JP4029221B2

JP4029221B2 - Myocardial infarction preventive and therapeutic agent

Info

Publication number: JP4029221B2
Application number: JP33281195A
Authority: JP
Inventors: 昭松森; 洋巳和田; 淳司淀井
Original assignee: Redox Bioscience Inc
Current assignee: Redox Bioscience Inc
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2015-11-27
Also published as: JPH09143092A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト成人Ｔ細胞白血病由来因子（以下「ヒトＡＤＦ」という）活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する心筋梗塞予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、我国においては、人口の高齢化や食生活の変化等により、心筋梗塞が急増していることから、これらの原因の究明と、心筋梗塞の予防及び治療が重大な問題となっている。
心筋梗塞は、心臓の拍動を司る心筋への血流を構成する冠状動脈が、何らかの原因により血行障害を起こし、心筋が壊死等に陥ることにより発症するとされる。このような血行障害は、血栓が冠状動脈内に発生して急速に血流が遮断される場合、冠状動脈狭窄により緩やかに血流が遮断される場合等に惹起される。
【０００３】
心筋梗塞の原因については種々の研究が行れている。現在では、冠状動脈に粥状硬化が起こり、内腔が狭くなったところに血栓形成が生じること、冠状動脈の狭窄が徐々にしかも高度に進行して心筋の虚血が発生して心筋壊死に至ること、等により発症することが判っている。
このような粥状硬化の原因については、遺伝的体質、高血圧、高コレステロール血症、糖尿病、喫煙、ストレス、運動不足等が考えられている。また、女子よりも男子の発症比率が高いことから、女性ホルモンが何らかの防御作用を有していることが示唆されている。
【０００４】
しかしながら心筋梗塞の原因療法については、上のような現状から根本的な治療方法が確立されているわけではない。現在では、より対症的な方法により種々の薬物の投与が行われている。例えば、血栓溶解剤として、ｔ−ＰＡ、ｐｒｏ−ＵＫ等が使用されているが、これらは再潅流時に不整脈や出血等の副作用が起こり適応及び使用に充分な配慮が必要となる。
そこで、再潅流時に良好な血流を確保し、副作用が生じない薬物の開発が求められていた。
【０００５】
ところで、ヒトＡＤＦは、最初、インターロイキン２レセプターの発現を誘導する物質として発見され、ヒト成人型Ｔ白血病患者より樹立したＴ白血病細胞株の培養液上清中に存在することが見いだされたものである（特公平５−５５５１９号公報）。このヒトＡＤＦは、その後の種々の研究により、ポリペプチドであることが判明し、そのアミノ酸配列も明細書末尾に明記する配列表のように決定された。
【０００６】
現在では、このヒトＡＤＦとともにヒトＡＤＦと同様の活性を有する他のポリペプチドも、「ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド」として知られており、本明細書においては、これらヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドも、ヒトＡＤＦと同等に取り扱うこととする。
【０００７】
ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドについては、その薬理作用について種々の研究が行われている。特開平３−２０４８１８号公報には、放射線防護剤を初め、抗炎症剤、リウマチ治療剤、自己免疫疾患治療剤、虚血性臓器障害治療剤、薬物中毒治療剤、動脈硬化治療剤等が開示されている。しかしながら、これらの作用機作は、放射線による生体障害に起因するフリーラジカルが生体構成物質を攻撃して損傷を与えることを前提としているので、放射線照射とは無関係な疾患への適用が明らかにされているわけではない。
【０００８】
特開平５−１３９９９２号公報には、ヒトＡＤＦを、臓器移植時等における移植臓器の損傷軽減、虚血再潅流臓器障害を伴う心臓、脳、消化器等を活性酸素から保護する臓器保護等に使用する技術が開示されている。しかしながら、これらの作用機作は、活性酸素から保護することを目的とするものに限定されていた。
【０００９】
特開平６−９４３３号公報には、ヒトＡＤＦを有するポリペプチドを、膵炎の予防治療に用いる技術が開示されている。しかしながら、この場合の作用機作もフリーラジカル生成酵素であるキサンチンオキシダーゼ等の不活性化を目的とするものであった。
【００１０】
心筋梗塞の原因については、上述したように種々の可能性が示唆されてはいるが、平行して研究されている疫学的検討によっても、その本質的病因は、いまだ解明されておらず、むしろ、精神的ストレス、運動不足、高コレステロール食等が複雑に絡み合ってその病因となっている可能性が高い。
【００１１】
ところで、急性心筋梗塞にあっては、発作が起こった後の数十分以内の措置により予後が全く異なることが知られ、初期治療の重要性が明白となっている。急性心筋梗塞においては、種々の要因により一旦冠動脈が閉塞することから、その閉塞後の再潅流時において良好な血流と正常状態の復帰が早期に行れることが、急性心筋梗塞の治療には欠かせない事項となっている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状に鑑み、本発明は、急性及び慢性の心筋梗塞を効果的に予防し、発作時の応急措置として高い信頼性を有する治療効果をも有する心筋梗塞予防治療剤を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、心筋梗塞予防治療剤を、ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有するものとするところに存する。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明で使用されるヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドとしては、ヒトＡＤＦ活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、Ｎ末端にメチオニン残基が付加されたポリペプチド；化学修飾、塩基置換法等によりアミノ酸配列に置換が加えられたポリペプチド；アミノ酸配列の一部に欠損があるポリペプチド；アミノ酸残基の挿入が加えられたポリペプチド；側鎖に糖鎖等が付加されたポリペプチド等を挙げることができる。
【００１５】
好ましくは、下記配列表の配列番号１に示すＮ末端バリンから始まる１０４個のアミノ酸からなるポリペプチド、下記配列表の配列番号２に示すメチオニンがＮ末端に付加された１０５個のアミノ酸からなるポリペプチド等を挙げることができる。
【００１６】
上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドの製造方法としては特に限定されず、例えば、▲１▼ＡＴＬ−２細胞等のヒト由来細胞株を培養し、上記培養で得られる培養液又は細胞抽出液から塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等、一般的に用いられる手法により精製して得る方法、▲２▼遺伝子組換え法により、ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドのｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子を大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物細胞、植物細胞等の宿主細胞に導入し、宿主細胞内で組換えヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドを発現させ、その後▲１▼の手法等を用いて精製する方法、▲３▼ペプチド化学合成法により合成する方法等を挙げることができる。
【００１７】
上記遺伝子組換え法で使用されるヒトＡＤＦ遺伝子としては、例えば、上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドをコードするものであれば特に限定されず、例えば、塩基置換、塩基挿入、塩基欠損等を有するものであってもよい。好ましくは、下記配列表の配列番号１に示すＮ末端バリンから始まる１０４個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするもの、下記配列表の配列番号２に示すメチオニンがＮ末端に付加された１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするもの等である。
【００１８】
本発明の心筋梗塞予防治療剤は、上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有するものである。
上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドの剤型としては特に限定されず、例えば、静注用剤型であってもよく、非注射用剤型であってもよい。好ましくは、静注用剤型であり、より好ましくは、等張性水溶液、懸濁液等である。上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドは、蒸留水又は緩衝液に溶解した後、使用されてもよく、凍結乾燥処理された後、使用されてもよい。
【００１９】
本発明の心筋梗塞予防治療剤を医薬として投与する場合、活性成分をそのまま又は活性成分を医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば、０．１〜９９．９％、好ましくは、１．０〜９９．０％含有する医薬組成物とし、それを単位投与剤型に製して投与される。上記医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体としては特に限定されず、例えば、マンニトール、シクロデキストリン等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の心筋梗塞予防治療剤は、殺菌された後、例えば、防腐剤、安定剤、膨潤剤等の補助剤；乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整する塩；緩衝剤；上記ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド以外の別の効能を有する薬剤等が、例えば、混合、溶解、凍結乾燥等により含有されたものであってもよい。
【００２１】
本発明の心筋梗塞予防治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、投与経路、病気の種類や程度等を考慮した上で設定することが望ましく、成人に対して通常０．１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１．０μｇ／ｋｇ／日〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日が使用される。
【００２２】
本発明で使用されるヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドは、ヒト由来の蛋白質であるので、人体に投与しても異物とは認識されず、毒性は、非常に低い。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
試験例
雄性家兎をケタラール及びセラクタールで麻酔した後、開胸し、冠状動脈の左回施枝に縫合糸をかけて皮下に留置した。３日後、縫合糸をゾンデを通して引き、血流を遮断して虚血した後、２０分後に糸を緩めて再潅流を行った。
ヒトＡＤＦを、上記の虚血１５分後に１５ｍｇ／ｋｇ静注し、再潅流直後に、同量を静注した。
上記試験中、虚血前、虚血中、再潅流直後、麻酔下にて心電図をとり、ＳＴ上昇の程度を評価した。また、虚血前、再潅流の３０分、４５分、６０分及び７５分後にそれぞれ採血し、ＣＰＫ（クリアチン・ホスフォ・キナーゼ）量を測定して虚血前値からの上昇を比較した。対照として、ヒトＡＤＦを投与しない群を、同時に測定した。心電図上ＳＴの結果を図１に、ＣＰＫの変化量の結果を図１及び図２に示した。
【００２５】
血中のＣＰＫの量は、血管障害の存在により上昇することが判っているので、血中ＣＰＫ量の測定により、血管障害の有無を測定することが有効である。
【００２６】
心電図上ＳＴは、再潅流により更に上昇したが、ヒトＡＤＦを投与することにより、低下することが判った。また、血中ＣＰＫは、再潅流の４５分後において、５％の危険率で有意差が認められ、再潅流により上昇した血中ＣＰＫが、ヒトＡＤＦ投与により有意に低下することが判った。
ヒトＡＤＦが、心筋細胞の障害を軽減することが明らかである。
【００２７】
【発明の効果】
本願発明のヒトＡＤＦは、心筋の虚血再潅流時において有効な薬理作用を有することが明白であり、心筋梗塞予防治療剤として有用である。
【００２８】
【配列表】
【００２９】

【００３０】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における心電図上ＳＴの測定結果を示す図。縦軸は、ＳＴ上昇値（ｍＶ）を表す。横軸中、左は、虚血中の測定を表し、右は、再潅流直後の測定を表す。
【図２】実施例における血中ＣＰＫの測定結果を示す図。縦軸は、ＣＰＫ量（ＩＵ／Ｌ）を表す。横軸は、再潅流後の時間（分）を表す。図中、△は、ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドを投与した群を表し、○は、対照群を表す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a prophylactic and therapeutic agent for myocardial infarction comprising a polypeptide having human adult T-cell leukemia-derived factor (hereinafter referred to as “human ADF”) activity as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
In recent years, myocardial infarction has increased rapidly due to the aging of the population, changes in dietary habits, etc. in Japan, and investigation of these causes and prevention and treatment of myocardial infarction have become serious problems.
Myocardial infarction is said to develop when coronary arteries constituting the blood flow to the myocardium responsible for the pulsation of the heart cause a blood flow disorder for some reason and the myocardium falls into necrosis. Such a blood circulation disorder is caused when a thrombus is generated in the coronary artery and the blood flow is rapidly interrupted, or when the blood flow is gently interrupted by coronary artery stenosis.
[0003]
Various studies have been conducted on the cause of myocardial infarction. At present, atherosclerosis occurs in the coronary artery and thrombus formation occurs when the lumen is narrowed, and the stenosis of the coronary artery progresses gradually and highly to cause myocardial ischemia, resulting in myocardial necrosis. It is known that it develops due to
Regarding the cause of such atherosclerosis, genetic constitution, hypertension, hypercholesterolemia, diabetes, smoking, stress, lack of exercise, etc. are considered. Moreover, since the onset ratio of boys is higher than that of girls, it is suggested that female hormones have some protective action.
[0004]
However, as for the causal treatment of myocardial infarction, the fundamental treatment method has not been established from the above situation. Currently, various drugs are administered by a more symptomatic method. For example, t-PA, pro-UK, and the like are used as thrombolytic agents. However, side effects such as arrhythmia and bleeding occur during reperfusion, and sufficient consideration is required for adaptation and use.
Therefore, there has been a demand for the development of a drug that ensures good blood flow during reperfusion and does not cause side effects.
[0005]
By the way, human ADF was first discovered as a substance that induces expression of interleukin 2 receptor, and was found to be present in the culture supernatant of a T leukemia cell line established from a human adult type T leukemia patient. (Japanese Patent Publication No. 5-55519). This human ADF was found to be a polypeptide by various subsequent studies, and its amino acid sequence was also determined as shown in the sequence listing specified at the end of the specification.
[0006]
At present, other polypeptides having the same activity as human ADF together with this human ADF are also known as “polypeptides having human ADF activity”. In the present specification, these polypeptides having human ADF activity are also known. Will be handled in the same way as human ADF.
[0007]
Various studies have been conducted on the pharmacological action of polypeptides having human ADF activity. JP-A-3-204818 discloses radioprotective agents, anti-inflammatory agents, rheumatic therapeutic agents, autoimmune disease therapeutic agents, ischemic organ disorder therapeutic agents, drug addiction therapeutic agents, arteriosclerosis therapeutic agents, and the like. ing. However, these mechanisms of action are based on the premise that free radicals resulting from biological damage caused by radiation attack and damage biological constituents, and thus their application to diseases unrelated to radiation irradiation has been clarified. I don't mean.
[0008]
Japanese Patent Laid-Open No. 5-139992 discloses human ADF for reducing organ damage during organ transplantation, organ protection for protecting heart, brain, digestive organs and the like with ischemia-reperfusion organ injury from active oxygen, etc. The technique used is disclosed. However, these mechanisms of action have been limited to those intended to protect against active oxygen.
[0009]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-9433 discloses a technique in which a polypeptide having human ADF is used for the prevention and treatment of pancreatitis. However, the mechanism of action in this case was also intended to inactivate xanthine oxidase, which is a free radical-generating enzyme.
[0010]
As described above, various possibilities for the cause of myocardial infarction have been suggested, but the essential etiology has not yet been elucidated by the epidemiological studies studied in parallel. There is a high possibility that mental stress, lack of exercise, high cholesterol diet, etc. are complicatedly intertwined with the pathogenesis.
[0011]
By the way, in acute myocardial infarction, it is known that the prognosis is completely different depending on measures within tens of minutes after the occurrence of a seizure, and the importance of initial treatment is clear. In acute myocardial infarction, the coronary artery is temporarily occluded due to various factors, so that good blood flow and normal recovery can be achieved early during reperfusion after the occlusion. It is an indispensable matter.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, the present invention aims to provide a preventive and therapeutic agent for myocardial infarction that effectively prevents acute and chronic myocardial infarction and also has a highly reliable therapeutic effect as an emergency measure at the time of stroke. To do.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The gist of the present invention resides in that the agent for preventing or treating myocardial infarction contains a polypeptide having human ADF activity as an active ingredient.
The present invention is described in detail below.
[0014]
The polypeptide having human ADF activity used in the present invention is not particularly limited as long as it has human ADF activity. For example, a polypeptide having a methionine residue added to the N-terminus; chemical modification, base substitution A polypeptide in which a substitution is added to the amino acid sequence by a method; a polypeptide in which a part of the amino acid sequence is deleted; a polypeptide in which an amino acid residue is inserted; a polypeptide in which a sugar chain or the like is added to the side chain Etc.
[0015]
Preferably, a polypeptide consisting of 104 amino acids starting from the N-terminal valine shown in SEQ ID NO: 1 in the following sequence listing, and a polypeptide consisting of 105 amino acids added with methionine shown in SEQ ID NO: 2 in the following sequence listing added to the N-terminus A peptide etc. can be mentioned.
[0016]
The method for producing the polypeptide having human ADF activity is not particularly limited. For example, (1) a human-derived cell line such as ATL-2 cells is cultured, and a salt is obtained from the culture solution or cell extract obtained by the culture. Analysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, etc. To introduce a cDNA or genomic gene of a polypeptide having human ADF activity into a host cell such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, higher animal cells, plant cells, etc., and a polypeptide having recombinant human ADF activity in the host cell. A method of expressing and then purifying using the method of (1), etc., (3) peptide And a method such as that synthesized by Manabu synthesis.
[0017]
The human ADF gene used in the genetic recombination method is not particularly limited as long as it encodes a polypeptide having the human ADF activity, and has, for example, base substitution, base insertion, base deletion, etc. It may be a thing. Preferably, those encoding a polypeptide consisting of 104 amino acids starting from the N-terminal valine shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing below, 105 having methionine shown in SEQ ID NO: 2 in the following sequence listing added to the N-terminus For example, it encodes a polypeptide consisting of amino acids.
[0018]
The agent for preventing or treating myocardial infarction of the present invention comprises the above-mentioned polypeptide having human ADF activity as an active ingredient.
The dosage form of the polypeptide having human ADF activity is not particularly limited, and may be, for example, an intravenous dosage form or a non-injectable dosage form. Preferred are intravenous dosage forms, and more preferred are isotonic aqueous solutions and suspensions. The polypeptide having human ADF activity may be used after being dissolved in distilled water or a buffer solution, or may be used after being lyophilized.
[0019]
When the agent for preventing or treating myocardial infarction of the present invention is administered as a pharmaceutical, the active ingredient is used as it is or in a non-toxic and inert carrier that is pharmaceutically acceptable, for example, 0.1 to 99.9%, Preferably, a pharmaceutical composition containing 1.0 to 99.0% is prepared and administered in a unit dosage form. The pharmaceutically acceptable non-toxic and inert carrier is not particularly limited, and examples thereof include mannitol and cyclodextrin.
[0020]
The agent for preventing and treating myocardial infarction of the present invention is, for example, an auxiliary agent such as a preservative, a stabilizer, a swelling agent; an emulsifier, a solubilizer, a salt for adjusting osmotic pressure; a buffer; A drug having another effect other than a polypeptide having a phenotype may be contained, for example, by mixing, dissolving, lyophilizing, or the like.
[0021]
The dose of the agent for preventing or treating myocardial infarction of the present invention is preferably set in consideration of the patient's age, weight, administration route, type and degree of illness and the like, and usually 0.1 μg / kg / Daily to 10 mg / kg / day, preferably 1.0 μg / kg / day to 1.0 mg / kg / day is used.
[0022]
Since the polypeptide having human ADF activity used in the present invention is a human-derived protein, it is not recognized as a foreign substance even when administered to the human body, and its toxicity is very low.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0024]
Test Example Male rabbits were anesthetized with Ketalar and Seractal, and then thoracotomy was performed, and a suture was applied to the left branch of the coronary artery and placed subcutaneously. Three days later, the suture was pulled through a sonde to block the blood flow and ischemic, and then 20 minutes later, the thread was loosened and reperfusion was performed.
Human ADF was intravenously injected at 15 mg / kg 15 minutes after the above ischemia, and the same amount was intravenously injected immediately after reperfusion.
During the test, an electrocardiogram was taken before ischemia, during ischemia, immediately after reperfusion, and under anesthesia, and the degree of ST elevation was evaluated. In addition, blood was collected before ischemia, 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, and 75 minutes after reperfusion, and the amount of CPK (clearin phosphokinase) was measured to compare the rise from the pre-ischemic value. As a control, a group not administered with human ADF was measured simultaneously. The result of ST on the electrocardiogram is shown in FIG. 1, and the result of the variation of CPK is shown in FIGS.
[0025]
Since it is known that the amount of CPK in blood increases due to the presence of vascular disorder, it is effective to measure the presence or absence of vascular disorder by measuring the amount of CPK in blood.
[0026]
On the electrocardiogram, ST was further increased by reperfusion, but decreased by administration of human ADF. In addition, a significant difference was observed in blood CPK at a risk rate of 5% 45 minutes after reperfusion, and it was found that blood CPK increased by reperfusion was significantly reduced by administration of human ADF.
It is clear that human ADF reduces cardiomyocyte damage.
[0027]
【The invention's effect】
The human ADF of the present invention clearly has an effective pharmacological action during myocardial ischemia / reperfusion, and is useful as an agent for preventing or treating myocardial infarction.
[0028]
[Sequence Listing]
[0029]

[0030]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing measurement results of ST on an electrocardiogram in Examples. The vertical axis represents the ST increase value (mV). In the horizontal axis, the left represents the measurement during ischemia and the right represents the measurement immediately after reperfusion.
FIG. 2 is a view showing a measurement result of blood CPK in Examples. The vertical axis represents the amount of CPK (IU / L). The horizontal axis represents time (minutes) after reperfusion. In the figure, Δ represents a group to which a polypeptide having human ADF activity was administered, and ◯ represents a control group.

Claims

An agent for preventing or treating myocardial infarction, comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.