JP4041311B2

JP4041311B2 - Somatostatin agonist

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Publication number: JP4041311B2
Application number: JP2001506685A
Authority: JP
Inventors: モーガン，バリー・エイ; サダト−アアラエ，ディーン
Original assignee: ソシエテ・ドゥ・コンセイユ・ドゥ・ルシェルシュ・エ・ダプリカーション・シャンティフィック・エス・ア・エス
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2020-06-23
Also published as: RU2263677C2; IL146941A0; EP1189942A1; WO2001000676A1; CA2377265A1; JP2003503369A; AU770958B2; HUP0201696A2; HUP0201696A3; AU6200000A; PL352763A1; CN1367792A; AR024463A1; MXPA01013127A; BR0011919A; CZ20014534A3

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、後記に記載および定義する式（Ｉ）により定める、ソマトスタチンアゴニスト活性をもつ環状ペプチド、またはその医薬的に許容できる塩、それらのペプチドを含む医薬組成物、ならびにソマトスタチン受容体サブタイプアゴニストとしてのその使用に関する。本発明のペプチドはソマトスタチンサブタイプ受容体５に選択的に結合し、それらのペプチドが結合するソマトスタチンサブタイプ受容体からのアゴニスト作用を引き起す。
【０００２】
ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）は、３位と１４位の間にジスルフィド橋を含む環状テトラデカペプチドホルモンであり（Ｈｅｉｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４５：４２９−４３６（１９８７））、成長ホルモン（ＧＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の放出を抑制し、アミリン、インスリンおよびグルカゴンの放出を抑制し、胃液分泌および神経伝達物質の放出を減少させる特性をもつ。アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼによるソマトスタチン代謝により、作用持続時間が短縮される。天然ソマトスタチンの半減期は短いので、たとえば先端巨大症の治療のために種々のソマトスタチン類似体が開発された。Ｒａｙｎｏｒ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．，４３：８３８（１９９３）。
【０００３】
５つの異なるソマトスタチン受容体が同定および解明された。Ｈｏｙｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓＡｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３５０：４４１（１９９４）。ソマトスタチンは５つの異なる受容体（ＳＳＴＲ）サブタイプに、各サブタイプにつき比較的高い同等な親和性で結合する。これらの異なるタイプのソマトスタチンサブタイプへの結合により、下記の状態および／または疾患が治療され（”ＳＳＴＲ−２”）（Ｒａｙｎｏｒ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．，４３：８３８（１９９３）；Ｌｌｏｙｄ，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６８：Ｇ１０２（１９９５））、これに対しインスリンの抑制はソマトスタチンタイプ−５受容体（”ＳＳＴＲ−５”）によるものであった（Ｃｏｙ，ｅｔａｌ．，１９７：３６６−３７１（１９９３））。タイプ２と５の活性化に伴って、成長ホルモンが抑制され、より具体的にはＧＨ分泌性アデノーマ（先端巨大症）およびＴＳＨ分泌性アデノーマが抑制された。タイプ２が活性化され、ただしタイプ５は活性化されない場合、プロラクチン分泌性アデノーマが治療された。ソマトスタチン活性化の他の指標は、下記のものである：インスリンおよび／またはグルカゴンの抑制、より具体的には糖尿病、血管障害、増殖性網膜症、ダウン現象（ｄａｗｎｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）および腎障害の抑制；胃酸分泌抑制、より具体的には消化性潰瘍、腸皮および膵皮フィステル、過敏性腸症候群、ダンピング症候群、漿液性下痢症候群、エイズ関連下痢、化学療法誘発性下痢、急性または慢性膵炎および消化器ホルモン分泌性腫瘍の抑制；癌、たとえば肝細胞癌の治療；血管形成抑制；炎症性障害、たとえば関節炎の治療；網膜症の治療；慢性同種異系移植片拒絶の治療；血管形成術；移植血管および消化器出血の阻止。目的とする生物学的応答に関与する特異的ソマトスタチン受容体サブタイプに選択的であり、したがって望ましくない副作用を生じる可能性のある他の受容体サブタイプとの相互作用の少ない類似体を得ることが好ましい。
【０００４】
式（Ｉ）のペプチドは、本発明の譲受人に一部譲渡された出願中の米国特許出願０８／８５５，２０４（１９９７年５月１３日出願）に記載および特許請求されている化合物群に属するが、本発明の式（Ｉ）の化合物は米国特許出願０８／８５５，２０４に具体的には記載されていない。意外にも本発明の式（Ｉ）の化合物はソマトスタチンアゴニスト活性をもつことが見いだされた。米国特許出願０８／８５５，２０４の化合物は本来ソマトスタチンアンタゴニスト活性をもつことが認められていたので、これは予想外の知見である。
【０００５】
発明の概要
１態様において本発明は、式（Ｉ）のペプチド：
Ｘ−Ａ¹−cyclo（Ｄ−Cys−Ａ³−Ａ⁴−Lys−Ａ⁶−Ａ⁷）−Ａ⁸−Ｙ（Ｉ）
またはその医薬的に許容できる塩に関する：
［式中：
Ｘは、Ｈ、
【０００６】
【化４】

【０００７】
であり；
Ａ¹およびＡ³はそれぞれ独立して、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（Ｉ）、Ｔｒｐ、３−Ｐａｌ、４−Ｐａｌ、ＣｐａおよびＮａｌよりなる群から選択されるアミノ酸のＤ−またはＬ−異性体であり；
Ａ⁴は、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｌ−β−メチル−ＴｒｐまたはＤ−β−メチル−Ｔｒｐであり；
Ａ⁶は、−ＮＨ−（ＣＨＲ¹）_n−ＣＯ−であり、ここでｎは２、３または４であり；
Ａ⁷は、Ｌ−またはＤ−Ｃｙｓであり；
Ａ⁸は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（Ｉ）、Ｔｒｐ、Ｎａｌ、Ｃｐａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸のＤ−またはＬ−異性体であり；
Ｙは、ＮＲ²Ｒ³であり、ここでＲ²およびＲ³はそれぞれ独立してＨまたは（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキルであり；
Ｒ¹は、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルおよび−ＣＨ₂−アリールよりなる群から選択され；ここでアリールはフェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチルよりなる群から選択される置換されていてもよい部分であり、置換されていてもよい部分はそれぞれ独立して（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、アリール、アリール（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、−Ｎ（Ｒ⁴Ｒ⁵）、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮ（Ｒ⁴Ｒ⁵）、ハロ、−ＯＨ、−ＣＮおよび−ＮＯ₂よりなる群から選択される１以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれ、それぞれの場合につき独立して、Ｈまたは（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキルであり；
式中、Ａ²のＣｙｓがＡ⁷のＣｙｓに、各Ｃｙｓのチオール基から形成されるジスルフィド結合により結合している］。
【０００８】
好ましい前記式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩は下記のものである：
ＸはＨであり；
Ａ¹は、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＣｐａまたはＤ−Ｃｐａであり；
Ａ³は、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＴｒｐまたはＬ−３−Ｐａｌであり；
Ａ⁴は、Ｄ−Ｔｒｐであり；
Ａ⁶は、β−ＡｌａまたはＧａｂａであり；
Ａ⁷は、Ｌ−Ｃｙｓであり；
Ａ⁸は、Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｎａｌであり；かつ
Ｒ²およびＲ³はそれぞれＨである。
【０００９】
上記群のペプチドのうち好ましいものは、下記のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩である：
【００１０】
【化５】

【００１１】
上記群のペプチドのうち好ましいものは、下記のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩である：
【００１２】
【化６】

【００１３】
他の態様において本発明は、ヒトまたは他の動物においてソマトスタチンアゴニスト応答を引き起すのに有用な医薬組成物であって、有効量の式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物を提供する。
【００１４】
さらに他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは他の動物においてソマトスタチンアゴニスト応答を引き起す方法であって、有効量の式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
他の態様において本発明は、ヒトまたは他の動物においてソマトスタチンサブタイプ受容体タイプ５を選択的に結合する方法であって、有効量の式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
さらに他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは他の動物において疾患または状態を処置する方法であって、有効量の式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与し、その際疾患または状態がクッシング症候群、ゴナドトロピノーマ（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｏｍａ）、上皮小体機能亢進症、ページェット病、ＶＩＰ産生腫瘍、膵島細胞症、高インスリン症、ガストリン産生腫瘍、ゾリンジャー-エリソン症候群、エイズおよび他の状態に関連する分泌過多下痢、過敏性腸症候群、膵炎、クローン病、全身性硬化症、甲状腺癌、乾癬、低血圧症、パニック発作、スクレロドーマ（ｓｃｌｅｒｏｄｏｍａ）、小腸閉塞、胃食道逆流、十二指腸胃逆流、グレーブズ病、多嚢胞卵巣症、上部胃腸出血、膵偽性嚢胞、膵腹水、白血病、髄膜腫、癌性悪液質、先端巨大症、再狭窄、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、充実性腫瘍の加速増殖抑制、減量、インスリン耐性の治療、X症候群、膵細胞の生存延長、線維症、高脂血症、高アミリン血症、高プロラクチン血症およびプロラクチン血症よりなる群から選択されるものである方法を提供する。
【００１７】
さらに他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは他の動物において成長ホルモン、インスリン、グルカゴンの分泌または膵臓外分泌を抑制する方法であって、式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに他の態様において本発明は、ヒトまたは他の動物においてインビボでソマトスタチン受容体含有細胞を造影する方法であって、式（Ｉ）においてＡ¹、Ａ³またはＡ⁸のうち少なくとも１つがＴｙｒ（Ｉ）であるペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
他の態様において本発明は、インビトロでソマトスタチン受容体含有細胞を造影する方法であって、式（Ｉ）においてＡ¹、Ａ³またはＡ⁸のうち少なくとも１つがＴｙｒ（Ｉ）であるペプチドまたはその医薬的に許容できる塩をヒトまたは他の動物に投与することを含む方法を提供する。そのような本発明のペプチドは、ソマトスタチン受容体をもつ細胞（たとえば癌細胞）をインビボで検出するために、あるいはインビトロで放射性リガンドとしてソマトスタチン受容体結合アッセイに使用できる。
【００２０】
本発明のペプチドにおいてアミノ酸を表すために、当技術分野で受け入れられている３文字略号を用いる。本明細書に記載した式には、残基Ａ²（すなわちＤ−Ｃｙｓ）の側鎖上のチオール基と残基Ａ⁷（すなわちＬ−ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓ）の側鎖上のチオール基との間のジスルフィド結合は示されていない。以下のアミノ酸略号はその後に示した名称を表す：Ｃｐａ＝ｐ−クロロフェニルアラニン；Ｎａｌ＝β−（２−ナフチル）アラニン；３−Ｐａｌ＝β−（３−ピリジル）アラニン；４−Ｐａｌ＝β−（４−ピリジル）アラニン；およびＧａｂａ−４−アミノ酪酸。定義”−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−、ここでｎは２、３または４である”には、β−ＡｌａおよびＧａｂａなどのアミノ酸が含まれる。
【００２１】
別途明記しない限り、アミノ酸の３文字略号はＬ−異性体を表す。
アルキルという用語は、表記した長さの直鎖または分枝鎖構造のアルキル基を含むものとする。そのようなアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチルなどである。用語Ｃ₀−アルキルが定義に含まれる場合、それは共有単結合を表すものとする。
【００２２】
アルケニルという用語は、１以上の二重結合をもち、表記した数の炭素原子をもつ直鎖または分枝鎖構造の炭化水素基を含むものとする。そのようなアルケニル基の例は、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、ｔ−ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、イソヘキセニルなどである。
【００２３】
アルキニルという用語は、１以上の三重結合および表記した数の炭素原子をもつ直鎖または分枝鎖構造のアルキニル基、すなわち炭化水素基を含むものとする。そのようなアルキニル基の例は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、イソペンチニル、ヘキシニル、イソヘキシニルなどである。
【００２４】
アルコキシという用語は、１以上の三重結合および表記した数の炭素原子をもつ直鎖または分枝鎖構造のアルコキシ基を含むものとする。そのようなアルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ヘキソキシ、イソヘキソキシなどである。
【００２５】
アリールという用語は、当技術分野で既知の芳香環を含むものとし、単環式または二環式、たとえばフェニルおよびナフチルであってよい。
ハロという用語は、塩素、臭素、ヨウ素およびフッ素を含むものとする。
【００２６】
詳細な記述
当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用できる。したがって以下の具体的態様は本発明の説明にすぎず、本発明の範囲全体を限定するものと解すべきではない。
【００２７】
本発明のペプチドは下記により製造することができ、この方法で合成された：ＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−ＭＢＨＡ樹脂）上でＦＭＯＣ化学のための標準固相プロトコルを用いて合成し、ＴＦＡ／フェノール／Ｈ₂Ｏ／トリイソプロピルシラン（８３ｍｌ／５ｇ／１０ｍｌ／２ｍｌ）混合物により樹脂から開裂する。ペプチドをＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５ｍｌ／５ｍｌ）中でＥＫＡＴＨＩＯＸ（商標）樹脂（ＥＫＡＧＥＮ社、カリフォルニア州サンカルロス）により環化し、Ｃ₁₈シリカ（ＲａｉｎｉｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、マサチュセッツ州ウーバン；現在はＶａｒｉａｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌ、カリフォルニア州ウォールナットクリーク）上でアセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸および緩衝液を用いて精製した。分析用ＨＰＬＣにより均一性を評価し、各ペプチドにつき＞９５％であると判定された。ペプチドを質量分析法で解明した。
【００２８】
本発明の式（Ｉ）のヨウ素化Ｔｙｒ（Ｔｙｒ（Ｉ））の合成（たとえばクロラミン−Ｔ法）については十分に文献記載されており、当業者が容易になしうる範囲内のものである。たとえばＣｚｅｒｎｉｃｋ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：５５２５（１９９３）およびＥＰ３８９，１８０Ｂ１参照。
【００２９】
式（Ｉ）においてＸが
【００３０】
【化７】

【００３１】
であるペプチドは、ＵＳＰ５，５５２，５２０の方法および教示に従って合成できる。その内容全体を本明細書に参考として援用する。
以下に実施例１および２の合成を詳述する。式（Ｉ）の化合物に含まれる他のペプチドは、ペプチド合成の当業者に周知の適切な変更を行って製造することができる。
【００３２】
実施例１
工程１：Ｆｍｏｃ−Ｃｐａ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｐａｌ−Ｎ−ｉｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｎ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−４−（２’，４’−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンズヒドリルアミン樹脂の製造
ＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンディエゴ）０．５ｇ（０．２６５ｍｍｏｌ）を、振とう器（ＢｕｒｒｅｌｌＷｒｉｓｔ−ＡｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｈａｋｅｒ）、溶剤ディストリビューターおよび真空ポンプの接続により組み立てた２４−ＲＶペプチド合成装置の反応容器に入れた。このペプチド合成装置を下記の反応サイクルの実施のためにプログラミングした：
ａ．ジメチルホルムアミド；
ｂ．ジメチルホルムアミド中２５％ピペリジン（手動で添加）（各１５分間で２回、間で１回のＤＭＦ洗浄）；
ｃ．ＤＭＦ洗浄（１０ｍＬで３回、各１分間）；
樹脂をジメチルホルムアミド中でＦＭＯＣ−Ｎａｌ（１．０６ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＵＴ）（１．００７ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（２．１２ｍｍｏｌ）と共に約１．５時間撹拌し、得られたアミノ酸樹脂を次いで前記の洗浄／脱保護プログラムの工程（ａ）〜（ｃ）で循環させた。
【００３３】
同じ方法で下記のアミノ酸をＮａｌ−樹脂に順次結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｓ−Ｔｒｉｔｙｌ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ、Ｎ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−（Ｎ−ｉｎ−ｔ−Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−ＣｙｓおよびＦｍｏｃ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ。ＤＭＦ洗浄（１０ｍＬで３回、それぞれ約１分間）および真空乾燥の後、完成ペプチド樹脂の重量は０．７４９ｇであった。
【００３４】
工程２：Ｈ−Ｃｐａ−ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ｃｙｓ−Ｐａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−Ｃｙｓ）−Ｎａｌ−ＮＨ₂の製造
実施例１の工程１から得たペプチド樹脂（０．３６ｇ，０．０８７ｍｍｏｌ）を、新たに調製した、ＴＦＡ（８．８ｍＬ）、フェノール（０．５ｇ）、Ｈ₂Ｏ（０．５ｍＬ）およびトリイソプロピルシラン（０．２ｍＬ）の溶液と室温で混合し、約２．５時間撹拌した。過剰のＴＦＡを減圧下で蒸発させて、油性残留物を得た。次いでエーテルを油性残留物に添加し、遊離線状ペプチドを沈殿させ、濾過し、乾燥エーテルで洗浄した。次いでこの粗製ペプチドを１０ｍＬのＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ（５ｍＬ／５ｍＬ）に溶解した後、２００ｍｇのＥＫＡＴＨＩＯＸ（商標）樹脂を添加した。混合物を一夜撹拌し、濾過した。濾液を蒸発させて体積を減少させ、次いでミクロソルブ（ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）オクタデシルシランシリカ（５μｍ）カラム（２２−２５０ｍｍ）に付与した。水中アセトニトリル（両溶剤とも０．１％トリフルオロ酢酸を含有）の直線勾配（２０％から４０％まで、６０分間かけて）により溶離して画分を得た。これらを分析用高速液体クロマトグラフィー（”ＨＰＬＣ”）により検査して、最大純度が得られるようにプールした。溶液を水から凍結乾燥して、２６ｍｇの生成物を白色綿毛状粉末として得た。前記と同じ溶離剤を直線勾配（３０％から７０％まで、１５分間かけて）で用いるＨＰＬＣＣ₁₈シリカにより、生成物は均一であることが認められた（保持時間６．３１３分）。インフュージョン質量分析によりこの環状ペプチドの組成を確認した。分子量１１３３．８。
【００３５】
実施例２
工程１：Ｆｍｏｃ−Ｃｐａ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｐａｌ−Ｎ−ｉｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｎ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｇａｂａ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｃｙｓ−Ｎａｌ−４−（２’，４’−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンズヒドリルアミン樹脂の製造
ＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンディエゴ）０．２ｇ（０．１０６ｍｍｏｌ）を、２４−ＲＶペプチド合成装置の反応器＃３（ＲＶ−３）に入れた。このペプチド合成装置を下記の反応サイクルの実施のためにプログラミングした：
ａ．ジメチルホルムアミド；
ｂ．ジメチルホルムアミド中２５％ピペリジン（手動で添加）（各１５分間で２回、間で１回のＤＭＦ洗浄）；
ｃ．ＤＭＦ洗浄（１０ｍＬで３回、各１分間）；
樹脂をジメチルホルムアミド中でＦＭＯＣ−Ｎａｌ（０．４２４ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＵＴ）（０．４０３ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（０．８４８ｍｍｏｌ）と共に約１．５時間撹拌し、得られたアミノ酸樹脂を次いで前記洗浄プログラムの工程（ａ）〜（ｃ）で循環させた。
【００３６】
下記のアミノ酸をペプチド樹脂に同順序で順次結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｓ−Ｔｒｉｔｙｌ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｇａｂａ、Ｎ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−（Ｎ−ｉｎ−ｔ−Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−ＣｙｓおよびＦｍｏｃ−Ｃｐａ。ＤＭＦ洗浄（１０ｍＬで３回、それぞれ約１分間）および真空乾燥の後、完成ペプチド樹脂の重量は０．３１ｇであった。
【００３７】
工程２：Ｈ−Ｃｐａ−ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ｃｙｓ−Ｐａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇａｂａ−Ｃｙｓ）−Ｎａｌ−ＮＨ₂の製造
実施例２の工程１から得たペプチド樹脂を、新たに調製した、ＴＦＡ（８．３ｍＬ）、フェノール（０．５ｇ）、Ｈ₂Ｏ（１ｍＬ）およびトリイソプロピルシラン（０．２ｍＬ）の溶液と室温で混合し、約２．５時間撹拌した。過剰のＴＦＡを減圧下で蒸発させて、油性残留物を得た。次いでエーテルを油性残留物に添加し、遊離線状ペプチドを沈殿させ、濾過し、次いで乾燥エーテルで洗浄した。次いでこの粗製ペプチドを１０ｍＬのＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏに溶解した後、２００ｍｇのＥＫＡＴＨＩＯＸ（商標）樹脂を添加した。混合物を一夜撹拌し、濾過した。濾液を蒸発させて体積を減少させ、次いでミクロソルブオクタデシルシランシリカ（５μｍ）カラム（２２−２５０ｍｍ）に付与し、水中アセトニトリル（両溶剤とも０．１％トリフルオロ酢酸を含有）の直線勾配（２０％から１００％まで、６０分間かけて）により溶離した。画分を分析用高速液体クロマトグラフィー（”ＨＰＬＣ”）により検査して、最大純度が得られるようにプールした。溶液を水から凍結乾燥して、１３ｍｇの生成物を白色綿毛状粉末として得た。前記と同じ溶離剤（２０％から８０％まで、１５分間かけて）を用いるＨＰＬＣＣ₁₈シリカにより、生成物は均一であることが認められた（保持時間９．１９５分）。インフュージョン質量分析によりこの環状ペプチドの組成を確認した。分子量１１４７．８３。
【００３８】
本発明のペプチドは、医薬的に許容できる塩類の形で提供できる。そのような塩類の例には、有機酸（たとえば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホンまたはパモイックアシッド（ｐａｍｏｉｃａｃｉｄ））、無機酸（たとえば塩酸、硫酸またはリン酸）、およびポリマー酸（たとえばタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸−グリコール酸コポリマー）が含まれるが、これらに限定されない。本発明ペプチドの塩を調製する一般的方法は当技術分野で周知であり、標準的な塩交換法により達成できる。したがって、本発明ペプチドのＴＦＡ塩（ＴＦＡ塩はＴＦＡ含有緩衝液で溶離する調製用ＨＰＬＣによるペプチド精製により得られる）は、少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液にこのペプチドを溶解することにより酢酸塩に変換できる。得られた溶液を半調製用ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ，３００ＳＢ，Ｃ−８）に付与する。カラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）直線勾配（２０％から１００％までの溶液Ｂ、３０分間かけて）、流速４ｍｌ／分で溶離した（溶液Ａは０．２５Ｎ酢酸水溶液；溶液Ｂはアセトニトリル／水（８０：２０）中の０．２５Ｎ酢酸）。本発明のペプチドを含有する画分を採集し、凍結乾燥した。
【００３９】
ヒトソマトスタチンサブタイプ受容体１〜５（それぞれｓｓｔ₁、ｓｓｔ₂、ｓｓｔ₃、ｓｓｔ₄およびｓｓｔ₅）に対する本発明ペプチドの親和性は、ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクション細胞への（¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹）ＳＲＩＦ−１４の結合阻害を測定することにより判定される。
【００４０】
ヒトｓｓｔ₁受容体遺伝子をゲノムフラグメントとしてクローニングした。１００ｂｐの５’側非翻訳領域、１，１７Ｋｂの全コード領域、および２３０ｂｐの３’側非翻訳領域を含む１．５ＫｂのＰｓｔ−ＸｍｎＩセグメントを、ＢｇｌＩＩリンカー付加により修飾した。得られたＤＮＡフラグメントをｐＣＭＶ−８１のＢａｍＨＩ中へサブクローニングして、哺乳動物発現プラスミドを作製した（Ｄｒ．ＧｒａｅｍｅＢｅｌｌにより提供，シカゴ大学）。リン酸カルシウム共沈法（１）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）中へトランスフェクションすることにより、ｓｓｔ₁受容体を安定に発現するクローン細胞系を得た。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ）を選択性マーカーとして挿入した。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中でクローン細胞系を選択し、リングクローニングし、培養増殖させた。
【００４１】
ヒトｓｓｔ₂ソマトスタチン受容体遺伝子は、１．７ＫｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩゲノムＤＮＡフラグメントとしてクローニングされ、プラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中へサブクローニングされたものとして、Ｄｒ．Ｇ．Ｂｅｌｌ（シカゴ大学）により好意的に提供された。この１．７ＫｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ５の適合する制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することにより、哺乳動物細胞発現ベクターを構築する。リン酸カルシウム共沈法を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞中へトランスフェクションすることにより、クローン細胞系を得る。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏを選択性マーカーとして挿入する。
【００４２】
ヒトｓｓｔ₃をゲノムフラグメントとして単離し、全コード配列を２．４ＫｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに挿入した。２．０ＫｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの両端をＥｃｏＲＩリンカー付加により修飾した後、ｐＣＭＶベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、哺乳動物発現プラスミドｐＣＭＶ−ｈ３を構築した。リン酸カルシウム共沈法を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）中へトランスフェクションすることにより、ｓｓｔ₃受容体を安定に発現するクローン細胞系を得た。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ）を選択性マーカーとして挿入した。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中でクローン細胞系を選択し、リングクローニングし、培養増殖させた。
【００４３】
ヒトｓｓｔ₄受容体発現プラスミドｐＣＭＶ−ＨＸは、Ｄｒ．ＧｒａｅｍｅＢｅｌｌ（シカゴ大学）により提供された。このベクターは、ｐＣＭＶ−ＨＸのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた、ヒトｓｓｔ₄、４５６ｂｐの５’側非翻訳領域および２００ｂｐの３’側非翻訳領域をコードする１．４ＫｂのＮｈｅＩ−ＮｈｅＩゲノムフラグメントを含む。リン酸カルシウム共沈法を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）中へトランスフェクションすることにより、ｓｓｔ₄受容体を安定に発現するクローン細胞系を得た。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ）を選択性マーカーとして挿入した。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中でクローン細胞系を選択し、リングクローニングし、培養増殖させた。
【００４４】
ヒトｓｓｔ₅遺伝子は鋳型としてλゲノムクローンを用いるＰＣＲにより得られたものであり、Ｄｒ．ＧｒａｅｍｅＢｅｌｌ（シカゴ大学）により好意的に提供された。得られた１．２ＫｂのＰＣＲフラグメントは、２１ｂｐの５’側非翻訳領域、全コード領域、および５５ｂｐの３’側非翻訳領域を含んでいた。このクローンをプラスミドｐＢＳＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。挿入体を、ｐＣＭＶ５哺乳動物発現ベクター中へサブクローニングするための１．２ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして回収した。リン酸カルシウム共沈法を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）中へトランスフェクションすることにより、ｓｓｔ₅受容体を安定に発現するクローン細胞系を得た。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ）を選択性マーカーとして挿入した。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中でクローン細胞系を選択し、リングクローニングし、培養増殖させた。
【００４５】
ヒトｓｓｔ受容体のひとつを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％のウシ胎仔血清および０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。細胞を０．５ｍＭＥＤＴＡで採集し、５００ｇ、約４℃で約５分間、遠心分離する。ペレットを５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に再懸濁し、５００ｇ、約４℃で約５分間、２回遠心分離する。超音波処理により細胞を溶解し、３９０００ｇ、約４℃で約１０分間、遠心分離する。ペレットを同緩衝液に再懸濁し、５００００ｇ、約４℃で約１０分間、遠心分離し、得られたペレット中の膜を−８０℃で保存する。
【００４６】
（¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹）ＳＲＩＦ−１４結合の競合阻害実験を、ポリプロピレン製９６ウェルプレートにおいて二重試験法で実施する。細胞膜（タンパク質１０μｇ／ウェル）を（¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹）ＳＲＩＦ−１４（０．０５ｎＭ）と共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．２％のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２００ＫＩＵ／ｍｌのＴｒａｓｙｌｏｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌのバシトラシンおよび０．０２ｍｇ／ｍｌのフッ化フェニルメチルスルホニル中、約３７℃で約６０分間インキュベートする。
【００４７】
Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ１９６（Ｐａｃｋａｒｄ）細胞ハーベスターを用い、０．１％ポリエチレンイミン（Ｐ．Ｅ．Ｉ．）でプレソーキングしたＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタープレート（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ，Ｐａｃｋａｒｄ）により直ちに濾過することによって、結合形（¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹）ＳＲＩＦ−１４を遊離形から分離する。フィルターを５０ｍＭＨＥＰＥＳで約０〜４℃において約４秒間洗浄し、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔにより放射能をアッセイする。
【００４８】
非特異的結合（０．０１μＭのＳＲＩＦ−１４の存在下で測定）を全結合から差し引くことにより、特異的結合を求める。結合データをコンピューター支援非線形回帰分析（ＭＤＬ）により分析して、阻害定数（Ｋｉ）を決定する。
【００４９】
本発明化合物がアゴニストまたはアンタゴニストであるかの判定は、下記のアッセイにより決定できる：
機能アッセイ：細胞内ｃＡＭＰ産生の阻害：
ヒトソマトスタチン（ＳＲＩＦ−１４）サブタイプ受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２４ウェル組織培養用マルチディッシュ中、１０％のＦＣＳおよび０．０４ｍｇ／ｍｌのゲネチシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に接種する。実験前日に培地を交換する。
【００５０】
細胞１０⁵個／ウェルを、０．２％のＢＳＡを含有する新たなＲＰＭＩ［０．５ｍＭの（１）３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充］０．５ｍｌで２回洗浄し、約３７℃で約５分間インキュベートする。
【００５１】
・１ｍＭフォルスコリン（ＦＳＫ）の添加により約３７℃で約１５〜３０分間、サイクリックＡＭＰ産生を刺激する
・ＦＳＫ（１μＭ）、ＳＲＩＦ−１４（１０^-12〜１０^-6Ｍ）および被験化合物（１０^-10〜１０^-5Ｍ）の同時添加により、化合物のアゴニスト作用を測定する
・ＦＳＫ（１μＭ）、ＳＲＩＦ−１４（１〜１０ｎＭ）および被験化合物（１０^-10〜１０^-5Ｍ）の同時添加により、化合物のアンタゴニスト作用を測定する。
【００５２】
反応媒質を除去し、２００ｍｌの０．１ＮＨＣｌを添加する。ｃＡＭＰをラジオイムノアッセイ法により測定する（キットＦｌａｓｈＰｌａｔｅＳＭＰ００１Ａ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）。
【００５３】
当業者に周知のように、ソマトスタチンについて知られている潜在用途は多種多様である。ソマトスタチン受容体刺激のための本発明ペプチドの投与は、ソマトスタチン自体と同じ作用および用途をもつことができる。たとえば下記のものが含まれる：成長ホルモン、インスリン、グルカゴンの分泌および膵臓外分泌の抑制（ＵＳＰ４，８５３，３７１）；再狭窄の処置（ＵＳＰ５，１４７，８５６）；肝細胞癌の処置（ＵＳＰ５，４１１，９４３）；肺癌の処置（ＵＳＰ５，０７３，５４１）；黒色腫の処置（米国特許出願０８／０８９，４１０；１９９３年７月９日出願）；充実性腫瘍の加速増殖抑制（ＵＳＰ５，５０４，０６９）；減量（米国特許出願０８／８５４，９４１；１９９７年５月１３日出願）；インスリン耐性およびＸ症候群の処置（米国特許出願０８／８５４，９４３；１９９７年５月１３日出願）；膵細胞の生存延長（ＵＳＰ５，６８８，４１８）；線維症の処置（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４１５４）；高脂血症の処置（米国特許出願０８／８５５，３１１；１９９７年５月１３日出願）；高アミリン血症の処置（米国特許出願０８／４４０，０６１；１９９５年５月１２日出願）；高プロラクチン血症およびプロラクチノーマの処置（米国特許出願０８／８５２，２２１；１９９７年５月７日出願）；クッシング症候群（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ｖ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３８，ｐ．９４３Ａ，１９９０参照）；ゴナドトロピノーマ（ＡｍｂｒｏｓｉＢ．，ｅｔａｌ．，ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒ．（Ｃｏｐｅｎｈ．）１２２，５６９−５７６，１９９０参照）；上皮小体機能亢進（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｎａｄａ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１４５，ｐｐ．２２７−２２８，１９９１参照）；ページェット病（Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｇ．Ｍ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｏｎｅａｎｄＭｉｎｅｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，７（Ｓｕｐｐｌ．１）ｐ．Ｓ２４０（Ａｂｓ．５９１）１９９２参照）；ＶＩＰ産生腫瘍（Ｋｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｚ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２８，２９５−３０１，１９９０およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．，ＡｃｔａＣｈｉｒ．Ｓｃａｎｄ．，１５５，５４１−５４３，１９８９参照）；膵島細胞症および高インスリン症（Ｌａｒｏｎ，Ｚ．，ＩｓｒａｅｌＪ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２６，Ｎｏ．１，１−２，１９９０；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＩｒｉｓｈＪ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１５８，Ｎｏ．１，３１−３２，１９８９およびＭｉｃｉｃ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，１６，Ｓｕｐｐｌ．１．７０．Ａｂｓ．１９３，１９９０参照）；ガストリン産生腫瘍（Ｂａｕｅｒ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８３，５５，１９９０参照）；ゾリンジャー-エリソン症候群（Ｍｏｚｅｌｌ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃ．Ｏｂｓｔｅｔ．，１７０，４７６−４８４，１９９０参照）；エイズおよび他の状態に関連する分泌過多下痢（エイズによるもの：Ｃｅｌｌｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８，Ｎｏ．５，Ｐａｒｔ２，Ｓｕｐｐｌ．，Ａ１６３，１９９０参照；ガストリン放出ペプチド増加によるもの：Ａｌｈｉｎｄａｗｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，３３，１３９−１４２，１９９０参照；腸移植片対宿主疾患に伴うもの：Ｂｉａｎｃｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４９，１１９４−１１９５，１９９０参照；化学療法薬関連の下痢：Ｐｅｔｒｅｌｌｉ，Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１０，ｐ．１３８，ＡＢｓｔｒ．Ｎｏ．４１７，１９９１参照）；過敏性腸症候群（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｌ．Ｊ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．４，１７７−１８１，１９９０参照）；膵炎（Ｔｕｌａｓｓａｙ，Ｚ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８，Ｎｏ．５，Ｐａｒｔ２，Ｓｕｐｐｌ．，Ａ２３８，１９９０参照）；クローン病（Ｆｅｄｏｒａｋ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３，Ｎｏ．２，５３−５７，１９８９参照）；全身性硬化症（Ｓｏｕｄａｈ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８，Ｎｏ．５，Ｐａｒｔ２，Ｓｕｐｐｌ．，Ａ１２９，１９９０参照）；甲状腺癌（Ｍｏｄｉｇｌｉａｎｉ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．（Ｐａｒｉｓ），５０，４８３−４８８，１９８９参照）；乾癬（Ｃａｍｉｓａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．，５７，Ｎｏ．１，７１−７６，１９９０参照）；低血圧症（Ｈｏｅｌｄｔｋｅ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．，６９，８９５−８９８，１９８８およびＫｏｏｎｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２８，７３５Ｐ−７３６Ｐ，１９８９参照）；パニック発作（Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０，１２８−１３２，１９９０参照）；スクレロドーマ（Ｓｏｕｄａｈ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３９，ｐ．３０３Ａ，１９９１参照）；小腸閉塞（Ｎｏｔｔ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，Ｖｏｌ．７７，ｐ．Ａ６９１，１９９０参照）；胃食道逆流（Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．５，Ｐａｒｔ２，Ｓｕｐｐｌ．，ｐ．Ａ４２５，１９９１参照）；十二指腸胃逆流（Ｈａｓｌｅｒ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．５，Ｐａｒｔ２，Ｓｕｐｐｌ．，ｐ．Ａ４４８，１９９１参照）；グレーブズ病（Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３０４，ｐ．５８，１９９２参照）；多嚢胞卵巣症（Ｐｒｅｌｅｖｉｃ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ，４１，Ｓｕｐｐｌ．２，ｐｐ．７６−７９，１９９２参照）；上部胃腸出血（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｇｕｔ．，３３，ｐｐ．４０４−４０７，１９９２およびＡｒｒｉｇｏｎｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８７，ｐ．１３１１（ａｂｓ．２７５）１９９２参照）；膵偽性嚢胞および膵腹水（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．，８５，ｐｐ．１０７−１０８，１９９２参照）；白血病（Ｓａｎｔｉｎｉ，ｅｔａｌ．，７８（Ｓｕｐｐｌ．１）ｐ．４２９Ａ（Ａｂｓ．１７０８）１９９１参照）；髄膜腫（Ｋｏｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．，７４，ｐｐ．５４３−５４７，１９９２参照）；ならびに癌性悪液質（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｆｏｒｕｍ．，４２，ｐｐ．１４−１６，１９９１参照）。
【００５４】
したがって本発明の範囲には、有効成分としての少なくとも１種類の式（Ｉ）のペプチドを医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む医薬組成物が含まれる。一般に本発明の活性、たとえば先端巨大症の処置に有効な用量は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００５５】
本発明のペプチドは経口、非経口（たとえば筋肉内、腹腔内、静脈内もしくは皮下注射、または埋込み）、鼻腔、膣、直腸、舌下または局所投与経路で投与でき、医薬的に許容できるキャリヤーと配合して各投与経路に適した剤形を得ることができる。
【００５６】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸薬、散剤および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形においては、有効化合物を少なくとも１種類の医薬的に許容できる不活性キャリヤー、たとえばショ糖、乳糖またはデンプンと混合する。そのような固体剤形は、これらの不活性希釈剤のほかに、普通はさらに他の物質、たとえばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含むことができる。カプセル剤、錠剤および丸薬の場合、これらの剤形は緩衝剤をも含むことができる。錠剤および丸薬はさらに、腸溶コーティングをもつものとして製造できる。
【００５７】
経口投与用の液体剤形には、当技術分野で慣用される不活性希釈剤、たとえば水を含有する、医薬的に許容できる乳剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、エリキシル剤が含まれる。そのような不活性希釈剤のほかに、組成物は佐剤、たとえば湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、着香剤および香料を含有することもできる。
【００５８】
非経口投与用の本発明製剤には、無菌の水性または非水性液剤、懸濁液剤または乳剤が含まれる。非水性の溶剤またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。これらの剤形は、佐剤、たとえば保存剤、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤を含有してもよい。それらをたとえば細菌保持フィルターによる濾過、組成物への殺菌薬の装入、組成物の照射、または組成物の加熱により殺菌できる。それらを無菌固体組成物の形で製造し、これらを使用直前に無菌水または他の注射用無菌媒質に溶解することができる。
【００５９】
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは坐剤であり、これらは有効物質のほかに、賦形剤、たとえばカカオ脂または坐剤用ろうを含有してもよい。
鼻腔または舌下投与用組成物も、当技術分野で周知の標準的賦形剤を用いて製造できる。
【００６０】
さらに、本発明化合物はたとえば下記の特許および特許出願に記載される徐放性組成物中において投与することもできる。ＵＳＰ５，６７２，６５９には、生物活性薬剤およびポリエステルを含む徐放性組成物が教示されている。ＵＳＰ５，５，５９５，７６０には、ゲル化しうる形の生物活性薬剤を含む徐放性組成物が教示されている。ＵＳＰ５，８２１，２２１には、生物活性薬剤およびキトサンを含むポリマー形徐放性組成物が教示されている。米国特許出願０８／７４０，７７８（１９９６年１１月１日出願）には、生物活性薬剤およびシクロデキストリンを含む徐放性組成物が教示されている。米国特許出願０９／０１５，３９４（１９９８年１月２９日出願）には、生物活性薬剤の吸収性徐放性組成物が教示されている。米国特許出願０９／１２１，６５３（１９９８年７月２３日出願）には、ペプチドなどの水中油型療法薬を含む微粒子の製造方法が教示されている。米国特許出願０９／１３１，４７２（１９９８年８月１０日出願）には、ペプチドなどの療法薬およびホスホリル化ポリマーを含む複合体が教示されている。米国特許出願０９／１８４，４１３（１９９８年１１月２日出願）には、ペプチドなどの療法薬および非重合性ラクトン保有ポリマーを含む複合体が教示されている。以上の特許および特許出願の教示を参考として本明細書に援用する。
【００６１】
本発明組成物の有効成分の用量は変更できるが、有効成分量は適切な剤形が得られる量であることが必要である。選択する用量は、目的とする療法効果、投与経路、および処置期間に依存する。効果的な成長ホルモン放出を得るためには、一般に０．０００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の量をヒトおよび他の動物、たとえば哺乳動物に投与する。
【００６２】
好ましい投与量は０．０１〜５．０ｍｇ／体重ｋｇ／日であり、これを１回量として、または多数回量に分割して投与できる。
別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に引用したすべての刊行物、特許出願、特許その他の参考文献を参考として援用する。[0001]
Background of the Invention
The present invention relates to a cyclic peptide having somatostatin agonist activity, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition comprising these peptides, and a somatostatin receptor subtype agonist, as defined by formula (I) described and defined below. Concerning its use as. The peptides of the present invention selectively bind to somatostatin subtype receptor 5 and cause an agonistic action from the somatostatin subtype receptor to which those peptides bind.
[0002]
Somatostatin (SRIF) is a cyclic tetradecapeptide hormone containing a disulfide bridge between positions 3 and 14 (Heiman, et al., Neuroendocrinology, 45: 429-436 (1987)), growth hormone (GH) and It has the properties of inhibiting the release of thyroid stimulating hormone (TSH), inhibiting the release of amylin, insulin and glucagon and reducing gastric secretion and neurotransmitter release. Somatostatin metabolism by aminopeptidases and carboxypeptidases reduces the duration of action. Since natural somatostatin has a short half-life, various somatostatin analogs have been developed, for example, for the treatment of acromegaly. Raynor, et al. , Molecular Pharmacol. 43: 838 (1993).
[0003]
Five different somatostatin receptors have been identified and elucidated. Hoyer, et al. , Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 350: 441 (1994). Somatostatin binds to five different receptor (SSTR) subtypes with relatively high equivalent affinity for each subtype. By binding to these different types of somatostatin subtypes, the following conditions and / or diseases are treated ("SSTR-2") (Raynor, et al., Molecular Pharmacol., 43: 838 (1993); Lloyd, et al., Am. J. Physiol., 268: G102 (1995)), whereas insulin inhibition was due to the somatostatin type-5 receptor (“SSTR-5”) (Coy, et al. 197: 366-371 (1993)). With the activation of types 2 and 5, growth hormone was suppressed, more specifically, GH-secreting adenoma (acromegaly) and TSH-secreting adenoma were suppressed. If type 2 was activated but type 5 was not activated, prolactin-secreting adenoma was treated. Other indicators of somatostatin activation are: suppression of insulin and / or glucagon, more specifically suppression of diabetes, vascular disorders, proliferative retinopathy, dawn phenomenon and kidney damage; Suppression of gastric acid secretion, more specifically peptic ulcers, intestinal and pancreatic fistulas, irritable bowel syndrome, dumping syndrome, serous diarrhea syndrome, AIDS-related diarrhea, chemotherapy-induced diarrhea, acute or chronic pancreatitis and digestive tract Inhibition of hormone-secreting tumors; Treatment of cancer, eg hepatocellular carcinoma; Inhibition of angiogenesis; Treatment of inflammatory disorders, eg arthritis; Treatment of retinopathy; Treatment of chronic allograft rejection; Angioplasty; And prevention of gastrointestinal bleeding. To obtain analogs that are selective for specific somatostatin receptor subtypes involved in the biological response of interest and thus have less interaction with other receptor subtypes that may cause undesirable side effects Is preferred.
[0004]
Peptides of formula (I) are among the compounds described and claimed in pending US application Ser. No. 08 / 855,204 (filed May 13, 1997), assigned in part to the assignee of the present invention. Although belonging to, the compounds of formula (I) of the present invention are not specifically described in US patent application 08 / 855,204. Surprisingly, it has been found that the compounds of formula (I) of the present invention have somatostatin agonist activity. This is an unexpected finding since the compound of US patent application 08 / 855,204 was originally recognized to have somatostatin antagonist activity.
[0005]
Summary of the Invention
In one embodiment, the present invention provides a peptide of formula (I):
X-A¹-Cyclo (D-Cys-A^Three-A^Four-Lys-A⁶-A⁷-A⁸-Y (I)
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Where:
X is H,
[0006]
[Formula 4]

[0007]
Is;
A¹And A^ThreeEach independently is a D- or L-isomer of an amino acid selected from the group consisting of Phe, Tyr, Tyr (I), Trp, 3-Pal, 4-Pal, Cpa and Nal;
A^FourIs L-Trp, D-Trp, L-β-methyl-Trp or D-β-methyl-Trp;
A⁶Is —NH— (CHR¹)_n-CO-, where n is 2, 3 or 4;
A⁷Is L- or D-Cys;
A⁸Is the D- or L-isomer of an amino acid selected from the group consisting of Phe, Tyr, Tyr (I), Trp, Nal, Cpa, Val, Leu, Ile, Ser and Thr;
Y is NR²R^ThreeWhere R²And R^ThreeAre independently H or (C₁-C_FiveA) alkyl;
R¹Is H, (C₁-C_Four) Alkyl and -CH₂-Selected from the group consisting of aryl; where aryl is an optionally substituted moiety selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl and 2-naphthyl, each optionally substituted moiety being independently (C₁-C₆) Alkyl, (C₂-C₆) Alkenyl, (C₂-C₆) Alkynyl, aryl, aryl (C₁-C₆) Alkyl, (C₁-C₆) Alkoxy, -N (R^FourR^Five), -COOH, -CON (R^FourR^Five), Halo, -OH, -CN and -NO₂Optionally substituted with one or more substituents selected from the group consisting of:
R^FourAnd R^FiveAre each independently in each case H or (C₁-C_ThreeA) alkyl;
Where A²Cys of A⁷To each Cys by a disulfide bond formed from the thiol group of each Cys].
[0008]
Preferred peptides of the above formula (I) or pharmaceutically acceptable salts thereof are:
X is H;
A¹Is L-Phe, D-Phe, L-Cpa or D-Cpa;
A^ThreeIs L-Tyr, L-Trp or L-3-Pal;
A^FourIs D-Trp;
A⁶Is β-Ala or Gaba;
A⁷Is L-Cys;
A⁸Is Thr, L-Trp, L-Leu or L-Nal; and
R²And R^ThreeAre each H.
[0009]
Preferred among the above groups of peptides are the following peptides or pharmaceutically acceptable salts thereof:
[0010]
[Chemical formula 5]

[0011]
Preferred among the above groups of peptides are the following peptides or pharmaceutically acceptable salts thereof:
[0012]
[Chemical 6]

[0013]
In another aspect, the invention provides a pharmaceutical composition useful for eliciting a somatostatin agonist response in a human or other animal, comprising an effective amount of a peptide of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and Compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier are provided.
[0014]
In yet another aspect, the invention provides a method of eliciting a somatostatin agonist response in a human or other animal in need thereof, wherein an effective amount of a peptide of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a human or A method comprising administering to another animal is provided.
[0015]
In another aspect, the invention provides a method for selectively binding somatostatin subtype receptor type 5 in humans or other animals, comprising an effective amount of a peptide of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A method comprising administering to a human or other animal is provided.
[0016]
In yet another aspect, the invention provides a method of treating a disease or condition in a human or other animal in need thereof, wherein an effective amount of a peptide of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a human or Administered to other animals, where the disease or condition is Cushing's syndrome, gonadotropinoma, hyperparathyroidism, Paget's disease, VIP-producing tumor, islet cell disease, hyperinsulinism, gastrin-producing tumor Zollinger-Ellison syndrome, hypersecretory diarrhea associated with AIDS and other conditions, irritable bowel syndrome, pancreatitis, Crohn's disease, systemic sclerosis, thyroid cancer, psoriasis, hypotension, panic attacks, sclerodoma, Small bowel obstruction, gastroesophageal reflux, duodenal gastric reflux, Graves' disease, polycystic ovary disease, upper gastrointestinal exit Blood, pancreatic pseudocyst, pancreatic ascites, leukemia, meningioma, cancer cachexia, acromegaly, restenosis, hepatocellular carcinoma, lung cancer, melanoma, accelerated growth inhibition of solid tumor, weight loss, insulin resistance A method is provided that is selected from the group consisting of treatment, syndrome X, pancreatic cell survival prolongation, fibrosis, hyperlipidemia, hyperamylinemia, hyperprolactinemia and prolactinemia.
[0017]
In yet another aspect, the present invention provides a method of inhibiting the secretion of growth hormone, insulin, glucagon or exocrine pancreas in a human or other animal in need thereof, comprising the peptide of formula (I) or a pharmaceutically acceptable peptide thereof There is provided a method comprising administering to a human or other animal a possible salt.
[0018]
In yet another aspect, the present invention provides a method for imaging somatostatin receptor-containing cells in vivo in a human or other animal, comprising:¹, A^ThreeOr A⁸There is provided a method comprising administering to a human or other animal a peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein at least one of which is Tyr (I).
[0019]
In another aspect, the present invention provides a method for imaging somatostatin receptor-containing cells in vitro comprising:¹, A^ThreeOr A⁸There is provided a method comprising administering to a human or other animal a peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein at least one of which is Tyr (I). Such peptides of the present invention can be used in somatostatin receptor binding assays to detect cells with somatostatin receptors (eg, cancer cells) in vivo or as a radioligand in vitro.
[0020]
The art accepted three letter abbreviations are used to represent amino acids in the peptides of the present invention. The formula described herein includes a residue A²The thiol group and residue A on the side chain of (ie D-Cys)⁷Disulfide bonds between thiol groups on the side chains of (ie L-Cys or D-Cys) are not shown. The following amino acid abbreviations represent the names given thereafter: Cpa = p-chlorophenylalanine; Nal = β- (2-naphthyl) alanine; 3-Pal = β- (3-pyridyl) alanine; 4-Pal = β- (4-pyridyl) alanine; and Gaba-4-aminobutyric acid. Definition "-NH- (CH₂)_n"-CO-, where n is 2, 3 or 4" includes amino acids such as β-Ala and Gaba.
[0021]
Unless otherwise specified, the three letter abbreviations for amino acids represent the L-isomer.
The term alkyl is intended to include linear or branched alkyl groups of the indicated length. Examples of such alkyl groups are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl and the like. Term C₀When -alkyl is included in the definition, it shall represent a covalent single bond.
[0022]
The term alkenyl is intended to include straight or branched chain hydrocarbon groups having one or more double bonds and the indicated number of carbon atoms. Examples of such alkenyl groups are ethenyl, propenyl, isopropenyl, butenyl, sec-butenyl, t-butenyl, pentenyl, isopentenyl, hexenyl, isohexenyl and the like.
[0023]
The term alkynyl is intended to include linear or branched alkynyl groups, ie hydrocarbon groups, having one or more triple bonds and the indicated number of carbon atoms. Examples of such alkynyl groups are ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, isopentynyl, hexynyl, isohexynyl and the like.
[0024]
The term alkoxy is intended to include linear or branched alkoxy groups having one or more triple bonds and the indicated number of carbon atoms. Examples of such alkoxy groups are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, t-butoxy, pentoxy, isopentoxy, hexoxy, isohexoxy and the like.
[0025]
The term aryl is intended to include aromatic rings known in the art and may be monocyclic or bicyclic, such as phenyl and naphthyl.
The term halo shall include chlorine, bromine, iodine and fluorine.
[0026]
Detailed description
Those skilled in the art can make full use of the present invention based on the description of the specification. Accordingly, the following specific embodiments are merely illustrative of the present invention and should not be construed as limiting the full scope of the invention.
[0027]
The peptides of the present invention can be prepared by the following and synthesized by this method: Rink Amide MBHA resin (4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxyacetamide-norleucyl-MBHA resin) Synthesized using standard solid phase protocol for FMOC chemistry above, TFA / phenol / H₂Cleavage from the resin with a mixture of O / triisopropylsilane (83 ml / 5 g / 10 ml / 2 ml). Peptide to CH_ThreeCN / H₂Cyclized with EKATIOX ™ resin (EKAGEN, San Carlos, Calif.) In O (5 ml / 5 ml)₁₈Purification on silica (Rainin Instruments, Uban, Mass .; now Varian Analytical, Walnut Creek, Calif.) Using acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid and buffer. Uniformity was assessed by analytical HPLC and determined to be> 95% for each peptide. The peptides were elucidated by mass spectrometry.
[0028]
The synthesis (for example, chloramine-T method) of iodinated Tyr (Tyr (I)) of formula (I) of the present invention is well documented and within the scope that can be easily made by those skilled in the art. For example, Czernick, et al. , J .; Biol. Chem. 258: 5525 (1993) and EP389,180B1.
[0029]
In formula (I), X is
[0030]
[Chemical 7]

[0031]
Can be synthesized according to the methods and teachings of USP 5,552,520. The entire contents thereof are incorporated herein by reference.
The synthesis of Examples 1 and 2 is detailed below. Other peptides included in the compounds of formula (I) can be prepared with appropriate modifications well known to those skilled in the art of peptide synthesis.
[0032]
Example 1
Step 1: Fmoc-Cpa-S-trityl-D-Cys-Pal-N-in-t-Boc-D-Trp-N-ε-t-Boc-Lys-β-Ala-S-trityl-Cys-Nal Preparation of -4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylaminomethyl) phenoxyacetamide-norleucyl-methylbenzhydrylamine resin
Rink Amide MBHA resin (Novabiochem, San Diego, Calif.) 0.5 g (0.265 mmol) assembled from a shaker (Burrell Wrist-Action Laboratory Shaker), solvent distributor and vacuum pump connected 24-RV peptide synthesis Placed in the reaction vessel of the apparatus. The peptide synthesizer was programmed to perform the following reaction cycle:
a. Dimethylformamide;
b. 25% piperidine in dimethylformamide (manual addition) (twice every 15 minutes, once in DMF wash);
c. DMF wash (3 x 10 mL, 1 min each);
The resin was treated with FMOC-Nal (1.06 mmol), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBUT) (1.007 mmol) in dimethylformamide. ), And diisopropylethylamine (2.12 mmol) for about 1.5 hours, and the resulting amino acid resin was then circulated in steps (a)-(c) of the washing / deprotection program described above.
[0033]
In the same manner, the following amino acids were sequentially coupled to Nal-resin: Fmoc-S-Trityl-Cys, Fmoc-β-Ala, N-ε-t-Boc-Lys, Fmoc- (N-int-Boc ) -D-Trp, Fmoc-Pal, Fmoc-S-trityl-D-Cys and Fmoc-p-Cl-Phe. After DMF washing (3 × 10 mL, about 1 minute each) and vacuum drying, the weight of the finished peptide resin was 0.749 g.
[0034]
Step 2: H-Cpa-cyclo (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-β-Ala-Cys) -Nal-NH₂Manufacturing of
Peptide resin (0.36 g, 0.087 mmol) obtained from Step 1 of Example 1 was prepared from freshly prepared TFA (8.8 mL), phenol (0.5 g), H₂Mix with a solution of O (0.5 mL) and triisopropylsilane (0.2 mL) at room temperature and stir for about 2.5 hours. Excess TFA was evaporated under reduced pressure to give an oily residue. Ether was then added to the oily residue to precipitate the free linear peptide, filtered and washed with dry ether. The crude peptide was then added to 10 mL CH_ThreeCN / H₂After dissolving in O (5 mL / 5 mL), 200 mg of EKATHIOX ™ resin was added. The mixture was stirred overnight and filtered. The filtrate was evaporated to reduce the volume and then applied to a microsorb octadecylsilane silica (5 μm) column (22-250 mm). Fractions were obtained by elution with a linear gradient (20% to 40% over 60 minutes) of acetonitrile in water (both solvents containing 0.1% trifluoroacetic acid). These were examined by analytical high performance liquid chromatography ("HPLC") and pooled for maximum purity. The solution was lyophilized from water to give 26 mg of product as a white fluffy powder. HPLC C using the same eluent as above with a linear gradient (from 30% to 70% over 15 minutes)₁₈By silica, the product was found to be homogeneous (retention time 6.313 minutes). The composition of this cyclic peptide was confirmed by infusion mass spectrometry. Molecular weight 1133.8.
[0035]
Example 2
Step 1: Fmoc-Cpa-S-trity-D-Cys-Pal-N-in-t-Boc-D-Trp-N-ε-t-Boc-Lys-Gaba-S-trityl-Cys-Nal-4 -Preparation of (2 ', 4'-dimethoxyphenylaminomethyl) phenoxyacetamide-norleucyl-methylbenzhydrylamine resin
0.2 g (0.106 mmol) of Rink Amide MBHA resin (Novabiochem, San Diego, CA) was placed in Reactor # 3 (RV-3) of the 24-RV peptide synthesizer. The peptide synthesizer was programmed to perform the following reaction cycle:
a. Dimethylformamide;
b. 25% piperidine in dimethylformamide (manual addition) (twice every 15 minutes, once in DMF wash);
c. DMF wash (3 x 10 mL, 1 min each);
The resin was treated with FMOC-Nal (0.424 mmol), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBUT) (0.403 mmol) in dimethylformamide. ), And diisopropylethylamine (0.848 mmol) for about 1.5 hours, and the resulting amino acid resin was then circulated in steps (a)-(c) of the washing program.
[0036]
The following amino acids were sequentially bound to the peptide resin in the same order: Fmoc-S-Trityl-Cys, Fmoc-Gaba, N-ε-t-Boc-Lys, Fmoc- (N-int-Boc) -D. -Trp, Fmoc-Pal, Fmoc-S-trityl-D-Cys and Fmoc-Cpa. After DMF washing (3 × 10 mL, approximately 1 minute each) and vacuum drying, the weight of the finished peptide resin was 0.31 g.
[0037]
Step 2: H-Cpa-cyclo (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Gaba-Cys) -Nal-NH₂Manufacturing of
Peptide resin obtained from Step 1 of Example 2 was prepared from freshly prepared TFA (8.3 mL), phenol (0.5 g), H₂Mix with a solution of O (1 mL) and triisopropylsilane (0.2 mL) at room temperature and stir for about 2.5 hours. Excess TFA was evaporated under reduced pressure to give an oily residue. Ether was then added to the oily residue to precipitate the free linear peptide, filtered and then washed with dry ether. The crude peptide was then added to 10 mL CH_ThreeCN / H₂After dissolving in O, 200 mg of EKATHIOX ™ resin was added. The mixture was stirred overnight and filtered. The filtrate was evaporated to reduce the volume, then applied to a microsolve octadecylsilane silica (5 μm) column (22-250 mm) and a linear gradient of acetonitrile in water (both solvents containing 0.1% trifluoroacetic acid) (20 From 100% to 100% over 60 minutes). Fractions were examined by analytical high performance liquid chromatography (“HPLC”) and pooled for maximum purity. The solution was lyophilized from water to give 13 mg of product as a white fluffy powder. HPLC C using the same eluent as above (from 20% to 80% over 15 minutes)₁₈By silica, the product was found to be homogeneous (retention time 9.195 minutes). The composition of this cyclic peptide was confirmed by infusion mass spectrometry. Molecular weight 1147.83.
[0038]
The peptides of the present invention can be provided in the form of pharmaceutically acceptable salts. Examples of such salts include organic acids (eg acetic acid, lactic acid, maleic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, toluenesulfone or pamoic acid). , Inorganic acids (such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid), and polymeric acids (such as, but not limited to, tannic acid, carboxymethylcellulose, polylactic acid, polyglycolic acid, or polylactic acid-glycolic acid copolymer). General methods for preparing salts of the peptides of the invention are well known in the art and can be achieved by standard salt exchange methods. Therefore, the TFA salt of the peptide of the present invention (TFA salt is obtained by peptide purification by preparative HPLC eluting with a TFA-containing buffer) is converted to the acetate salt by dissolving the peptide in a small amount of 0.25N aqueous acetic acid solution. it can. The resulting solution is applied to a semi-preparative HPLC column (Zorbax, 300SB, C-8). The column was (1) 0.1N aqueous ammonium acetate solution for 0.5 hour, (2) 0.25N aqueous acetic acid solution for 0.5 hour, and (3) linear gradient (20% to 100% solution B, 30 minutes) Eluting at a flow rate of 4 ml / min (solution A is 0.25N aqueous acetic acid; solution B is 0.25N acetic acid in acetonitrile / water (80:20)). Fractions containing the peptides of the present invention were collected and lyophilized.
[0039]
Human somatostatin subtype receptors 1-5 (each sst₁, Sst₂, Sst_Three, Sst_FourAnd sst_FiveThe affinity of the peptide of the present invention for CHO-K1 transfected cells (¹²⁵I-Tyr¹¹) Determined by measuring SRIF-14 binding inhibition.
[0040]
Human sst₁The receptor gene was cloned as a genomic fragment. A 1.5 Kb Pst-XmnI segment containing a 100 bp 5 'untranslated region, a total coding region of 1,17 Kb, and a 230 bp 3' untranslated region was modified by addition of a BglII linker. The resulting DNA fragment was subcloned into BamHI of pCMV-81 to generate a mammalian expression plasmid (provided by Dr. Graeme Bell, University of Chicago). By transfection into CHO-K1 cells (ATCC) using the calcium phosphate coprecipitation method (1), sst₁A clonal cell line stably expressing the receptor was obtained. Plasmid pRSV-neo (ATCC) was inserted as a selectable marker. Clonal cell lines were selected, ring cloned and grown in culture in RPMI 1640 medium containing 0.5 mg / ml G418 (Gibco).
[0041]
Human sst₂The somatostatin receptor gene was cloned as a 1.7 Kb BamHI-HindIII genomic DNA fragment and subcloned into the plasmid vector pGEM3Z (Promega). G. Favorably provided by Bell (University of Chicago). A mammalian cell expression vector is constructed by inserting this 1.7 Kb BamHI-HindII fragment into the appropriate restriction endonuclease site of plasmid pCMV5. Clonal cell lines are obtained by transfection into CHO-K1 cells using the calcium phosphate coprecipitation method. Plasmid pRSV-neo is inserted as a selectable marker.
[0042]
Human sst_ThreeWas isolated as a genomic fragment and the entire coding sequence was inserted into the 2.4 Kb BamHI-HindIII fragment. A mammalian expression plasmid pCMV-h3 was constructed by modifying both ends of a 2.0 Kb NcoI-HindIII fragment by EcoRI linker addition and then inserting it into the EcoRI site of the pCMV vector. By transfection into CHO-K1 cells (ATCC) using the calcium phosphate coprecipitation method, sst_ThreeA clonal cell line stably expressing the receptor was obtained. Plasmid pRSV-neo (ATCC) was inserted as a selectable marker. Clonal cell lines were selected, ring cloned and grown in culture in RPMI 1640 medium containing 0.5 mg / ml G418 (Gibco).
[0043]
Human sst_FourThe receptor expression plasmid pCMV-HX was obtained from Dr. Provided by Graeme Bell (University of Chicago). This vector is a human sst cloned into the XbaI / EcoRI site of pCMV-HX._FourIt contains a 1.4 Kb NheI-NheI genomic fragment encoding a 456 bp 5 'untranslated region and a 200 bp 3' untranslated region. By transfection into CHO-K1 cells (ATCC) using the calcium phosphate coprecipitation method, sst_FourA clonal cell line stably expressing the receptor was obtained. Plasmid pRSV-neo (ATCC) was inserted as a selectable marker. Clonal cell lines were selected, ring cloned and grown in culture in RPMI 1640 medium containing 0.5 mg / ml G418 (Gibco).
[0044]
Human sst_FiveThe gene was obtained by PCR using a λ genomic clone as a template. Favorably provided by Graeme Bell (University of Chicago). The resulting 1.2 Kb PCR fragment contained 21 bp of the 5 'untranslated region, the entire coding region, and 55 bp of the 3' untranslated region. This clone was inserted into the EcoRI site of plasmid pBSSK (+). The insert was recovered as a 1.2 Kb HindIII-XbaI fragment for subcloning into the pCMV5 mammalian expression vector. By transfection into CHO-K1 cells (ATCC) using the calcium phosphate coprecipitation method, sst_FiveA clonal cell line stably expressing the receptor was obtained. Plasmid pRSV-neo (ATCC) was inserted as a selectable marker. Clonal cell lines were selected, ring cloned and grown in culture in RPMI 1640 medium containing 0.5 mg / ml G418 (Gibco).
[0045]
CHO-K1 cells stably expressing one of the human sst receptors are grown in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum and 0.4 mg / ml geneticin. Cells are harvested with 0.5 mM EDTA and centrifuged at 500 g at about 4 ° C. for about 5 minutes. Resuspend the pellet in 50 mM Tris (pH 7.4) and centrifuge twice at 500 g for about 5 minutes at about 4 ° C. Cells are lysed by sonication and centrifuged at 39000 g at about 4 ° C. for about 10 minutes. The pellet is resuspended in the same buffer, centrifuged at 50000 g, about 4 ° C. for about 10 minutes, and the membrane in the resulting pellet is stored at −80 ° C.
[0046]
(¹²⁵I-Tyr¹¹) Competitive inhibition experiments of SRIF-14 binding are performed in a double test method in 96-well polypropylene plates. Cell membrane (10 μg protein / well) (¹²⁵I-Tyr¹¹) SRIF-14 (0.05 nM) with 50 mM HEPES (pH 7.4), 0.2% BSA, 5 mM MgCl₂Incubate for about 60 minutes at about 37 ° C. in 200 KIU / ml Trasylol, 0.02 mg / ml bacitracin and 0.02 mg / ml phenylmethylsulfonyl fluoride.
[0047]
By using a Filtermate 196 (Packard) cell harvester and immediately filtering through GF / C glass fiber filter plates (Unifilter, Packard) presoaked with 0.1% polyethyleneimine (PEI), the bound form (¹²⁵I-Tyr¹¹) Separate SRIF-14 from the free form. Filters are washed with 50 mM HEPES at about 0-4 ° C. for about 4 seconds and assayed for radioactivity by Packard Top Count.
[0048]
Specific binding is determined by subtracting non-specific binding (measured in the presence of 0.01 μM SRIF-14) from total binding. The binding data is analyzed by computer assisted nonlinear regression analysis (MDL) to determine the inhibition constant (Ki).
[0049]
Determination of whether a compound of the present invention is an agonist or antagonist can be determined by the following assay:
Functional assay: Inhibition of intracellular cAMP production:
CHO-K1 cells expressing the human somatostatin (SRIF-14) subtype receptor are inoculated into RPMI 1640 medium containing 10% FCS and 0.04 mg / ml geneticin in a 24-well tissue culture multi-dish. . Change the medium the day before the experiment.
[0050]
Cell 10^FiveThe cells / well were washed twice with 0.5 ml of fresh RPMI containing 0.2% BSA [supplemented with 0.5 mM (1) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)] and about 37 Incubate at 5 ° C for about 5 minutes.
[0051]
Stimulate cyclic AMP production by adding 1 mM forskolin (FSK) at about 37 ° C. for about 15-30 minutes
FSK (1 μM), SRIF-14 (10^-12-10^-6M) and test compound (10^-Ten-10^-FiveMeasure the agonistic effect of the compound by simultaneous addition of M)
FSK (1 μM), SRIF-14 (1-10 nM) and test compound (10^-Ten-10^-FiveThe antagonism of the compound is determined by simultaneous addition of M).
[0052]
The reaction medium is removed and 200 ml of 0.1N HCl is added. cAMP is measured by radioimmunoassay (kit FlashPlate SMP001A, New England Nuclear).
[0053]
As is well known to those skilled in the art, the potential uses known for somatostatin are diverse. Administration of the peptides of the present invention for somatostatin receptor stimulation can have the same actions and uses as somatostatin itself. Examples include: growth hormone, insulin, glucagon secretion and pancreatic exocrine secretion inhibition (USP 4,853,371); restenosis treatment (USP 5,147,856); hepatocellular carcinoma treatment (USP 5,411) , 943); treatment of lung cancer (USP 5,073,541); treatment of melanoma (US patent application 08 / 089,410; filed July 9, 1993); accelerated growth inhibition of solid tumors (USP 5,504) 069); weight loss (US patent application 08 / 854,941; filed May 13, 1997); treatment of insulin resistance and syndrome X (US patent application 08 / 854,943; filed May 13, 1997); pancreas Extended cell survival (USP 5,688,418); treatment of fibrosis (PCT / US97 / 14154); treatment of hyperlipidemia (US patent application 0 / 855,311; filed May 13, 1997); treatment of hyperamylinemia (US patent application 08 / 440,061; filed May 12, 1995); treatment of hyperprolactinemia and prolactinoma (US patent) Application 08/852, 221; filed May 7, 1997); Cushing's syndrome (Clark, RV et al., Clin. Res.,38, P. 943A, 1990); gonadotropinoma (see Ambrosi B., et al., Acta Endocr. (Copenh.) 122, 569-576, 1990); parathyroid hyperfunction (Miller, D., et al. , Canada. Med. Ass. J., Vol.145, pp.227-228, 1991); Paget's disease (Palmieri, GMA, et al., J. of Bone and Mineral Research, 7). (Suppl. 1) p. S240 (Abs. 591) 1992); VIP-producing tumor (Koverstein, B., et al., Z. Gastroenterology,28295-301, 1990 and Christensen, C .; Acta Chir. Scand. ,155, 541-543, 1989); islet cell disease and hyperinsulinism (Laron, Z., Israel J. Med. Sci.,26, No. 1, 1-2, 1990; Wilson, D .; C. Irish J .; Med. Sci. ,158, No. 1, 31-32, 1989 and Micic, D. et al. , Et al. , Digestion,16, Suppl. 1.70. Abs. 193, 1990); gastrin-producing tumors (Bauer, FE, et al., Europ. J. Pharmacol.,183Zollinger-Ellison syndrome (Mozell, E., et al., Surg. Gynec. Obstet.,).170476-484, 1990); hypersecretory diarrhea associated with AIDS and other conditions (by AIDS: Cello, JP, et al., Gastroenterology,98, No. 5, Part 2, Suppl. A163, 1990; due to increased gastrin releasing peptide: Alhindawai, R .; , Et al. , Can. J. et al. Surg. ,33, 139-142, 1990; associated with intestinal graft-versus-host disease: Bianco, J. et al. A. , Et al. , Transplantation, 49, 1194-1195, 1990; chemotherapeutic drug-related diarrhea: Petrelli, N .; , Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol. , Vol. 10, p. 138, ABstr. No. 417, 1991); irritable bowel syndrome (see O'Donnell, LJD, et al., Alignment. Pharmacol. Therap., Vol. 4, 177-181, 1990); pancreatitis (Tulassay, Z , Et al., Gastroenterology, 98, No. 5, Part 2, Suppl., A238, 1990); Crohn's disease (Fedorak, RN, et al., Can. J. Gastroenterology,3, No. 2, 53-57, 1989); systemic sclerosis (Saudah, H., et al., Gastroenterology,98, No. 5, Part 2, Suppl. Thyroid cancer (see Modigliani, E., et al., Ann. Endocr. (Paris), 50, 483-488, 1989); psoriasis (Camisa, C., et al., Cleveland Clin). J. Med.,57, No. 1, 71-76, 1990); hypotension (Hoeldke, RD, et al., Arch. Med. Rehab.,69, 895-898, 1988 and Kooner, J. et al. S. , Et al. Brit. J. et al. Clin. Pharmacol. ,28, 735P-736P, 1989); panic attacks (Abelson, JL, et al., Clin. Psychopharmacol.,10, 128-132, 1990); Sclerodoma (see Soudah, H., et al., Clin. Res., Vol. 39, p. 303A, 1991); small intestinal obstruction (Nott, DM, et al. Grit, J. Surg., Vol. 77, p. A691, 1990); gastroesophageal reflux (Branch, MS, et al., Gastroenterology, Vol. 100, No. 5, Part 2, Suppl. Duodenal gastric reflux (see Hasler, W., et al., Gastroenterology, Vol. 100, No. 5, Part 2, Suppl., P. A448, 1991); Graves' disease (Chang , TC, et al., Brit. 304, p. 58, 1992); polycystic ovary disease (see Prelevic, GM, et al., Metabolism Clinical and Experimental, 41, Suppl. 2, pp. 76-79, 1992); (Jenkins, SA, et al., Gut., 33, pp. 404-407, 1992 and Arrigoni, A., et al., American Journal of Gastroenterology, 87, p. 1311 (abs. 275) 1992). Pancreatic pseudocyst and pancreatic ascites (see Hartley, JE, et al., J. Roy. Soc. Med., 85, pp. 107-108, 1992); leukemia (Santini, et al. , 78 ( uppl.1) p.429A (Abs. 1708) 1991); meningioma (see Koper, JW, et al., J. Clin, Endocr. Metab., 74, pp. 543-547, 1992). ); And cancer cachexia (see Bartlett, DL, et al., Surg. Forum., 42, pp. 14-16, 1991).
[0054]
Accordingly, the scope of the present invention includes pharmaceutical compositions comprising at least one peptide of formula (I) as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier. In general, effective doses for the treatment of the activity of the present invention, eg acromegaly, are from 0.01 to 200 mg / kg / day, preferably from 0.5 to 100 mg / kg / day.
[0055]
The peptides of the invention can be administered orally, parenterally (eg intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or subcutaneously, or implanted), nasally, vaginally, rectally, sublingually or by a topical route of administration, and with a pharmaceutically acceptable carrier Formulations suitable for each route of administration can be obtained by blending.
[0056]
Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, pills, powders and granules. In such solid dosage forms, the active compound is admixed with at least one pharmaceutically acceptable inert carrier such as sucrose, lactose or starch. In addition to these inert diluents, such solid dosage forms can usually contain other substances, such as lubricants such as magnesium stearate. In the case of capsules, tablets and pills, these dosage forms may also contain buffering agents. Tablets and pills can additionally be prepared with enteric coatings.
[0057]
Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs containing inert diluents conventionally used in the art, such as water. Besides such inert diluents, the composition may also contain adjuvants such as wetting agents, emulsifying agents and suspending agents, and sweetening, flavoring and perfuming agents.
[0058]
The preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. Examples of non-aqueous solvents or vehicles are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil and corn oil, gelatin, and injectable organic esters such as ethyl oleate. These dosage forms may contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents and suspending agents. They can be sterilized, for example, by filtration through a bacteria retaining filter, charging the composition with a bactericide, irradiating the composition, or heating the composition. They can be prepared in the form of sterile solid compositions which can be dissolved in sterile water or other sterile medium for injection just before use.
[0059]
Compositions for rectal or vaginal administration are preferably suppositories, which may contain, in addition to the active substance, excipients such as cocoa butter or suppository waxes.
Compositions for nasal or sublingual administration can also be prepared using standard excipients well known in the art.
[0060]
Furthermore, the compounds of the present invention can also be administered, for example, in sustained release compositions described in the following patents and patent applications. USP 5,672,659 teaches a sustained release composition comprising a bioactive agent and a polyester. USP 5,5,595,760 teaches a sustained release composition containing a bioactive agent in a gelable form. USP 5,821,221 teaches a polymeric sustained release composition comprising a bioactive agent and chitosan. US patent application 08 / 740,778 (filed November 1, 1996) teaches a sustained release composition comprising a bioactive agent and a cyclodextrin. US patent application 09 / 015,394 (filed January 29, 1998) teaches an absorbable sustained release composition of a bioactive agent. US patent application 09 / 121,653 (filed July 23, 1998) teaches a method for producing microparticles containing an oil-in-water therapeutic agent such as a peptide. US patent application 09 / 131,472 (filed Aug. 10, 1998) teaches a complex comprising a therapeutic agent such as a peptide and a phosphorylated polymer. US patent application 09 / 184,413 (filed Nov. 2, 1998) teaches a complex comprising a therapeutic agent such as a peptide and a non-polymerizable lactone bearing polymer. The teachings of the above patents and patent applications are incorporated herein by reference.
[0061]
Although the dose of the active ingredient of the composition of the present invention can be changed, the amount of the active ingredient needs to be an amount capable of obtaining an appropriate dosage form. The dose selected will depend on the intended therapeutic effect, the route of administration, and the duration of treatment. In order to obtain effective growth hormone release, generally an amount of 0.0001-100 mg / kg body weight / day is administered to humans and other animals, such as mammals.
[0062]
A preferred dosage is 0.01 to 5.0 mg / kg body weight / day, which can be administered as a single dose or divided into multiple doses.
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. All publications, patent applications, patents and other references cited herein are incorporated by reference.

Claims

A peptide of the following formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof: