JP4039591B2

JP4039591B2 - Method for measuring mannose using enzymes

Info

Publication number: JP4039591B2
Application number: JP09519798A
Authority: JP
Inventors: 一智三輪; 忠緒田口
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2018-03-25
Also published as: JPH11266896A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラノースオキシダーゼ、又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素又は、これとグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素を組み合わせてグルコースを除去する前処理法と、マンノースをグルコース誘導体として検出するマンノース測定法を組み合わせた、簡便なマンノース測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マンノースは生体内では、主に糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖合成に利用されており、糖タンパク質の生合成や分泌、さらには、糖タンパク質の機能発現に重要な役割を果たしている。マンノースは小腸からほとんど吸収されないので、生体内のマンノースは、主としてグルコース代謝系（即ち、グルコース→グルコース−６−リン酸→フルクトース−６−リン酸→マンノース−６−リン酸）から供給されている。また、マンノース−６−リン酸から合成されるＧＤＰ−マンノース（マンノース−６−リン酸→マンノース−１−リン酸→ＧＤＰ−マンノース）は、マンノース糖鎖合成のドナーとして、重要な役割を果たしている。
【０００３】
健常者血清中のマンノース濃度については、多くの報告があるが、平均値で１６〜８１μＭ、ＳＤの範囲では１１〜１４２μＭとされている（日本臨牀 53(増刊号) p579-581(1995)）。また、血清中のマンノース濃度は、糖尿病や真菌感染症で変動することが知られており、診断薬として期待されている。
【０００４】
糖尿病患者では、空腹時の血清マンノースは健常者の３〜５倍に上昇し、グルコースとよく相関することが知られている（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223 (1990)、Clin. Chim. Acta 251 p91-103(1996)）。特に、ケトアシドーシスの症例においては約６７０μＭ（健常者平均値の５０倍）に達し、治療で約５０μＭにまで改善した（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223(1990））。糖尿病の合併症では、網膜症の発症群で、血清マンノースが有意に高値だった（糖尿病 33(Sup.) p144(1990)、糖尿病 34(Sup.) p277(1991)）。白内障患者のレンズ中の糖鎖に含まれるマンノースの割合は、糖尿病群では非糖尿病群より高かった（防衛医科大学校雑誌 18(4) p308-315(1993））。妊娠糖尿病では、妊娠の初期、中期、後期を通じ、糖尿病群の血清マンノースは正常群より高く、妊娠初期のマンノース高値群で自然流産の頻度が高かった（糖尿病 33(9) p719-725(1990））などの報告がある。
【０００５】
また、免疫力の低下した患者で問題になる真菌症、特に、カンジダ症においては血清マンノースが１１０〜１，３１５μＭ（健常者平均値の６３倍）と、著しく上昇していたとの報告がある（日本臨牀 53(増刊号) p579-581(1995 ）、日本医事新報 No.3286 p46-48(1987））。
【０００６】
生化学検査のほとんどの項目は、生化学検査用の自動分析装置（汎用機）で測定されている。また、近年の医療費の高騰により、汎用機での自動測定に対応できない、即ち、特殊な分析装置を必要とし、人手が必要で人件費のかかる検査項目は、事実上、臨床応用が困難な状況にあると言える。これまで、マンノースの測定法として数多くの報告はあるが、何れも煩雑な操作を必要とするため、汎用機での測定は困難であった（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）。
【０００７】
最も信頼できるマンノースの測定法として、キャピラリィー・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223(1990) ）やガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリィー（ＧＣ−ＭＳ）法（Clin. Chim. Acta 251 p91-103(1996 ））などの分離分析法が報告されているが、何れも、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要する特殊な装置を必要としていた。
【０００８】
また、酵素を用いたマンノースの測定法も幾つか報告されている。これらは、何れも、マンノースをヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）でリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させ、生成したマンノース−６−リン酸をマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）でフルクトース−６−リン酸へ異性化し、さらに、フルクトース−６−リン酸をグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）でグルコース−６−リン酸に異性化後、検体中のマンノース量に応じて生成したグルコース−６−リン酸を、補酵素の存在下にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いて酸化し、この反応によって生じた補酵素の還元体を分光光度計で測定するものである（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）。
【０００９】
この酵素系でマンノースを測定する場合、ヘキソキナーゼはグルコースもリン酸化するため、多量のグルコース−６−リン酸を生じ、これがグルコース−６−リン酸脱水素酵素と反応することになる。特に、ヒト血清中においては、グルコース量はマンノース量の１００倍ぐらいに達するため、測定前に、効率的に除去しておく必要がある。Soyama等（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）と Akazawa等（J. Clin. Endocrinol. Metab. 62(5) p984-989(1986)）は、グルコースオキシダーゼを用いてグルコースを除去する方法を報告しているが、グルコースの除去が不完全であったり、長時間に反応するとマンノースまで反応してしまうという問題があった（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）。また、James等は、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）を用いてグルコースを選択的にリン酸化し、生じたグルコース−６−リン酸をアニオン交換樹脂を充填した遠心型のミニカラムで吸着除去後、吸着されずに通過液中に回収されたマンノースを、前記の酵素を用いたマンノース測定法で検出している（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）が、煩雑な遠心操作を必要としていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このように、１液の中でグルコースを効率的に除去し、そのまま引続きマンノースを測定する簡便な方法は未だ完成しておらず、生化学検査用の汎用機に適用できていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、検体中に存在するマンノースを、グルコースの誘導体として検出するマンノース測定法において、予め、検体をピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素、又は、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素を組み合わせて処理し、検体中に存在するグルコースを完全に除去してからマンノースを測定すれば、簡便にマンノースを定量できることを見いだし、本発明に至ったものである。
【００１２】
即ち、本発明は、
（１）検体中のマンノースを測定する際に、予め検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去することを特徴とするマンノースの定量法
（２）グルコースの２位酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼである（１）記載のマンノースの定量法
（３）検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去する際に、グルコースの１位酸化酵素を併用する（１）又は（２）の方法
（４）グルコースの１位酸化酵素がグルコースオキシダーゼである（３）に記載のマンノースの定量法
（５）検体中のマンノースの定量を、予めグルコースを除去した検体中のマンノースを、酵素を用いて順次マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸に変換し、生成するグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いて検出し、定量する（１）から（４）のいずれかの方法
（６）検体中に含まれるグルコースを除去する際に、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼとグルコースオキシダーゼを併用することを特徴とするグルコースの除去方法、
に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の検体とは、臨床的にマンノース濃度を測定する意義のあるものであれば何であってもよいが、特に、血清、血漿、尿、髄液などの体液があげられる。
【００１４】
本発明のグルコースを除去する方法とは、グルコースの２位酸化酵素、又は、グルコースの２位酸化酵素とグルコースの１位酸化酵素とを組み合わせてグルコースを効率的に完全に酸化し、マンノースの測定には妨害しないような物質に変換する方法である。本発明のグルコースの２位酸化酵素とは、酸素を電子受容体とするピラノースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼや、酸素やＮＡＤ（Ｐ）以外のものを電子受容体とする脱水素酵素がある。ＮＡＤ（Ｐ）は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及び／又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のことを意味する。
本発明のグルコースの１位酸化酵素とは、酸素を電子受容体とするグルコースオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）を電子受容体とするグルコース脱水素酵素（EC1.1..1.47, EC1.1.1.118, EC1.1.1.119)や酸素やＮＡＤ（Ｐ）以外のものを電子受容体とするグルコース脱水素酵素（EC1.1.99.10)などがある。グルコースの除去に必要なそれぞれの酵素の量は、グルコースの２位酸化酵素については０．１〜５００単位／ｍＬ、好ましくは、１〜１０単位／ｍＬ濃度になるように添加すればよい。グルコースの１位酸化酵素ついては０．１〜５０００単位／ｍＬ、好ましくは、１〜１００単位／ｍＬ濃度になるように添加すればよい。
なお、グルコースの１位酸化酵素が脱水素酵素の場合には、０．１〜５００単位／ｍＬ好ましくは０．５〜１０単位／ｍＬ濃度になるように添加する。又、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素との相対活性比は通常１：１００〜１００：１、好ましくは１：１０〜１０：１であればよい。なお、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼとグルコースの１位酸化酵素として脱水素酵素を用いる場合の相対活性比は通常１：１０〜１００：１、好ましくは、１：１〜１０：１であればよい。
【００１５】
本発明のピラノースオキシダーゼとは、グルコースの２位を酸化する酵素で、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）の酵素委員会でＥＣ１．１．３．１０と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されないが、グルコースと比較した場合のマンノースの相対反応性が１．５％以下で、グルコース除去の際に、実質上、マンノースと反応しないものが好ましい。具体的には、Polyporus obtusus由来のピラノースオキシダーゼがあげられる。
【００１６】
本発明のＬ−ソルボースオキシダーゼとは、Ｌ−ソルボースの５位を酸化する酵素で、かつグルコースの２位も効率よく酸化する性質があり、Ｉ．Ｕ．Ｂ．の酵素委員会でＥＣ１．１．３．１１と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されないが、グルコースと比較した場合のマンノースの相対反応性が１．５％以下で、グルコース除去の際に、実質上、マンノースと反応しないものが好ましい。
【００１７】
本発明のグルコースオキシダーゼとは、グルコースの１位酸化酵素で、Ｉ．Ｕ．Ｂ．の酵素委員会でＥＣ１．１．３．４と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されない。
【００１８】
本発明の検体中のマンノースを測定する方法としては、検体中に存在する物質のうちで、グルコース以外には反応する成分が実質的にない程度にマンノースに対して特異性の高い酵素を用いるマンノースの定量法が好ましい。マンノースに対して特異性の高い酵素を用いる方法であれば、マンノース酸化酵素単独でも、複数の酵素を組み合わせた系でもよく、公知の方法に従って行うことができる。複数の酵素を組み合わせるマンノースに特異的な方法としては、例えば、検体中のマンノースを、酵素を用いて順次マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸に変換し、生成するグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いる方法が使用できる（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）。ここでは、マンノースをリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させるためにはヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）を、マンノース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸への異性化にはマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）を、フルクトース−６−リン酸からグルコース−６−リン酸への異性化にはグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）を使用している。
【００１９】
マンノースを定量する方法としては、マンノースを変換する最終酵素としてマンノースデヒドロゲナーゼやグルコース−６−リン酸脱水素酵素などの脱水素酵素を用いて、これらの酵素反応の結果生じる補酵素の還元体、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）や還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）（両方を合わせてＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略す）の吸光度を直接測定したり、ジアホラーゼや１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト（1m−ＰＭＳ）の存在下にＮＡＤ（Ｐ）Ｈでテトラゾリウム塩類を還元し、生じたフォルマザンの吸光度を測定する高感度な方法が用いられる。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのより高感度な測定法としては、1m−ＰＭＳなどの電子伝達体の存在下にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを溶存酸素で酸化し、スーパーオキシドラジカルや過酸化水素を発生させ、これらをルミノールやイソルミノールなどを用いる化学発光により測定する方法や、従来から汎用されている過酸化水素を高感度で測定する方法がある。また、微生物由来の生物発光酵素系で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法もまた使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下に、参考例、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１グルコース除去法の検討
健常者の血清を、３つの方法（表１）で処理後、残存するグルコースを液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）で定量し、グルコース残存割合を求めて比較した。微生物由来のグルコースオキシダーゼ（Ｇ１ＯＤ）（オリエンタル酵母（株）社製）を用いた「方法１」では、約３０％のグルコースが残存し、前処理法としては、不完全であった。一方、Polyporus obtusus 由来のピラノースオキシダーゼ（Ｇ２ＯＤ）（宝酒造（株）社製）を用いた「方法２」と、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを組み合わせた「方法３」では、グルコースは完全に除去されていた。
【００２１】

１）略号は、ＣＡＴ：カタラーゼ（シグマ社製）、Ｍ−Ｔ緩衝液：トリス−マレイン酸緩衝液。
２）方法３で、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを蒸留水に変えたものを対象（１００％）とし、グルコースの残存割合を計算した。
【００２２】
なお、残存するグルコースの分析には、デガッサー（880-50）、カラムオーブン（860-CO）、移動相ポンプ（880-PU）からなる日本分光（株）のＨＰＬＣシステムを用いた。分画分子量３万の遠心限外濾過チューブ（Ultrafree-MC、ミリポア社）で除蛋白した反応液２０μＬを、８０℃に保温した糖分析用カラム（Waters Sugar Pak、ウォターズ社製）にチャージし、移動相として蒸留水を０．５ｍＬ／分の流速で流しグルコースを分離した。検出には、示差屈折率検出器（Shodex RI SE-51、昭和電工（株）製）を用い、ピークの解析には、クロマト・インテグレータ（D-2500、日立製作所（株）製）を用いた。
【００２３】
実施例２血清中のマンノースの定量
患者血清を想定し、４００μＭのマンノースを添加した健常者血清を検体として、実施例１のグルコース除去法の「方法２」及び「方法３」で処理後、この反応液２６０μＬに、２５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μＬ、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）６．７ｍＭ、アデノシントリフォスフェイト（ＡＴＰ）１５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 を３０ｍＭ含む「補酵素溶液（ＮＡＭ）」２０μＬ、酵母由来のヘキソキナーゼ（ＨＫ、シグマ社製）、Leuconostoc mesenteroides由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ、シグマ社製）、酵母由来のグルコースリン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ、シグマ社製）をそれぞれ５０Ｕずつ取り、４℃で１２，０００ｇ×１０分間遠心分離後、上清の硫酸アンモニウム溶液を取り除いた残査に２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）１ｍＬを加えて調製した「ＨＫ／Ｇ６ＰＤＨ／ＧＰＩ溶液」１５μＬ、酵母由来のマンノースリン酸イソメラーゼ（ＭＰＩ、シグマ社製）を１００Ｕ取り、４℃で１２，０００ｇ×１０分間遠心分離後、上清の硫酸アンモニウム溶液を取り除いた残査に２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）１ｍＬを加えて調製した「ＭＰＩ溶液」５μＬを加え、３７℃で１５分間反応させた。
【００２４】
検体中のマンノースに由来するグルコース−６−リン酸の酸化反応によって生じた補酵素の還元体ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（JASCO V-530、日本分光（株）製）と記録計（JASCO RC-150、日本分光（株）製）で測定した。同時に、微量に存在する内因性フルクトースの影響を差し引くため検体ブランクとして、ＭＰＩ溶液を蒸留水に変え、検体と同様に処理した反応液の吸光度も測定した。マンノース濃度の計算は、標準液を検体としたときの標準液の吸光度差（標準液−標準液ブランク）をプロットした検量線に基づき、検体の吸光度差（検体−検体ブランク）から求めた。
【００２５】
Ｇ２ＯＤを用いた「方法２」と、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを組み合わせた「方法３」で前処理した検体のマンノース値は、それぞれ、理論値の９６．０±０．５％（ｎ＝８）、９７．０±３．２％（ｎ＝２１）であった。何れの方法でも、ほぼ満足できる結果が得られ、どちらも血清マンノースの測定に利用できることが分かった。
【００２６】
実施例３マンノース測定に影響する成分
マンノースの測定に干渉する物質を調べるため、マンノース４００μＭを添加した健常者血清に、各種血清成分を過剰となるように添加した。これらの血清を、実施例２に示した２つの方法で測定し、添加したマンノースの回収率を求めた。その結果を、表２にまとめた。アスコルビン酸、尿酸、ビリルビンとヘモグロビンは、いずれの測定法に対しても、ほとんど干渉しなかった。しかしながら、溶血は、両測定法に強く干渉した。一方、グルコースの添加は、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤで前処理した「方法３」では正確に測定できていたのに対し、Ｇ２ＯＤのみで前処理した「方法２」では、強く干渉し、添加したマンノースの約６０％しか回収できなかった。このことから、マンノース測定に干渉するグルコースの除去には、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤの両者を組み合わせた方が、好ましいことが分かる。
【００２７】

1)測定値は平均値±ＳＤ、括弧内は測定回数。
2)ビリルビン添加血清は、市販の標準血清「アナセラム−ＢＩＬ」（第一化学薬品社製）を健常者血清で希釈して調製した。
3)ヘパリン採血決液を、液体窒素で凍結後、融解して溶血し、ヘモグロビン濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように、この溶血液を健常者血清に添加して調製した。
【００２８】
実施例４自動分析装置への適用検討
患者血清を想定し、４００μＭのマンノースを添加した健常者血清を、実施例１の「方法３」で前処理し、次のようにして測定した。ミクロセルに、血清３０μＬ、Ｇ１ＯＤ（１００Ｕ／ｍＬ）１０μＬ、Ｇ２ＯＤ（１００Ｕ／ｍＬ）１０μＬ、ＣＡＴ（５００Ｕ／ｍＬ）１０μＬ、 50mM Ｍ−Ｔ緩衝液（ｐＨ５．５） 200μＬを加えて攪拌してから、分光光度計の恒温装置付きセルホルダーにセットし、３７℃で５分間反応した。さらに、この反応液に、実施例２の「補酵素溶液（ＮＡＭ）」２０μＬ、「ＨＫ／Ｇ６ＰＤＨ／ＧＰＩ溶液」１５μＬ、２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μＬの割合で混合した「試薬混液」３３５μＬを加えてさらに２分間反応後、「ＭＰＩ溶液」５μＬを加え、３７℃で２０分間反応させた。
【００２９】
結果を図１に示した。図から明らかなように、「試薬混液」添加後の吸光度の上昇は無く、内因性のフルクトースはなく、且つ「方法３」によるグルコースの前処理は完全であることが分かる。また、「ＭＰＩ溶液」の添加により、血清に添加したマンノース＋内因性マンノースに相当する吸光度の増加がみられ、マンノースの定量が可能であることが分かった。このように、検体の入った同一のセルに、連続して試薬を添加するだけでマンノースの測定が可能であることが示され、このマンノース測定法は、広く臨床で使用されている生化学検査用の自動測定装置（汎用機）へ適用することができる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のグルコースの２位酸化酵素又は、これとグルコースの１位酸化酵素を組み合わせてグルコースを除去する前処理法は、マンノースをグルコース誘導体として検出するマンノース測定法に対し、測定を妨害する内因性グルコースの除去に有効であり、マンノースの生化学検査用の自動分析装置（汎用機）での測定を可能にした。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】血清中のマンノース測定における反応のタイムコース[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a pretreatment method for removing glucose by combining glucose 2-position oxidase such as pyranose oxidase or L-sorbose oxidase, or glucose 1-position oxidase such as glucose oxidase, and mannose as a glucose derivative. It relates to a simple mannose measurement method in combination with a mannose measurement method detected as
[0002]
[Prior art]
Mannose is mainly used for the synthesis of glycoproteins such as glycoproteins and glycolipids in vivo, and plays an important role in the biosynthesis and secretion of glycoproteins and the functional expression of glycoproteins. Since mannose is hardly absorbed from the small intestine, mannose in the living body is mainly supplied from the glucose metabolism system (ie, glucose → glucose-6-phosphate → fructose-6-phosphate → mannose-6-phosphate). . Further, GDP-mannose (mannose-6-phosphate → mannose-1-phosphate → GDP-mannose) synthesized from mannose-6-phosphate plays an important role as a donor for mannose sugar chain synthesis. .
[0003]
There are many reports on the mannose concentration in the serum of healthy subjects, but the average value is 16 to 81 μM, and the SD range is 11 to 142 μM (Nippon Rin 53 (Special Issue) p579-581 (1995)) . In addition, serum mannose concentration is known to vary with diabetes and fungal infection, and is expected as a diagnostic agent.
[0004]
In diabetics, fasting serum mannose is 3-5 times higher than normal and is known to correlate well with glucose (National Defense Medical College 15 (4) p217-223 (1990), Clin Chim. Acta 251 p91-103 (1996)). In particular, in the case of ketoacidosis, it reached about 670 μM (50 times the average value of healthy subjects) and improved to about 50 μM by treatment (National Defense Medical College Journal 15 (4) p217-223 (1990)). In diabetic complications, serum mannose was significantly higher in the onset of retinopathy (Diabetes 33 (Sup.) P144 (1990), Diabetes 34 (Sup.) P277 (1991)). The proportion of mannose contained in sugar chains in the lenses of cataract patients was higher in the diabetic group than in the non-diabetic group (National Defense Medical College Journal 18 (4) p308-315 (1993)). In gestational diabetes, serum mannose in the diabetic group was higher than that in the normal group throughout the first, middle, and late stages of pregnancy, and spontaneous abortion was more frequent in the high mannose group in the first trimester (Diabetes 33 (9) p719-725 (1990) ).
[0005]
In addition, there is a report that serum mannose was significantly increased to 110 to 1,315 μM (63 times the average value of healthy subjects) in mycosis, particularly candidiasis, which is a problem in patients with decreased immunity ( Japan Lin 53 (Special Issue) p579-581 (1995), Japan Medical News No.3286 p46-48 (1987)).
[0006]
Most items of biochemical tests are measured by automatic analyzers (general-purpose machines) for biochemical tests. Also, due to the recent rise in medical costs, it is not possible to support automatic measurement with general-purpose machines, that is, inspection items that require special analyzers and require labor and labor costs are practically difficult to apply clinically. It can be said that it is in a situation. Up to now, there have been many reports on mannose measurement methods, but since all of them require complicated operations, measurement with a general-purpose machine has been difficult (Clin. Chem. 43 (3) p533-538 (1997). )).
[0007]
The most reliable method for measuring mannose is the capillary gas chromatography (GC) method (National Defense Medical College Journal 15 (4) p217-223 (1990)) and the gas chromatography / mass spectrometry (GC-MS) method. (Clin. Chim. Acta 251 p91-103 (1996)) have been reported, but all of them require special equipment requiring complicated pretreatment and advanced maintenance techniques.
[0008]
Several methods for measuring mannose using an enzyme have also been reported. In any of these, mannose is phosphorylated with hexokinase (EC 2.7.1.1) to produce mannose-6-phosphate, and the produced mannose-6-phosphate is converted to mannose phosphate isomerase (EC 5.3). Isomerization of fructose-6-phosphate to glucose-6-phosphate with glucose phosphate isomerase (EC 5.3.1.9), Glucose-6-phosphate produced according to the amount of mannose in the sample was oxidized using glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.149) in the presence of a coenzyme, and this reaction The reduced form of the coenzyme produced by the above is measured with a spectrophotometer (Clin. Chem. 30 (2) p293-294 (1984)).
[0009]
When mannose is measured with this enzyme system, hexokinase also phosphorylates glucose, so that a large amount of glucose-6-phosphate is produced, which reacts with glucose-6-phosphate dehydrogenase. In particular, in human serum, the amount of glucose reaches about 100 times the amount of mannose, so it is necessary to remove it efficiently before measurement. Soyama et al. (Clin. Chem. 30 (2) p293-294 (1984)) and Akazawa et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab. 62 (5) p984-989 (1986)) used glucose oxidase to Although the method of removing was reported, there was a problem that the removal of glucose was incomplete or the reaction to mannose occurred for a long time (Clin. Chem. 43 (3) p533-538 (1997). )). James et al. Also used glucokinase (EC 2.7.1.2) to selectively phosphorylate glucose and adsorb the resulting glucose-6-phosphate using a centrifugal minicolumn packed with an anion exchange resin. After removal, mannose recovered in the flow-through without being adsorbed is detected by the mannose measurement method using the aforementioned enzyme (Clin. Chem. 43 (3) p533-538 (1997)). Necessitating proper centrifugation.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Thus, a simple method for efficiently removing glucose in one liquid and measuring mannose as it is has not yet been completed, and it has not been applied to a general-purpose machine for biochemical examination.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have previously determined that the sample is prepared in advance in a mannose measurement method in which mannose present in the sample is detected as a glucose derivative. -Glucose 2-position oxidase, such as sorbose oxidase, or glucose 2-position oxidase, such as pyranose oxidase or L-sorbose oxidase, and glucose 1-position oxidase, such as glucose oxidase, are treated in combination and present in the sample. It has been found that mannose can be easily quantified by measuring mannose after completely removing the glucose to be produced, and the present invention has been achieved.
[0012]
That is, the present invention
(1) When measuring mannose in a sample, glucose contained in the sample is previously removed using glucose 2-oxidase; (2) glucose 2-oxidase Is a pyranose oxidase or L-sorbose oxidase (1) The mannose quantification method according to (1) (3) When glucose contained in a specimen is removed using glucose 2-position oxidase, Method (1) or (2) used in combination (4) The mannose quantification method according to (3), wherein the first oxidase of glucose is glucose oxidase (5) The mannose in the sample is quantified in advance by removing glucose The mannose in the sample was converted to mannose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, and glucose-6-phosphate sequentially using enzymes. Then, the glucose-6-phosphate produced is detected using glucose-6-phosphate dehydrogenase and quantified (1) to any one of the methods (4) (6) The glucose contained in the sample is When removing, a method for removing glucose characterized by using pyranose oxidase or L-sorbose oxidase in combination with glucose oxidase,
About.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The specimen of the present invention may be anything clinically meaningful for measuring the mannose concentration, and particularly includes body fluids such as serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid.
[0014]
The method for removing glucose of the present invention is the measurement of mannose by efficiently and completely oxidizing glucose by combining glucose 2-oxidase or glucose 2-oxidase and glucose 1-oxidase. It is a method of converting to a substance that does not interfere with it. Examples of the glucose 2-position oxidase of the present invention include pyranose oxidase and L-sorbose oxidase using oxygen as an electron acceptor, and dehydrogenase using something other than oxygen or NAD (P) as an electron acceptor. NAD (P) means oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and / or oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP).
The glucose 1-position oxidase of the present invention is glucose oxidase using oxygen as an electron acceptor, glucose dehydrogenase using EC as an electron acceptor (AD1.1..1.47, EC1.1.1.118, EC1.1.1.119) and glucose dehydrogenase (EC1.1.99.10) using an electron acceptor other than oxygen or NAD (P). The amount of each enzyme required for removing glucose may be 0.1 to 500 units / mL, preferably 1 to 10 units / mL for glucose 2-oxidase. What is necessary is just to add about 0.1-5000 units / mL about the 1st-position oxidase of glucose, Preferably, it may be 1-100 units / mL concentration.
In addition, when the 1st-position oxidase of glucose is a dehydrogenase, it adds so that it may become 0.1-500 unit / mL, preferably 0.5-10 unit / mL concentration. The relative activity ratio of glucose 2-position oxidase such as pyranose oxidase or L-sorbose oxidase to glucose 1-position oxidase such as glucose oxidase is usually 1: 100 to 100: 1, preferably 1:10 to 10-10. : 1. The relative activity ratio in the case of using dehydrogenase as the first oxidase of pyranose oxidase or L-sorbose oxidase and glucose is usually 1:10 to 100: 1, preferably 1: 1 to 10: 1. Good.
[0015]
The pyranose oxidase of the present invention is an enzyme that oxidizes the 2-position of glucose, as long as it is classified as EC 1.1.3.10 by the Enzyme Committee of the International Biochemical Union (IUB). The origin of the enzyme is not particularly limited, but the relative reactivity of mannose when compared to glucose is 1.5% or less, and there is a substance that does not substantially react with mannose when removing glucose. preferable. Specific examples include pyranose oxidase derived from Polyporus obtusus.
[0016]
The L-sorbose oxidase of the present invention is an enzyme that oxidizes the 5-position of L-sorbose and has the property of efficiently oxidizing the 2-position of glucose. U. B. Any enzyme can be used as long as it is classified as EC 1.1.3.11 by the enzyme committee, and the origin of the enzyme is not particularly limited, but the relative reactivity of mannose compared to glucose is 1. It is preferably 5% or less and substantially does not react with mannose when removing glucose.
[0017]
The glucose oxidase of the present invention is glucose 1-position oxidase. U. B. Any enzyme may be used as long as it is classified as EC 1.1.3.4 by the enzyme committee of No. 1, and the origin of the enzyme is not particularly limited.
[0018]
As a method for measuring mannose in a sample of the present invention, mannose using an enzyme having a high specificity for mannose to the extent that there is substantially no component other than glucose among substances present in the sample. The quantitative method is preferred. As long as the method uses an enzyme having high specificity for mannose, a mannose oxidase alone or a system combining a plurality of enzymes may be used, and can be carried out according to a known method. As a method specific to mannose combining a plurality of enzymes, for example, mannose in a sample is sequentially converted to mannose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, glucose-6-phosphate using the enzyme. The method using glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.1.49) can be used for the produced glucose-6-phosphate (Clin. Chem. 30 (2) p293-294 (1984)). . Here, in order to phosphorylate mannose to produce mannose-6-phosphate, hexokinase (EC 2.7.1.1) is isomerized from mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate. Mannose phosphate isomerase (EC 5.3.1.8) and glucose isomerase (EC 5.3.1.9) for isomerization of fructose-6-phosphate to glucose-6-phosphate. I am using it.
[0019]
As a method for quantifying mannose, a dehydrogenase such as mannose dehydrogenase or glucose-6-phosphate dehydrogenase is used as the final enzyme for converting mannose, and a coenzyme reduct or reduction resulting from these enzyme reactions is used. The absorbance of β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and reduced β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) (both are abbreviated as NAD (P) H) can be directly measured, or diaphorase or 1 A highly sensitive method is used in which tetrazolium salts are reduced with NAD (P) H in the presence of -methoxy-5-methylphenadium methyl sulfate (1m-PMS) and the absorbance of the resulting formazan is measured. Furthermore, as a more sensitive measurement method of NAD (P) H, NAD (P) H is oxidized with dissolved oxygen in the presence of an electron carrier such as 1m-PMS to generate superoxide radicals and hydrogen peroxide. There are a method of measuring these by chemiluminescence using luminol, isoluminol, or the like, and a method of measuring hydrogen peroxide which has been widely used conventionally with high sensitivity. In addition, a method for measuring NAD (P) H in a bioluminescent enzyme system derived from a microorganism can also be used.
[0020]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference examples, experimental examples, and examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Examination of Glucose Removal Method Serum of healthy subjects was treated by three methods (Table 1), and the remaining glucose was quantified by liquid chromatography (HPLC), and the glucose residual ratio was determined and compared. In “Method 1” using microorganism-derived glucose oxidase (G1OD) (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.), about 30% of glucose remained, and the pretreatment method was incomplete. On the other hand, in “Method 2” using Polyporus obtusus-derived pyranose oxidase (G2OD) (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and “Method 3” in which G1OD and G2OD are combined, glucose was completely removed.
[0021]

1) Abbreviations are CAT: Catalase (manufactured by Sigma), MT buffer: Tris-maleic acid buffer.
2) In method 3, G1OD and G2OD were changed to distilled water as the target (100%), and the residual ratio of glucose was calculated.
[0022]
For analysis of the remaining glucose, an HPLC system of JASCO Corporation comprising a degasser (880-50), a column oven (860-CO), and a mobile phase pump (880-PU) was used. Charge 20 μL of the reaction solution deproteinized with a centrifugal ultrafiltration tube (Ultrafree-MC, Millipore) having a molecular weight cut off of 30,000 to a sugar analysis column (Waters Sugar Pak, manufactured by Waters) kept at 80 ° C., Distilled water was allowed to flow as a mobile phase at a flow rate of 0.5 mL / min to separate glucose. A differential refractive index detector (Shodex RI SE-51, manufactured by Showa Denko KK) was used for detection, and a chromatographic integrator (D-2500, manufactured by Hitachi, Ltd.) was used for peak analysis. .
[0023]
Example 2 Quantitative determination of mannose in serum Assuming patient serum, the serum of a healthy subject to which 400 μM mannose was added was used as a specimen and treated with “Method 2” and “Method 3” of the glucose removal method of Example 1, 260 μL of reaction solution contains 300 μL of 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) 6.7 mM, adenosine triphosphate (ATP) 15 mM, MgCl 2 30 mM "Coenzyme solution (NAM)" 20 μL, yeast-derived hexokinase (HK, manufactured by Sigma), Leuconostoc mesenteroides-derived glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, manufactured by Sigma), yeast-derived glucose phosphate isomerase (GPI, manufactured by Sigma) is taken 50U each and 12,000g × 10 at 4 ° C. After centrifuging for 15 minutes, 15 μL of “HK / G6PDH / GPI solution” prepared by adding 1 mL of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) to the residue obtained by removing the supernatant ammonium sulfate solution, yeast-derived mannose phosphate isomerase Take 100 U (MPI, Sigma), centrifuge at 12,000 g × 10 minutes at 4 ° C., add 1 mL of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) to the residue after removing the ammonium sulfate solution of the supernatant. 5 μL of the prepared “MPI solution” was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes.
[0024]
Absorbance at 340 nm of reduced enzyme NADPH of coenzyme produced by oxidation of glucose-6-phosphate derived from mannose in the sample was measured with a spectrophotometer (JASCO V-530, manufactured by JASCO Corporation) and a recorder (JASCO RC-150, manufactured by JASCO Corporation). At the same time, in order to subtract the influence of endogenous fructose present in a trace amount, as a sample blank, the MPI solution was changed to distilled water, and the absorbance of the reaction solution treated in the same manner as the sample was also measured. The mannose concentration was calculated from the absorbance difference of the sample (sample-sample blank) based on a calibration curve in which the difference in absorbance of the standard solution (standard solution-standard solution blank) was plotted when the standard solution was used as the sample.
[0025]
The mannose values of specimens pretreated by “Method 2” using G2OD and “Method 3” combining G1OD and G2OD are 96.0 ± 0.5% (n = 8), 97 of the theoretical values, respectively. 0.0 ± 3.2% (n = 21). Both methods gave almost satisfactory results, and it was found that both methods can be used for the measurement of serum mannose.
[0026]
Example 3 Components Influencing Mannose Measurement In order to examine substances that interfere with the measurement of mannose, various serum components were added in an excess amount to healthy human serum to which mannose 400 μM was added. These sera were measured by the two methods shown in Example 2, and the recovery rate of the added mannose was determined. The results are summarized in Table 2. Ascorbic acid, uric acid, bilirubin and hemoglobin hardly interfered with any of the measurement methods. However, hemolysis interfered strongly with both assays. On the other hand, the addition of glucose was able to be accurately measured by “Method 3” pretreated with G1OD and G2OD, whereas “Method 2” pretreated with G2OD alone strongly interfered with the addition of mannose. Only 60% could be recovered. From this, it can be seen that it is preferable to combine both G1OD and G2OD to remove glucose that interferes with mannose measurement.
[0027]

1) The measured value is mean ± SD, and the number in parentheses is the number of measurements.
2) Serum containing bilirubin was prepared by diluting commercially available standard serum “Anaceram-BIL” (Daiichi Chemical Co., Ltd.) with serum from healthy subjects.
3) A heparin collected blood solution was frozen with liquid nitrogen, thawed and hemolyzed, and this hemolyzed blood was added to healthy subject serum so that the hemoglobin concentration was 500 mg / dL.
[0028]
Example 4 Examination of Application to Automatic Analyzer Assuming patient serum, healthy subject serum added with 400 μM mannose was pretreated by “Method 3” of Example 1 and measured as follows. To the microcell, 30 μL of serum, 10 μL of G1OD (100 U / mL), 10 μL of G2OD (100 U / mL), 10 μL of CAT (500 U / mL), 200 μL of 50 mM MT buffer (pH 5.5) were added and stirred. It was set in a cell holder with a thermostat of a spectrophotometer, and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Furthermore, “reagent mixed with 20 μL of“ coenzyme solution (NAM) ”in Example 2, 15 μL of“ HK / G6PDH / GPI solution ”, and 300 μL of 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). After adding 335 μL of “mixed liquid” and reacting for 2 minutes, 5 μL of “MPI solution” was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes.
[0029]
The results are shown in FIG. As is apparent from the figure, there is no increase in absorbance after addition of the “reagent mixture”, no endogenous fructose, and glucose pretreatment by “Method 3” is complete. In addition, the addition of “MPI solution” showed an increase in absorbance corresponding to mannose added to serum + endogenous mannose, and it was found that mannose can be quantified. Thus, it was shown that mannose can be measured simply by adding a reagent to the same cell containing the specimen, and this mannose measurement method is a biochemical test widely used in clinical practice. It can be applied to an automatic measuring device (general-purpose machine).
[0030]
【The invention's effect】
The pretreatment method for removing glucose by combining the glucose 2-position oxidase or the glucose 1-position oxidase of the present invention with respect to the mannose measurement method in which mannose is detected as a glucose derivative is intrinsic to interfere with the measurement. It is effective in removing glucose and enables measurement with an automatic analyzer (general purpose machine) for biochemical testing of mannose.
[0031]
[Brief description of the drawings]
[FIG. 1] Time course of reaction in measurement of serum mannose

Claims

A method for quantifying mannose, which comprises previously removing glucose contained in a specimen using a glucose 2-position oxidase when measuring mannose in the specimen.

The method for quantifying mannose according to claim 1, wherein the glucose 2-oxidase is pyranose oxidase or L-sorbose oxidase.

The method according to claim 1 or 2, wherein the glucose 1-position oxidase is used together when removing glucose contained in the sample using the glucose 2-position oxidase.

The method for quantifying mannose according to claim 3, wherein the glucose 1-oxidase is glucose oxidase.

Mannose in a sample is quantified by converting mannose in the sample from which glucose has been removed in advance into mannose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, and glucose-6-phosphate using an enzyme. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein glucose-6-phosphate is detected and quantified using glucose-6-phosphate dehydrogenase.

A method for removing glucose, wherein pyranose oxidase or L-sorbose oxidase and glucose oxidase are used in combination when removing glucose contained in a specimen.