JP4021286B2

JP4021286B2 - Medicine consisting of HGF gene

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Publication number: JP4021286B2
Application number: JP2002261616A
Authority: JP
Inventors: 竜一森下; 俊男荻原; 敏一中村; 哲也冨田; 隆弘越智
Original assignee: Anges MG Inc
Current assignee: Anges Inc
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 2002-09-06
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2016-08-22
Also published as: JP2003095988A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療などに用いられる医薬に関する。さらに、詳しくはＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）遺伝子からなる医薬、及びＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは様々な薬理作用を示す生理活性ペプチドであり、その薬理作用については、例えば実験医学 Vol.10, No.3（増刊）330-339（1992）に記載されている。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺繊維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等（特開平 4-18028号公報、特開平 4-49246号公報、EP 492614号公報、特開平 6-25010号公報、WO 93/8821、特開平 6-172207、特開平 7-89869号公報、特開平 6-40934号公報、WO 94/2165、特開平 6-40935号公報、特開平 6-56692号公報、特開平 7-41429号公報、WO 93/3061、特開平 5-213721等）として有用である。
【０００３】
遺伝子治療に関しては、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、ＡＩＤＳ遺伝子治療、癌遺伝子治療、嚢胞性繊維症性遺伝子治療、血友病遺伝子治療等について現在活発な開発研究が国際的になされている。
しかし、ＨＧＦ遺伝子を用いた遺伝子治療についてはまだ知られておらず、また遺伝子治療が可能であるかについても不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦは血中半減期の短い薬物の１つである。従って、局所における持続的な投与が望まれていた。
また、ＨＧＦは多種多様の薬理作用を有することから、種々の治療剤としての開発が期待されている反面、その多種多様の薬理作用から全身的な投与では副作用が問題となることもありうる。また、ＨＧＦそのものを静脈内に投与すれば、かなりのＨＧＦが肝臓に滞留するため、治療目的の臓器に到達する量が少なくなるという欠点がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記課題を解決するためになされたものであり、その要旨は、
（１）ＨＧＦ遺伝子からなる医薬、
（２）ＨＧＦ遺伝子を含有するリポソーム、
（３）センダイウイルスと融合させた膜融合リポソームである上記（２）記載のリポソーム、
（４）上記（２）又は（３）記載のリポソームからなる医薬、
（５）動脈疾患治療剤である（１）又は（４）記載の医薬、及び
（６）軟骨傷害治療剤である（１）又は（４）記載の医薬に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦを発現し得る遺伝子をいい、当該遺伝子には、発現されるポリペプチドがＨＧＦと実質的に同効である限り、その遺伝子配列の一部が欠失又は他の塩基により置換されていたり、他の塩基配列が一部挿入されていたり、５′末端及び／又は３′末端に塩基が結合したような遺伝子も包含される。かかるＨＧＦ遺伝子としては、例えば、Nature, 342, 440 (1989) 、特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989) などに記載のＨＧＦ遺伝子が例示され、これらの遺伝子を本発明で使用することができる。
ＨＧＦ遺伝子は、適当なベクターに組み込んだものを使用する。例えば、後に挙げるウイルスの遺伝子にＨＧＦ遺伝子を組み込んだウイルスベクター、又はＨＧＦ遺伝子を組み込んだ適当な発現ベクターとして使用する。
【０００７】
本発明における「医薬」とは、ＨＧＦの有する薬理作用に基づいたヒトの疾患の治療剤又は予防剤をいい、例えば上記の治療剤又は予防剤が挙げられる。本発明によってＨＧＦ遺伝子が細胞に導入された後、該細胞でＨＧＦが発現され、そのＨＧＦが薬理作用を示す。従って、本発明の医薬は、ＨＧＦの対象疾患と同様の対象疾患に有効である。
例えば、ＨＧＦ遺伝子を細胞内に導入した場合、実施例に記載の様に、血管内皮細胞の増殖は促進されるが、血管平滑筋細胞の増殖は促進されない。さらに、実施例に記載のように、ラットを用いた動物実験において、生体内心臓にＨＧＦ遺伝子を導入した場合、血管新生が見られる。従って、ＨＧＦ遺伝子は動脈疾患、特に血管平滑筋細胞の異常な増殖を主体とする障害に起因する各種疾患（例えば、血管拡張術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄、動脈硬化症、抹梢循環不全等）の治療・予防、心筋梗塞、心筋症、末梢性血管閉塞症、心不全などの疾患の予防・治療に有用である。なお、ＨＧＦ自体も、血管内皮細胞の増殖は促進するが、血管平滑筋細胞の増殖を促進せず、同様の治療剤・予防剤として有用であり、ＨＧＦ遺伝子による効果は、ＨＧＦ自体の効果に基づくものである。
また、実施例に記載の様に、関節内にＨＧＦ遺伝子を導入すると、関節軟骨細胞の修復が促進され、プロテオグリカンを合成する細胞の増殖が促進される。従って、ＨＧＦ遺伝子は種々の軟骨傷害、例えば骨形成異常症、変形性関節症、変形性椎間板症、骨折の修復・治癒不全、スポーツによる外傷、キーパンチャー病などの疾患の予防、治療に有効である。ＨＧＦ自体も軟骨細胞の修復・増殖を促進し、同様の治療剤・予防剤として有用であり、ＨＧＦ遺伝子による効果は、ＨＧＦ自体の効果に基づくものである。
【０００８】
「リポソーム」とは、内部に水層を有する脂質二重層でできた閉鎖小胞体であり、その脂質２分子膜構造は生体膜に極めて近似していることが知られている。本発明のリポソームを製造する際に使用するリン脂質としては、例えばレシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル酸等の酸性リン脂質、又はこれらのアシル基をラウロイル基、ミリストイル基、オレオイル基等に置換したリン脂質、ホスファチジル・エタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等などがある。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、例えば通常の細胞膜中に存在する脂質など天然の材料から通常知られた方法で製造することができる。本発明のＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームは、例えば精製したリン脂質の薄膜をＨＧＦ遺伝子を含有する溶液に懸濁し、超音波処理等を施して製造することができる。
【０００９】
また、本発明のＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームは、適宜ウイルス等と融合させて膜融合リポソームとしてもよい。その場合、ウイルスを、例えば、紫外線等で不活性化することが好ましい。特に好ましい膜融合リポソームとして、センダウイルス（Hemagglutinating virus of Japan：ＨＶＪ）と融合させた膜融合リポソームが挙げられる。この膜融合リポソームは、日経サイエンス、1944年４月号、32-38頁、J. Biol Chem., 266(6), 3361-3364 (1991) 等記載の方法で製造することができ、例えば、紫外線照射等で不活性化した精製ＨＶＪとＨＧＦ遺伝子ベクターを含有するリポソーム懸濁液とを混合し、緩やかに撹拌した後、結合しなかったＨＶＪをショ糖密度勾配遠心法で除去することにより、ＨＶＪ融合リポソーム（ＨＶＪ−リポソーム）を調製することができる。また、リポソームに、標的細胞に親和性を有するものを結合させて細胞への遺伝子導入効率を上げることができる。標的細胞に親和性を有するものとしては、例えば、抗体、レセプター等のリガンド等が挙げられる。
【００１０】
ＨＧＦ遺伝子の細胞内への導入方法としては、ウイルスベクターによるもの、及びその他のものに大別される（日経サイエンス、1994年４月号、20-45頁、月刊薬事、36(1),23-48 (1994) 、及びこれらの引用文献等）。本発明の医薬においてはいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビス他のＲＮＡウイルス等にＨＧＦ遺伝子を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の導入方法としては、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、リポソーム法が特に好ましい。
【００１１】
また、ＨＧＦ遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＨＧＦ遺伝子を直接体内に導入するIn Vivo法、及びヒトからある種の細胞を採取し体外でＨＧＦ遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すEx Vivo法がある（日経サイエンス, 1994年４月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48 (1994) 、及びこれらの引用文献等）。本発明の医薬においては治療目的の疾患、標的臓器等に応じて、適宜いずれかの方法を選択して適用することができる。
In Vivo法は、Ex Vivo法に比べて費用と手間が少なく、また簡便である。Ex Vivo法は、ＨＧＦ遺伝子の細胞内導入の効率がよい。
【００１２】
本発明の医薬において、In Vivo 法により投与する場合は治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直接投与すれば、臓器選択的に治療することができる。例えば、「ＰＴＣＡ後の再狭窄」に対する遺伝子を用いる治療では、動脈内に投与することで実施でき（実験医学、12 (15増刊), 1298-1933 (1994)）、好ましくはＰＴＣＡにおけるバルーンの先に本発明の医薬をつけて、血管にこすりつければそのまま血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞に導入することも可能である。
【００１３】
また、Ex Vivo法による場合には、常法に準じ、ヒトの細胞（例えば、リンパ球、造血幹細胞等）を採取し、それに本発明の医薬を感作させて遺伝子導入を行った後、ＨＧＦ産生細胞をヒトへ戻すことが行われる。
In Vivo法により投与する場合は、種々の製剤形態（例えば、液剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦ遺伝子を含有する注射剤等とされる。また、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。当該注射剤等は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦ遺伝子を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができ、またＨＧＦ遺伝子に代え、ＨＧＦ遺伝子を組み込んだウイルスベクターを製剤化してもよい。さらに、ＨＧＦ遺伝子を包埋したリポソーム（又はＨＪＶ−リポソーム）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中のＨＧＦ遺伝子の含量は、治療目的の疾患、標的臓器、患者の年齢、体重などにより適宜調製することができるが、通常ＨＧＦ遺伝子として0.0001mg〜 100mg、好ましくは0.001mg〜１０mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが適当である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。なお、使用した実験材料及び方法の概要は以下のとおりである。
【００１５】
実験材料及び方法
(1) ＨＧＦ発現ベクター
ＨＧＦ発現ベクターの調製は、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（FEBS, 333, 61-66 (1993)）のＥｃｏＲＩとＮｏｔＩサイトの間にヒトＨＧＦｃＤＮＡ（2.2kb ：Biochem. Biophys. Res. Commun.,172, 321-327 (1990)；日本特許公開平5-111383）を挿入することにより行なった。このプラスミドベクターにおいて、ＨＧＦｃＤＮＡの転写はＳＲαプロモーターにより制御される（Nature 342, 440-443 (1989)）。
【００１６】
(2) 細胞培養
ラットの冠動脈内皮細胞は、８週令のスプラギュードウリィ（ＳＤ）ラットの心臓を酵素的に消化したものから密度勾配遠心法により単離した（Transplantation 57, 1653-1660 (1994)）。ラットの大動脈平滑筋細胞（以下、ＶＳＭＣという）は、１２週令ＳＤラットから酵素処理により得た（J. Clin. Invest., 93, 355-360 (1994)）。これらの細胞は、１０％（vol/vol）ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を含有するＤＭＥＭ培地で維持した。細胞は、３７℃、９５％空気−５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、２日ごとに培地を交換してインキュベートした。これらの細胞は、免疫組織学的及び形態的観察により、それぞれ内皮細胞及び平滑筋細胞であることが示された。
ヒト大動脈内皮細胞（５代継代）及びヒトＶＳＭＣ（５代継代）は、クラボ社より入手したものを用い、上記と同様な方法で、５％ウシ胎児血清、上皮成長因子（１０ng／ml）、塩基性繊維芽細胞成長因子（２ng／ml）及びデキサメサゾン（１μM）を含有するＭＣＤＢ１３１培地で培養した。
なお、静止期の内皮細胞は、J. Clin. Invest. 86, 1690-1697 (1990) ; ibid. 94, 824-829 (1994) に従って調製した。
【００１７】
(3) ＨＶＪ−リポソームの In Vitro 遺伝子導入
感作される内皮細胞又はＶＳＭＣは、１０⁸個を６ウエルプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞は、２mM塩化カルシウムを含む平衡塩類溶液（１３７mM NaCl, 5.4mM KCl, １０mM Tris-HCl, pH7.6、以下「ＢＳＳ」という）で３回洗浄し、実施例１で得たＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（2.5 mgの脂質及び１０μｇの包埋ＤＮＡ含有）の溶液１ml又は比較例１で得たＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの溶液１mlを加え、４℃で５分間、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は洗浄し、１０％ウシ血清を含む新鮮培地中、ＣＯ₂インキュベーターで維持した。
【００１８】
(4) 内皮細胞及びＶＳＭＣＨ中のＨＧＦ濃度の測定
感作される内皮細胞及びＶＳＭＣが産生するＨＧＦ濃度の測定はＥＬＩＳＡ法で行なった。即ち、ラット又はヒトの内皮細胞又はＶＳＭＣは６ウエルプレート（コーニング社製）に５×１０⁴細胞／cm²の細胞密度で播種し、２４時間培養した。感作後２４時間して、培地を交換し更に４８時間培養した。ＨＧＦの放出を検討するため、感作された細胞（感作４８時間後）は洗浄し、インスリン（５×１０^-7M）、トランスフェリン（５μg／ml）及びアスコルベート（0.2mM）を含有する無血清培地１mlに加えた。２４時間後、培養培地を集め、６００ｇで１０分間遠心し、−２０℃で保存した。
培地中のＨＧＦ濃度は、抗ラットＨＧＦ抗体又は抗ヒトＨＧＦ抗体を用いた酵素免疫法で測定した（Exp. Cell Res. 210, 326-335 (1994) ; Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)）。ウサギ抗ラット又は抗ヒトＨＧＦＩｇＧを、９６ウエルプレート（コーニング社製）に４℃で１５時間コートした。３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）でブロッキングした後、培養培地を各ウエルに加え、２５℃で２時間インキュベートした。ウエルは、0.025％トゥイーンを含むＰＢＳ（PBS-トゥイーン）で３回洗浄後、ビオチン化ウサギ抗ラットＨＧＦＩｇＧ又は抗ヒトＨＧＦＩｇＧを添加し、２５℃で２時間インキュベートした。PBS-トゥイーンで洗浄後、ウエルは西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン−ビオチン複合体（PBS-トゥイーン溶液）とインキュベートした。酵素反応は、基質溶液（2.5mM O-フェニレンジアミン、１００mM リン酸ナトリウム、５０mM クエン酸、0.015％過酸化水素含有）を添加することにより開始した。酵素反応は、１Ｍ硫酸を添加することにより停止し、４９０nmの吸光度を測定した。なお、抗ヒトＨＧＦ抗体はヒトＨＧＦとのみ交差反応し、ラットＨＧＦとは反応せず、また抗ラットＨＧＦ抗体はラットＨＧＦとのみ交差反応し、ヒトＨＧＦとは反応しない。
【００１９】
(5) ＨＧＦ
使用したヒト及びラット組換ＨＧＦは、ヒト又はラットＨＧＦｃＤＮＡを含む発現プラスミドで感作されたＣＨＯ細胞又はＣ−１２７細胞の培養液から精製したものを使用した（Cell, 77, 261-271 (1994) ; J. Clin. Invest. 93, 355-360 (1994)）。
【００２０】
(6) 統計的解析
全ての実験は少なくとも３回行い、測定値は平均値±標準誤差で示した。測定値の統計的解析は、ダンカン法（Duncan's test）で行った。
【００２１】
(7) ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、アザン（Ａｚａｎ）染色
ＨＧＦ遺伝子を導入したラットを遺伝子導入後１０日に、ヘバリンを加えた生理食塩水を潅流して屠殺し、引き続きＰＢＳで調製した４％パラホルムアルデヒドによる固定を一晩行った。固定後にパラフィン包埋を行って切片を作製し、通常の方法によりＨＥ染色、Ａｚａｎ染色を行った。顕微鏡下にて微小血管数を数えた。
【００２２】
実施例１
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製
テトラヒドロフランに、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びコレステロールを重量比で１：4.8 ：２で混合した。テトラヒドロフランをロータリーエバポレーターで留去することで、この脂質の混合物（１０mg）を容器壁に析出させた。ウシ胸腺から精製したＨＭＧ１核蛋白（high mobility group 1 nuclear protein）９６μｇとプラスミドＤＮＡ（３００μｇ）のＢＳＳ（２００μｌ）溶液と２０℃で１時間混合し、次いで上記の脂質に添加した。リポソーム−ＤＮＡ−ＨＭＧ１複合体懸濁液はボルテックスで混合し、３秒間超音波処理をし、３０分間撹拌した。
精製したＨＶＪ（Ｚ株）は、使用直前に３分間紫外線照射 (１１０erg/mm² sec)で不活性化した。上記で得られたリポソーム懸濁液（0.5 ml, 脂質１０mgを含有）とＨＶＪ（20,000 hemagglutinating units）を全液量が４mlとなる様にＢＳＳを加えて、混合した。この混合物を４℃で１０分間インキュペートし、さらに３７℃で３０分間ゆっくりと撹拌した。融合していないＨＶＪは、ショ糖密度勾配遠心法で、ＨＶＪ−リポソームから除去した。すなわち、ショ糖密度勾配における上層を集めることで、ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソーム（１０μｇ／mlのＨＧＦ発現ベクターを含有する）を得た。以下、ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡと称する。
【００２３】
実施例２
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームのラットへの投与
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製は、ＨＭＧ１核蛋白を６４μｇ、プラスミドＤＮＡを２００μｇ用いて、実施例に記載の方法に従って行った。また、リポソーム懸濁液（0.5 ml, 脂質１０mgを含有）とＨＶＪ（35,000 hemagglutinating units）を全液量が２mlとなる様にＢＳＳを加えて混合した。
ＳＤラット（４００−５００ｇ；日本チャールズリバー社より購入）に対しベントバルビタール・ナトリウム塩（0.1ml／１００mg）を腹腔内投与して麻酔し、保温して自動呼吸器により呼吸を確保した。ラットに左側開胸術を施し、ＨＶＪ−リポソームＤＮＡ又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ（２０μｌ）を３０Ｇの注射針を用いて、心尖に直接、慎重に注入した。
【００２４】
比較例１
ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームの製造
ＨＧＦ遺伝子を含まないベクターに、実施例１記載の方法と同様の操作を行って、ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームの製造した。以下、ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔと称する。
【００２５】
比較例２
ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製
ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを用いて、実施例１と同様にしてヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを調製した。
ここで、ヒトＴＧＦ−β発現ベクターとしては、文献？に従って調製されたベクターを用いた。
以下、ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）と称する。
【００２６】
試験例１
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞のＨＧＦの発現
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（リポソーム中のＨＧＦ発現ベクター濃度：１０μｇ／ml）を、ラット冠動脈内皮細胞（細胞数：１０⁸個）に感作し、ＨＧＦの産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを用いて、上記と同様な試験を行った。更に、非感作ラット冠動脈内皮細胞についてもＨＧＦ産生量を測定した（無処置群）。その結果を図１に示す（ｎ＝６）。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞群である。
図１に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞は高いレベルでＨＧＦを産生し、分泌した。それに対して、無処置群及びＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したラット冠動脈内皮細胞群には、実質上、ＨＧＦ産生は認められなかった。
細胞数で測ってみると、ＨＧＦ発現群では有意に高い細胞数であった。
【００２７】
試験例２
内皮細胞の増殖に対する感作されたＨＧＦの発現ベクターの効果
ヒト内皮細胞にＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作し、外因的に添加した組換ヒトＨＧＦの存在下（１、１０及び１００ｎｇ／ml）又は非存在下に培養し、細胞数の増加率（％）を測定した。その結果を図２（折線グラフ）に示す（ｎ＝６）。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦは所定濃度の組換ヒトＨＧＦの存在下に培養した群を示す（＊：Ｐ＜0.05, ＊＊：Ｐ＜0.01対ＤＳＦ）。
図２の折線グラフに示されるように、外因的に添加したＨＧＦにより内皮細胞の増殖は促進されることが明らかになった。
一方、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（濃度：１０μｇ／ml）を感作した内皮細胞を培養し、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞を培養し、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。その結果を図２（棒グラフ）に示す（ｎ＝６）。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦベクターはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞群を示す（＊＊；Ｐ＜0.01対ＤＳＦ、＃：Ｐ＜0.05対ＨＧＦ 100ng/ml）。
図２の棒グラフに示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の増加率は対照に比べて著しく高く、また外因的に添加したＨＧＦの効果に対しても有意に高いことが明らかになった。
【００２８】
更に、上記のＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の培養をウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下又は非存在下に行ない、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞を培養し、同様に細胞数の増加率（％）を求めた。なお、ウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体は文献（Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)）に記載の方法により精製し、この抗体は１０μｇ／mlの濃度において１０ｎｇ／mlの生物活性を中和することができる。更に、抗ヒトＨＧＦ抗体はヒトＨＧＦとのみ交差反応し、ラットＨＧＦとは反応せず、抗ラットＨＧＦ抗体はラットＨＧＦとのみ交差反応し、ヒトＨＧＦとは反応しない。また、正常ウサギ血清ＩｇＧ（１０μｇ／ml）をコントロールとして用いた。
その結果を図３に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ感作内皮細胞群；ＨＧＦはＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群；ＨＧＦａｂはウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群を示す。なお、増加率（％）は、対照の増加率を１００とした相対％で示した（＊：Ｐ＜0.01対対照、＃：Ｐ＜0.05対ＨＧＦ）。
図３に示されるように、抗ヒトＨＧＦ抗体の存在により、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞の増殖は抑制され、対照と同程度の細胞増加率であった。このことより、ＨＧＦは、内皮細胞の増殖因子であることが明らかになった。
【００２９】
試験例３
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を、静止期にあるラット冠動脈内皮細胞培養系（細胞数：１０⁵個）に加え、３日間培養し、当該内皮細胞数の増加を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を用いて、同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図４に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群である。
図４に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群においては、内皮細胞数の有意な増加がみられた。
【００３０】
上記のＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦ抗体及び抗ラットＨＧＦ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。また、非感作のＶＳＭＣの培養上清中のＨＧＦ濃度も測定した（無処置群）。
抗ヒトＨＧＦ抗体を用いた測定結果を図５に、抗ラットＨＧＦ抗体を用いた結果を図６に示す（いずれもｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
図５に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清にはＨＧＦが検出され、その値は対照に対して有意に高かった。
また、図６に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清にはラットＨＧＦも検出され、その値は対照に対して有意に高かった。
なお、図５及び図６に示されるように、無処理群及び対照群では培養上清中にＥＬＩＳＡ法で測定できる程度の量のＨＧＦは存在しなかった。
【００３１】
試験例４
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を静止期のラット冠動脈内皮細胞培養系（細胞数：１０⁵個）に加え、３日間培養し、当該内皮細胞数の増加を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を用いて、同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図７に示す。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群（ｎ＝８）；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群（ｎ＝８）；Ｃは無処置群（ｎ＝１５）である。
図７に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群においては、内皮細胞数の有意な増加がみられたのに対し、対照群では細胞数は無処置群と同程度であった。（対照群：0.117 ±0.002 , Ａ群：0.148 ±0.03 Ｐ＜0.01）。
【００３２】
次に、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を加え、上記と同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図８に示す（ｎ＝８）。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＣはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を添加した群；ＤはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清にコントロール抗体を添加した群である。
図８のＡ及びＣに示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清の細胞増殖促進活性は、抗ＨＧＦ抗体を添加により完全に消失した。このことより、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清の細胞増殖促進活性はＨＧＦに起因することが明らかになった。
【００３３】
試験例５
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したヒトＶＳＭＣのヒト内皮細胞への効果
ヒトＶＳＭＣ細胞培養インサート（コースター社製、孔径0.45μｍ）に播種し、１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。一方、ヒト内皮細胞は、６ウエルプレートに播種し、１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地で維持した。ＶＳＭＣが８０％コンフルエントになったときに、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（リポソームの中のＤＮＡ含量：１０μｇ）又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔと４℃で５分間、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。感作した後、感作ＶＳＭＣを含むインサートを静止期のヒト内皮細胞を含むウエルに加えた。ＶＳＭＣと内皮細胞とを、0.5％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地中で３日間共培養し、ＷＳＴ−細胞数測定キット（ワコー社製）を用いて細胞数の測定を行なった。その結果を図９に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
図９に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したヒトＶＳＭＣは、静止期にある非感作ヒト内皮細胞の増殖を有意に増加させることが明らかになった。
【００３４】
試験例６
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣのラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣ（細胞数：１０⁸個）と静止期にあるラット冠動脈内皮細胞（細胞数：１０⁵個）とを、３日間共培養し、当該冠動脈内皮細胞の増加数を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣを用いて、同様に共培養して内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図１０に示す（ｎ＝６）。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣ群、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣ群である。
図１０に示される様に、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣより放出されたＨＧＦにより内皮細胞の増殖が刺激され、細胞数の増加が認められた（対照群：0.126 ±0.006、ＨＧＦ群：0.156 ±0.01 Ｐ＜0.05）。
【００３５】
試験例７
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの増殖
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣとＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣをそれぞれ個別に培養し、細胞数の増加を比較検討したが、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作は細胞増殖になんら影響は与えなかった。このことから、ＨＧＦにはＶＳＭＣに対する細胞増殖促進活性はないことが判明した。
【００３６】
試験例８
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋における新生血管増生
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋及び無処置のラット心筋をＨＥ染色、Ａｚａｎ染色し、検鏡して微小血管数を数えた。その結果を図１１に示す。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋の微小血管数である。
図１１で示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを注入したラット心筋では、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを注入したラット心筋及び無処置のラット心筋と比較して、有意に微小血管数が増加した。このことは、内皮細胞増殖作用を持つＨＧＦが生体において血管新生作用を持つことを示している。
【００３７】
試験例９
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを関節内に直接導入することによる関節軟骨の修復
１０週齢のフィッシャーラットの大腿骨顆間部に直径１．８ｍｍのキルシュナー鋼線を用い軟骨下骨を貫く損傷を作製した。術後１週の時点で、実施例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（１００μｌ／膝）を直接的に関節内へ導入した。コントロールとして、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔおよび比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）を同量関節内に投与した。これらの遺伝子等の導入後１、３、４週でラットを屠殺し、組織学的に修復部位を観察した。
その結果、図１２に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後３週で修復組織に一部にトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を認めることができた。また、図１３に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後４週ではさらにプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現範囲が広がる傾向を認めた。
図１４に示されるように、比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）の関節内への投与の場合には、投与後４週でこの様な軟骨様細胞の出現は認められなかった。また、図１５に示されるように、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの関節内への投与の場合には、投与後４週でこの様な軟骨様細胞の出現は認められなかった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の医薬は、ＨＧＦそのものの投与に比べ治療効果が持続的であり、また局所選択的に作用させることができるため、ＨＧＦの副作用を低減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試験例１における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞でのＨＧＦの発現を示す図である。
【図２】図２の折線グラフは、試験例２における、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞のＨＧＦ存在下又は非存在下における細胞増加率を示す図である。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦは所定濃度の組換ヒトＨＧＦの存在下に培養した群を示す。図２の棒グラフは、試験例２における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の細胞増加率を示す図である。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦベクターはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞群を示す。
【図３】図３は、試験例２における、抗ＨＧＦ抗体の存在下又は非存在下におけるＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の細胞増加率を示す図である。図中、対照はＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ感作内皮細胞群；ＨＧＦはＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群；ＨＧＦａｂはウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群を示す。なお、増加率（％）は、対照の増加率を１００とした相対％で示した。
【図４】図４は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群である。
【図５】図５は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦ抗体を用いて測定した結果を示す図である。図中、無処置は非感作ＶＳＭＣの培養上清群；対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
【図６】図６は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ラットＨＧＦ抗体を用いて測定した結果を示す図である。図中、無処置は非感作ＶＳＭＣの培養上清群；対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
【図７】図７は、試験例４における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；Ｃは無処置群である。
【図８】図８は、試験例４における、抗ＨＧＦ抗体の存在下での、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット感動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＣはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を添加した群；ＤはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清にコントロール抗体を添加した群である。
【図９】図９は、試験例５における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したヒトＶＳＭＣと非感作ヒト内皮細胞を共培養したときの内皮細胞の細胞増加を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
【図１０】図１０は、試験例６における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣと非感作ラット冠動脈内皮細胞を共培養したときの内皮細胞の細胞増加を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
【図１１】図１１は、試験例８における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数の増加を示す図である。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋の微小血管数である。
【図１２】図１２は、試験例９における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後３週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を示す図である。
【図１３】図１３は、試験例９における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を示す図である。
【図１４】図１４は、試験例９における、比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）の関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞が認められないことを示す図である。
【図１５】図１５は、試験例９における、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞が認められないことを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a medicine used for gene therapy and the like. More specifically, the present invention relates to a medicine comprising an HGF (Hepatocyte Growth Factor) gene and a liposome containing the HGF gene.
[0002]
[Prior art]
HGF is a physiologically active peptide having various pharmacological actions, and the pharmacological action thereof is described in, for example, Experimental Medicine Vol. 10, No. 3 (extra number) 330-339 (1992). Because of its pharmacological action, HGF is a therapeutic agent for cirrhosis, a therapeutic agent for renal diseases, an epithelial cell proliferation promoter, an anticancer agent, a side effect inhibitor for cancer therapy, a therapeutic agent for lung disorders, a therapeutic agent for gastric / duodenal injury, a therapeutic agent for cranial nerve disorders, Suppressive side effect inhibitor, collagen degradation accelerator, cartilage disorder treatment agent, arterial disease treatment agent, pulmonary fibrosis treatment agent, liver disease treatment agent, blood coagulation disorder treatment agent, plasma low protein treatment agent, wound treatment agent, neuropathy improvement Drugs, hematopoietic stem cell increasing agents, hair growth promoters, etc. (JP-A-4-18028, JP-A-4-49246, EP 492614, JP-A-6-25010, WO 93/8821, JP-A-6- 172207, JP 7-89869, JP 6-40934, WO 94/2165, JP 6-40935, JP 6-56692, JP 7-41429, WO 93 / 3061, JP-A-5-213721, etc.).
[0003]
With regard to gene therapy, active development research is being conducted internationally for adenosine deaminase deficiency, AIDS gene therapy, cancer gene therapy, cystic fibrosis gene therapy, hemophilia gene therapy, and the like.
However, gene therapy using the HGF gene is not yet known, and it is unclear whether gene therapy is possible.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
HGF is one of drugs with a short blood half-life. Accordingly, continuous administration locally has been desired.
In addition, since HGF has a wide variety of pharmacological actions, development as various therapeutic agents is expected. On the other hand, side effects may be a problem in systemic administration due to the wide variety of pharmacological actions. In addition, if HGF itself is administered intravenously, a considerable amount of HGF stays in the liver, so that there is a drawback that the amount reaching the organ for treatment is reduced.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to solve the above problems, and the gist thereof is as follows.
(1) a pharmaceutical comprising the HGF gene,
(2) a liposome containing the HGF gene,
(3) The liposome according to (2) above, which is a membrane-fused liposome fused with Sendai virus,
(4) A medicament comprising the liposome according to (2) or (3) above,
(5) The medicament according to (1) or (4), which is a therapeutic agent for arterial disease, and
(6) The pharmaceutical according to (1) or (4), which is a therapeutic agent for cartilage injury.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The “HGF gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing HGF, and the gene includes a part of the gene sequence as long as the expressed polypeptide is substantially the same as HGF. Are deleted or substituted with other bases, other base sequences are partially inserted, and genes in which bases are bonded to the 5 'end and / or the 3' end are also included. Examples of such HGF genes include Nature,342, 440 (1989), JP-A-5-111383, Biochem. Biophys. Res. Commun.163, 967 (1989) and the like, and these genes can be used in the present invention.
As the HGF gene, one incorporated into an appropriate vector is used. For example, it is used as a viral vector in which an HGF gene is incorporated into a viral gene described later, or an appropriate expression vector in which an HGF gene is incorporated.
[0007]
The “medicament” in the present invention refers to a therapeutic or prophylactic agent for human diseases based on the pharmacological action of HGF, and examples thereof include the above therapeutic or prophylactic agents. After the HGF gene is introduced into a cell according to the present invention, HGF is expressed in the cell, and the HGF exhibits a pharmacological action. Therefore, the medicament of the present invention is effective for target diseases similar to the target diseases of HGF.
For example, when the HGF gene is introduced into cells, as described in the Examples, the proliferation of vascular endothelial cells is promoted, but the proliferation of vascular smooth muscle cells is not promoted. Furthermore, as described in the Examples, when an HGF gene is introduced into an in vivo heart in an animal experiment using rats, angiogenesis is observed. Therefore, HGF gene is an arterial disease, particularly various diseases caused by abnormal growth of vascular smooth muscle cells (for example, restenosis after vasodilatation (PTCA), arteriosclerosis, peripheral circulatory insufficiency, etc.) It is useful for the prevention and treatment of diseases such as myocardial infarction, cardiomyopathy, peripheral vascular occlusion, and heart failure. HGF itself also promotes the proliferation of vascular endothelial cells, but does not promote the proliferation of vascular smooth muscle cells, and is useful as a similar therapeutic / prophylactic agent. The effect of the HGF gene is similar to that of HGF itself. Is based.
Further, as described in the Examples, when the HGF gene is introduced into the joint, repair of articular chondrocytes is promoted, and proliferation of cells that synthesize proteoglycan is promoted. Therefore, the HGF gene is effective for the prevention and treatment of various cartilage injuries such as osteogenesis dysplasia, osteoarthritis, degenerative disc disease, fracture repair / healing failure, sports trauma, key puncher disease and the like. is there. HGF itself promotes chondrocyte repair / proliferation and is useful as a similar therapeutic / prophylactic agent. The effect of the HGF gene is based on the effect of HGF itself.
[0008]
“Liposome” is a closed vesicle made of a lipid bilayer having an aqueous layer inside, and its lipid bimolecular membrane structure is known to be very close to that of a biological membrane. Examples of the phospholipid used in producing the liposome of the present invention include phosphatidylcholine such as lecithin and lysolecithin, acid phospholipid such as phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol and phosphatidylic acid, or an acyl group containing a lauroyl group, Examples include phospholipids substituted with myristoyl groups, oleoyl groups, and the like, sphingophospholipids such as phosphatidyl / ethanolamine, and sphingomyelin. Moreover, cholesterol etc. can also be added. Liposomes can be produced by a generally known method from natural materials such as lipids present in normal cell membranes. The liposome containing the HGF gene of the present invention can be produced, for example, by suspending a purified phospholipid thin film in a solution containing the HGF gene and subjecting it to ultrasonic treatment or the like.
[0009]
In addition, the liposome containing the HGF gene of the present invention may be appropriately fused with a virus or the like to form a membrane-fused liposome. In that case, it is preferable to inactivate the virus with, for example, ultraviolet rays. Particularly preferred membrane fusion liposomes include membrane fusion liposomes fused with Sendavirus (Hemagglutinating virus of Japan: HVJ). This membrane-fused liposome can be produced by a method described in Nikkei Science, April 1944, 32-38, J. Biol Chem., 266 (6), 3361-3364 (1991), etc. By mixing purified HVJ inactivated by ultraviolet irradiation and the like and a liposome suspension containing the HGF gene vector, and gently stirring, HVJ that did not bind was removed by sucrose density gradient centrifugation, HVJ fusion liposomes (HVJ-liposomes) can be prepared. In addition, it is possible to increase the efficiency of gene transfer into cells by binding liposomes to those having affinity for target cells. Examples of those having affinity for the target cell include ligands such as antibodies and receptors.
[0010]
Methods for introducing the HGF gene into cells are roughly classified into those using viral vectors and others (Nikkei Science, April 1994, pages 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23 -48 (1994) and references cited therein). Any method can be applied to the medicament of the present invention.
Examples of the introduction method using a viral vector include a method of introducing an HGF gene into a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poliovirus, symbis or other RNA virus. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and the like are particularly preferred.
Examples of other introduction methods include a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like, and the liposome method is particularly preferable.
[0011]
In addition, in order to make the HGF gene actually act as a medicine, an in vivo method in which the HGF gene is directly introduced into the body, and certain cells from human beings are collected and the HGF gene is introduced into the cells outside the body. Ex Vivo method (Nikkei Science, April 1994, 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs,36 (1), 23-48 (1994) and references cited therein). In the medicament of the present invention, any method can be appropriately selected and applied depending on the disease to be treated, the target organ and the like.
The In Vivo method is less expensive and less labor-intensive than the Ex Vivo method, and is simple. The Ex Vivo method is efficient in introducing the HGF gene into the cell.
[0012]
When the pharmaceutical of the present invention is administered by the In Vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease to be treated, the target organ and the like. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly, or directly to a target site of a disease such as kidney, liver, lung, brain, nerve or the like. If it is administered directly to the disease site, it can be treated selectively by organs. For example, the treatment using a gene for “restenosis after PTCA” can be performed by intraarterial administration (Experimental Medicine, 12 (15th edition), 1298-1933 (1994)), preferably the tip of the balloon in PTCA. If the medicine of the present invention is attached and rubbed into a blood vessel, it can be directly introduced into vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells.
[0013]
In the case of the Ex Vivo method, human cells (for example, lymphocytes, hematopoietic stem cells, etc.) are collected according to a conventional method, sensitized with the medicament of the present invention, and gene transfer is performed. The production cells are returned to the human.
In the case of administration by the In Vivo method, various preparation forms (for example, liquids etc.) can be taken, but generally, it is an injection containing the HGF gene as an active ingredient. Moreover, you may add a usual support | carrier as needed. The injection can be prepared by a conventional method. For example, the HGF gene is dissolved in an appropriate solvent (for example, sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc.) and then sterilized by filtration through a filter or the like. Then, it can be prepared by filling a sterile container, or a viral vector incorporating the HGF gene may be formulated instead of the HGF gene. Furthermore, in the liposome (or HJV-liposome) in which the HGF gene is embedded, it can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated freezing agent.
The content of the HGF gene in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the target organ, the age of the patient, the body weight, etc., but is usually 0.0001 mg to 100 mg, preferably 0.001 mg to 10 mg as the HGF gene. It is appropriate to administer this once every few days or months.
[0014]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited at all by these Examples. The outline of the experimental materials and methods used are as follows.
[0015]
Experimental materials and methods
(1) HGF expression vector
The preparation of the HGF expression vector was carried out using the pUC-SRα expression vector (FEBS,333, 61-66 (1993)) between the Eco RI and Not I sites of human HGF cDNA (2.2 kb: Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321-327 (1990); Japanese Patent Publication 5-111383). In this plasmid vector, transcription of HGF cDNA is controlled by the SRα promoter (Nature342, 440-443 (1989)).
[0016]
(2) Cell culture
Rat coronary endothelial cells were isolated by density gradient centrifugation from an enzymatic digestion of the heart of an 8-week old Sprague-Dawley (SD) rat (Transplantation).57, 1653-1660 (1994)). Rat aortic smooth muscle cells (hereinafter referred to as VSMC) were obtained from 12-week-old SD rats by enzyme treatment (J. Clin. Invest.,93, 355-360 (1994)). These cells were maintained in DMEM medium containing 10% (vol / vol) fetal calf serum, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml). Cells are 37 ° C, 95% air-5% CO₂In a humidified atmosphere, the medium was changed and incubated every 2 days. These cells were shown to be endothelial cells and smooth muscle cells by immunohistological and morphological observations, respectively.
Human aortic endothelial cells (passage 5) and human VSMC (passage 5) were obtained from Kurabo and 5% fetal bovine serum, epidermal growth factor (10 ng / ml) was obtained in the same manner as described above. ), MCDB131 medium containing basic fibroblast growth factor (2 ng / ml) and dexamethasone (1 μM).
In addition, the resting phase of endothelial cells is J. Clin. Invest.86, 1690-1697 (1990); ibid.94, 824-829 (1994).
[0017]
(3) Of HVJ-liposomes In vitro Gene transfer
Sensitized endothelial cells or VSMCs are 10⁸The cells were seeded in 6-well plates and grown to 80% confluence. The cells were washed three times with a balanced salt solution containing 2 mM calcium chloride (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, hereinafter referred to as “BSS”), and the HVJ-liposome- obtained in Example 1 was used. 1 ml of a solution of DNA (containing 2.5 mg of lipid and 10 μg of embedded DNA) or 1 ml of the HVJ-liposome-cont solution obtained in Comparative Example 1 was added and incubated at 4 ° C. for 5 minutes and further at 37 ° C. for 30 minutes. Cells are washed and washed with CO 2 in fresh medium containing 10% bovine serum.₂Maintained in incubator.
[0018]
(Four) Measurement of HGF concentration in endothelial cells and VSMCH
Measurement of HGF concentration produced by sensitized endothelial cells and VSMC was performed by ELISA. That is, rat or human endothelial cells or VSMC are 5 × 10 5 in a 6-well plate (Corning).^FourCells / cm²The cell density was seeded and cultured for 24 hours. 24 hours after the sensitization, the medium was changed and the culture was further continued for 48 hours. To examine the release of HGF, sensitized cells (48 hours after sensitization) were washed and insulin (5 × 10 5^-7M), transferrin (5 μg / ml) and ascorbate (0.2 mM) were added to 1 ml of serum-free medium. After 24 hours, the culture medium was collected, centrifuged at 600 g for 10 minutes, and stored at -20 ° C.
The HGF concentration in the medium was measured by an enzyme immunization method using an anti-rat HGF antibody or an anti-human HGF antibody (Exp. Cell Res.210, 326-335 (1994); Jpn. J. Cancer Res.,831262-1266 (1992)). Rabbit anti-rat or anti-human HGF IgG was coated on a 96-well plate (Corning) at 4 ° C. for 15 hours. After blocking with PBS (phosphate buffered saline) containing 3% bovine serum albumin, culture medium was added to each well and incubated at 25 ° C. for 2 hours. The wells were washed three times with PBS containing 0.025% Tween (PBS-Tween), biotinylated rabbit anti-rat HGF IgG or anti-human HGF IgG was added, and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After washing with PBS-Tween, the wells were incubated with horseradish peroxidase-conjugated streptavidin-biotin complex (PBS-Tween solution). The enzyme reaction was started by adding a substrate solution (containing 2.5 mM O-phenylenediamine, 100 mM sodium phosphate, 50 mM citric acid, 0.015% hydrogen peroxide). The enzymatic reaction was stopped by adding 1M sulfuric acid and the absorbance at 490 nm was measured. The anti-human HGF antibody cross-reacts only with human HGF and does not react with rat HGF, and the anti-rat HGF antibody cross-reacts only with rat HGF and does not react with human HGF.
[0019]
(Five) HGF
The human and rat recombinant HGF used was purified from the culture medium of CHO cells or C-127 cells sensitized with an expression plasmid containing human or rat HGF cDNA (Cell,77, 261-271 (1994); J. Clin. Invest.93, 355-360 (1994)).
[0020]
(6) Statistical analysis
All experiments were performed at least three times, and the measured values were expressed as mean ± standard error. Statistical analysis of the measured values was performed by Duncan's test.
[0021]
(7) Hematoxylin and eosin (HE) staining, Azan staining
On the 10th day after the gene introduction, the rats into which the HGF gene had been introduced were killed by perfusion with physiological saline supplemented with hevaline, followed by overnight fixation with 4% paraformaldehyde prepared in PBS. After fixation, paraffin embedding was performed to prepare a section, and HE staining and Azan staining were performed by a usual method. The number of microvessels was counted under a microscope.
[0022]
Example 1
Preparation of HVJ-liposomes containing HGF expression vectors
Tetrahydrofuran was mixed with phosphatidylserine, phosphatidylcholine and cholesterol in a weight ratio of 1: 4.8: 2. Tetrahydrofuran was distilled off with a rotary evaporator to precipitate this lipid mixture (10 mg) on the vessel wall. 96 μg of HMG 1 nuclear protein purified from bovine thymus and a BSS (200 μl) solution of plasmid DNA (300 μg) were mixed at 20 ° C. for 1 hour, and then added to the above lipids. The liposome-DNA-HMG 1 complex suspension was vortexed, sonicated for 3 seconds, and stirred for 30 minutes.
Purified HVJ (Z strain) is irradiated with ultraviolet rays (110 erg / mm) for 3 minutes immediately before use.² sec). The liposome suspension (0.5 ml, containing 10 mg of lipid) obtained above and HVJ (20,000 hemagglutinating units) were added and mixed so that the total liquid volume was 4 ml. The mixture was incubated at 4 ° C. for 10 minutes and further stirred slowly at 37 ° C. for 30 minutes. Unfused HVJ was removed from HVJ-liposomes by sucrose density gradient centrifugation. That is, by collecting the upper layer in the sucrose density gradient, HVJ-liposomes containing the HGF expression vector (containing 10 μg / ml HGF expression vector) were obtained. Hereinafter, the HVJ-liposome containing the HGF expression vector is referred to as HVJ-liposome-DNA.
[0023]
Example 2
Administration of HVJ-liposomes containing HGF expression vectors to rats
Preparation of HVJ-liposomes containing an HGF expression vector was carried out according to the method described in Examples using 64 μg of HMG 1 nucleoprotein and 200 μg of plasmid DNA. In addition, liposome suspension (0.5 ml, containing 10 mg of lipid) and HVJ (35,000 hemagglutinating units) were added and mixed so that the total liquid volume was 2 ml.
An SD rat (400-500 g; purchased from Nippon Charles River) was anesthetized by intraperitoneal administration of bentbarbital sodium salt (0.1 ml / 100 mg), and kept warm to ensure respiration with an automatic respirator. Rats were subjected to left thoracotomy and HVJ-liposomal DNA or HVJ-liposome-cont (20 μl) was carefully injected directly into the apex using a 30G needle.
[0024]
Comparative Example 1
Production of HVJ-liposomes containing no HGF expression vector
An HVJ-liposome not containing an HGF expression vector was produced by performing the same operation as that described in Example 1 on a vector containing no HGF gene. Hereinafter, the HVJ-liposome not containing the HGF expression vector is referred to as HVJ-liposome-cont.
[0025]
Comparative Example 2
Preparation of HVJ-liposomes containing human TGF-β expression vector
Using human TGF-β expression vector, HVJ-liposomes containing human TGF-β expression vector were prepared in the same manner as in Example 1.
Here, as a human TGF-β expression vector,Literature?The vector prepared according to
Hereinafter, the HVJ-liposome containing the human TGF-β expression vector is referred to as HVJ-liposome-DNA (TGF-β).
[0026]
Test example 1
Expression of HGF in rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA
HVJ-liposome-DNA (concentration of HGF expression vector in liposome: 10 μg / ml) was added to rat coronary artery endothelial cells (cell number: 10).⁸The amount of HGF produced was measured by ELISA. Moreover, the test similar to the above was done using HVJ-liposome-cont as a control. Furthermore, the amount of HGF produced was also measured for non-sensitized rat coronary artery endothelial cells (untreated group). The result is shown in FIG. 1 (n = 6). In the figure, HGF is a group of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA.
As shown in FIG. 1, rat coronary endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA produced and secreted HGF at high levels. On the other hand, substantially no HGF production was observed in the untreated group and the rat coronary artery endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-cont.
When measured by the number of cells, the number of cells was significantly higher in the HGF expression group.
[0027]
Test example 2
Effect of sensitized HGF expression vector on endothelial cell proliferation
Human endothelial cells were sensitized with HVJ-liposome-cont and cultured in the presence (1, 10, and 100 ng / ml) or absence of exogenously added recombinant human HGF, and the percentage increase in cell number (% ) Was measured. The results are shown in FIG. 2 (line graph) (n = 6). In the figure, DSF represents a group of endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont, and HGF represents a group cultured in the presence of a predetermined concentration of recombinant human HGF (*: P <0.05, **: P <0.01 pair) DSF).
As shown in the line graph of FIG. 2, it was revealed that the proliferation of endothelial cells was promoted by exogenously added HGF.
On the other hand, endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA (concentration: 10 μg / ml) were cultured, the increase in the number of cells was measured, and the rate of increase (%) was determined. Moreover, as a control, endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont were cultured, and the increase in the number of cells was measured to determine the rate of increase (%). The results are shown in FIG. 2 (bar graph) (n = 6). In the figure, DSF represents an endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-cont, and the HGF vector represents an endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-DNA (**; P <0.01 vs. DSF, #: P <0.05). Vs. HGF 100 ng / ml).
As shown in the bar graph of FIG. 2, the increase rate of endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA is remarkably higher than that of the control, and is also significantly higher than the effect of exogenously added HGF. It was revealed.
[0028]
Further, endothelial cells sensitized with the above HVJ-liposome-DNA were cultured in the presence or absence of rabbit anti-human HGF antibody, and the increase in the number of cells was measured to determine the rate of increase (%). As a control, endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont were cultured, and the increase rate (%) of the number of cells was similarly determined. Rabbit anti-human HGF antibody is described in the literature (Jpn. J. Cancer Res.,83, 1262-1266 (1992)), and this antibody can neutralize 10 ng / ml biological activity at a concentration of 10 μg / ml. Furthermore, the anti-human HGF antibody only cross-reacts with human HGF and does not react with rat HGF, and the anti-rat HGF antibody only cross-reacts with rat HGF and does not react with human HGF. Normal rabbit serum IgG (10 μg / ml) was used as a control.
The result is shown in FIG. 3 (n = 6). In the figure, the control is HVJ-liposome-cont-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of IgG control; HGF is the HVJ-liposome-DNA-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of IgG control; HGFab is rabbit anti-human The HVJ-liposome-DNA-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of HGF antibody is shown. The increase rate (%) was expressed as a relative% with the increase rate of the control as 100 (*: P <0.01 vs. control, #: P <0.05 vs. HGF).
As shown in FIG. 3, the growth of HVJ-liposome-DNA-sensitized endothelial cells was suppressed by the presence of the anti-human HGF antibody, and the cell increase rate was similar to that of the control. This revealed that HGF is an endothelial cell growth factor.
[0029]
Test example 3
Effect of culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA on rat coronary artery endothelial cells
The culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA was cultured in a rat coronary artery endothelial cell culture system (cell number: 10).^FiveIn addition, the cells were cultured for 3 days, and the increase in the number of endothelial cells was examined. As a control, an increase in the number of endothelial cells was examined in the same manner using a culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont. The result is shown in FIG. 4 (n = 6). In the figure, control is a group to which a culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont was added; HGF is a group to which a culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA was added.
As shown in FIG. 4, a significant increase in the number of endothelial cells was observed in the group to which the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA was added.
[0030]
The HGF concentration of the culture supernatant of rat VSMC sensitized with the above HVJ-liposome-DNA or HVJ-liposome-cont was measured by ELISA using anti-human HGF antibody and anti-rat HGF antibody. In addition, the HGF concentration in the culture supernatant of non-sensitized VSMC was also measured (untreated group).
The measurement results using the anti-human HGF antibody are shown in FIG. 5, and the results using the anti-rat HGF antibody are shown in FIG. 6 (n = 6 in all cases). In the figure, the control is a culture supernatant group of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; and HGF is the culture supernatant group of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA.
As shown in FIG. 5, HGF was detected in the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA, and its value was significantly higher than that of the control.
Further, as shown in FIG. 6, rat HGF was also detected in the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA, and its value was significantly higher than that of the control.
As shown in FIGS. 5 and 6, there was no HGF of an amount that could be measured by the ELISA method in the culture supernatant in the untreated group and the control group.
[0031]
Test example 4
Effect of culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA on rat coronary artery endothelial cells
The culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA was cultured in a rat coronary artery endothelial cell culture system (cell number: 10).^FiveIn addition, the cells were cultured for 3 days, and the increase in the number of endothelial cells was examined. Further, as a control, an increase in the number of endothelial cells was examined in the same manner using a culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont. The result is shown in FIG. In the figure, A is a group to which culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA was added (n = 8); B is a culture top of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont. Group to which Qing was added (n = 8); C is an untreated group (n = 15).
As shown in FIG. 7, in the group to which the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA was added, a significant increase in the number of endothelial cells was observed, whereas in the control group, The cell count was similar to the untreated group. (Control group: 0.117 ± 0.002, Group A: 0.148 ± 0.03 P <0.01).
[0032]
Next, an anti-HGF antibody was added to the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA, and the increase in the number of endothelial cells was examined in the same manner as described above. The result is shown in FIG. 8 (n = 8). In the figure, A is a group added with culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA; B is a group added with culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont. C is a group in which anti-HGF antibody is added to the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA; D is a control in the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA This is a group to which an antibody was added.
As shown in FIGS. 8A and 8C, the cell growth promoting activity of the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA was completely lost by the addition of anti-HGF antibody. This revealed that the cell growth promoting activity of the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA was caused by HGF.
[0033]
Test Example 5
Effect of human VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA on human endothelial cells
A human VSMC cell culture insert (Coaster, Inc., pore size: 0.45 μm) was seeded and grown in DMEM medium supplemented with 10% bovine serum. On the other hand, human endothelial cells were seeded in 6-well plates and maintained in DMEM medium supplemented with 10% bovine serum. When VSMC was 80% confluent, it was incubated with HVJ-liposome-DNA (DNA content in liposome: 10 μg) or HVJ-liposome-cont for 5 minutes at 4 ° C. and then for 30 minutes at 37 ° C. After sensitization, inserts containing sensitized VSMCs were added to wells containing quiescent human endothelial cells. VSMC and endothelial cells were co-cultured in DMEM medium containing 0.5% bovine serum for 3 days, and the number of cells was measured using a WST-cell count kit (Wako). The result is shown in FIG. 9 (n = 6). In the figure, the control is a co-culture group with VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; HGF is a culture supernatant group of VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA.
As shown in FIG. 9, it was revealed that human VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA significantly increased the proliferation of non-sensitized human endothelial cells in stationary phase.
[0034]
Test Example 6
Effect of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA on rat coronary artery endothelial cells
Rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA (cell count: 10⁸) And rat coronary endothelial cells in stationary phase (cell count: 10)^FiveWere co-cultured for 3 days, and the increased number of coronary endothelial cells was examined. Further, as a control, rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont was co-cultured in the same manner to examine the increase in the number of endothelial cells. The result is shown in FIG. 10 (n = 6). In the figure, HGF is a rat VSMC group sensitized with HVJ-liposome-DNA, and a control is a rat VSMC group sensitized with HVJ-liposome-cont.
As shown in FIG. 10, proliferation of endothelial cells was stimulated by HGF released from rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA, and an increase in the number of cells was observed (control group: 0.126 ± 0.006, HGF). Group: 0.156 ± 0.01 P <0.05).
[0035]
Test Example 7
Growth of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA
Rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA and rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont were cultured separately, and the increase in the number of cells was compared and examined. There was no effect on proliferation. From this, it was found that HGF has no cell proliferation promoting activity against VSMC.
[0036]
Test Example 8
Neovascularization in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-DNA
Rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-DNA, rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-cont and untreated rat myocardium were HE-stained and Azan-stained, and microscopically counted. The result is shown in FIG. In the figure, HGF is the number of microvessels in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-DNA, and the control is the number of microvessels in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-cont.
As shown in FIG. 11, the number of microvessels was significantly increased in the rat myocardium injected with HVJ-liposome-DNA compared to the rat myocardium injected with HVJ-liposome-cont and the untreated rat myocardium. This indicates that HGF having an endothelial cell proliferation action has an angiogenesis action in the living body.
[0037]
Test Example 9
Repair of articular cartilage by directly introducing HVJ-liposome-DNA into the joint
An injury that penetrates the subchondral bone was created using a Kirschner steel wire with a diameter of 1.8 mm in the interfemoral condyles of a 10-week-old Fischer rat. At one week after the operation, the HVJ-liposome-DNA (100 μl / knee) prepared in Example 1 was directly introduced into the joint. As controls, HVJ-liposome-cont prepared in Comparative Example 1 and HVJ-liposome-DNA (TGF-β) prepared in Comparative Example 2 were administered into the joint in the same amount. Rats were sacrificed 1, 3, and 4 weeks after introduction of these genes and the like, and the repair site was observed histologically.
As a result, as shown in FIG. 12, the appearance of cartilage-like cells in which the synthesis of proteoglycan partially stained with toluidine blue staining was observed in the repaired tissue 3 weeks after administration of HVJ-liposome-DNA into the joint. I was able to admit. In addition, as shown in FIG. 13, in the 4 weeks after administration of HVJ-liposome-DNA into the joint, the appearance range of chondrocyte-like cells that recognized proteoglycan synthesis tended to expand.
As shown in FIG. 14, when HVJ-liposome-DNA (TGF-β) prepared in Comparative Example 2 was administered into the joint, the appearance of such chondroid cells was observed 4 weeks after the administration. I couldn't. Further, as shown in FIG. 15, in the case of administration of the HVJ-liposome-cont produced in Comparative Example 1 into the joint, no such cartilage-like cells appeared in 4 weeks after the administration. .
[0038]
【The invention's effect】
Since the medicament of the present invention has a sustained therapeutic effect as compared with the administration of HGF itself and can act locally, it can reduce the side effects of HGF.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the expression of HGF in rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 1. FIG.
2 is a graph showing the cell increase rate in the presence or absence of HGF in endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont in Test Example 2. FIG. In the figure, HGF represents an endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-cont, and HGF represents a group cultured in the presence of a predetermined concentration of recombinant human HGF. The bar graph of FIG. 2 is a graph showing the cell increase rate of endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 2. In the figure, DSF represents an endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-cont, and HGF vector represents an endothelial cell group sensitized with HVJ-liposome-DNA.
FIG. 3 is a graph showing the cell increase rate of endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA in the presence or absence of an anti-HGF antibody in Test Example 2. In the figure, the control is HVJ-liposome-cont-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of IgG control; HGF is the HVJ-liposome-DNA-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of IgG control; HGFab is rabbit anti-human The HVJ-liposome-DNA-sensitized endothelial cell group cultured in the presence of HGF antibody is shown. The increase rate (%) was expressed as a relative% with the increase rate of the control as 100.
4 is a graph showing the cell proliferation effect on rat coronary artery endothelial cells of the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 3. FIG. In the figure, control is a group to which a culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont was added; HGF is a group to which a culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA was added.
FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the HGF concentration of the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 3 using an anti-human HGF antibody. In the figure, untreated is a culture supernatant group of non-sensitized VSMC; a control is a culture supernatant group of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; and HGF is a culture of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA. Supernatant group.
FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the HGF concentration of the culture supernatant of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 3 using an anti-rat HGF antibody. In the figure, untreated is a culture supernatant group of non-sensitized VSMC; a control is a culture supernatant group of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; and HGF is a culture of rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA. Supernatant group.
FIG. 7 is a graph showing the cell proliferation effect on the rat coronary artery endothelial cells of the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA in Test Example 4; In the figure, A is a group added with culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA; B is a group added with culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont. C is the untreated group.
FIG. 8 shows the cell proliferation effect on rat coronary artery endothelial cells in the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA in the presence of anti-HGF antibody in Test Example 4; FIG. In the figure, A is a group to which culture supernatant of rat sensation arterial endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA is added; B is a culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-cont. Group: C was a group in which anti-HGF antibody was added to the culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA; D was a culture supernatant of rat coronary artery endothelial cells sensitized with HVJ-liposome-DNA This is a group to which a control antibody was added.
FIG. 9 is a graph showing the increase in the number of endothelial cells when human VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA and non-sensitized human endothelial cells were co-cultured in Test Example 5. In the figure, the control is a co-culture group with VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; HGF is a culture supernatant group of VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA.
FIG. 10 is a graph showing the increase in the number of endothelial cells when co-cultured rat VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA and non-sensitized rat coronary artery endothelial cells in Test Example 6; In the figure, the control is a co-culture group with VSMC sensitized with HVJ-liposome-cont; HGF is a culture supernatant group of VSMC sensitized with HVJ-liposome-DNA.
FIG. 11 is a graph showing an increase in the number of microvessels in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-DNA in Test Example 8. In the figure, HGF is the number of microvessels in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-DNA, and the control is the number of microvessels in rat myocardium directly injected with HVJ-liposome-cont.
FIG. 12 is a diagram showing the appearance of cartilage-like cells in which the synthesis of proteoglycan stained with toluidine blue staining is observed 3 weeks after administration of HVJ-liposome-DNA into the joint in Test Example 9; It is.
FIG. 13 shows the appearance of cartilage-like cells in which the synthesis of proteoglycan stained with toluidine blue staining was observed 4 weeks after administration of HVJ-liposome-DNA into the joint in Test Example 9. It is.
FIG. 14 is a graph of proteoglycan stained with toluidine blue staining at 4 weeks after intra-articular administration of HVJ-liposome-DNA (TGF-β) prepared in Comparative Example 2 in Test Example 9; It is a figure which shows that the chondroid cell which recognizes a synthesis | combination is not recognized.
FIG. 15 is a cartilage-like structure in which the synthesis of proteoglycan stained with toluidine blue staining is observed 4 weeks after administration of HVJ-liposome-cont prepared in Comparative Example 1 into the joint in Test Example 9 It is a figure which shows that a cell is not recognized.

Claims

A medicament for intraarticular administration, comprising a HVJ-liposome containing an HGF expression vector as an active ingredient, for treating cartilage injury.

The medicament according to claim 1, which, when introduced into a joint, promotes the appearance of cartilage-like cells that recognize proteoglycan synthesis.