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５μｇおよび０．３１μｇ）であり、図の縦軸は、分子量を示す。
【００２３】
一般的に糖鎖を有する物質を電気泳動した場合、レーン当たりのサンプル量が過剰の時には染色帯が幅広くなり、見かけの分子量範囲が広くなる。図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥではレーン５から８は、同一試料の低分子量ＬＰＳの量を変更して泳動したものであるが、試料の泳動量が増えるに従い染色帯の幅が広がっている。従って、正確な分子量を調べる目的では、１μｇ程度の量が適当であり、レーン８が相当する。なお、レーン２およびレーン５は、高分子量のＬＰＳの存在を確認するために多量の試料を泳動させたものである。
【００２４】
低分子量ＬＰＳの分子量（レーン８より計算）は、レーン１のサイズマーカから計算して染色帯の中心値で５ｋＤａ、染色帯幅の範囲は４ｋＤａから７ｋＤａであった。また、レーン５では、２０μｇの低分子量ＬＰＳを泳動させたにもかかわらず、レーン２のように高分子量ＬＰＳは全く認められなかった。
以上の結果から、この発明の低分子量ＬＰＳの分子量は、５，０００±２，０００であり、高分子量ＬＰＳが完全に除去されていることが判明した。
▲２▼ヘキソサミン含量
この発明の低分子量ＬＰＳのヘキソサミン数は２個／分子量５，０００であった。
▲３▼ＫＤＯ含量
この発明の低分子量ＬＰＳに含まれるＫＤＯは２．４個／分子量５，０００であった。
▲４▼リムラス活性
この発明の低分子量ＬＰＳのリムラス活性は４３．５ＥＵ／ｎｇであり、これに対して、参考例１と同様の方法で調製した従来のＬＰＳのリムラス活性は８．４ＥＵ／ｎｇであった。
▲５▼タンパク質含量
この発明の低分子量ＬＰＳのタンパク質含量は、０．６８％以下であった。
▲６▼核酸含量
この発明の低分子量ＬＰＳの核酸含量は０．５０％以下であった。
▲７▼純度
この発明の低分子量ＬＰＳの純度は９８％以上であった。
【００２５】
なお、微生物および製造法を変更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。試験例２
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの急性毒性を調べるために行った。
（１）試料の調製および試験方法
実施例１と同一の方法で調製した低分子量ＬＰＳおよび参考例１と同一の方法で調製したＬＰＳの毒性を、７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールス・リバー社から購入）を用いて試験した。１群４匹からなるマウス群に、各試料を生理食塩水に溶解し、１匹あたり５．０、１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与した（ただし４０ｍｇ／Ｋｇの投与は低分子量ＬＰＳのみ）。投与後７２時間マウスの生死を観察した。
（２）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、静脈内投与の場合、この発明の低分子量ＬＰＳではいずれの投与量においてもマウスの死亡例は認められず、ＬＤ₅₀は４０ｍｇ／ｋｇ以上であったが、ＬＰＳでは１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で全数が死亡し、ＬＤ₅₀は６．０〜８．６ｍｇ／ｋｇであった。なお、微生物の種類および低分子量ＬＰＳの製造法を変更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。
【００２６】
【表１】

【００２７】
試験例３
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳを試験例２よりも多量に投与した場合の急性毒性を調べるために行った。
（１）試料の調製および試験方法
試験例２と同一の低分子量ＬＰＳを１匹あたり４０、８０および１６０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したこと、およびＬＰＳを１匹あたり５．０、または１０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したことを除き、試験例２と同一の方法により試験した。
（２）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、ＬＰＳ５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で２５％が、また１０ｍｇ／ｋｇの投与量では７５％が死亡した。これに対して、低分子量ＬＰＳにおいては４０ｍｇ／ｋｇの投与量で死亡せず、８０および１６０ｍｇ／ｋｇの投与量では、１００％が死亡した。前試験例２とこの試験例３の結果から、ＬＤ₅₀を算出すると表３のとおりである。表３から明らかなように、低分子量ＬＰＳのＬＤ₅₀の値はＬＰＳのそれに比べて、静脈内投与では約８倍であった。
【００２８】
これらの結果は、ＬＰＳの分子量の相違が毒性に影響を及ぼすことを示しており、低分子量ＬＰＳは、従来のＬＰＳに比して極めて毒性の低いことが判明した
【００２９】
。
【表２】

【００３０】
【表３】

【００３１】
試験例４
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効果を確認するために行った。
各群３匹の７週齢の雄Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールズ・リバー社より購入）の尾静脈に、１匹あたり０．１、１．０、または１０μｇの実施例１と同様の方法で製造した低分子量ＬＰＳ、または参考例１と同じ方法で得られたＬＰＳを含む生理食塩水０．２ｍｌを注射し、その１時間後に採血し常法により血清を分離した。
【００３２】
このようにして得られた各血清中のＴＮＦ活性を、Ｌ９２９細胞に対する毒性に基づく方法で測定した。すなわち、Ｌ９２９細胞を５％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地で８×１０^４個／１００μｌの濃度に調製し、これを９６穴平底プレートの各穴に１００μｌづつまき、３７℃で２時間、５％ＣＯ_２存在下で培養した。その後アクチノマイシンＤを１μｌ／ｍｌとなるように添加し、ＭＥＭ培地で段階希釈した血清試料または陽性対照ヒトＴＮＦ−α（旭化成社製）を５０μｌづつ添加し、更に同じ条件で１８時間培養した。培地をアスピレーターで取り除いた後、３７℃のＰＢＳで洗浄し死細胞を完全に取り除き、０．１％クリスタルバイオレットを含む１％メチルアルコール溶液を加えて生細胞を染色した。この染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を指標として測定し、陽性対照として用いたＴＮＦ−αの希釈率と吸光度との関係をもとにＴＮＦ活性を算定した。
【００３３】
その結果は、表４に示すとおりであった。表４においてＴＮＦ活性は各群３匹の平均値である。この結果から、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効果は、参考例１の方法で得られる従来のＬＰＳのそれを上回ることが明らかとなった。
【００３４】
【表４】

【００３５】
参考例１
トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業社製。特級）１０ｇを蒸留水１リットルに添加し、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整し、オートクレーブで滅菌し、別に滅菌したグルコース（和光純薬工業社製。特級）を０．１％の割合で添加した培地（以下Ｌ−肉汁培地と記載する）１００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、−８０℃で保存されているパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans) 保存菌株から単一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を１，０００ｍｌのＬ−肉汁培地の入った３リットル容の坂口フラスコに接種し、同様に培養した。
【００３６】
さらに、７リットルのＬ−肉汁培地の入った１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を接種し、同条件で通気培養し、のち集菌し、約７０ｇの湿菌体を回収し、これを凍結保存した。
凍結保存菌体約７０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。フェノール層を更に１回前記と同一の操作を反復し、回収した２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・トーヨー社製。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮した。
【００３７】
得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製ＬＰＳを得た。
【００３８】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
実施例１
参考例１と同一の方法で得た精製ＬＰＳ１００ｍｇを５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化緩衝液［３％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａおよび２０ｍＭトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］に溶解し、精製ＬＰＳ溶液２０ｍｌをセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマシア社製）の上部に静かに重層し、溶出緩衝液［０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］により流速１６ｍｌ／時で８００ｍｌ（５０時間）溶出した。
【００４０】
ペリスタポンプＰＩ（ファルマシア社製）を用いて流速を制御しながら、得られた溶出液を、フラクションコレクター（アドバンテック社製。ＳＦ２１２０）により分画し、最初の２４０ｍｌ（２４フラクション分）を廃棄し、その後１０ｍｌ／フラクションで８０フラクションまで分画した。溶出した各画分について原液または希釈液でフェノール／硫酸法（福井作蔵、「還元糖の定量法・第２版」、第５０〜５２ページ、学会出版センター、１９９０年）により糖の定量を行い、溶出状態を調べた。得られた溶出状態の結果から、ＬＰＳの存在が予想される分画（フラクション３０〜６０）のうち、フラクション３７〜５５の各フラクション０．５ｍｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＬＰＳの分画パターンを調べた。その結果、フラクション４５−５５は低分子量（分子量約５ｋＤ）ＬＰＳのみが認められ、フラクション３７−４４は高分子分量および低分子量の両方のＬＰＳが認められたので、フラクション４５−５５の低分子量ＬＰＳ分画を次のとおりさらに精製した。
【００４１】
各画分を混合して凍結乾燥し、エタノールに懸濁し、遠心分離によりエタノールに可溶なデオキシコール酸を除去し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収した。低分子量ＬＰＳ画分のエタノール処理をさらに２回反復し、デオキシコール酸を除去し、次に７０％エタノールに再度懸濁し、遠心分離で緩衝液成分を除去し、この操作をさらに３回反復し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収し、凍結乾燥し、精製した低分子量ＬＰＳを約２０ｍｇ得た。
実施例２
トリプトン（ディフコ社製）５ｇ、リン酸二水素カリウム１．６ｇおよび塩化ナトリウム８ｇを精製水１，０００ｍｌに溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した（以下これを基礎培地という）。基礎培地１００ｍｌに４０％塩化マグネシウム溶液１０ｍｌおよび０．４％マラカイトグリン溶液３ｍｌを無菌的に添加し、これをマグネシウム−マラカイトグリン培地とした。
【００４２】
マグネシウム−マラカイトグリン培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)保存菌株から単一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を１，０００ｍｌのマグネシウム−マラカイトグリン培地の入った３リットル容の坂口フラスコに接種し、同一条件で培養した。
【００４３】
さらに、７リットルのマグネシウム−マラカイトグリン培地の入った１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を接種し、同一条件で通気培養し、のち集菌し、約５０ｇの湿菌体を回収し、これを凍結保存した。
凍結保存菌体約５０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。フェノール層をさらに１回前記と同一の操作で処理した。２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・トーヨー社。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮をした。
【００４４】
得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥し、約５０ｇの湿菌体から約２１０ｍｇの精製ＬＰＳを得た。
【００４５】
この精製ＬＰＳ８０ｍｇを実施例１と同一の方法で、３％デオキシコール酸ナトリウムを含有する可溶化緩衝液に溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマシア社製）で展開し、低分子量ＬＰＳのみを含有する画分を回収し、凍結乾燥後、エタノールに懸濁し、遠心分離によりデオキシコール酸等の緩衝液成分を除去し、凍結乾燥し、約５ｍｇの低分子量ＬＰＳを得た。
【００４６】
この低分子量ＬＰＳの分子量、ＫＤＯ数およびヘキソサミン数を前記試験例１と同一の方法で測定した結果、それぞれ６，０００、２．０１個／分子量６，０００、および２．８個／分子量６，０００であった。
なお、参考のため図２に、サルモネラ・ミネソタ菌株から精製された低分子量ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示す。図中レーン１は蛋白質およびペプチドマーカー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤおよび２．５６ｋＤ（ファルマシア社製）］、レーン２、３および４はデオキシコール酸ナトリウム存在化でのゲル瀘過前の精製ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、および１．２５μｇ）、レーン５、６、７および８は、低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５μｇ、および０．３１μｇ）である。
【００４７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明により、医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、かつ生物活性の高い低分子量ＬＰＳが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。
【図２】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a novel low molecular weight lipopolysaccharide having specific physicochemical and biological properties, extremely high safety (low toxicity), and high biological activity.
[0002]
[Prior art]
Lipopolysaccharide (hereinafter sometimes referred to as LPS) is a complex compound consisting of lipids and sugars present in the outer membrane surrounding peptidoglycan of Gram-negative bacterial cell walls such as Escherichia coli, Salmonella, Bordetella pertussis, Known as the active ingredient of O antigen and endotoxin [edited by JM Ghuysen and R. Hakenbeck, “New Comprehensive Biochemistry”, No. 27, Bacterial Cell Wall, page 18, Elsevea, 1994]. The basic structure of LPS is composed of lipid A having a specific lipid, an oligosaccharide called R-core covalently bound thereto, and an O-specific polysaccharide (“Nikkei Biotechnology Latest Dictionary”, page 431). Nikkei McGraw Hill, 1985).
[0003]
The basic structure of lipid A is common to many bacterial species, and the basic skeleton consists of β-1 and 6-linked glucosaminyl and glucosamine, with phosphates bound to the C-1 and C-4 'positions, respectively. There are many. Each amino group binds 3-hydroxy fatty acid, and hydroxyl group binds several kinds of saturated fatty acids or hydroxy fatty acids to form a unique glycolipid, but the type of fatty acid is somewhat different depending on the bacterial species. Although it is a small number of examples, the basic skeleton is completely different, and an example consisting only of 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose has also been reported (Shindo Noma, “Medical Science Dictionary 49”). 82, Kodansha, 1984).
[0004]
The structure of the R core is common to most bacterial species belonging to it, such as Salmonella, and there are cases in which several different structures are known, such as Escherichia coli [JM Edited by JM Ghuysen and R. Hakenbeck, "New Comprehensive Biochemistry", Volume 27, Bacterial Cell Wall, 283 Page, Elsevea, 1994]. In general, heptose and 2-keto-3-deoxyoctonate (hereinafter referred to as KDO) are components common to many R cores, and are linked to lipid A via KDO. The existence of LPS lacking one or both is also known [edited by JM Ghuysen and R. Hakenbeck, “New Comprehensive Biochemistry. ”, 27, Bacterial Cell Wall, 294-295, Elsevea, 1994].
[0005]
The structure of the O-specific polysaccharide is the most diverse among the constituent components, is specific to the bacterial species, and exhibits activity as a so-called O antigen. In general, it is characterized by a repeating structure of oligosaccharides composed of several monosaccharides, but those composed of the same monosaccharide or those not having a repeating structure are also known. The biosynthesis of O-specific polysaccharides is governed by a gene different from that of R-core, and it is possible to replace O-specific polysaccharides of different bacterial species by conjugation or transduction. [Edited by JM Ghuysen and R. Hakenbeck, “New Comprehensive Biochemistry”, Vol. 27, Bacterial Bacterial Cell Wall, pp. 265-267, Elsevea, 1994].
[0006]
LPS has a wide variety of pharmacological actions. However, when an antigen and LPS are administered simultaneously, for example, the immune response is enhanced, so LPS is currently used as a kind of adjuvant (adjuvant) that enhances the vaccine effect. (Satoshi Honma et al., “Bacterial Endotoxin”, page 312, Kodansha, 1973).
Conventionally, a wide variety of LPS has been reported. Generally, any LPS extracted by any method is 10⁶-10⁷It is known that it has a very large molecular weight (Satoshi Honma et al., “Bacterial Endotoxin”, page 211, Kodansha, 1973). Thereafter, LPS having a relatively low molecular weight was also reported. Molecular weight of 8,000 ± 1,000 or 5,000 ± 2,000, phosphate number of 1 to 4 / molecular weight of 8,000, hexosamine number by SDS-PAGE derived from wheat. LPS having 6 ± 2 / molecular weight 8,000, fatty acid number 6 ± 2 / molecular weight 8,000, KDO number 5 ± 1 / molecular weight 8,000 (JP-A-4-49245, JP-A-4-49243, No. 4-49242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244, JP-A-4-49240, JP-A-5-155778, JP-A-6-40937), derived from chlorella SDS-PAGE molecular weight 40,000-90,000, phosphoric acid number 4 ± 1 / molecular weight 10,000, hexosamine number 7 ± 1 / molecular weight 10,000, fatty acid number 6 ± 1 / molecular weight 10,000 LPS having a KDO number of 2 ± 1 / molecular weight of 10,000 (JP-A-4-49245, JP-A-4-49243, JP-A-4-49242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244) , JP-A-4-49240, JP-A-5-155778, JP-A-6-40937), SDS-PAGE derived from E. coli, molecular weight 30,000 ± 5,000, phosphoric acid number 12 / molecular weight LPS with 30,000, hexosamine number 45 ± 6 / molecular weight 30,000, fatty acid number 18 / molecular weight 30,000, KDO number 5 ± 1 / molecular weight 30,000 (JP-A-4-49245, JP-A-4-49243, No. 4-49242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244, JP-A-4-49240), molecular weight by SDS-PAGE derived from Bordetella pertussis 1,000 ± 1,000 or 9,000 ± 1,000, phosphoric acid number 5 / molecular weight 8,000, hexosamine number 16 ± 2 / molecular weight 8,000, fatty acid number 5 / molecular weight 8,000, KDO number 2 ± 1 / LPS with a molecular weight of 8,000 (JP-A-4-49245, JP-A-4-49243, JP-A-4-49242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244, No. 4-49240), molecular weight of 40,000 ± 10,000 or 8,000 ± 4,000 by SDS-PAGE derived from E. coli, phosphoric acid number 12 / molecular weight 30,000, hexosamine number 45 ± 6 / molecular weight 30,000, LPS with 18 fatty acids / molecular weight 30,000, KDO number 5 ± 1 / molecular weight 30,000 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-40937), molecular weight 5,000 by SDS-PAGE derived from Serratia spp. LPS having ± 1,000, phosphoric acid number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 9 ± 1 / molecular weight 5,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 5,000 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-40937, special JP-A-5-155778, JP-A-6-65092, JP-A-4-99481, JP-A-6-90745), SDS-PAGE derived from Enterobacter bacteria, molecular weight 6,500 ± 2,500 LPS having a phosphoric acid number of 1-2 / molecular weight of 5,000, hexosamine number of 7 ± 1 / molecular weight of 5,000, KDO number of 1-2 / molecular weight of 5,000 (JP-A-6-40937, JP-A-5-155778) , JP-A-6-65092, JP-A-4-99481, JP-A-6-90745),

molecular weight

6,5 by SDS-PAGE derived from Pantoea bacteria LPS with 00 ± 2,500, phosphoric acid number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 5 ± 1 / molecular weight 5,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 5,000 (JP-A-6-40937, JP-A-6-65092, JP-A-4-99481, JP-A-6-90745), pertussis-derived SDS-PAGE, molecular weight 6,000 ± 1,000, phosphoric acid number 4 / molecular weight 6, 000, LPS with hexosamine number 12 / molecular weight 6,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 6,000 (JP-A-5-155778, JP-A-6-40937), molecular weight by SDS-PAGE derived from Bordetella pertussis 6,000 ± 1,000 or 9,500 ± 1,500, phosphoric acid number 5 / molecular weight 8,000, hexosamine number 16 ± 2 / molecular weight 8,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 5,000 LPS (Japanese Patent Laid-Open No. 4-187640), SDS-PAGE derived from Aeromonas hydrophilia inoculum, molecular weight 5,000 ± 1,500, phosphate number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 9 ± 1 / molecular weight LPS having a KDO number of 0.8 ± 0.5 / molecular weight of 5,000 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-141849), SDS-PAGE derived from Pantoea bacteria, molecular weight of 5,000, phosphorus number of 2 / molecular weight of 5 , Hexosamine number 2 / molecular weight 5,000, KDO number 5 / molecular weight 5,000 [BIOTHERAPY, Vol. 6, No. 3, page 357, 1992] and the like have been reported. As described above, LPS having a molecular weight of around 5,000 has already been reported, but the main staining zone in these SDS-PAGE is 5,000 or 6,000, and at the same time, staining corresponding to a molecular weight of 30,000 or more. There was also an obi. That is, the conventional LPS having a molecular weight of around 5,000 was a mixture with LPS having a molecular weight of 30,000 or more.
[0007]
Regarding the use of LPS, the inventors of the present invention have so far made an anti-toxoplasma agent (JP-A-4-49259), a cholesterol-lowering agent (JP-A-4-49243), and an anti-herpes agent (JP-A-4-492). 49242), anti-rheumatic agents (JP-A-4-49241), anti-diabetic agents (JP-A-4-49244), anti-peptic ulcer agents (JP-A-4-49240), immune function activation Agent (JP-A-4-99481, JP-A-6-141849), oral / transcutaneous immune function promoter (JP-A-4-187640), analgesic (JP-A-6-40937), growth Accelerators (Japanese Patent Laid-Open No. 3-155778), anti-abnormal symptoms (Japanese Patent Laid-Open No. 6-65092), and the like have been proposed.
[0008]
However, conventional LPS has been pointed out to be problematic for clinical application in terms of safety (edited by the Japanese Society for Tissue Culture, “Cell Growth Factor part”).II”Page 121, Asakura Shoten, 1987).
On the other hand, a method for purifying LPS from bacterial cell walls is described in the conventional phenol-water extraction method (O. Westphal, edited by Methods in Carbohydrate Chemistry, No. 5). Volume 83, Academic Press (1965), Trichloroacetic acid extraction method (AM Staub), Methods in Immunology and Immunochemistry , Vol. 1, page 28, Academic Press, 1967], EDTA extraction method [Journal of Biological Chemistry, No. 243, page 6384, 1968] The LPS obtained in this way is sodium deoxycholate. It has been reported that it further dissociates into subunits having a molecular weight of about 20,000 in the presence of a surfactant such as lithium (Satoshi Honma et al., “Bacterial Endotoxin”, page 229, Kodansha, 1973). ). On the other hand, a method for obtaining only LPS having a molecular weight of about 5,000 and not including LPS having a molecular weight of 20,000 or more has not been reported. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-99481 shows a diagram of SDS-PAGE, but in addition to a staining band having a molecular weight of about 6,000, a staining band having a molecular weight of 30,000 or more is clearly present. . JP-A-4-187640, JP-A-4-49240 and JP-A-5-155778 disclose low molecular weight LPS having a molecular weight of 5,000 or 6,000, all of which are hot phenols. This was a sample purified by the method and ion exchange, and was not subjected to a process for completely eliminating high molecular weight LPS, and high molecular weight LPS was mixed.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, conventionally reported low molecular weight LPS is a mixture containing high molecular weight LPS, and for clinical use as a pharmaceutical ingredient such as an immune function activator, for example, from the viewpoint of safety, Or it was not always satisfactory from the aspect of medicinal performance. .
[0010]
The present invention has been made in view of the circumstances as described above, and provides a novel LPS having higher safety (ie, lower toxicity) and superior biological activity than conventional LPS. It is an object.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found a novel low molecular weight LPS different from the conventionally reported LPS, and this novel low molecular weight LPS. However, the present invention was completed by finding that it is extremely safer than the conventional LPS and has a biological activity superior to that of the conventional LPS.
[0013]
  This invention is obtained from Pantoea agglomerans, and the following physicochemical and biological properties a) to f)
a) The molecular weight measured by SDS-PAGE using a protein marker is 5,000 ± 2,000,
b) The hexosamine content measured by the Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000.
c) The content of 2-keto-3-deoxyoctonate measured by the diphenylamine method is 1 to 3 / molecular weight 5,000.
d) Limulus activity is at least 10 EU / ng
e) Protein content is 1% (weight) or less
f) The nucleic acid content is 1% (weight) or less.
HaveThe purity of the low molecular weight lipopolysaccharide is 98% (weight) or more.Low molecular weight lipopolysaccharides are provided.
[0014]
  NextThe present invention will be described in detail below. In the following description, the percentage display is a value by weight unless otherwise specified.
[0015]
  The low molecular weight LPS of this invention isPuntair Agglomerans (Pantoea agglomerans)Is cultured by a conventional method, and the cells are collected from the medium. From the collected cells, a known method, for example, a hot phenol method [O. Westphal, edited by Methods in Carbohydrate Chemistry, (Methods
in Carbohydrate Chemistry, Volume 5, Page 83, Academic Press
Press), 1965], and further purified with an anion exchange resin. That is, microbial cells are suspended in distilled water, this suspension is added to a mixture of distilled water and an equal volume of hot phenol and stirred, and then centrifuged to recover the aqueous layer. The dialyzed product is dialyzed to remove phenol, concentrated by ultrafiltration, and the crude LPS fraction is collected. This fraction is purified by conventional anion exchange chromatography (for example, using mono-Q-sepharose or Q-sepharose). Used) and desalted by conventional methods.
[0016]
The purified LPS thus obtained has a molecular weight of 5,000 disclosed in JP-A-4-187640, JP-A-4-49240, JP-A-4-99481 and JP-A-5-155778. It is substantially equal to LPS of about 6,000.
Furthermore, the obtained purified LPS is subjected to gel filtration in the presence of a surfactant such as sodium deoxycholate, and only the fraction containing low molecular weight LPS is recovered, and the mixed high molecular weight LPS is removed. Can provide a highly purified novel low molecular weight LPS of the present invention. The gel filtration step in the presence of the surfactant is carried out by using a molecular weight of 5,000 to 6,000 disclosed in JP-A-4-187640, JP-A-4-49240 and JP-A-5-155778. This is for further purifying the degree of LPS, and this process completely eliminates the high molecular weight LPS mixed therein.
[0017]
  The novel low molecular weight LPS of the present invention produced by the above method is as shown in Test Example 1 described later,
a) The molecular weight measured by SDS-PAGE using a protein marker is 5,000 ± 2,000,
b) The hexosamine content measured by the Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000.
c) The content of 2-keto-3-deoxyoctonate measured by the diphenylamine method is 1 to 3 / molecular weight 5,000.
d) Limulus activity is at least 10 EU / ng
e) Protein content is 1% or less
f) Nucleic acid content is 1% or less
And has a purity of at least 98%. However, depending on the purpose of use, the degree of purification can be reduced (eg, 90%).
[0018]
The novel low molecular weight LPS of the present invention can also be used as a pharmaceutical having a function of activating immune function, a veterinary drug or the like.
Next, test examples are shown, and the low molecular weight LPS of the present invention will be described in more detail. Test example 1
This test was conducted to investigate the physicochemical and biological properties of the low molecular weight LPS of this invention.
1) Sample preparation
Low molecular weight LPS and LPS were prepared by the same method as in Example 1 and Reference Example 1, respectively.
2) Test method
(1) Measurement of molecular weight
Low molecular weight LPS and LPS were each dissolved in distilled water to prepare a solution having a concentration of 2 mg / ml, and 10 μg thereof was weighed into a 1.5 ml plastic tube. Separately, 180 μl of 10% (w / v) SDS, 45 μl of 5% β-mercaptoethanol, 90 μl of CBB dye solution, 112.5 μl of 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) and 22.5 μl of 10 μl of the SDS treatment solution prepared by adding distilled water was added to each sample solution and mixed well, then immersed in a boiling water bath for 5 minutes, and then immediately immersed in ice water for rapid cooling.
[0019]
An electrophoresis buffer prepared by dissolving 10 ml of 10% (w / v) SDS, 17.9 g of tricine and 3.03 g of tris in 1 liter of distilled water was placed in a slab gel electrophoresis tank (manufactured by Marisol). . A 20% polyacrylamide gel was fixed in the electrophoresis tank, the specimen was put in the sample groove, the voltage was fixed at 50 V for 1 hour, and then fixed at 150 V, and the electrophoresis was continued until the dye eluted from the gel. After completion of the electrophoresis, silver staining was performed at room temperature using a silver staining kit 161-0443 (Bio-Rad) to confirm the behavior. (2) Determination of hexosamine content
The hexosamine content was determined by the Elson-Morgan method (edited by the Japanese Biochemical Society, “Biochemistry Experiment Course”, Volume 4, pages 377-379, 1st edition, Tokyo Chemical Doujin Publishing, 1976). Quantification was performed as follows. LPS was dissolved in distilled water to prepare a solution having a concentration of 2 mg / ml. 100 μl of the solution was weighed into a Spitz with screw cap (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.). After heating for 4 hours, the pH was adjusted to 7 by adding about 200 μl of 4N NaOH. 100 μl of the solution was weighed and placed in another Spitz with a screw cap, 200 μl of reagent A was added, heated at 105 ° C. for 1.5 hours, and cooled with running water. Next, 100 μl of the solution was collected, 670 μl of 96% ethanol was added, 67 μl of reagent B was further added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the absorbance at 535 nm was measured. As a standard sample for preparing a calibration curve, 0-800 μg / ml N-acetylglucosamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
Reagent A: A mixture of 75 μl acetylacetone and 2.5 ml 1.25N sodium carbonate.
Reagent B: A mixture of 1.6 g p-dimethylbenzaldehyde, 30 ml concentrated hydrochloric acid and 30 ml 96% ethanol.
(3) Determination of KDO content
The KDO content was quantified by the diphenylamine method [Analytical Biochemistry, Vol. 58, No. 1, pp. 123-129, 1974] as follows.
[0020]
500 mg of diphenylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 ml of ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 45 ml of glacial acetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 50 ml of concentrated hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed and KDO A detection reagent was prepared. To 500 μl, 250 μl of an aqueous solution containing each sample at a concentration of 0.50 mg / ml was mixed, heated in a boiling water bath at 100 ° C. for 30 minutes, and then cooled in constant temperature water (24-25 ° C.) for 30 minutes. The absorbance at 420, 470, 630, and 650 nm was measured with a spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd. Model U2010) (measured values are described as A420, A470, A630, and A650, respectively). As a standard sample, 250 μl of an aqueous solution of KDO ammonium salt (manufactured by Sigma) having a concentration of 0.5 μmol was used.
[0021]
From the four types of measured values of the specimen sample and the standard sample, the S value is obtained by the equation (1), and the S values of the specimen sample and the standard sample are obtained as_tAnd S_sIt was. Subsequently, the number of moles X of KDO was calculated by the formula (2).

(4) Measurement of Limulus activity
Limulus activity refers to the Limulus test (Suzuki Ikuo, “Development of pharmaceuticals, Vol. 14, Quality control and testing of pharmaceuticals”, an endotoxin quantification method using a horseshoe crab hemocyte extract and a chromogenic synthetic substrate, developed by Levin in 1968. ”, Pp. 227-243, Yodogawa Shoten, 1990), this limulus test is known as an LPS detection method. Measurement was performed using a Toxicolor system (manufactured by Seikagaku Corporation) using 345 pg / EU E. coli 0111: B4 as a standard product.
(5) Protein content
The protein content was measured by the Raleigh method [Journal of Biological Chemistry, 193, 65, 1951].
(6) Nucleic acid content
The nucleic acid content was quantified from the measured value (1 OD = 40 μg) at OD (260 nm-300 nm).
(7) Purity
Purity (%) was calculated by the following formula.
[0022]
Purity = [{dry yield− (protein content + nucleic acid content)} / dry yield] × 100
3) Test results
(1) Molecular weight
The results of molecular weight measurement are as shown in FIG. FIG. 1 is an SDS-PAGE electrophoretic diagram, in which lane 1 is a protein and peptide molecular weight marker [94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20.1 kD, 17.2 kD, 14.6 kD, 14.4 kD simultaneously migrated. , 8.24 kD, 6.38 kD, 2.56 kD (Pharmacia)],

lanes

2, 3 and 4 are LPS (20 μg, 5 μg and 1.25 μg),

lanes

5, 6, 7 and 8 are low molecular weight LPS ( 20 μg, 5 μg, 1.25 μg and 0.31 μg), and the vertical axis of the figure indicates the molecular weight.
[0023]
In general, when a substance having a sugar chain is electrophoresed, when the amount of sample per lane is excessive, the staining band becomes wider and the apparent molecular weight range becomes wider. In the SDS-PAGE of FIG. 1, lanes 5 to 8 are migrated by changing the amount of low molecular weight LPS of the same sample, but the width of the staining band increases as the amount of migration of the sample increases. Therefore, for the purpose of examining the accurate molecular weight, an amount of about 1 μg is appropriate, and lane 8 corresponds.

Lanes

2 and 5 are obtained by running a large amount of sample in order to confirm the presence of high molecular weight LPS.
[0024]
The molecular weight of low-molecular-weight LPS (calculated from lane 8) was calculated from the size marker in lane 1 and was 5 kDa as the central value of the stained band, and the range of the stained band width was 4 kDa to 7 kDa. In Lane 5, although 20 μg of low molecular weight LPS was migrated, no high molecular weight LPS was observed as in Lane 2.
From the above results, it was found that the molecular weight of the low molecular weight LPS of the present invention was 5,000 ± 2,000, and the high molecular weight LPS was completely removed.
(2) Hexosamine content
The number of hexosamines of the low molecular weight LPS of this invention was 2 / molecular weight 5,000.
(3) KDO content
The KDO contained in the low molecular weight LPS of this invention was 2.4 / molecular weight 5,000.
(4) Limulus activity
The limulus activity of the low molecular weight LPS of this invention was 43.5 EU / ng, whereas the limulus activity of the conventional LPS prepared by the same method as in Reference Example 1 was 8.4 EU / ng.
(5) Protein content
The protein content of the low molecular weight LPS of the present invention was 0.68% or less.
(6) Nucleic acid content
The nucleic acid content of the low molecular weight LPS of this invention was 0.50% or less.
(7) Purity
The purity of the low molecular weight LPS of this invention was 98% or more.
[0025]
In addition, although it tested by changing microorganisms and a manufacturing method, the substantially same result was obtained. Test example 2
This test was conducted to investigate the acute toxicity of the low molecular weight LPS of this invention.
(1) Sample preparation and test method
Toxicity of low molecular weight LPS prepared by the same method as in Example 1 and LPS prepared by the same method as in Reference Example 1 was tested using 7-week-old C3H / He mice (purchased from Charles River, Japan). did. In a group of mice consisting of 4 mice per group, each sample was dissolved in physiological saline and administered intravenously at a rate of 5.0, 10, 20, and 40 mg / kg per mouse (however, administration of 40 mg / Kg is Low molecular weight LPS only). The mice were observed for life and death for 72 hours after administration.
(2) Test results
The results of this test are shown in Table 1. As is apparent from Table 1, in the case of intravenous administration, no mouse death was observed at any dose with the low molecular weight LPS of the present invention.₅₀Was over 40 mg / kg, but in LPS, all died at doses of 10 and 20 mg / kg, and LD₅₀Was 6.0 to 8.6 mg / kg. In addition, although it tested by changing the kind of microorganisms and the manufacturing method of low molecular weight LPS, the substantially same result was obtained.
[0026]
[Table 1]

[0027]
Test example 3
This test was conducted to examine the acute toxicity when the low molecular weight LPS of the present invention was administered in a larger amount than Test Example 2.
(1) Sample preparation and test method
The same low molecular weight LPS as in Test Example 2 was intravenously administered at a rate of 40, 80 and 160 mg / kg per mouse, and LPS was intravenously injected at a rate of 5.0 or 10 mg / kg per mouse Tested in the same manner as in Test Example 2, except that it was administered.
(2) Test results
The results of this test are as shown in Table 2. As is apparent from Table 2, 25% died at a dose of 5.0 mg / kg LPS and 75% died at a dose of 10 mg / kg. In contrast, low molecular weight LPS did not die at doses of 40 mg / kg, and 100% died at doses of 80 and 160 mg / kg. From the results of the previous test example 2 and this test example 3, the LD₅₀Is as shown in Table 3. As is clear from Table 3, LD of low molecular weight LPS₅₀The value of was approximately 8 times higher than that of LPS when administered intravenously.
[0028]
These results indicate that the difference in the molecular weight of LPS has an effect on toxicity, and it was found that low molecular weight LPS is extremely less toxic than conventional LPS.
[0029]
.
[Table 2]

[0030]
[Table 3]

[0031]
Test example 4
This test was conducted to confirm the TNF production effect of the low molecular weight LPS of the present invention.
In the same manner as in Example 1, 0.1, 1.0, or 10 μg per mouse was added to the tail vein of three 7-week-old male C3H / He mice (purchased from Charles River Japan) in each group. The produced low molecular weight LPS or 0.2 ml of physiological saline containing LPS obtained by the same method as in Reference Example 1 was injected, and after 1 hour, blood was collected and serum was separated by a conventional method.
[0032]
The TNF activity in each serum thus obtained was measured by a method based on toxicity to L929 cells. That is, L929 cells were 8 × 10 8 in MEM medium containing 5% fetal calf serum.⁴Per 100 μl concentration, and 100 μl each in a well of a 96-well flat bottom plate, and 5% CO 2 at 37 ° C. for 2 hours.₂Cultured in the presence. Thereafter, actinomycin D was added to 1 μl / ml, 50 μl of a serum sample serially diluted with MEM medium or positive control human TNF-α (Asahi Kasei Co., Ltd.) was added, and further cultured under the same conditions for 18 hours. After removing the medium with an aspirator, the cells were washed with PBS at 37 ° C. to completely remove dead cells, and 1% methyl alcohol solution containing 0.1% crystal violet was added to stain the living cells. The degree of staining was measured using the absorbance at OD (590 nm) as an index, and TNF activity was calculated based on the relationship between the dilution rate of TNF-α used as a positive control and the absorbance.
[0033]
The results were as shown in Table 4. In Table 4, the TNF activity is an average value of 3 animals in each group. From this result, it became clear that the TNF production effect of the low molecular weight LPS of the present invention exceeds that of the conventional LPS obtained by the method of Reference Example 1.
[0034]
[Table 4]

[0035]
Reference example 1
10 g of tryptone (Difco), 5 g of yeast extract (Difco) and 10 g of NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) are added to 1 liter of distilled water, and the pH is adjusted to 7.5 with NaOH. In a 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of a medium (hereinafter referred to as L-meat medium) supplemented with 0.1% of sterilized glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), Pantoea agglomerans stored at −80 ° C. A single colony was isolated and inoculated from a stock strain, cultured overnight at 35 ° C. with shaking, and the whole amount was added to 1,000 ml of L-meat medium. The 3 liter Sakaguchi flask was inoculated and cultured in the same manner.
[0036]
Furthermore, the cultured cells were inoculated into a 10-liter tabletop fermenter (manufactured by Maruhishi Bio-Engineering Co., Ltd.) containing 7 liters of L-meat broth culture medium, aerated and cultured under the same conditions, and then collected. 70 g of wet cells were collected and stored frozen.
Suspend approximately 70 g of cryopreserved cells in 500 ml of distilled water, add 500 ml of 90% hot phenol, stir at 65-70 ° C. for 20 minutes, cool, and centrifuge at 10,000 G, 4 ° C. for 20 minutes. The aqueous layer was collected. Repeat the same operation as above for the phenol layer one more time, combine the collected two aqueous layers, dialyze overnight to remove the phenol, and remove the dialysis solution from the ultrafiltration device (Advantech Toyo). Ultra-concentrated under an atmosphere of nitrogen at 2 atm with a molecular weight of 200,000 cut-off membrane using UK-200).
[0037]
The obtained crude LPS lyophilizate was dissolved in distilled water, sterilized by filter, added with a buffer, subjected to anion exchange chromatography (Pharmacia, Q-Sepharose Fast Flow), 10 mM Tris-HCl ( The sample solution was passed through the column with a buffer containing pH 7.5) and 10 mM NaCl, and the Limulus active fraction was eluted with 200 to 400 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). The eluate was ultrafiltered under the same conditions as described above, desalted and concentrated, and lyophilized to obtain about 300 mg of purified LPS from about 70 g of wet cells.
[0038]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0039]
【Example】
Example 1
100 mg of purified LPS obtained by the same method as in Reference Example 1 was solubilized at a concentration of 5 mg / ml [3% sodium deoxycholate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.2 M sodium chloride, 5 mM EDTA-2Na and 20 mM Tris. -Made of hydrochloric acid, dissolved in pH 8.3], 20 ml of purified LPS solution was gently layered on top of a Sephacryl S-200HR column (Pharmacia), and the elution buffer [0.25% sodium deoxycholate (sum) Made of 0.2M sodium chloride, 5 mM EDTA and 10 mM Tris-hydrochloric acid, and eluted with 800 ml (50 hours) at a flow rate of 16 ml / hour.
[0040]
While controlling the flow rate using Perista Pump PI (Pharmacia), the resulting eluate was fractionated with a fraction collector (Advantech, SF2120), and the first 240 ml (24 fractions) were discarded. Fractionation was performed up to 80 fractions at 10 ml / fraction. For each eluted fraction, saccharides are quantified by the phenol / sulfuric acid method (Sakuzo Fukui, “Quantification Method for Reducing Sugars, Second Edition”, pages 50-52, Academic Publishing Center, 1990) in stock solution or diluent. The elution state was examined. From the results of the elution state obtained, SDS-PAGE was performed using 0.5 ml of each of the fractions 37 to 55 among the fractions (fractions 30 to 60) in which the presence of LPS was expected, and the fraction of LPS I examined the pattern. As a result, only low molecular weight (molecular weight of about 5 kD) LPS was found in fraction 45-55, and both high molecular weight and low molecular weight LPS were found in fraction 37-44. Therefore, low molecular weight LPS of fraction 45-55 The fraction was further purified as follows.
[0041]
Each fraction was mixed and lyophilized, suspended in ethanol, deoxycholic acid soluble in ethanol was removed by centrifugation, and low molecular weight LPS was recovered in the insoluble fraction. Repeat the ethanol treatment of the low molecular weight LPS fraction two more times to remove deoxycholic acid, then resuspend in 70% ethanol, remove the buffer components by centrifugation, and repeat this procedure three more times. The low molecular weight LPS was recovered in the insoluble fraction and freeze-dried to obtain about 20 mg of purified low molecular weight LPS.
Example 2
5 g of tryptone (manufactured by Difco), 1.6 g of potassium dihydrogen phosphate and 8 g of sodium chloride were dissolved in 1,000 ml of purified water and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes (hereinafter referred to as basal medium). To 100 ml of basal medium, 10 ml of 40% magnesium chloride solution and 3 ml of 0.4% malachitogulin solution were aseptically added to obtain a magnesium-malachitogulin medium.
[0042]
A 500-ml Sakaguchi flask containing 100 ml of magnesium-malachite glin medium was inoculated with a single colony isolated from a Salmonella minnesota-preserving strain, cultured at 35 ° C. with shaking overnight, and the whole amount was 1 as it was. A 3 liter Sakaguchi flask containing 1,000 ml of magnesium-malachitogulin medium was inoculated and cultured under the same conditions.
[0043]
Furthermore, the cultured cells were inoculated into a 10-liter tabletop fermenter (manufactured by Maruhishi Bio-Engineering Co., Ltd.) containing 7 liters of magnesium-malachite glin medium, aerated under the same conditions, and then collected. About 50 g of wet cells were collected and stored frozen.
Suspend approximately 50 g of cryopreserved cells in 500 ml of distilled water, add 500 ml of 90% hot phenol, stir at 65-70 ° C. for 20 minutes, cool, and centrifuge at 10,000 G, 4 ° C. for 20 minutes. The aqueous layer was collected. The phenol layer was treated once more by the same procedure as described above. Combine the two aqueous layers and dialyze overnight to remove the phenol, and use an ultrafiltration device (Advantech Toyo Co., Ltd., UK-200) to remove the dialysis solution from the 200,000 cut-off membrane. Ultrafiltration was performed under nitrogen gas at 2 atm.
[0044]
The obtained crude LPS lyophilizate was dissolved in distilled water, sterilized by filter, added with a buffer, subjected to anion exchange chromatography (Pharmacia, Q-Sepharose Fast Flow), 10 mM Tris-HCl ( The sample solution was passed through the column with a buffer containing pH 7.5) and 10 mM NaCl, and the Limulus active fraction was eluted with 200 to 400 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). This eluate was subjected to ultrafiltration under the same conditions as described above, desalted and concentrated, and lyophilized to obtain about 210 mg of purified LPS from about 50 g of wet cells.
[0045]
80 mg of this purified LPS was dissolved in a solubilization buffer containing 3% sodium deoxycholate in the same manner as in Example 1, and developed with a Sephacryl S-200HR column (Pharmacia), containing only low molecular weight LPS. The fractions to be collected were collected, freeze-dried, suspended in ethanol, buffer components such as deoxycholic acid were removed by centrifugation, and lyophilized to obtain about 5 mg of low molecular weight LPS.
[0046]
The molecular weight, KDO number, and hexosamine number of this low molecular weight LPS were measured by the same method as in Test Example 1, and as a result, 6,000, 2.01 pieces / molecular weight 6,000, and 2.8 pieces / molecular weight 6, respectively. 000.
For reference, FIG. 2 shows an SDS-PAGE diagram of low molecular weight LPS purified from Salmonella Minnesota strain. Lane 1 in the figure is a protein and peptide marker [94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20 kD, 17.2 kD, 14.6 kD, 14.4 kD, 8.24 kD, 6.38 kD and 2.56 kD (manufactured by Pharmacia)],

Lanes

2, 3 and 4 are purified LPS before gel filtration in the presence of sodium deoxycholate (20 μg, 5 μg and 1.25 μg),

lanes

5, 6, 7 and 8 are low molecular weight LPS (20 μg, 5 μg 1.25 μg, and 0.31 μg).
[0047]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present invention provides a low molecular weight LPS that is extremely safe and can be used as a pharmaceutical product and has high biological activity.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an SDS-PAGE diagram of each LPS sample.
FIG. 2 is an SDS-PAGE diagram of each LPS sample.

Claims

Physicochemical and biological properties obtained from Pantoea agglomerans (a) to f) a) Molecular weight measured by SDS-PAGE using protein markers is 5,000 ± 2,000 Yes,
b) The hexosamine content measured by the Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000 c) The 2-keto-3-deoxyoctonate content measured by the diphenylamine method is 1 to 3 / molecular weight 5, it d) limulus activity is 000, the low has to be that e) a protein content of at least 10 EU / ng is, f) nucleic acid content is not more than 1% (by weight) of 1% or less (by weight) A low molecular weight lipopolysaccharide in which the purity of the molecular weight lipopolysaccharide is 98% (by weight) or more .