JP4014330B2

JP4014330B2 - Viral infection protection agent

Info

Publication number: JP4014330B2
Application number: JP09275299A
Authority: JP
Inventors: 俊朗須栗; 卓巳阿部; 美則大西
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2007-11-28
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: JP2000290194A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鉄−ラクトフェリンを有効成分とするウイルス感染防御剤に関する。また、本発明は、ウイルスに対する感染防御機能を賦与した医薬品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に病原性細菌のヒトへの感染は、標的細胞、すなわち生体上皮の表層に存在する複合糖質の糖鎖構造（レセプター）を認識して結合することにより成立する。そして、この病原性細菌の生体への感染に対する一般的な治療法として、抗生物質の使用がある。この抗生物質は、増殖した病原性細菌を死滅させることにより病気を治療しようとするもので、病原性細菌の感染過程の最終段階で作用するものである。このように、抗生物質による感染症の治療は、発病後の生体に対する治療法としては非常に有効であるが、抗生物質の性格上、様々な副作用、あるいはアレルギー症状を引き起こすなど問題も多い。
【０００３】
一般に、生体はこれらの病原性細菌による感染に対し、その感染初期の段階において、防御機構を備えている。例えば、消化管においては分泌型免疫グロブリンＡを主体とする免疫グロブリンによる生体防御機構であり、これらの免疫グロブリンは病原性細菌の標的細胞への付着を阻止することにより、生体を病原性細菌による感染から守る。
【０００４】
ところで、一般にレセプターやレセプターと類似した構造を持つ物質は、病原性細菌の細胞表層のレセプター結合部位に特異的に結合し、病原性細菌の標的細胞への結合を特異的に阻害することが期待されている。この特異的な作用は、病原性細菌の感染を初期の段階で阻止するという意味で前述の免疫グロブリンによる生体防御機構に類似している。すなわち、このような病原性細菌の受容体結合部位と特異的に結合する物質は、病原性細菌による感染を未然に防ぎ、しかも作用が穏やかで、副作用が少ない病原性細菌感染防御剤となり得る。
【０００５】
一方、ウイルス感染症に関しては、現在までに抗ウイルス剤に関する多くの研究がなされている。しかし、ウイルスは、宿主細胞の増殖機能に依存して増殖するという性質を有するため、薬剤による治療は困難である。例えば、ウイルスの細胞への侵入を阻害するアマンタジンがインフルエンザＡに効果があるといわれているが、治療効果が弱い上に、中枢神経毒性などの副作用もあり、臨床薬としては殆ど利用されていない。現在、我が国で使用が認可されている抗ウイルス剤としては、ウイルス遺伝子の合成を阻害するアシクロビル（単純ヘルペス、単純ヘルペス脳炎などに適用）、ビダラビン（単純ヘルペス、単純ヘルペス脳炎などに適用）、点眼剤用のイドクスウリジン（ヘルペス角膜炎に適用）、そして、抗ＨＩＶ剤としてアジドチミジン（ＡＩＤＳに適用）などがある。アジドチミジンについては、全身投与でしばしば重篤な副作用が出現し、治療薬としてはまだまだ問題を抱えている。
【０００６】
さらに、抗ウイルス剤として最近注目を集めているものに、インターフェロンがある。インターフェロンはウイルスの細胞内増殖を抑制する因子で、最近では遺伝子組み換え技術により生産発売されているが、高価であり、副作用も問題となっている。
【０００７】
これらの現状から、ウイルス性疾患への対策として、ウイルス感染を予防するワクチン投与が最も普及している。このワクチンには、ウイルスを何らかの方法で弱毒化した生ワクチンやウイルスをホルマリン処理などして作成した不活性化ワクチン、ウイルスの抗原部分のみを精製したコンポーネントワクチンがある。これらのワクチンにより、大部分のウイルス性疾患については予防が可能となっている。
【０００８】
しかし、最も代表的なウイルス性疾患の一つであるインフルエンザを例にとった場合、ワクチンによる感染の予防は困難である。インフルエンザウイルスはウイルスのエンベロープに抗原が存在し、この抗原をワクチンとして使用しているが、この抗原部分ではしばしば変異を繰り返し、変異型のウイルスに対しては、旧型のワクチンは何ら効果を示さないからである。また、ＨＩＶのようにワクチンとして利用可能な抗原が不明なものや、臓器移植後の免疫抑制剤投与による免疫機能低下時にしばしば発症するサイトメガロウイルス感染症などに対しては、ワクチンによりウイルス感染を防御することは困難である。さらに、ワクチンによっては、そのウイルス性疾患に罹患する危険性があり、ワクチンの接種による副作用も考慮すべき問題である。
【０００９】
近年、ウイルス学研究の進展により、ウイルスのヒトへの感染についても前述の病原性細菌による感染の場合と同様に、標的細胞、すなわち生体上皮の表層に存在する複合糖質の糖鎖構造などのウイルスレセプターにウイルスが結合して、細胞内へウイルスが侵入することが明らかになっている。例えば、ＨＩＶはＴリンパ球の表面に存在するＣＤ４レセプターに結合する。このため、ＣＤ４を大量に血中に投与することにより、ＡＩＤＳ発症を防止することが可能になるといわれている。また、インフルエンザウイルスは、やはり細胞表面のシアル酸結合複合糖質分子をレセプターとして結合し、ウイルス感染が成立するが、このレセプター分子、もしくはレセプター分子構造を有する様な糖鎖構造を持つものは、インフルエンザウイルスの細胞への結合を阻害し、ウイルス感染を防止し、さらには、感染後の他の細胞や組織への伝播を防御し得るものと考えられている。
【００１０】
従来、病原性細菌やウイルスのレセプターへの結合を阻害して感染防御する効果を有する物質として、κカゼインやそのプロテアーゼ分解物であるκカゼイングリコマクロペプチド（ＧＭＰ）が知られている（特開昭 63-284133号公報）。また、同様のメカニズムでＧＭＰが抗歯垢及び抗齲歯剤として有効であることが知られている（特開昭 63-233911号公報）。さらに、山川らは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集を阻害する物質をヒト血球より単離し、この物質がシアル酸を構成糖に持つ糖タンパク質であることを明らかにした（山川他, 「生化学」, vol.31, pp.416-421, 1959) 。
【００１１】
ところで、乳中には感染防御機能を有するタンパク質としてラクトフェリンが存在している。ラクトフェリンの病原性細菌に対する作用は、その鉄キレート力により病原性細菌の増殖に必要な鉄を奪い取り、その結果、病原性細菌の増殖が抑制されるというものである。しかしながら、ラクトフェリンによる病原性細菌の増殖抑制効果は一時的なものであり、また、他の食品と同時にラクトフェリンを摂取する場合、食品中の全ての鉄分をキレートするために多量のラクトフェリンを摂取する必要があるという問題がある。
【００１２】
なお、ラクトフェリンには、その鉄キレート力に由来する機能とは全く別のメカニズム、すなわちラクトフェリンの分子中の糖鎖が病原性細菌の腸管細胞への付着を阻止する機能が示唆されている。ラクトフェリンのウイルスに対する作用においては、病原性細菌に対する作用と同様、ラクトフェリン分子中の糖鎖がウイルスの細胞への付着を阻止する機能が示唆されており、抗ウイルス剤として有効であることが開示されている（特開平2-233619号公報）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来より、ラクトフェリンの持つ薬理作用について鋭意研究を行ってきたところ、ウイルスの細胞への付着を阻止する機能に関しては、市販されているような通常のラクトフェリンと比較して、鉄−ラクトフェリンに強い活性があることを見出した。そして、特に、ラクトフェリン1g当たり15mg以上の炭酸および／または重炭酸と10〜700mg の鉄とが結合した鉄−ラクトフェリンが、ウイルスの細胞への付着を強く阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
したがって、本発明は、鉄−ラクトフェリンを有効成分とするウイルス感染防御剤を提供することを課題とする。また、本発明は、鉄−ラクトフェリンを配合して、ウイルスに対する感染防御機能を賦与した医薬品および飲食品を提供することを課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
ラクトフェリンは、通常、１分子当たり鉄を２原子キレート結合する能力を有している。本発明で使用する鉄−ラクトフェリンは、ラクトフェリンに特定の処理を行うことにより、ラクトフェリン１分子当たり少なくとも３原子の鉄を安定に保持できるようにしたものである。このような鉄−ラクトフェリンは従来より知られている。例えば、ラクトフェリン溶液に鉄塩を添加し、アルカリを加えて溶液のpHを高めることにより得られる、鉄を安定に保持したラクトフェリン粉末（特開平7- 17825号公報）、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄複合体（特開平6-239900号公報）、あるいは炭酸、重炭酸およびラクトフェリンを含む溶液に鉄を含有する溶液を混合して得られる炭酸または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体（特開平7-304798号公報）などが知られている。
【００１６】
本発明で使用することができる鉄−ラクトフェリンは、これらいずれの鉄−ラクトフェリンであってもよい。鉄−ラクトフェリンは、鉄とラクトフェリンとが結合した状態のものであって、鉄とラクトフェリンとが結合しているか、あるいは他の物質を介して鉄とラクトフェリンとが結合しているものであって、いわゆる、鉄がイオン状態で存在していないものであればよい。特に、ラクトフェリン類に炭酸および／または重炭酸と鉄とが結合した状態の鉄−ラクトフェリン結合体や鉄−ラクトフェリン複合体を例示することができ、これらの鉄−ラクトフェリンを使用することが望ましい。これらの鉄−ラクトフェリンは、耐熱性を有しているので、医薬品や飲食品に添加し、加工する際に加熱処理しても、感染防御機能の低下が起こり難いという特徴を有している。また、これらの鉄−ラクトフェリンは、鉄の収斂味や金属味などが全くしないという特徴を有しているので、風味上の問題も全くない。
【００１７】
本発明では、ウイルスに対する感染防御剤の有効成分として、あるいはウイルスに対する感染防御機能を医薬品や飲食品に賦与するために、鉄−ラクトフェリンを使用する。
【００１８】
なお、上述したような鉄−ラクトフェリンを製造する際に使用することができるラクトフェリンとしては、哺乳類の乳などの分泌液から分離して得られるラクトフェリンを例示することができる。また、ラクトフェリンは、完全に単離されている必要はなく、他の成分が含まれているものであっても構わない。さらに、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物から生産されたラクトフェリンも、その安全性が保証されているものであれば、使用することが可能である。そして、ラクトフェリンをタンパク質分解酵素で分解したものを使用することもできる。
【００１９】
また、上述したような鉄−ラクトフェリンを製造する際に使用することができる鉄としては、硫酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、乳酸鉄、クエン酸鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄などを例示することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のウイルス感染防御剤は、乳から簡単な処理により得られる、あるいは既に比較的安価に市販されているラクトフェリンに、特定の処理を行うことにより得られる鉄−ラクトフェリンを有効成分として使用する。
【００２１】
ウイルス感染防御剤の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散在、粉剤などにすればよく、経口的に投与することが望ましい。また、これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができる。例えば、製剤の製造上許可される担体や賦形剤などと混合して成型する。
【００２２】
また、本発明のウイルス感染防御機能を賦与した医薬品および飲食品については、鉄−ラクトフェリンを前記したような剤型とし、医薬品、特に経口剤に配合したり、あるいは鉄−ラクトフェリンを牛乳、乳飲料、コーヒー牛乳、ジュース、ゼリー、ビスケット、飴、パン、麺、ソーセージなどの飲食品、さらには各種粉乳の他、乳児、幼児および低出生体重児などを対象とする栄養組成物に配合したりする。
【００２３】
これらの医薬品および飲食品は、ウイルスに対する感染防御機能を有しているので、ウイルスに感染する疾病を予防し、あるいは疾病を治療する用途に用いることができる。このような疾病としては、大腸菌などの食中毒原因細菌類による下痢、食中毒、ストレプトコッカス・ミュータンスなどによる齲蝕病、ヘリコバクター・ピロリ菌による胃潰瘍や胃がん、インフルエンザウイルスによるインフルエンザ、サイトメガロウイルスによる妊婦などへの感染症が知られている。
【００２４】
本発明において、ウイルスに対する感染防御機能を発揮させるためには、成人の場合、鉄−ラクトフェリンを一日当たり 0.1〜5,000mg 摂取できるよう配合量などを調整すればよい。
【００２５】
次に実施例及び試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
水 10 l に市販のラクトフェリン (ＤＭＶ社製) 90g と塩化第二鉄 52gを溶解し、撹拌機で撹拌しながら重炭酸ナトリウム5gを添加して鉄−ラクトフェリンを含む溶液を調製した。この溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮した後、水を加えて容量 10 l の溶液とした。なお、この鉄−ラクトフェリンを含む溶液について、誘導結合プラズマ発光分光分析器 (ＩＣＰ) で測定したところ、溶液中に含まれる鉄量は 102mg/100mlであった。次に、この溶液を凍結乾燥して鉄−ラクトフェリン粉末100gを得た。なお、この鉄−ラクトフェリン粉末は、鉄を多く含んでいるにも関わらず、無味、無臭であった。
【００２６】
【実施例２】
水 2 lに重炭酸ナトリウム400gを添加し、撹拌機で撹拌して調製した重炭酸ナトリウム過飽和溶液中に、水 8 lに市販ラクトフェリン (ＤＭＶ社製) 90g と塩化第二鉄 52gを溶解した溶液を撹拌しながら添加し、鉄−ラクトフェリン複合体を含む溶液を調製した。この溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮した後、水を加えて容量 10 l の溶液とした。なお、この鉄−ラクトフェリン複合体を含む溶液について、ＩＰＣで測定したところ、溶液中に含まれる鉄量は 101mg/100mlであった。次に、この溶液は凍結乾燥して鉄−ラクトフェリン複合体粉末100gを得た。なお、この鉄−ラクトフェリン複合体粉末は、鉄を多く含んでいるにも関わらず、無味、無臭であった。
【００２７】
【参考例１】
病原性大腸菌のヒト小腸細胞（JTC-17）への付着に対する阻止効果実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料とし、病原性大腸菌に対する感染防御機能を調べた。この試験は３連で次のように行った。すなわち、東京医科大学より分譲を受けたヒト小腸細胞（JTC-17）を、５％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）で、 25cm²底面積培養フラスコに、37℃、二酸化炭素濃度５％で培養した。細胞がほぼコンフルエントの状態に増殖したら、常法によりトリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥がし取り、遠心操作により細胞を集めた。そして、上清を吸い出し、新たに５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ 8mlに細胞を懸濁した。この細胞懸濁液各１mlを10ml容ポリスチレンチューブ（2095、ファルコン社製）に入れ、37℃で３日間培養した。
【００２８】
都立衛生研究所より分譲を受けた病原性大腸菌H10407株および Pb176株をそれぞれ１白金耳取り、普通ブイヨン培地４mlに、37℃で一夜培養した後、3,000rpm、10分間遠心分離することにより集菌し、これをpH８に調整したＰＢＳで３回洗浄した。その後、大腸菌をpH８に調整したＰＢＳ 1mlに懸濁し、ＦＩＴＣ 1mgを加えて十分溶解し、４℃で３時間ゆっくり撹拌しながら反応させ、大腸菌をＦＩＴＣラベルした。ラベルした大腸菌は、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ 3mlに懸濁した。このようにして調製し、ＦＩＴＣでラベルした大腸菌懸濁液 400μl に、目的の試料(0.1％）ＰＢＳ溶液 200μl を混合し、37℃で１時間インキュベートした。
【００２９】
一方、３日間の培養を終えたヒト小腸細胞（JTC-17）を1,000rpmで５分間遠心分離して上清の培地を除き、さらにＰＢＳで３回洗浄し、これに上述の大腸菌と試料とを混合してインキュベートした溶液 600μl を加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート終了後、750rpmで５分間遠心分離し、細胞だけを沈澱させ、細胞に付着せずに上清に残った大腸菌を吸い出した。さらに、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳで洗浄した細胞に200Uトリプシン／ＰＢＳ 900μl を加え、激しく撹拌した。これに 0.1％ＳＤＳ 100μl 、脱イオン水１mlを加えて激しく撹拌し、30分間静置することにより細胞を溶解した。
【００３０】
そして、蛍光分光光度計（日立フルオレッセンススペクトロメーターF-3000）を用い、励起波長 520nmおよび蛍光波長 520nmでこの溶液の相対蛍光強度を測定し、蛍光ラベルした大腸菌のヒト小腸細胞（JTC-17）への付着を評価した。その結果を表１に示す。なお、試料を添加していない時の相対蛍光強度（ブランク）を付着率 100％、蛍光ラベルした大腸菌のポリスチレンチューブへの非特異的な吸着（ポリエチレンチューブ内に検体と同じ条件で測定した相対蛍光強度）を付着率０％とし、各試料を添加した時の付着率を求めた。
【００３１】
【表１】

【００３２】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、病原性大腸菌のヒト小腸細胞（JTC-17）への付着を強く阻止することが判る。
【００３３】
【参考例２】
齲歯原因菌のポリスチレンチューブへの付着に対する阻止効果実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料として、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する感染防御機能を調べた。この試験は２連で次のように行った。すなわち、３種のストレプトコッカス・ミュータンス (ATCC-27670, ATCC-25175, ATCC-27351) を１白金耳取り、ブレインハートフージョン（ＢＨＩ）培地４mlで一夜培養した後、3,000rpm、10分間遠心分離することにより集菌し、上清の培地を吸い出した。さらに、これをＰＢＳで３回洗浄し、この菌体をOD 650＝ 0.8となるようＰＢＳに懸濁した。そして、菌体懸濁液と試料溶液(0.1％) を当量混合し、10ml容量のポリスチレンチューブ（2095、ファルコン社製）に入れ、よく撹拌し、37℃で３時間インキュベートした。インキュベート終了後、OD 650を測定し、次式から付着率を求めた。その結果を表２に示す。
付着率（％）＝〔｛ 0.4− (試料のOD 650の値) ｝／ 0.4〕× 100
【００３４】
【表２】

【００３５】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、齲歯原因菌のポリスチレンチューブへの付着を強く阻止することが判る。
【００３６】
【試験例１】
インフルエンザウイルスに対する凝集反応阻止（ＨＩ）
活性実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料として、インフルエンザウイルスに対する感染防御機能を調べた。この試験は次のように行った。すなわち、インフルエンザウイルスのヒヨコ安定化赤血球（武田薬品工業社製）およびヒト赤血球Ｏ型に対するＨＩ活性を測定した。ＨＩ活性は、前述した山川らの方法 (生化学, vol.31, pp.416-421) に準じて測定した。インフルエンザウイルスは、デンカ生研より入手した不活化インフルエンザウイルスのA/山形/120/86(H1N1) 、A/新潟/102/81/(H3N2)、A/四川、A/福岡/C29/85(H2N2) 、B/長崎/1/87 、B/シンガポール/222/79 及び静岡薬科大学より入手した不活化されていないインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1) を用いた。ヒヨコ安定化赤血球に対するＨＩ活性の測定結果を表３に、ヒト赤血球Ｏ型に対するＨＩ活性の測定結果を表４にそれぞれ示す。
【００３７】
【表３】

【００３８】
【表４】

【００３９】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、強いＨＩ活性を示すことが判る。
【００４０】
【試験例２】
インフルエンザウイルスに対する感染防御機能
実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料として、静岡薬科大学より入手した不活化されていないインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1) およびA/愛知/2/68(H3N2) を段階的に希釈し、５個のニワトリ10日卵に 0.1mlずつ尿液喰内腔内に接種し、３日後、個々の卵の尿液50μl を採り、これを 0.5％ヒヨコ安定化赤血球と混合、撹拌し、赤血球凝集反応により感染率を決定した。 100％の感染率を示した希釈倍率のウイルス希釈液 0.1mlに市販のラクトフェリンまたは鉄−ラクトフェリンをそれぞれ 0.5mg溶解し、室温で30分間インキュベートした後、ニワトリ10日卵に 0.1mlずつ尿液喰内腔内に接種した。３日後、個々の卵の尿液50μl を採り、赤血球凝集反応により感染率を決定した。１群５個の卵を使用し、各群の感染率を得た。その結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】

【００４２】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、インフルエンザウイルスに対する強い感染防御機能を示すことが判る。
【００４３】
【試験例３】
サイトメガロウイルスに対する感染防御機能
実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する感染防御機能を調べた。この試験は次のように行った。すなわち、ラクトフェリンまたは鉄−ラクトフェリンを２％血清添加ＭＥＭ培地に5mg/mlとなるように溶解し、0.45μm のフィルターで濾過滅菌し、ストック溶液を必要に応じて２％血清添加ＭＥＭ培地により希釈して用いた。
【００４４】
ヒトＣＭＶ(Towne株) をラクトフェリンまたは鉄−ラクトフェリン含有培養液(0.1mg/ml)で１時間インキュベート後、ヒト胎児繊維芽細胞（ＨＥＬ細胞）に感染させた。さらに、ラクトフェリンを含まない培養液をコントロールとした。24時間培養後、ヒトＣＭＶ陽性血清で蛍光染色し、細胞へのヒトＣＭＶの吸着能力を測定した。その結果を表６に示す。
【００４５】
【表６】

【００４６】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、ヒトＣＭＶに対する強い感染防御機能をを示すことが判る。
【００４７】
【参考例３】
ヘリコバクター・ピロリ菌に対する感染防御機能
実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンおよび市販のラクトフェリンを試料として、ヘリコバクター・ピロリ菌に対する感染防御機能を調べた。この試験は次のように行った。すなわち、Ｍ−ＢＨＭピロリ‐寒天培地（日研生物医学研究所製）で生育したヘリコバクター・ピロリ菌 (NCTC11637)をブルセラ液体培地 (Brucella Broth、Difco Lab.) に播種し、ガスパックシステム(BBLCampy Pak, Beckton Dickinson co.)により、微好気条件で一夜振盪培養した。
【００４８】
胃ガン細胞(Kato III)は、５％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）：ハムＦ−１０（１：１）混合培地で、37℃、二酸化炭素濃度５％で培養した。細胞が増殖したら培養液１mlを遠心分離して胃ガン細胞を集めた。上清を吸い出し、新たにＰＢＳ 1mlに細胞を懸濁した(106 cell/ml) 。この胃ガン細胞懸濁液各１mlに、上述のヘリコバクター・ピロリ菌と試料とを混合してインキュベートした溶液１mlを加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、ショ糖溶液（15％）14mlを加え、撹拌後、遠心分離した。上清を吸引除去後、抗ヘリコバクター・ピロリウサギ抗体 100μl を加え、４℃で20分間インキュベートした。その後、ＰＢＳ 15ml で洗浄を２回繰り返し、それにＦＩＴＣラベルした抗ウサギＩｇＧヤギ抗血清を加え、４℃で20分インキュベートした後、ＰＢＳ 15ml で洗浄を２回繰り返した。ＰＢＳで洗浄した細胞に200Uトリプシン／ＰＢＳ 900μl を加え、激しく撹拌した。これに 0.1％ＳＤＳ 100μl 、１mlの脱イオン水を加えて激しく撹拌し、30分間静置することにより細胞を溶解した。
【００４９】
そして、蛍光分光光度計（日立フルオレッセンススペクトロメーターF-3000）を用い、励起波長 520nmおよび蛍光波長 520nmでこの溶液の相対蛍光強度を測定し、 Kato III 細胞への付着を評価した。その結果を表７に示す。なお、試料を添加していない時の相対蛍光強度（ブランク）を付着率 100％、ピロリ菌および試料を加えずに Kato III 細胞のみで一連の抗体反応を行った細胞の相対蛍光強度を付着率０％とし、各試料を添加した時の付着率を求めた。
【００５０】
【表７】

【００５１】
これによると、市販のラクトフェリンに比べて、実施例１の鉄−ラクトフェリンが、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃ガン細胞(Kato III)への付着を強く阻止することが判る。
【００５２】
【実施例３】
表８に示した配合で原料を混合した後、打錠機で打錠して、ウイルス感染防御機能を賦与したタブレットを製造した。
【００５３】
【表８】

【００５４】
【実施例４】
表９に示した配合で原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、ウイルス感染防御機能を賦与した飲料を製造した。
【００５５】
【表９】

【００５６】
【発明の効果】
本発明のウイルス感染防御剤、あるいはウイルス感染防御機能を賦与した医薬品および飲食品は、ウイルスに対して、優れた感染防御機能を示す。しかも、本発明で使用する鉄−ラクトフェリンは、比較的安価に大量調製が可能であり、かつ極めて安全性が高いという特徴を有している。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is an iron - related active ingredients and to roux virus infection protective agent lactoferrin. The present invention also relates to pharmaceutical products which confer infection defense against viruses.
[0002]
[Prior art]
Generally, human infection with pathogenic bacteria is established by recognizing and binding to a sugar chain structure (receptor) of a complex carbohydrate existing on the surface of a target cell, that is, a living epithelium. As a general treatment method for infection of the pathogenic bacteria into the living body, there is use of antibiotics. This antibiotic is intended to treat the disease by killing the grown pathogenic bacteria and acts at the end of the infection process of the pathogenic bacteria. Thus, the treatment of infectious diseases with antibiotics is very effective as a treatment method for living bodies after the onset of the disease, but there are many problems such as various side effects or allergic symptoms due to the nature of antibiotics.
[0003]
In general, a living body has a defense mechanism against infection by these pathogenic bacteria at an early stage of infection. For example, in the gastrointestinal tract, it is a biological defense mechanism by immunoglobulins mainly composed of secretory immunoglobulin A, and these immunoglobulins prevent the pathogenic bacteria from attaching to target cells, thereby causing the organisms to pass through the pathogenic bacteria. Protect from infection.
[0004]
By the way, in general, a receptor or a substance having a structure similar to that of a receptor is expected to specifically bind to a receptor binding site on the cell surface layer of pathogenic bacteria and specifically inhibit the binding of pathogenic bacteria to target cells. Has been. This specific action is similar to the aforementioned host defense mechanism by immunoglobulins in the sense that it blocks infection of pathogenic bacteria at an early stage. That is, such a substance that specifically binds to a receptor binding site of a pathogenic bacterium can prevent infection by the pathogenic bacterium, has a mild action, and can be a protective agent against pathogenic bacterium infection with few side effects.
[0005]
On the other hand, with regard to viral infections, many studies on antiviral agents have been conducted so far. However, since viruses have the property of growing depending on the growth function of host cells, treatment with drugs is difficult. For example, amantadine, which inhibits virus entry into cells, is said to be effective against influenza A, but has little therapeutic effect and side effects such as central neurotoxicity, and is hardly used as a clinical drug. . Currently approved antiviral agents in Japan include acyclovir (applicable to herpes simplex and herpes simplex encephalitis), vidarabine (applicable to herpes simplex and herpes simplex encephalitis), eye drops, etc. There are idoxuridine for drugs (applied to herpes keratitis) and azidothymidine (applied to AIDS) as an anti-HIV agent. As for azidothymidine, serious side effects often appear after systemic administration, and there are still problems as therapeutic agents.
[0006]
Further, interferon is recently attracting attention as an antiviral agent. Interferon is a factor that suppresses the intracellular growth of viruses. Recently, it has been produced and released by genetic recombination technology, but it is expensive and has a problem with side effects.
[0007]
From these current situations, vaccine administration for preventing viral infection is most popular as a countermeasure against viral diseases. This vaccine includes a live vaccine in which the virus is attenuated by some method, an inactivated vaccine prepared by treating the virus with formalin, and a component vaccine in which only the antigen portion of the virus is purified. These vaccines can prevent most viral diseases.
[0008]
However, in the case of influenza, which is one of the most typical viral diseases, it is difficult to prevent infection with a vaccine. Influenza virus has an antigen in the envelope of the virus, and this antigen is used as a vaccine. However, this antigen part often repeats mutation, and the old vaccine has no effect on the mutant virus. Because. In addition, for HIV and other unknown antigens that can be used as vaccines, and for cytomegalovirus infections that often develop when immune functions are reduced by the administration of immunosuppressants after organ transplantation, viral infections are caused by vaccines. It is difficult to defend. Furthermore, depending on the vaccine, there is a risk of suffering from the viral disease, and side effects due to vaccination are issues to be considered.
[0009]
In recent years, due to the progress of virological research, the infection of humans with viruses is similar to the case of infection with pathogenic bacteria described above, including the sugar chain structure of complex carbohydrates present on the surface layer of target cells, ie, the living epithelium. It has been shown that the virus binds to the viral receptor and enters the cell. For example, HIV binds to the CD4 receptor present on the surface of T lymphocytes. For this reason, it is said that the onset of AIDS can be prevented by administering a large amount of CD4 into the blood. In addition, influenza virus also binds sialic acid-binding glycoconjugate molecules on the cell surface as receptors, and viral infection is established, but this receptor molecule, or those having a sugar chain structure that has a receptor molecule structure, It is thought that it can inhibit the binding of influenza virus to cells, prevent viral infection, and further prevent transmission to other cells and tissues after infection.
[0010]
Conventionally, κ casein and κ casein glycomacropeptide (GMP), which is a protease degradation product thereof, are known as substances having the effect of inhibiting the binding of pathogenic bacteria and viruses to receptors and protecting against infection (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-259151). Sho 63-284133). In addition, it is known that GMP is effective as an anti-plaque and anti-dental agent by the same mechanism (Japanese Patent Laid-Open No. 63-233911). In addition, Yamakawa et al. Isolated a substance that inhibits hemagglutination by influenza virus from human blood cells and revealed that this substance is a glycoprotein having sialic acid as a constituent sugar (Yamakawa et al., “Biochemistry”, vol.31, pp.416-421, 1959).
[0011]
By the way, lactoferrin is present in milk as a protein having an infection protection function. The action of lactoferrin on pathogenic bacteria is to take away iron necessary for the growth of pathogenic bacteria by its iron chelating power, and as a result, the growth of pathogenic bacteria is suppressed. However, the effect of suppressing the growth of pathogenic bacteria by lactoferrin is temporary, and when lactoferrin is consumed at the same time as other foods, it is necessary to ingest a large amount of lactoferrin to chelate all the iron in the food. There is a problem that there is.
[0012]
In addition, lactoferrin is suggested to have a completely different mechanism from the function derived from its iron chelating power, that is, a function in which a sugar chain in the molecule of lactoferrin prevents adhesion of pathogenic bacteria to intestinal cells. In the action of lactoferrin on the virus, as well as the action on pathogenic bacteria, the sugar chain in the lactoferrin molecule has been suggested to have a function of blocking the attachment of the virus to cells, and it is disclosed that it is effective as an antiviral agent. (Japanese Patent Laid-Open No. 2-333619).
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have conventionally Toko filtrate has conducted extensive research on the pharmacological action possessed by lactoferrin, for the ability to inhibit the adhesion to cells of the virus, as compared with conventional lactoferrin, such as commercially available Thus, it was found that iron-lactoferrin has a strong activity. Then, in particular, and iron carbonate or 15mg per lactoferrin 1g and / or bicarbonate and 10~700mg iron bound - found that lactoferrin inhibits strongly adhering to virus cells, completed the present invention It came to do.
[0014]
Accordingly, the present invention is the iron - and to provide the active ingredient and to roux virus infection protective agent lactoferrin. Further, the present invention is an iron - lactoferrin by blending, it is an object to provide a pharmaceutical and food products were endowed infection defense against viruses.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
Lactoferrin usually has the ability to chelate two atoms of iron per molecule. The iron-lactoferrin used in the present invention can stably retain at least 3 atoms of iron per molecule of lactoferrin by performing a specific treatment on lactoferrin. Such iron-lactoferrin is conventionally known. For example, lactoferrin powder that stably retains iron obtained by adding an iron salt to a lactoferrin solution and increasing the pH of the solution by adding an alkali (JP-A-7-17825), bicarbonate to the amino group of lactoferrin Heat-resistant lactoferrin-iron complex (Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 6-239900) in which iron is bound via ions, or carbonic acid or heavy carbonate obtained by mixing a solution containing iron, carbonic acid, bicarbonate and lactoferrin A carbonate-iron-lactoferrin complex (Japanese Patent Laid-Open No. 7-304798) is known.
[0016]
The iron-lactoferrin that can be used in the present invention may be any of these iron-lactoferrins. Iron-lactoferrin is in a state where iron and lactoferrin are bound, and iron and lactoferrin are bound, or iron and lactoferrin are bound via another substance, Any iron that does not exist in an ionic state may be used. In particular, an iron-lactoferrin conjugate or an iron-lactoferrin complex in which carbonic acid and / or bicarbonate and iron are bound to lactoferrin can be exemplified, and it is desirable to use these iron-lactoferrin. Since these iron-lactoferrins have heat resistance, they have the feature that even if they are added to pharmaceuticals and foods and drinks and processed by heat treatment, the infection-protecting function is hardly lowered. Moreover, since these iron-lactoferrins have a feature that there is no astringent taste or metallic taste of iron, there is no problem in flavor.
[0017]
In the present invention, as an active ingredient of infection protective agents against viruses, there have in order to impart infection defense against viruses in pharmaceuticals and food products, iron - using lactoferrin.
[0018]
Incidentally, the iron as described above - is a lactoferrin that can be used in the production of lactoferrin, Ru can be exemplified lactoferrin obtained by separating from secretions such as mammal's milk. Also, lactoferrin is not completely necessary that isolated, but may be one that contains other components. Further, by genetic manipulation, microbial, animal cells, and lactoferrin produced from the transgenic animal, as long as its safety is guaranteed, it is possible to use. Then, it is also possible to use those obtained by decomposing the lactoferrin with proteolytic enzymes.
[0019]
Moreover, as iron which can be used when manufacturing iron-lactoferrin as described above, ferrous sulfate, ferrous gluconate, iron lactate, iron citrate, ferrous sodium citrate, citric acid Examples include iron ammonium, ferrous pyrophosphate, ferric pyrophosphate, ferric chloride, ferric sulfate, ferric nitrate, and ferric sulfate.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Virus infection protective agent of the present invention is obtained by a simple process from milk, or lactoferrin is already relatively low cost commercial is iron obtained by performing specific processing - to use lactoferrin as an active ingredient .
[0021]
Virus infection protective agent dosage forms are tablets, capsules, granules, powders, may be such as dusts, it is desirable to administer orally. Moreover, these dosage forms can be manufactured by a conventionally known ordinary method. For example, it is molded by mixing with a carrier or excipient that is permitted in the production of the preparation.
[0022]
As for the pharmaceutical and food and beverage were conferring virus infection defense mechanisms of the present invention, the iron - lactoferrin and the dosage forms as described above, and pharmaceutical, or particular compounding oral dosage, or iron - lactoferrin milk, milk Beverages, coffee milk, juice, jelly, biscuits, rice cakes, bread, noodles, sausages and other foods and beverages, as well as various types of powdered milk, as well as nutritional compositions for infants, infants, low birth weight infants, etc. To do.
[0023]
These pharmaceutical and food products, than have an infection defense against viruses, may be used in applications to prevent disease that infect virus, or of treating a disease. Such diseases include diarrhea caused by bacteria causing food poisoning such as Escherichia coli, food poisoning, caries caused by Streptococcus mutans, gastric ulcer and stomach cancer caused by Helicobacter pylori, influenza caused by influenza virus, pregnant women caused by cytomegalovirus, etc. Infectious diseases are known.
[0024]
Te present invention odor, in order to exert infection defense against viruses, in the case of adults, the iron - may be adjusted such amounts so that lactoferrin can daily 0.1~5,000mg ingested.
[0025]
Next, examples and test examples will be shown to explain the present invention in more detail.
[Example 1]
90 g of commercially available lactoferrin (manufactured by DMV) and 52 g of ferric chloride were dissolved in 10 l of water, and 5 g of sodium bicarbonate was added while stirring with a stirrer to prepare a solution containing iron-lactoferrin. This solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 5,000 cut, and then water was added to make a 10 l solution. The solution containing iron-lactoferrin was measured with an inductively coupled plasma emission spectrometer (ICP), and the amount of iron contained in the solution was 102 mg / 100 ml. Next, this solution was freeze-dried to obtain 100 g of iron-lactoferrin powder. The iron-lactoferrin powder was tasteless and odorless despite containing a lot of iron.
[0026]
[Example 2]
A solution in which 90 g of commercial lactoferrin (manufactured by DMV) and 52 g of ferric chloride are dissolved in 8 l of water in a supersaturated sodium bicarbonate solution prepared by adding 400 g of sodium bicarbonate to 2 l of water and stirring with a stirrer. Was added with stirring to prepare a solution containing an iron-lactoferrin complex. This solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 5,000 cut, and then water was added to make a 10 l solution. When the solution containing this iron-lactoferrin complex was measured by IPC, the amount of iron contained in the solution was 101 mg / 100 ml. Next, this solution was freeze-dried to obtain 100 g of iron-lactoferrin complex powder. The iron-lactoferrin complex powder was tasteless and odorless despite containing a lot of iron.
[0027]
[ Reference Example 1]
Inhibitory effect of pathogenic E. coli on adhesion to human small intestinal cells (JTC-17) Using iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples, the infection-protecting function against pathogenic E. coli was examined. This test was performed in triplicate as follows. That is, human small intestinal cells (JTC-17) obtained from Tokyo Medical University were placed in a 25 cm ² bottom area culture flask in Dulbecco's modified Eagle medium (5% FCS / DMEM) containing 5% fetal calf serum. The cells were cultured at 5 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%. When the cells grew to a nearly confluent state, the cells were detached with trypsin-EDTA by a conventional method, and the cells were collected by centrifugation. Then, the supernatant was sucked out and the cells were newly suspended in 8 ml of 5% FCS / DMEM. 1 ml of each cell suspension was placed in a 10 ml polystyrene tube (2095, manufactured by Falcon) and cultured at 37 ° C. for 3 days.
[0028]
Collect pathogen E. coli H10407 and Pb176 strains received from the Metropolitan Institute of Public Health by collecting 1 platinum ear each, culturing it in 4 ml of normal bouillon medium at 37 ° C overnight, and then centrifuging at 3,000 rpm for 10 minutes. This was washed three times with PBS adjusted to pH 8. Thereafter, E. coli was suspended in 1 ml of PBS adjusted to pH 8, 1 mg of FITC was added and sufficiently dissolved, and the mixture was allowed to react at 4 ° C. with slow stirring for 3 hours to label E. coli. The labeled E. coli was washed 3 times with PBS and then suspended in 3 ml of PBS. 200 μl of the target sample (0.1%) PBS solution was mixed with 400 μl of the E. coli suspension prepared in this manner and labeled with FITC, and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
[0029]
On the other hand, human small intestinal cells (JTC-17) that had been cultured for 3 days were centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant medium, and further washed 3 times with PBS. 600 μl of the incubated solution was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the incubation, the mixture was centrifuged at 750 rpm for 5 minutes to precipitate only the cells, and the E. coli remaining in the supernatant without being attached to the cells was sucked out. Furthermore, the cells were washed twice with PBS, 200 U trypsin / 900 μl of PBS was added to the cells washed with PBS, and vigorously stirred. The cells were lysed by adding 100 μl of 0.1% SDS and 1 ml of deionized water, stirring vigorously, and allowing to stand for 30 minutes.
[0030]
Then, using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi Fluorescence Spectrometer F-3000), the relative fluorescence intensity of this solution was measured at an excitation wavelength of 520 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm, and fluorescently labeled E. coli human small intestinal cells (JTC-17) Adhesion to was evaluated. The results are shown in Table 1. In addition, relative fluorescence intensity (blank) when no sample is added is 100% adherence, non-specific adsorption of fluorescently labeled Escherichia coli to polystyrene tubes (relative fluorescence measured under the same conditions as the specimen in a polyethylene tube) (Strength) was defined as an adhesion rate of 0%, and the adhesion rate when each sample was added was determined.
[0031]
[Table 1]

[0032]
According to this, it can be seen that the iron-lactoferrin of Example 1 strongly inhibits the attachment of pathogenic E. coli to human small intestinal cells (JTC-17) as compared to commercially available lactoferrin.
[0033]
[ Reference Example 2]
Inhibitory effect on the adhesion of rodent causative bacteria to polystyrene tube Using iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples, the infection protection function against Streptococcus mutans was examined. This test was performed in duplicate as follows. That is, three kinds of Streptococcus mutans (ATCC-27670, ATCC-25175, ATCC-27351) were picked from one platinum ear and cultured overnight in 4 ml of Brain Heart Fusion (BHI) medium, followed by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes. The cells were collected and the supernatant medium was aspirated. Further, this was washed 3 times with PBS, and the cells were suspended in PBS so that OD 650 = 0.8. The bacterial cell suspension and the sample solution (0.1%) were mixed in an equivalent amount, placed in a 10 ml capacity polystyrene tube (2095, manufactured by Falcon), stirred well, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After completion of the incubation, OD 650 was measured, and the adhesion rate was determined from the following formula. The results are shown in Table 2.
Adhesion rate (%) = [{0.4− (sample OD 650 value)} / 0.4] × 100
[0034]
[Table 2]

[0035]
According to this, compared with commercially available lactoferrin, it turns out that the iron- lactoferrin of Example 1 blocks | prevents adhesion to the polystyrene tube of the causative agent of a rodent.
[0036]
[Test Example 1 ]
Agglutination inhibition against influenza virus (HI)
Activity The infection protection function against influenza virus was examined using the iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples. This test was conducted as follows. That is, the HI activity against influenza virus chick-stabilized red blood cells (manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.) and human red blood cells O-type was measured. HI activity was measured according to the method of Yamakawa et al. (Biochemistry, vol.31, pp.416-421). Influenza viruses are A / Yamagata / 120/86 (H1N1), A / Niigata / 102/81 / (H3N2), A / Sichuan, A / Fukuoka / C29 / 85 (H2N2) ), B / Nagasaki / 1/87, B / Singapore / 222/79 and non-inactivated influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1) obtained from Shizuoka Pharmaceutical University. The measurement results of HI activity against chick stabilized erythrocytes are shown in Table 3, and the measurement results of HI activity against human erythrocytes type O are shown in Table 4, respectively.
[0037]
[Table 3]

[0038]
[Table 4]

[0039]
According to this, it turns out that the iron- lactoferrin of Example 1 shows strong HI activity compared with commercially available lactoferrin.
[0040]
[Test Example 2 ]
Infection protection function against influenza virus Using iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples, non-inactivated influenza viruses A / PR / 8/34 (H1N1) and A / Aichi / 2/68 (H3N2) was diluted in stages, and 0.1 ml of 5 chicken 10-day eggs was inoculated into the urine cavity. After 3 days, 50 μl of urine was collected from each egg. Was mixed with 0.5% chick-stabilized red blood cells, stirred, and the infection rate was determined by hemagglutination. Dissolve 0.5 mg of commercially available lactoferrin or iron-lactoferrin in 0.1 ml of virus dilution solution at a dilution ratio that showed 100% infection rate, and incubate for 30 minutes at room temperature. Inoculated intraluminally. Three days later, 50 μl of urine from each egg was taken and the infection rate was determined by hemagglutination. Using 5 eggs per group, the infection rate of each group was obtained. The results are shown in Table 5.
[0041]
[Table 5]

[0042]
According to this, it turns out that the iron- lactoferrin of Example 1 shows a strong infection protection function with respect to influenza virus compared with commercially available lactoferrin.
[0043]
[Test Example 3 ]
Infection protection function against cytomegalovirus The infection protection function against cytomegalovirus (CMV) was examined using the iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples. This test was conducted as follows. That is, lactoferrin or iron-lactoferrin is dissolved in MEM medium supplemented with 2% serum to a concentration of 5 mg / ml, sterilized by filtration with a 0.45 μm filter, and the stock solution is diluted with MEM medium supplemented with 2% serum as necessary. Used.
[0044]
Human CMV (Towne strain) was incubated with lactoferrin or a medium containing iron-lactoferrin (0.1 mg / ml) for 1 hour, and then infected with human fetal fibroblasts (HEL cells). Furthermore, a culture solution containing no lactoferrin was used as a control. After 24 hours of culture, the cells were fluorescently stained with human CMV positive serum, and the ability of human CMV to be adsorbed to the cells was measured. The results are shown in Table 6.
[0045]
[Table 6]

[0046]
According to this, it can be seen that the iron-lactoferrin of Example 1 exhibits a strong infection-protecting function against human CMV as compared to commercially available lactoferrin.
[0047]
[ Reference Example 3 ]
Infection protection function against Helicobacter pylori Using the iron-lactoferrin obtained in Example 1 and commercially available lactoferrin as samples, the infection protection function against Helicobacter pylori was examined. This test was conducted as follows. Specifically, Helicobacter pylori (NCTC11637) grown on M-BHM pylori-agar medium (manufactured by Nikken Biomedical Research Institute) was seeded on Brucella broth medium (Brucella Broth, Difco Lab.) And gas pack system (BBLCampy Pak , Beckton Dickinson co.) Was shaken overnight under microaerobic conditions.
[0048]
Gastric cancer cells (Kato III) are Dulbecco's modified Eagle's medium (5% FCS / DMEM): Ham F-10 (1: 1) mixed medium containing 5% fetal calf serum, 37 ° C., carbon dioxide concentration 5% In culture. When the cells grew, 1 ml of the culture solution was centrifuged to collect gastric cancer cells. The supernatant was aspirated and the cells were newly suspended in 1 ml of PBS (106 cell / ml). To each 1 ml of this gastric cancer cell suspension, 1 ml of a solution obtained by mixing and incubating the aforementioned Helicobacter pylori and the sample was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After the incubation, 14 ml of sucrose solution (15%) was added, stirred and centrifuged. After removing the supernatant by aspiration, 100 μl of anti-Helicobacter pylori rabbit antibody was added and incubated at 4 ° C. for 20 minutes. Thereafter, washing was repeated twice with 15 ml of PBS, and FITC-labeled anti-rabbit IgG goat antiserum was added thereto and incubated at 4 ° C. for 20 minutes, and then washing was repeated twice with 15 ml of PBS. To cells washed with PBS, 900 μl of 200 U trypsin / PBS was added and vigorously stirred. The cells were lysed by adding 100 μl of 0.1% SDS and 1 ml of deionized water, stirring vigorously, and allowing to stand for 30 minutes.
[0049]
Then, using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi Fluorescence Spectrometer F-3000), the relative fluorescence intensity of this solution was measured at an excitation wavelength of 520 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm to evaluate the adhesion to Kato III cells. The results are shown in Table 7. The relative fluorescence intensity (blank) when no sample is added is 100%, and the relative fluorescence intensity of cells that undergo a series of antibody reactions using only Kato III cells without adding H. pylori and the sample is the adhesion rate. The adhesion rate when each sample was added was determined as 0%.
[0050]
[Table 7]

[0051]
According to this, it can be seen that the iron-lactoferrin of Example 1 strongly inhibits the adhesion of Helicobacter pylori to gastric cancer cells (Kato III) as compared to commercially available lactoferrin.
[0052]
[Example 3]
After mixing the raw material with formulations shown in Table 8, it is compressed on a tablet machine to produce tablets which endow virus infection defense mechanisms.
[0053]
[Table 8]

[0054]
[Example 4]
Raw material were mixed in formulations shown in Table 9, after filling the container, heat sterilization to, to produce a beverage that endow virus infection defense mechanisms.
[0055]
[Table 9]

[0056]
【The invention's effect】
Virus infection protective agent of the present invention, there have pharmaceuticals and food products to impart virus infection protective function against virus, it exhibits excellent infection defense mechanisms. Moreover, the iron-lactoferrin used in the present invention is characterized in that it can be prepared in large quantities at a relatively low cost and is extremely safe.

Claims

A virus infection protective agent comprising iron-lactoferrin, which retains at least 3 atoms of iron per molecule of lactoferrin as an active ingredient.

2. The infection protective agent according to claim 1, wherein the iron-lactoferrin is an iron-lactoferrin conjugate and / or an iron-lactoferrin complex in which carbonic acid and / or bicarbonate and iron are bound to lactoferrin.

The infection according to claim 1, wherein the iron-lactoferrin is an iron-lactoferrin conjugate and / or an iron-lactoferrin complex in which 15 mg or more of carbonic acid and / or bicarbonate and 10 to 700 mg of iron are bound per gram of lactoferrin. Protective agent.

Either the virus infection protective agent medicament for viral infections defense formulated with the description of the claims 1-3.