JP4004095B2

JP4004095B2 - Novel substrate compound and method for measuring cholinesterase activity

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Publication number: JP4004095B2
Application number: JP08878397A
Authority: JP
Inventors: 秀人柴田; 博幸坪田; 玲子嶋田; 達彦八木
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2017-03-24
Also published as: JPH09316040A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規化合物、及びその新規化合物を基質として用いるコリンエステラーゼ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清（血漿）中のコリンエステラーゼは、擬性コリンエステラーゼ（ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ；系統名：Ａｃｙｌｃｈｏｌｉｎｅａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＥＣ３．１．１．８）と呼ばれ、神経系に関与する真性コリンエステラーゼとは区別される。その生合成は肝臓で行われ血中に放出されるため、血中のコリンエステラーゼを測定すれば、肝機能、抗コリンエステラーゼ剤使用時の体調、有機リン中毒、ネフローゼ症候群、又は甲状腺機能亢進症等の診断・治療上等に対して有益な指標を得ることができるので、臨床診断分野において重要な測定項目となっている。
【０００３】
コリンエステラーゼの測定方法としては、アセチルコリンを基質として、生成する酢酸をフェノールフタレインの発色に導き、これをｐＨの変化単位として表示する方法が古くから行われてきた。その後、この酢酸を酢酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸キナーゼ、及びＮＡＤＨ−乳酸デヒドロゲナーゼ系へと接続する方法、あるいはベンゾイルコリン、又はトルイルコリンを基質として生成するコリンに、コリンオキシダーゼとペルオキシダーゼを作用させて、過酸化水素による色素の酸化発色に導く方法、又は４−ヒドロキシベンゾイルコリンにオキシゲナーゼとＮＡＤＨとを組み合わせる方法等、検出系に酵素を組み合わせた酵素的測定法が開発された。一方、チオコリンエステルもコリンエステラーゼによって容易に水解を受けるため、アセチルチオコリン、ブチリルチオコリン又はプロピオニルチオコリン等の基質から生成するチオコリンの−ＳＨ基の、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の黄色を追跡する方法も汎用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の測定方法において、フェノールフタレインの発色法は測定感度が不十分であり、検出系に酵素を組み合わせた酵素的測定法は、使用する酵素の安定性や特異性等の問題があり、試薬の性能を維持するのに注意を払う必要があった。更に、チオコリンによる発色法についても、反応液や検体中に、共存する他のチオール化合物や酸化還元性物質の干渉を受け易く、酵素学的測定法と同様に試薬の性能維持の面で問題がある。すなわち、従来法では、使用する基質に応じて生成する芳香族、若しくは脂肪族カルボン酸又はコリン、若しくはチオコリンを酵素による発色系に導くか、あるいは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の発色系に導くかが限定され、また、その指示反応系におけるアスコルビン酸、ビリルビン又はグルタチオン等の還元性物質や他のチオール類の干渉が生じるため、根本的な改善がなされない状況下で種々の測定法が使用されていた。
そこで、本発明者等は、これらの問題点を解決するために、発色性の置換基を構造中に含むコリンエステラーゼ活性測定用の新規基質物質を設計して合成し、この新規基質物質を用いてコリンエステラーゼ活性を測定する方法を鋭意検討し、本発明を完成させた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
Ｒ¹−Ａ¹−ＯＣ−Ｒ²−ＣＯ−Ａ²−（ＣＨ₂）₂−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃・Ｘ^- （Ｉ）
〔式中、Ａ¹及びＡ²は、それぞれ同じか又は異なり、Ｏ又はＳであり、Ｒ¹は、Ｒ¹−Ａ¹Ｈとして、芳香族又は芳香族性複素環式のヒドロキシ化合物又はチオール化合物を示し、Ｒ²は、飽和若しくは不飽和の置換若しくは非置換の炭素数２〜４の炭素鎖であり、そしてＸ^-は、陰イオンである〕
で表される化合物に関する。
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を基質物質として用いることを特徴とする、コリンエステラーゼ活性測定方法にも関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
前記一般式（Ｉ）において基Ｒ¹は、置換若しくは非置換の芳香族基又は芳香族性複素環式環基であり、好ましくは、コリンエステラーゼの活性測定時の反応ｐＨ領域（弱酸性〜アルカリ性、具体的にはｐＨ５〜１０、特にはｐＨ７〜９．５）で、前記一般式（Ｉ）で表される化合物から遊離される「Ｒ¹−Ａ¹Ｈ」が、フェノキシド誘導体、フェニルメルカプチド誘導体又はキノイド誘導体を誘導して分光学的に区別される発色をともなうものであれば特に限定されるものではない。
Ｒ¹−Ａ¹Ｈは、更に好ましくは、置換若しくは非置換フェノール、置換若しくは非置換ナフトール、置換若しくは非置換ヒドロキシインドール、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノキサゾン、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノキサゾン−Ｎ−オキシド、置換若しくは非置換フルオレセイン、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノチアゾン、置換若しくは非置換チオフェノール、又は置換若しくは非置換チオナフトールである。
【０００７】
前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フェニル基Ｒ¹は、好ましくは一般式（１）：
【化３】

〔式中、Ｒ¹¹は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基又は置換若しくは非置換のニトロフェニルアゾ基であり、ｎは１〜５の整数であるが、ｎが２〜５の場合には、Ｒ¹¹はそれぞれ同じか又は異なってもよいものとし、そして、Ｒ¹¹の少なくとも１つが、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるものとし、更に、Ｒ¹¹は、一般式（１ａ）：
【化４】

（式中、Ｒ¹¹¹は、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であり、ｍは１〜５の整数であるが、ｍが２〜５の場合には、Ｒ¹¹¹はそれぞれ同じか又は異なっていてもよく、そしてＲ¹¹¹の少なくとも１つが、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるものとする）
で表される基であることができるものとする〕
で表される基である。
【０００８】
更に、また、好ましい置換若しくは非置換フェニル基Ｒ¹は、上記一般式（１）において、Ｒ¹¹が式（１ｂ）：
【化５】

〔式中、Ｒ¹²及びＲ¹³は、それぞれ同じか又は異なり、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、前記式（１ａ）で表される置換フェニル基、非置換フェニル基又は置換フェニル若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であり、ＢはＣＯ又はＳＯ₂であり、ｐ及びｑは、それぞれ同じか又は異なり、１〜３の整数であるが、ｐ又はｑが２又は３の場合には、Ｒ¹²及びＲ¹³は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものする〕
で表されるフェノールフタレイン又はフェノールスルホンフタレイン誘導体であることができる。
【０００９】
また、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換ナフチル基Ｒ¹は、好ましくは一般式（２ａ）：
【化６】

又は一般式（２ｂ）：
【化７】

〔前記式中、Ｒ²¹は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基又は置換フェニル若しくはニトロフェニルアゾ基であり、ｒは１〜７の整数であるが、ｒが２〜７の場合には、Ｒ²¹はそれぞれ同じか又は異なっていてもよく、そして一般式（２ａ）の場合には、それぞれ２〜８位の少なくともいずれか１つ、又は一般式（２ｂ）の場合には、それぞれ１位、又は３〜８位の少なくともいずれか１つに、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるＲ²¹が存在するものとする〕
で表される基である。
【００１０】
また、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換インドリル基Ｒ¹は、好ましくは一般式（３）：
【化８】

〔式中、Ｒ³¹は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ³²は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、前記式（１ａ）で表される置換フェニル基、又は非置換フェニル基であり、ｓは１〜４の整数であるが、ｓが２〜４の場合には、Ｒ³²はそれぞれ同じか又は異なっていてもよい〕
で表される基である。
【００１１】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フェノキサゾニル基Ｒ¹又はそのＮ−オキシド体の基Ｒ¹は、好ましくは一般式（４）：
【化９】

〔式中、Ｒ⁴¹は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ＥはＮ又はＮ→Ｏ（Ｎ−オキシド）であり、ｔは１〜６の整数であるが、ｔが２〜６の場合には、Ｒ⁴¹はそれぞれ同じか又は異なってもよい〕
で表される基である。
【００１２】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フルオレセイン化合物（Ｒ¹−Ａ¹Ｈ）は、好ましくは一般式（５）：
【化１０】

〔式中、Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²及びＲ⁵³は、それぞれ同じか又は異なり、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ｕ及びｖは１〜３の整数であり、ｗは１〜４の整数であるが、ｕ又はｖが２又は３の場合、及びｗが２〜４の場合には、Ｒ⁵¹、Ｒ⁵²及びＲ⁵³は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものする〕
で表される化合物である。この置換若しくは非置換フルオレセイン化合物の３’−ＯＨ又は６’−ＯＨが、前記一般式（Ｉ）における−Ａ¹Ｈに相当する。
【００１３】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノチアゾン化合物（Ｒ¹−Ａ¹Ｈ）は、好ましくは一般式（６）：
【化１１】

〔式中、Ｒ⁶¹及びＲ⁶²は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ｘ及びｙは、それぞれ同じか又は異なり、１〜３の整数であるが、ｘ又はｙが２又は３の場合には、Ｒ⁶¹及びＲ⁶²は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものとする〕
で表される化合物である。この置換ヒドロキシフェノチアゾン化合物の７−ＯＨが、前記一般式（Ｉ）の−Ａ¹Ｈに相当する。
【００１４】
陰イオンＸ^-は、特に限定されるものではないが、コリンエステラーゼ活性を顕著に妨害しない陰イオンが好ましい。具体的には、例えば、ハロゲン化物イオン、硫酸水素イオン、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン）、アルカンスルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン）、又はカルボン酸イオン（例えば、酢酸イオン）を挙げることができる。また、前記式（Ｉ）において陰イオンＸ^-を除いた陽イオン部分２分子以上と塩を形成する２価又はそれ以上の有機酸イオン（例えば、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン又はフマル酸イオン）、又は無機酸イオン（例えば、硫酸イオン、又はリン酸イオン）であることもできる。
【００１５】
本明細書において、ハロゲン原子とは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又はフッ素原子である。炭素数１〜４の低級アルキル基には、直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基が含まれ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、又はｔ−ブチル基を挙げることができる。炭素数１〜４の低級アルコキシ基には、直鎖状又は分枝鎖状の低級アルコキシ基が含まれ、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基を挙げることができる。炭素数１〜４のスルホアルキル基又はヒドロキシスルホアルキル基は、スルホ基で置換された前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基又はヒドロキシアルキル基である。炭素数２〜５の低級アルカノイル基は、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸から誘導されるアシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、又はイソバレリル基を挙げることができる。
【００１６】
炭素数２〜５のカルボキシアルキル基は、カルボキシル基で置換された前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基である。炭素数２〜５の酸アミド基は、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸のアミド基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換されたアミノ基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基でモノ置換されたアミノ基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でジ置換されたアミノ基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の同一若しくは異なる低級アルキル基でジ置換されたアミノ基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基でモノ置換されたアミン部分あるいは前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の同一若しくは異なる低級アルキル基でジ置換されたアミン部分と、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸部分とからなる酸アミド基である。
【００１７】
具体的な置換フェノール（Ｒ¹−ＯＨ）、及び置換チオフェノール（Ｒ¹−ＳＨ）の例としては、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、３，４−ジニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−４−クロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジブロモ−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフェノール、２−メチル−４−ニトロフェノール、２，６−ジメチル−４−ニトロフェノール、２−メトキシ−４−ニトロフェノール、２，６−ジメトキシ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−６−メチルフェノール、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチル−４−ニトロフェノール、若しくは４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチルフェノール、又は前記置換フェノールに相当する置換チオフェノール、更にフェノールフタレイン、フェノールスルホンフタレイン、ブロムフェノールブルー、又はクロルフェノールレッドを挙げることができる。
【００１８】
また、置換ヒドロキシフェノキサゾン（Ｒ¹−ＯＨ）の例としては、７−ヒドロキシフェノキサゾン、４−メチル−７−ヒドロキシフェノキサゾン、又は８−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシフェノキサゾンを挙げることができ、置換ナフトール（Ｒ¹−ＯＨ）及び置換チオナフトール（Ｒ¹−ＳＨ）としては、例えば、４−ニトロ−１−ナフトール、６−ニトロ−２−ナフトール、２−クロロ−４−ニトロ−１−ナフトール、２−メチル−４−ニトロ−１−ナフトール、若しくは１，３−ジクロロ−６−ニトロ−２−ナフトール、又は前記置換ナフトールに相当する置換チオナフトール等を挙げることができる。また、置換ヒドロキシインドール（Ｒ¹−ＯＨ）の例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−ヒドロキシインドールを挙げることができる。更に、置換フルオレセイン（Ｒ¹−ＯＨ）の例としては、４，５，６，７−テトラクロロフルオレセイン、又は４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン（ローズベンガル）等を挙げることができ、置換ヒドロキシフェノチアゾン（Ｒ¹−ＯＨ）の例としては、６−ブロモ−ヒドロキシフェノチアゾン、又は１，９−ジメチル−ヒドロキシフェノチアゾン等を挙げることができる。
【００１９】
前記一般式（Ｉ）において好ましいＲ²は、２価の置換若しくは非置換の飽和若しくは不飽和の炭化水素基であって、その炭化水素基が一般式（Ｉ）中のＲ²に隣接する２つの−ＣＯ−基、及び−Ｏ−と一緒になって形成されるジカルボン酸の環状酸無水物から誘導される基である。Ｒ²の置換基は、ハロゲン原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、アミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、又は水酸基であり、これらの同一又は異なる１〜６個の置換基を有することができる。好ましいＲ²は、隣接する２つの−ＣＯ−基間の炭素数が２〜４の置換若しくは非置換のアルキレン基（例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、プロピレン基、若しくはエチルエチレン基）又はアルケニレン基（例えば、ビニレン基、若しくはプロペニレン基）である。
【００２０】
別の好ましいＲ²は、一般式（Ｉ）中のそのＲ²に隣接する２つの−ＣＯ−基間の最短炭素鎖の炭素数が２〜４の置換若しくは非置換のシクロペンチレン基、シクロペンテニレン基、シクロヘキシレン基、シクロヘキシニレン基若しくはアリーレン基である。ここで、Ｒ²の炭素鎖の構成炭素原子が同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルキル環若しくはシクロアルケニル環又は置換若しくは非置換の炭素数６〜１０のアリール環の環構成炭素原子である場合には、一般式（Ｉ）中のＲ²に隣接する２つの−ＣＯ−基間の炭素鎖が２種存在する。従って、「最短炭素鎖」とは、それらの２種の炭素鎖の内、炭素数の少ない方の炭素鎖を意味する。
【００２１】
シクロペンチレン基、シクロペンテニレン基、シクロヘキシレン基、又はシクロヘキセニレン基としてのＲ²は、例えば、１，２−若しくは１，３−シクロペンチレン基、１，２−若しくは１，３−シクロヘキシレン基、１，２−若しくは１，３−シクロペンテニレン基、又は１，２−若しくは１，３−シクロヘキセニレン基を挙げることができる。シクロアルケニル部分の不飽和結合部分は、前記の最短炭素鎖内に含まれていても、又はもう一方の炭素鎖中に含まれていてもよい。
アリーレン基としてのＲ²は、好ましくは炭素数６〜１０個のアリーレン基であり、例えば、１，２−フェニレン基、１，２−ナフチレン基、２，３−ナフチレン基、又は１，８−ナフチレン基を挙げることができる。
アリーレン基としてのＲ²は、環炭素原子１又はそれ以上がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子又はイオウ原子）で置き換わっていることができる。
【００２２】
更に別の好ましいＲ²は、（１）Ｒ²の炭素鎖の構成炭素原子の内の一部（２個又は３個）が、同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルキル環、シクロアルケニル環又は置換若しくは非置換の炭素数６〜１０のアリール環〔アリール環の環炭素原子１又はそれ以上は、ヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子又はイオウ原子）で置き換わっていることができる〕の環構成炭素原子であり、そして（２）Ｒ²の炭素鎖の構成炭素原子の内の他の一部（１個又は２個）が、前記シクロアルキル環、シクロアルケニル環又はアリール環の環構成炭素原子と１つ若しくは２つの−ＣＯ−基との間に介在するメチレン基（−ＣＨ₂−）、エチレン基（−ＣＨ₂ＣＨ₂−）又はビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）である場合である。この場合の−ＯＣ−Ｒ²−ＣＯ−基は、例えば、２（又は３）−カルボニルシクロペンチルアセチル基、２（又は３）−カルボニルシクロペンテニルアセチル基、２（又は３）−カルボニルシクロヘキシルアセチル基、２（又は３）−カルボニルメチルシクロペンチルアセチル基、２（又は３）−カルボニルメチルシクロヘキシルアセチル基、２−カルボニルフェニルアセチル基、１−カルボニルメチルナフチル−２（又は８）−カルボニル基、２−カルボニルメチルナフチル−３−カルボニル基、２−カルボニルメチルフェニルアセチル基、１−カルボニルメチルナフチル−２（又は８）−アセチル基、又は２−カルボニルメチルナフチル−３−アセチル基、あるいは２，３−ピリジレン基である。
【００２３】
Ｒ²の炭素鎖の構成炭素原子が、同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルケニル環の環構成炭素原子である場合に、そのシクロアルケニレン環の不飽和結合部分は、前記の最短炭素鎖内に含まれていても、あるいは含まれていなくてもよい。
【００２４】
本発明の新規基質化合物は、それ自体公知の方法によって調製することができる。本発明化合物の調製工程の代表例を図１に示す。図１中のＲ¹、Ｒ²及びＡ²は前記と同様の意味である。より具体的には、基Ｒ²を含むジカルボン酸無水物と２−ブロモエタノール（あるいは、２−ブロモエチルメルカプタン）とを、例えばベンゼン等の無極性有機溶媒中で１〜６時間加熱還流し、冷却後、炭酸ナトリウム水溶液を加えて、水相を分取し、エーテル洗浄後、塩酸酸性にした後、エーテルで抽出する。このエーテルを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥してブロモエトキシカルボニルカルボン酸（あるいはブロモエチルチオカルボニルカルボン酸）〔図１の前駆体（１）に相当〕を得る。ここで用いられる基Ｒ²を含むジカルボン酸無水物としては、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、イタコン酸、又はシトラコン酸等の脂肪族ジカルボン酸、更には、ショウノウ酸、シクロヘキサン−１，２（あるいは１，３）−ジカルボン酸、フタル酸、ナフタレン−１，８（１，２あるいは２，３）−ジカルボン酸等の環状酸無水物、又はキノリン２，３−（若しくは３，４−、４，５−、５，６−、６，７−、若しくは７，８−）ジカルボン酸、あるいはこれらの基本骨格上に置換基としてのハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシル基、アミノ基、低級アルキル置換アミノ基、水酸基、及び／又はフェニル基を有する誘導体を挙げることができる。
【００２５】
前記のカルボン酸誘導体〔前駆体（１）〕に塩化チオニルを加え、５分〜１時間加熱還流し、冷却後ベンゼンを加えて減圧濃縮して、塩化チオニルを除去する。これに発色性の芳香族炭化水素化合物（Ｒ¹−ＯＨ）とピリジンのエーテル溶液を加え、１０分〜１時間加熱還流する。ここで用いられる発色性の芳香族炭化水素化合物（Ｒ¹−ＯＨ）としては、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、３，４−ジニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−４−クロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジブロモ−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフェノール、２−メチル−４−ニトロフェノール、２，６−ジメチル−４−ニトロフェノール、２−メトキシ−４−ニトロフェノール、２，６−ジメトキシ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−６−メチルフェノール、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチル−４−ニトロフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチルフェノール、７−ヒドロキシフェノキサゾン、７−ヒドロキシ−４−メチルフェノキサゾン、又は４−ニトロ−１−ナフトール等を挙げることができる。冷却後、この反応物を塩酸中に加え、エーテルで抽出し、これを水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し、得られる油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ブロモエトキシカルボニルカルボン酸の芳香族化合物エステル（あるいは、ブロモエチルチオカルボニルカルボン酸の芳香族化合物エステル）〔図１の前駆体（２）に相当〕を得る。このエステル化合物〔前駆体（２）〕の無水ベンゼン溶液中に、トリメチルアミンのガスを、撹拌下、１〜５日間導入する。生じた沈殿を濾別し、ベンゼンで洗浄後、減圧乾燥して固形物を得、これをアセトン等から再結晶し、減圧乾燥することで、コリンエステラーゼ活性測定用の新規基質化合物である発色性芳香族基を有するコリン誘導体（あるいは、チオコリン誘導体）〔図１の「本発明基質」に相当〕を得ることができる。
【００２６】
こうして得られる新規基質化合物は、基本的には発色性の置換芳香族基とコリン又はチオコリンとの非対称ジカルボン酸エステルである。具体的な化合物の１例としては、３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、３−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、３−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、２−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）シクロヘキサンカルボニルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）シクロヘキサンカルボニルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ナフタレン−１−カルボニルコリン、３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）アクリルコリン、又は４−ニトロフェノキシカルボニルメタクリルコリン等を挙げることができる。また、前記の各化合物のコリン構造がチオコリンに置き換わった化合物も含まれる。
【００２７】
本発明による化合物は、コリンエステラーゼと接触させるとコリンエステラーゼ活性と比例する量の発色性置換芳香族化合物を遊離する。従って、その発色体化合物をモニターすることで、直接的にコリンエステラーゼ活性を測定することができるので、コリンエステラーゼ活性測定用の基質物質として有用である。従来の基質は、基質とコリンエステラーゼを接触させて生成する酢酸あるいはコリンを酵素的に発色系に導くか、あるいは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の発色系に導いており、直接的な発色法ではないため、基質自体の分解だけでなく酵素の失活や他の発色系へ導く組成物の劣化等、測定の不正確性に関与する要素が多く、正確にコリンエステラーゼ活性値を得られないことがあった。これに対して、本発明化合物によれば、それらの問題点を一挙に解決することができるという格別な効果を有している。すなわち、本発明による化合物をコリンエステラーゼ活性測定用基質物質として用いれば、コリンエステラーゼによって直接的に検出可能な置換フェノキシド等を生成するので、精度良くコリンエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２８】
前記新規化合物を用いて、生体液、特には血清や血漿中のコリンエステラーゼ活性を測定することができる。すなわち、本発明化合物を基質物質としてコリンエステラーゼと接触させることで、発色性の置換フェノキシド等、ジカルボン酸無水物及びコリン（あるいは、チオコリン）を生成し、この発色性置換フェノキシド等を光学的に検出することで、予めコリンエステラーゼ標品による検量線作成、あるいは標品による活性単位当たりの吸光度変化量を求める等の操作・計算をしておけば、被検試料中に含まれるコリンエステラーゼ活性を定量的に求めることができる。
【００２９】
より具体的には、例えば、血清等の被検試料をｐＨ７〜１０の従来公知の緩衝液（例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）で適宜希釈して、２５〜４０℃に保持し、そこに本発明基質０．０５〜１００ｍＭを含むｐＨ５〜１０の従来公知の緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）を添加して反応させ、波長４００〜５００ｎｍにおける吸光度変化を分光学的に検出し、単位時間当たりの吸光度変化量を求める（いわゆるレートアッセイ法）ことで、精度良くコリンエステラーゼ活性を求めることができる。
【００３０】
このとき、発色性置換フェノキシド等の解離を促進するために、αーシクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、あるいはそれらシクロデキストリンに塩基性官能基（例えば、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル、あるいはトリメチルアンモニオエチル等の４級アンモニウム塩）を導入したシクロデキストリン類を存在させることもできる。また、これらの試薬をキット化する際には、保存性や試料中の干渉物影響の回避等の目的で従来から使用されている各種界面活性剤、防腐剤、キレート剤等を適宜添加して用いることも本発明は包含するものである。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の各実施例で用いた各有機溶媒及び各化合物は、市販の試薬特級品である。
実施例１：３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリンの合成
無水コハク酸１０．０ｇ（１００ｍｍｏｌ）と２−ブロモエタノール１２．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）のベンゼン（４０ｍｌ）溶液を４時間加熱還流した。冷却後、反応液を炭酸ナトリウム水溶液（炭酸ナトリウム１４．８ｇを精製水４００ｍｌに溶解した水溶液）中に加えて、撹拌して水相を分取し、水相をエーテルで洗浄後、更に１０％塩酸で酸性にした後、エーテル３００ｍｌで抽出し、この抽出物を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、更に真空で乾燥して、前駆体（１）〔図１参照〕である３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸の白色固形物１６．１ｇ（収率７１．１％）を得た。
【００３２】
引き続き、室温で上記３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸１４．８ｇ（６６ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド１滴と塩化チオニル７．０ｍｌ（９９ｍｍｏｌ）とを加え、１５分間撹拌後、更に１５分間加熱還流した。冷却後、乾燥ベンゼン７０ｍｌを加えて減圧濃縮し、過剰の塩化チオニルを除去した。この残渣に４−ニトロフェノール９．２ｇ（６６ｍｍｏｌ）と無水ピリジン６．５ｍｌ（８０ｍｍｏｌ）の無水エーテル７０ｍｌの溶液を撹拌しながら加え、室温で３０分間反応させ、更に６０分間加熱還流した。冷却後、この反応混合物を冷１０％塩酸３５０ｍｌ中に加え、エーテル７００ｍｌで抽出し、この抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して油状物質を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、Ｒｆ値＝０．３９）で精製し、前駆体（２）〔図１参照〕である３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル１８．２ｇ（収率８１％）を得た。
【００３３】
前記３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル１５．０ｇ（４３．３ｍｍｏｌ）の無水ベンゼン８０ｍｌの溶液中に、水酸化ナトリウム管を通して乾燥させたトリメチルアミンのガス（３０％トリメチルアミン水溶液を加熱して発生させた）を攪拌下、３日間導入した。生じた沈殿を濾別して、これをベンゼン１００ｍｌで洗浄し、室温で減圧乾燥して得られた固形物を、活性炭を用いてアセトンから再結晶し、更に減圧乾燥して３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−Ｉともいう）である殆ど白色の結晶性粉末７．６７ｇ（総収率４３．７％）を得た。この生成物は極めて水に溶け易く、吸湿性を有する。前記生成物の元素分析の結果はＣ₁₅Ｈ₂₁Ｎ₂Ｏ₆Ｂｒ（分子量：４０５．２５）であり、¹Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３４】
実施例２：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水グルタル酸１１．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−IIともいう）である殆ど白色の結晶性粉末１４．２ｇ（総収率３４％）を得た。この生成物は極めて水に溶け易く、吸湿性を有する。前記生成物の元素分析の結果はＣ₁₆Ｈ₂₃Ｎ₂Ｏ₆Ｂｒ（分子量：４１９．２７）であり、¹Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３５】
実施例３：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水２，２−ジメチルグルタル酸１４．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−III ともいう）である白色固形物８．５ｇ（総収率１９％）を得た。この生成物の元素分析の結果はＣ₁₈Ｈ₂₇Ｎ₂Ｏ₆Ｂｒ（分子量：４４７．３３）であり、¹Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３６】
実施例４：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水３，３−ジメチルグルタル酸１４．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−IVともいう）である白色固形物４．５ｇ（総収率１０％）を得た。この生成物の元素分析の結果はＣ₁₈Ｈ₂₇Ｎ₂Ｏ₆Ｂｒ（分子量：４４７．３３）であり、¹Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
実施例５：コリンエステラーゼ活性の測定
（１）コリンエステラーゼ標準試料
ヒト血漿由来コリンエステラーゼ（ベーリンガーマンハイム社；ブチリルコリンを基質として１バイアル当たり約１００Ｕ含有）を０．１％牛血清アルブミンを含む生理食塩水５ｍｌに溶解し、更に使用時に０．１％牛血清アルブミンを含む生理食塩水で１０倍に希釈したものをコリンエステラーゼ標準試料とした。
（２）試薬１
ｐＨ７．５の１００ｍＭトリス緩衝液を試薬（１）として調製した。
（３）試薬２
前記各実施例１〜４で調製した合成基質（ＣｈＥ−Ｉ、ＣｈＥ−II、ＣｈＥ−III 、又はＣｈＥ−IV）の５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ−２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）を試薬（２）として調製した。
（４）操作
コリンエステラーゼ活性の測定には、Ｈ−７１５０型自動分析装置（日立製作所）を使用した。測定時のパラメーターは以下の通りである。

測定機は上記パラメーターに従って、コリンエステラーゼ標準試料１０μｌと試薬（１）（３２０μｌ）を分注して混合し、一定の恒温時間（３７℃、５分間）の後、試薬（２）（８０μｌ）を添加混合して反応を開始させた。このときの吸光度変化（タイムコース）を図２に示す。なお、図２中の記号は、−●−がＣｈＥ−Ｉ、−△−がＣｈＥ−II、−□−がＣｈＥ−III 、−○−がＣｈＥ−IVを表している。コリンエステラーゼ標準試料に本発明基質を含む試薬を添加すると、コリンエステラーゼと本発明基質との反応によって本発明基質から生成する４−ニトロフェノールに由来する吸光度の上昇が確認された。
【００３９】
また、コリンエステラーゼ標準試料の希釈列を調製し、それを試料として上記と同様の操作を行い、試薬（２）を添加してから１８０秒経過後に、それ以後の１２０秒間での、それぞれの基質含有試薬の単位時間当たりの吸光度変化を求めた。結果を図３に示す。なお、図３中の記号は、前記と同様に−●−がＣｈＥ−Ｉ、−△−がＣｈＥ−II、−□−がＣｈＥ−III 、−○−がＣｈＥ−IVを表している。コリンエステラーゼ標準試料の希釈列に対し、各基質毎の単位時間当たりの吸光度変化量は直線性を示しており、コリンエステラーゼと本発明による各基質が反応すると、定量的に４−ニトロフェノールが生成していることが確認された。この結果から、本発明による新規基質物質を用いて、被検試料中のコリンエステラーゼ活性を定量的に測定できることが認められた。
【００４０】
実施例６：血清中のコリンエステラーゼ活性の測定
実施例５に従って、管理血清（商品名：セラケム；ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｍｐａｎｙ製）中のコリンエステラーゼ活性を測定した。すなわち、ＣｈＥ−Ｉを基質として、その他は実施例５の操作方法に準じて行った。比較として、従来のコリンエステラーゼ測定用試薬（商品名：イアトロファインＣｈ−Ｅレート；ヤトロン社製、基質物質：ブチリルチオコリン）を用いて同様に試験を行った。但し、試料の量は３μｌ、測定波長は６００−４８０ｎｍに変更して行った。それらの各試験を１０回繰り返し行った測定結果を表２に示す。表２に示すように、本発明化合物はコリンエステラーゼ活性測定用の基質として用いることができ、従来のものと遜色なく精度良く血清中のコリンエステラーゼ活性を測定することができた。
【００４１】
【表２】

【００４２】
実施例７：２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水フタル酸１３．６ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリンの臭化物である殆ど白色の結晶性粉末１０．２ｇ（総収率２２．５％）を得た。この生成物は水に溶け易く、吸湿性を有する。この生成物の元素分析の結果はＣ₁₉Ｈ₂₁Ｎ₂Ｏ₆Ｂｒ（分子量：４５３．２９）であった。前記生成物５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ−ＭＥＳ緩衝液を調製し、実施例５に準じてコリンエステラーゼ標準試料と反応させ、遊離する４−ニトロフェノキシド由来の発色を確認した。
【００４３】
実施例８：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルチオコリンの合成
実施例１の２−ブロモエタノールに換えて、２−ブロモエタンチオール１４．１ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルチオコリンの臭化物である淡黄白色の粉末７．８ｇ（総収率１８．５％）を得た。この生成物は水に溶け易かった。この生成物の元素分析の結果はＣ₁₅Ｈ₂₁Ｎ₂Ｏ₅ＳＢｒ（分子量：４２１．１９）であった。前記生成５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭＭＥＳ緩衝液を調製し、実施例５に準じてコリンエステラーゼ標準試料と反応させ、遊離する４−ニトロフェノキシド由来の発色を確認した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明による化合物は、コリンエステラーゼの基質であると同時に、その構造内に発色性成分を含有しており、コリンエステラーゼと接触させると、その発色性成分を放出して発色性化合物を生成することができる。しかも、その生成量は、本発明化合物に接触させた前記コリンエステラーゼの活性と比例する。従って、前記発色性化合物をモニターすることにより、直接的にコリンエステラーゼ活性を測定することができ、発色系へ誘導する酵素や試薬を使用する従来法よりも正確な測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規化合物の合成工程の１例を示す説明図である。
【図２】本発明による４種の新規化合物がコリンエステラーゼ標準試薬と接触した際に生成する発色性化合物由来の吸光度変化を示すグラフ（タイムコース）である。
【図３】本発明による４種の新規化合物がコリンエステラーゼ標準試薬の希釈列と接触した際に生成する発色性化合物の単位時間当たりの吸光度変化量を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel compound and a method for measuring cholinesterase activity using the novel compound as a substrate.
[0002]
[Prior art]
Cholinesterase in human serum (plasma) is called pseudocholinesterase (strain name: Acylcholine acylhydrolase; EC 3.1.1.8) and is distinguished from true cholinesterase involved in the nervous system. Its biosynthesis is performed in the liver and released into the blood, so if you measure cholinesterase in the blood, liver function, physical condition when using anticholinesterase, organophosphate poisoning, nephrotic syndrome, hyperthyroidism, etc. Since a useful index for diagnosis and treatment can be obtained, it is an important measurement item in the clinical diagnosis field.
[0003]
As a method for measuring cholinesterase, a method of using acetylcholine as a substrate, acetic acid produced to lead to color formation of phenolphthalein, and displaying this as a unit of pH change has long been performed. Thereafter, a method of connecting this acetic acid to acetate kinase, phosphoenolpyruvate kinase, and NADH-lactate dehydrogenase system, or choline oxidase and peroxidase are allowed to act on choline produced using benzoylcholine or toluoylcholine as a substrate, An enzymatic measurement method in which an enzyme is combined with a detection system has been developed, such as a method that leads to oxidative coloring of a dye by hydrogen peroxide, or a method that combines 4-hydroxybenzoylcholine with oxygenase and NADH. On the other hand, since thiocholine esters are also easily hydrolyzed by cholinesterase, 5,5′-dithio-bis (2- (2)) of the —SH group of thiocholine produced from a substrate such as acetylthiocholine, butyrylthiocholine, or propionylthiocholine. A method for tracking the yellow color of released 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid through substitution with (nitrobenzoic acid) is also widely used.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional measurement method, the phenolphthalein coloring method has insufficient measurement sensitivity, and the enzymatic measurement method combining an enzyme with the detection system has problems such as the stability and specificity of the enzyme used. Care must be taken to maintain reagent performance. Furthermore, the color development method using thiocholine is also susceptible to interference from other coexisting thiol compounds and redox substances in the reaction solution and specimen, and as with the enzymatic measurement method, there are problems in maintaining reagent performance. is there. That is, in the conventional method, an aromatic or aliphatic carboxylic acid or choline or thiocholine produced according to a substrate to be used is introduced into a coloring system by an enzyme, or 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). Acid) is limited to lead to the coloration system of free 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid, and reducing substances such as ascorbic acid, bilirubin or glutathione and other thiols in the indicated reaction system Various measurement methods have been used in situations where fundamental improvements have not been made due to similar interference.
In order to solve these problems, the present inventors designed and synthesized a new substrate substance for measuring cholinesterase activity containing a chromogenic substituent in the structure, and used this new substrate substance. The present invention was completed by intensively studying a method for measuring cholinesterase activity.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is directed to general formula (I):
[Chemical 2]
R¹-A¹-OC-R²-CO-A²-(CH₂)₂-N⁺(CH_Three)_Three・ X^- (I)
[Where A¹And A²Are the same or different and are O or S, and R¹Is R¹-A¹H represents an aromatic or aromatic heterocyclic hydroxy compound or thiol compound, R²Is a saturated or unsaturated substituted or unsubstituted carbon chain of 2 to 4 carbon atoms and X^-Is an anion.
It is related with the compound represented by these.
The present invention also relates to a method for measuring cholinesterase activity, wherein the compound represented by the general formula (I) is used as a substrate substance.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the general formula (I), the group R¹Is a substituted or unsubstituted aromatic group or aromatic heterocyclic ring group, preferably a reaction pH region (weakly acidic to alkaline, specifically pH 5 to 10, particularly pH 5 when measuring the activity of cholinesterase “R released from the compound represented by the general formula (I) at pH 7 to 9.5)”¹-A¹There is no particular limitation as long as “H” has color development that is spectroscopically differentiated by inducing a phenoxide derivative, a phenyl mercaptide derivative, or a quinoid derivative.
R¹-A¹H is more preferably substituted or unsubstituted phenol, substituted or unsubstituted naphthol, substituted or unsubstituted hydroxyindole, substituted or unsubstituted hydroxyphenoxazone, substituted or unsubstituted hydroxyphenoxazone-N-oxide, substituted or Unsubstituted fluorescein, substituted or unsubstituted hydroxyphenothiazone, substituted or unsubstituted thiophenol, or substituted or unsubstituted thionaphthol.
[0007]
In the general formula (I), a substituted or unsubstituted phenyl group R¹Is preferably the general formula (1):
[Chemical 3]

[In the formula, R¹¹Is a hydrogen atom, halogen atom, nitro group, lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, lower alkoxy having 1 to 4 carbon atoms Mono- or di-substitution with a group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms Amino group, acid amide group, hydroxyl group, carboxyl group, sulfo group, unsubstituted, mono- or di-substituted amine moiety with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms A phenyl group or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group, and n is an integer of 1 to 5, but when n is 2 to 5,¹¹Each may be the same or different and R¹¹At least one of them is a nitro group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group, and R¹¹Is the general formula (1a):
[Formula 4]

(Wherein R¹¹¹Is a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, carbon A mono- or di-substituted amino group having a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms Group, an acid amide group consisting of an amine moiety mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfo group, an unsubstituted phenyl group, Or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group, and m is an integer of 1 to 5, but when m is 2 to 5,¹¹¹Each may be the same or different and R¹¹¹At least one of them is a nitro group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group)
It can be a group represented by
It is group represented by these.
[0008]
Furthermore, preferred substituted or unsubstituted phenyl groups R¹Is R in the general formula (1).¹¹Is the formula (1b):
[Chemical formula 5]

[In the formula, R¹²And R¹³Are the same or different and each is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a carbon number. 1 to 4 lower alkoxy groups, 2 to 5 lower alkanoyl groups, 2 to 5 carboxyalkyl groups, amino groups, 2 to 5 acid amide groups, 1 to 4 lower alkyl groups A mono- or di-substituted amino group, an acid amide group, a hydroxyl group or a carboxyl group comprising an amine moiety mono- or di-substituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms , A sulfo group, a substituted phenyl group, an unsubstituted phenyl group or a substituted phenyl or unsubstituted nitrophenylazo group represented by the formula (1a), and B is CO or SO₂And p and q are the same or different and are integers of 1 to 3, but when p or q is 2 or 3, R and¹²And R¹³Each may be the same or different]
Or a phenol sulfonephthalein derivative represented by the formula:
[0009]
In the general formula (I), a substituted or unsubstituted naphthyl group R¹Is preferably general formula (2a):
[Chemical 6]

Or general formula (2b):
[Chemical 7]

[In the above formula, R^{twenty one}Is a hydrogen atom, halogen atom, nitro group, lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, lower alkoxy having 1 to 4 carbon atoms Mono- or di-substitution with a group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms Amino group, acid amide group, hydroxyl group, carboxyl group, sulfo group, unsubstituted, mono- or di-substituted amine moiety with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms A phenyl group or a substituted phenyl or nitrophenylazo group, and r is an integer of 1 to 7, but when r is 2 to 7,^{twenty one}May be the same or different, and in the case of general formula (2a), at least one of positions 2 to 8, respectively, or in the case of general formula (2b), R which is a nitro group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group at at least one of positions 3 to 8^{twenty one}Is assumed to exist)
It is group represented by these.
[0010]
In the general formula (I), a substituted or unsubstituted indolyl group R¹Is preferably general formula (3):
[Chemical 8]

[In the formula, R³¹Is a hydrogen atom, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a halogen atom, and R³²Is a hydrogen atom, halogen atom, nitro group, lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, lower alkoxy having 1 to 4 carbon atoms Mono- or di-substitution with a group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms An amino group, an acid amide group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfo group, which is composed of an amine moiety mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms, (1a) is a substituted phenyl group or an unsubstituted phenyl group, and s is an integer of 1 to 4, but when s is 2 to 4, R³²Each may be the same or different.
It is group represented by these.
[0011]
Further, in the general formula (I), a substituted or unsubstituted phenoxazonyl group R¹Or a group R of the N-oxide thereof¹Is preferably general formula (4):
[Chemical 9]

[In the formula, R⁴¹Is a hydrogen atom, halogen atom, nitro group, lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, lower alkoxy having 1 to 4 carbon atoms Mono- or di-substitution with a group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms An amino group, an acid amide group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfo group, or a non-substituent consisting of an amine moiety mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms A substituted phenyl group, E is N or N → O (N-oxide), t is an integer of 1-6, but when t is 2-6, R⁴¹Each may be the same or different.
It is group represented by these.
[0012]
Further, in the general formula (I), a substituted or unsubstituted fluorescein compound (R¹-A¹H) is preferably of the general formula (5):
[Chemical Formula 10]

[In the formula, R⁵¹, R⁵²And R⁵³Are the same or different and each is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a carbon number. 1 to 4 lower alkoxy groups, 2 to 5 lower alkanoyl groups, 2 to 5 carboxyalkyl groups, amino groups, 2 to 5 acid amide groups, 1 to 4 lower alkyl groups A mono- or di-substituted amino group, an acid amide group, a hydroxyl group or a carboxyl group comprising an amine moiety mono- or di-substituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms , A sulfo group, or an unsubstituted phenyl group, u and v are integers of 1 to 3, w is an integer of 1 to 4, but when u or v is 2 or 3, and w is 2 to 2. In case of 4, R⁵¹, R⁵²And R⁵³Each may be the same or different]
It is a compound represented by these. The 3'-OH or 6'-OH of this substituted or unsubstituted fluorescein compound is -A in the general formula (I).¹Corresponds to H.
[0013]
Further, in the general formula (I), a substituted or unsubstituted hydroxyphenothizone compound (R¹-A¹H) is preferably of the general formula (6):
Embedded image

[In the formula, R⁶¹And R⁶²Is a hydrogen atom, halogen atom, nitro group, lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, hydroxysulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, lower alkoxy having 1 to 4 carbon atoms Mono- or di-substitution with a group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an amino group, an acid amide group having 2 to 5 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms An amino group, an acid amide group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfo group, or a non-substituent consisting of an amine moiety mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms A substituted phenyl group, and x and y are the same or different and are integers of 1 to 3, but when x or y is 2 or 3, R⁶¹And R⁶²Each may be the same or differentWhenTo do]
It is a compound represented by these. Of this substituted hydroxyphenothiazone compound7-OH represents -A in the general formula (I).¹Corresponds to H.
[0014]
Anion X^-Is not particularly limited, but an anion that does not significantly interfere with cholinesterase activity is preferable. Specifically, for example, halide ion, hydrogen sulfate ion, alkyl sulfate ion (for example, methyl sulfate ion), alkane sulfonate ion (for example, methane sulfonate ion), or carboxylate ion (for example, acetate ion) Can be mentioned. In the formula (I), the anion X^-Divalent or higher organic acid ions (for example, oxalate ion, citrate ion, succinate ion or fumarate ion) that form a salt with two or more molecules of the cation moiety excluding, or inorganic acid ion (for example, Sulfate ion or phosphate ion).
[0015]
In this specification, a halogen atom is a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, or a fluorine atom. The lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms includes a linear or branched lower alkyl group, such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group. A group, a s-butyl group, or a t-butyl group. The lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms includes a linear or branched lower alkoxy group, such as a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, Examples thereof include an isobutoxy group, an s-butoxy group, and a t-butoxy group. A C1-C4 sulfoalkyl group or a hydroxy sulfoalkyl group is the said C1-C4 linear or branched lower alkyl group or hydroxyalkyl group substituted by the sulfo group. The lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms is an acyl group derived from a linear or branched lower alkanoic acid having 2 to 5 carbon atoms, such as acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group. Group, valeryl group or isovaleryl group.
[0016]
A C2-C5 carboxyalkyl group is the said C1-C4 linear or branched lower alkyl group substituted by the carboxyl group. The C2-5 acid amide group is an amide group of a linear or branched lower alkanoic acid having 2 to 5 carbon atoms. The amino group mono-substituted by a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is an amino group mono-substituted by the above-mentioned linear or branched lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. The amino group disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is an amino group disubstituted with the same or different lower alkyl group having the same or different straight chain or branched chain structure having 1 to 4 carbon atoms. . The acid amide group composed of an amine moiety mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and an acid moiety having 2 to 5 carbon atoms is a straight chain or branched chain having 1 to 4 carbon atoms. An amine moiety mono-substituted with a chain-like lower alkyl group, or an amine moiety di-substituted with the same or different linear or branched lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, It is an acid amide group consisting of 5 linear or branched lower alkanoic acid moieties.
[0017]
Specific substituted phenols (R¹-OH), and substituted thiophenols (R¹Examples of -SH) include 2-nitrophenol, 3-nitrophenol, 4-nitrophenol, 3,4-dinitrophenol, 2-chloro-4-nitrophenol, 2-nitro-4-chlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, 2,5-dinitrophenol, 2,6-dichloro-4-nitrophenol, 2,6-dibromo-4-nitrophenol, 2,3,6-trichloro-4-nitrophenol, 2-methyl -4-nitrophenol, 2,6-dimethyl-4-nitrophenol, 2-methoxy-4-nitrophenol, 2,6-dimethoxy-4-nitrophenol, 2-nitro-6-methylphenol, 2,6- Dichloro-4-acetylphenol, 4- (4-nitrophenylazo) phenol, 4- (2-chloro-4-nitrophenyl) Nylazo) phenol, 4- (4-nitrophenylazo) -2-methyl-4-nitrophenol, or 4- (4-nitrophenylazo) -2-methylphenol, or a substituted thiophenol corresponding to the substituted phenol, Further examples include phenolphthalein, phenolsulfonephthalein, bromophenol blue, and chlorophenol red.
[0018]
Substituted hydroxyphenoxazone (R¹Examples of -OH) may include 7-hydroxyphenoxazone, 4-methyl-7-hydroxyphenoxazone, or 8-chloro-4-methyl-7-hydroxyphenoxazone, substituted naphthol ( R¹-OH) and substituted thionaphthol (R)¹-SH) is, for example, 4-nitro-1-naphthol, 6-nitro-2-naphthol, 2-chloro-4-nitro-1-naphthol, 2-methyl-4-nitro-1-naphthol, or 1 , 3-dichloro-6-nitro-2-naphthol, or substituted thionaphthol corresponding to the substituted naphthol. Substituted hydroxyindoles (R¹As an example of -OH), mention may be made of 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Furthermore, substituted fluorescein (R¹Examples of —OH) include 4,5,6,7-tetrachlorofluorescein, or 4,5,6,7-tetrachloro-2 ′, 4 ′, 5 ′, 7′-tetraiodofluorescein (Rose Bengal And substituted hydroxyphenothizone (R¹Examples of -OH) include 6-bromo-hydroxyphenothiazone or 1,9-dimethyl-hydroxyphenothiazone.
[0019]
Preferred R in the general formula (I)²Is a divalent substituted or unsubstituted saturated or unsaturated hydrocarbon group, and the hydrocarbon group is R in the general formula (I)²Is a group derived from a cyclic anhydride of a dicarboxylic acid formed together with two —CO— groups adjacent to each other and —O—. R²The substituent is a halogen atom, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, an amino group, or an amino group mono- or disubstituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. Or a hydroxyl group and may have 1 to 6 of these same or different substituents. Preferred R²Is a substituted or unsubstituted alkylene group having 2 to 4 carbon atoms between two adjacent —CO— groups (for example, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, propylene group, or ethylethylene group) or alkenylene group (For example, vinylene group or propenylene group).
[0020]
Another preferred R²In the general formula (I)²A substituted or unsubstituted cyclopentylene group, cyclopentenylene group, cyclohexylene group, cyclohexylinylene group or arylene group having 2 to 4 carbon atoms in the shortest carbon chain between two —CO— groups adjacent to each other is there. Where R²When the carbon atoms of the carbon chain are simultaneously the ring constituent carbon atoms of a substituted or unsubstituted cycloalkyl ring or cycloalkenyl ring or a substituted or unsubstituted aryl ring having 6 to 10 carbon atoms In the general formula (I),²There are two types of carbon chains between two —CO— groups adjacent to each other. Therefore, the “shortest carbon chain” means a carbon chain having a smaller number of carbons out of the two types of carbon chains.
[0021]
  R as a cyclopentylene group, a cyclopentenylene group, a cyclohexylene group, or a cyclohexenylene group²Is, for example, 1,2- or 1,3-cyclopentylene group, 1,2- or 1,3-cyclohexylene group, 1,2- or 1,3-cyclopentenylene group, or 1,2 -A 1,3- cyclohexenylene group can be mentioned. The unsaturated bond part of the cycloalkenyl part may be contained in the shortest carbon chain, or may be contained in the other carbon chain.
  R as an arylene group²Is preferably an arylene group having 6 to 10 carbon atoms, and examples thereof include a 1,2-phenylene group, a 1,2-naphthylene group, a 2,3-naphthylene group, and a 1,8-naphthylene group. it can.
  R as an arylene group²Is one or more ring carbon atoms that are heteroatoms (eg, nitrogen, oxygen or sulfur atoms).)Can be replaced with.
[0022]
Yet another preferred R²(1) R²A part (2 or 3) of the constituent carbon atoms of the carbon chain at the same time is a substituted or unsubstituted cycloalkyl ring, cycloalkenyl ring or substituted or unsubstituted carbon number 6 A ring-constituting carbon atom of from 10 to 10 aryl rings, wherein one or more ring carbon atoms of the aryl ring can be replaced by heteroatoms (eg, nitrogen, oxygen or sulfur atoms), and ( 2) R²And another part (one or two) of the constituent carbon atoms of the carbon chain of the cycloalkyl ring, the cycloalkenyl ring or the aryl ring and one or two —CO— groups Methylene group (—CH₂-), Ethylene group (-CH₂CH₂-) Or vinylene group (-CH = CH-). -OC-R in this case²The —CO— group is, for example, 2 (or 3) -carbonylcyclopentylacetyl group, 2 (or 3) -carbonylcyclopentenylacetyl group, 2 (or 3) -carbonylcyclohexylacetyl group, 2 (or 3) -carbonylmethyl. Cyclopentylacetyl group, 2 (or 3) -carbonylmethylcyclohexylacetyl group, 2-carbonylphenylacetyl group, 1-carbonylmethylnaphthyl-2 (or 8) -carbonyl group, 2-carbonylmethylnaphthyl-3-carbonyl group, 2 A carbonylmethylphenylacetyl group, a 1-carbonylmethylnaphthyl-2 (or 8) -acetyl group, a 2-carbonylmethylnaphthyl-3-acetyl group, or a 2,3-pyridylene group.
[0023]
R²When the constituent carbon atoms of the carbon chain are simultaneously the constituent carbon atoms of a substituted or unsubstituted cycloalkenyl ring having 5 to 6 carbon atoms, the unsaturated bond portion of the cycloalkenylene ring is the shortest carbon. It may or may not be included in the chain.
[0024]
The novel substrate compound of the present invention can be prepared by a method known per se. A representative example of the preparation process of the compound of the present invention is shown in FIG. R in FIG.¹, R²And A²Means the same as above. More specifically, the group R²A dicarboxylic acid anhydride containing 2-bromoethanol (or 2-bromoethyl mercaptan) is heated to reflux in a nonpolar organic solvent such as benzene for 1 to 6 hours, cooled, and then added with an aqueous sodium carbonate solution. The aqueous phase is separated, washed with ether, acidified with hydrochloric acid, and extracted with ether. This ether is washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and then dried under reduced pressure to obtain bromoethoxycarbonylcarboxylic acid (or bromoethylthiocarbonylcarboxylic acid) [corresponding to the precursor (1) in FIG. 1]. The group R used here²Examples of the dicarboxylic acid anhydride containing succinic acid, glutaric acid, adipic acid, maleic acid, itaconic acid, citraconic acid and other aliphatic dicarboxylic acids, camphoric acid, cyclohexane-1,2 (or 1,3) ) -Dicarboxylic acid, phthalic acid, cyclic acid anhydrides such as naphthalene-1,8 (1,2 or 2,3) -dicarboxylic acid, or quinoline 2,3- (or 3,4-, 4,5-, 5,6-, 6,7-, or 7,8-) dicarboxylic acid, or halogen atoms, lower alkyl groups, lower alkoxyl groups, amino groups, lower alkyl-substituted amino groups as substituents on these basic skeletons, Examples thereof include derivatives having a hydroxyl group and / or a phenyl group.
[0025]
Thionyl chloride is added to the carboxylic acid derivative [precursor (1)], and the mixture is heated to reflux for 5 minutes to 1 hour. After cooling, benzene is added and concentrated under reduced pressure to remove thionyl chloride. In addition to this, chromogenic aromatic hydrocarbon compounds (R¹-OH) and an ether solution of pyridine are added and heated to reflux for 10 minutes to 1 hour. Color-forming aromatic hydrocarbon compound (R) used here¹-OH) includes 2-nitrophenol, 3-nitrophenol, 4-nitrophenol, 3,4-dinitrophenol, 2-chloro-4-nitrophenol, 2-nitro-4-chlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, 2,5-dinitrophenol, 2,6-dichloro-4-nitrophenol, 2,6-dibromo-4-nitrophenol, 2,3,6-trichloro-4-nitrophenol, 2-methyl-4 -Nitrophenol, 2,6-dimethyl-4-nitrophenol, 2-methoxy-4-nitrophenol, 2,6-dimethoxy-4-nitrophenol, 2-nitro-6-methylphenol, 2,6-dichloro- 4-acetylphenol, 4- (4-nitrophenylazo) phenol, 4- (2-chloro-4-nitropheny) Azo) phenol, 4- (4-nitrophenylazo) -2-methyl-4-nitrophenol, 4- (4-nitrophenylazo) -2-methylphenol, 7-hydroxyphenoxazone, 7-hydroxy-4 -Methylphenoxazone, 4-nitro-1-naphthol, etc. can be mentioned. After cooling, the reaction product is added to hydrochloric acid and extracted with ether. This is washed with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine in that order, dried over anhydrous sodium sulfate, and dried under reduced pressure. The oily substance is purified by silica gel column chromatography to obtain an aromatic compound ester of bromoethoxycarbonylcarboxylic acid (or an aromatic compound ester of bromoethylthiocarbonylcarboxylic acid) [corresponding to the precursor (2) in FIG. 1]. . A trimethylamine gas is introduced into an anhydrous benzene solution of the ester compound [precursor (2)] for 1 to 5 days with stirring. The resulting precipitate was filtered off, washed with benzene, and then dried under reduced pressure to obtain a solid, which was recrystallized from acetone and the like, and dried under reduced pressure to produce a chromophoric fragrance that is a novel substrate compound for measuring cholinesterase activity. It is possible to obtain a choline derivative (or thiocholine derivative) having a group (corresponding to the “substrate of the present invention” in FIG. 1).
[0026]
The novel substrate compound thus obtained is basically an asymmetric dicarboxylic acid ester of a chromogenic substituted aromatic group and choline or thiocholine. Examples of specific compounds include 3- (4-nitrophenoxycarbonyl) propionylcholine, 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) butyrylcholine, 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) -4,4-dimethylbutyrylcholine. 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) -3,3-dimethylbutyrylcholine, 2- (4-nitrophenoxycarbonyl) benzoylcholine, 3- (3,4-dinitrophenoxycarbonyl) propionylcholine, 4- (3 4-dinitrophenoxycarbonyl) butyrylcholine, 4- (3,4-dinitrophenoxycarbonyl) -4,4-dimethylbutyrylcholine, 4- (3,4-dinitrophenoxycarbonyl) -3,3-dimethylbutyrylcholine, 2- (3,4-dinitrophenoxycarbonyl) Nzoylcholine, 3- (2-chloro-4-nitrophenoxycarbonyl) propionylcholine, 4- (2-chloro-4-nitrophenoxycarbonyl) butyrylcholine, 4- (2-chloro-4-nitrophenoxycarbonyl) -4,4 -Dimethylbutyrylcholine, 4- (2-chloro-4-nitrophenoxycarbonyl) -3,3-dimethylbutyrylcholine, 2- (2-chloro-4-nitrophenoxycarbonyl) benzoylcholine, 2- (2-chloro- 4-nitrophenoxycarbonyl) cyclohexanecarbonylcholine, 2- (4-nitrophenoxycarbonyl) cyclohexanecarbonylcholine, 2- (4-nitrophenoxycarbonyl) naphthalene-1-carbonylcholine, 3- (4-nitrophenoxycarbonyl) acrylcholine Or 4-nitrophenoxy carbonyl methacrylic choline and the like. Also included are compounds in which the choline structure of each compound is replaced with thiocholine.
[0027]
When contacted with cholinesterase, the compounds according to the invention release an amount of chromogenic substituted aromatic compound proportional to the cholinesterase activity. Therefore, since the cholinesterase activity can be directly measured by monitoring the chromogenic compound, it is useful as a substrate substance for measuring cholinesterase activity. Conventional substrates are liberated through the enzymatic conversion of acetic acid or choline produced by contacting the substrate with cholinesterase to the chromogenic system or by substitution with 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). Since it is led to a coloring system of 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid and not a direct coloring method, not only decomposition of the substrate itself but also deactivation of the enzyme and deterioration of the composition leading to other coloring systems, etc. There are many factors involved in measurement inaccuracy, and cholinesterase activity values may not be obtained accurately. On the other hand, according to the compound of the present invention, it has a special effect that these problems can be solved at once. That is, when the compound according to the present invention is used as a substrate substance for measuring cholinesterase activity, a substituted phenoxide or the like that can be directly detected by cholinesterase is produced, so that cholinesterase activity can be accurately measured.
[0028]
The novel compound can be used to measure cholinesterase activity in biological fluids, particularly serum and plasma. That is, by contacting the compound of the present invention with a cholinesterase as a substrate substance, a chromogenic substituted phenoxide or the like, dicarboxylic acid anhydride and choline (or thiocholine) are generated, and the chromogenic substituted phenoxide or the like is optically detected. Thus, the cholinesterase activity contained in the test sample can be quantitatively determined by performing an operation / calculation such as preparing a calibration curve using a cholinesterase sample in advance or determining the amount of change in absorbance per activity unit using the sample. be able to.
[0029]
More specifically, for example, a test sample such as serum is appropriately diluted with a conventionally known buffer having a pH of 7 to 10 (eg, Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good buffer, etc.). And a conventionally known buffer solution having a pH of 5 to 10 containing 0.05 to 100 mM of the substrate of the present invention (for example, citrate buffer solution, phosphate buffer solution, acetate buffer solution, Tris buffer). Solution, borate buffer solution, Good buffer solution, etc.), react, spectroscopically detect changes in absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm, and determine the amount of absorbance change per unit time (so-called rate assay method) Thus, cholinesterase activity can be determined with high accuracy.
[0030]
At this time, in order to promote dissociation of chromogenic substituted phenoxide, etc., α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, or basic functional groups (for example, diethylaminoethyl, dimethylaminoethyl, Alternatively, cyclodextrins into which a quaternary ammonium salt such as trimethylammonioethyl) has been introduced can also be present. In addition, when preparing these reagents as kits, various surfactants, preservatives, chelating agents, etc. that have been used for the purpose of preserving and avoiding the influence of interfering substances in the sample are appropriately added. The use is also encompassed by the present invention.
[0031]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, each organic solvent and each compound used in the following examples are commercially available reagent special grades.
Example 1: Synthesis of 3- (4-nitrophenoxycarbonyl) propionylcholine
A solution of 10.0 g (100 mmol) of succinic anhydride and 12.5 g (100 mmol) of 2-bromoethanol in benzene (40 ml) was heated to reflux for 4 hours. After cooling, the reaction solution was added to an aqueous sodium carbonate solution (an aqueous solution in which 14.8 g of sodium carbonate was dissolved in 400 ml of purified water), stirred, the aqueous phase was separated, the aqueous phase was washed with ether, and further 10% After acidifying with hydrochloric acid, extraction was performed with 300 ml of ether, and the extract was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated under reduced pressure, and further dried under vacuum to obtain precursor (1) [FIG. 16.1 g (yield: 71.1%) of 3- (2-bromoethoxycarbonyl) propionic acid as a white solid was obtained.
[0032]
Subsequently, 1 drop of dimethylformamide and 7.0 ml (99 mmol) of thionyl chloride are added to 14.8 g (66 mmol) of the above 3- (2-bromoethoxycarbonyl) propionic acid at room temperature, and the mixture is stirred for 15 minutes and then heated to reflux for 15 minutes. did. After cooling, 70 ml of dry benzene was added and concentrated under reduced pressure to remove excess thionyl chloride. To this residue, a solution of 9.2 g (66 mmol) of 4-nitrophenol and 70 ml of anhydrous ether in 6.5 ml (80 mmol) of anhydrous pyridine was added with stirring, reacted at room temperature for 30 minutes, and further heated to reflux for 60 minutes. After cooling, the reaction mixture was added to 350 ml of cold 10% hydrochloric acid and extracted with 700 ml of ether. The extract was washed with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine in that order, and dried over anhydrous sodium sulfate. Thereafter, it was concentrated under reduced pressure to obtain an oily substance. This was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 2: 1, Rf value = 0.39), and 3- (2-bromoethoxycarbonyl) propionic acid which is the precursor (2) [see FIG. 1]. 18.2 g (81% yield) of 4-nitrophenyl ester was obtained.
[0033]
  Sodium hydroxide was added to a solution of 15.0 g (43.3 mmol) of 3- (2-bromoethoxycarbonyl) propionic acid 4-nitrophenyl ester in 80 ml of anhydrous benzene.tubeThe trimethylamine gas dried through (generated by heating a 30% aqueous trimethylamine solution) was introduced under stirring for 3 days. The resulting precipitate was filtered off, washed with 100 ml of benzene, and dried under reduced pressure at room temperature. The solid obtained was recrystallized from acetone using activated carbon and further dried under reduced pressure to give 3- (4-nitrophenoxy). Carbonyl) propionylcholine bromide (hereinafter also referred to as ChE-I) was obtained as an almost white crystalline powder (7.67 g, total yield: 43.7%). This product is extremely soluble in water and is hygroscopic. The result of elemental analysis of the product is C₁₅H_{twenty one}N₂O₆Br (molecular weight: 405.25)¹H-NMR signal assignment results are shown in Table 1.
[0034]
Example 2: Synthesis of 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) butyrylcholine
By replacing the succinic anhydride of Example 1 with 11.4 g (100 mmol) of glutaric anhydride, the synthesis procedure described in Example 1 was repeated to obtain 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) butyrylcholine. 14.2 g (total yield 34%) of an almost white crystalline powder which was bromide (hereinafter also referred to as ChE-II) was obtained. This product is extremely soluble in water and is hygroscopic. The result of elemental analysis of the product is C₁₆H_{twenty three}N₂O₆Br (molecular weight: 419.27)¹H-NMR signal assignment results are shown in Table 1.
[0035]
Example 3: Synthesis of 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) -4,4-dimethylbutyrylcholine
By replacing the succinic anhydride of Example 1 with 14.2 g (100 mmol) of 2,2-dimethylglutaric anhydride, 4- (4-nitro) was repeated by repeating the synthesis procedure described in Example 1 above. There was obtained 8.5 g (total yield 19%) of a white solid which was a bromide of phenoxycarbonyl) -4,4-dimethylbutyrylcholine (hereinafter also referred to as ChE-III). The result of elemental analysis of this product is C₁₈H₂₇N₂O₆Br (molecular weight: 447.33)¹H-NMR signal assignment results are shown in Table 1.
[0036]
Example 4: Synthesis of 4- (4-nitrophenoxycarbonyl) -3,3-dimethylbutyrylcholine
By replacing the succinic anhydride of Example 1 with 14.2 g (100 mmol) of 3,3-dimethylglutaric anhydride, 4- (4-nitro) was repeated by repeating the synthesis procedure described in Example 1 above. Phenoxycarbonyl) -3,3-dimethylbutyrylcholine bromide (hereinafter also referred to as ChE-IV) (4.5 g, total yield: 10%) was obtained. The result of elemental analysis of this product is C₁₈H₂₇N₂O₆Br (molecular weight: 447.33)¹H-NMR signal assignment results are shown in Table 1.
[0037]
[Table 1]

[0038]
Example 5: Measurement of cholinesterase activity
(1) Cholinesterase standard sample
Human plasma-derived cholinesterase (Boehringer Mannheim, Inc .; containing about 100 U per vial using butyrylcholine as a substrate) is dissolved in 5 ml of physiological saline containing 0.1% bovine serum albumin, and further contains 0.1% bovine serum albumin when used. A sample diluted 10 times with physiological saline was used as a cholinesterase standard sample.
(2) Reagent 1
A pH 7.5 100 mM Tris buffer was prepared as reagent (1).
(3) Reagent 2
20 mM-2-morpholinoethanesulfonic acid buffer (MES) at pH 5.0 containing 5 mM of the synthetic substrate (ChE-I, ChE-II, ChE-III, or ChE-IV) prepared in each of Examples 1 to 4 above. Buffer) was prepared as reagent (2).
(4) Operation
An H-7150 type automatic analyzer (Hitachi, Ltd.) was used for the measurement of cholinesterase activity. The parameters at the time of measurement are as follows.

According to the above parameters, the measuring instrument dispenses and mixes 10 μl of cholinesterase standard sample and reagent (1) (320 μl), and after a constant temperature (37 ° C., 5 minutes), adds reagent (2) (80 μl). The reaction was started by mixing. The absorbance change (time course) at this time is shown in FIG. The symbols in FIG. 2 represent -E- represents ChE-I, -Δ- represents ChE-II,-□-represents ChE-III, and -O- represents ChE-IV. When a reagent containing the substrate of the present invention was added to the cholinesterase standard sample, an increase in absorbance derived from 4-nitrophenol produced from the substrate of the present invention due to the reaction between the cholinesterase and the substrate of the present invention was confirmed.
[0039]
Also, prepare a dilution series of cholinesterase standard sample, perform the same operation as above using the sample as a sample, and after 180 seconds from the addition of reagent (2), each substrate content for 120 seconds thereafter The absorbance change per unit time of the reagent was determined. The results are shown in FIG. In addition, symbols in FIG. 3 represent -E- represents ChE-I, -Δ- represents ChE-II,-□-represents ChE-III, and -O- represents ChE-IV, as described above. The amount of change in absorbance per unit time for each substrate for the dilution series of the cholinesterase standard sample shows linearity, and when cholinesterase reacts with each substrate according to the present invention, 4-nitrophenol is quantitatively produced. It was confirmed that From this result, it was confirmed that the cholinesterase activity in the test sample can be quantitatively measured using the novel substrate substance according to the present invention.
[0040]
Example 6: Measurement of cholinesterase activity in serum
According to Example 5, cholinesterase activity in the control serum (trade name: Serachem; manufactured by Instrumentation Laboratory Company) was measured. Namely, ChE-I was used as a substrate, and the others were performed according to the operation method of Example 5. For comparison, a similar test was performed using a conventional reagent for measuring cholinesterase (trade name: Iatrofine Ch-E rate; manufactured by Yatron, substrate material: butyrylthiocholine). However, the amount of the sample was changed to 3 μl, and the measurement wavelength was changed to 600 to 480 nm. Table 2 shows the measurement results obtained by repeating these tests 10 times. As shown in Table 2, the compounds of the present invention can be used as a substrate for measuring cholinesterase activity, and the cholinesterase activity in serum can be measured with high accuracy without any difference from conventional compounds.
[0041]
[Table 2]

[0042]
Example 7: Synthesis of 2- (4-nitrophenoxycarbonyl) benzoylcholine
By replacing the succinic anhydride of Example 1 with 13.6 g (100 mmol) of phthalic anhydride, the synthesis procedure described in Example 1 was repeated to obtain 2- (4-nitrophenoxycarbonyl) benzoylcholine. 10.2 g of an almost white crystalline powder (total yield 22.5%) was obtained. This product is easily soluble in water and is hygroscopic. The result of elemental analysis of this product is C₁₉H_{twenty one}N₂O₆It was Br (molecular weight: 453.29). A 20 mM MES buffer solution having a pH of 5.0 containing 5 mM of the product was prepared, reacted with a cholinesterase standard sample according to Example 5, and coloration derived from the released 4-nitrophenoxide was confirmed.
[0043]
Example 8: 4- (4-Nitrophenoxycarbonyl) propionylthiocholine Composition
4- (4-nitrophenoxycarbonyl) was obtained by repeating the synthesis procedure described in Example 1 except that 14.1 g (100 mmol) of 2-bromoethanethiol was used instead of 2-bromoethanol of Example 1. ) 7.8 g of a pale yellowish white powder (total yield 18.5%) which is a bromide of propionylthiocholine was obtained. This product was readily soluble in water. The result of elemental analysis of this product is C₁₅H_{twenty one}N₂O_FiveIt was SBr (molecular weight: 421.19). A 20 mM MES buffer solution having a pH of 5.0 containing 5 mM was prepared and reacted with a cholinesterase standard sample according to Example 5 to confirm the color development derived from the released 4-nitrophenoxide.
[0044]
【The invention's effect】
The compound according to the present invention is a substrate for cholinesterase and at the same time contains a chromogenic component in its structure, and when contacted with cholinesterase, it can release the chromogenic component to produce a chromogenic compound. . Moreover, the amount produced is proportional to the activity of the cholinesterase contacted with the compound of the present invention. Therefore, by monitoring the chromogenic compound, the cholinesterase activity can be directly measured, and more accurate measurement than the conventional method using an enzyme or reagent that induces the chromogenic system is possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing an example of a synthesis process of a novel compound of the present invention.
FIG. 2 is a graph (time course) showing a change in absorbance derived from a chromogenic compound produced when four kinds of novel compounds according to the present invention come into contact with a cholinesterase standard reagent.
FIG. 3 is a graph showing the amount of change in absorbance per unit time of a chromogenic compound produced when four kinds of novel compounds according to the present invention come into contact with a dilution column of a cholinesterase standard reagent.

Claims

Formula (I):
^{^{^{R 1 - O -OC-R 2}}} -CO-A 2 - (CH 2) 2 -N + (CH 3) 3 · X - (I)
[Wherein A ² is O or S;
R ¹ is
General formula (1):

(In the formula, R ¹¹ represents a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted group. A nitrophenylazo group, n is an integer of 1 to 4, and at least one of R ¹¹ is a nitro group, a lower alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted nitrophenylazo group, n And when R is 2 to 4, each R ¹¹ may be the same or different).
R ² is a phenylene group or an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms that may be substituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms , and X ⁻ is an anion.
A compound represented by

A method for measuring cholinesterase activity, comprising using the compound represented by formula (I) according to claim 1 as a substrate substance.

Use of the compound represented by the general formula (I) according to claim 1 as a substrate substance in cholinesterase activity measurement.