JP4019208B2 - Novel enzyme and method for producing the same - Google Patents

Description

作用は、加水分解と脱水閉環の双方向を触媒し可逆的である。
【０００３】
本酵素は、ヌクレオシドホスフォリラーゼによる塩基交換反応を利用したプリンヌクレオシド化合物の製造の効率化に有用である。該プリンヌクレオシド化合物の製造において、本酵素は、ピリミジンヌクレオシドとプリン塩基との塩基交換により生成されるピリミジン塩基を、塩基交換を触媒する酵素（ヌクレオシドホスホリラーゼ）の基質になり得ない化合物に変換する役割を果たす。尚、塩基交換反応による該プリンヌクレオシド化合物の製造方法の詳細は、例えば特開平１１−４６７９０に開示されている。また、上記反応から理解できるように、本酵素はバルビツール酸の定量に利用することも可能である。
【０００４】
【従来の技術】
国際生化学連合酵素委員会報告（Enzyme Nomenclature -Recommendations(1978) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry, Academic Press(1979))、同報告の補遺１（NC-IUB, Eur. J. Biochem., 104, 1-4(1979))と補遺２（NC-IUB, Eur. J. Biochem.,116, 423-435(1981))において、バルビツラーゼ（Barubiturase、ＥＣ3.5.2.1）は下記式に示すように、バルビツール酸を加水分解してマロン酸と尿素を生成する加水分解酵素（Hydrolase）と定義されている。
【０００５】
【化３】

【０００６】
従来、バルビツラーゼに関する記載及び報告は次のようなものがある。
【０００７】
［１］Hayashi, O. & Kornberg, A. : J. Biol. Chem., 197, 717-732,(1952)
［２］Hayashi, O.: Meth. Enzymol. 2, 492-493(1955)
［３］Lara, F.J.S.: J. Bacteriol. 64, 279-285(1952)
［４］Patal, B.N. & West, T.P.: FEBS Microbial. Lett. 40, 33-36(1987)
［５］Vogels G.D. & Van Der Drift, C.: Bacteriol. Rev. 40, 403-468(1976)
［６］丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック（朝倉書店）、596頁（1982）
［７］Schumburg, D. & Stephan, D., ed., Enzyme Hondbook(Springer-Verlag), EC3.5.2.1(1991)。
【０００８】
バルビツラーゼの起源としては、Mycobacterium属（文献［１］、［２］）、Nocardia属（文献［３］）、Enterobacter属（文献［４］）、及びCorynebacterium属（文献［１］、［５］）が報告されている。そして、見いだされたバルビツラーゼの触媒機能と生成物は全て上記の式に合致することが報告されている。しかしながら、これまでバルビツラーゼは精製困難な酵素の一つとされ、途中まで精製されたことはあっても、単離されたことはなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バルビツール酸の加水分解反応を触媒する安定な酵素、その製造方法及び該酵素を生産し得る微生物を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の課題を解決すべく、バルビツール酸加水分解酵素とその生産菌を探索した結果、従来知られているものとは全く性質を異にする新規酵素と該酵素を生産する微生物を見いだし本発明を完成するに至った。
【００１１】
まず本発明の第１は、次の反応を触媒する新規酵素である。
【００１２】
【化４】

作用は、加水分解と脱水閉環の双方向を触媒し可逆的である。
【００１３】
次に本発明の第２は、上述の新規酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とする新規酵素の製造方法である。
【００１４】
そして本発明の第３は、上述の新規酵素を生産する能力を有する微生物、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１、ロドコッカス・エリスロポリスＪＣＭ ３１３２、又はアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
〈新規酵素〉
まず本発明の第１は、次の反応を触媒する新規酵素であり、該酵素の理化学的性質及び酵素学的性質の典型的な例を挙げれば、以下のとおりである。
【００１７】
【化５】

作用は、加水分解と脱水閉環の双方向を触媒し可逆的である。
【００１８】
酵素の理化学的性質及び酵素学的性質
（１）基質特異性：バルビツール酸に対して作用する。
【００１９】
（２）至適pH及びpH安定性：至適pHは8.0付近であり、pH6.0〜7.0において安定である。
【００２０】
（３）至適温度及び熱安定性：至適温度は40℃で、４℃〜50℃で安定である。
【００２１】
（４）阻害：
（ａ） ＳＨ阻害剤；N−エチルマレイミド［NEM］、5,5'−ジチオビス（2−ニトロ安息香酸）［DTNB］、p−（クロロメルクリ）安息香酸［p-CMB］、Ｎ−ブロモスクシンイミド、
（ｂ） セリンプロテアーゼ阻害剤：フェニルメチルスルホニルフルオリド［PMSF］、ジイソプロピルフルオロリン酸［DipF］、
（ｃ） 金属イオン類；Ｎｉ^＋＋、Ｃｏ^＋＋、Ｃｄ^＋＋、Ｃｕ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、Ｈｇ^＋＋、
（ｄ）環状アミド；ジヒドロオロチン酸、アロキサン
などにより阻害される。
【００２２】
（５）安定化：エチレングリコールにより安定化される。その濃度は10％付近が好ましい。
【００２３】
（６）分子量：
（ａ） ゲル濾過法による分子量は172,000。
（ｂ） ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニットの分子量は45,000。
【００２４】
従って、本酵素はホモ４量体である。
【００２５】
（７）動力学的パラメーター：
バルビツール酸の加水分解反応におけるKm=1.0mM、Ｖmax＝2.5μmol/min/mg
（８）アミノ酸配列：アミノ酸の部分配列は以下のようであり、これまでに知られているいかなる環状アミド変換酵素とも類似性がない。
（ａ）Ｎ−末端アミノ酸配列：
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ
（ｂ）内部アミノ酸配列：
（その１）
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
（その２）
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
（その３）
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
（その４）
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ。
【００２６】
〈新規酵素の製造方法〉
次いで、本発明の第２は、上述の新規酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とする新規酵素の製造方法である。前記微生物は、好ましくはロドコッカス属又はアルスロバクター属に属し、更に好ましくは、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２又はアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）である。
【００２７】
本発明で用いる微生物の培養は通常行われる条件で行えばよい。大量に培養するには液体培地を用い、振盪培養又は通気撹拌培養により好気的条件下で行うことが好ましい。培地としては炭素源及び窒素源としてグルコース、グリセリン、ウラシル、チミン、アスパラギン、ペプトン、肉エキス、マルトエキス、イーストエキス、塩化アンモニウムなどを用いることができるが、さらにビタミン類の添加が好ましい。本微生物が生育し、本酵素が十分に生産される条件であれば、培養温度、培養時間、培養のpHは特に制限されない。培養条件によって変動することもありうるが、培養温度は30℃近傍、初発pHは7.0付近で、培養時間は48〜144時間、好ましくは96時間、好気的に培養する。
【００２８】
培養物から本酵素を採取するには、通常用いられる方法に従って行えばよい。例えば、遠心分離などによって集菌した菌体を超音波、あるいはガラスビーズなどで摩砕した後、遠心分離などにより細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を得る。次に、硫安、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィーなどによるクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法などを用いて精製することができる。この間、本酵素の安定化のためにエチレングリコールを10％程度共存させておくことが好ましい。
【００２９】
〈新規酵素を生産する微生物〉
さらに、本発明の第３は、新規酵素を生産する能力を有するロドコッカス属又はアルスロバクター属に属する微生物を提供することである。好ましくは、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis） ＪＣＭ ３１３２、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis） ＪＣＭ ３１９１、又はアルスロバクター・スピーシーズ（Arthrobacter sp.） ＹＧＫ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）である。最も好ましくは、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis） ＪＣＭ ３１３２である。
【００３０】
ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis） ＪＣＭ ３１３２とロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis） ＪＣＭ ３１９１の菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設の保有する菌株であって、ＪＣＭ菌株カタログ第７版（１９９９）に掲載されている。アルスロバクター・スピーシーズ（Arthrobacter sp.） ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３１】
寄託菌株の菌学的性質を、バージェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第８版（１９７５年）、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１版（１９８４）及び第２版（１９８６）に準じて検討した結果は次の通りである。なお、実験は主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。
【００３２】
アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２
１．形態的性質
（１）細胞の大きさ： ０．５〜０．７×１．０〜５．０μｍの桿菌
（２）グラム染色性： 陽性
（３）細胞の多形性： 生活環に伴う球菌〜桿菌の顕著な多形性が見られる。
【００３３】
（４）運動性： 有り（酵母エキス加肉汁液体培地で５〜２４時間培養に運動性が見られる）
（５）鞭毛の着生状態：有り、１〜２本の側毛
（６）胞子の有無： 無し
（７）抗酸性： 無し。
【００３４】
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養： ３０℃、２４時間培養で乳白色、半透明、表面がザラザラの円形、波状のコロニ−を形成する。
【００３５】
（２）肉汁寒天斜面培養： 淡黄色、半透明で培地全体に拡がり生育は良好である。
【００３６】
（３）肉汁液体培養： 生育が遅い。酵母エキスを添加した振とう培養で良好な生育が見られる。
【００３７】
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：表面のみわずかに液化する。
【００３８】
（５）リトマスミルク： 変化しない。
【００３９】
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元 陰性
（２）脱窒反応 陰性
（３）ＭＲテスト 陰性
（４）ＶＰテスト 陰性
（５）インドールの生成 陰性
（６）硫化水素の生成 陰性
（７）クエン酸の利用
・クリステンセン培地 陰性
・コーザーの培地 陰性
（８）無機窒素源の利用
・硝酸塩 陽性
・アンモニウム塩 陰性
（９）色素の生成 無し
（10）ウレアーゼ 陰性
（11）オキシダーゼ 陰性
（12）カタラーゼ 陽性
（13）生育の範囲
・ｐＨ域 ５．５〜９．５
・温度域 １９〜３８℃
（14）酸素に対する態度 好気性
（15）Ｏ−Ｆテスト
・グルコ−ス 変化無し
・サッカロ−ス 変化無し
（16）各種炭素源の利用
・Ｌ−アラビノ−ス ±
・Ｄ−キシロ−ス ＋
・Ｄ−グルコ−ス ＋
・Ｄ−マンノ−ス ＋
・Ｄ−フラクト−ス ＋
・Ｄ−ガラクト−ス ＋
・マルトース ＋
・スクロース ＋
・ラクトース −
・トレハロ−ス ＋
・Ｄ−ソルビトール ＋
・Ｄ−マンニトール ＋
・イノシトール ＋
・グリセリン −
・デンプン −。
【００４０】
４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による）
Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝６９．６
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はアルスロバクター属（Arthrobacter sp.）に属することが判明した。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【００４２】
実施例１：本酵素生産菌の探索
本酵素を生産する菌の探索を、２段階の選抜により行った。
第一の選抜として、ウラシル又はチミン２ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、酵母エキス６ｇ及び蒸留水１ＬよりなるpH7.0の「Ａ培地」に良く生育し、ウラシル又はチミンを著しく資化する微生物を、約１５００の土壌及び保有菌株の中から選抜した。培養は各微生物の生育適温で振盪培養により行った。ウラシル及びチミンの資化性はＵＶ検出器を装着した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、その減少度合いから定量した。
【００４３】
［ＨＰＬＣ条件］
検出器：UV260nm
カラム：Inertsil ODS２（ＧＬサイエンス製）、4.6ｘ２５０mm
溶媒：リン酸二水素アンモニウム100mM／メタノール＝97/3(v/v)
送液量：1.0 mL/分。
【００４４】
次に、第二の選抜を行った。選抜菌株の培養には、Ａ培地又はグリセリン１０ｇ、塩化アンモニウム４ｇ、硫酸マグネシウム・七水塩0.3ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、チアミン塩酸塩１mg、リボフラビン２mg、ニコチン酸２mg、パントテン酸２mg、ピリドキシン塩酸塩２mg、ビオチン 0.1 mg、p−アミノ安息香酸１mg、葉酸 0.1 mg、塩化カルシウム二水和物10mg、塩化マンガン四水和物10mg、塩化ニッケル六水和物10mg、硫酸亜鉛七水和物10mg、塩化カドミウム二水和物10mg、硫酸銅五水和物10mg、硫酸鉄七水和物10mg、硫酸ベリリウム四水和物10mg、塩化ルビジュウム10mg、塩化コバルト(ＩＩ)・無水10mg及び蒸留水１ＬからなるpH7.0の「Ｂ培地」を用いた。Ｂ培地５mLを入れた試験管（16.5 x 160 mm)に上記第一の選抜菌株を接種し、300 rpmで振盪させつつ、28℃で96時間培養し、遠心分離により湿菌体を得た。
【００４５】
バルビツール酸20mM、Hepes（同仁化学研究所製）/NaOH100mM（pH8.0）の水溶液０.１mLに湿菌体10mgを加え、30℃で30〜60分間放置した。遠心分離により上清を得て、上記ＨＰＬＣによりバルビツール酸の減少と生成物を分析した。
【００４６】
その結果、本酵素を生産する菌株として、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１及びアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）が選定された。この中で、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２が一番活性が強かったので、以下、本菌株が生産する新規酵素について検討した。
【００４７】
実施例２：各種環状アミド関連化合物の新規酵素生産に対する効果
Ｂ培地に表１に示す各種環状アミド関連化合物を0.15%(w/v)加えた以外は実施例１と同様の条件でロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２を培養し、酵素活性を測定した。なお、酵素活性は湿菌体１gが１分間に分解するバルビツール酸量（μmol）として表示した。化合物を加えなかった場合の活性を１００として相対活性を右欄に示した。バルビツール酸、ウラシル及びチミンが最も有効な活性誘導物質であった。
【００４８】
【表１】

【００４９】
実施例３：本酵素安定化物質
本酵素は不安定な酵素であり、培養菌体を破砕すると、そのままでは急速に失活した。そこで、安定化物質を検索した。湿菌体20gを20mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）20mLに懸濁したものを超音波破砕に供し、遠心分離後得た上清を酵素液として用いた。これに0.2%(w/v)の種々の界面活性剤（Tween20、Tween80、TritonX-100、Span20、Briji35、コール酸ナトリウム、ヘキサデシルピリジニウムクロリド一水和物）、10%(w/v)のグリセロールもしくはエチレングリコールを種々の組み合わせで加え、４℃保存時における安定化効果を検討した。その結果、図１（代表的な結果を示す）に示すように、エチレングリコールがきわめて有効な物質であることを見いだした。
【００５０】
実施例４：本酵素の分離精製
培地Ｂにチミン0.15%(w/v)を加えた「培地Ｃ」500mLを2L坂口フラスコ中に調製し、これにロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２を接種し、培養温度28℃、150rpmにて96時間振盪培養した。
【００５１】
以下の操作は全て４℃以下で行った。また、タンパク質はローリー法により定量した。
【００５２】
上記培養の終了後、菌体を遠心分離（10,000ｇ、10分）により集め、得られた湿菌体20gを20mLの10％エチレングリコールを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）に懸濁した。該懸濁液を、ダイノ−ミル（DYNO-MILL、ウイリー・エー・バコーフェン社製）によりガラスビーズで破砕し、該破砕液を遠心分離（15,000ｇ、15分）することにより無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。次いで遠心分離し、得られた上清を、DEAE-Sepharacelカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出により、本酵素活性を有する画分を回収した。このアニオン交換クロマトグラフィーを、塩化ナトリウムの濃度勾配を緩やかにしてもう１度行った。得られた活性画分を、MonoＱ HR5/5を用いた強アニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。さらに、活性画分をPhenyl-Sepharose CL-4Bを用いた疎水性カラムクロマトグラフイーにより精製した。最後に、Superdex S-200カラムによりゲル濾過クロマトグラフイーを行い、最終精製酵素標品を得た。得られた本酵素酵素標品は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE)において、単一のバンドを示し、その分子量は45,000であった。また、ゲル濾過法による本酵素の分子量は172,000であった。したがって、本酵素は４つの単一なサブユニットからなる、ホモ４量体であることが判明した。
【００５３】
精製の要約を表２に示す。精製酵素の比活性は1.95U/mgタンパク質であった。１Uは１分間に１μmolのバルビツール酸を加水分解する酵素量を表す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
実施例５：本酵素のアミノ酸配列
実施例４で得られた本酵素標品の部分アミノ酸配列を定法により決定した。結果は以下のようであり、部分アミノ酸配列はこれまでに知られているいかなる環状アミド変換酵素とも類似性がない。
【００５６】
（１）Ｎ−末端アミノ酸配列：
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ
（２）内部アミノ酸配列：
（その１）
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
（その２）
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
（その３）
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
（その４）
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ。
【００５７】
実施例６：生成物の同定
精製単離した本酵素をバルビツール酸に作用させ、下記条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により反応生成物を分析した。生成物は唯一つであり、分取により単離された。
【００５８】
本生成物に関して、以下のことがＨＰＬＣの保持時間の比較、スペクトロメトリーの一致などにより確認された。すなわち、単離した物質はバルビツール酸と異なり250nm付近に吸収を示さなかったことから、環状構造を持たないことが判明した。本物質は加水分解により、尿素とマロン酸を生成した。また、本物質は酸性条件下で自動的に閉環し、元のバルビツール酸に戻ることが、確認された。以上の結果から、本生成物はウレイドマロン酸（ureidomalonate）と同定された。ＨＰＬＣの結果を図２に示す。（Ｂ）は、本酵素によりバルビツール酸から反応生成物が生じたことを示し、（Ａ）は、該反応生成物の加水分解によって尿素とマロン酸が生じたことを示す。
【００５９】
[ＨＰＬＣの条件]
カラム：Cosmosil 5C18AR-II（ナカライテスク製）、4.6 x 250 mm
溶媒：150 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.4）
送液量：１mL/分
検出器：UV210nm。
【００６０】
実施例７：温度とpHの影響
（１）温度： バルビツール酸20mM、Hepes/NaOH100mM（pH8.0)に、単離した本酵素を加え、温度を変化させて触媒活性を測定した結果、活性の最適温度は40℃であった。また、温度４℃〜50℃では安定であった。
【００６１】
（２）pH：定法により緩衝液（100mM）のpHを変えて酵素の安定性を調べた結果、活性はpH8.0で最大であったが、pH6.0〜7.0において最も安定であった。
【００６２】
実施例８：反応機構と基質特異性
（１）触媒作用：バルビツール酸20mM、Hepes/NaOH100mM（pH8.0)に、単離した本酵素を40℃で作用させて、反応の経時変化を求めた結果を図３に示す。本反応が平衡に達することを示しており、作用は加水分解と脱水閉環の双方向を触媒し可逆的であることが分かった。
【００６３】
（２）動力学的パラメーター：上記と同一条件で、バルビツール酸加水分解反応における動力学的パラメーターを求めた。最大速度Ｖmaxは2.5μmol/min/mgであり、ミカエリス定数Ｋｍは1.0mMであった。
【００６４】
（３）基質特異性：上記バルビツール酸の代わりに、ウラシル、チミン、ジヒドロウラシル、ジヒドロチミン、オロチン酸、ジヒドロオロチン酸、アロキサン、パラバン酸、ヒダントイン、スクシンイミド、バルビタール、シクロバルビタール、アロバルビタール、アラントイン、又はイソバルビツール酸を用いて反応を行わせたが、何れも加水分解を受けず、極めて基質特異性が高いことが判明した。
【００６５】
実施例９：反応の阻害
バルビツール酸20mM、Hepes/NaOH 100mM（pH8.0)に単離した本酵素を加え、下記の各種化合物及び金属イオンをそれぞれ添加して、40℃で反応を行わせた結果、
（１）ＳＨ阻害剤；N-エチルマレイミド［NEM］、5,5'−ジチオビス（2−ニトロ安息香酸）［DTNB］、p−（クロロメルクリ）安息香酸［p-CMB］、Ｎ-ブロモスクシンイミド、
（２）セリンプロテアーゼ阻害剤：フェニルメチルスルホニルフルオリド［PMSF］、ジイソプロピルフルオロリン酸［DipF］、
（３）金属イオン類：Ｎｉ^＋＋、Ｃｏ^＋＋、Ｃｄ^＋＋、Ｃｕ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、Ｈｇ^＋＋、
（４）環状アミド：ジヒドロオロチン酸、アロキサン
により阻害された。
【００６６】
【発明の効果】
文献未記載の反応機構を有する、基質特異性の高い新規酵素が提供された。バルビツール酸に作用してウレイドマロン酸を生成する本酵素はバルビツール酸の分解を必要とする反応に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の新規酵素に対するエチレングリコールの安定化効果を示す図。
【図２】 （Ａ）は、本発明の新規酵素によりバルビツール酸から反応生成物が生じたことを示す図、（Ｂ）は、該反応生成物の加水分解によって尿素とマロン酸が生じたことを示す図。
【図３】 本発明の新規酵素の作用は正逆双方向反応を触媒するものであることを示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel enzyme that catalyzes the following reaction, a method for producing the same, and a microorganism that can produce the enzyme.
[0002]
[Chemical 2]

The action is reversible, catalyzing both hydrolysis and dehydration ring closure.
[0003]
This enzyme is useful for increasing the efficiency of the production of purine nucleoside compounds using a base exchange reaction by nucleoside phosphorylase. In the production of the purine nucleoside compound, this enzyme converts a pyrimidine base produced by base exchange between a pyrimidine nucleoside and a purine base into a compound that cannot serve as a substrate for an enzyme (nucleoside phosphorylase) that catalyzes the base exchange. Fulfill. The details of the method for producing the purine nucleoside compound by base exchange reaction are disclosed in, for example, JP-A-11-46790. As can be understood from the above reaction, the enzyme can also be used for quantification of barbituric acid.
[0004]
[Prior art]
Enzyme Nomenclature -Recommendations (1978) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry, Academic Press (1979)), Appendix 1 of the report (NC-IUB, Eur. J. Biochem. , 104, 1-4 (1979)) and Addendum 2 (NC-IUB, Eur. J. Biochem., 116, 423-435 (1981)), Barubiturase (EC 3.5.2.1) is expressed by the following formula: As shown, it is defined as a hydrolase that hydrolyzes barbituric acid to produce malonic acid and urea.
[0005]
[Chemical 3]

[0006]
Conventionally, descriptions and reports on barbiturase include the following.
[0007]
[1] Hayashi, O. & Kornberg, A .: J. Biol. Chem., 197, 717-732, (1952)
[2] Hayashi, O .: Meth. Enzymol. 2, 492-493 (1955)
[3] Lara, FJS: J. Bacteriol. 64, 279-285 (1952)
[4] Patal, BN & West, TP: FEBS Microbial. Lett. 40, 33-36 (1987)
[5] Vogels GD & Van Der Drift, C .: Bacteriol. Rev. 40, 403-468 (1976)
[6] Bunji Maruo, supervised by Nobuo Tamiya, Enzyme Handbook (Asakura Shoten), 596 pages (1982)
[7] Schumburg, D. & Stephan, D., ed., Enzyme Hondbook (Springer-Verlag), EC 3.5.2.1 (1991).
[0008]
The origins of barbiturase include the genera Mycobacterium (literatures [1] and [2]), the genus Nocardia (literature [3]), the genus Enterobacter (literature [4]), and the genus Corynebacterium (literatures [1] and [5]). Has been reported. And it has been reported that the catalytic function and product of the barbiturase found all agree with the above formula. However, until now, barbiturase is considered to be one of the enzymes that are difficult to purify, and even though it has been partially purified, it has never been isolated.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a stable enzyme that catalyzes a hydrolysis reaction of barbituric acid, a method for producing the enzyme, and a microorganism that can produce the enzyme.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of searching for a barbituric acid hydrolase and its producing bacteria in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors produce a novel enzyme having completely different properties from those conventionally known and the enzyme. The inventors have found microorganisms and have completed the present invention.
[0011]
First, the first of the present invention is a novel enzyme that catalyzes the following reaction.
[0012]
[Formula 4]

The action is reversible, catalyzing both hydrolysis and dehydration ring closure.
[0013]
Next, a second aspect of the present invention is a method for producing a novel enzyme, which comprises culturing a microorganism having the ability to produce the aforementioned novel enzyme and collecting the enzyme from the culture.
[0014]
The third aspect of the present invention is a microorganism having the ability to produce the above-mentioned novel enzyme, Rhodococcus erythropolis JCM 3191, Rhodococcus erythropolis JCM 3132, or Arthrobacter species YGK 222 (FERM BP-5907). .
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0016]
<New enzyme>
First, the first of the present invention is a novel enzyme that catalyzes the following reaction, and typical examples of the physicochemical and enzymatic properties of the enzyme are as follows.
[0017]
[Chemical formula 5]

The action is reversible, catalyzing both hydrolysis and dehydration ring closure.
[0018]
Enzyme physicochemical and enzymatic properties (1) Substrate specificity: Acts on barbituric acid.
[0019]
(2) Optimal pH and pH stability: The optimal pH is around 8.0 and is stable at pH 6.0 to 7.0.
[0020]
(3) Optimum temperature and thermal stability: The optimum temperature is 40 ° C. and stable at 4 ° C. to 50 ° C.
[0021]
(4) Inhibition:
(A) SH inhibitor; N-ethylmaleimide [NEM], 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) [DTNB], p- (chloromercuri) benzoic acid [p-CMB], N-bromosuccinimide ,
(B) Serine protease inhibitor: phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], diisopropyl fluorophosphate [DipF],
(C) Metal ions: Ni ⁺⁺ , Co ⁺⁺ , Cd ⁺⁺ , Cu ⁺⁺ , Zn ⁺⁺ , Hg ⁺⁺ ,
(D) Cyclic amide; inhibited by dihydroorotic acid, alloxan and the like.
[0022]
(5) Stabilization: Stabilized with ethylene glycol. The concentration is preferably around 10%.
[0023]
(6) Molecular weight:
(A) The molecular weight by gel filtration method is 172,000.
(B) The molecular weight of the subunit by SDS-polyacrylamide electrophoresis is 45,000.
[0024]
Therefore, this enzyme is a homotetramer.
[0025]
(7) Kinetic parameters:
Km = 1.0mM, Vmax = 2.5μmol / min / mg in the hydrolysis of barbituric acid
(8) Amino acid sequence: A partial amino acid sequence is as follows, and has no similarity to any known cyclic amide converting enzyme.
(A) N-terminal amino acid sequence:
Pro-Glu-Ala-Ile-Glu-Val-Arg-Lys-Val-Pro-Leu-His-Ser-Val-Ser-Asp-Ala-Xaa-Glu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ile
(B) Internal amino acid sequence:
(Part 1)
Asp-Pro-Leu-Asp-Gln-Asp-Gly-Ile-Trp-Ala-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Glu-Arg-Pro-His-Ser- Asn-Asp-Leu-Asp-Gly-Gln-Leu-Val-Asn
(Part 2)
Leu-Ile-Asp-Asp-Gly-Val-Leu-Glu-Ala-Asp-Arg-Val-Ile-Ala-Val-Ile-Gly-Lys
(Part 3)
Thr-Asp-Glu-Pro-Arg-Leu-Thr-Val-Gly-Val-Ala-Met-Ser-Glu-Gln-Leu-Leu-Pro-Glu-Asp-Ile-Gly-Arg-Thr-Ala- Met-Ile-Thr-Lys
(Part 4)
Thr-Pro-Leu-Leu-Thr-Ile-His-Thr-Ile-Arg-Asp-Ala-Lys.
[0026]
<Method for producing novel enzyme>
Next, a second aspect of the present invention is a method for producing a novel enzyme, which comprises culturing a microorganism having the ability to produce the above-mentioned novel enzyme, and collecting the enzyme from the culture. The microorganism preferably belongs to the genus Rhodococcus or Arthrobacter, and more preferably Rhodococcus erythropolis JCM 3191, Rhodococcus erythropolis JCM 3132 or Arslobacter species YGK 222 (FERM BP-5907).
[0027]
The culture of the microorganism used in the present invention may be performed under the usual conditions. For culturing in large quantities, it is preferable to use a liquid medium and perform it under aerobic conditions by shaking culture or aeration stirring culture. As the medium, glucose, glycerin, uracil, thymine, asparagine, peptone, meat extract, malto extract, yeast extract, ammonium chloride, and the like can be used as the carbon source and nitrogen source, but the addition of vitamins is preferred. The culture temperature, culture time, and culture pH are not particularly limited as long as the microorganism grows and the enzyme is sufficiently produced. Although it may vary depending on the culture conditions, the culture temperature is about 30 ° C., the initial pH is about 7.0, and the culture time is 48 to 144 hours, preferably 96 hours.
[0028]
In order to collect the enzyme from the culture, it may be carried out according to a commonly used method. For example, microbial cells collected by centrifugation or the like are ground with ultrasonic waves or glass beads, and then solids such as cell debris are removed by centrifugation or the like to obtain a crude enzyme solution. Next, it can be purified using a salting-out method using ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, a chromatographic method using ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, or gel electrophoresis. During this time, about 10% of ethylene glycol is preferably allowed to coexist for stabilization of the enzyme.
[0029]
<Microorganisms that produce new enzymes>
The third aspect of the present invention is to provide a microorganism belonging to the genus Rhodococcus or Arthrobacter having the ability to produce a novel enzyme. Preferably, Rhodococcus erythropolis JCM 3132, Rhodococcus erythropolis JCM 3191, or Arthrobacter sp. YGK222 (FERM BP-5). Most preferred is Rhodococcus erythropolis JCM 3132.
[0030]
Rhodococcus erythropolis (Rhodococcus erythropolis) JCM 3132 and Rhodococcus erythropolis JCM 3191 strains are owned by the Institute of Physical and Chemical Research Microbiology System and are listed in the JCM strain catalog 7th edition (1999). It is posted. Arthrobacter sp. YGK 222 (FERM BP-5907) has been deposited with the Patent Microbiology Depositary Center of the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.
[0031]
The bacteriological properties of the deposited strains are summarized as follows: Barjays Manual of Deterministic Bacteriology 8th Edition (1975), Barjays Manual of Systematic Bacteriology 1st Edition (1984) and 2nd Edition The results examined in accordance with (1986) are as follows. The experiment was performed mainly by the method described by Takeharu Hasegawa, revised edition “Classification and Identification of Microorganisms” (Academic Publishing Center, 1985).
[0032]
Arthrobacter Spices YGK 222
1. Morphological properties (1) Cell size: 0.5-0.7 × 1.0-5.0 μm bacilli (2) Gram staining: Positive (3) Cell polymorphism: Cocci associated with life cycle ~ Significant polymorphism of Neisseria gonorrhoeae is seen.
[0033]
(4) Motility: Existence (Mobility is observed in culture for 5 to 24 hours in yeast extract-added broth liquid medium)
(5) Flagellar state: Yes, 1-2 side hairs (6) Presence of spores: No (7) Antiacidity: No
[0034]
2. Culture characteristics (1) Meat broth agar plate culture: Milky white, translucent, rough round and wavy colonies are formed by culturing at 30 ° C. for 24 hours.
[0035]
(2) Meat broth agar slope culture: Pale yellow, translucent, spreads throughout the medium and grows well.
[0036]
(3) Meat broth liquid culture: Slow growth. Good growth is seen in shake culture with yeast extract added.
[0037]
(4) Gravy gelatin puncture culture: Only the surface is slightly liquefied.
[0038]
(5) Litmus milk: No change.
[0039]
3. Physiological Properties (1) Nitrate Reduction Negative (2) Denitrification Negative (3) MR Test Negative (4) VP Test Negative (5) Indole Generation Negative (6) Hydrogen Sulfide Generation Negative (7) Citric Acid Use ・ Christensen medium negative ・ Coser medium negative (8) Use of inorganic nitrogen source ・ Nitrate positive ・ Ammonium salt negative (9) Dye production None (10) Urease negative (11) Oxidase negative (12) Catalase positive (13) Growth range / pH range 5.5-9.5
・ Temperature range: 19 ~ 38 ℃
(14) Attitude toward oxygen Aerobic (15) OF test ・ No change in glucose ・ No change in saccharose (16) Utilization of various carbon sources ・ L-arabinose ±
・ D-xylos +
・ D-glucose +
・ D-Mannos +
・ D-fructose +
・ D-galactose +
・ Maltose +
・ Sucrose +
・ Lactose −
・ Trehalose +
・ D-sorbitol +
・ D-mannitol +
・ Inositol +
・ Glycerin −
-Starch.
[0040]
4). GC content (by HPLC method)
G + C (mol%) = 69.6
Based on the above bacteriological properties, this strain was found to belong to the Arthrobacter sp.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0042]
Example 1: Search for the present enzyme-producing bacterium The search for the bacterium that produces this enzyme was performed by two-stage selection.
As the first selection, 2g of uracil or thymine, 1g of potassium dihydrogen phosphate, 3g of dipotassium hydrogen phosphate, 6g of yeast extract and 1L of distilled water grows well on "A medium" with pH 7.0, and uracil or thymine Were selected from about 1,500 soils and retained strains. The culture was carried out by shaking culture at a suitable growth temperature for each microorganism. The utilization of uracil and thymine was quantified from the degree of decrease by high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with a UV detector.
[0043]
[HPLC conditions]
Detector: UV260nm
Column: Inertsil ODS2 (manufactured by GL Sciences), 4.6 x 250 mm
Solvent: 100 mM ammonium dihydrogen phosphate / methanol = 97/3 (v / v)
Feed rate: 1.0 mL / min.
[0044]
Next, a second selection was performed. For the culture of the selected strain, A medium or glycerol 10 g, ammonium chloride 4 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.3 g, potassium dihydrogen phosphate 1 g, dipotassium hydrogen phosphate 1 g, thiamine hydrochloride 1 mg, riboflavin 2 mg, nicotinic acid 2 mg, pantothenic acid 2 mg, pyridoxine hydrochloride 2 mg, biotin 0.1 mg, p-aminobenzoic acid 1 mg, folic acid 0.1 mg, calcium chloride dihydrate 10 mg, manganese chloride tetrahydrate 10 mg, nickel chloride hexahydrate 10 mg, Zinc sulfate heptahydrate 10 mg, cadmium chloride dihydrate 10 mg, copper sulfate pentahydrate 10 mg, iron sulfate heptahydrate 10 mg, beryllium sulfate tetrahydrate 10 mg, rubidium chloride 10 mg, cobalt chloride (II) A pH 7.0 “B medium” consisting of anhydrous 10 mg and 1 L of distilled water was used. A test tube (16.5 × 160 mm) containing 5 mL of B medium was inoculated with the first selected strain, cultured at 28 ° C. for 96 hours while shaking at 300 rpm, and wet cells were obtained by centrifugation.
[0045]
10 mg of wet cells were added to 0.1 mL of an aqueous solution of 20 mM barbituric acid and Hepes (manufactured by Dojindo Laboratories) / 100 mM NaOH (pH 8.0), and left at 30 ° C. for 30 to 60 minutes. The supernatant was obtained by centrifugation, and the reduction of barbituric acid and the product were analyzed by HPLC.
[0046]
As a result, Rhodococcus erythropolis JCM 3132, Rhodococcus erythropolis JCM 3191 and Arthrobacter sp. YGK 222 (FERM BP-5907) were selected as strains producing this enzyme. Among them, Rhodococcus erythropolis JCM 3132 had the strongest activity. Therefore, a novel enzyme produced by this strain was examined below.
[0047]
Example 2: Effect of various cyclic amide-related compounds on new enzyme production Rhodococcus erythro under the same conditions as in Example 1 except that 0.15% (w / v) of various cyclic amide-related compounds shown in Table 1 was added to medium B. Police JCM 3132 was cultured and enzyme activity was measured. Enzyme activity was expressed as the amount of barbituric acid (μmol) that 1 g of wet cells decomposes in 1 minute. The relative activity is shown in the right column, assuming that the activity when no compound was added was 100. Barbituric acid, uracil and thymine were the most effective activity inducers.
[0048]
[Table 1]

[0049]
Example 3: This enzyme stabilizing substance This enzyme is an unstable enzyme, and when the cultured cells were disrupted, it was rapidly inactivated. Therefore, we searched for stabilizing substances. A suspension of 20 g of wet cells in 20 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was subjected to ultrasonic disruption, and the supernatant obtained after centrifugation was used as an enzyme solution. 0.2% (w / v) of various surfactants (Tween20, Tween80, TritonX-100, Span20, Briji35, sodium cholate, hexadecylpyridinium chloride monohydrate), 10% (w / v) Glycerol or ethylene glycol was added in various combinations, and the stabilizing effect when stored at 4 ° C. was examined. As a result, as shown in FIG. 1 (showing representative results), it was found that ethylene glycol is a very effective substance.
[0050]
Example 4: Separation and purification of this enzyme 500 mL of “medium C” obtained by adding 0.15% (w / v) thymine to a 2 L Sakaguchi flask was inoculated with Rhodococcus erythropolis JCM 3132 and cultured. The culture was shaken for 96 hours at a temperature of 28 ° C. and 150 rpm.
[0051]
The following operations were all performed at 4 ° C. or lower. Proteins were quantified by the Raleigh method.
[0052]
After completion of the above culture, the cells were collected by centrifugation (10,000 g, 10 minutes), and 20 g of the obtained wet cells were suspended in 20 mL of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 10% ethylene glycol. It became cloudy. The suspension was crushed with glass beads using a DYNO-MILL (manufactured by Willy A. Bacofen), and the crushed liquid was centrifuged (15,000 g, 15 minutes) to obtain a cell-free extract. Obtained. Protamine sulfate was added to the cell-free extract to remove nucleic acids and microsomes. Subsequently, centrifugation was performed, and the resulting supernatant was subjected to anion exchange chromatography using a DEAE-Sepharacel column, and a fraction having this enzyme activity was recovered by concentration gradient elution of sodium chloride. This anion exchange chromatography was performed once again with a gentle concentration gradient of sodium chloride. The obtained active fraction was purified by strong anion exchange chromatography using MonoQ HR5 / 5. Furthermore, the active fraction was purified by hydrophobic column chromatography using Phenyl-Sepharose CL-4B. Finally, gel filtration chromatography was performed using a Superdex S-200 column to obtain a final purified enzyme preparation. The obtained enzyme enzyme preparation showed a single band in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and its molecular weight was 45,000. Moreover, the molecular weight of this enzyme by the gel filtration method was 172,000. Therefore, this enzyme was found to be a homotetramer consisting of four single subunits.
[0053]
A summary of the purification is shown in Table 2. The specific activity of the purified enzyme was 1.95 U / mg protein. 1 U represents the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μmol of barbituric acid per minute.
[0054]
[Table 2]

[0055]
Example 5: Amino acid sequence of the enzyme The partial amino acid sequence of the enzyme preparation obtained in Example 4 was determined by a conventional method. The results are as follows, and the partial amino acid sequence is not similar to any known cyclic amide converting enzyme.
[0056]
(1) N-terminal amino acid sequence:
Pro-Glu-Ala-Ile-Glu-Val-Arg-Lys-Val-Pro-Leu-His-Ser-Val-Ser-Asp-Ala-Xaa-Glu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ile
(2) Internal amino acid sequence:
(Part 1)
Asp-Pro-Leu-Asp-Gln-Asp-Gly-Ile-Trp-Ala-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Glu-Arg-Pro-His-Ser- Asn-Asp-Leu-Asp-Gly-Gln-Leu-Val-Asn
(Part 2)
Leu-Ile-Asp-Asp-Gly-Val-Leu-Glu-Ala-Asp-Arg-Val-Ile-Ala-Val-Ile-Gly-Lys
(Part 3)
Thr-Asp-Glu-Pro-Arg-Leu-Thr-Val-Gly-Val-Ala-Met-Ser-Glu-Gln-Leu-Leu-Pro-Glu-Asp-Ile-Gly-Arg-Thr-Ala- Met-Ile-Thr-Lys
(Part 4)
Thr-Pro-Leu-Leu-Thr-Ile-His-Thr-Ile-Arg-Asp-Ala-Lys.
[0057]
Example 6: Identification of product Purification The isolated enzyme was allowed to act on barbituric acid, and the reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions. There was only one product, isolated by preparative.
[0058]
With respect to this product, the following was confirmed by comparison of HPLC retention times, agreement of spectrometry, and the like. That is, since the isolated substance did not show absorption at around 250 nm unlike barbituric acid, it was revealed that it did not have a cyclic structure. This substance produced urea and malonic acid by hydrolysis. It was also confirmed that this substance automatically closed under acidic conditions and returned to the original barbituric acid. From the above results, this product was identified as ureidomalonate. The result of HPLC is shown in FIG. (B) shows that a reaction product was generated from barbituric acid by this enzyme, and (A) shows that urea and malonic acid were generated by hydrolysis of the reaction product.
[0059]
[HPLC conditions]
Column: Cosmosil 5C18AR-II (manufactured by Nacalai Tesque), 4.6 x 250 mm
Solvent: 150 mM potassium phosphate buffer (pH 6.4)
Feed rate: 1 mL / min Detector: UV 210 nm.
[0060]
Example 7: Influence of temperature and pH (1) Temperature: As a result of measuring the catalytic activity by adding this isolated enzyme to 20 mM barbituric acid and 100 mM Hepes / NaOH (pH 8.0) and changing the temperature, the activity was measured. The optimum temperature was 40 ° C. Moreover, it was stable at a temperature of 4 ° C to 50 ° C.
[0061]
(2) pH: As a result of examining the stability of the enzyme by changing the pH of the buffer solution (100 mM) by a conventional method, the activity was maximum at pH 8.0, but was most stable at pH 6.0 to 7.0.
[0062]
Example 8: Reaction mechanism and substrate specificity (1) Catalytic action: The isolated enzyme was allowed to act on barbituric acid 20 mM, Hepes / NaOH 100 mM (pH 8.0) at 40 ° C., and the time course of the reaction was determined. The results are shown in FIG. The reaction reached equilibrium, and the action was found to be reversible, catalyzing both hydrolysis and dehydration ring closure.
[0063]
(2) Kinetic parameters: Kinetic parameters in the barbituric acid hydrolysis reaction were determined under the same conditions as described above. The maximum speed Vmax was 2.5 μmol / min / mg, and the Michaelis constant Km was 1.0 mM.
[0064]
(3) Substrate specificity: uracil, thymine, dihydrouracil, dihydrothymine, orotic acid, dihydroorotic acid, alloxan, parabanic acid, hydantoin, succinimide, barbital, cyclobarbital, allobarbital, allantoin instead of the above barbituric acid Alternatively, the reaction was carried out using isobarbituric acid, but none was subjected to hydrolysis, and it was found that the substrate specificity was extremely high.
[0065]
Example 9: Inhibition of reaction The isolated enzyme was added to 20 mM barbituric acid and 100 mM Hepes / NaOH (pH 8.0), and the following various compounds and metal ions were added, and the reaction was carried out at 40 ° C. As a result,
(1) SH inhibitor; N-ethylmaleimide [NEM], 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) [DTNB], p- (chloromercuri) benzoic acid [p-CMB], N-bromosuccinimide ,
(2) Serine protease inhibitor: phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], diisopropyl fluorophosphate [DipF],
(3) Metal ions: Ni ⁺⁺ , Co ⁺⁺ , Cd ⁺⁺ , Cu ⁺⁺ , Zn ⁺⁺ , Hg ⁺⁺ ,
(4) Cyclic amide: inhibited by dihydroorotic acid and alloxan.
[0066]
【The invention's effect】
A novel enzyme having a reaction mechanism not described in the literature and having high substrate specificity was provided. This enzyme that acts on barbituric acid to produce ureidomalonic acid can be widely used in reactions that require the degradation of barbituric acid.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the stabilizing effect of ethylene glycol on the novel enzyme of the present invention.
FIG. 2A is a diagram showing that a reaction product is generated from barbituric acid by the novel enzyme of the present invention, and FIG. 2B is a diagram in which urea and malonic acid are generated by hydrolysis of the reaction product. FIG.
FIG. 3 is a diagram showing that the action of the novel enzyme of the present invention catalyzes a bidirectional reaction.

Claims (5)

A novel enzyme that catalyzes the next reaction

(The action is reversible catalyzing both hydrolysis and dehydration ring closure) ,
A novel enzyme having the physicochemical and enzymatic properties shown in the following [1] to [6] and comprising a partial amino acid sequence shown in the following [7] :
[1] Substrate specificity: Acts on barbituric acid.
[2] Optimum pH and pH stability: The optimum pH is around 8.0 and is stable at pH 6.0 to 7.0 .
[3] Optimum temperature and thermal stability: The optimum temperature is 40 ° C and is stable at 4 ° C to 50 ° C.
[4] Inhibition: Activity is inhibited by SH inhibitor, serine protease inhibitor, dihydroorotic acid and alloxan.
[5] Stabilization: Stabilized with ethylene glycol.
[6] Molecular weight:
(A) The molecular weight by gel filtration method is 172,000 .
(B) The molecular weight of the subunit by SDS-polyacrylamide electrophoresis is 45,000 .
[7] Partial amino acid sequence
(1) N-terminal amino acid sequence:
Pro-Glu-Ala-Ile-Glu-Val-Arg-Lys-Val-Pro-Leu-His-Ser-Val-Ser-Asp-Ala-Xaa-Glu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ile
(2) Internal amino acid sequence:
(Part 1)
Asp-Pro-Leu-Asp-Gln-Asp-Gly-Ile-Trp-Ala-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Glu-Arg-Pro-His-Ser- Asn-Asp-Leu-Asp-Gly-Gln-Leu-Val-Asn
(Part 2)
Leu-Ile-Asp-Asp-Gly-Val-Leu-Glu-Ala-Asp-Arg-Val-Ile-Ala-Val-Ile-Gly-Lys
(Part 3)
Thr-Asp-Glu-Pro-Arg-Leu-Thr-Val-Gly-Val-Ala-Met-Ser-Glu-Gln-Leu-Leu-Pro-Glu-Asp-Ile-Gly-Arg-Thr-Ala- Met-Ile-Thr-Lys
(Part 4)
Thr-Pro-Leu-Leu-Thr-Ile-His-Thr-Ile-Arg-Asp-Ala-Lys A method for producing a novel enzyme, comprising culturing a microorganism capable of producing the novel enzyme according to claim 1 and collecting the enzyme from the culture. The method for producing a novel enzyme according to claim 2 , wherein the microorganism belongs to the genus Rhodococcus or Arthrobacter. The method for producing a novel enzyme according to claim 3 , wherein the microorganism is Rhodococcus erythropolis JCM 3191, Rhodococcus erythropolis JCM 3132, or Arthrobacter species YGK 222 (FERM BP-5907). Rhodococcus erythropolis JCM 3132, Rhodococcus erythropolis JCM 3191, or Arthrobacter sp. YGK 222 (FERM BP-5907) is cultured, and the novel enzyme according to claim 1 is cultured in the presence of ethylene glycol. A method for producing a novel enzyme, which comprises collecting the enzyme.

Images