JP4035348B2

JP4035348B2 - Macrocyclic target-selective antisense nucleic acid compounds

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Publication number: JP4035348B2
Application number: JP2002064400A
Authority: JP
Inventors: ヨン・グ・パク; ビン・ウー
Original assignee: ウェルジンインコーポレィティッド
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2008-01-23
Anticipated expiration: 2022-03-08
Also published as: AU1883102A; CA2370324A1; JP2004313003A

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、アンチセンス技術分野に関するものである。また本発明は、アンチセンス技術を治療及び遺伝子機能同定システムに利用することに関するものである。
【０００２】
背景技術
アンチセンス分子は、ワトソン−クリック塩基対（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋｂａｓｅｐａｉｒｉｎｇ）にしたがってｍＲＮＡの相補的配列と結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＡＳ−オリゴ）は、配列特異的に遺伝子発現を減少させることによって遺伝子の機能的研究に有用利用されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３１４，３６３−３６６（１９８５）；Ｍｅｌａｎｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５１，２８９７−２９０１（１９９１）；Ａｎｆｏｓｓｉｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３３７９−３３８３（１９８９））。特に、癌の開始及び進行に関連する遺伝子の異常発現を除去するアンチセンス抗癌剤を開発する為に多くの研究が行われてきた（Ｋａｍａｎｏｅｔａｌ．Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，１４，８３１−８３９（１９９０）；Ｍｅｌｏｔｔｉｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，８７，２２２１−２２３４（１９９６）；Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．ＣｅｌｌｇｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ．，１，５４３−５４８（１９９０）；Ｒａｔａｊｃｚａｋｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，７９，１９５６−１９６１（１９９２）；Ｋａｓｔａｎｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，７４，１５１７−１５２４（１９８９）；Ｔｈａｌｅｒｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１３５２−１３５６（１９９６）；ＷａｇｎｅｒＮａｔｕｒｅ，３７２，３３３−３３５，（１９９４））。
【０００３】
合成ＡＳ−オリゴは、標的遺伝子に対する有能な特異性だけではなく、そのデザインと合成が容易なため幅広く使用されている。遺伝子発現に対するアンチセンスの抑制作用は、アンチセンスＤＮＡ−ｍＲＮＡデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を形成した後、ＲＮａｓｅＨの活性によって分解されたり、リボソーム複合体に結合するｍＲＮＡの移動を立体的に妨害することによって成り立つと知られている（ＤｏｌｎｉｃｋＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔ．，９，１８５−１９４（１９９１））。また、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）領域でトリプル−ヘリックス（ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ）構造を形成することによって、遺伝子の発現を抑制するとも報告されている。さらに、ゲノムＤＮＡのプロモーター領域に競合するデュプレックスオリゴヌクレオチド誘引体もまた形成される（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１００２３−１００２６，（１９９１））。
ＡＳ−オリゴの効能は、いくつかの最近の臨床的研究だけではなく、動物モデルにおいても有用性が確認されてきた（Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．，１２，１２５７−１２６２，（１９９３）；Ｔｏｍｉｔａｅｔａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２６，１３１−１３６，（１９９５）；Ｎｅｓｔｅｒｏｖａｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｎｅｄ．，１，５２８−５３３，（１９９５）；ＲｏｕｓｈＳｃｉｅｎｃｅ，２７６，１１９２−１１９３（１９９７））。さらに、ＣＭＶ網膜炎に対する最初のアンチセンス医薬品が、米国とヨーロッパで承認された。
【０００４】
しかし、ＡＳ−オリゴに対する期待は、結果が常に明白なものではないために時々失望をもたらす。ＡＳ−オリゴを使用するにあたっては、標的部位への接近困難（Ｆｌａｎａｇａｎｅｔａｌ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１７２，２１３−２２５（１９９７）；Ｍａｔｓｕｄａｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７，１０９５−１１０６（１９９６））、ヌクレアーゼに対する不安定さ（Ａｋｈｔａｒｅｔａｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，４９，１７９３−１８０１（１９９１）；Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１５１０−１５１３（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２４，１５０８−１５１４（１９９６））、配列特異性の不足及び生体内（ｉｎｖｉｖｏ）での多様な副作用等が問題点になっている。ＡＳ−オリゴの安定性は、いわゆる第２世代ＡＳ−オリゴと呼ばれる化学的に修飾したオリゴを使用することによって、ある程度改善された（ＨｅｌｅｎｅＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，２７（１１），１４６６−７１（１９９１）；Ｂａｙｅｖｅｒｅｔａｌ．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．３（４），３８３−９０（１９９３）；Ｂａｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８９，３−１８（１９９９））。ホスホロチオアート−オリゴ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｏｌｉｇｏ，ＰＳ−オリゴ）及びメチルホスホナート−オリゴ（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｏｌｉｇｏ，ＭＰ−オリゴ）は綿密に研究されていて、ヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために主に使用される。しかし、修飾したＡＳ−オリゴは、遺伝子の塩基配列に対する特異性が少なくＲＮａｓｅＨ活性に対する疑問が見え、それにＤＮＡ複製時突然変異が不適切に導入されたりや加水分解された修飾ヌクレオチドの再利用時に問題が生じうる。
【０００５】
安定性を増加させた一連のアンチセンス分子、いわゆる第３世代ＡＳ−オリゴは、１）ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造、２）ＣＭＡＳ（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ−ｃｌｏｓｅｄＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｓｅｎｓｅ）構造、及び３）ＲｉＡＳ（ＲｉｂｂｏｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅ）構造（Ｍｏｏｎｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ．，３４６，２９５−３０３（２０００）；Ｍａｔｓｕｄａｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７，１０９５−１１０６（１９９６）；Ｍｏｏｎｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ．，２７５（７），４６４７−５３（２０００））を持つ。ＣＭＡＳ及びＲｉＡＳ−オリゴヌクレオチドは、生体液でエクソヌクレアーゼ及びヌクレアーゼに対する安定性が増加されることが分かる。このアンチセンス分子は、また標的ｍＲＮＡの特異的に減少させるのに効果的に使用される。しかし、さらに容易にアンチセンス分子を開発して結合効率を増加させられるアンチセンス分子を開発する技術が求められている。
Ｍ１３バクテリオファージのようなバクテリオファージは、一本鎖環状ゲノムを持ち、これらは突然変異研究だけではなくＤＮＡ配列分析のためにも使用されている。Ｍ１３プラスミドは、組換えバクテリオファージの構成に利用されるプラスミドに、特異的遺伝子に対するアンチセンス配列を含む大量の環状一本鎖ゲノムＤＮＡを生産するために使用できる。アンチセンスＤＮＡを生産するためのこのようなアプローチは、共有結合的に閉鎖された構造と関連するエクソヌクレアーゼに対する安定性、配列の高い正確性、難しい標的部位研究の除去及びアンチセンスライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の構造が容易である等の長所を持っている。
【０００６】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒａｌｐｈａ；ＴＮＦ−α）は、正常免疫反応（Ｐｅｒｋｉｎｓｅｔａｌ．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．，４１（１２），２２０５−１０（１９９８））、敗血ショック（Ｃａｍｅｎｉｓｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２（６），３４９８−５０３（１９９９））、及び過多生成された場合には、移植組織対宿主反応（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４（２），６５６−６３（２０００））のために必要なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。また、ＴＮＦ−αは典型的な伝染症性サイトカインであり、リューマチ関節炎、アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）及び敗血症のような炎症現象を含む他の免疫異常に密接に関連する（Ｐｅｒｋｉｎｓｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．，４１（１２），２２０５−１０（１９９８））。ＴＮＦ−α発現は、リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）が処理された白鼠単核細胞株ＷＲＴ７／Ｐ２から誘導できる。
【０００７】
核因子κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ κＢ，ＮＦ−κＢ）は、サイトカイン（ＣｏｌｌｉｎｓＬａｂＩｎｖｅｓｔ．，６８，４９９−５０８（１９９３）；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．ＦＡＳＥＢＪ．，９，８９９−９０９（１９９５））及び附着受容体（Ｔｈａｎｏｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，８０，５２９−５３２（１９９５））に関する多様な遺伝子を調節する。活性化されたＮＦ−κＢは、人間動脈硬化組織のマクロファージ、平滑筋細胞及び内皮細胞で同定され（Ｄｅｆｉｌｌｉｐｉｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｍｍｕｎｏｌ．，１８４，８７−９８（１９９３））、炎症及び増殖過程で重要な役割をするものと考えられている（Ｂｒａｎｄｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．，９７，１７１５−１７２２（１９９６））。
【０００８】
ｒａｓ発癌遺伝子は、ヒト腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）でよく活性化される。ＲＡＳｐ２１蛋白質は、ＧＴＰ／ＧＤＰ結合蛋白質の大きなファミリー（ｆａｍｉｌｙ）の一部として、血漿膜の内部に位置する。ｒａｓ遺伝子の点突然変異は、結合されたＧＴＰを加水分解できないので細胞内に信号を伝達して細胞増殖を調節できなくなり、ＲＡＳｐ２１蛋白質を生産できる（Ａｌｂｅｒｔｓｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１２７３−１２９０（１９９４））。
原発癌性遺伝子（ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｃ−ｍｙｂは、造血細胞の増殖及び分化に重要な役割をする。造血細胞は、ｃ−ｍｙｂの分化的な発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示し、末端分化（ｔｅｒｍｉｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に関する遺伝子は、ほとんど発現されない（Ｍｅｌｏｔｔｉｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，８７，２２２１−２２３４（１９９６）；Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ，ＣｅｌｌｇｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ．，１，５４３−５４８（１９９０））。ｃ−ｍｙｂ遺伝子産物は、白血病細胞で過多発現するのをよく見ることができる（Ｍｅｌａｎｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５１，２８９７−２９０１（１９９１）；Ａｎｆｏｓｓｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３３７９−３３８３（１９８９）；Ｋａｍａｎｏｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，１４，８３１−８３９（１９９０））。
ＭＹＣ発癌蛋白質は、腫瘍細胞の成長に重要な役割をする（Ｐａｃｋｈａｍｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２４２，１１−２８（１９９５）；Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６８，１０９−１８２（１９９６））。ＭＹＣは、休止細胞を細胞周期に入るように誘導するのに充分な能力があり（Ｅｉｌｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４０，６６−６８（１９８９））、継続的な細胞成長のために必要である。反面ＭＹＳの抑制は、細胞分裂の信号を抑制して細胞が最終的に分化されるように誘導できる（Ｈｅｉｋｋｉｌａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，４４５−４４８（１９８７）；Ｓａｗｙｅｒｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７０，９０１−９１０（１９９２））。
【０００９】
細胞周期調節性遺伝子の主要な構成要素は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓ，ＣＤＫｓ）と呼ばれる蛋白質キナーゼで代表される。細胞周期のある一段階から次の段階へ進行されることを調節する分子的メカニズムを研究する過程でＣＤＫｓが発見された（ＭｏｒｇｅｎＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３７４，１３１−１３４（１９９５））。ＣＤＫｓは、個別的なサイクリン蛋白質の補助活性剤と結合する時までは、不活性状態である。細胞がＧ１に入ると、初期Ｇ１チェックポイントを通じた進行によってＣＤＫ４及びＣＤＫ６のキナーゼ活性が必須的なものであると見られ（ＳｈｅｒｒＣｅｌｌ，７３，１０５９−１０６５（１９９３））、ＣＤＫ２−サイクリンＥ複合体の活性は、Ｇ１からＳ基に進行されることが必須的である（Ｏｈｔｓｕｂｏｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，２６１２−２６２４（１９９４））。ＣＤＫ活性に対して効能があるアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発することは、腫瘍細胞の成長を抑制するための良い方法になるであろう。したがって、多様な人間疾病に使用されうる、さらに特異的で安定的で有能なアンチセンスに関する技術が必要である。
【００１０】
発明の要約
本発明は、上記で言及された問題点を克服して、アンチセンス分子、アンチセンス分子の組成物、アンチセンス分子を作る方法及び、標的遺伝子の発現を抑制したり有為な改良を行う利点を提供するアンチセンス分子及び組成物を使用する方法を提供する。標的遺伝子の発現が癌を誘発させる場合、本発明のアンチセンス分子を細胞に投与すれば標的ＲＮＡが除去され、細胞の増殖を抑制することによって癌を治療したり、少なくても生存を延長させられる。
【００１１】
本発明は、癌を治療することに限定されない。本発明のアンチセンス化合物の治療原理は、ある特定の標的ＲＮＡを除去するのに適用できる。アンチセンス治療は、ウイルス感染を除去したり代謝疾患および免疫学的疾患等を治療する等の癌を治療する際に現れる上記の化学活性のすべての表現型発現をアンチセンス治療の結果として示す。
本発明は、さらに薬学的に許容可能な担体を含むアンチセンス分子の組成物を提供する。
本発明は、標的特異的なアンチセンス領域を含む大環状核酸分子に関するものである。遺伝子から発現されるＲＮＡ部分に特異的に結合する上記のアンチセンス分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。大環状核酸分子は、少なくても約３千個のヌクレオチド長さを持っていて、その分子のアンチセンス領域は、少なくても約５０個のヌクレオチド長さ、好ましくは少なくても約１００個のヌクレオチド長さを持っている。それにアンチセンス領域は、全体遺伝子配列に実質的に相補的である。
【００１２】
本発明の実施例で、大環状核酸分子は、組換えバクテリオファージまたは繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｐｈａｇｅ）及び特にファージＭ１３と同じファージミドゲノムの一本鎖型である。
他の実施例で、上記で説明したように大環状核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、繊維状ファージから由来する。また他の実施例で、ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、また遺伝子から発現されるＲＮＡの特定部分と特異的に結合する標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子で成り立つ組成物及び薬学的に許容可能な担体に関するものである。上記のアンチセンス分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。
【００１３】
また他の実施例で、選択された蛋白質をコード化するＲＮＡを標的にする大環状核酸分子によって選択された蛋白質の発現を抑制できる方法を提供する。上記方法は、核酸分子がＲＮＡを標的にして、核酸分子がＲＮＡとハイブリッドしてＲＮＡとデュプレックスを形成することからなる、上記デュプレックスは、選択された蛋白質の発現を抑制する。その標的蛋白質は、細胞増殖や癌を誘発することがある。上記の癌は、白血病、肺癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、脳癌、前立腺癌、頚部癌、または乳癌等をあげられるが、これに限定されるものではない。特に、上記の癌は、白血病、頚部癌、または乳癌である。
【００１４】
標的蛋白質は、腫瘍壊死因子、核因子、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＲＡＳまたは細胞分裂キナーゼ（ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｋｉｎａｓｅ）等である。標的蛋白質がウイルス性蛋白質ならそのウイルスは、疱疹（ｈｅｒｐｅｓ）、人間パピロマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ）、単核細胞症（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、肝炎または呼吸性シンシチアルウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）等をあげられるが、これに限定されるものではない。
標的蛋白質は、代謝疾患や免疫異常を招来する。代謝疾患には、フェニルケトン尿症、原発性甲状腺低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病または肥満等をあげられるが、これに限定されるものではない。免疫異常には、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓＳｙｎｄｒｏｍｅ）、抗リン脂質症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫複合性疾患、紫斑病、シェーンレイン−ヘノホ症候群（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ）、免疫欠乏症候群、全身性紅斑性狼瘡、免疫欠乏、リュウマチ、腎臓または肝硬変をあげられるが、これに限定されるものではない。
本発明は、また複数の標的遺伝子から発現される複数の標的ＲＮＡに特異的に結合する標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子を提供する。上記の核酸分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。さらに、キメラ大環状核酸分子および薬学的に許容可能な担体を含有する組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、また複数の選択された蛋白質をコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）する複数のＲＮＡ分子を標的とする大環状核酸分子によって多数の選択的蛋白質の発現を抑制させる方法に関するもので、１）上記の複数の標的ＲＮＡに標的化された標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子を生産する段階、２）多数のＲＮＡを標的にしてキメラ大環状核酸分子が上記のＲＮＡとハイブリッドして多数の選択された蛋白質の発現を減少させるデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を形成する段階からなる。
さらに、本発明は、細胞増殖を阻害する方法に関するものである。
一つ以上の標的遺伝子に対して実質的に相補的な一つ以上のアンチセンス領域を含有する大環状核酸分子を細胞に投与すれば、上記遺伝子の発現を抑制して細胞増殖を抑制する。
実施例を見れば、選択された蛋白質の発現を抑制する標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子を作る方法に関するもので、１）目的とする標的特異的ＤＮＡをファージまたはファージミドゲノムに挿入する段階、２）ファージが一本鎖型の大環状核酸分子を生産する段階、３）ゲル濾過カラムによって上記大環状核酸分子を分離する段階からなる。
【００１６】
本発明は、また遺伝子の機能をスクリーニングする方法に関するもので、ａ）細胞から発現されるＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス領域を含有する大環状核酸分子を生産する段階、ｂ）細胞が大環状核酸分子と接触することによってアンチセンス分子が細胞に入って細胞内で発現されたＲＮＡとハイブリッドして遺伝子産物の発現を抑制する段階、ｃ）多様な表現型に関して細胞を分析する段階で成り立つ。
上記の方法でａ）〜ｃ）段階は、上記の大環状核酸分子のライブラリーに適用できる。それに、その方法において、核酸分子は組換えバクテリオファージやファージミドゲノムの一本鎖型である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は標的特異的アンチセンス領域、特にバクテリオファージから生産される標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子が遺伝子発現の効果的な除去剤として有用であるという発見に根拠をおいている。
本明細書において、“アンチセンス”は、アンチセンス核酸（ＤＮＡまたＲＮＡ）およびその類似体を意味し、アンチセンスは、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合相互作用を通してポリヌクレオチド標的配列や配列部分を認識する一連のヌクレオチド塩基配列を持った一連の化学種を言う。その標的配列は、一本鎖または二重鎖ＲＮＡや一本鎖または二重鎖ＤＮＡである。
【００１８】
このようなＲＮＡやＤＮＡ類似体は、２‘−Ｏ−アルキル糖修飾（２‘−Ｏ−ａｌｋｙｌｓｕｇａｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、メチルホスホナート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、３’−チオホルムアセタール（３‘−ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、スルホン（ｓｕｌｆｏｎｅ）、スルファメート（ｓｕｌｆａｍａｔｅ）、およびニトロキシド骨格修飾（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅｂａｃｋｂｏｎｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、アミド（ａｍｉｄｅ）および塩基の一部分が修飾された類似体で構成されるが、これに限定されるものではない。加えて、分子類似体は、糖の一部分が異なる適切な一部分によって修飾されたり代替されるポリマーであることが可能で、そのポリマーは、モルホリン（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）類似体およびペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ＰＮＡ）類似体を含むが、これに限定されるものではない。このような類似体は、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨによって媒介される分解（ＲＮａｓｅＨ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性および標的特異性を向上させるために連結グループと関連した上記で言及した修飾および糖や塩基の構造的修飾の多様な組み合わせを含む。
【００１９】
本明細書において、“アンチセンス治療”は、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）また生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で願わない標的ＤＮＡやＲＮＡ配列を不活性化するために標的遺伝子に関するアンチセンス切片を含む大環状核酸分子の特異的結合を含む一般的な用語である。
本明細書において、“細胞増殖”は、細胞分裂を意味する。“成長”という用語は、速い細胞分裂と遅いアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）つまり細胞死のために増加した細胞数を意味する。調節されない細胞増殖は、癌や異常細胞増殖に対する指標になる。正常的で癌細胞でない細胞は、特定類型の細胞のよくある特徴にしたがって規則的に分裂する。細胞が癌化状態に転移した時、その細胞は、非統制的に細胞分裂をして増殖する。増殖や成長の抑制が細胞の異常な分裂を調節する。
【００２０】
本明細書において、“キメラ大環状核酸分子”は、多数の標的遺伝子に対して実質的に相補的な複数のアンチセンスヌクレオチド切片を含む大環状核酸分子を意味する。アンチセンス分子の切片は、各切片間に直接またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を利用して間接的にお互いに連結できる。
【００２１】
本明細書において、“繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｐｈａｇｅ）”は、本発明の大環状核酸分子を生産する為の媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。ファージまたはファージミドが利用できる。例えば、一本鎖がファージまたファージミドによって生産された時、大環状核酸一本鎖が生産されるようにするために目標とする配列が媒介物に挿入されたりクローニングされる。ＤＮＡやＲＮＡバクテリオファージが、このような目的に使用できる。特に、繊維状バクテリオファージが使用できる。Ｍ１３，ｆｄおよびｆ１のような繊維状ファージは、環状ｓｓＤＮＡ分子を持った繊維状カプシド（ｃａｐｓｉｄ）を持つ。これらのライフサイクルは、エンカプシデーション（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）前にｓｓＤＮＡ分子に転換される細胞内でｄｓＤＮＡ中間媒介体複製形と関連がある。このような転換がｓｓＤＮＡを製造する手段を提供する。バクテリオファージＭ１３がクローニングベクターの用途に採択されてきた。
本明細書において、“遺伝子”は、完全なヌクレオチド配列の遺伝子または一部配列の遺伝子を言う。
本明細書において、“抑制”また“減少”は、遺伝子の発現、細胞増殖またはその他の表現型的特徴を低めることを示し、これらは混用して使用される。
本明細書において、“大環状核酸分子”は、“大環状アンチセンス分子”とも称されるが、一本鎖分子であり、実質的に相補的であり、標的遺伝子やＲＮＡ配列と結合する少なくても一つ以上のアンチセンス領域を含み、イソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）だけではなく、遺伝子の発現を抑制または減少させる。環状一本鎖核酸分子は、標的遺伝子に関する配列がアンチセンス型である限りは、一つ以上の遺伝子に関するセンスまたはアンチセンス配列を含む。
【００２２】
大環状核酸分子は、化学的な方法によって合成できる。しかし、典型的にはＭ１３とＭ１３から由来するファージミドを含む繊維状ファージシステムから生産される。大環状核酸分子がファージから生産される時、これを “ファージゲノムアンチセンス化合物“と呼ぶ。
【００２３】
ある場合には、大環状核酸分子は、約２０ないし３０個のヌクレオチド長さの典型的なオリゴヌクレオチド配列よりもさらに長い。反対に、大環状核酸分子は、少なくても３千個ヌクレオチド長さであることも可能である。典型的にその範囲は、約３千個ないし８千個のヌクレオチド長さである。たとえ約３１００ないし７０００個のヌクレオチドが本発明で有用であるとしても、さらに望ましい長さの範囲は、約３３００ないし６０００塩基である。
【００２４】
大環状核酸分子の長さは、絶対的にさらに高いまたはさらに低い限界を持つ必要は無い。これは、ファージが大環状核酸分子を生産するのに使用される場合に特にそうである。標的遺伝子の少なくても一部分をコード化するファージの大きさと挿入の大きさで生産される一本鎖核酸の長さを調節できる。したがって、実施例の一つとして、上記核酸分子はファージ、例えば繊維状ファージが収容できる程度の長さにすることが可能である。
大環状核酸分子は、外来の配列だけではなく、特異的なアンチセンス配列を含むことができる。外来の配列は、多様な異なる遺伝子のセンスまたアンチセンス形を含むことができる。また、もしファージが核酸分子を生産するために使用されるなら、外来の配列は、ベクター配列であるばずである。大環状核酸分子の標的特異的アンチセンス領域の長さは、約１００個ヌクレオチドよりさらに短いものから約５０００個塩基以上に至るまで、制限が無い。典型的には、その範囲が約２００ないし約３０００個であり、望ましくは、その範囲は、約４００ないし２０００個である。標的特異的アンチセンス領域は、また全体遺伝子に相補的である。
また他の実施例として、アンチセンス分子は、ファージの通常の生活周期の一部としてバクテリオファージゲノムから生産される。
【００２５】
本明細書において、“実質的に相補的な”は、標的ＲＮＡに相補的で特異的に結合するアンチセンス化合物と約８０％程度の相同性を持つアンチセンス配列を意味する。一般的な問題として、絶対的な相補性を必要としないのである。
標的核酸と安定なデュプレックスまたはトリプレックスを形成するのに充分な相補性を持ついかなるアンチセンス分子でも適切であると思われる。安定なデュプレックス形成は、ハイブリッドされたアンチセンス分子の配列および長さとアンチセンス分子および標的配列間の相補性の程度に依存するために大環状分子が持つ相補性が少し充実していなくてもそのシステムは、維持できる。
本明細書において、“標的”また“標的化”は、アンチセンス分子が作られるようにする特別な個別遺伝子を言う。本発明の実施例として、アンチセンス分子は、ＬＣ−アンチセンス化合物の挿入から作られる。いくつかの文段で“標的化”は、標的遺伝子の発現が除去されるようにするために、アンチセンス分子を内因的に発現した転写物に結合させることを意味する。標的核酸配列は、免疫疾患、感染疾患、代謝疾患および遺伝疾患のような多様な疾患、または異常的な遺伝子発現によって招来される他の疾患の開始および進行に関連する遺伝子を含んだ多様な悪性腫瘍に関連する遺伝子から選択されることができる。
【００２６】
本発明のアンチセンス分子は、生化学的、生物学的活性において伝統的な合成ＡＳ−オリゴよりさらに優れている。伝統的なＡＳ−オリゴがＤＮＡ合成機によって簡単に合成されるというが、これらは、標的部位の選択を必要とする。標的部位の選択過程は、時時、ＡＳ−オリゴデザインとも呼ぶ。この過程は、時間を消費し時々結論が出ない場合もある。それに、合成されたＡＳ−オリゴは、ヌクレアーゼに不安定で、多くのシークエンス・エラーが起こりやすく、高い生産費用を必要としリポソームと複合体をなした後でも低い細胞内流入を示す。
本発明の実施例でみると、アンチセンスベクターに使用されるバクテリオファージから生産される一本鎖環状ゲノムＤＮＡが提供される。特に、使用されるバクテリオファージは、Ｍ１３ファージやＭ１３ファージの修飾型である。しかし、一本鎖核酸を生産するバクテリオファージまたはプラスミド、ウイルスまたは他のクローニング媒介物も使用できる。さらに望ましいのは、生産される一本鎖核酸は、環状である。アンチセンス分子を生産するＤＮＡ分子は、バクテリオファージのような媒介物のゲノムからクローニングされる。
【００２７】
アンチセンス研究分野で、伝統的に知られている知識によって長いアンチセンス分子を使用しないようにした。それは、さらに長いＡＳ−オリゴは、特異的に欠け、合成がさらに難しく細胞内流入が非効率的な傾向があるためである。事実、ホスホロチオエイト修飾オリゴのように化学的に修飾された第２世代ＡＳ−オリゴは、ＡＳ−オリゴが長くなるほど配列特異性が減少した。それに、直線ＡＳ−オリゴの合成が漸次的にさらに難しくなり、ＡＳ−オリゴ長さが増加するにしたがって目立って配列忠実度が減少する。
ファージベクターは、高い配列忠実度を持ったアンチセンス配列を含む長い一本鎖配列を簡単に生産できる。本発明のアンチセンス分子がたとえ以前とは異なり長い長さであっても標的ｍＲＮＡの発現を除去するのに立派な配列特異性を示した。アンチセンス核酸の独特な作用理論や機構を根拠とせずに、一旦アンチセンス配列の小さい部分が相補的配列と結合さえすれば、アンチセンス配列が相補的な標的配列の全体長さに関して配列の特異性を示す（ｚｉｐｓ）。アンチセンスＤＮＡとセンスＲＮＡの間に形成される長いデュプレックスは、その後ＲＮａｓｅＨ活性に対する基質としてずっと安定に維持される。
【００２８】
本発明のアンチセンス分子の有利な結合に対するまた異なる根拠は、長いアンチセンス分子が構造的に露出している標的部位に結合できる可能性がさらに高いということである。ｍＲＮＡは、それ自身の配列内で、そして細胞の細胞質でＲＮＡ結合蛋白質との相互作用によって広範囲な２次および３次構造を形成する傾向がある。アンチセンス分子に対するオープン標的部位を探すことは、好結果のアンチセンス活性のために必須的である。長い長さとともにファージゲノムアンチセンス分子は、標的ｍＲＮＡの露出された相補的配列にアプローチできる配列を持たなければならず、したがって標的ｍＲＮＡを除去する可能性を向上させることができる。
【００２９】
本発明のアンチセンス分子の原理は、目的とする標的遺伝子に適用されることである。例えば、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｋ２およびｋ−ｒａｓが、本発明のアンチセンス分子を利用する例として提供されたが、本発明のアンチセンス分子は目的とするどんな遺伝子に対しても製造できる。事実、本発明のアンチセンス分子は、意味ある程度にヌクレアーゼに対してさらに安定的であり標的除去に効果的である。例示されたＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｋ２およびｋ−ｒａｓ標的遺伝子の配列特異的減少が、本アンチセンス方法の幅広い活用を裏付けする。したがって、本発明のアンチセンス分子は、ある原料から来る標的ｍＲＮＡ配列に結合するのに使用できる。
アンチセンス活性はまた、標的ｍＲＮＡおよび蛋白質の除去と関連性を保障するために蛋白質レベルで調査された。ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳの投与は、細胞培養培地でラットＴＮＦ−αの分泌を有意性を持って減少させることによって効果的なアンチセンス活性を確実にする。反対に、正常ファージゲノム化合物（アンチセンス挿入が無い一本鎖環状分子）ＤＮＡは、ＴＮＦ−α分泌を軽微に減少させただけである。対照群アンチセンス分子の添加によるＴＮＦ−α分泌の軽微な減少は、特にエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）内にある自由陽イオン性リポソームの細胞毒性によって説明できる。陽イオン性リポソームだけで処理された細胞は、リポソーム−アンチセンス分子複合体を有する細胞より低い生存率を示した。同様に、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの処理もＣＤＫ２発現の除去効果をもたらした。さらに、本発明の遺伝子特異的アンチセンス化合物をｃ−ｍｙｂおよびｃｄｋ２を含む腫瘍細胞株に投与した時、成長阻害を観察することができた。
【００３０】
伝統的なＡＳ−オリゴの細胞内流入は、陽イオン性リポソームと複合体を形成する時ずっと増加させられる。しかし、ＡＳ−オリゴが異った類型のリポソームと複合体を形成する時には、一貫しないで時々非効率的な細胞内流入が見られる。反対に、ファージゲノムアンチセンス分子は、その長い長さのために複数の短いステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成し、まるでプラスミドＤＮＡのように作用する。実際に、いくつかの異った類型のリポソームと複合体をなす時、アンチセンスＤＮＡは、一貫的であり増加された細胞内流入を示した。
合成ＡＳ−オリゴは、一般的に１５ないし２５個のヌクレオチド残基を持ち、一つの標的部位にだけ結合して基質ｍＲＮＡを除去する。しかし、大部分の慢性的な人間疾患等は、その疾患と関連する多様な遺伝子を標的にできるアンチセンス分子を必要とする複合的遺伝異常が見られる。そのような要求を満足させる為に複合的な標的化能力を持ったアンチセンス分子を考案することが望ましい。しかし、そのような分子を化学的に合成することは、化学合成時の多様な障害要因のために実用化が難しい。ファージゲノムＤＮＡを使用することによって、複合的なアンチセンス配列が遺伝子クローニングによってたやすく設計できる。さらに複合的なアンチセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡの配列完全度（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、バクテリア細胞で増幅されたプラスミドＤＮＡのものと同一である。
【００３１】
ファージゲノムアンチセンス分子が持つまた他の長所は、配列変化においての幅広い許容性がある。本発明のゲノムアンチセンス分子は、約１５個以上の連続的なヌクレオチドを持つ配列が、異なる遺伝子修飾間で保存される限り効果的である。このような特性は、同一なアンチセンス分子が変異型に対して使用できるＨＩＶおよびＨＢＶのような病原性ウイルスの多形性細胞株を標的にするのに特に有用である。そのうえ、人間のような一つの種から生産されるこのような類型のファージゲノムアンチセンス分子は、出処および標的生物間の配列ダイバージェンス（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）がコーディング配列にしたがって均等に分布していない限り、齧歯類のような異なる種で遺伝子の機能研究のために使用できる。
アンチセンス分子は、またいわゆる“ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）”アプローチ（ＤｅＢａｃｋｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９，２３５−２４１（２００１）；Ｊｉｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２２６６−２２６９（２００１））によって遺伝子の機能を研究するための効果的な手段になる。ノックダウンアプローチで、その遺伝子を破壊しないで遺伝子機能を明らかにできる。このような方法は、遺伝子機能を同定するために使用される伝統的な“ノックアウト” 方法よりもっと速い。本発明の実施例を見ると、ゲノムアンチセンス分子は、巨大機能的なゲノム学（ｍａｓｓｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ）に対して特に適切である。巨大機能的なゲノム学のためにファージゲノムアンチセンス化合物を利用するいくつかの顕著な特徴は１）複雑なアンチセンスデザインを必要としないアンチセンス構造、２）大きい個別膜クローンを持ったアンチセンスライブラリーの構造、３）部分的なアンチセンス活性によるデーターの誤訳を避けられるさらに優れたアンチセンス活性を持っているということである。
【００３２】
本発明の実施例を見ると、ファージゲノムアンチセンス方法を利用することによって、巨大機能的ゲノム学で使用されるそのシステムの効能が伝統的なＡＳ−オリゴ方法の効能より何百倍も優れている。それに、ＤＮＡチップ、遺伝子発現連続分析（ＳｅｒｉａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ）、ＴＩＧＲ定方向遺伝子整列（ＴＩＧＲＯｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓＧｅｎｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ，ＴＯＧＡ）データベース、およびプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）のような異なる間接的なシステムを使用することに反して、本発明のファージゲノムアンチセンスシステムを使用する巨大機能的ゲノム学は、直接的な遺伝子機能化システムを使用する。
【００３３】
バクテリオファージシステムからつくられた環状アンチセンス分子、特にＭ１３バクテリオファージシステムや適切なファージミドシステムからつくられた環状アンチセンス分子は、安定で、標的遺伝子の発現を防ぐのに有効である。ファージゲノムアンチセンス分子は、少ない量で有効であるが、また大量に調製できる。本発明のアンチセンス分子は、多様な類型の癌、ウイルス感染、免疫異常、代謝異常疾患、及び、さらに遺伝子発現を調節することによって疾患の開始および進行を抑制できる、他の人間疾患等に対する有効な治療薬である。
治療薬に適用される場合、大環状核酸分子は、経口、局所又は局在投与を含む多様な投与方法が考案可能である。テクニックおよび処方は、一般的に、レミントン薬学的科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔｅｄｉｔｉｏｎ）から探し出した。活性成分、つまりアンチセンス分子は、投与経路や剤形の本質にしたがって充填剤、膨脹剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、腐蝕させるポリマー（ｅｒｏｄａｂｌｅｐｏｌｙｍｅｒ）、または滑沢剤を含む稀釈賦形剤のような担体と結合して使用する。典型的な剤形は、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤および溶剤を含む液体調製物、顆粒剤、およびカプセル剤を含む。
【００３４】
本発明の大環状核酸化合物は、普遍的な薬物運搬状態下で約４時間まで、薬物維持形を運搬する時には、約１２時間まで胃の酸性環境に薬物の露出される場合の経口投与に特に適当である。特定の条件での治療のためには、アンチセンス化合物で維持形に処方することが有利なことがある。
大環状核酸分子の全身投与は、粘膜透過または経皮透過方法を通して可能である。また上記化合物を経口投与することもできる。粘膜透過または経皮透過の為には、障壁を透過するために適合な透過物が剤形に使用されなければならない。このような透過物は、一般的にその技術分野で知られているものが含まれ、例えば、粘膜透過のためには胆汁酸、フシディン酸（ｆｕｓｉｄｉｃａｃｉｄ）誘導体を含む。それに、界面活性剤が透過を促進するために使用される。粘膜透過投与は、例えば、吸入や座剤による投与に適切な形態だけではなく、鼻腔スプレーの使用を通してすることもできる。
【００３５】
本発明の大環状核酸分子は、また患者に投与するために薬学的に許容可能な担体と組合わせられる。薬学的に許容可能な担体の例としては、いくつかの種類の陽イオン性脂質、例えば、Ｎ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（Ｎ−（１−２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ）−ｎ，ｎ，ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＴＭＡ））およびジオレオイルホスホチディルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｐｈｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ））があるが、これらに限定されるものではない。リポソームもまた本発明のアンチセンス分子に適合な担体である。また異なる適合な担体は、本発明のアンチセンス分子を含む維持放出ゲルやポリマーである。
大環状核酸分子は、静脈投与、筋肉注射、硬膜投与、鼻腔投与、腹腔投与、腫瘍内投与、皮下注射、ｉｎｓｉｔｕ注入および経口投与を含む効果的な投与経路によって患者に投与できる。経口投与は、本発明のアンチセンス分子および類似体を胃腸管での分解から保護するための腸用コーティングが必要になることもある。大環状核酸分子は、生理的に許容可能な担体または生理食塩水や他の適当な溶液のような賦形剤と混合できる。アンチセンス分子は、また核酸分子またはその類似体がそれらの標的に到達するまで分解するのを防止したり、または組織障壁を透過するアンチセンス分子やその類似体の移動を促進させる他の担体手段等を組合わせることができる。
【００３６】
実施例を見ると、大環状核酸分子は、癌や新生物腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的な量で投与される。また、アンチセンス分子は、ウイルス感染を治療するのに使用できる。上記ウイルスは、疱疹、人間パピロマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘、単核細胞増加症（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、肝炎または呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）等があげられるが、これに限定されない。それに、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、原発性甲状腺低下症、ガラクトース血症、異常的ヘモグロビン、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病または肥満等のような代謝疾患を標的とすることができるが、これに限定されない。本発明のアンチセンス分子は、ショーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓＳｙｎｄｒｏｍｅ）、抗リン脂質症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫複合性疾患、紫斑病、ショーエンレイン−ヘノホ症候群（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫欠乏症候群、全身性紅斑性狼瘡、免疫欠乏、リューマチ等をあげられるが、これに限定されない免疫疾患のような他の疾患を治療するのに使用できる。
特定な大環状核酸分子の実質投与量は、疾患や感染の類型および段階、身体の異なる細胞に対するアンチセンス分子の毒性、細胞内流入速度、および核酸分子が投与される個体の重量および年齢等の要因に依存するであろう。患者のための効果的な用量は、細胞増殖を抑制するのに非効果的な量から効果的な量まで、アンチセンス分子の用量を増加させるのと同様な伝統的な方法によって確定され得る。疾患がある細胞に与えられる濃度は、約０．１ｎＭから約３０μＭの範囲であり、遺伝子発現を抑制するのに効果的で、分析できる表現型を見せる。癌や他の徴候の治療のためのアンチセンス分子の化学療法的適用において薬学的または薬動力学的パラメータを決定する方法は、従来技術として知られている。
【００３７】
大環状核酸分子は、少なくても望ましい効果を得るのに充分な時間、患者に投与される。効果的なレベルを維持するために一日に何回、毎日、または何日かの間隔を置いてアンチセンス核酸分子を投与する必要がある。癌細胞に対して、アンチセンス分子は、癌細胞がそれ以上検出されなくなる時まで、またはさらに治療するとしても数的に意味ある程度減少されない間または、細胞が手術や治療によって調節できる数に減少される時まで投与される。アンチセンス分子が投与される時間の長さは、癌細胞に対する特定分子の流入速度および細胞がその分子と反応をするために必要な時間のような要因に依存する。
【００３８】
次の実施例は、本発明を具体的に提示するが、これに限定されるものではない。
【００３９】
実施例
実施例１−物質および方法
１．細胞培養
単核細胞性マウス細胞株のＷＲＴ７／Ｐ２を使用した。人間細胞株のＴＨＰ−１、ＨＬ−６０（急性前骨髄細胞性白血病）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＨｅＬａ（頚部癌）およびＭＣＦ−７（乳癌）は、韓国細胞株銀行から得た（ＫＣＬＢ，韓国）。このような細胞株は、１０％加熱非活性化されたＦＢＳ（ＪＢＩ，韓国）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０またはＥＭＥＭ（ＪＢＩ，韓国）培地で維持させた。細胞は、３７℃ ＣＯ２（５％）インキュベータで培養され過成長を避けるように注意した。細胞は、リポフェクション一日前に新鮮な培地に交換され、本実験当日に０．４％トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇ）で細胞生存を検査した。
【００４０】
２．ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの誘導発現およびラットのＴＮＦ−αおよび人間ＮＦ−κＢをコード化する遺伝子のクローニング
ラットＴＮＦ−α発現は、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞からリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ，３０μｇ／ｍｌ）によって誘導された。細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）は、４８ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）の各ウェルに分注されＬＰＳで処理した。細胞は、ｍＲＮＡ量を調査するために望ましい時間に回収した。ＴＮＦ−α発現が最高に誘導されるためのＬＰＳインキュベーション時間は、他の実験から選択された。
ラットＴＮＦ−α ｃＤＮＡは、上で説明した通り増幅されたｃＤＮＡ切片から得た。全体コーディング配列を含むＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲ切片（７０８ｂｐ）は、一組のＰＣＲプライマーによって増幅された。：５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣ−３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１），および５−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２）。ラットＴＮＦ−α ｃＤＮＡ切片は、ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を利用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）ＫＳ（−）ベクターの複合成クローニング部位でクローニングされた（図１）。
同様に、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓａｎｄｃｄｋ２遺伝子のｃＤＮＡ切片は、一組のＰＣＲプライマーによって増幅された（表１）。その末端を緩慢にした後ｐＢＳ−ＫＳ（＋）ベクターのＥｃｏＲＶ部位でクローニングされた。増幅されたｃＤＮＡ切片は、常に制限素化およびＤＮＡ配列によって確認された。
【００４１】
３．ファージミドベクターおよびＭ１３ＫＯ７ヘルパーバクテリオファージを利用した大環状核酸分子の構成
（１）センスまたはアンチセンス配列を含んでいる一本鎖バクテリオファージゲノムの構成。標的遺伝子に特異的なアンチセンス領域を含む大環状核酸分子は、標準クローニング手順にしたがって構成された（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，１９８９）。感応（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ｃＤＮＡを持ったｐＢＳ−ＫＳ（＋）または（−）ファージミドを含む有能なバクテリア細胞（ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’）が、ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７（ＮＥＢＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，ＵＳＡ）で形質感染された。ファージミドベクターでクローニングされたｃＤＮＡの方向は、センスまたはアンチセンス配列を決定する。２０％ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ８０００）は、２×ＹＴで成長したヘルパーファージ感染細胞を夜通し培養した上澄み液に添加された。バクテリオファージ沈澱物は、ＴＥ（ｐＨ８．０）で再懸濁され、ファージゲノムＤＮＡは、フェノール抽出およびエタノール沈澱によって分離された。
【００４２】
（２）ファージゲノムアンチセンス分子の精製
ヘルパーバクテリオファージの残留ゲノムＤＮＡおよび宿主バクテリア細胞からファージゲノムアンチセンス分子の精製は、少ない量の精製に関しては、０．８％低い融点を持った（ｌｏｗｍｅｌｔｉｎｇ，ＬＭＰ）アガロースゲル、多い量の精製に関しては、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１．０×５０ｃｍ）で行った。ゲル濾過のためのカラム樹脂は、最高級セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）（登録商標）Ｓ−１０００（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｕｔｏｆｆ：２０，０００ｂｐ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）であり、０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．３）を含んだ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）され平衡が維持された。アンチセンス分子の初めの容量は５％ゲル空隙容量（ｇｅｌｖｏｉｄｖｏｌｕｍｅ）で調整して、ＤＮＡ溶出は、樹脂平衡化によって同じ緩衝液で行った（流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。試料は、デュアルＵＶ検出システムの２６０／２８０ｎｍでＵＶスキャンして溶出の間、５分毎に収集した。試料分画は、洗浄され７０％冷たいエタノールのによって沈澱され、次の実験のために蒸溜された超精製水およびＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で再懸濁された。精製されたアンチセンス分子は、１％アガロースゲルで定量して純度を検査した。対照群センス分子は、ベクターでｌａｃＺ遺伝子の反対方向にｐＢＳ−ＫＳ（＋）でクローニングされたＴＮＦ−ａｃＤＮＡ切片で構成される。一本鎖センスまたはアンチセンス分子は、配列化のためにＴ７プライマーを使用して配列を確認させた。ＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（ａｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で行った。
【００４３】
４．ファージゲノム環状アンチセンス分子の構造的な分析および安定性検査
アンチセンス分子は、一本鎖の環状であり安定であるという事実を、他の方法によって検査した。ＴＮＦ−αをコーディングする遺伝子に対するアンチセンス分子（１μｇ）は、３７℃で３時間ＸｈｏＩ（１０Ｕ／μｇＤＮＡ）、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（１６０Ｕ／μｇＤＮＡ）、またはＳ１ヌクレアーゼ（１０Ｕ／μｇＤＮＡ）で処理し、切断パターンだけではなく安定性研究のためにフェノール抽出、エタノール沈澱および１％アガロースゲルでゲル電気泳動（ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。
安定性検査のために、１μｇアンチセンス分子だけ、またはＤＮＡ：リポソームが約１：３（ｗ／ｗ）の比率でリポソーム複合体を形成した後、検査した。非加熱不活性化された３０％ＦＢＳ溶液がアンチセンス−リポソーム複合体に添加され４８時間の間、多様な時間週期で３７℃で培養した。ＦＢＳおよびヌクレアーゼで培養した後、アンチセンスＤＮＡは、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ１％アガロースゲルで電気泳動を行った。
環状アンチセンス分子（ＴＮＦ−αアンチセンス）および二重鎖プラスミドＤＮＡ（ＴＮＦ−α ｃＤＮＡ切片を含んだｐＢＳ−ＫＳ（−）ファージミド）の熱変性が１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２および１０ｍＭｓｏｄｉｕｍＰＩＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）の溶液で行なわれた。１０μｇ／ｍｌ（１０ｎＭ）のＤＮＡを９５℃に加熱して変性実験前に室温でゆっくり冷却されるようにした。次に温度は、０．５℃／３分の速度で上昇させた。融点の研究は、ペルチア温度調節器（ｐｅｌｔｉｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ））を備えたダイオード整列分光光度計で行った。
【００４４】
５．標的遺伝子転写物の検出
（１）リポソームと複合化されたアンチセンス分子のトランスフェクション（形質感染）
リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標））、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標））またはリポフェクタミンプラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（登録商標））（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）と同じ量の陽イオン性リポソームが、アンチセンス分子またはセンス対照群分子と混合された。このリポソーム−ＤＮＡ複合体は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）で混合され、その後製造業者が提案した方法にしたがって細胞に添加された。リポフェクションの細部事項を次に示す。つまり細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＰＲＭＩ１６４０またはＥＭＥＭ培地で培養し、リポフェクション３０分前にＯＰＴＩ−ＭＥＭで２回洗浄した。細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を４８−ウェルプレートに２００ｍｌずつ分注した。アンチセンス分子は、約１：３（ｗ／ｗ）の倍率で陽イオン性リポソームと混合され、形質転換によって細胞に添加された。細胞は、血清除去培地で３７℃、６時間培養した。リポフェクション後、２×ＦＢＳおよび抗生物質を培養培地に添加し３７℃で１８時間さらに培養した。ラットＴＮＦ−α発現は、ＬＰＳ（３０μｇ／ｍｌ）によって誘導された。細胞等は、ＲＮＡ調製の為に使用され、細胞上澄み液は、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏ−ＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）でＩＬ−１０の存在下で検査した。
【００４５】
（２）逆転写酵素−重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で転写の検出
ＲＮＡ調製は、製造業者に勧められた方法にしたがってトリ試薬（Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ＭＲＣ，ＵＳＡ））を利用して行った。上記５−１で形質感染された各ウェルから回収された細胞は、ＲＮＡ精製のために１ｍｌトリ試薬および２００ｍｌクロロホルムで混合された。精製されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ））を使用して５０μｌ反応容量でＲＴ−ＰＣＲを行った。精製されたＲＮＡ、一組のプライマー（Ｔａｂｌｅ２）、ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）、ＴｆｌＤＮＡ重合酵素（５Ｕ／μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ，１μｌ）およびＭｇＳＯ４（２５ｍＭ，２．５μｌ）をＰＣＲチューブに添加した。逆転写およびＰＣＲ反応は、熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ，ＵＫ））で連続的に行った。始めに合成されたｃＤＮＡの合成は、４８℃で４５分間実施され、続いてＤＮＡ増幅が９４℃で３０秒（変性）、５９℃で１分（加熱変性）、および６８℃で２分（重合）間、３０回の反復サイクルによって行われた。ＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲルで電気泳動を行って確認され、増幅されたＤＮＡの定量分析は、ゲル文章化プログラム（ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ，ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ１２２０（ＡｌｐｈａＩｎｎｏ−Ｔｅｃｈｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ））を行った。
【００４６】
（３）サザンブロット（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）
サザンブロットのためのプローブは、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｃａｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）オリゴ−標識および検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）によって調製された。ＲＴ−ＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲルで電気泳動した後、０．４ＭＮａＯＨ溶液でナイロン膜に移転された。ＴＮＦ−αの為のオリゴヌクレオチドプローブは、２２ｍｅｒ：５’−ＧＡＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧ−３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、およびＮＦ−κＢの為のオリゴヌクレオチドプローブは、２５ｍｅｒ５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４）であった。
【００４７】
１００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブがフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）、カコディルネイト緩衝液（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅｂｕｆｆｅｒ）および末端転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）で混合されＥＬＣ標識の為に３７℃で７０分間培養された。移転されたＤＮＡを持ったナイロン膜に対するプローブハイブリッドは、４２℃で１４時間の間６ｍｌハイブリッド緩衝液（５×ＳＳＣ，０．０２％ＳＤＳ）で行った。ナイロン膜は、４５℃で１５分間０．１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣで二回、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで一回洗浄した。その膜は、３０分間ＨＲＰ抗フルオレセイン接合抗体（ＨＲＰａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理した後、Ｘ線フィルムに露出される前、約５分間ＥＣＬ検出試薬で培養された。
（４）イライザ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）によるポリペプチドの検出
アンチセンス処理後、標的蛋白質の定量がイライザまたはウエスタンブロット方法によって調査された。イライザ分析の為に、細胞培養上澄み液が５０倍に稀釈されて、ＴＮＦ−αに対する抗体でコーティングされたイライザプレートに添加された。抗ＴＮＦ−αに対するビオチン化された２次抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙ）がイライザプレートの各ウェルに添加され、９０分間室温で培養された。三回の洗浄後、ストレプタビディン−ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が添加され、４５分間さらに培養された。そのプレートは、結合されないストレプタビディン−ペルオキシダーゼを除去するために４回洗浄され、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）が添加された。発色のために２０分間培養した後、吸光度４５０ｎｍで測定された。
【００４８】
ウエスタンブロットがＣＤＫ２の存在を調査するために行われた。全体蛋白質量は、細胞をアンチセンスまたはセンスＤＮＡで処理した後、ＢＣＡ（登録商標）蛋白質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）で決定した。２０ｇの蛋白質試料が１２％ポリアクリルアミドゲルに充填（ｌｏａｄ）され、電気泳動した。ゲル電気泳動後、蛋白質は、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に移転された。その膜が３％無脂肪牛乳および０．０５％ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含むＰＢＳで反応停止のために培養された。膜は、その後人間ＣＤＫ２に対するウサギの複合性クローニングＩｇＧ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）で培養された。２次性抗体の西洋わさびペルオキシダーゼ接合ドンキー抗ラビットＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｄｏｎｋｅｙａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｗｅｄｅｎ））が添加され、蛋白質バンドがＥＣＮキットを使用して視覚化された。
【００４９】
（５）細胞成長の抑制を決定する為のＭＴＴ分析
ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２に対するアンチセンス分子等は、ＭＴＴ分析を利用してその成長抑制効果を研究した。ＭＴＴ試薬は、３−［４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）である。Ｋ５６２、ＨＬ−６０、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞（６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで二回洗浄され５０μｌ体積で９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ウェルに分注された。リポフェクタミン２０００またはリポフェクタミンプラス（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）は、細胞内流入のために約１：３（ｗ／ｗ）の比率でアンチセンス分子と複合された。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭで５時間の間アンチセンス−リポソーム複合体と培養され、３７℃で５日間ＣＯ２（５％）培養器で維持された。
【００５０】
ＭＴＴ試薬は、５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳで稀釈し、１００ｍｇのＭＴＴ試薬が１００μｌの培養培地を含んでいる各ウェルに添加された。細胞は、３７℃で４時間の間ＣＯ２（５％）培養器で維持され、室温で１時間同一の量のイソプロパノール（０．１ＮＨＣｌを含有）で処理された。その後、細胞は、イライザリーダー（ＥＬＩＳＡｒｅａｄｅｒ，ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ））で吸光度５７０ｎｍで測定された。
【００５１】
実施例２実験方法および結果
組換えＭ１３バクテリオファージシステムを使用した大環状核酸化合物の構造
Ｍ１３バクテリオファージ（ファージ）の環状ファージゲノムがそのゲノムの部分としてアンチセンス配列を持つことができるのかを調査して新しいアンチセンス分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成形と関連した問題を克服できるかを調査する為に実験を行った。組換えのＭ１３ファージの生産が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ファージミドですでに修飾されたバクテリア細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させて行われた（Ｊｕｐｉｎｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２３，５３５−５３６（１９９５））。標的遺伝子に関するアンチセンスまたはセンス配列を含む一本鎖環状ファージゲノムを生産するためにファージミドのＦ１開始点（Ｆ１ｏｒｉｇｉｎ）を利用した。ラットＴＮＦａをコード化する遺伝子の場合、アンチセンス配列を生産するためにその遺伝子の全体ｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ベクターに配置された（図１）。一本鎖ゲノムＤＮＡにおいてアンチセンス配列は、Ｔ７配列化プライマーを利用したＤＮＡ配列によって確認された（図２）。ＴＮＦ−αアンチセンス挿入の５′および３′フランク配列（ｆｌａｎｋｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ファージミドベクターの配列であると現れた。挿入配列は、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの配列と関連するのでアンチセンス配列が存在することを証明した。ＴＮＦ−α、ＮＦ−ｋＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２に関するアンチセンス配列を含む環状ファージゲノムは、各各ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ、およびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳであると明らかになった。
【００５２】
２．ファージゲノムアンチセンスＤＮＡのカラムクロマトグラフィー精製
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを持ったラットＴＮＦ−αｃＤＮＡを含んだ組換えファージミドですでに修飾されたバクテリア細胞を感染させた後分離された。アンチセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡがファージミドシステムを使用して生産される時、一本鎖ＤＮＡは、少量のＭ１３ファージの二重鎖複製形やヘルパーファージから由来の野生型一本鎖ゲノムＤＮＡで混入される。それに、アンチセンス調製は、トランスフェクション効率を低めて細胞増殖に影響を与えられ得る高いレベルの混入リポポリサッカリド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）を含むものと知られている。アンチセンス配列を含むファージゲノムＤＮＡは、アガロースゲル精製方法を利用して少ない量で分離できる。
【００５３】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは、環状ファージゲノムアンチセンスＤＮＡの大規模精製のために検査された。セファクリルＳ−１０００最上級ゲルが５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３，０．２ＭＮａＣｌ）で平衡化され、アンチセンス試料（ゲル体積の５％）で充填された。カラムが平衡化緩衝液と同じ溶出緩衝液で溶出された時、主要なピークが７５分から１２０分の保持時間から得られた（図３Ａ）。ピークは、分画ＩからＶＩＩまで各分画に対する５また１０分の保持時間によって７分画に分けられた。各溶出分画は、アンチセンス鎖の精製量を確認するために１％アガロースゲルにローディングさせた（図３Ｂ）。野生型Ｍ１３バクテリオファージＤＮＡが主バンドとして分画ＩＩＩから探された（保持時間７５分）。分画ＩＶは、主バンドとして大環状アンチセンス分子を含んだ（保持時間８０分）。保持時間８０から１００分までを検出した分画を集めて、エタノールで沈澱させた。アンチセンス沈澱物は、その後、７０％冷エタノールで洗浄し、次の実験のために蒸溜水で再懸濁させた。大環状アンチセンス鎖は、６０％の回収率で得、アンチセンスの吸光度は、２６０／２８０比率で１．８以上であった。ＬＡＬ検査でＬＰＳを測定した時、アンチセンス分子は、大部分ＬＰＳによって混入されなかった。上記の事実から、クロマトグラフィー精製によって混入物の効果的な除去が行われたことが分かった。
【００５４】
３．ファージゲノムアンチセンスＤＮＡの構造的分析および安定性検査
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの環状構造およびヌクレアーゼに対する安定性に関して調査した。アンチセンス分子は、閉鎖された環状構造のためにエクソヌクレアーゼに対して安定であると予想された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがエンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理される時、アンチセンス分子は、ヌクレアーゼと３時間の培養後であってもほとんど損傷されないと知られている。反対に、ＸｈｏＩが組換えＭ１３ファージＤＮＡの二重鎖複製形に添加される時、ＤＮＡは、予想どうり制限酵素およびエクソヌクレアーゼＩＩＩの組換えによって完全に切断された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが一本鎖環状分子であるという事実は、Ｓ１ヌクレアーゼによってアンチセンス分子を完全に切断させることによって確認された（図４Ａ）。
ファージゲノムアンチセンス分子は、またそれらの構造的真偽（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が血清と培養した後、大きく保全された為に安定であると知られている。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが陽イオン性リポソームと結合した時、アンチセンス分子の大分画は、牛胎児血清（ＦＢＳ）で培養した後、損傷されていないまま残された。本当に、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、３０％ＦＢＳで２４時間培養した後でさえ損傷しなかった。上記の結果から、ファージゲノムアンチセンス分子がリポソームと複合体を形成することによって生体内（ｉｎｖｉｖｏ）適用の間もっと安定になることが分かった（図４Ｂ）。
【００５５】
一本鎖ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよびＴＮＦ−α挿入を含む二重鎖ファージミドＤＮＡは、また融点（Ｔｍ１／２）を測定することによって調査した。温度が漸進的に増加される時、二重鎖ファージミドＤＮＡに関して吸光度２６０ｎｍがモニターされる時、典型的な色彩変化が８７℃附近で検出された。しかし、ファージゲノムアンチセンス分子が融点によって調査した時、緩和な傾きの色彩変化が５４℃附近で検出され、これは短い細胞内分子デュプレックスを持つ領域が変性されたことを示すものである（図５）。上記の結果から、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが一本鎖であり環状分子であることが分かった。
【００５６】
４．ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳによるラットＴＮＦ−αｍＲＮＡの効果的で特異的除去
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性を検査した。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、非特異的アンチセンスファージミドベクター配列とラットＴＮＦ−αｍＲＮＡに特異的なアンチセンス領域を含む長いアンチセンス配列を含む。ファージゲノムアンチセンス分子が大量の非特異的配列を持っているという事実は、アンチセンス活性の標的特異性の徹底した分析を必要とする。ファージゲノムアンチセンス分子が標的遺伝子発現を除去する為に特異的に作用するかを調査するために、複合性対照群遺伝子がｍＲＮＡ除去のレベルを比較する為に利用された。
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの特異的活性を検討するために、０．５μｇ（１．４ｎＭ）のアンチセンス分子が１．５μｇの陽イオン性リポソームと複合され、１×１０５個の単核細胞株ＷＲＴ７／Ｐ２に添加された。その後細胞は、ＬＰＳ処理によってＴＮＦ−α発現が誘導された。細胞がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳで処理された時、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの誘導レベルは、有意性を持って減少した。反対に、細胞がＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−αのセンス鎖）またはＭ１３ＳＳ（アンチセンス挿入が無い一本鎖ファージゲノム）で処理された時、細胞は、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの大きな減少を見せなかった（図６Ａ）。ＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲバンドが増幅されたＤＮＡ切片の中間と結合されるプローブを利用してサザンブロットによって確認した（図６Ｂ）。
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）およびラクタマーゼ（Ａｍｐ）遺伝子のアンチセンス配列だけではなくラットＴＮＦ−αアンチセンス配列を含み、全体３．７ｋｂ一本鎖環状ゲノムを含んでいる。ＴＮＦ−α特異的アンチセンス領域は、約７０８塩基長さである。したがって、２０または３０個のヌクレオチドの伝統的な合成アンチセンス分子と比較する時、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでＴＮＦ−α特異的アンチセンス配列は、それ自体でとても長い。アンチセンス分子が長くなるほど配列特異性が減少すると一般的に信じられているため、これは意味がある。さらに、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性が本当に配列特異的であることを示すためにまた異なる実験を行った。
【００５７】
配列特異的アンチセンス活性を証明するために、三つの異なる遺伝子がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクション後、ｍＲＮＡレベルに関して調査された。三種類の遺伝子は、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびＩＬ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）である。これら遺伝子の発現は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクションによって影響を受けなかった（図６Ａ，Ｃ）。
アンチセンス活性でＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの容量応答がまた調査された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが０．０１μｇ（０．０３ｎＭ）の濃度で使用された時、ＴＮＦ−α発現がただ軽微に減少された。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）の濃度で、ＴＮＦ−α発現が部分的に除去された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの量が、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）に増加された時、ＴＮＦ−αｍＲＮＡは、ほとんど無いことが分かった（図６Ｄ）。これらの結果がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、伝統的に使用されるアンチセンス分子よりずっと少ない量を使用して標的ｍＲＮＡの除去のために効果的であることを示している。
【００５８】
５．ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２遺伝子に対するファージゲノムアンチセンス分子によるｍＲＮＡ発現の特異的除去
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの効能を観察する為に、他の遺伝子に特異的に向かうファージゲノムアンチセンス化合物はＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２と同じ他の遺伝子の発現を防ぐのかを調査する為に実験を行った。ＮＦ−κＢ（ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ）に対するアンチセンス化合物が有効なアンチセンス活性のためにＴＨＰ−１細胞から生産され検査した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳは、またリポソームと複合させる量を増加させながら細胞に添加した。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）のＮＦｋＢ−Ｍ１３ＡＳがＴＨＰ−１に添加された時、ＮＦ−κＢｍＲＮＡは、約７０％に減少した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの量が、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）および０．２μｇ（０．５６ｎＭ）に増加された時、ＮＦ−κＢｍＲＮＡは、約９０％以上が除去された。反面、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ（ＮＦκＢのセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡ）またはＭ１３ＳＳで処理された細胞は、ＮＦ−κＢ発現があまり影響を受けなかった（図７Ａ）。ＮＦ−κＢのＰＣＲで増幅されたバンドは、サザンブロットによってさらに信頼できる証明になった（図７Ｂ）。
【００５９】
０．４μｇ（１．１２ｎＭ）のｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳがＫ５６２細胞に添加された時、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡは、約８０％程度減少した。反面、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＳＥまたはＭ１３ＳＳで処理されたＫ５６２細胞では、ｃ−ｍｙｃ発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ａ）。０．２μｇ（０．５６ｎＭ）および０．４μｇ（１．１２ｎＭ）のｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳがＨＬ−６０細胞に添加された時、ｃ−ｍｙｂｍＲＮＡは、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥと比較して約７０％程度減少された。反面、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥで処理されたＨＬ−６０細胞では、発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ｂ）。
０．３μｇ（０．８４ｎＭ）のｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳがＨｅＬａ細胞に添加された時、ｋ−ｒａｓｍＲＮＡは、約８０％程度減少した。反面、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥまたはＭ１３ＳＳで処理されたＨｅＬａ細胞は、ｋ−ｒａｓ発現があまり影響を受けなかった（図８Ｃ）。
最後に、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）および０．２μｇ（０．５６ｎＭ）のｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳが、ＨｅＬａ細胞に添加された時、ｃｄｋ２ｍＲＮＡレベルがｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥと比較して各各約７０％および７５％程度減少した。ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの量が０．３μｇ（０．８４ｎＭ）に増加された時、内因性ｃｄｋ２ｍＲＮＡレベルが９０％以上除去された。反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥで処理されたＨｅＬａ細胞では、ｃｄｋ２発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ｄ）。
【００６０】
６．ＴＮＦ−αおよびＣＤＫ２活性の減少
標的遺伝子のｍＲＮＡがアンチセンス方法で除去される時、ｍＲＮＡの飜訳生産物は、作られることがない。標的遺伝子の減少または除去された蛋白質の確認は、したがって、アンチセンス分子によって起こる生理学的な効果を裏付けするのに必要である。蛋白質レベルは、細胞をアンチセンス分子で処理した後、二種類の方法で調査した。
ＷＲＴ７／Ｐ２細胞は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでリポフェクションされ、形質転換体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）から分泌されるＴＮＦ−αは、イライザ分析を利用して測定した。内因性ＴＮＦ−αｍＲＮＡの減少レベルと同様にＴＮＦ−α上澄み液がまたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ投与後９０％以上減少した（図９Ａ）。しかし、対照群アンチセンス分子のＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−α遺伝子のセンス鎖を含有）またはＭ１３ＳＳは、ＷＲＴ７／Ｐ２形質転換体でＴＮＦ−α発現を減少させなかった。この結果からＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがＴＮＦ−αｍＲＮＡの除去および形質転換体からＴＮＦ−αの連続する消滅に効果的であることが分かった。
【００６１】
ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの形質転換体でＣＤＫ２レベルをウエスタンブロットで調査した。ＨｅＬａ細胞は、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳまたはｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥで処理され、形質転換後４８時間が経過した後、上記細胞を利用して全体蛋白質を抽出した。分離された蛋白質は、定量の為にウエスタンブロット技術を利用して分析した。０．８ｎＭ（０．３μｇ／ｗｅｌｌ）の濃度でｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳがＣＤＫ２レベルを７０％以上減少させた反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥは、蛋白質の細胞レベルにいかなる影響も与えなかった（図９Ｂ）。この結果から、このファージゲノムアンチセンス分子が標的ｍＲＮＡの特異的除去と連続する形質転換体で標的蛋白質の消滅を導き効果的に機能することが分かった。
【００６２】
７．ファージゲノムアンチセンス方法による癌細胞の成長抑制
発癌遺伝子は、新生物腫瘍的変形（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および癌細胞の進行に関連する。発癌遺伝子がアンチセンス介入のための良い標的であるため、２個の重要な発癌遺伝子のｃ−ｍｙｂおよびｋ−ｒａｓの発現が、これらの遺伝子に特異的なファージゲノムアンチセンス分子によって特異的に遮断されたなら成長抑制が起きるかどうかを調査するために若干の腫瘍細胞株を検査した。また、ｃｄｋ２遺伝子発現がｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの投与に反応して遮断される為に腫瘍細胞に関する抑制効果を調査した。
ｋ−ｒａｓに対するファージゲノムアンチセンス分子がＭＣＦ−７（乳癌）細胞株に添加されｃ−ｍｙｂに対するアンチセンスがＫ５６２（慢性骨髄性白血病）またはＨＬ−６０（急性前骨髄細胞性白血病）細胞株に添加され、ｃｄｋ２に対するアンチセンス分子がＨｅＬａ（頚部癌）細胞株に添加された。各アンチセンス化合物に関するアンチセンス形質転換体が、その後ＭＴＴエッセイを利用して腫瘍細胞成長の抑制に関して調査した（図１０および１１）。
【００６３】
ｋ−ｒａｓに対するファージゲノムアンチセンス分子（ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ）がＭＣＦ−７細胞に添加される時、形質転換体は、０．１μｇ（０．５ｎＭ）および０．２μｇ（１ｎＭ）のアンチセンス濃度で細胞成長に関して７０％以上の抑制を示した。反面、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ（Ｒａｓ遺伝子のセンス対照群）は、０．５ｎＭアンチセンス濃度で約９％以下に抑制され、１ｎＭ濃度で約１５％以下に抑制され、最低の細胞成長抑制を示しただけである（図１０Ａ）。ＨｅＬａ細胞は、２ｎＭの濃度でｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳで処理された時、約７０％以上の成長抑制が観察された。反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（ｃｄｋ２遺伝子のセンス対照群）は、形質転換されたＨｅＬａ細胞の３０％以下の成長抑制を示した（図１０Ｂ）。
ｃ−ｍｙｂに対するアンチセンス分子は、０．５ｋｂ（ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１）および１．５ｋｂ（ｋ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２）の２個の異なる長さに構成された。白血病細胞株Ｋ５６２およびＨＬ−６０がｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１またはｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２で処理される時、これら細胞株において約６０％以上成長抑制が観察された（図１１）。反面、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ（対照センス分子）は、Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞の実質的どんな成長抑制も示さなかった。
【００６４】
ここで引用された全ての引例は、完全に引例として編入される。
本発明の範囲が、上記実施例に限定されるものではなく、本発明が属する技術分野に属する通常の知識を持つ者であれば、請求範囲に記載された本発明の保護範囲内で、多様な補完及び修飾が可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラットＴＮＦαのファージゲノム環状アンチセンス分子（ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ）の模式図である。
ラットＴＮＦαは、ｐＢＳ−ＫＳ（−）というファージミドベクターのマルチプル・クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）へクローニングされた。一本鎖センス分子は、ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にＴＮＦα挿入を位置させて得られる反面、アンチセンス分子は、ｌａｃＺ遺伝子と逆方向にＴＮＦα遺伝子を位置させて得られる。Ｍ１３Ｋ０７と同じヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ）と一緒に感染させると、このような構成物に存在するＴＮＦαの一本鎖アンチセンスやセンス分子が発現される。
【図２】図２は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのＤＮＡ配列を示した図である。
ＤＮＡ配列分析は、Ｔ３シークエンシングプライマー（Ｔ３ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｒｉｍｅｒ）を使用して、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでＴＮＦαアンチセンス配列を確認するために行った。センス配列は、ＴＮＦαに関するもので、右側に表示された矢印の下に示される。鋳型の実際のアンチセンス配列は、逆向きであり相補的である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ファージゲノムアンチセンス分子のクロマトグラフィー精製を示した図である。
Ａ．ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による環状アンチセンス分子に対する溶出状態（ｅｌｕｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ）。セファクリルＳ−１０００最上級（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）（１．０×５０ｃｍ）樹脂がＤＮＡ分画に使用された。溶出緩衝液は、０．２ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）で、流速は１分当り０．３ｍｌに設定された。各分画の試料用量は、７０μｇ（１ｍｇ／ｍｌで７０μｌ）に設定した。
Ｂ．ゲル濾過カラムクロマトグラフィーから得た分画の電気泳動パターン。レーン１、粗成物ＤＮＡ；レーン２〜８、保持時間に対応する分画Ｉ〜ＶＩＩ。精製されたＤＮＡは、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）染色で視覚化した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＴＮＦ−α配列を含むファージゲノムアンチセンス分子の生化学的な特性を示した図である。
Ａ．ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ分子の特性、
レーン１、λ−ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤＮＡサイズ・マーカー；レーン２、ＴＮＦ−αｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ＴＮＦα−ｐｌａｓｍｉｄ）；レーン３、ＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；レーン４、制限酵素ＸｈｏＩで処理したＴＮＦα−プラスミド；レーン５、制限酵素ＸｈｏＩで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；レーン６、Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＴＮＦα−プラスミド；レーン７、Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；レーン８、制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、エクソヌクレアーゼＩＩＩで処理したＴＮＦα−プラスミド；レーン９、制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、エクソヌクレアーゼＩＩＩで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ。ＴＮＦ−α−プラスミドまたはＴＮＦ−αＭ１３ＡＳは、製造業者によって特定される多様な酵素と共に反応を行った。
Ｂ．ＴＮＦ−αＭ１３ＡＳの安定性検査。ファージゲノムアンチセンス分子は、３０％牛胎児血清（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ，ＦＢＳ）で多様な時間間隔で反応させた。
レーン１〜８、異なる時間別に血清で処理した。レーン９は、正常群である。血清で処理したアンチセンス分子は、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）染色で視覚化した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよび二重鎖プラスミド分子の融点を示した図である。
吸光度は、温度が３０℃から９５℃に上がる間、３分間隔で０．５℃増加する度に測定した。
Ａ．ＴＮＦ−α挿入を含む二重鎖ファージミドのＴｍ１／２プロファイル。Ｂ．一本鎖環状アンチセンス分子のＴＮＦ−αＭ１３ＡＳのＴｍ１／２プロファイル。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞でＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルに対するＴＮＦ−αＭ１３ＡＳのアンチセンス活性を示す。
Ａ、Ｃ、およびＤで示した結果は、ＲＴ−ＰＣＲから得た。Ｂで示した結果は、サザンハイブリダイゼーションから得た。ＲＴ−ＰＣＲは、全体ＲＮＡを使って行った。細胞は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と複合されたＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ（１．４ｎＭ，１．６５ｇ／ｍｌ）で処理された。アンチセンス分子のリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）後、ＴＮＦ−αは、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞にＬＰＳ処理で誘導されその後、全体ＲＮＡが分離された。
Ａ．ＲＴ−ＰＣＲは、ＴＮＦ−αプライマーまたはβ−アクチンプライマーの２セットのプライマーで行った。ＰＣＲで確認した結果は、レーン１、リポソーム；レーン２、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ（アンチセンス）；レーン３、ＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（センス）；レーン４、Ｍ１３ＳＳ（アンチセンス挿入がないファージゲノムＤＮＡ）。
Ｂ．パネルＡのＤＮＡが、ナイロン膜に移転された２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドでプローブされた。
Ｃ．非特異的アンチセンスの効果を調査するために、ＩＬ−１βおよびＧＡＰＤＨがＲＴ−ＰＣＲで増幅された。全体ＲＮＡ量とアンチセンス化合物を含む一本鎖環状分子の量は、パネルＡと同じ。増幅ＰＣＲ分画は、１％アガロースゲルで電気泳動してエチジウムブロマイドで染色して視覚化した。
Ｄ．ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現に関するＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳの用量依存的な効果。レーン１、リポソーム；レーン２〜５、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ；レーン６、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＳＥ；およびレーン７、Ｍ１３ＳＳ。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＴＨＰ１細胞で人間ＮＦκＢｍＲＮＡレベルに関するＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの効果を示した図である。
ＴＨＰ１細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）は、異なる量のＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ、またはＭ１３ＳＳで感染させた。リポフェクション後細胞は、６時間の間ＰＭＡ（１６０ｎＭ）で刺激された。全体ＲＮＡが分離され、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
Ａ．ＮＦκＢのｍＲＮＡレベルは、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ処理によって用量依存的に減少した。レーン１の左側にある表示されないレーンは、分子量マーカー（１００ｂｐｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ）、レーン１、正常群；レーン２〜４、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．１４ｎＭ、０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）；レーン５〜６、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）；レーン７〜８、Ｍ１３ＳＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）；およびレーン９の右側にある表示されないレーンは、リポフェクタミン。
Ｂ．パネルＡでＤＮＡバンドは、ナイロン膜に転移され、サザンハイブリダイゼーションを行った。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、各各遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの効果を示した図である。
Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞は、各各ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳおよびｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子で感染させた。
Ａ．Ｋ５６２細胞でのＲＴ−ＰＣＲ結果。
レーン１〜２、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）；レーン３〜４、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）；およびレーン５、Ｍ１３ＳＳ（０．５６ｎＭ）。
Ｂ．ＨＬ−６０細胞でのＲＴ−ＰＣＲ結果。
レーン１〜２、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）；レーン３〜４、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）。
ＣおよびＤ．ヒーラ細胞（ＨｅＬａｃｅｌｌ）が各各異なる量のｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ分子で処理された。Ｃ．レーン１〜２、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．８４ｎＭ）；レーン３〜４、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）；レーン５〜６、Ｍ１３ＳＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）。
Ｄ．レーン１〜３、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（各各０．２８ｎＭ、０．５６ｎＭおよび０．８４ｎＭ）；レーン４〜６、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭ、０．５６ｎＭおよび０．８４ｎＭ）。増幅されたＰＣＲ分画は、１％アガロースゲルで電気泳動をしてエチジウムブロマイド染色で視覚化した。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ファージゲノムアンチセンス分子を投与することによるＴＮＦ−αおよびＣＤＫ２の発現減少を示した図である。
Ａ．培地から遊離されたＴＮＦ−αは、イライザ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定された。ＷＲＴ７／Ｐ２細胞は、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＳＥまたＭ１３ＳＳ（各各、レーン１〜３）で感染させた。ＴＮＦ−αは、６時間の間３０μｇ／ｍｌＬＰＳで誘導された。細胞培養の上澄み液は、分析直前に５０倍稀釈された。各各の値は、三回の実験に関する平均±標準偏差を示す。統計的有意性は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔで計算した（変動分析、＊ｐ＜０．０５）。
Ｂ．ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ分子の処理後、ＨｅＬａ細胞を使ってＣＤＫ２のサザンハイブリダイゼーション。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＭＣＦ−７およびＨｅＬａ細胞の増殖に対するファージゲノムアンチセンス分子の効果を示した図である。
ＭＴＴ分析を行い、各各ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳで処理された細胞の成長抑制を決定した。
Ａ．ＭＣＦ−７細胞は、１：３（ｗ／ｗ）の比率でリポフェクタミン２０００と複合された０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭのｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳで処理された。□、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ；網状四角、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ；斜線四角、リポソームがないｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ；および■、リポフェクタミン２０００。
Ｂ．ＨｅＬａ細胞は、リポフェクタミン２０００と複合されたｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）で処理された。カラム１、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）；カラム２、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（０．８４ｎＭ）；カラム３、リポソームがないｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ；および、カラム４、リポフェクタミン２０００。各値は、三回の実験の平均±標準偏差を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞の増殖に関するｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子の効果を示す。
ＭＴＴ分析を行いｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳによる成長抑制を調査した。二種類のｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子、並びに、各各０．５ｋｂや１．５ｋｂのｃ−ｍｙｂ配列を含むｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１およびｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２で構成された。Ｋ５６２（Ａ）およびＨＬ−６０（Ｂ）細胞は、リポフェクタミン２０００と複合されたｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）で処理された。
カラム１、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ０．５ｋｂ；カラム２、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１．５ｋｂ；カラム３、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ１．５ｋｂ；およびカラム４、リポソームがないｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１．５ｋｂ。各値は、三回の実験の平均±標準偏差を示す。
【配列表】

[0001]
Technical field
The present invention relates to the field of antisense technology. The present invention also relates to the use of antisense technology in therapeutic and gene function identification systems.
[0002]
Background art
Antisense molecules bind to the complementary sequence of mRNA according to Watson-Crick base pairing. Antisense oligonucleotides (AS-oligos) have been usefully utilized for gene functional studies by decreasing gene expression in a sequence-specific manner (Thompson et al. Nature, 314, 363-366 (1985)). Melani et al. Cancer Res., 51, 2897-2901 (1991); Anfossi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3379-3383 (1989)). In particular, many studies have been conducted to develop antisense anticancer agents that eliminate abnormal expression of genes associated with cancer initiation and progression (Kamano et al. Leuk. Res., 14, 831-839 (1990). Melotti et al. Blood, 87, 2221-2234 (1996); Ferrari et al. Cell growth Differ., 1, 543-548 (1990); Ratajczket et al., Blood, 79, 1992-1961; Blood, 74, 1517-1524 (1989); Thaler et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1352-1356 (1996); e, 372, 333-335, (1994)).
[0003]
Synthetic AS-oligos are widely used because of their ease of design and synthesis, as well as effective specificity for target genes. Antisense inhibitory action on gene expression is achieved by forming an antisense DNA-mRNA duplex and then being degraded by the activity of RNase H or sterically hindering the movement of mRNA bound to the ribosome complex. (Dolnick Cancer Invest., 9, 185-194 (1991)). Oligonucleotides have also been reported to suppress gene expression by forming a triple-helix structure in the promoter region of genomic DNA. In addition, duplex oligonucleotide attractants that compete with the promoter region of genomic DNA are also formed (Young et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10030-1000026, (1991)).
The efficacy of AS-oligo has been confirmed not only in several recent clinical studies, but also in animal models (Offensperger et al. EMBO J., 12, 1257-1262 (1993); Tomita et al. Hypertension, 26, 131-136, (1995); Nesterova et al. Nat. Ned., 1, 528-533, (1995); Rush Science, 276, 1192-1193 (1997)). In addition, the first antisense drug for CMV retinitis was approved in the United States and Europe.
[0004]
However, expectations for AS-oligos are sometimes disappointing because the results are not always obvious. In using AS-oligos, it is difficult to access the target site (Flanaga et al. Mol. Cell Biochem., 172, 213-225 (1997); Matsuda et al. Mol. Biol. Cell, 7, 1095-1106. (1996)), nuclease instability (Akhtar et al. Life Sci., 49, 1793-1801 (1991); Wagner et al. Science, 260, 1510-1513 (1993); Gryaznov et al. , 24, 1508-1514 (1996)), lack of sequence specificity and various in vivo side effects. The stability of AS-oligo was improved to some extent by using chemically modified oligos called so-called second generation AS-oligos (Helen Eur JCancer, 27 (11), 1466-71 (1991); Bayever et al. Antisense Res. Dev. 3 (4), 383-90 (1993); Baker et al. Biochim. Biophys. Acta., 1489, 3-18 (1999)). Phosphorothioate-oligo (PS-oligo) and methylphosphonate-oligo (MP-oligo) have been studied extensively and are mainly used to increase stability against nucleases Is done. However, the modified AS-oligo has less specificity for the base sequence of the gene, so there are doubts about the RNase H activity, and there is a problem when reusing the modified nucleotide that has been inappropriately introduced with a mutation during DNA replication or hydrolyzed. Can occur.
[0005]
A series of antisense molecules with increased stability, so-called third generation AS-oligos, are: 1) a stem-loop structure, 2) a CMAS (Covalently-closed Multiple Antisense) structure, and 3) RiAS ( Ribbon Antisense structure (Moon et al. Biochem J., 346, 295-303 (2000); Matsuda et al. Mol. Biol. Cell, 7, 1095-1106 (1996); Moon et al. Biochem J., 275 ( 7), 4647-53 (2000)). It can be seen that CMAS and RiAS-oligonucleotides have increased exonuclease and nuclease stability in biological fluids. This antisense molecule is also effectively used to specifically reduce target mRNA. However, there is a need for a technique for developing an antisense molecule that can more easily develop an antisense molecule and increase the binding efficiency.
Bacteriophages such as the M13 bacteriophage have single-stranded circular genomes that are used not only for mutation studies but also for DNA sequence analysis. The M13 plasmid can be used to produce large quantities of circular single-stranded genomic DNA containing antisense sequences for specific genes in plasmids utilized in the construction of recombinant bacteriophages. Such approaches for producing antisense DNA include stability against exonucleases associated with covalently closed structures, high sequence accuracy, elimination of difficult target site studies and antisense libraries. ) Has the advantage that the structure is easy.
[0006]
Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) is a normal immune response (Perkins et al. Arthritis Rheum., 41 (12), 2205-10 (1998)), septic shock (Camensch et al.,). J. Immunol., 162 (6), 3498-503 (1999)), and when overproduced, transplanted tissue versus host reaction (Hill et al. J. Immunol., 164 (2), 656-63). (2000)) are necessary cytokines. TNF-α is also a typical infectious cytokine and is closely associated with other immune abnormalities including inflammatory phenomena such as rheumatoid arthritis, allergy and sepsis (Perkins et al., Arthritis Rheum. , 41 (12), 2205-10 (1998)). TNF-α expression can be derived from the birch mononuclear cell line WRT7 / P2 treated with lipopolysaccharide (LPS).
[0007]
Nuclear factor κB (Nuclear factor κB, NF-κB) is a cytokine (Collins Lab Invest., 68, 499-508 (1993); Collins et al. FASEB J., 9, 899-909 (1995)) and attachment receptors. It regulates various genes related to the body (Thanos et al., Cell, 80, 529-532 (1995)). Activated NF-κB has been identified in macrophages, smooth muscle cells and endothelial cells of human arteriosclerotic tissues (Defilipi et al., Curr Top Microbiological Immunol., 184, 87-98 (1993)), inflammation and proliferation. It is thought to play an important role in the process (Brand et al., J Clin Invest., 97, 1715-1722 (1996)).
[0008]
The ras oncogene is well activated in human tumors (neoplasm). The RAS p21 protein is located inside the plasma membrane as part of a large family of GTP / GDP binding proteins. The point mutation of the ras gene cannot hydrolyze the bound GTP, so that it is unable to regulate cell growth by transmitting a signal into the cell and can produce RAS p21 protein (Alberts et al. Molecular biology of the cell., Garland). , New York, 1273-1290 (1994)).
The primary oncogene c-myb plays an important role in the proliferation and differentiation of hematopoietic cells. Hematopoietic cells show differential expression of c-myb and few genes for terminal differentiation are expressed (Melotti et al. Blood, 87, 2221-2234 (1996); Ferrari et al, Cell growth Differ., 1, 543-548 (1990)). The c-myb gene product can be seen to be overexpressed in leukemia cells (Melani et al., Cancer Res., 51, 2897-2901 (1991); Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3379-3383 (1989); Kamano et al., Leuk. Res., 14, 831-839 (1990)).
MYC oncoprotein plays an important role in tumor cell growth (Packham et al. Biochim. Biophys. Acta., 1242, 11-28 (1995); Henriksson et al., Adv. Cancer Res., 68, 109 -182 (1996)). MYC is sufficiently capable to induce resting cells to enter the cell cycle (Eilers et al., Nature, 340, 66-68 (1989)) and is required for continued cell growth. On the other hand, suppression of MYS can be induced such that cells are finally differentiated by suppressing the signal of cell division (Heikkila et al., Nature, 328, 445-448 (1987); Sawyers et al., Cell, 70, 901-910 (1992)).
[0009]
The main component of cell cycle regulatory genes is represented by protein kinases called cyclin-dependent kinases (CDKs). CDKs were discovered in the process of studying the molecular mechanisms that regulate progression from one stage of the cell cycle to the next (MorgenNature (Lond.), 374, 131-134 (1995)). CDKs are in an inactive state until they bind to a co-activator of individual cyclin proteins. When cells enter G1, CDK4 and CDK6 kinase activity appears to be essential due to progression through the early G1 checkpoint (Sherr Cell, 73, 1059-1065 (1993)), and CDK2-cyclin E complex It is essential that the body activity proceeds from G1 to the S group (Otsusubo et al. Mol. Cell. Biol., 15, 2612-2624 (1994)). Developing antisense oligonucleotides that are effective against CDK activity would be a good way to inhibit tumor cell growth. Therefore, there is a need for more specific, stable and competent antisense technology that can be used in a variety of human diseases.
[0010]
Summary of invention
The present invention overcomes the above-mentioned problems, and provides an antisense molecule, a composition of the antisense molecule, a method for producing the antisense molecule, and an advantage of suppressing the expression of the target gene or making a significant improvement. Methods of using antisense molecules and compositions that provide are provided. When target gene expression induces cancer, administration of the antisense molecule of the present invention to cells removes the target RNA and treats the cancer by inhibiting cell growth, or at least prolongs survival. It is done.
[0011]
The present invention is not limited to treating cancer. The therapeutic principle of antisense compounds of the present invention can be applied to remove certain target RNAs. Antisense therapy shows as a result of antisense therapy all phenotypic expression of the above-mentioned chemical activity that appears when treating cancer such as removing viral infections or treating metabolic and immunological diseases and the like.
The present invention further provides a composition of antisense molecules comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
The present invention relates to a macrocyclic nucleic acid molecule comprising a target-specific antisense region. The antisense molecules that bind specifically to the RNA portion expressed from the gene are effective in reducing the expression of the gene. A macrocyclic nucleic acid molecule has a length of at least about 3,000 nucleotides, and the antisense region of the molecule is at least about 50 nucleotides in length, preferably at least about 100 nucleotides. Has a nucleotide length. In addition, the antisense region is substantially complementary to the entire gene sequence.
[0012]
In an embodiment of the invention, the large circular nucleic acid molecule is a single stranded form of the same phagemid genome as a recombinant bacteriophage or filamentous phage and in particular phage M13.
In another example, a vector comprising a large circular nucleic acid molecule as described above is provided. The vector is derived from a filamentous phage. In yet another embodiment, a host cell comprising the vector is provided.
The present invention also relates to a composition comprising a macrocyclic nucleic acid molecule comprising a target-specific antisense region that specifically binds to a specific portion of RNA expressed from a gene, and a pharmaceutically acceptable carrier. The above antisense molecules are effective in reducing the expression of the above genes.
[0013]
In yet another embodiment, a method is provided that can suppress the expression of a selected protein by a macrocyclic nucleic acid molecule that targets RNA encoding the selected protein. The method consists of a nucleic acid molecule targeting RNA and the nucleic acid molecule hybridizes with RNA to form a duplex with RNA, wherein the duplex suppresses the expression of the selected protein. The target protein can induce cell proliferation and cancer. Examples of the cancer include, but are not limited to, leukemia, lung cancer, liver cancer, colon cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, brain cancer, prostate cancer, cervical cancer, and breast cancer. In particular, the cancer is leukemia, cervical cancer or breast cancer.
[0014]
The target protein is tumor necrosis factor, nuclear factor, MYB, MYC, RAS, cell division kinase, or the like. If the target protein is a viral protein, the virus can be herpes, human papilloma virus (HPV), HIV, small pox, mononucleosis (Epstein-Barr virus), hepatitis or Examples thereof include respiratory syncytial virus (RSV), but are not limited thereto.
Target proteins cause metabolic diseases and immune abnormalities. Examples of metabolic diseases include, but are not limited to, phenylketonuria, primary hypothyroidism, galactosemia, abnormal hemoglobin, type I and type II diabetes or obesity. The immune abnormalities include Sjogren's Syndrome, antiphospholipid syndrome, immune complex disease, purpura, Schonlein-Henoch syndrome, immune deficiency syndrome, systemic erythematous Examples include, but are not limited to, lupus, immune deficiency, rheumatism, kidney or cirrhosis.
The present invention also provides a chimeric macrocyclic nucleic acid molecule comprising a target-specific antisense region that specifically binds to a plurality of target RNAs expressed from a plurality of target genes. The nucleic acid molecule is effective in reducing the expression of the gene. Further provided is a composition comprising a chimeric macrocyclic nucleic acid molecule and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0015]
The present invention also relates to a method of suppressing the expression of a number of selective proteins by a macrocyclic nucleic acid molecule that targets a plurality of RNA molecules that encode a plurality of selected proteins. Producing a chimeric large circular nucleic acid molecule comprising a target-specific antisense region targeted to a plurality of target RNAs, 2) targeting a large number of RNAs and hybridizing a large number of chimeric large circular nucleic acid molecules with the above RNA Forming a duplex that reduces the expression of the selected protein.
Furthermore, the present invention relates to a method for inhibiting cell proliferation.
When a macrocyclic nucleic acid molecule containing one or more antisense regions that are substantially complementary to one or more target genes is administered to a cell, expression of the gene is suppressed and cell proliferation is suppressed.
Seeing examples, it relates to a method for producing a macrocyclic nucleic acid molecule containing a target-specific antisense region that suppresses the expression of a selected protein. 1) Insert a target-specific DNA into a phage or phagemid genome. 2) a step in which a phage produces a single-stranded macrocyclic nucleic acid molecule, and 3) a step of separating the macrocyclic nucleic acid molecule by a gel filtration column.
[0016]
The present invention also relates to a method for screening the function of a gene, a) producing a large circular nucleic acid molecule containing an antisense region substantially complementary to RNA expressed from a cell, b) When the cell contacts the macrocyclic nucleic acid molecule, the antisense molecule enters the cell and hybridizes with the RNA expressed in the cell to suppress the expression of the gene product. C) Analyzing the cell for various phenotypes It consists of stages.
Steps a) to c) in the above method can be applied to the library of macrocyclic nucleic acid molecules described above. Moreover, in that method, the nucleic acid molecule is a single-stranded form of a recombinant bacteriophage or phagemid genome.
[0017]
Detailed Description of the Invention
The present invention is based on the discovery that macrocyclic nucleic acid molecules containing target-specific antisense regions, particularly target-specific antisense regions produced from bacteriophage, are useful as effective gene expression removers. .
As used herein, “antisense” refers to antisense nucleic acids (DNA or RNA) and analogs thereof, and antisense refers to a polynucleotide target sequence or sequence portion through a hydrogen bond interaction with the nucleotide base of the target sequence. A series of chemical species with a series of recognized nucleotide sequences. The target sequence is single-stranded or double-stranded RNA or single-stranded or double-stranded DNA.
[0018]
Such RNA and DNA analogs include 2'-O-alkyl sugar modifications, methylphosphonates, phosphorothioates, phosphorodithioates, formacetals. (Formacetal), 3′-thioformacetal (3′-thioformacetal), sulfone, sulfamate, and nitroxide backbone modifications, amides and similar base modifications Although it is comprised by a body, it is not limited to this. In addition, the molecular analog can be a polymer in which a portion of the sugar is modified or replaced by an appropriate portion that is different, such as a morpholine analog and peptide nucleic acid, PNA. ) Including, but not limited to, analogs. Such analogs include the modifications and sugars mentioned above associated with the linking group to improve RNase H-mediated destruction of target RNA, binding affinity, nuclease resistance and target specificity. And various combinations of structural modifications of bases.
[0019]
As used herein, “antisense therapy” refers to a macrocycle comprising an antisense segment associated with a target gene in order to inactivate a target DNA or RNA sequence that is not desired in vitro or in vivo. A general term that includes the specific binding of nucleic acid molecules.
As used herein, “cell proliferation” means cell division. The term “growth” means an increased number of cells due to fast cell division and slow apoptosis or cell death. Unregulated cell growth is an indicator for cancer and abnormal cell growth. Cells that are normal and not cancer cells divide regularly according to the common characteristics of certain types of cells. When a cell metastasizes to a cancerous state, the cell divides and proliferates in a non-regulated manner. Inhibition of proliferation and growth regulates abnormal cell division.
[0020]
As used herein, “chimeric macrocycle nucleic acid molecule” means a macrocycle nucleic acid molecule comprising a plurality of antisense nucleotide segments that are substantially complementary to a large number of target genes. Antisense molecule segments can be linked to each other either directly between each segment or indirectly using a spacer.
[0021]
As used herein, “filamentous phage” is a vehicle for producing the large circular nucleic acid molecules of the present invention. Phage or phagemid can be used. For example, when a single strand is produced by a phage or phagemid, the target sequence is inserted or cloned into the vehicle so that a large circular nucleic acid single strand is produced. DNA and RNA bacteriophages can be used for such purposes. In particular, filamentous bacteriophages can be used. Filamentous phages such as M13, fd and f1 have a fibrous capsid with a circular ssDNA molecule. These life cycles are associated with dsDNA intermediate mediator replicative forms in cells that are converted to ssDNA molecules prior to encapsidation. Such conversion provides a means for producing ssDNA. Bacteriophage M13 has been adopted for use as a cloning vector.
As used herein, “gene” refers to a complete nucleotide sequence gene or a partial sequence gene.
As used herein, “suppression” or “reduction” refers to reducing gene expression, cell proliferation, or other phenotypic characteristics, and these are used together.
In the present specification, a “macrocyclic nucleic acid molecule” is also referred to as a “macrocyclic antisense molecule”, but is a single-stranded molecule that is substantially complementary and binds to a target gene or RNA sequence. However, it contains one or more antisense regions, and suppresses or reduces the expression of genes as well as isoforms. A circular single-stranded nucleic acid molecule contains a sense or antisense sequence for one or more genes as long as the sequence for the target gene is antisense.
[0022]
Macrocyclic nucleic acid molecules can be synthesized by chemical methods. However, it is typically produced from a filamentous phage system containing phagemids derived from M13 and M13. When a large circular nucleic acid molecule is produced from a phage, it is called a “phage genomic antisense compound”.
[0023]
In some cases, large circular nucleic acid molecules are even longer than typical oligonucleotide sequences of about 20-30 nucleotides in length. Conversely, a large circular nucleic acid molecule can be at least 3,000 nucleotides in length. Typically the range is about 3,000 to 8,000 nucleotides in length. Even though about 3100 to 7000 nucleotides are useful in the present invention, a further desirable length range is about 3300 to 6000 bases.
[0024]
The length of a large circular nucleic acid molecule need not have an absolutely higher or lower limit. This is especially true when phage are used to produce large circular nucleic acid molecules. The length of the single-stranded nucleic acid produced can be controlled by the size of the phage encoding at least a portion of the target gene and the size of the insertion. Thus, as one example, the nucleic acid molecule can be made long enough to accommodate a phage, eg, a filamentous phage.
Macrocyclic nucleic acid molecules can include specific antisense sequences as well as foreign sequences. Exogenous sequences can include sense or antisense forms of a variety of different genes. Also, if the phage is used to produce a nucleic acid molecule, the foreign sequence must be a vector sequence. The length of the target-specific antisense region of a macrocyclic nucleic acid molecule is not limited, ranging from even shorter than about 100 nucleotides to more than about 5000 bases. Typically, the range is about 200 to about 3000, and desirably the range is about 400 to 2000. The target specific antisense region is also complementary to the entire gene.
As yet another example, antisense molecules are produced from bacteriophage genomes as part of the normal life cycle of phage.
[0025]
In the present specification, “substantially complementary” means an antisense sequence having about 80% homology with an antisense compound that is complementary and specifically binds to a target RNA. As a general problem, absolute complementarity is not required.
Any antisense molecule with sufficient complementarity to form a stable duplex or triplex with the target nucleic acid would be suitable. Stable duplex formation depends on the sequence and length of the hybridized antisense molecule and the degree of complementarity between the antisense molecule and the target sequence. The system can be maintained.
As used herein, “target” or “targeting” refers to a particular individual gene that allows an antisense molecule to be made. As an example of the present invention, antisense molecules are made from the insertion of LC-antisense compounds. “Targeting” in some sentences means that the antisense molecule is bound to an endogenously expressed transcript so that the expression of the target gene is removed. Target nucleic acid sequences include a variety of malignancies including genes associated with the initiation and progression of various diseases such as immune diseases, infectious diseases, metabolic diseases and genetic diseases, or other diseases caused by abnormal gene expression It can be selected from genes associated with tumors.
[0026]
The antisense molecules of the present invention are superior to traditional synthetic AS-oligos in biochemical and biological activity. Although traditional AS-oligos are easily synthesized by DNA synthesizers, they require selection of the target site. The target site selection process is sometimes also referred to as AS-oligo design. This process is time consuming and sometimes can not be concluded. In addition, the synthesized AS-oligo is unstable to nucleases, prone to many sequence errors, requires high production costs and exhibits low intracellular influx even after complexing with liposomes.
In an embodiment of the present invention, a single-stranded circular genomic DNA produced from a bacteriophage used in an antisense vector is provided. In particular, the bacteriophage used is M13 phage or a modified form of M13 phage. However, bacteriophages or plasmids, viruses or other cloning mediators that produce single stranded nucleic acids can also be used. More desirably, the single stranded nucleic acid produced is circular. DNA molecules that produce antisense molecules are cloned from the genome of a mediator such as a bacteriophage.
[0027]
In the antisense research field, traditionally known knowledge has been avoided to use long antisense molecules. This is because longer AS-oligos are specifically lacking, are more difficult to synthesize, and tend to be inefficient in cellular entry. In fact, second-generation AS-oligos that were chemically modified, such as phosphorothioate-modified oligos, had less sequence specificity as the AS-oligo was longer. In addition, the synthesis of linear AS-oligos becomes progressively more difficult and the sequence fidelity decreases noticeably as the AS-oligo length increases.
Phage vectors can easily produce long single-stranded sequences containing antisense sequences with high sequence fidelity. The antisense molecules of the present invention showed excellent sequence specificity to eliminate target mRNA expression even though they were longer than before. Without relying on the unique theory or mechanism of action of antisense nucleic acids, once a small portion of the antisense sequence binds to a complementary sequence, the sequence specificity of the antisense sequence with respect to the total length of the complementary target sequence Sex (zips). The long duplex formed between the antisense DNA and sense RNA then remains much more stable as a substrate for RNase H activity.
[0028]
A different basis for the advantageous binding of the antisense molecules of the present invention is that the longer antisense molecules are more likely to bind to structurally exposed target sites. mRNA tends to form extensive secondary and tertiary structures within its own sequence and by interacting with RNA binding proteins in the cytoplasm of the cell. Searching for open target sites for antisense molecules is essential for successful antisense activity. With a long length, the phage genome antisense molecule must have a sequence that can approach the exposed complementary sequence of the target mRNA, thus increasing the likelihood of removing the target mRNA.
[0029]
The principle of the antisense molecule of the present invention is to be applied to the target gene of interest. For example, TNF-α, NFκB, c-myb, c-myc, cdk2 and k-ras have been provided as examples utilizing the antisense molecules of the present invention, but the antisense molecules of the present invention may be of any purpose. It can also be produced for genes. In fact, the antisense molecules of the present invention are more stable against nucleases to some degree and are effective for target removal. The sequence-specific reduction of the exemplified TNF-α, NFκB, c-myb, c-myc, cdk2 and k-ras target genes confirms the widespread use of this antisense method. Thus, the antisense molecules of the invention can be used to bind to target mRNA sequences that come from certain sources.
Antisense activity was also investigated at the protein level to ensure relevance and removal of target mRNA and protein. Administration of TNF-α-M13AS ensures effective antisense activity by significantly reducing rat TNF-α secretion in cell culture media. In contrast, normal phage genomic compound (single-stranded circular molecule without antisense insertion) DNA only slightly reduced TNF-α secretion. The slight decrease in TNF-α secretion due to the addition of the control antisense molecule can be explained by the cytotoxicity of free cationic liposomes, especially within the endosome. Cells treated with only cationic liposomes showed a lower survival rate than cells with liposome-antisense molecule complexes. Similarly, treatment with cdk2-M13AS also resulted in CDK2 expression removal effects. Furthermore, when the gene-specific antisense compound of the present invention was administered to a tumor cell line containing c-myb and cdk2, growth inhibition could be observed.
[0030]
The intracellular entry of traditional AS-oligo is increased all the time when complexed with cationic liposomes. However, when AS-oligos are complexed with different types of liposomes, there are inconsistent and sometimes inefficient intracellular influx. Conversely, phage genome antisense molecules form multiple short stem-loop structures due to their long length, acting like plasmid DNA. Indeed, when complexed with several different types of liposomes, antisense DNA showed a consistent and increased intracellular flux.
Synthetic AS-oligos generally have 15 to 25 nucleotide residues and bind to only one target site to remove substrate mRNA. However, most chronic human diseases have complex genetic abnormalities that require antisense molecules that can target a variety of genes associated with the disease. In order to satisfy such requirements, it is desirable to devise antisense molecules with multiple targeting capabilities. However, chemically synthesizing such molecules is difficult to put into practical use due to various obstacles during chemical synthesis. By using phage genomic DNA, complex antisense sequences can be easily designed by gene cloning. Furthermore, the sequence integrity of phage genomic DNA with complex antisense sequences is identical to that of plasmid DNA amplified in bacterial cells.
[0031]
Another advantage of phage genome antisense molecules is their wide tolerance in sequence variation. The genomic antisense molecules of the present invention are effective as long as sequences with about 15 or more contiguous nucleotides are conserved between different genetic modifications. Such properties are particularly useful to target polymorphic cell lines of pathogenic viruses such as HIV and HBV where the same antisense molecule can be used against the mutant form. Moreover, this type of phage genome antisense molecule produced from one species, such as humans, can be expressed as long as the sequence divergence between source and target organisms is not evenly distributed according to the coding sequence. It can be used for functional study of genes in different species such as teeth.
Antisense molecules are also known as the “knockdown” approach (De Backer et al. Nat. Biotechnol., 19, 235-241 (2001); Ji et al. Science, 293, 2266-2269 (2001)). Makes it an effective tool for studying gene function. A knockdown approach can reveal gene function without destroying the gene. Such a method is much faster than the traditional “knockout” method used to identify gene function. Looking at the embodiments of the present invention, genomic antisense molecules are particularly suitable for massive functional genomics. Some notable features of using phage genomic antisense compounds for large functional genomics are: 1) antisense structure that does not require complex antisense design, 2) antisense with large individual membrane clones The structure of the library 3) It has a superior antisense activity that can avoid mistranslation of data due to partial antisense activity.
[0032]
Looking at the examples of the present invention, by utilizing the phage genome antisense method, the efficacy of the system used in giant functional genomics is hundreds of times better than that of the traditional AS-oligo method. . It also uses different indirect systems such as DNA chips, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), TIGR Oriented Gene Alignment (TOGA) database, and proteomics. In contrast, macrofunctional genomics using the phage genome antisense system of the present invention uses a direct gene functionalization system.
[0033]
Circular antisense molecules made from bacteriophage systems, in particular circular antisense molecules made from M13 bacteriophage systems and appropriate phagemid systems, are stable and effective in preventing target gene expression. Phage genomic antisense molecules are effective in small quantities, but can also be prepared in large quantities. The antisense molecule of the present invention is effective against various types of cancers, viral infections, immune disorders, metabolic disorders, and other human diseases that can suppress the initiation and progression of the disease by regulating gene expression. Remedy.
When applied to therapeutic agents, various administration methods can be devised for macrocyclic nucleic acid molecules, including oral, topical or localized administration. Techniques and formulations were generally sought from Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Latest edition. The active ingredient, i.e. the antisense molecule, contains a filler, a swelling agent, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, an erodable polymer, or a lubricant, depending on the route of administration and the nature of the dosage form. Used in combination with a carrier such as a diluent excipient. Typical dosage forms include tablets, powders, suspensions, liquid preparations including emulsions and solvents, granules, and capsules.
[0034]
The macrocyclic nucleic acid compounds of the present invention are particularly useful for oral administration when the drug is exposed to the acidic environment of the stomach for up to about 12 hours when transporting the drug maintenance form under universal drug delivery conditions, up to about 4 hours. Is appropriate. For treatment in certain conditions, it may be advantageous to formulate a maintenance form with an antisense compound.
Systemic administration of macrocyclic nucleic acid molecules can be through mucosal permeation or transdermal permeation methods. Moreover, the said compound can also be administered orally. For mucosal or percutaneous penetration, a suitable permeate must be used in the dosage form to penetrate the barrier. Such permeates include those generally known in the art, including, for example, bile acids, fusidic acid derivatives for mucosal permeation. In addition, surfactants are used to facilitate permeation. Mucosal permeation can be accomplished, for example, through the use of nasal sprays as well as in forms suitable for administration by inhalation or suppository.
[0035]
The macrocyclic nucleic acid molecules of the invention are also combined with a pharmaceutically acceptable carrier for administration to a patient. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include several types of cationic lipids, such as N- (1-2,3-dioleoxy) propyl) -n, n, n-trimethylammonium chloride (N- (1-2,3-dioleoyloxy) propyl) -n, n, n-trimethylammonium chloride (DOTMA)) and dioleoylphosphotydylethanolamine (DOPE)), but are not limited thereto. is not. Liposomes are also suitable carriers for the antisense molecules of the present invention. Another suitable carrier is a sustained release gel or polymer containing the antisense molecule of the present invention.
Macrocyclic nucleic acid molecules can be administered to patients by effective routes of administration including intravenous administration, intramuscular injection, dural administration, nasal administration, intraperitoneal administration, intratumoral administration, subcutaneous injection, in situ infusion and oral administration. Oral administration may require an intestinal coating to protect the antisense molecules and analogs of the invention from degradation in the gastrointestinal tract. The macrocyclic nucleic acid molecule can be mixed with a physiologically acceptable carrier or excipient such as saline or other suitable solution. Antisense molecules also prevent other nucleic acid molecules or their analogs from degrading until they reach their target, or other carrier means that facilitate the movement of antisense molecules and their analogs across tissue barriers Etc. can be combined.
[0036]
By way of example, macrocyclic nucleic acid molecules are administered in an amount effective to inhibit the growth of cancer and neoplastic tumor cells. Antisense molecules can also be used to treat viral infections. Examples of the virus include herpes zoster, human papilloma virus (HPV), HIV, smallpox, mononuclear cell hyperplasia (Epstein-Barr virus), hepatitis or respiratory syncytium virus (RSV). It is not limited to this. Additionally, metabolic diseases such as phenylketonuria (PKU), primary hypothyroidism, galactosemia, abnormal hemoglobin, type I and type II diabetes or obesity can be targeted, but not limited to Not. Antisense molecules of the present invention include Sjogren's Syndrome, antiphospholipid syndrome, immune complex disease, purpura, Schoenlein-Henoch syndrome, immune deficiency It can be used to treat other diseases such as, but not limited to, syndrome, systemic lupus erythematosus, immune deficiency, rheumatism and the like.
The substantial dose of a particular macrocyclic nucleic acid molecule includes the type and stage of the disease or infection, the toxicity of the antisense molecule to different cells of the body, the rate of intracellular entry, and the weight and age of the individual to whom the nucleic acid molecule is administered. It will depend on the factors. Effective doses for a patient can be determined by traditional methods similar to increasing doses of antisense molecules from ineffective to effective amounts to inhibit cell proliferation. Concentrations given to cells with disease range from about 0.1 nM to about 30 μM, which is effective in suppressing gene expression and exhibits an analyzable phenotype. Methods for determining pharmacological or pharmacokinetic parameters in chemotherapeutic applications of antisense molecules for the treatment of cancer and other symptoms are known in the prior art.
[0037]
The macrocyclic nucleic acid molecule is administered to the patient for a time sufficient to obtain at least the desired effect. In order to maintain an effective level, it is necessary to administer antisense nucleic acid molecules several times a day, daily, or at intervals of several days. For cancer cells, antisense molecules are reduced until no more cancer cells can be detected, or while they are not further reduced numerically to some degree, even if they are further treated, or to a number that the cells can regulate by surgery or treatment. Until the last hour. The length of time that an antisense molecule is administered depends on factors such as the influx rate of a particular molecule into the cancer cell and the time required for the cell to react with that molecule.
[0038]
The following examples specifically illustrate the present invention, but are not limited thereto.
[0039]
Example
Example 1 Materials and Methods
1. Cell culture
The mononuclear mouse cell line WRT7 / P2 was used. Human cell lines THP-1, HL-60 (acute promyelocytic leukemia), K562 (chronic myelogenous leukemia), HeLa (cervical cancer) and MCF-7 (breast cancer) were obtained from the Korea Cell Line Bank ( KCLB, Korea). Such cell lines were grown in RPMI 1640 or EMEM (JBI, Korea) medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS (JBI, Korea), 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Maintained. The cells were cultured in a 37 ° C. CO 2 (5%) incubator, taking care to avoid overgrowth. Cells were replaced with fresh medium one day prior to lipofection and the cell viability was examined on the day of the experiment with 0.4% trypan blue staining.
[0040]
2. Inducible expression of TNF-α mRNA and cloning of genes encoding rat TNF-α and human NF-κB
Rat TNF-α expression was induced from WRT7 / P2 cells by lipopolysaccharide (lipopolysaccharide, LPS, 30 μg / ml). Cells (1 × 10 5 cells / well) were dispensed into each well of a 48-well plate and treated with LPS. Cells were harvested at the desired time to investigate mRNA levels. The LPS incubation time for maximal induction of TNF-α expression was selected from other experiments.
Rat TNF-α cDNA was obtained from cDNA sections amplified as described above. A TNF-α RT-PCR section (708 bp) containing the entire coding sequence was amplified by a set of PCR primers. 5′-GATCGTCGACGATGAGCACAGAAAGCATGATCC-3 ′ (SEQ ID NO: 1), and 5-GATCGAATTCGTCACAGAGCAATGAACTCCAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 2). The rat TNF-α cDNA section was cloned at the complex cloning site of the pBluescript (pBS) KS (−) vector using SalI and EcoRI restriction sites in the same orientation as the lacZ gene (FIG. 1).
Similarly, cDNA sections of NF-κB, c-myb, c-myc, k-ras and cdk2 genes were amplified by a set of PCR primers (Table 1). It was cloned at the EcoRV site of the pBS-KS (+) vector after slowing down its ends. Amplified cDNA sections were always confirmed by restriction digestion and DNA sequencing.
[0041]
3. Construction of large circular nucleic acid molecule using phagemid vector and M13KO7 helper bacteriophage
(1) Construction of a single-stranded bacteriophage genome containing a sense or antisense sequence. A macrocyclic nucleic acid molecule containing an antisense region specific for the target gene was constructed according to standard cloning procedures (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989). Competent bacterial cells (XL-1 Blue MRF ′) containing pBS-KS (+) or (−) phagemid with competent cDNA are transfected with helper bacteriophage M13K07 (NEB Nucleic Acids, USA) It was done. The orientation of the cDNA cloned in the phagemid vector determines the sense or antisense sequence. 20% polyethylene glycol (Polyethylene Glycol, PEG 8000) was added to the supernatant obtained by overnight culture of helper phage-infected cells grown in 2 × YT. The bacteriophage precipitate was resuspended with TE (pH 8.0) and the phage genomic DNA was separated by phenol extraction and ethanol precipitation.
[0042]
(2) Purification of phage genome antisense molecules
Purification of phage genomic antisense molecules from residual genomic DNA of helper bacteriophage and host bacterial cells, low-melting (LMP) agarose gel, large amount of purification for small amounts of purification Was performed by gel filtration column chromatography (1.0 × 50 cm). The column resin for gel filtration is the highest grade Sephacryl® S-1000 (molecular cutoff: 20,000 bp) (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden), 0.2M NaCl (pH 8.3). The solution was packaged with a 50 mM Tris-HCl buffer solution and the equilibrium was maintained. The initial volume of antisense molecules was adjusted with 5% gel void volume and DNA elution was performed in the same buffer by resin equilibration (flow rate: 0.3 ml / min). Samples were collected every 5 minutes during elution by UV scanning at 260/280 nm in a dual UV detection system. Sample fractions were washed and precipitated with 70% cold ethanol and resuspended in distilled ultrapure water and PBS (phosphate buffered saline) for the next experiment. Purified antisense molecules were quantified on a 1% agarose gel and tested for purity. The control group sense molecule consists of a TNF-a cDNA section cloned in vector with pBS-KS (+) in the opposite direction of the lacZ gene. Single stranded sense or antisense molecules were sequenced using T7 primers for sequencing. The DNA sequence was performed with an automated DNA sequencer.
[0043]
4). Structural analysis and stability testing of phage genome circular antisense molecules
The fact that the antisense molecule is single-stranded circular and stable was examined by other methods. Antisense molecules (1 μg) against the gene encoding TNF-α were treated with XhoI (10 U / μg DNA), exonuclease III (160 U / μg DNA), or S1 nuclease (10 U / μg DNA) at 37 ° C. for 3 hours. Then, gel electrophoresis was performed on phenol extraction, ethanol precipitation and 1% agarose gel for stability studies as well as cleavage patterns.
For stability testing, 1 μg antisense molecule alone or DNA: liposomes were formed after forming liposome complexes in a ratio of about 1: 3 (w / w). Non-heat-inactivated 30% FBS solution was added to the antisense-liposome complex and incubated at 37 ° C. for various time periods for 48 hours. After culturing with FBS and nuclease, the antisense DNA was extracted with chloroform, precipitated with ethanol, and electrophoresed on a 1% agarose gel.
Thermal denaturation of circular antisense molecules (TNF-α antisense) and double-stranded plasmid DNA (pBS-KS (−) phagemid containing TNF-α cDNA sections) was performed with 100 mM NaCl, 10

mM MgCl

2 and 10 mM sodium PIPES (Sigma, USA). 10 μg / ml (10 nM) of DNA was heated to 95 ° C. to allow it to cool slowly at room temperature before denaturation experiments. The temperature was then increased at a rate of 0.5 ° C./3 minutes. Melting point studies were performed on a diode-aligned spectrophotometer equipped with a Peltier temperature controller (Hewlett Packard, USA).
[0044]
5. Target gene transcript detection
(1) Transfection of antisense molecules complexed with liposomes (plasma infection)
The same amount of cationic liposomes as Lipofectamine (Lipofectamine®), Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000®) or Lipofectamine Plus (Lipofectamine Plus®) (Life Technologies, USA) Mixed with sense or sense control molecules. The liposome-DNA complex was mixed with OPTI-MEM (Life Technologies, USA) and then added to the cells according to the method suggested by the manufacturer. Details of lipofection are as follows. That is, the cells were cultured in PRMI 1640 or EMEM medium supplemented with 10% FBS, and washed twice with OPTI-MEM 30 minutes before lipofection. 200 ml of cells (1 × 10 5 cells / well) were dispensed into 48-well plates. Antisense molecules were mixed with cationic liposomes at a magnification of about 1: 3 (w / w) and added to the cells by transformation. The cells were cultured at 37 ° C. for 6 hours in a serum removal medium. After lipofection, 2 × FBS and antibiotics were added to the culture medium and further cultured at 37 ° C. for 18 hours. Rat TNF-α expression was induced by LPS (30 μg / ml). Cells and the like were used for RNA preparation, and the cell supernatant was examined by ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) in the presence of IL-10.
[0045]
(2) Detection of transcription by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)
RNA preparation was performed using a Tri reagent (Trireagent (registered trademark) (MRC, USA)) according to a method recommended by the manufacturer. Cells collected from each well transfected with 5-1 above were mixed with 1 ml avian reagent and 200 ml chloroform for RNA purification. The purified RNA was subjected to RT-PCR using a RT-PCR kit (Access® RT-PCR kit (Promega, USA)) in a 50 μl reaction volume. Purified RNA, a set of primers (Table 2), AMV reverse transcriptase (5 U / μl), Tfl DNA polymerase (5 U / μl), dNTP (10 mM, 1 μl) and MgSO4 (25 mM, 2.5 μl) Was added to the PCR tube. Reverse transcription and PCR reactions were performed continuously with a thermal cycler (Hybaid, UK). Initially synthesized cDNA was synthesized at 48 ° C. for 45 minutes, followed by DNA amplification at 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 59 ° C. for 1 minute (heat denaturation), and 68 ° C. for 2 minutes (polymerization). ) For 30 repeated cycles. The PCR product was confirmed by electrophoresis on a 1% agarose gel, and quantitative analysis of the amplified DNA was performed using a gel documentation program (Alpha Imager 1220 (Alpha Inno-Tech Corporation, USA)). It was.
[0046]
(3) Southern blotting
Probes for Southern blots were prepared by enhanced chemical luminescence (ECL) oligo-labeling and detection system (Amersham Life Science, UK). The RT-PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel and then transferred to a nylon membrane with 0.4 M NaOH solution. The oligonucleotide probe for TNF-α is 22mer: 5′-GATGAGAGGGAGCCCATTTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 3), and the oligonucleotide probe for NF-κB is 25mer 5′-CTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCACCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
[0047]
100 pmol of oligonucleotide probe is mixed with fluorescein-11-dUTP (fluorescein-11-dUTP), cacodylate buffer and terminal transferases and incubated at 37 ° C. for 70 minutes for ELC labeling It was done. Probe hybrids to nylon membranes with transferred DNA were performed in 6 ml hybrid buffer (5 × SSC, 0.02% SDS) at 42 ° C. for 14 hours. The nylon membrane was washed twice with 5 × SSC containing 0.1% SDS for 15 minutes at 45 ° C. and once with 1 × SSC containing 0.1% SDS. The membrane was incubated with an ECL detection reagent for about 5 minutes after being treated with HRP anti-fluorescein conjugated antibody for 30 minutes before being exposed to X-ray film.
(4) Detection of polypeptides by ELISA or Western blotting
After antisense treatment, target protein quantification was investigated by Eliza or Western blot methods. For ELISA analysis, cell culture supernatant was diluted 50-fold and added to an ELISA plate coated with an antibody against TNF-α. Biotinylated secondary antibody against anti-TNF-α was added to each well of the ELISA plate and incubated for 90 minutes at room temperature. After three washes, streptavidin-peroxidase was added and further incubated for 45 minutes. The plate was washed 4 times to remove unbound streptavidin-peroxidase and chromogen was added. After incubation for 20 minutes for color development, the absorbance was measured at 450 nm.
[0048]
A Western blot was performed to investigate the presence of CDK2. Total protein mass was determined with BCA® protein analysis kit (Pierce, USA) after treating cells with antisense or sense DNA. A 20 g protein sample was loaded onto a 12% polyacrylamide gel and electrophoresed. After gel electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad, USA). The membrane was incubated to stop the reaction in PBS containing 3% non-fat milk and 0.05% Tween-20. Membranes were then cultured with rabbit complex cloning IgG antibodies against human CDK2 (Santa Cruz biotechnology, USA). A secondary antibody horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (Amersham Life science, Sweden)) was added, and the protein band was visualized using an ECN kit.
[0049]
(5) MTT analysis to determine cell growth inhibition
Antisense molecules for c-myb, k-ras and cdk2 were studied for their growth inhibitory effects using MTT analysis. The MTT reagent is 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (Sigma, USA). K562, HL-60, HeLa and MCF-7 cells (6 × 10 4 cells / ml) were washed twice with OPTI-MEM and dispensed into each well of a 96-well plate in a 50 μl volume. Lipofectamine 2000 or Lipofectamine plus (Life Technologies, USA) was complexed with antisense molecules at a ratio of about 1: 3 (w / w) for intracellular entry. Cells were cultured with antisense-liposome complexes in OPTI-MEM containing 10% FBS (HyClone, USA) for 5 hours and maintained in a CO2 (5%) incubator at 37 ° C for 5 days.
[0050]
MTT reagent was diluted with PBS to a concentration of 5 μg / ml and 100 mg of MTT reagent was added to each well containing 100 μl of culture medium. Cells were maintained in a CO2 (5%) incubator for 4 hours at 37 ° C. and treated with the same amount of isopropanol (containing 0.1 N HCl) for 1 hour at room temperature. The cells were then measured at an absorbance of 570 nm with an Eliza reader (ELISA reader, SpectraMAX 190 (Molecular devices, USA)).
[0051]
Example 2 Experimental method and results
Structure of macrocyclic nucleic acid compounds using recombinant M13 bacteriophage system
Investigate whether the circular phage genome of the M13 bacteriophage (phage) can have an antisense sequence as part of its genome to see if new antisense molecules can overcome the problems associated with synthetic forms of antisense oligonucleotides An experiment was conducted to investigate. Production of recombinant M13 phage was performed by infecting bacterial cells already modified with pBluescript KS (-) phagemid with M13K07 helper phage (Jupin et al. Nucleic Acid Res., 23, 535-536 ( 1995)). The phagemid F1 origin was used to produce a single-stranded circular phage genome containing an antisense or sense sequence for the target gene. In the case of the gene encoding rat TNFa, the entire cDNA of the gene was placed in the pBluescriptKS (−) vector to produce the antisense sequence (FIG. 1). In the single-stranded genomic DNA, the antisense sequence was confirmed by the DNA sequence using the T7 sequencing primer (FIG. 2). The 5 'and 3' flank sequences of the TNF-α antisense insert appeared to be the sequence of the phagemid vector. The insertion sequence was related to that of TNF-α mRNA, thus demonstrating the presence of the antisense sequence. Circular phage genomes containing antisense sequences for TNF-α, NF-kB, c-myb, c-myc, k-ras and cdk2 are represented by each TNFα-M13AS, NFκB-M13AS, c-myb-M13AS, c- Myc-M13AS, k-ras-M13AS, and cdk2-M13AS were revealed.
[0052]
2. Column chromatography purification of phage genomic antisense DNA
TNFα-M13AS was isolated after infecting bacterial cells already modified with a recombinant phagemid containing rat TNF-α cDNA with M13K07 helper phage. When phage genomic DNA with an antisense sequence is produced using the phagemid system, the single-stranded DNA is a small amount of double-stranded replicative form of M13 phage or wild-type single-stranded genomic DNA derived from helper phage. Mixed in. In addition, antisense preparations are known to contain high levels of contaminating lipopolysaccharides (LPS) that can reduce transfection efficiency and affect cell growth. Phage genomic DNA containing antisense sequences can be separated in small quantities using agarose gel purification methods.
[0053]
Gel filtration column chromatography was examined for large-scale purification of circular phage genomic antisense DNA. Sephacryl S-1000 superlative gel was equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3, 0.2 M NaCl) and filled with antisense sample (5% of gel volume). When the column was eluted with the same elution buffer as the equilibration buffer, a major peak was obtained from a retention time of 75 to 120 minutes (FIG. 3A). The peak was divided into 7 fractions from fractions I to VII with a retention time of 5 or 10 minutes for each fraction. Each elution fraction was loaded onto a 1% agarose gel to confirm the purified amount of the antisense strand (FIG. 3B). Wild type M13 bacteriophage DNA was probed from fraction III as the main band (retention time 75 minutes). Fraction IV contained a macrocyclic antisense molecule as the main band (retention time 80 minutes). Fractions with a retention time of 80 to 100 minutes were collected and precipitated with ethanol. The antisense precipitate was then washed with 70% cold ethanol and resuspended in distilled water for the next experiment. The macrocyclic antisense strand was obtained with a recovery rate of 60%, and the absorbance of the antisense was 1.8 or more at a 260/280 ratio. When measuring LPS in the LAL test, the antisense molecules were largely not contaminated by LPS. From the above facts, it was found that effective removal of contaminants was achieved by chromatographic purification.
[0054]
3. Structural analysis and stability testing of phage genomic antisense DNA
TNFα-M13AS was investigated for its cyclic structure and stability to nuclease. The antisense molecule was expected to be stable to exonuclease due to the closed circular structure. When TNFα-M13AS is treated with endonuclease XhoI and exonuclease III, antisense molecules are known to be hardly damaged even after 3 hours of incubation with nuclease. Conversely, when XhoI was added to the double-stranded replicative form of recombinant M13 phage DNA, the DNA was completely cleaved by restriction enzyme and exonuclease III recombination as expected. The fact that TNFα-M13AS is a single-stranded circular molecule was confirmed by completely cleaving the antisense molecule with S1 nuclease (FIG. 4A).
Phage genomic antisense molecules are also known to be stable because their structural integrity is greatly conserved after incubation with serum. When TNFα-M13AS was associated with cationic liposomes, a large fraction of the antisense molecule was left intact after incubation with fetal bovine serum (FBS). Indeed, TNFα-M13AS was not damaged even after 24 hours of incubation with 30% FBS. The above results showed that the phage genome antisense molecules became more stable during in vivo application by forming a complex with liposomes (FIG. 4B).
[0055]
Double-stranded phagemid DNA containing single-stranded TNFα-M13AS and TNF-α insertions was also investigated by measuring the melting point (Tm1 / 2). When the temperature was gradually increased, a typical color change was detected around 87 ° C. when the absorbance at 260 nm was monitored for double-stranded phagemid DNA. However, when the phage genome antisense molecules were investigated by melting point, a moderate slope color change was detected around 54 ° C., indicating that regions with short intracellular molecular duplexes were denatured (FIG. 5). From the above results, it was found that TNFα-M13AS is a single chain and a cyclic molecule.
[0056]
4). Effective and specific removal of rat TNF-α mRNA by TNFα-M13AS
The antisense activity of TNFα-M13AS was examined. TNFα-M13AS contains a long antisense sequence containing a non-specific antisense phagemid vector sequence and an antisense region specific for rat TNF-α mRNA. The fact that phage genome antisense molecules have large amounts of non-specific sequences requires thorough analysis of the target specificity of the antisense activity. In order to investigate whether phage genome antisense molecules act specifically to eliminate target gene expression, a composite control gene was used to compare the level of mRNA removal.
To study the specific activity of TNFα-M13AS, 0.5 μg (1.4 nM) of antisense molecules were complexed with 1.5 μg of cationic liposomes and 1 × 10 5 mononuclear cell lines WRT7 / Added to P2. The cells were then induced to express TNF-α by LPS treatment. When cells were treated with TNFα-M13AS, the induction level of TNF-α mRNA decreased significantly. Conversely, when cells were treated with TNFα-M13SE (sense strand of TNF-α) or M13SS (single-stranded phage genome without antisense insertion), the cells did not show a significant decrease in TNF-α mRNA. (FIG. 6A). The RT-PCR band of TNF-α was confirmed by Southern blot using a probe bound to the middle of the amplified DNA section (FIG. 6B).
TNFα-M13AS contains not only the antisense sequences of the β-galactosidase (LacZ) and lactamase (Amp) genes, but also the rat TNF-α antisense sequence, and contains the entire 3.7 kb single-stranded circular genome. The TNF-α specific antisense region is about 708 bases long. Thus, when compared to traditional synthetic antisense molecules of 20 or 30 nucleotides, the TNF-α specific antisense sequence in TNFα-M13AS is very long in itself. This makes sense because it is generally believed that the longer the antisense molecule, the less sequence specificity. In addition, different experiments were performed to show that the antisense activity of TNFα-M13AS is indeed sequence specific.
[0057]
In order to demonstrate sequence specific antisense activity, three different genes were investigated for mRNA levels after lipofection of TNFα-M13AS. The three types of genes are β-actin, GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), and IL-1 (interleukin-1). The expression of these genes was not affected by lipofection of TNFα-M13AS (FIGS. 6A, C).
The capacitive response of TNFα-M13AS with antisense activity was also investigated. When TNFα-M13AS was used at a concentration of 0.01 μg (0.03 nM), TNF-α expression was only slightly reduced. At a concentration of 0.05 μg (0.14 nM), TNF-α expression was partially removed. When the amount of TNFα-M13AS was increased to 0.1 μg (0.28 nM), it was found that there was almost no TNF-α mRNA (FIG. 6D). These results indicate that TNFα-M13AS is effective for target mRNA removal using much lower amounts than traditionally used antisense molecules.
[0058]
5. Specific removal of mRNA expression by phage genome antisense molecules against NF-κB, c-myc, c-myb, k-ras and cdk2 genes
In order to observe the efficacy of TNFα-M13AS, the phage genome antisense compounds specifically directed to other genes are capable of expressing the same other genes as NF-κB, c-myc, c-myb, k-ras and cdk2. An experiment was conducted to investigate whether to prevent it. Antisense compounds against NF-κB (NFκB-M13AS) were produced and tested from THP-1 cells for effective antisense activity. NFκB-M13AS was also added to the cells in increasing amounts to be complexed with the liposomes. When 0.05 μg (0.14 nM) of NFkB-M13AS was added to THP-1, NF-κB mRNA was reduced to approximately 70%. When the amount of NFκB-M13AS was increased to 0.1 μg (0.28 nM) and 0.2 μg (0.56 nM), approximately 90% or more of NF-κB mRNA was removed. On the other hand, cells treated with NFκB-M13SE (phage genomic DNA with NFκB sense sequence) or M13SS were not significantly affected by NF-κB expression (FIG. 7A). The band amplified by PCR of NF-κB proved more reliable by Southern blot (FIG. 7B).
[0059]
When 0.4 μg (1.12 nM) of c-myc-M13AS was added to K562 cells, c-myc mRNA was reduced by about 80%. On the other hand, c-myc expression was not substantially affected in K562 cells treated with c-myc-M13SE or M13SS (FIG. 8A). When 0.2 [mu] g (0.56 nM) and 0.4 [mu] g (1.12 nM) of c-myb-M13AS were added to HL-60 cells, c-myb mRNA was approximately equal to c-myb-M13SE. It was reduced by about 70%. On the other hand, expression was not substantially affected in HL-60 cells treated with c-myb-M13SE (FIG. 8B).
When 0.3 μg (0.84 nM) of k-ras-M13AS was added to HeLa cells, k-ras mRNA was reduced by about 80%. In contrast, HeLa cells treated with k-ras-M13SE or M13SS were not significantly affected by k-ras expression (FIG. 8C).
Finally, when 0.1 μg (0.28 nM) and 0.2 μg (0.56 nM) cdk2-M13AS were added to HeLa cells, the cdk2 mRNA levels were about 70% each and compared to cdk2-M13SE and It decreased by about 75%. When the amount of cdk2-M13AS was increased to 0.3 μg (0.84 nM), endogenous cdk2 mRNA levels were removed by over 90%. On the other hand, cdk2 expression was not substantially affected in HeLa cells treated with cdk2-M13SE (FIG. 8D).
[0060]
6). Decreased TNF-α and CDK2 activity
When target gene mRNA is removed by antisense methods, no translated product of mRNA is produced. Confirmation of the reduced or removed protein of the target gene is therefore necessary to support the physiological effects caused by the antisense molecule. Protein levels were investigated in two ways after cells were treated with antisense molecules.
WRT7 / P2 cells were lipofected with TNFα-M13AS, and TNF-α secreted from transformants was measured using Eliza analysis. Similar to the decreased level of endogenous TNF-α mRNA, the TNF-α supernatant was also reduced by more than 90% after TNFα-M13AS administration (FIG. 9A). However, the control antisense molecule TNFα-M13SE (containing the sense strand of the TNF-α gene) or M13SS did not reduce TNF-α expression in WRT7 / P2 transformants. From this result, it was found that TNFα-M13AS is effective in removing TNF-α mRNA and continuously eliminating TNF-α from the transformant.
[0061]
CDK2 levels in cdk2-M13AS transformants were examined by Western blot. HeLa cells were treated with cdk2-M13AS or cdk2-M13SE, and after 48 hours from the transformation, whole proteins were extracted using the cells. The separated protein was analyzed using Western blot technology for quantification. While cdk2-M13AS reduced CDK2 levels by 70% or more at a concentration of 0.8 nM (0.3 μg / well), cdk2-M13SE had no effect on the cellular level of the protein (FIG. 9B). From this result, it was found that this phage genome antisense molecule functions effectively by leading to the disappearance of the target protein in a transformant continuous with specific removal of the target mRNA.
[0062]
7). Growth inhibition of cancer cells by phage genome antisense method
Oncogenes are associated with neoplastic neoplastic transformation and cancer cell progression. Since oncogenes are good targets for antisense intervention, the expression of two important oncogenes, c-myb and k-ras, are specifically expressed by phage genome antisense molecules specific for these genes. Some tumor cell lines were examined to see if growth inhibition would occur if blocked. Moreover, since the cdk2 gene expression was blocked in response to administration of cdk2-M13AS, the inhibitory effect on tumor cells was investigated.
Phage genomic antisense molecule against k-ras was added to MCF-7 (breast cancer) cell line and antisense to c-myb was added to K562 (chronic myeloid leukemia) or HL-60 (acute promyelocytic leukemia) cell line In addition, an antisense molecule against cdk2 was added to the HeLa (cervical cancer) cell line. Antisense transformants for each antisense compound were then investigated for inhibition of tumor cell growth using the MTT essay (FIGS. 10 and 11).
[0063]
When phage genomic antisense molecules against k-ras (k-ras-M13AS) are added to MCF-7 cells, transformants are 0.1 μg (0.5 nM) and 0.2 μg (1 nM) antisense. Concentration showed over 70% inhibition on cell growth. On the other hand, k-ras-M13SE (Ras gene sense control group) is suppressed to about 9% or less at 0.5 nM antisense concentration, and suppressed to about 15% or less at 1 nM concentration, showing the lowest cell growth suppression. Only (FIG. 10A). When HeLa cells were treated with cdk2-M13AS at a concentration of 2 nM, growth suppression of about 70% or more was observed. On the other hand, cdk2-M13SE (cdk2 gene sense control group) showed growth inhibition of 30% or less of transformed HeLa cells (FIG. 10B).
Antisense molecules against c-myb were composed of two different lengths of 0.5 kb (c-myb-M13AS1) and 1.5 kb (k-myb-M13AS2). When the leukemia cell lines K562 and HL-60 were treated with c-myb-M13AS1 or c-myb-M13AS2, growth inhibition of about 60% or more was observed in these cell lines (FIG. 11). In contrast, c-myb-M13SE (control sense molecule) did not show virtually any growth inhibition of K562 and HL-60 cells.
[0064]
All references cited herein are fully incorporated by reference.
The scope of the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various persons within the protection scope of the present invention described in the claims may be used by those who have ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs. Supplementation and modification would be possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a rat TNFα phage genome circular antisense molecule (TNFα-M13AS).
Rat TNFα was cloned into a multiple cloning site of a phagemid vector called pBS-KS (−). A single-stranded sense molecule is obtained by positioning the TNFα insertion in the same direction as the lacZ gene, whereas an antisense molecule is obtained by positioning the TNFα gene in the opposite direction to the lacZ gene. When infected with the same helper phage as M13K07, single-stranded antisense and sense molecules of TNFα present in such constructs are expressed.
FIG. 2 is a view showing a DNA sequence of TNFα-M13AS.
DNA sequence analysis was performed to confirm the TNFα antisense sequence with TNFα-M13AS using T3 sequencing primers. The sense sequence relates to TNFα and is shown below the arrow displayed on the right. The actual antisense sequence of the template is reverse and complementary.
FIGS. 3A and 3B show chromatographic purification of phage genomic antisense molecules.
A. Elution profile for circular antisense molecules by gel filtration column chromatography. Sephacryl S-1000 superfine (1.0 × 50 cm) resin was used for DNA fractionation. The elution buffer was 50 mM Tris-HCl (pH 8.3) containing 0.2 M NaCl, and the flow rate was set to 0.3 ml per minute. The sample dose for each fraction was set to 70 μg (70 μl at 1 mg / ml).
B. Electrophoretic pattern of fractions obtained from gel filtration column chromatography. Lane 1, crude product DNA; Lanes 2-8, fractions I-VII corresponding to retention time. The purified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide staining.
FIGS. 4A and 4B show the biochemical properties of phage genomic antisense molecules containing TNF-α sequences.
A. Characteristics of TNFα-M13AS molecule,
Lane 1, λ-HindIII, DNA size marker; Lane 2, plasmid DNA containing TNF-α cDNA (TNFα-plasmid); Lane 3, TNF-αM13AS; Lane 4, TNFα-plasmid treated with restriction enzyme XhoI; Lane 5 TNF-αM13AS treated with restriction enzyme XhoI; Lane 6, TNFα-plasmid treated with S1 nuclease; Lane 7, TNF-αM13AS treated with S1 nuclease; Lane 8, treated with restriction enzyme XhoI and then with exonuclease III Treated TNFα-plasmid; Lane 9, TNF-αM13AS treated with restriction enzyme XhoI followed by exonuclease III. TNF-α-plasmid or TNF-αM13AS was reacted with various enzymes specified by the manufacturer.
B. TNF-αM13AS stability test. Phage genomic antisense molecules were reacted with 30% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS) at various time intervals.
Lanes 1-8 were treated with serum at different times. Lane 9 is the normal group. Antisense molecules treated with serum were electrophoresed on a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide staining.
FIGS. 5A and 5B are diagrams showing the melting points of TNFα-M13AS and double-stranded plasmid molecules.
Absorbance was measured each time the temperature increased from 30 ° C. to 95 ° C. and increased by 0.5 ° C. at 3 minute intervals.
A. Tm1 / 2 profile of double-stranded phagemid containing TNF-α insertion. B. Tm1 / 2 profile of TNF-αM13AS, a single-stranded circular antisense molecule.
FIGS. 6A-6D show the antisense activity of TNF-αM13AS against TNF-α mRNA levels in WRT7 / P2 cells.
The results indicated by A, C, and D were obtained from RT-PCR. Results shown as B were obtained from Southern hybridization. RT-PCR was performed using total RNA. Cells were treated with TNF-α-M13AS (1.4 nM, 1.65 g / ml) complexed with lipofectamine. Following lipofection of antisense molecules, TNF-α was induced in WRT7 / P2 cells by LPS treatment, and then total RNA was isolated.
A. RT-PCR was performed with two sets of primers, TNF-α primer or β-actin primer. The results confirmed by PCR are as follows: Lane 1, liposome; Lane 2, TNFα-M13AS (antisense); Lane 3, TNFα-M13SE (sense); Lane 4, M13SS (phage genomic DNA without antisense insertion).
B. Panel A DNA was probed with a 20mer oligonucleotide transferred to a nylon membrane.
C. To investigate the effect of non-specific antisense, IL-1β and GAPDH were amplified by RT-PCR. The total RNA amount and the amount of the single-stranded circular molecule containing the antisense compound is the same as in panel A. Amplified PCR fractions were visualized by electrophoresis on a 1% agarose gel and staining with ethidium bromide.
D. Dose-dependent effect of TNF-α-M13AS on TNF-α mRNA expression. Lane 1, liposome; lanes 2-5, TNF-α-M13AS; lane 6, TNF-α-M13SE; and lane 7, M13SS.
FIGS. 7A and 7B show the effect of NFκB-M13AS on human NFκB mRNA levels in THP1 cells.
THP1 cells (1 × 10 5 cells / well) were infected with different amounts of NFκB-M13AS, NFκB-M13SE, or M13SS. Post-lipofection cells were stimulated with PMA (160 nM) for 6 hours. Total RNA was isolated and RT-PCR was performed.
A. NFκB mRNA levels were reduced in a dose-dependent manner by NFκB-M13AS treatment. Lanes not shown on the left side of lane 1 are molecular weight markers (100 bp ladder marker), lane 1, normal group; lanes 2-4, NFκB-M13AS (each 0.14 nM, 0.28 nM and 0.56 nM each) Lanes; lanes 5-6, NFκB-M13SE (each 0.28 nM and 0.56 nM each); lanes 7-8, M13SS (each 0.28 nM and 0.56 nM each); Not the lane, Lipofectamine.
B. In panel A, the DNA band was transferred to a nylon membrane and Southern hybridization was performed.
FIGS. 8A to 8D are diagrams showing the effects of c-myc-M13AS, c-myb-M13AS, k-ras-M13AS and cdk2-M13AS on the mRNA expression of each gene.
K562 and HL-60 cells were infected with each respective c-myc-M13AS and c-myb-M13AS molecule.
A. RT-PCR results with K562 cells.
Lanes 1-2, c-myc-M13AS (0.56 nM and 1.12 nM each); Lanes 3-4, c-myc-M13SE (0.56 nM and 1.12 nM each); and Lane 5, M13SS ( 0.56 nM).
B. RT-PCR results in HL-60 cells.
Lanes 1-2, c-myb-M13AS (0.56 nM and 1.12 nM each); Lanes 3-4, c-myb-M13SE (0.56 nM and 1.12 nM each).
C and D.C. HeLa cells (HeLa cell) were treated with each different amount of k-ras-M13AS and cdk2-M13AS molecules. C. Lanes 1-2, k-ras-M13AS (each 0.28 nM and 0.84 nM each); Lanes 3-4, k-ras-M13SE (each 0.28 nM and 0.56 nM each); Lanes 5-6, M13SS (each 0.28 nM and 0.56 nM each).
D. Lanes 1-3, cdk2-M13AS (each 0.28 nM, 0.56 nM and 0.84 nM each); Lanes 4-6, cdk2-M13SE (each 0.28 nM, 0.56 nM and 0.84 nM each). Amplified PCR fractions were electrophoresed on a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide staining.
FIGS. 9A and 9B are diagrams showing decreased expression of TNF-α and CDK2 by administration of phage genome antisense molecules. FIG.
A. TNF-α released from the medium was measured using an ELISA. WRT7 / P2 cells were infected with TNF-α-M13AS, TNF-α-M13SE or M13SS (each, lanes 1-3). TNF-α was induced with 30 μg / ml LPS for 6 hours. Cell culture supernatant was diluted 50-fold immediately prior to analysis. Each value represents the mean ± standard deviation for triplicate experiments. Statistical significance was calculated by student's t-test (variation analysis, * p <0.05).
B. Southern hybridization of CDK2 using HeLa cells after treatment with cdk2-M13AS molecule.
FIGS. 10A and 10B show the effect of phage genomic antisense molecules on the growth of MCF-7 and HeLa cells.
MTT analysis was performed to determine the growth inhibition of cells treated with each k-ras-M13AS and cdk2-M13AS.
A. MCF-7 cells were treated with 0.28 nM and 0.56 nM k-ras-M13AS complexed with Lipofectamine 2000 at a ratio of 1: 3 (w / w). □, k-ras-M13AS; reticulated square, k-ras-M13SE; hatched square, k-ras-M13AS without liposomes; and ■, lipofectamine 2000.
B. HeLa cells were treated with cdk2-M13AS (0.84 nM) conjugated with Lipofectamine 2000. Column 1, cdk2-M13AS (0.84 nM); Column 2, cdk2-M13SE (0.84 nM); Column 3, cdk2-M13AS without liposomes; and Column 4, Lipofectamine 2000. Each value represents the mean ± standard deviation of three experiments.
FIGS. 11A and 11B show the effect of c-myb-M13AS molecules on the proliferation of K562 and HL-60 cells.
MTT analysis was performed to investigate growth inhibition by c-myb-M13AS. It was composed of two types of c-myb-M13AS molecules, and c-myb-M13AS1 and c-myb-M13AS2 containing each 0.5 kb and 1.5 kb c-myb sequences. K562 (A) and HL-60 (B) cells were treated with c-myb-M13AS (0.84 nM) complexed with Lipofectamine 2000.
Column 1, c-myb-M13AS 0.5 kb; Column 2, c-myb-M13AS 1.5 kb; Column 3, c-myb-M13SE 1.5 kb; and Column 4, c-myb-M13AS without liposomes. 5 kb. Each value represents the mean ± standard deviation of three experiments.
[Sequence Listing]

Claims

Recombinant bacterio, which is at least 3000 nucleotides in length, comprising a target-specific antisense region characterized in that it binds specifically to the RNA portion expressed from the gene and is effective in reducing said gene expression Phage or phagemid genome circular single-stranded DNA molecule.

The circular single-stranded DNA molecule according to claim 1, wherein the antisense region of the molecule is at least 50 nucleotides in length.

The circular single-stranded DNA molecule according to claim 1, wherein the antisense region is substantially complementary to one whole gene sequence.

The circular single-stranded DNA molecule according to claim 1 , wherein the bacteriophage or phagemid is derived from a filamentous phage.

The circular single-stranded DNA molecule according to claim 4 , wherein the filamentous phage is phage M13.

A recombinant vector comprising the circular single-stranded DNA molecule of claim 1.

The vector according to claim 6 , wherein the vector is derived from a filamentous phage.

A host cell comprising the vector of claim 6 .

At least 3000 nucleotides in length including a target-specific antisense region characterized in that it binds specifically to a portion of RNA expressed from the gene and is effective to reduce expression of the gene A composition comprising a recombinant bacteriophage or phagemid genomic circular single stranded DNA molecule and a pharmaceutically acceptable carrier thereof.

Consisting of targeting a DNA molecule to RNA and hybridizing with RNA to form a duplex with RNA,
The duplex is a recombinant bacteriophage or phagemid genomic circular single strand that is at least 3000 nucleotides long that targets RNA encoding a selected protein characterized by suppressing expression of the selected protein A therapeutic agent that contains a DNA molecule.

The therapeutic agent according to claim 10 , wherein the expression of the protein induces cell proliferation or cancer.

12. The therapeutic agent according to claim 11 , wherein the protein is tumor necrosis factor, nuclear factor, MYB, MYC, RAS or cell division kinase.

The therapeutic agent according to claim 10 , wherein the protein is a viral protein.

The therapeutic agent according to claim 10 , wherein the expression of the protein is a metabolic disease or an immune disorder.

A length of at least 3000 nucleotides comprising a target-specific antisense region, characterized in that it specifically binds to a plurality of target RNAs expressed from a plurality of target genes and is effective in reducing gene expression A recombinant bacteriophage or phagemid genomic chimeric circular single-stranded DNA molecule.

A length of at least 3000 nucleotides comprising a target-specific antisense region, characterized in that it specifically binds to a plurality of target RNAs expressed from a plurality of target genes and is effective in reducing gene expression A composition comprising a recombinant bacteriophage or phagemid genomic chimeric circular single stranded DNA molecule and a pharmaceutically acceptable carrier.

1) producing a recombinant bacteriophage or phagemid genomic chimeric circular single-stranded DNA molecule that is at least 3000 nucleotides long, including target-specific antisense regions targeted to multiple target RNAs, 2) multiple Recombinant bacteriophage or phagemid genomic chimeric circular single-stranded DNA molecules that target RNA and are at least 3000 nucleotides in length hybridize with the above RNA to form a duplex that reduces the expression of a number of selected proteins Including stages,
Expression of multiple selected proteins by recombinant bacteriophage or phagemid genomic chimeric circular single-stranded DNA molecules that are at least 3000 nucleotides long that target multiple RNA molecules that encode multiple selected proteins How to suppress.

1) A recombinant bacteriophage or phagemid genomic circular single-stranded DNA molecule that is at least 3000 nucleotides in length containing one or more antisense regions that are substantially complementary to one or more target genes. Consists of the administration stage,
2) including suppressing the cell growth by suppressing the expression of the gene,
A method for inhibiting cell proliferation.

1) inserting a target-specific DNA of interest into a phage or phagemid genome, 2) producing a single-stranded circular nucleic acid molecule from a phage, and 3) separating the circular nucleic acid molecule by a gel filtration column. A method of producing a circular nucleic acid molecule comprising a target-specific antisense region that inhibits expression of a selected protein comprising a step.

1) producing a recombinant bacteriophage or phagemid genomic single-stranded circular nucleic acid molecule comprising an antisense region substantially complementary to RNA expressed from the cell; 2) the cell is a recombinant bacteriophage or A step in which an antisense molecule enters a cell and hybridizes with RNA expressed in the cell by contacting with a phagemid genome single-stranded circular nucleic acid molecule to suppress the expression of the gene product, and 3) with respect to various phenotypes A method of screening for the function of a gene, comprising analyzing a cell.

21. The method according to claim 20 , wherein steps 1) to 3) are applied to the library of circular nucleic acid molecules.