JP4033534B2

JP4033534B2 - Method for stabilizing human hemoglobin

Info

Publication number: JP4033534B2
Application number: JP34993297A
Authority: JP
Inventors: 昌泰榎本; 誠博山口
Original assignee: Alfresa Pharma Corp
Current assignee: Alfresa Pharma Corp
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: JPH11166932A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中におけるヒトヘモグロビンの安定化方法およびヒトヘモグロビン含有物を溶解する緩衝液、ヒトヘモグロビンを安定に保持する緩衝液あるいはヒトヘモグロビンを安定に含有している溶液に関するものである。さらに、本発明は、ヒトヘモグロビンを安定に保持する緩衝液を含んでいるヒトヘモグロビン測定用採便容器に関する。
【０００２】
本発明のヒトヘモグロビンを安定化する方法をヒトヘモグロビンの検出に適用することにより、種々の溶液中、例えば、標準溶液、陽性対照溶液（以下、陽性コントロール液という）および被検試料（例えば、糞便溶解液）中でのヒトヘモグロビンの変性および／または分解が抑制され、より正確にヒトヘモグロビン濃度を測定することができる。
【０００３】
【従来の技術】
近年、大腸癌などの下部消化器の疾患の早期検出方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中の便潜血成分、特にヒトヘモグロビンの検出が広く行われている。このようなヒトヘモグロビンの検出方法として、従来必要とされていた食品摂取の制限あるいは薬剤投与の制限等を必要としない、免疫学的検出法が普及し、手軽な検査方法として定着している。
【０００４】
上記ヒトヘモグロビンの免疫学的検出法としては、例えば寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した動物血球を用いる逆受身血球凝集法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法等が挙げられる。
【０００５】
上記検出法においては、被検物質であるヒトヘモグロビンは、通常、溶液状態で検査に供される。例えば、便潜血検査では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解し、その溶液をヒトヘモグロビン測定用の被検試料として用いている。
【０００６】
被検試料中のヒトヘモグロビンは、温度上昇および時間経過に伴い、変性されあるいは分解されることが知られている。このヒトヘモグロビンの変性あるいは分解により抗原決定基が失活し、免疫学的検出方法における検出感度が著しく低下する。特に、ヒトヘモグロビンの濃度が低い場合には、上記、変性あるいは分解により、ヒトヘモグロビンの濃度が検出限界以下となり、診断を誤ることになる。同様なヒトヘモグロビンの変性あるいは分解は、検査性能の確認に利用する陽性コントロール液、あるいはヘモグロビンの定量を行うために利用するヘモグロビン標準溶液中でも生じ、正確な測定の障害ともなっている。
【０００７】
ところで、便潜血検査の実情は、被験者自身が自宅などで採便し、これを便溶解液に溶かし、郵送又は被験者が病院へ持参することが多い。このため、便潜血検査のサンプルは、採便から検査機関における検査を開始するまでに、溶液状態で数日間置かれることが多い。また、検査機関で採便する場合においても、他項目の検査を実施しているため、便潜血の検査までに多くの時間を要することもある。このような状況下での検査は、前述のようにヒトヘモグロビンの変性あるいは分解が生じ、正確な測定ができない等の点で、好ましくない。
【０００８】
このようなヒトヘモグロビンの変性あるいは分解を防止する目的で、便潜血検出用の便溶解液に種々の物質を添加する方法が検討されている。例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいは、チメロサール、アジ化ナトリウム等の一般的抗菌剤の添加、動物血清の添加（特開平4-145366号公報）、糖類の添加（特開昭63-243756 号公報）、アジ化ナトリウム、アルブミンおよび乳酸の添加（特開平6-281654号公報）、溶菌酵素の添加（特開平5-69466 号公報）、プロテアーゼ阻害物質の添加（特開平3-279859号公報）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平5-281227号公報）等が報告されている。また、ｐＨをコントロールする方法（特開平5-281226号公報）も報告されている。さらに、ヘモグロビンの分解を防止する方法として、ヘモグロビンに特定の含窒素化合物を添加して、ヘム部からの鉄の遊離を防止するヘモグロビンの分解防止方法（特開昭60-35270号公報）あるいはヘモグロビン含有試料に、非ペニシリン系抗生物質を共存させることによるヘモグロビンの分解抑制法（特開平7-72154 号公報）が報告されている。その他に、キレート試薬を添加する方法（特開平5-99923 号公報並びに特開平2-221859号公報）、水溶性遷移金属錯体を添加する方法（特開平7-229902号公報）が報告されている。更には、フッ化ナトリウムの添加（特開平7-191026号公報）、動物ヘモグロビンの添加（特開平2-296149号公報）、ヘモグロビン以外の鉄タンパクとフェリシアンイオンとをヘモグロビンと共存させる方法（特開平8-262020号公報）等が報告されている。
【０００９】
しかし、これら公知のヒトヘモグロビン安定化技術では、糞便を含む被検試料中のヒトヘモグロビンの変性あるいは分解を十分に抑制するには至っていない。
【００１０】
更に、糞便を含まない陽性コントロール液や標準溶液として利用する目的で、ヒトヘモグロビン標品あるいは赤血球より調製したヒトヘモグロビンを溶液中で安定化させるために上記公知技術を用いても、ヒトヘモグロビンは不安定でありその変性あるいは分解を十分に防ぐには至っていない。従って、糞便中のヘモグロビンあるいはヘモグロビン標品、赤血球から調製したヘモグロビン等の各種ヘモグロビンを溶液中で安定に保持する方法が望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、本発明の目的は、新規なヒトヘモグロビンの安定化方法を提供することにある。さらに具体的には、本発明の目的は、糞便を含む被検試料中のヒトヘモグロビンの安定性を増すことによって、より正確な測定値を得ることにある。また、本発明の目的は、糞便を溶解し被検試料とする場合に、その中に含まれるヒトヘモグロビンを安定化するための糞便溶解液、その溶解液を含む糞便採取用容器を提供することにある。さらに本発明の目的は、ヒトヘモグロビンを安定化した優れた陽性コントロール液またはヘモグロビン標準溶液を提供することにある。
【００１２】
上記の実情および目的に鑑み、本発明者らはヒトヘモグロビンの溶液中での変性あるいは分解を抑制するための改良された安定化方法を見い出すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトヘモグロビンと、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を溶液中に共存させることにより、ヘモグロビンを安定化する方法を見いだして、本発明を完成した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒトヘモグロビンを溶液中で安定化する方法であって、ヒトヘモグロビンと、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を溶液中に共存させる方法に関する。
【００１４】
好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、カゼインと、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも１つの物質とを含む。
【００１５】
また、好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、ホウ酸又はその塩と、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質とを含む。
好適な実施態様においては、前記溶液のｐＨが5.5 から7.5 の範囲である。
好適な実施態様においては、前記ヒトヘモグロビンが、糞便中のヒトヘモグロビンである。
【００１６】
また、本発明は、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を含有する、ヒトヘモグロビン含有物を溶解するための緩衝液に関する。
【００１７】
好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、カゼインと、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１つの物質である。
【００１８】
また、好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、ホウ酸又はその塩と、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質である。
また、好適な実施態様においては、前記緩衝液のｐＨが、5.5 から7.5 の範囲である。
好適な実施態様においては、前記ヒトヘモグロビン含有物が、ヒト糞便である。
【００１９】
さらに、本発明は、ヒトヘモグロビンとカゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を含有する、ヒトヘモグロビン含有溶液に関する。
【００２０】
好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、カゼインと、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質である。
【００２１】
また好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、ホウ酸又はその塩と、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質である。
さらに好適な実施態様においては、前記緩衝液のｐＨが、5.5 から7.5 の範囲である。
また好適な実施態様においては、前記ヒトヘモグロビン含有溶液が、ヒトヘモグロビンの陽性コントロール液またはヒトヘモグロビン標準溶液である。
【００２２】
さらに、本発明は、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を含有するヒトヘモグロビン含有物溶解用緩衝液を含む、ヒトヘモグロビン測定用採便容器に関する。
【００２３】
好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、カゼインと、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質である。
【００２４】
また、好適な実施態様においては、前記２種以上の物質が、ホウ酸又はその塩と、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質である。
さらに好適な実施態様においては、前記緩衝液のｐＨが、5.5 から7.5 の範囲である。
【００２５】
上記本発明によれば、溶液中でのヒトヘモグロビン安定化を図ることが出来る。また、本発明によれば、長期にわたって使用可能である安定な陽性コントロール液やヘモグロビン標準溶液を提供できる。また、糞便を溶解してその中のヒトヘモグロビンを安定化する糞便溶解用緩衝液およびその緩衝液を含む採便用容器を提供することができ、さらに臨床検査の分野において、ヘモグロビン測定の精度を向上させる方法を提供することができる。従って、本発明により、上記目的を達成できる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の方法等に用いられるヒトヘモグロビンとしては、糞便中に含まれるヒトヘモグロビン、赤血球から調製したヒトヘモグロビンおよび市販のヒトヘモグロビンのいずれであってもよい。赤血球からのヒトヘモグロビンは、常法によりヒト赤血球を採取し、あるいは、市販のヒト赤血球を購入して、蒸留水中で赤血球を破壊することにより調製される。
【００２７】
溶液中でヒトヘモグロビンを安定化するのに用いるカゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムとしては市販品を用いることができる。
【００２８】
本発明に用いるカゼインの濃度は、約0.01％〜約1.0 ％（重量％、以下同じ）であり、好ましくは、約0.05％〜約0.2 ％である。
【００２９】
ホウ酸塩としては、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。ホウ酸又はその塩の濃度は、ホウ酸の濃度として約0.02％〜約2.0 ％であり、好ましくは約0.1 ％〜約0.5 ％である。
【００３０】
アルミニウム塩としては塩化アルミニウム、硫酸アンモニウムアルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム等が挙げられる。アルミニウム塩の濃度は、塩化アルミニウムの濃度として約0.001 ％〜約0.5 ％であり、好ましくは約0.005 ％〜約0.1 ％である。
【００３１】
チオ尿素の濃度は約0.00005 ％〜約0.01％であり、好ましくは約0.0001％〜約0.001 ％である。塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムの濃度は約0.005 ％〜約2.0 ％、好ましくは約0.02％〜約0.4 ％である。
【００３２】
これらの、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムは、単独で添加してもよいし、これらの物質を２種以上組み合わせて添加してもよい。
【００３３】
２種類の物質を組み合わせて用いる場合には、カゼインと、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも１種の物質とを含むようにすることが好ましい。好ましい組み合わせとしては、カゼインとホウ酸、カゼインと塩化アルミニウム、カゼインとチオ尿素、またはカゼインと塩化カルシウムとの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
また、ホウ酸又はその塩と、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる少なくとも１種の物質を含むようにすることも好ましい。好ましい組み合わせとしては、ホウ酸と塩化アルミニウム、ホウ酸とチオ尿素、およびホウ酸と塩化カルシウムの組み合わせが挙げられる。
【００３５】
また、塩化アルミニウムとチオ尿素、塩化アルミニウムと塩化カルシウム、塩化アルミニウムと酢酸カルシウムとを組み合わせて用いてもよく、チオ尿素と塩化カルシウムを組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
また、３種類の組み合わせの場合は、カゼインとホウ酸と塩化アルミニウム、カゼインとホウ酸とチオ尿素、カゼインとホウ酸と塩化カルシウム、カゼインとホウ酸と酢酸カルシウム、ホウ酸と塩化アルミニウムと塩化カルシウム、ホウ酸とチオ尿素と塩化カルシウムの組み合わせが好適である。さらに、４種類以上の物質を含んでいてもよい。これらの物質を２種以上共存させる場合の添加濃度は、上記濃度範囲でよい。
【００３７】
上記物質を１種または２種以上含ませた場合に、ヒトヘモグロビンを安定化する溶液のｐＨは、約5.0 〜約8.5 、好ましくは約5.5 〜約7.5 、より好ましくは約6.0 〜約7.0 の範囲である。極端な酸やアルカリ条件下ではヘモグロビンの安定性を損なう恐れがあるからである。ｐＨの維持のためには適切な緩衝剤が用いられる。
【００３８】
本発明のヒトヘモグロビン含有物を溶解するための緩衝液（以下、単に本発明の緩衝液という）は、上記カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を含有する。これにより、本発明の緩衝液にヒトヘモグロビン含有物を溶解したときに、ヒトヘモグロビンが安定に保持される。本発明の緩衝液のｐＨは、上記と同様、約5.0 〜約8.5 、好ましくは約5.5 〜約7.5 、より好ましくは約6.0 〜約7.0 の範囲である。このｐＨを維持する緩衝液であれば、特に限定はない。好適な緩衝液としては、当業者に周知のリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、β−β’ジメチルグルタル酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられる。グッドの緩衝液としては、グリシン、グリシルグリシン、トリス- 塩酸、ＭＥＳ（2-(N- モノホリノ) エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ-2- ヒドロキシエチル- ピペラジン- Ｎ’- エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）等が好適に用いられる。
【００３９】
本発明のヒトヘモグロビン含有溶液は、ヒトヘモグロビンと上記カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群から選択される１種または２種以上の物質を含有する。これにより、本発明のヒトヘモグロビンの含有溶液中では、ヒトヘモグロビンが安定に保持される。本発明のヒトヘモグロビンの含有溶液は、具体的には陽性コントロール液またはヒトヘモグロビン標準溶液である。ヒトヘモグロビンの含有溶液中のヒトヘモグロビン濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌが適切である。
【００４０】
本発明のヒトヘモグロビンの安定化方法、ヒトヘモグロビン含有溶液又はヒトヘモグロビン含有物を溶解するための緩衝液中には、保存安定性を高めるために、抗菌剤（例えば、アジ化ナトリウム）、蛋白質安定剤（例えば、アルブミン）、塩化ナトリウム等を添加することが望ましい。アジ化ナトリウムの濃度としては約0.02〜約2.0 ％、好ましくは約0.1 〜約0.5 ％である。アルブミンとしては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく、濃度としては約0.01〜約2.0 ％、好ましくは約0.05〜約0.5 ％が好ましい。塩化ナトリウムは生理的食塩水の濃度近傍が好ましい。また、その他の無機塩類や糖類、アミノ酸類、キレート剤等を添加してもよい。
【００４１】
本発明のヒトヘモグロビン測定用採便容器は、上記本発明の緩衝液を含む。緩衝液は、好適には、ガラス製、プラスチック性の容器に適切な量含まれている。採便容器には、採便器具（例えば、スティック等）を付属することができ、当該採便器具で糞便を採取し、一定量の糞便を緩衝液に溶解させるようにすることができる。
【００４２】
本発明におけるヒトヘモグロビンの測定方法は免疫学的方法である。即ち、上記本発明の緩衝液に溶解したヒトヘモグロビン標品、赤血球から調製したヒトヘモグロビン、あるいはヒト糞便中のヒトヘモグロビンと抗ヒトヘモグロビン抗体とを抗原抗体反応させる。抗原抗体反応条件は、当業者に周知である。適切な緩衝液と温度、例えば30℃〜40℃、で適切な時間反応させる。
【００４３】
さらに、抗原抗体反応をコントロールする目的で、ポリエチレングリコール（2,000 、4,000 、6,000 、20,000）やデキストラン等の物質を、本発明のヒトヘモグロビン含有溶液又はヒトヘモグロビン含有物を溶解するための緩衝液に添加してもよい。添加する濃度は、約0.001 〜約４％が好適である。
【００４４】
ヒトヘモグロビンの測定方法としては、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法であればどのようなものでもよい。好適には金コロイド凝集比色法が用いられる。この方法は、金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体がヘモグロビンを介して凝集する際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定して、ヒトヘモグロビンを検出する方法である。金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体としては、周知の方法で抗ヘモグロビン抗体を作成して金コロイドに標識してもよく、あるいは、市販の金コロイド試薬凍結乾燥品（例えばメイチェックヘモプレート（オート）：日本商事（株）製）を、適切な緩衝液に溶解して金コロイド試薬液として用いてもよい。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
(1) ヒトヘモグロビンの調製
市販のヒト赤血球を蒸留水中で破壊した後、シアンメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキット−Ｎ；日本商事( 株) 製）にてヘモグロビン濃度を測定した。その後、生理食塩水を用いてヒトヘモグロビン溶液（1mg/ml）を調製し-40 ℃で凍結保存した。
【００４６】
(2) 対照溶液の調製
1mg/mlヒト糞便を、0.9 ％塩化ナトリウム、1.8 ％ポリエチレングリコール20,000、0.2 ％ＢＳＡ、0.2 ％アジ化ナトリウムを含む30mM ＭＥＳ緩衝液ｐＨ6.3 に溶解し、対照溶液を調製した。
【００４７】
(3) 試験溶液の調製
(2) で得られた対照溶液に表１に記載の物質を添加し、試験溶液を調製した。なお、表１記載の添加物質の濃度( ％) は、試験溶液中におけるその物質の終濃度（重量％）を示す。表２および表３においても同様である。
【００４８】
(4) 検体希釈液
0.9 ％塩化ナトリウム、1.8 ％ポリエチレングリコール20,000、0.05％BSA 、0.1 ％DL- アスパラギン、0.05％アジ化ナトリウムを含む、30mM ＭＥＳ緩衝液ｐＨ5.7 を調製し、検体希釈液とした。
【００４９】
(5) 試験方法
上記対照溶液および試験溶液に、上記(1) で調製したヒトヘモグロビンを200ng/mlとなる様に添加して試料とし、以下の方法でヒトヘモグロビンを測定した。
ヒトヘモグロビンの測定には、市販の金コロイド試薬凍結乾燥品（メイチェックヘモプレート（オート）：日本商事（株）製）を、0.1 ％ＢＳＡ、3.0 ％マンニトール、0.05％アジ化ナトリウムを含む10mM ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ7.5 、30mlで溶解して、金コロイド試薬液として用い、金コロイド凝集比色法で行った。
ＥＩＡ用マイクロプレートに試料25μｌを分注し、検体希釈液50μｌと金コロイド試薬液100 μｌとを添加後１０秒間マイクロミキサー（三光純薬（株）製）で攪拌した。金コロイド試薬添加１分後と７分後の吸光度（主波長540nm 、副波長700nm ）をマイクロプレートリーダー（和光純薬工業（株）製）を用いて測定し、その吸光度差を求めた。
【００５０】
試料調製当日および37℃、１日保存後に測定を行った。各試料の調製当日の吸光度差と、37℃、１日保存後の吸光度差の比から残存率( ％) を求め、ヘモグロビン安定化の指標とした。その結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】

【００５２】
表１より、対照溶液でのヘモグロビン残存率に比して、カゼイン、塩化アルミニウム、硫酸アンモニウムアルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、ホウ酸、チオ尿素、塩化カルシウム、酢酸カルシウムを含有する溶液の残存率は高く、ヘモグロビンの安定化効果が認められた。
【００５３】
（実施例２）
実施例１にて、ヘモグロビン安定化効果が認められた物質のうち、カゼイン、塩化アルミニウム、ホウ酸、塩化カルシウム、およびチオ尿素について、安定化効果の確認と、添加濃度の検討を行った。安定化効果の確認は実施例１と同じ方法で行った。その結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
カゼイン、塩化アルミニウム、ホウ酸、塩化カルシウム、およびチオ尿素は各々、検討した濃度において安定化効果が認められた。
【００５６】
（実施例３）
実施例１および２でヘモグロビン安定化効果が認められた物質を組み合わせて用いた場合の安定化効果を、実施例１と同様の方法で評価した。その結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】

【００５８】
カゼイン、塩化アルミニウム、チオ尿素、塩化カルシウム、ホウ酸をそれぞれ単独で配合する場合と同様に、これらの物質を組み合わせて存在させた場合にも、安定化効果が認められた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の溶液中におけるヒトヘモグロビンの安定化法によれば、カゼイン、ホウ酸又はその塩、アルミニウム塩、チオ尿素、塩化カルシウム及び酢酸カルシウムから選ばれる１種または２種以上の物質を含有させることにより、ヒトヘモグロビンの変性または分解を抑制することができる。本発明により、便潜血検査において糞便を含む被検試料中のヒトヘモグロビンを数日間安定化することが可能となり、検査施設で検出するまで安定な状態で保存でき、より正確な測定結果を得ることができる。また、ヒトヘモグロビンを含む安定な陽性コントロール液または標準溶液を作製し、測定値の精度管理を行うことが可能となる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for stabilizing human hemoglobin in a solution and a buffer solution for dissolving human hemoglobin-containing material, a buffer solution for stably holding human hemoglobin, or a solution that stably contains human hemoglobin. Furthermore, the present invention relates to a human hemoglobin measurement stool collection container containing a buffer that stably holds human hemoglobin.
[0002]
By applying the method for stabilizing human hemoglobin of the present invention to detection of human hemoglobin, for example, a standard solution, a positive control solution (hereinafter referred to as a positive control solution), and a test sample (for example, stool) Degeneration and / or degradation of human hemoglobin in the lysate) is suppressed, and the concentration of human hemoglobin can be measured more accurately.
[0003]
[Prior art]
In recent years, as a method for early detection of diseases of the lower digestive tract such as colorectal cancer, detection of fecal occult blood components, particularly human hemoglobin, caused by bleeding from the digestive tract has been widely performed. As a method for detecting such human hemoglobin, an immunological detection method that does not require restriction of food intake or drug administration, which has been conventionally required, has become widespread and has become established as a simple test method.
[0004]
As the above-mentioned immunological detection method of human hemoglobin, for example, a one-dimensional immunodiffusion method using a sedimentation line between an anti-human hemoglobin antibody and human hemoglobin in a test sample in an agar plate, and an anti-human hemoglobin antibody were sensitized Reverse passive hemagglutination using animal blood cells, latex agglutination using latex particles sensitized with anti-human hemoglobin antibody, enzyme immunization or radioimmunoassay using anti-human hemoglobin antibody labeled with enzyme or radioactive element, anti-human hemoglobin Examples thereof include a colloidal gold colorimetric method using colloidal gold particles sensitized with an antibody.
[0005]
In the above detection method, human hemoglobin, which is a test substance, is usually subjected to a test in a solution state. For example, in a fecal occult blood test, feces are dissolved in physiological saline or a buffer solution, and the solution is used as a test sample for measuring human hemoglobin.
[0006]
It is known that human hemoglobin in a test sample is denatured or degraded with increasing temperature and time. Due to the denaturation or degradation of human hemoglobin, the antigenic determinant is inactivated, and the detection sensitivity in the immunological detection method is significantly reduced. In particular, when the concentration of human hemoglobin is low, the concentration of human hemoglobin falls below the detection limit due to the above-described denaturation or decomposition, and the diagnosis is erroneous. Similar denaturation or degradation of human hemoglobin also occurs in a positive control solution used for confirming test performance, or in a hemoglobin standard solution used for quantifying hemoglobin, and is an obstacle to accurate measurement.
[0007]
By the way, the actual situation of the fecal occult blood test is often taken by the subject himself / herself at home or the like, dissolved in a stool solution, and mailed or brought by the subject to the hospital. For this reason, the fecal occult blood test sample is often placed in a solution state for several days from the time when the stool is collected until the start of the inspection in the inspection organization. In addition, even when the stool is collected at an inspection organization, since other items are being tested, it may take a long time to check for fecal occult blood. The examination under such circumstances is not preferable in that, for example, human hemoglobin is denatured or decomposed as described above, and accurate measurement cannot be performed.
[0008]
In order to prevent such degeneration or degradation of human hemoglobin, methods for adding various substances to a stool solution for detecting fecal occult blood have been studied. For example, bovine serum albumin (BSA) or addition of general antibacterial agents such as thimerosal and sodium azide, addition of animal serum (JP 4-145366), addition of sugar (JP 63-243756) ), Addition of sodium azide, albumin and lactic acid (JP-A-6-281654), addition of lytic enzyme (JP-A-5-69466), addition of protease inhibitor (JP-A-3-279859), The addition of iron protoporphyrin (JP-A-5-281227) has been reported. A method for controlling pH (Japanese Patent Laid-Open No. 5-281226) has also been reported. Furthermore, as a method for preventing the decomposition of hemoglobin, a method for preventing the decomposition of hemoglobin (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 60-35270) or hemoglobin by adding a specific nitrogen-containing compound to hemoglobin to prevent the release of iron from the heme portion A method for suppressing the degradation of hemoglobin by causing a non-penicillin antibiotic to coexist in the contained sample has been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 7-72154). In addition, a method of adding a chelating reagent (JP-A-5-99923 and JP-A-2-218259) and a method of adding a water-soluble transition metal complex (JP-A-7-229902) have been reported. . Furthermore, addition of sodium fluoride (JP-A-791026), addition of animal hemoglobin (JP-A-2-296149), and a method in which iron protein other than hemoglobin and ferricyan ion coexist with hemoglobin (special (Kaihei 8-262020)) has been reported.
[0009]
However, these known human hemoglobin stabilization techniques do not sufficiently suppress the denaturation or degradation of human hemoglobin in a test sample containing feces.
[0010]
Furthermore, even if the above-mentioned known technique is used to stabilize human hemoglobin prepared from human hemoglobin preparations or red blood cells in solution for the purpose of use as a positive control solution or standard solution that does not contain stool, human hemoglobin is not present. It is stable and does not sufficiently prevent its denaturation or decomposition. Therefore, there is a demand for a method of stably holding various hemoglobins such as hemoglobin in stool or hemoglobin preparation, hemoglobin prepared from red blood cells, etc. in a solution.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
Thus, an object of the present invention is to provide a novel method for stabilizing human hemoglobin. More specifically, an object of the present invention is to obtain a more accurate measurement value by increasing the stability of human hemoglobin in a test sample containing feces. Another object of the present invention is to provide a stool solution for stabilizing human hemoglobin contained therein when stool is dissolved and used as a test sample, and a stool collection container containing the solution. It is in. Another object of the present invention is to provide an excellent positive control solution or hemoglobin standard solution in which human hemoglobin is stabilized.
[0012]
In view of the above circumstances and objectives, the present inventors have conducted extensive research to find an improved stabilization method for inhibiting denaturation or degradation of human hemoglobin in solution. As a result, human hemoglobin, casein, Finding a method of stabilizing hemoglobin by coexisting one or more substances selected from the group consisting of boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate in the solution The present invention has been completed.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is a method for stabilizing human hemoglobin in a solution, which is selected from the group consisting of human hemoglobin and casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate. Alternatively, the present invention relates to a method of allowing two or more substances to coexist in a solution.
[0014]
In a preferred embodiment, the two or more substances include casein and at least one substance selected from the group consisting of boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
[0015]
In a preferred embodiment, the two or more substances include boric acid or a salt thereof and at least one substance selected from an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
In a preferred embodiment, the pH of the solution is in the range of 5.5 to 7.5.
In a preferred embodiment, the human hemoglobin is human hemoglobin in feces.
[0016]
In addition, the present invention dissolves human hemoglobin-containing substances containing one or more substances selected from the group consisting of casein, boric acid or salts thereof, aluminum salts, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate. This relates to a buffer solution for
[0017]
In a preferred embodiment, the two or more substances are at least one substance selected from casein and boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
[0018]
In a preferred embodiment, the two or more substances are at least one substance selected from boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
In a preferred embodiment, the pH of the buffer solution is in the range of 5.5 to 7.5.
In a preferred embodiment, the human hemoglobin-containing material is human feces.
[0019]
Furthermore, the present invention includes human hemoglobin containing one or more substances selected from the group consisting of human hemoglobin and casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate. Regarding the solution.
[0020]
In a preferred embodiment, the two or more substances are casein and at least one substance selected from boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
[0021]
In a preferred embodiment, the two or more substances are at least one substance selected from boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
In a more preferred embodiment, the pH of the buffer is in the range of 5.5 to 7.5.
In a preferred embodiment, the human hemoglobin-containing solution is a human hemoglobin positive control solution or a human hemoglobin standard solution.
[0022]
Furthermore, the present invention provides a buffer for dissolving human hemoglobin-containing material, which contains one or more substances selected from the group consisting of casein, boric acid or salts thereof, aluminum salts, thiourea, calcium chloride and calcium acetate. The invention relates to a stool collection container for measuring human hemoglobin.
[0023]
In a preferred embodiment, the two or more substances are casein and at least one substance selected from boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
[0024]
In a preferred embodiment, the two or more substances are at least one substance selected from boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate.
In a more preferred embodiment, the pH of the buffer is in the range of 5.5 to 7.5.
[0025]
According to the present invention, human hemoglobin can be stabilized in a solution. Moreover, according to this invention, the stable positive control liquid and hemoglobin standard solution which can be used for a long term can be provided. In addition, it is possible to provide a stool dissolution buffer that dissolves stool and stabilizes human hemoglobin therein, and a stool collection container containing the buffer, and further improves the accuracy of hemoglobin measurement in the field of clinical testing. A method of improving can be provided. Therefore, the above object can be achieved by the present invention.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The human hemoglobin used in the method of the present invention may be any of human hemoglobin contained in feces, human hemoglobin prepared from red blood cells, and commercially available human hemoglobin. Human hemoglobin from erythrocytes is prepared by collecting human erythrocytes by a conventional method, or purchasing commercially available human erythrocytes and destroying the erythrocytes in distilled water.
[0027]
Commercially available products can be used as casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate used to stabilize human hemoglobin in a solution.
[0028]
The concentration of casein used in the present invention is about 0.01% to about 1.0% (% by weight, hereinafter the same), preferably about 0.05% to about 0.2%.
[0029]
Examples of the borate include sodium borate and potassium borate. The concentration of boric acid or a salt thereof is about 0.02% to about 2.0%, preferably about 0.1% to about 0.5%, as the concentration of boric acid.
[0030]
Examples of the aluminum salt include aluminum chloride, ammonium aluminum sulfate, and potassium aluminum sulfate. The concentration of the aluminum salt is about 0.001% to about 0.5%, preferably about 0.005% to about 0.1%, as the concentration of aluminum chloride.
[0031]
The concentration of thiourea is about 0.00005% to about 0.01%, preferably about 0.0001% to about 0.001%. The concentration of calcium chloride and calcium acetate is about 0.005% to about 2.0%, preferably about 0.02% to about 0.4%.
[0032]
These casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate may be added alone, or two or more of these substances may be added in combination.
[0033]
When two kinds of substances are used in combination, casein and at least one substance selected from the group consisting of boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate are included. It is preferable. Preferred combinations include casein and boric acid, casein and aluminum chloride, casein and thiourea, or a combination of casein and calcium chloride.
[0034]
It is also preferable to include boric acid or a salt thereof and at least one substance selected from an aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate. Preferred combinations include boric acid and aluminum chloride, boric acid and thiourea, and boric acid and calcium chloride.
[0035]
Further, aluminum chloride and thiourea, aluminum chloride and calcium chloride, aluminum chloride and calcium acetate may be used in combination, or thiourea and calcium chloride may be used in combination.
[0036]
In the case of three combinations, casein and boric acid and aluminum chloride, casein and boric acid and thiourea, casein and boric acid and calcium chloride, casein and boric acid and calcium acetate, boric acid and aluminum chloride and calcium chloride A combination of boric acid, thiourea and calcium chloride is preferred. Furthermore, four or more kinds of substances may be included. The concentration of addition in the case where two or more of these substances coexist may be in the above concentration range.
[0037]
When one or more of the above substances are contained, the pH of the solution that stabilizes human hemoglobin is in the range of about 5.0 to about 8.5, preferably about 5.5 to about 7.5, more preferably about 6.0 to about 7.0. It is. This is because the stability of hemoglobin may be impaired under extreme acid or alkaline conditions. Appropriate buffers are used to maintain the pH.
[0038]
A buffer solution for dissolving the human hemoglobin-containing material of the present invention (hereinafter simply referred to as the buffer solution of the present invention) is a group consisting of the above casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate. 1 type or 2 or more types of substances selected from these are contained. Thereby, when a human hemoglobin-containing material is dissolved in the buffer solution of the present invention, human hemoglobin is stably held. The pH of the buffer of the present invention is in the range of about 5.0 to about 8.5, preferably about 5.5 to about 7.5, more preferably about 6.0 to about 7.0, as described above. If it is a buffer solution which maintains this pH, there will be no limitation in particular. Suitable buffers include phosphate buffer, citrate buffer, β-β ′ dimethyl glutarate buffer, Good's buffer, etc., well known to those skilled in the art. Good buffers include glycine, glycylglycine, Tris-hydrochloric acid, MES (2- (N-monophorino) ethanesulfonic acid), HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-ethanesulfonic acid), TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) and the like are preferably used.
[0039]
The human hemoglobin-containing solution of the present invention contains human hemoglobin and one or more substances selected from the group consisting of casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate. . Thereby, human hemoglobin is stably held in the human hemoglobin-containing solution of the present invention. The human hemoglobin-containing solution of the present invention is specifically a positive control solution or a human hemoglobin standard solution. An appropriate concentration of human hemoglobin in the human hemoglobin-containing solution is about 10 ng / ml to about 1 mg / ml.
[0040]
In the method for stabilizing human hemoglobin of the present invention, the human hemoglobin-containing solution or the buffer solution for dissolving the human hemoglobin-containing product is provided with an antibacterial agent (for example, sodium azide), protein stability, in order to enhance storage stability. It is desirable to add an agent (eg, albumin), sodium chloride or the like. The concentration of sodium azide is about 0.02 to about 2.0%, preferably about 0.1 to about 0.5%. The albumin is preferably bovine serum albumin (BSA), and the concentration is preferably about 0.01 to about 2.0%, preferably about 0.05 to about 0.5%. Sodium chloride is preferably close to the concentration of physiological saline. Further, other inorganic salts, saccharides, amino acids, chelating agents and the like may be added.
[0041]
The human hemoglobin measurement stool collection container of the present invention contains the buffer of the present invention. The buffer is preferably contained in an appropriate amount in a glass, plastic container. A stool collection device (for example, a stick or the like) can be attached to the stool collection container. Feces can be collected with the stool collection device, and a certain amount of stool can be dissolved in a buffer solution.
[0042]
The method for measuring human hemoglobin in the present invention is an immunological method. That is, a human hemoglobin sample dissolved in the buffer of the present invention, a human hemoglobin prepared from red blood cells, or a human hemoglobin in human feces and an anti-human hemoglobin antibody are reacted with each other by an antigen-antibody reaction. Antigen-antibody reaction conditions are well known to those skilled in the art. React with an appropriate buffer and temperature, for example, 30 ° C. to 40 ° C. for an appropriate time.
[0043]
Furthermore, for the purpose of controlling the antigen-antibody reaction, a substance such as polyethylene glycol (2,000, 4,000, 6,000, 20,000) or dextran is added to the human hemoglobin-containing solution or the buffer for dissolving the human hemoglobin-containing material of the present invention. May be. The concentration to be added is preferably about 0.001 to about 4%.
[0044]
As a method for measuring human hemoglobin, any immunological detection method using an anti-human hemoglobin antibody may be used. A gold colloid aggregation colorimetric method is preferably used. This method is a method for detecting human hemoglobin by optically measuring a color difference (color tone change) generated when a colloidal gold-labeled anti-human hemoglobin antibody aggregates via hemoglobin. As the colloidal gold-labeled anti-human hemoglobin antibody, an anti-hemoglobin antibody may be prepared by a well-known method and labeled with colloidal gold, or a commercially available gold colloid reagent freeze-dried product (for example, Maycheck hemoplate (auto): Nippon Shoji Co., Ltd.) may be dissolved in an appropriate buffer and used as a gold colloid reagent solution.
[0045]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely based on an Example, this invention is not limited to these.
Example 1
(1) Preparation of human hemoglobin After destroying commercially available human erythrocytes in distilled water, the hemoglobin concentration was measured by the cyanmethemoglobin method (Nescoat hemokit-N; manufactured by Nippon Shoji Co., Ltd.). Thereafter, a human hemoglobin solution (1 mg / ml) was prepared using physiological saline and stored frozen at −40 ° C.
[0046]
(2) Preparation of control solution
A control solution was prepared by dissolving 1 mg / ml human feces in 30 mM MES buffer pH 6.3 containing 0.9% sodium chloride, 1.8% polyethylene glycol 20,000, 0.2% BSA, 0.2% sodium azide.
[0047]
(3) Preparation of test solution
The substances listed in Table 1 were added to the control solution obtained in (2) to prepare a test solution. The concentration (%) of the additive substance described in Table 1 represents the final concentration (% by weight) of the substance in the test solution. The same applies to Tables 2 and 3.
[0048]
(4) Sample diluent
A 30 mM MES buffer pH 5.7 containing 0.9% sodium chloride, 1.8% polyethylene glycol 20,000, 0.05% BSA, 0.1% DL-asparagine, 0.05% sodium azide was prepared and used as a sample dilution.
[0049]
(5) Test method The human hemoglobin prepared in (1) above was added to the control solution and the test solution so as to be 200 ng / ml to prepare a sample, and human hemoglobin was measured by the following method.
For the measurement of human hemoglobin, a commercially available gold colloid reagent freeze-dried product (Maycheck hemoplate (Auto): manufactured by Nippon Shoji Co., Ltd.), 10 mM HEPES containing 0.1% BSA, 3.0% mannitol and 0.05% sodium azide is used. The solution was dissolved in 30 ml of buffer pH 7.5 and used as a gold colloid reagent solution, and the gold colloid aggregation colorimetric method was used.
25 μl of the sample was dispensed onto the EIA microplate, 50 μl of the sample diluent and 100 μl of the gold colloid reagent solution were added, and then stirred for 10 seconds with a micromixer (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). Absorbance (main wavelength: 540 nm, subwavelength: 700 nm) 1 minute and 7 minutes after the addition of the colloidal gold reagent was measured using a microplate reader (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the difference in absorbance was determined.
[0050]
Measurement was performed on the day of sample preparation and after storage at 37 ° C. for 1 day. The residual ratio (%) was determined from the ratio of the difference in absorbance on the day of preparation of each sample and the difference in absorbance after storage at 37 ° C. for 1 day, and used as an index for stabilizing hemoglobin. The results are shown in Table 1.
[0051]
[Table 1]

[0052]
From Table 1, the residual ratio of the solution containing casein, aluminum chloride, aluminum ammonium sulfate, potassium aluminum sulfate, boric acid, thiourea, calcium chloride, and calcium acetate is higher than that of the hemoglobin in the control solution. A stabilizing effect was observed.
[0053]
(Example 2)
Among the substances in which the hemoglobin stabilization effect was recognized in Example 1, the stabilization effect was confirmed and the addition concentration was examined for casein, aluminum chloride, boric acid, calcium chloride, and thiourea. The stabilization effect was confirmed by the same method as in Example 1. The results are shown in Table 2.
[0054]
[Table 2]

[0055]
Casein, aluminum chloride, boric acid, calcium chloride, and thiourea each showed a stabilizing effect at the concentrations studied.
[0056]
(Example 3)
In the same manner as in Example 1, the stabilization effect was evaluated in the case of using a combination of substances in which the hemoglobin stabilization effect was recognized in Examples 1 and 2. The results are shown in Table 3.
[0057]
[Table 3]

[0058]
Similar to the case where casein, aluminum chloride, thiourea, calcium chloride, and boric acid were each added alone, a stabilizing effect was also observed when these substances were present in combination.
[0059]
【The invention's effect】
According to the method for stabilizing human hemoglobin in the solution of the present invention, one or more substances selected from casein, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, thiourea, calcium chloride and calcium acetate are included. Thus, denaturation or degradation of human hemoglobin can be suppressed. According to the present invention, it is possible to stabilize human hemoglobin in a test sample containing feces in a fecal occult blood test for several days, and it can be stored in a stable state until it is detected in a laboratory, thereby obtaining a more accurate measurement result. Can do. In addition, it is possible to prepare a stable positive control solution or standard solution containing human hemoglobin, and to manage the accuracy of the measured values.

Claims

A method of stabilizing a solution of human hemoglobin, human hemoglobin, boric acid or a salt thereof, aluminum salt, and one or more substances selected from the group consisting of calcium chloride and calcium acetate The method of coexisting in the solution whose pH is in the range of 5.5 to 7.5 .

Before Symbol substance is a boric acid or a salt thereof, The method of claim 1.

The two or more materials, boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, a combination of at least one material selected from the group consisting of calcium chloride and calcium acetate The method of claim 1.

Furthermore, Ru coexist casein in solution, method of any of claims claims 1 to 3.

Boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, contain one or more substances selected from the group consisting of calcium chloride and calcium acetate, pH is area by der from 5.5 to 7.5, a human hemoglobin-containing material Buffer for lysis.

Before Symbol substance is a boric acid or a salt thereof, a buffer solution according to claim 5.

The two or more materials, boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, a combination of at least one substance selected from calcium chloride and calcium acetate buffer of claim 5.

Furthermore, you containing casein, buffer solution according to any one of claims claims 5 to 7.

The buffer solution according to any one of claims 5 to 8, wherein the human hemoglobin-containing material is human feces.

Human hemoglobin, boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, containing the one or more substances selected from the group consisting of calcium chloride and calcium acetate, pH is area by der from 5.5 to 7.5, A solution containing human hemoglobin.

Before Symbol substance is a boric acid or a salt thereof, human hemoglobin-containing solution of claim 10.

The two or more materials, boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, a combination of at least one substance selected from calcium chloride and calcium acetate, human hemoglobin-containing solution of claim 10.

Furthermore, you containing casein, human hemoglobin-containing solution according to any of claims claims 10 to 12.

The human hemoglobin-containing solution according to any one of claims 10 to 13, wherein the human hemoglobin-containing solution is a human hemoglobin positive control solution or a human hemoglobin standard solution.

Boric acid or a salt thereof, an aluminum salt, contain one or more substances selected from the group consisting of calcium chloride and calcium acetate, a pH of human hemoglobin-containing material dissolved area by der from 5.5 to 7.5 A stool collection container for human hemoglobin measurement containing a buffer solution.

Furthermore, the stool collection container for human hemoglobin measurement of Claim 15 containing casein.