JP4035062B2

JP4035062B2 - Peroxidase composition

Info

Publication number: JP4035062B2
Application number: JP2003016150A
Authority: JP
Inventors: 嗣朗村岡; 由美子松岡; 雅寿境; 勉本庄
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2023-01-24
Also published as: JP2004222634A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定化されたペルオキシダーゼ組成物に関する。該組成物は、特に、免疫測定用キットに用いる試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
免疫測定用の試薬として抗原又は抗体とコンジュゲートしたペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」と略す。）が広く用いられている。ＰＯＤは、競合法或いは非競合法に基づく免疫学的測定法において、形成された抗原−抗体複合体の鋭敏且つ簡便な検出方法として多用される。非競合法に基づくサンドウイッチ−ＥＬＩＳＡを例に簡単に説明すると、まず、測定対象物質（抗原）と特異的に結合する一次抗体をマイクロプレートのウェル等の固体表面に固相化し、当該固相化一次抗体と測定対象物を含む試料溶液を接触させて測定対象物を前記一次抗体上に捕捉する。次いで、洗浄により一次抗体を介して固相に維持された測定対象物のみを分離し、分離された測定対象物を該測定対象物に特異的なＰＯＤ標識二次抗体で検出する。すなわち、ＰＯＤは特定の基質に作用してそれを発色させることができるので、固相化一次抗体−測定対象物（抗原）−ＰＯＤ標識二次抗体の生成量がその発色強度に比例することになり、それにより測定対象物の濃度が検出される。
【０００３】
従って、ＰＯＤの酵素活性は前記免疫測定の感度を左右する極めて重要な因子である。特に、そのような免疫測定用の試薬類はキットの形態で広く用いられており、その流通・保存の全段階において該ＰＯＤの酵素活性を維持するような条件、例えば−８０℃等の極低温を維持しなければならないとすると極めて不都合である。好ましくは、該キットは常温程度で流通させることができ、また、厳重な保存条件下に付すことなく長期間安定であるべきである。
【０００４】
このような観点から、ＰＯＤの安定性に関する多くの技術が提案されてきた。特許文献１には、安定化ＰＯＤ溶液のための血清タンパク質とパラハイドロキシフェニルカルボン酸の併用が開示されている。特許文献２には、安定化されたＰＯＤ組成物のためのアルコキシフェノール化合物の使用が開示されている。特許文献３には、安定なＰＯＤ組成物のための、特定の置換基を有するフェノール化合物の使用が開示されている。特許文献４には、安定化ＰＯＤ組成物のための特定のフェノール誘導体の使用が開示されている。特許文献５には、安定なＰＯＤ組成物のためのヒドロキシベンジルアルキルアルコール、ヒドロキシベンジルシラン類の使用が開示されている。特許文献６には、安定化されたＰＯＤ溶液におけるフェノール系化合物とアジ化ナトリウムの併用が開示されている。特許文献７には、安定なＰＯＤ組成物のためのヒドロキシフェニル−アルコキシシランの使用が開示されている。特許文献８には、安定化されたＰＯＤ活性を有する溶液のためのヒドロキシフェニル−アルキレン−カルボン酸の使用が開示されている。しかしながら、これらいずれの文献もヒドロキシル基を有さないベンゼン環化合物の使用を示唆しない。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭６１−２３９８９０号公報
【特許文献２】
特開昭６４−６３３８０号公報
【特許文献３】
特開平２−４２９８２号公報
【特許文献４】
特開平６−１２１６８３号公報
【特許文献５】
特開平７−７５５７４公報
【特許文献６】
特開平７−１３５９７５号公報
【特許文献７】
特開平７−１４０１４６号公報
【特許文献８】
特開平９−２９９０８５号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な安定化ＰＯＤ組成物を提供する。ＰＯＤを常温においても長期間安定化させ、且つ廉価であるような化合物を含む組成物が特に望ましい。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今や、フェノール（或いはヒドロキシフェニル／ヒドロキシベンジル）骨格を有さない特定の化合物が極めて有効にＰＯＤを安定化することが見出された。
【０００８】
５−アセトアミドアントラニル酸は、その入手の容易性等を考慮しても特に好ましい。従って、本発明の第１は、
（１）５−アセトアミドアントラニル酸を含有するペルオキシダーゼ組成物である。
【０００９】
また、本発明のＰＯＤ組成物は、特に免疫測定用の試薬に好適に用いることができ、また、当該試薬を含むキットは、長期化安定に保存し得るので極めて有用である。従って、本発明の第２乃至第３は、
（２）ペルオキシダーゼが、抗体又は抗原とのコンジュゲートとして存在する上記（１）の組成物であり、
（３）上記（２）の組成物を含む免疫測定用キットである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＯＤ組成物は、少なくともＰＯＤと前記一般式（Ｉ）で表されるアントラニル酸誘導体を含む。
【００１１】
ＰＯＤ（ＥＣ１．１１．１．７）は、一般にＨ₂Ｏ₂＋ＡＨ₂→2Ｈ₂Ｏ＋Ａの反応を触媒する酵素であり、動物、植物或いは微生物界にも広く存在する酵素である。ＥＬＩＳＡやウェスタンブロット等の実験技法において用いられる場合は、西洋ワサビペルオキシダーゼが特に有用である。これらの実験技法で用いられる場合、例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を基質として用いることで、ＰＯＤによる検出可能な発色が得られる。
【００１２】
免疫学的測定方法においては、ＰＯＤを特定の抗原又は抗体にコンジュゲートすることが好ましい。当該コンジュゲート及びその作製方法は当業者に公知である。各種の抗原又は抗体がＰＯＤとコンジュゲートされ得る。抗体では、抗ＡＩＤＳウイルス抗体、抗肝炎ウイルス抗体、抗インシュリン抗体、抗食物アレルゲン抗体、抗ステロイドホルモン抗体或いはこれらの抗体の抗原特異的結合性部位等が例示されるがこれに限定されない。同様に抗原も各種ウイルスの抗原タンパク質や糖鎖、食物アレルゲンタンパク質、各種ホルモン等がＰＯＤとコンジュゲートされてよい。勿論、他の実験技法等に用いる場合はＰＯＤが核酸、レセプター、糖鎖又はレクチン等とコンジュゲートしていてもよく、或いは全くコンジュゲートしていない単体のＰＯＤであってもよい。
【００１３】
組成物中に含有されるＰＯＤの量には特に制限がなく、当該組成物の形態、用途や該組成物の他の成分等も勘案して適宜変更できるが、免疫測定用の試薬に用いる場合は、典型的に最終溶液の形態で０.０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲であってよい。
【００１４】
本発明の組成物のもう一方の必須成分であるアントラニル酸誘導体は、その５位にアルキルアミド基を有する。該アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル等が上げられる。
【００１５】
特に５位の置換基としてアセトアミド基を有する化合物、すなわち５−アセトアミドアントラニル酸は市販されており、例えば東京化成工業株式会社から容易且つ廉価に入手することができる。
【００１６】
該アントラニル酸誘導体の組成物への添加量も、当該組成物の形態、用途等を勘案して適宜変更できるが、典型的には最終溶液の形態で０.０１乃至１ｗ／ｖ％、好ましくは０.０５〜０.５ｗ／ｖ％程度の範囲で添加されてよい。
【００１７】
本発明のＰＯＤ組成物には上記の２成分以外の付加的な成分を含み得る。例えば、組成物のｐＨ調製のための緩衝剤や牛血清アルブミン等の血清タンパク質、各種無機塩類、界面活性剤等を更に含んでよく、また所望によりラクトースやデキストラン、アスパラギン酸マグネシウム等の追加的安定剤を含んでもよい。
【００１８】
組成物が溶液形態である場合、当該組成物のｐＨは４乃至９程度に維持されることが好ましい。また、組成物を凍結乾燥物形態として調製する場合も、当該凍結乾燥形態の組成物が水に再溶解された際のｐＨは、やはり４乃至９程度となるように上記各種成分を組成すべきである。
【００１９】
本発明のＰＯＤ組成物は免疫測定用キットの試薬として好適に利用できる。サンドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ用キットの例では、キャプチャー用としての一次抗体からなる試薬と、本発明のＰＯＤ組成物、すなわち本発明のアントラニル酸誘導体を含むＰＯＤ標識抗体含有検出用試薬、及び適切な酵素基質が該キットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェルへの非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が更に含まれてもよい。そのようなキットの構成及びその製造方法は当業者にとって公知であろう。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明が当該実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、以下において、特にことわりのない限り濃度（％）は、ｗ／ｖ％をさす。
【００２０】
【実施例】
以下の方法により本発明のＰＯＤ組成物の安定性を試験した。
【００２１】
すなわち、ＰＯＤ組成物としてＰＯＤ標識抗体溶液（ＰＯＤ標識抗グリアジン抗体、０.１％ＢＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ）を用い、これに０.１％の５−アセトアミドアントラニル酸を添加した溶液（実施例）及び無添加の溶液（比較例）を調製した。３７℃で３、７、１０及び１４日間保存後のＰＯＤの活性を以下の測定プロトコールに従って評価した。
【００２２】
測定プロトコール
１．抗グリアジン抗体（一次抗体）を固相化したマイクロプレートに１００μｌのサンプル溶液（それぞれ、グリアジン：０、1、３２及び６４ｎｇ／ｍｌを含む）を分注する。
２．室温で一時間静置して反応させる。
３．３００μｌの洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ）で６回洗浄する。
４．ＰＯＤ標識抗体溶液を１００μｌずつ分注する。
５．室温で３０分静置して反応させる。
６．３００μｌの洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ）で６回洗浄する。
７．発色基質（ＴＭＢ：３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）を１００μｌずつ分注し、遮光下、室温で１０分間反応させる。
８．１Ｎ硫酸、１００μｌで反応を停止する。
９．波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２３】
評価試験結果
上記試験の結果（２連）を表１に示した。
【００２４】
【表１】

【００２５】
また、上記の結果のうち、抗原（グリアジン）濃度が６４ｎｇ／ｍｌのサンプルについての２連の平均値を、５−アセトアミドアントラニル酸添加（実施例）と無添加（比較例）の場合で、試験開始後０日目の測定値を１００％として標準化し、作成したグラフを図１に示した。
【００２６】
表１及び図１から明らかなように、本発明のアントラニル酸誘導体は組成物中のＰＯＤ活性を極めて有効に安定化した。
【図面の簡単な説明】
【図１】５−アセトアミドアントラニル酸添加ＰＯＤ組成物（実施例）と無添加ＰＯＤ組成物（比較例）における３７℃でのＰＯＤ酵素活性の経時的変化を示す。縦軸は０日目の酵素活性を１００％とした時の相対活性（％)。横軸は日数。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a stabilized peroxidase composition. The composition is particularly useful as a reagent used in an immunoassay kit.
[0002]
[Prior art]
A peroxidase conjugated to an antigen or an antibody (hereinafter abbreviated as “POD”) is widely used as an immunoassay reagent. POD is frequently used as a sensitive and simple detection method for the formed antigen-antibody complex in an immunoassay based on a competitive method or a non-competitive method. Briefly, taking a sandwich-ELISA based on the non-competitive method as an example, first, a primary antibody that specifically binds to a substance to be measured (antigen) is immobilized on a solid surface such as a well of a microplate, The measurement target is captured on the primary antibody by bringing the sample solution containing the primary antibody into contact with the measurement target. Subsequently, only the measurement object maintained on the solid phase via the primary antibody is separated by washing, and the separated measurement object is detected with a POD-labeled secondary antibody specific to the measurement object. That is, since POD can act on a specific substrate and cause it to develop color, the amount of primary antibody immobilized-measurement target (antigen) -POD-labeled secondary antibody is proportional to the color development intensity. Thus, the concentration of the measurement object is detected.
[0003]
Therefore, the enzyme activity of POD is a very important factor that affects the sensitivity of the immunoassay. In particular, such immunoassay reagents are widely used in the form of kits, and the conditions for maintaining the enzyme activity of the POD at all stages of distribution and storage, such as a cryogenic temperature such as −80 ° C. It is extremely inconvenient if you have to maintain. Preferably, the kit can be distributed at about room temperature and should be stable for a long time without being subjected to strict storage conditions.
[0004]
From this point of view, many techniques relating to the stability of POD have been proposed. Patent Document 1 discloses the combined use of serum protein and parahydroxyphenyl carboxylic acid for a stabilized POD solution. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of alkoxyphenolic compounds for stabilized POD compositions. Patent Document 3 discloses the use of a phenol compound having a specific substituent for a stable POD composition. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of certain phenol derivatives for stabilized POD compositions. Patent Document 5 discloses the use of hydroxybenzylalkyl alcohol and hydroxybenzylsilanes for a stable POD composition. Patent Document 6 discloses the combined use of a phenolic compound and sodium azide in a stabilized POD solution. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of hydroxyphenyl-alkoxysilanes for stable POD compositions. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of hydroxyphenyl-alkylene-carboxylic acids for solutions with stabilized POD activity. However, none of these documents suggest the use of a benzene ring compound that does not have a hydroxyl group.
[0005]
[Patent Document 1]
JP 61-239890 A [Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 64-63380 [Patent Document 3]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-42982 [Patent Document 4]
JP-A-6-121683 [Patent Document 5]
Japanese Patent Laid-Open No. 7-75574 [Patent Document 6]
JP-A-7-135975 [Patent Document 7]
JP 7-14146 A [Patent Document 8]
JP-A-9-299085 [0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel stabilized POD composition. A composition containing a compound that stabilizes POD for a long time even at room temperature and is inexpensive is particularly desirable.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
It has now been found that certain compounds that do not have a phenol (or hydroxyphenyl / hydroxybenzyl) skeleton stabilize POD very effectively.
[0008]
5 -Acetamidoanthranilic acid is particularly preferable in view of its availability. Therefore, the first of the present invention is
( 1) A peroxidase composition containing 5-acetamidoanthranilic acid.
[0009]
Moreover, the POD composition of the present invention can be suitably used particularly as a reagent for immunoassay, and a kit containing the reagent is extremely useful because it can be stored stably for a long period of time. Therefore, the second to third aspects of the present invention include
( 2 ) The composition according to (1 ) above, wherein peroxidase is present as a conjugate with an antibody or an antigen,
( 3 ) An immunoassay kit comprising the composition of ( 2 ) above.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The POD composition of the present invention contains at least POD and an anthranilic acid derivative represented by the general formula (I).
[0011]
POD (EC 1.11.1.1.7) is an enzyme that generally catalyzes the reaction of H ₂ O ₂ + AH ₂ → 2H ₂ O + A, and is also an enzyme that exists widely in the animal, plant, and microbial communities. Horseradish peroxidase is particularly useful when used in experimental techniques such as ELISA or Western blot. When used in these experimental techniques, for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or the like can be used as a substrate to obtain a detectable color by POD.
[0012]
In the immunological measurement method, POD is preferably conjugated to a specific antigen or antibody. Such conjugates and methods for making them are known to those skilled in the art. Various antigens or antibodies can be conjugated to the POD. Examples of antibodies include, but are not limited to, anti-AIDS virus antibodies, anti-hepatitis virus antibodies, anti-insulin antibodies, anti-food allergen antibodies, anti-steroid hormone antibodies, or antigen-specific binding sites of these antibodies. Similarly, antigens such as antigen proteins and sugar chains of various viruses, food allergen proteins, various hormones and the like may be conjugated with POD. Of course, when used for other experimental techniques, the POD may be conjugated with a nucleic acid, receptor, sugar chain, lectin, or the like, or may be a single POD that is not conjugated at all.
[0013]
The amount of POD contained in the composition is not particularly limited and can be appropriately changed in consideration of the form and use of the composition, other components of the composition, etc., but when used as a reagent for immunoassay May typically range from 0.01 μg / ml to 10 mg / ml in the form of a final solution.
[0014]
The anthranilic acid derivative which is another essential component of the composition of the present invention has an alkylamide group at the 5-position thereof. Examples of the alkyl include methyl, ethyl, propyl, i-propyl, butyl, i-butyl, t-butyl and the like.
[0015]
In particular, a compound having an acetamide group as a substituent at the 5-position, that is, 5-acetamidoanthranilic acid is commercially available, and can be easily and inexpensively obtained from, for example, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
[0016]
The amount of the anthranilic acid derivative added to the composition can also be appropriately changed in consideration of the form and use of the composition, but typically 0.01 to 1 w / v% in the form of the final solution, preferably It may be added in the range of about 0.05 to 0.5 w / v%.
[0017]
The POD composition of the present invention may contain additional components other than the above two components. For example, it may further contain a buffer for adjusting the pH of the composition, serum proteins such as bovine serum albumin, various inorganic salts, surfactants and the like, and if necessary, additional stability such as lactose, dextran, magnesium aspartate, etc. An agent may be included.
[0018]
When the composition is in the form of a solution, the pH of the composition is preferably maintained at about 4 to 9. In addition, when preparing the composition in the form of a lyophilized product, the various components should be formulated so that the pH when the composition in the lyophilized form is redissolved in water is also about 4 to 9. It is.
[0019]
The POD composition of the present invention can be suitably used as a reagent for an immunoassay kit. In an example of an ELISA kit based on the sandwich method, a reagent comprising a primary antibody for capture, a POD composition of the present invention, that is, a detection reagent containing a POD-labeled antibody comprising the anthranilic acid derivative of the present invention, and an appropriate enzyme A substrate can be included in the kit. A buffer for washing, a blocking reagent that suppresses nonspecific adsorption to the well, and the like may further be included. The construction of such a kit and its manufacturing method will be known to those skilled in the art.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, it cannot be overemphasized that this invention is not limited to the said Example. In the following, the concentration (%) refers to w / v% unless otherwise specified.
[0020]
【Example】
The stability of the POD composition of the present invention was tested by the following method.
[0021]
That is, a POD-labeled antibody solution (POD-labeled anti-gliadin antibody, 0.1% BSA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween) was used as the POD composition, and 0.1% was used. A solution (Example) to which 5% 5-acetamidoanthranilic acid was added and an additive-free solution (Comparative Example) were prepared. The activity of POD after storage at 37 ° C. for 3, 7, 10 and 14 days was evaluated according to the following measurement protocol.
[0022]
Measurement protocol Dispense 100 μl of sample solution (containing gliadin: 0, 1, 32, and 64 ng / ml, respectively) onto a microplate on which an anti-gliadin antibody (primary antibody) is immobilized.
2. Allow to react at room temperature for 1 hour.
3. Wash 6 times with 300 μl wash (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween).
4). Dispense 100 μl of the POD-labeled antibody solution.
5. The reaction is allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
6. Wash 6 times with 300 μl wash (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween).
7). 100 μl of chromogenic substrate (TMB: 3,3 ′, 5,5 ′ tetramethylbenzidine) is dispensed and reacted at room temperature for 10 minutes under light shielding.
8. Stop the reaction with 100 μl of 1N sulfuric acid.
9. The absorbance at a wavelength of 450 nm is measured.
[0023]
Evaluation Test Results The results of the above test (2 series) are shown in Table 1.
[0024]
[Table 1]

[0025]
In addition, among the above results, the average of duplicates for a sample with an antigen (gliadin) concentration of 64 ng / ml was tested in the case of addition of 5-acetamidoanthranilic acid (Example) and no addition (Comparative Example). The measured value on the 0th day after the start was standardized as 100%, and the created graph is shown in FIG.
[0026]
As is apparent from Table 1 and FIG. 1, the anthranilic acid derivative of the present invention stabilized POD activity in the composition very effectively.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows time-dependent changes in POD enzyme activity at 37 ° C. in a 5-acetamidoanthranilic acid-added POD composition (Example) and an additive-free POD composition (Comparative Example). The vertical axis represents relative activity (%) when the enzyme activity on day 0 is defined as 100%. The horizontal axis is the number of days.

Claims

A peroxidase composition containing 5 -acetamidoanthranilic acid.

Peroxidase The composition of claim 1 present as a conjugate of the antibody or antigen.

An immunoassay kit comprising the composition according to claim 2 .