JP4000453B2 - Novel functional peptide nucleic acid and production method thereof - Google Patents

Description

によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
【０００６】
当初ＰＮＡには下記のようなｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化６】

が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化７】

が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、ｔＢｏｃ型の使用頻度は減少している。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないｔＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
【０００７】
これ以外にも、光機能性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（Peter E. Nielsen, GeraldHaaiman, Anne B. Eldrup PCT Int. Appl. (1998） WO 985295 A1 19981126, T. A. Tran, R.-H. Mattern, B. A. Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145,Jesper Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 503-509, Hans-georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen, et al. Pct Int. Appl. (1998) WO 9837232A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch, et al. (1998) Nucleic Acid Res., 26, 715-720）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化８】

【化９】

では効率良く合成できないと予想された。
【０００８】
したがって、一般に光機能性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合目的的な機能性PNAの合成方法、すなわち、（１）機能性PNAモノマーユニットの設計における、機能性分子のPNA背骨構造への効率的な導入、（２）コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および（３）遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化１０】

に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体6を用いて1のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体5と縮合してほぼ定量的に光機能性ＰＮＡモノマー4を合成する方法を見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体6の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
【００１１】
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってPNAプローブとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
【００１２】
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（Oliver Seitz; Tetrahedron Letters 1999, 40, 4161-4164.）。
【化１１】

【００１３】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
【００１４】
例えば、下図に示すように、市販されている光機能性分子のsuccinimideエステルを導入することはできず、導入するためにはFmoc-Gly等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化１２】

【００１５】
また、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでDNAオリゴマー・RNAオリゴマー・PNAオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているDNA/RNAオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
【００１６】
一方PNAオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、PNAオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
【００１７】
しかし、そのような処理を施してPNAオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞1個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの開発が有用であると考えられている。
【００１８】
なお、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブは既に存在する。例えば、（１）膜透過性機能を有するオリゴペプチドをPNAに結合させたもの、（２）膜透過性機能を有するリン脂質をPNAに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりPNA以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なPNAプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性ＰＮＡを提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーにおいて、Ｆｍｏｃ基及び／又はＢｏｃ基と結合している２級アミノ基（−ＮＨ−）に対し、遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法に関する。
【００２２】
また、本発明は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルと^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとの反応によって製造されたものであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルが、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノールとの反応によって製造されたものであることを特徴とする、前記方法に関する。
【００２３】
さらにまた、本発明は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする、前記方法に関する。
またさらに、本発明は、導入される機能性分子が、光機能性分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子および分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする、、前記方法に関する。
また、本発明は、導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
そして、本発明は、光機能性分子が、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸であることを特徴とする、前記方法に関する。
【００２４】
また、本発明は、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、Ｚ基であることを特徴とする、前記方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、ＰＮＡオリゴマーの合成が、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
またさらに、本発明は、ｔＢｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらにまた、本発明は、遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする、前記方法に関する。
【００２６】
また、本発明は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（I）
【化１３】

（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２７】
また、本発明は、下記ａ）〜ｄ）：
ａ）Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルを製造する工程において、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノールとを反応させること；
ｂ）Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを製造する工程において、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルを^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させることによってＦｍｏｃ−ω−アミノ基を^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨに導入すること；
ｃ）Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨからＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；および
ｄ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われる行うこと、
の１または２以上を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
【００２８】
そして、本発明は、下記一般式（I）
【化１４】

（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物に関する。
【００２９】
そしてさらに、本発明は、一般式（I）
【化１５】

（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物を製造する方法であって、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸をペンタフルオロフェノールと反応させ、その反応物を^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させることによってＦｍｏｃ−ω−アミノ基を導入することを特徴とする、前記方法に関する。
【００３０】
そして、本発明は、下記一般式（II）
【化１６】

（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ^１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２およびＺ_１〜Ｚ_５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３≧０であり、Ｙ_１＋Ｙ_２＞０であり、Ｚ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５≧０である。ただし、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３およびＺ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５が同時に０であることはなく、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３＝０の場合、Ｒ^１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表され、機能性カルボン酸誘導体が水溶性アミノ酸の誘導体、活性エステル型蛍光標識化合物の誘導体の少なくとも何れか一方であることに基づく化合物に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、水溶性アミノ酸が、アルギニン、リジン、セリンの何れかであることを特徴とする、前記化合物に関する。
また、本発明は、活性エステル型蛍光標識化合物がＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌの何れかであることを特徴とする、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、機能性カルボン酸誘導体として、水溶性アミノ酸の誘導体、及び活性エステル型蛍光標識化合物の誘導体の双方を採用することによって膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブ機能を有している、前記化合物に関する。
また、本発明は、水溶性アミノ酸がアルギニンであり、活性エステル型蛍光標識化合物がＦＩＴＣであることを特徴とする、前記化合物に関する。
【００３２】
また、本発明は、Ｘ_１＝Ｚ_１＝１であることを特徴とする、前記膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブによる化合物に関する。
さらに、本発明は、Ｙ_１≧２であり、Ｚ_２＝１であることを特徴とする、前記膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブによる化合物に関する。
またさらに、本発明は、ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、前記膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブによる化合物に関する。
また、本発明は、Ｒ^１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブによる化合物に関する。
【００３３】
本発明は、ＰＮＡ背骨構造にFmoc−ω−アミノ酸を導入した前駆体的PNAモノマーユニット、すなわちＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨをＰＮＡオリゴマーに導入した後、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に光機能性PNAオリゴマーを合成できることに成功したものである。
【００３４】
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のsuccinimideエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
【００３５】
また、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができる。したがって、本発明による製造方法によれば、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
【００３６】
本発明の方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（II）
【化１７】

（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ^１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２およびＺ_１〜Ｚ_５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３≧０であり、Ｙ_１＋Ｙ_２＞０であり、Ｚ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５≧０である。ただし、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３およびＺ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５が同時に０であることはなく、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３＝０の場合、Ｒ^１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５＝０であり、Ｒ^１が水素原子である化合物を挙げることができる。
【００３７】
本発明によれば、前記一般式（II）で表される化合物において同一または異なる機能性分子を、任意の複数の位置に導入することも可能となる。すなわち、前記前駆体的PNAモノマーユニットを用いてＰＮＡオリゴマーを導入した後、ピペリジン処理と機能性分子のポスト合成的導入を一括して行うことによるものであるが、これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過機能を向上させるアンテナペディアを高速に設計する上で、欠かせないものである。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
【００３８】
このように製造される化合物の例として、前記一般式（II）において、Ｚ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５＞０であり、Ｒが細胞膜透過性分子誘導体であり、Ｒ^１が機能性カルボン酸誘導体であるものが挙げられる。
【００３９】
このプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位（Ｚ_１〜Ｚ_５の添字付きで表される部分）を介して結合させた形をしている。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
【００４０】
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。このものの特徴は、既に国内特許出願を行っている一般式（I）で表される新規ＰＮＡユニットを膜透過性機能領域部に用いていることである。該一般式（I）で表される新規ＰＮＡユニットは機能性分子をポスト合成的に導入するために開発された前駆体ユニットであり、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子を一括導入できることを特徴としている。
【００４１】
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
このような機能性分子として、Naphthalimide型、Flavin型、Dabcyl型、Biotin型、FAM型、Rhodamine型、TAMRA型、ROX型、HABA型、Pyrene型、Coumarine型等の光機能性モノマーユニット、膜透過機能性分子、臓器選択機能性分子、殺菌機能性分子および分子認識機能性分子等が挙げられる。
【００４２】
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光機能性のみならず、膜透過性、臓器選択性、殺菌機能性および分子認識機能性等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖等を含むものも意味するものである。
【００４３】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【００４４】
本発明によるオリゴＰＮＡを合成するルートは、典型的には、下図
【化１８】

に示すとおりである。
【００４５】
まず、必要に応じて、下図
【化１９】

に示すように、Fmoc−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノール（ＰｆｐＯＨ）とを反応させて得られるＦｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐ）とから、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを合成する。
以後の工程において用いる該Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐの溶液を得るには、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはアセトン等と水とを含む水溶性溶媒したものいずれも好適に用いることができる。前記水溶性溶媒を用いた場合には、精製等の後処理の面におけるメリットを有するものである。
【００４６】
前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とＰｆｐＯＨをＤＭＦ溶液中にてＤＣＣを加えて反応させることによって、例えば下記式（III）
【化２０】

（式中、ｎは１〜１５の整数を表す）で表されるものが得られる。
【００４７】
次いで、これに^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのＤＭＦ溶液にジイソプロピルエチルアミンとともに添加し、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを得る。
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨは、ＰＮＡモノマーユニットの前駆体として機能するため、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと呼ぶことができる。
式（I）において、ｎとしては１〜１５までの整数を適宜選択できるが、ｎの値が大きい方が、ハイブリッド形成時の立体的反発（あるいは障害）を軽減する点において好ましい。
【００４８】
次に、下図
【化２１】

に示すように、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いて、オリゴマーＩａを合成する。具体的には、Ｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
【００４９】
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めｔＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、ｔＢｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
【００５０】
次に、下図
【化２２】

に示すように、ピペリジン処理によってFmoc基を選択的に脱保護してアミノ基とし、Ｉｂを得て、さらに、下図
【化２３】

に示すように、該Ｉｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
【００５１】
また、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、２０〜４０分が好適であり、最も好適には３０分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
【００５２】
なお、機能性分子の導入は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく（第１法）、あるいは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい（第２法）。
【００５３】
最後に、下図
【化２４】

に示すように、担体レジンからの切り出しとZ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマーＩｄを得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、TFA/TFMSA/p-cresol/Thioanisole＝60/25/10/10のような一般的な条件において好適に行われる。
【００５４】
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また一旦Ｉａを合成した後に種々の機能性分子が導入可能であるため、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブ合成が可能である。
【００５５】
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−^ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとＰＮＡ鎖を有する分子との反応を含む本発明による方法によれば、下記一般式（II）
【化２５】

（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ^１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２およびＺ_１〜Ｚ_５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３≧０であり、Ｙ_１＋Ｙ_２＞０であり、Ｚ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５≧０である。ただし、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３およびＺ_１＋Ｚ_２＋Ｚ_３＋Ｚ_４＋Ｚ_５が同時に０であることはなく、Ｘ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３＝０の場合、Ｒ^１は機能性カルボン酸誘導体である。）に示され、かつ機能性カルボン酸誘導体が水溶性アミノ酸の誘導体、活性エステル型蛍光標識化合物誘導体の少なくとも何れか一方であることに基づく化合物等が好適に合成される。
【００５６】
本発明の方法によって、式（II）で表される化合物として、例えば、Ｒがメチルレッドのカルボン酸誘導体を含むもの、さらにＸ_１＋Ｘ_２＋Ｘ_３＝９であり、Ｙ_１＋Ｙ_２＝１であるもの、またはＸ_１＝３、Ｘ_２＝６であり、Ｙ_１＝１であるもの等が、特に好適に合成される。
【００５７】
また、前記一般式（II）で表される化合物において、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、ＲまたはＲ^１が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、Ｒが細胞膜透過性機能分子誘導体等であり、Ｒ^１が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。このような化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
【化２６】

【００５８】
このような化合物は、例えば前記一般式（II）において、Ｘ_１＝Ｚ_１＝Ｚ_２＝１であり、かつＹ_１≧２である化合物である。このような化合物は合成のしやすさおよび合成コストの面等において好適である。
上記化合物において、ａ、ｂおよびｆはそれぞれ０〜１０の整数であれば特に限定されないが、例えばａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であるものであっても、合成上および実用上のいずれにおいても支障はない。
【００５９】
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防ぐための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式（I）におけるｆ〜ｈを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
【００６０】
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばKoch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. PeptideRes. 1997, 49, 80-88.を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
【００６１】
１の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。このような膜透過性機能部位は、前回特許前記一般式（I）で表される化合物を用いることにより、同様に導入することができる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リジンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
【００６３】
また、Fmocアミノ酸ユニットを利用することによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。その合成例は実施例２０および２１にも示した。しかしながら、上記２化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６４】
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
【００６５】
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子等も、本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【００６６】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）Fmoc-Gly-^BocPNA-OHの合成（１）
Fmoc-Gly-OH (891 mg, 3.0 mmol) とPfpOH (754 mg, 4.5 mmol)のDMF溶液(12mL)にDCC (845 mg, 4.5 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣を^ＢｏｃPNA-OH (436 mg, 2.0 mmol)のDMF溶液(16 mL)にdiisopropylethylamine (445 μL, 2.6 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-50% MeOH/CH_２Cl_２）により精製しFmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OH (121 mg, 12%)を得た。¹H NMR (DMSO-d_６)δ 7.88 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.62 (brt) and 7.56 (brt) (1 H), 7.41 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.85 (brt) and 6.79 (brt) (1 H), 4.35 - 4.15 (m, 3 H), 4.05 - 3.85 (m, 3 H), 3.77 (m, 1 H), 3.40 - 3.25 (m, 2 H), 3.10 (m) and 3.03 (s) (2 H), 1.37 (brs, 9 H); ¹³C NMR (DMSO-d_６) δ172.2 (d), 169.10 (d), 156.34 (d), 155.58 (d), 143.83, 140.66, 127.58, 127.04, 125.24, 120.04, 77.77 (d), 65.71, 47.34 (d), 46.72, 46.65 (d), 29.23 (d), 28.14 (d); FABMS m/z 498 [(M+H)⁺].
【００６７】
（実施例２) Fmoc-C₇-OPfpの合成
Fmoc-C₇-OH(381.9 mg，1.0 mmol)とPfpOH(349.7 mg、1.9 mmol)のDMF溶液(2.5mL)にDCC(392.0 mg，1.9 mmol)を氷冷下で加え、この反応液を0 ℃で30分次いで室温で一晩攪拌した。反応終了後DCUreaを濾別して濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法(CH₂Cl₂)により精製した後、Hexaneで再結晶し白色粉末としてFmoc-C₇-OPfp (537.5 mg，98%)を得た。¹H-NMR (CDCl₃)δ7.76(d，J= 7.6 Hz, 2 H)，7.59 (d，J = 7.6 Hz, 2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.31 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，4.70 - 4.73 (brt，1 H)，4.47 - 4.40 (brd，2 H)，4.22 (t，J = 6.42 Hz, 1 H)，3.20 (q，J = 5.94 Hz, 2 H)，2.66 (t，J = 7.38 Hz, 2 H)，1.80 - 1.75 (m，2 H)，1.55 - 1.50 (m，2 H)，1.45 - 1.34 (m，6 H); ¹³C-NMR (CDCl₃)δ 169.44, 156.43, 143.98, 141.96(m), 141.29, 140.23, 138.67(m), 136.99(m), 127.60, 126.96, 124.97, 119.91, 66.49, 55.73,47.29, 41.34(d), 34.89, 33.22, 29.85, 28.70, 26.42, 25.43, 24.60 ;HRMS(FAB⁺) calcd. for C₂₉H₂₇F₅NO₄ [(M+H)⁺] 547.5131 observed 548.1861.
【００６８】
(実施例３) Fmoc-Gly-^BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(６.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-Gly-OPfp (240.9 mg，0.52 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で6時間攪拌した。氷冷した１ N塩酸で冷却した反応溶液をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)及びLH-20(MeOH)で精製した。この後、塩化メチレンに溶かし、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-Gly-^BocPNA-OH (157.3 mg，80%)を得た。
【００６９】
（実施例４）Fmoc-β-Ala-^ＢｏｃPNA-OHの合成（１）
Fmoc-β-Ala-OH (311 mg, 1.0 mmol)とPfpOH (334 mg, 1.75 mmol)のDMF溶液(2.5 mL)にDCC (288 mg, 1.4 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（CH_２Cl_２）により精製した。これをHexaneとCH_２Cl_２で再結晶し、白色粉末としてFmoc-β-Ala-OPfp (429 mg, 90%) を得た。Fmoc-β-Ala-OPfp(100 mg, 0.21 mmol)と^ＢｏｃPNA-OH (41 mg, 0.19 mmol)のDMF溶液(2 mL)にdiisopropylethylamine (36 μL, 0.21 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-10% MeOH/CH_２Cl_２）により精製しFmoc-β-Ala-^ＢｏｃPNA-OH (41 mg, 42%)を得た。¹H NMR (DMSO-d_６)δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.41 (t, J= 7.3 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.83 (brt) and6.72 (brt) (2 H), 4.3 - 4.2 (m, 4 H), 4.05 - 3.9 (m, 3 H), 3.33 (brt) and 3.29 (brt) (2 H), 3.19 (m, 2 H), 3.07 (brq) and 3.02 (brq) (2 H), 1.36 (brs, 9 H); ¹³C NMR (DMSO-d₆) δ171.20 (d), 170.85 (d), 155.93, 155.56, 143.87, 140.69, 127.55, 127.01, 125.09, 120.05, 77.73 (d), 65.30 (d),59.69, 47.35 (d), 46.68, 46.49 (d), 37.99 (d), 36.72 (d), 28.14 (d).
【００７０】
(実施例５）Fmoc-β-Ala-^BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(1.25 mL)と水(1.25 mL)の混合溶液にNaHCO₃(92.4 mg，1.1 mmol)を加え、Fmoc-β-Ala-OPfp (476.0 mg，1.0 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.55 mmol)を溶解し、室温で6時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、反応液に1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。この後、塩化メチレンに溶かし、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-β-Ala-^BocPNA-OH (225.9 mg，80%)を得た。
【００７１】
（実施例６）Fmoc-GABA-^ＢｏｃPNA-OHの合成（１）
Fmoc-GABA-OPfp (100 mg, 0.20 mmol)と^ＢｏｃPNA-OH (40 mg, 0.18 mmol)のDMF溶液(2 mL)にdiisopropylethylamine (34 μL, 0.20 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-20% MeOH/CH_２Cl_２）により精製しFmoc-GABA-^ＢｏｃPNA-OH (43 mg, 45%)を得た。¹H NMR (DMSO-d₆)δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H),7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.29 (m, 1 H), 6.82 (brt) and 6.71 (brt) (1 H), 4.3 - 4.2 (m, 4 H), 4.05 - 3.9 (m, 3 H),3.35 - 3.25 (m, 2 H), 3.1 - 2.95 (m, 4 H), 1.36 (brs, 9 H); ¹³C NMR (DMSO-d_６) δ172.2 (d), 171.5 (d), 156.03, 155.60 (d), 143.89, 140.68, 127.54, 127.00, 125.50, 120.04, 77.70 (d), 65.19, 54.84, 47.89 (d), 46.97 (d), 46.72, 38.20 (d), 29.23 (d), 28.14 (d), 24.98 (d).
【００７２】
（実施例７）Fmoc-GABA-OPfpの合成
Fmoc-GABA-OH (325 mg, 1.0 mmol)とPfpOH (221 mg, 1.2 mmol)のDMF溶液(2.5mL)にDCC (248 mg, 1.2 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（CH_２Cl_２）により精製し、白色粉末としてFmoc-GABA-OPfp (463mg, 94%) を得た。¹H NMR (CDCl₃)δ7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.59 (d, J =7.5 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.31 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 4.85 (brs, 1 H), 4.45 (d, J = 6.3 Hz, 2 H), 4.21 (t, J = 6.3 Hz, 2 H), 3.32(d, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 1.98 (t, J = 6.5 Hz, 2H); ¹³C NMR（CDCl₃）δ169.02, 156.49, 143.83, 141.87 (m), 141.28, 140.23 (m), 138.61 (m), 136.94 (m), 127.62, 127.46, 124.89, 119.88, 66.52, 47.25, 39.92, 30.42, 25.03.
【００７３】
(実施例８) Fmoc-ＧＡＢＡ-^BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(5.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃ (67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-ＧＡＢＡ-OPfp (255.5 mg，0.52 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で8時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、反応液に1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-ＧＡＢＡ-^BocPNA-OH (175.9 mg，84%)を得た。
【００７４】
(実施例９) Fmoc-C₄-^BocPNA-OHの合成
アセトン(４.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₄-OPfp (323.5 mg，0.64 mmol)と^BocPNA-OH(87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で12時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-C₄-^BocPNA-OH (190.7 mg，88%)を得た。¹H-NMR(CDCl₃) δ7.76(d，J = 6.7 Hz, 2 H)，6.96 (mi) and 6.66 (ma) (brd, J = 6.7 Hz, 2 H), 7.41 - 7.37(m, 2 H), 7.32 ‐ 7.28(m，2 H), 7.14 (ma) and 6.68 (mi) (m, 1 H), 5.54 (ma) and 5.43 (mi) (brt, 1 H), 4.45(mi) and 4.37(ma) (m, 2 H), 4.24 - 4.21 (m, 1 H)，4.08 - 3.95 (m，2 H)，3.54 - 3.48 (m，2 H)，3.29 - 3.11 (m, 4 H)，2.43 - 2.25 (m, 2 H)，1.70 - 1.29 (m，13 H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 174.39，173.07，171.95，157.51，156.79(d)，156.11，144.06(d)，141.16，127.46(d)，126.90(d)，119.77(d), 81.42，79.67，66.39(d)，53.35，49.46(d)，49.17，48.60，47.15(d), 40.89，40.32(d)，38.68，31.87，31.41，29.59，29.11(d)，28.28，21.77(d); HRMS (FAB⁺) calcd. for C₂₉H₃₇N₃O₇ [(M+H)⁺] 539.2632 observed 540.2707.
【００７５】
(実施例１０) Fmoc-C₅-^BocPNA-OHの合成
アセトン(7.5 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₅-OPfp (311.0 mg，0.6 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとして、Fmoc-C₅-^BocPNA-OH (198.0 mg，90%)を得た。¹H-NMR (DMSO-d₆)δ 7.88(d，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.68 (d, J =7.2 Hz，2 H)，7.41 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.32 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.22(brt，1 H)，6.81 (ma) and 6.67 (mi) (brt, 1 H)，4.33 (mi) and 4.29 (ma)(brd，2 H)，4.20 (t，J = 7.1 Hz, 1 H)，4.08 (mi) and 3.90 (ma) (brs，2H)，3.09 - 2.94 (m，4 H)，2.30 (ma) and2.14 (mi) (brt，2 H)，1.51 - 1.45(m，2 H)，1.41 - 1.31 (brs，11 H)，1.29-1.21 (m，8 H); ¹³C-NMR (CDCl₃)δ175.1(d)，172.27(d)，157.20(t)，156.63，144.43(d)，141.69，128.07，127.45，125.40(d)，120.35，81.71，80.00，67.36(d)，50.42，49.81(d)，48.90(d)，47.82(d)，41.77，41.16，40.64，39.19，33.12，32.75，29.45(d)，28.81，26.59，24.97，24.70; HRMS (FAB⁺) calcd. for C₃₀H₃₉N₃O₇ [(M+H)⁺] 553.2788observed 554.2873.
【００７６】
(実施例１１) Fmoc-C₆-^BocPNA-OHの合成
アセトン(6.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₆-OPfp (331.9 mg，0.6 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C₆-^BocPNA-OH (197.0 mg，87%)を得た。¹H-NMR (DMSO-d₆)δ7.88 (d，J =7.7 Hz, 2 H)，7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd，J = 7.4 Hz，2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz，2 H), 7.32 (t, J =7.4 Hz，2 H), 7.22 (brt, 1 H), 6.79 (ma) and 6.66 (mi) (brt, 1 H), 4.39(mi) and 4.29 (ma) (brt, 2 H), 4.20 (t, J = 6.7 Hz，1 H) 4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs, 2 H), 3.10 - 2.97 (m， 4 H)，2.31 (ma) and 2.15 (mi) (brt，2 H)，1.50 - 1.47(m，2 H)，1.41 - 1.36(m，11 H)，1.28-1.24(brd，6 H);¹³C-NMR (CDCl₃)δ175.23(d)，172.41(d)，157.11(d)，156.60，144.34(d)，141.69，128.07，127.45，125.40(d)，120.35，81.68，80.00(d)，67.72，67.50(d)，53.87，50.77，50.14(d)，48.90，47.82(d)，41.29(d)，41.36，40.69，39.18，33.19，32.96，30.00，29.11，28.81，26.75(d)，25.27(d)，24.80(d); HRMS(FAB⁺) calcd. for C₂₉H₄₁N₃O₇ [(M+H)⁺] 567.2945 observed 568.3027.
【００７７】
(実施例１２) Fmoc-C₇-^BocPNA-OHの合成
アセトン(7.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₇-OPfp (328.5 mg，0.6 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C₇-^BocPNA-OH (196.1 mg，84%)を得た。¹H-NMR (DMSO-d₆);δ7.88(d，J = 7.7 Hz，2 H)，7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd，J = 7.4 Hz，2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz，2 H)，7.32 (t，J =7.4 Hz，2 H)，7.22 (brt，1 H)，6.79 (ma) and 6.79 (mi) (brt，1 H)，4.39(mi) and 4.29(ma) (brd，J = 6.9 Hz，2 H)，4.05 (t，J = 6.7 Hz，1 H)，4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs，2 H)，3.12 - 2.95 (m，4 H)，2.31 (mi) and 2.15 (ma) (brt，2 H)，1.50 - 1.47 (m，2 H)，1.42 - 1.34 (m，11 H)，1.25 (brd，2 H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 174.72，172.19，156.52，156.05，143.78(d)，141.14，127.51, 126.89, 124.86(d), 119.79, 79.43(d)，66.80(d)，53.33，50.19，49.20, 48.50，47.14(d)，41.18(d), 38.60，32.28(d)，29.60, 28.83，28.26, 26.27(d)，24.68(d)，21.77(d); HRMS (FAB⁺) calcd. for C₃₂H₄₃N₃O₇ [(M+H)⁺] 581.3101 observed 582.3171.
【００７８】
(実施例１３) Fmoc-C₁₀-^BocPNA-OH
アセトン(7.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₁₀-OPfp (353.7 mg，0.6 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C₁₀-^BocPNA-OH (218.5 mg，88%)を得た。¹H-NMR (CDCl₃)δ9.60 (brs，1 H)，7.73 (d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.58 (d，J = 6.8 Hz，2 H)，7.37 (t，J = 6.8 Hz，2 H)，7.29 (t，J = 7.2Hz，2 H)，5.52 (ma) and 5.35 (mi) (brd，1 H)，5.00 (s，1 H)，4.45 (mi)and 4.40 (ma) (brd，J = 6.4 Hz，2 H)，4.23 - 4.22 (m，1 H)，4.09 (mi) and 4.04 (ma) (brs，2 H)，3.57 - 3.46 (m，2 H)，3.29 - 3.03 (m，4 H)，1.66- 1.58 (brs，2 H)，1.52 - 1.37 (m，11 H)，1.33 - 1.20 (brs，12 H); ¹³C-NMR (CDCl₃)δ174.5(d)，172.43(d)，171.64(d)，157.83(d)，156.98，156.03，143.78(d)，141.17，127.52，126.90，124.86(d)，119.70(d)，81.08，79.43(d)，67.26，66.43，50.14，49.29，48.145(d)，47.17(t)，41.47，40.99，40.16，38.63，32.90，32.43(d)，29.55(d)，29.22(m)，28.28，26.56(d)，24.98，24.75; HRMS (FAB⁺) calcd. for C₃₅H₄₉N₃O₇[(M+H)⁺] 623.3571 observed 624.3643.
【００７９】
(実施例１４)Fmoc-C₁₁-OPfpの合成
Fmoc-C₁₁-OH (437.5 mg，2.0 mmol)とPfpOH(276.6 mg，3.0 mmol)のDMF溶液(2.5 mL)にDCC(309.5 mg，3.0 mmol)を氷冷下で加え、この反応液を0 ℃で30分次いで室温で18時間攪拌した。反応終了後DCUreaを濾別して濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法(CH₂Cl₂)により精製した後、Hexaneで再結晶し白色粉末としてFmoc-C₁₁-OPfp (575.6 mg，96%)を得た。¹H-NMR (CDCl₃)δ7.79(d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.63 (d，J = 7.2 Hz, 2 H)，7.43 (t，J =7.6 Hz, 2 H)，7.34 (t，J = 7.2 Hz, 2 H)，4.86 (brt，1 H)，4.47 (mi) and 4.44 (ma)(brd，2 H)，4.25 (t，1 H)，3.22 (q，J = 6.1 Hz, 2 H)，2.68 (t，J = 7.2 Hz, 2 H)，1.80 (m，2 H)，1.56 - 1.52 (m，2 H)，1.47 - 1.42 (m，2 H)，1.39- 1.30 (m，12 H); HRMS (FAB⁺) calcd. for C₃₃H₃₄F₅NO₄ [(M+H)⁺]603.6194 observed 604.2490.
【００８０】
(実施例１５) Fmoc-C₁₁-^BocPNA-OH
アセトン(10 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO₃(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C₁₁-OPfp (362.2 mg，0.6 mmol)と^BocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で48時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH₂Cl₂)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C₁₁-^BocPNA-OH (227.6 mg，89%)を得た。¹H-NMR (CDCl₃);δ9.62 (brs，1 H)，7.74 (d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.57 (d，J = 7.5 Hz，2 H)，7.37 (t，J = 7.1 Hz，2 H)，7.28 (t，J = 6.8Hz，2 H)，5.53 (ma) and 5.35 (mi) (brs，H)，5.00 (brt，1 H)，4.43 (mi)and 4.37 (ma) (brd，J = 6.4 Hz，2 H)，4.22 - 4.19 (m，1 H)，4.06 (mi) and 4.01 (ma) (brs，2 H)，3.51 - 3.44 (m，2 H)，3.23 - 3.08 (m，4 H)，2.36(ma) and 2.21 (mi) (brt，J = 7.0 Hz，2 H)，1.69 - 1.58 (brs，2 H)，1.52- 1.40 (m，11 H)，1.29 - 1.25 (brd，14 H); ¹³C-NMR (CDCl₃)δ175.45(d)，172.428(d)，157.91(d)，157.01，156.57，144.33(d)，141.72，128.05，127.43，125.40(d)，120.35，81.63，80.00(d)，67.77，66.97，50.67，49.84，49.20(d)，47.72(t)，42.10，41.53，40.70，39.18，33.51，33.07，30.032，29.83(m)，28.82，27.00(d)，25.44，25.35; HRMS (FAB⁺) calcd. for C₃₆H₅₁N₃O₇ [(M+H)⁺] 637.3727 observed 638.3794.
【００８１】
（実施例１６）PNA oligo 1（H₂N-G-A-T-pMR-G-A-C-G-C-CONH₂）の合成（第１法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。この間、Fmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OHを縮合した際には、次のチミジンPNAモノマーユニットと縮合する前に、まずピペリジン処理（20% piperidine in DMF 3 mL、室温３０分）してFmoc基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてp-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、チミジン、アデニン、グアニンのPNAモノマーユニットを逐次縮合したあと、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H₂O) 303, 548 (nm)。
【００８２】
（実施例１７）PNA oligo 1の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてp-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H₂O) 302, 550 (nm)。
【００８３】
（実施例１８）PNA oligo 2（H₂N-G-A-T-mMR-G-A-C-G-C-CONH₂）の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてm-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 2を得た。UVλmax (H₂O) 308, 570 (nm)。
【００８４】
（実施例１９）PNA oligo 3（H₂N-G-A-T-oMR-G-A-C-G-C-CONH₂）の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-^ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてo-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H₂O) 302, 561 (nm)。
【００８５】
（実施例２０）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブ（１）の合成
【化２７】

前記第２法を用いた。
標準的tBoc法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（50 mg）にチミンPNAモノマーユニット（7.7 mg、20 mmol）、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω‐アミノ酸Boc-7-aminoheptanoic Acid（5.2 mg、20 mmol）、Fmoc-Ahx-^BocPNA-OH（10.0 mg、20 mmol）と再度Boc-7-aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてFmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
TFA処理（95% TFA/5% m-cresol）によりBoc基を脱保護した後、FITC（9.3 mg,25 mmol）をDIEA（17.4 mL, 100 mmol）存在下、室温で12時間振盪し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）して残るFmoc基を脱保護した後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI-TOF MS: calcd. 2096.26 (M + H⁺), found 2096.36.
【００８６】
（実施例２１）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブ（２）の合成
【化２８】

標準的tBoc法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（50 mg）にチミンPNAモノマーユニット（7.7 mg、20 mmol）、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω‐アミノ酸Boc-7-aminoheptanoic Acid（5.2 mg、20 mmol）、Fmoc-Ahx-^BocPNA-OH（10.0 mg、20 mmol）と再度Boc-7-aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてFmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した後、再度Fmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の追加導入）。
TFA処理（95% TFA/5% m-cresol）によりBoc基を脱保護した後、FITC（9.3 mg, 25 mmol）をDIEA（17.4 mL, 100 mmol）存在下、室温で12時間振盪し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）して残るFmoc基を脱保護した後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI-TOF MS: calcd. 2252.44 (M + H⁺), found 2252.33.
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、光機能性分子に限定されることない多種多様な機能性分子を、PNA中に容易に導入することができ、多種多様な機能性分子をPNA中に容易かつ効率的に導入することができ、遺伝子治療などに用いられる種々のＰＮＡの構築が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
【図２】２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel method for producing a functional peptide nucleic acid monomer, a functional peptide nucleic acid oligomer produced by the production method, and an intermediate thereof. More specifically, the present invention relates to the above production method, wherein one or more functional molecules are introduced post-synthetically after the precursor PNA monomer unit is introduced into the PNA oligomer.
[0002]
[Prior art]
Nucleic acids are DNA and RNA that govern the genetic information of an organism. In contrast, peptide nucleic acid (PNA) is a modified nucleic acid obtained by converting the sugar phosphate skeleton of a nucleic acid into an N- (2-aminoethyl) glycine skeleton (FIG. 1). Although the sugar phosphate skeleton of DNA / RNA is negatively charged under neutral conditions and there is electrostatic repulsion between complementary strands, the backbone structure of PNA originally has no charge, so there is no electrostatic repulsion . Therefore, PNA has a higher ability to form a double strand and a higher ability to recognize a base sequence as compared with conventional nucleic acids. Furthermore, PNA is very stable against in vivo nuclease / protease and cannot be decomposed. Therefore, its application to gene therapy as an antisense molecule has been studied.
[0003]
By converting the conventional DNA-based technology into PNA, it has become possible to compensate for the disadvantages of DNA that could not be overcome. For example, the “DNA microarray technology” for systematic analysis of genetic information at high speed and in large quantities and the “molecular beacon” recently developed as a probe that can detect the specific recognition of the base sequence by fluorescence emission It is possible to apply. Since these all use DNA with poor enzyme resistance as a medium, strict sampling is required when using these techniques. Satisfying this requirement is the key to advancing the above-described technology.
[0004]
On the other hand, since PNA is completely resistant to enzymes, it is expected that substitution of PNA for DNA in DNA microarray technology and molecular beacons will overcome the disadvantages of the technology and bring out further advantages.
In addition to DNA microarray technology and molecular beacons, there are many fields that are expected to develop as a result of PNA conversion. In these fields, PNA is efficiently functionalized, that is, new by efficient introduction of functional molecules into PNA monomers. New PNA monomer design is required.
[0005]
Since the usual solid phase peptide synthesis method is used for the synthesis method of the PNA oligomer, if the PNA monomer unit is classified according to the backbone structure of PNA, two types of Fmoc type PNA monomer unit and tBoc type PNA monomer unit are included (FIG. 2). ).
Since the synthesis method of the Fmoc type PNA monomer unit has already been established and the synthesis of the oligomer can be performed by a general DNA automatic synthesizer, the following route is used.
[Chemical formula 5]

Enables synthesis on a small scale.
[0006]
Initially, PNA has the following tBoc type PNA monomer units
[Chemical 6]

And then a more efficient synthesis method
[Chemical 7]

Was established. However, since the Fmoc type that is easy to handle has been developed as described above, the frequency of use of the tBoc type is decreasing.
However, when introducing functional molecules other than guanine, thymine, cytosine, and adenine four types of nucleobases, for example, when introducing a photofunctional molecule, the introduced functional molecule may be unstable under alkaline conditions. Since there are many, the usefulness of the tBoc type | mold PNA backbone structure which does not use alkaline conditions is high. Regarding the “method for producing t-butoxycarbonylaminoethylamine and amino acid derivative”, the present inventors have already applied for a patent as Japanese Patent Application No. 2000-268638.
[0007]
In addition to this, five examples of synthesis of monomer units of optical functional oligo PNA have been known in the past. All of these use the above route, but the yield is not described or very low (Peter E. Nielsen, Gerald Haaiman, Anne B. Eldrup PCT Int. Appl. (1998) WO 985295 A1 19981126, TA Tran, R.-H. Mattern, BA Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145, Jesper Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 503-509, Hans- Georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen, et al. Pct Int. Appl. (1998) WO 9837232A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch, et al. (1998) Nucleic Acid Res., 26, 715-720). In addition, since the structure of the compound used is characterized by being relatively stable to alkaline conditions, when an unstable chromophore is attached to alkaline conditions, a method similar to the above-described conventional method, that is, the following route A
[Chemical 8]

[Chemical 9]

Therefore, it was predicted that it could not be synthesized efficiently.
[0008]
Therefore, in general, functional molecules such as photofunctional molecules are often expensive, and therefore, more suitable functional PNA synthesis methods, that is, (1) functional molecules in the design of functional PNA monomer units. Efficient introduction to PNA spine structure, (2) synthetic route considering cost performance, and (3) a method of introducing these functional molecules at an ultra-high speed to adapt to application as a genetic diagnostic agent. Quested.
[0009]
In view of the above problems, the present inventors have described the following route B as a novel method for producing a functional PNA monomer.
[Chemical Formula 10]

As shown in FIG. 4, a method for synthesizing photofunctional PNA monomer 4 almost quantitatively by condensing with active ester 5 containing 1 pentafluorophenyl group using t-butoxycarbonylaminoethylamine derivative 6 in the PNA backbone structure I found.
[0010]
As another method for synthesizing a functional PNA monomer, the present inventors use a benzyloxycarbonyl-ω-amino acid derivative instead of the t-butoxycarbonylaminoethylamine derivative 6 in the PNA backbone structure (Route C). I found. Patent applications have already been filed for these methods.
[0011]
Therefore, as a method for finally synthesizing functional PNA, a method for polymerizing them after synthesizing functional PNA monomers by a method using any one of the route B and route C has been established industrially. It is going That is, it is becoming possible to industrially synthesize functional PNA used as a PNA probe by a functional PNA synthesis method up to now.
[0012]
On the other hand, methods for synthesizing functional PNA have also been improved for the purpose of improving cost performance and introducing functional molecules at ultra-high speed. For example, as a different approach from the method using the functional PNA monomer unit, a method of introducing a functional molecule into a PNA oligomer post-synthetically by using the following precursor PNA monomer unit has been reported. (Oliver Seitz; Tetrahedron Letters 1999, 40, 4161-4164.).
Embedded image

[0013]
This method synthesizes a functional PNA by introducing the precursor PNA monomer unit into a PNA oligomer and then introducing a functional molecule.
However, this method has drawbacks such as limitations on the types of functional molecules that can be introduced.
[0014]
For example, as shown in the figure below, it is not possible to introduce a commercially available succinimide ester of a photofunctional molecule, and in order to introduce it, it is necessary to first introduce a linker such as Fmoc-Gly. The compound is difficult to use.
Embedded image

[0015]
In addition, DNA oligomers, RNA oligomers, and PNA oligomers have been used as fluorescent probes for introduction into cells, but in order to introduce them into cells, of course, they must pass through the cell membrane. Don't be. However, since the cell surface of the cell membrane is negatively charged, it is very difficult to introduce a DNA / RNA oligomer that is originally negatively charged.
[0016]
On the other hand, PNA oligomers are electrically neutral, but it is difficult to permeate the membrane. Therefore, when introducing PNA oligomers into cells, it is necessary to pre-treat the membrane surface for easy introduction, or to introduce it using a transfection reagent.
[0017]
However, even when the PNA oligomer is introduced after such treatment, even if the function of the probe is exhibited, it is not always guaranteed that the behavior that the living body originally exhibits is accurately expressed. In addition, this is a case of one cell, and it is impossible to use in multiple cells (individuals).
From such a current situation and viewpoint, it is considered useful to develop a fluorescent PNA probe having a membrane permeability function.
[0018]
A fluorescent PNA probe having a membrane permeability function already exists. Examples include (1) an oligopeptide having a membrane permeability function bound to PNA, and (2) a phospholipid having a membrane permeability function bound to PNA. However, after passing through the membrane, it is expected that parts other than PNA are degraded in the cells by enzymes such as proteases and stay in the cells. This means that the excess PNA probe that could not capture the target loses its membrane permeability, making it difficult to get out of the cell during the subsequent washing process. It means that it cannot be expressed.
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel method for synthesizing functional PNA, a compound used therefor, and a novel functional PNA, which are excellent in cost performance and capable of introducing functional molecules at an extremely high speed. .
[0020]
[Means for Solving the Problems]
As a result of repeated studies in view of the above problems, the present inventors have surprisingly overcome the above-mentioned problems in the conventional method by optimizing the structure of the precursor PNA monomer unit, and have a very wide range of functions. As a result, the present inventors have found that a functional PNA can be synthesized.
[0021]
That is, the present invention relates to a method for producing a functional PNA oligomer, wherein a PNA monomer unit having adenine, guanine, cytosine or thymine protected by a protecting group is converted to Fmoc-ω-amino acid- ^Boc After reacting with PNA-OH to synthesize a PNA oligomer, In contrast, with respect to the secondary amino group (—NH—) bonded to the Fmoc group and / or the Boc group, Introducing a functional molecule having a free carboxylic acid and further deprotecting the protecting group.
[0022]
Further, the present invention relates to Fmoc-ω-amino acid- ^Boc PNA-OH and Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester ^Boc It relates to the process, characterized in that it is prepared by reaction with PNA-OH.
Furthermore, the present invention relates to the method, wherein the Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester is produced by the reaction of Fmoc-ω-amino acid and pentafluorophenol.
[0023]
Furthermore, the present invention relates to the method, wherein another functional molecule is further introduced after the functional molecule is introduced.
Furthermore, the present invention is characterized in that the functional molecule to be introduced is selected from a photofunctional molecule, a membrane-permeable functional molecule, an organ-selective functional molecule, a bactericidal functional molecule, and a molecular recognition functional molecule. Relates to the method.
In addition, the present invention relates to the method, wherein the functional molecule to be introduced includes a photofunctional molecule and a membrane-permeable functional molecule.
The present invention relates to the method, wherein the photofunctional molecule is FITC, ROX, TAMRA or Dabcyl, and the membrane-permeable functional molecule is a water-soluble amino acid.
[0024]
The present invention also relates to the method, wherein the protecting group for protecting adenine, guanine, cytosine or thymine is a Z group.
[0025]
Furthermore, the present invention relates to the method, wherein the synthesis of the PNA oligomer comprises condensation / elongation in a PNA chain using a solid phase carrier for tBoc method.
Furthermore, the present invention relates to the method, wherein the tBoc solid phase carrier is MBHA.
Furthermore, the present invention is characterized in that the introduction of a functional molecule having a free carboxylic acid is carried out by dehydration condensation with a primary amino group obtained by selectively deprotecting the Fmoc group by piperidine treatment. To the method.
[0026]
Further, the present invention relates to Fmoc-ω-amino acid- ^Boc PNA-OH is represented by the following general formula (I)
Embedded image

The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the compound is represented by the formula (wherein n represents an integer of 1 to 15).
[0027]
Further, the present invention provides the following a) to d):
a) reacting Fmoc-ω-amino acid with pentafluorophenol in the step of producing Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester;
b) Fmoc-ω-amino acid- ^Boc In the process of producing PNA-OH, Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester ^Boc Fmoc-ω-amino group is reacted with PNA-OH ^Boc Introducing into PNA-OH;
c) Fmoc-ω-amino acid- ^Boc In the process of producing a PNA oligomer from PNA-OH, a PNA monomer unit is converted into Fmoc-ω-amino acid- ^Boc Reacting with PNA-OH to produce a PNA oligomer; and
d) In the step of producing a functional PNA oligomer from the PNA oligomer, the introduction of the functional molecule into the PNA oligomer is dehydration with a primary amino group obtained by selectively deprotecting the Fmoc group by piperidine treatment. What to do by condensation,
1 or 2 or more of the above.
[0028]
The present invention provides the following general formula (I):
Embedded image

(Wherein n represents an integer of 1 to 15).
[0029]
Still further, the present invention provides a compound of the general formula (I)
Embedded image

(Wherein n represents an integer from 1 to 15), wherein Fmoc-ω-amino acid is reacted with pentafluorophenol, and the reaction product is reacted with ^Boc The method is characterized in that the Fmoc-ω-amino group is introduced by reacting with PNA-OH.
[0030]
And this invention is the following general formula (II)
Embedded image

(In the formula, B is independent of each other and the same or different and is adenine, guanine, cytosine or thymine, and R is independent of each other and is the same or different. ,Functionality A carboxylic acid derivative, R ¹ Is a hydrogen atom or a functional carboxylic acid derivative, a to h are integers of 0 to 10, and X ₁ ~ X ₃ , Y ₁ , Y ₂ And Z ₁ ~ Z ₅ Are all integers greater than or equal to 0 and X ₁ + X ₂ + X ₃ ≧ 0, Y ₁ + Y ₂ > 0 and Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ ≧ 0. However, X ₁ + X ₂ + X ₃ And Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ Are not 0 at the same time, X ₁ + X ₂ + X ₃ If = 0, R ¹ Is a functional carboxylic acid derivative. ) And the functional carboxylic acid derivative is at least one of a water-soluble amino acid derivative and an active ester-type fluorescent labeling compound derivative Relates to compounds.
[0031]
Furthermore, the present invention provides The water-soluble amino acid is any one of arginine, lysine and serine , Relating to said compound.
The present invention also provides: The active ester type fluorescent labeling compound is any one of FITC, ROX, TAMRA, and Dabcyl , Relating to said compound.
Furthermore, the present invention provides As a functional carboxylic acid derivative, it has a fluorescent PNA probe function having a membrane permeability function by employing both a water-soluble amino acid derivative and an active ester-type fluorescent labeling compound derivative. , Relating to said compound.
The present invention also provides: The water-soluble amino acid is arginine, and the active ester fluorescent labeling compound is FITC. , Relating to said compound.
[0032]
In addition, the present invention relates to X ₁ = Z ₁ = 1, characterized in that By fluorescent PNA probe with membrane permeability Relates to compounds.
Furthermore, the present invention provides Y ₁ ≧ 2 and Z ₂ = 1, characterized in that By fluorescent PNA probe with membrane permeability Relates to compounds.
Furthermore, the present invention is characterized in that a ≦ 6, b ≦ 4, and f ≦ 6. By fluorescent PNA probe with membrane permeability Relates to compounds.
The present invention also provides R ¹ Is a photofunctional carboxylic acid derivative, By fluorescent PNA probe with membrane permeability Relates to compounds.
[0033]
The present invention relates to a precursor PNA monomer unit in which Fmoc-ω-amino acid is introduced into the PNA backbone structure, ie, Fmoc-ω-amino acid- ^Boc After introducing PNA-OH into a PNA oligomer, a functional molecule is introduced post-synthetically, thereby succeeding in synthesizing a photofunctional PNA oligomer almost quantitatively.
[0034]
Due to the above characteristics, in the production method of the present invention, it is not necessary to use a commercially available succinimide ester as a functional molecule to be introduced, and any compound having a carboxylic acid can be used without problems and quantitatively introduced. Therefore, the manufacturing method according to the present invention is extremely excellent in cost performance.
[0035]
In addition, by introducing the precursor PNA monomer unit into the functional PNA oligomer and then dividing the resin, different functional molecules can be introduced into each resin. Therefore, according to the production method of the present invention, it is possible to develop a very high-speed functional PNA oligomer synthesis method.
[0036]
As an example of a functional PNA oligomer that enables efficient synthesis by the method of the present invention, the following general formula (II)
Embedded image

(In the formula, B is independent of each other and is the same or different and is adenine, guanine, cytosine or thymine; R is independent of each other and is the same or different and is an Fmoc group or a functional carboxylic acid derivative; ¹ Is a hydrogen atom or a functional carboxylic acid derivative, a to h are integers of 0 to 10, and X ₁ ~ X ₃ , Y ₁ , Y ₂ And Z ₁ ~ Z ₅ Are all integers greater than or equal to 0 and X ₁ + X ₂ + X ₃ ≧ 0, Y ₁ + Y ₂ > 0 and Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ ≧ 0. However, X ₁ + X ₂ + X ₃ And Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ Are not 0 at the same time, X ₁ + X ₂ + X ₃ If = 0, R ¹ Is a functional carboxylic acid derivative. In the compound represented by ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ = 0 and R ¹ And a compound in which is a hydrogen atom.
[0037]
According to the present invention, the same or different functional molecules in the compound represented by the general formula (II) can be introduced at a plurality of arbitrary positions. That is, after introducing the PNA oligomer using the precursor PNA monomer unit, the piperidine treatment and the post-synthetic introduction of the functional molecule are performed collectively. It is indispensable for designing an antennapedia that improves the performance at high speed. Also in this respect, the method according to the present invention is extremely excellent.
[0038]
As an example of the compound thus produced, in the general formula (II), Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ > 0, R is a cell membrane permeable molecular derivative, R ¹ Are functional carboxylic acid derivatives.
[0039]
This probe can be roughly divided into a fluorescent labeling region, a cell membrane permeable functional region, and a molecular recognition region. ₁ ~ Z ₅ The part is connected via a subscript).
A commercially available fluorescent labeling compound or a novel fluorescently labeled PNA monomer unit for which the present inventors have already filed a PCT application can be used.
[0040]
The molecular recognition site is synthesized using a commercially available PNA unit. A feature of this is that a novel PNA unit represented by the general formula (I) for which a domestic patent application has already been filed is used in the membrane-permeable functional region. The novel PNA unit represented by the general formula (I) is a precursor unit developed for the post-synthetic introduction of functional molecules. It is characterized by the ability to introduce sex molecules at once.
[0041]
Therefore, according to the present invention, a wide variety of functional molecules, not limited to photofunctional molecules, can be easily and extremely efficiently introduced into PNA.
Such functional molecules include optical functional monomer units such as Naphthalimide, Flavin, Dabcyl, Biotin, FAM, Rhodamine, TAMRA, ROX, HABA, Pyrene, and Coumarine. Examples thereof include functional molecules, organ-selective functional molecules, bactericidal functional molecules, and molecular recognition functional molecules.
[0042]
That is, the term “functionality” in the present invention means that a compound is subjected to certain modifications including not only photofunctionality but also membrane permeability, organ selectivity, bactericidal functionality and molecular recognition functionality. It means all of various newly added functions.
Furthermore, the term “functional PNA” in the present invention includes not only those in which PNA monomers are directly bonded by a 2- (N-aminoethyl) glycine skeleton, but also those containing a hydrocarbon chain as a linker between them. That means.
[0043]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The features of the method according to the invention will now be described in more detail.
[0044]
The route to synthesize oligo PNAs according to the present invention is typically
Embedded image

As shown in
[0045]
First, if necessary,
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From Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester (Fmoc-ω-amino acid-OPfp) obtained by reacting Fmoc-ω-amino acid with pentafluorophenol (PfpOH), Fmoc-ω-amino acid − ^Boc Synthesize PNA-OH.
In order to obtain a solution of the Fmoc-ω-amino acid-OPfp used in the subsequent steps, an organic solvent such as DMF or a water-soluble solvent containing acetone or the like and water can be suitably used. When the water-soluble solvent is used, it has advantages in terms of post-treatment such as purification.
[0046]
The Fmoc-ω-amino acid-OPfp is reacted with Fmoc-ω-amino acid and PfpOH by adding DCC in a DMF solution, for example, by the following formula (III)
Embedded image

(Wherein n represents an integer of 1 to 15) is obtained.
[0047]
Then this ^Boc Fmoc-ω-amino acid- was added to a DMF solution of PNA-OH together with diisopropylethylamine. ^Boc PNA-OH is obtained.
Fmoc-ω-amino acid- ^Boc Since PNA-OH functions as a precursor of PNA monomer units, it can be referred to as a precursor PNA monomer unit.
In the formula (I), an integer from 1 to 15 can be appropriately selected as n, but a larger value of n is preferable in terms of reducing steric repulsion (or obstacles) during hybrid formation.
[0048]
Next, the figure below
Embedded image

The oligomer Ia is synthesized using a precursor PNA monomer unit as shown in FIG. Specifically, a PNA monomer unit having adenine, guanine, cytosine or thymine protected with a Z group (N-benzyloxycarbonyl group) or the like is reacted with a precursor PNA monomer unit, and a solid support for tBoc method Is used to sequentially condense and extend the PNA chain.
[0049]
In the PNA chain condensation, the tBoc group needs to be eliminated in advance, but the method is not limited and a general method is used. For the subsequent condensation, common condensing agents such as HATU, HBTU and BOP are used.
Further, the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is for the tBoc method, but MBHA is particularly preferably used.
[0050]
Next, the figure below
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As shown in the figure, the Fmoc group was selectively deprotected by piperidine treatment to give an amino group to obtain Ib.
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As shown in the above, Ic is obtained by dehydration condensation of a functional molecule having a free carboxylic acid on the amino group of the Ib.
Although there is no restriction | limiting in particular as said carboxylic acid, In terms of reactivity, since aliphatic carboxylic acid exceeds aromatic carboxylic acid, use of aliphatic carboxylic acid is preferable because of high production efficiency.
[0051]
Further, the deprotection of the Fmoc group by piperidine treatment is suitably performed by taking a certain amount of time. In particular, 20 to 40 minutes was preferable, and 30 minutes was most preferable.
There is no restriction | limiting in particular in the kind of condensing agent, Common condensing agents, such as HATU, HBTU, and BOP, are used similarly to the condensation of the said PNA chain | strand.
[0052]
In addition, introduction of a functional molecule is Fmoc-ω-amino acid- ^Boc It may be carried out immediately after the condensation of PNA-OH (the first method) or Fmoc-ω-amino acid- ^Boc You may carry out after condensing all the PNA monomer units containing PNA-OH sequentially (2nd method).
[0053]
Finally, the figure below
Embedded image

As shown in FIG. 4, the target PNA oligomer Id is obtained by simultaneously cutting out the carrier resin and deprotecting the Z group.
The conditions for cutting and deprotecting are not particularly limited as long as they are performed after the deprotection of the Fmoc group. For example, it is suitably performed under general conditions such as TFA / TFMSA / p-cresol / Thioanisole = 60/25/10/10.
[0054]
As described above, in the method according to the present invention, a functional molecule can be used as it is, unlike a method that requires synthesis of active esterification used in conventional functional monomer synthesis. In addition, since various functional molecules can be introduced after synthesizing Ia, high-speed and diverse parallel PNA probe synthesis, which has been difficult in the past, is possible.
[0055]
Fmoc-ω-amino acid- ^Boc According to the process according to the invention comprising the reaction of PNA-OH with a molecule having a PNA chain, the following general formula (II)
Embedded image

(In the formula, B is independent of each other and the same or different and is adenine, guanine, cytosine or thymine, and R is independent of each other and is the same or different. ,Functionality A carboxylic acid derivative, R ¹ Is a hydrogen atom or a functional carboxylic acid derivative, a to h are integers of 0 to 10, and X ₁ ~ X ₃ , Y ₁ , Y ₂ And Z ₁ ~ Z ₅ Are all integers greater than or equal to 0 and X ₁ + X ₂ + X ₃ ≧ 0, Y ₁ + Y ₂ > 0 and Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ ≧ 0. However, X ₁ + X ₂ + X ₃ And Z ₁ + Z ₂ + Z ₃ + Z ₄ + Z ₅ Are not 0 at the same time, X ₁ + X ₂ + X ₃ If = 0, R ¹ Is a functional carboxylic acid derivative. ) And the functional carboxylic acid derivative is at least one of a water-soluble amino acid derivative and an active ester fluorescent labeling compound derivative Compounds and the like are suitably synthesized.
[0056]
According to the method of the present invention, examples of the compound represented by the formula (II) include those containing a carboxylic acid derivative in which R is methyl red, ₁ + X ₂ + X ₃ = 9, Y ₁ + Y ₂ = 1 or X ₁ = 3, X ₂ = 6, Y ₁ Those having = 1 are particularly preferably synthesized.
[0057]
In addition, in the compound represented by the general formula (II), as a compound in which a plurality of functional molecules are introduced, for example, R or R ¹ Is a cell membrane-permeable functional molecule derivative that is suitably synthesized. In such a compound, typically, R is a cell membrane-permeable functional molecule derivative or the like, and R ¹ Is a functional carboxylic acid derivative such as a photofunctional molecule, that is, a compound in which a functional molecule is introduced into a plurality of sites including a terminal portion and a plurality of functions are imparted thereby. Such a compound can be modeled as follows, for example.
Embedded image

[0058]
Such a compound is, for example, X in the general formula (II). ₁ = Z ₁ = Z ₂ = 1 and Y ₁ A compound with ≧ 2. Such a compound is suitable in terms of easiness of synthesis and synthesis cost.
In the above compound, a, b and f are not particularly limited as long as each of them is an integer of 0 to 10, but for example, a ≦ 6, b ≦ 4 and f ≦ 6. There is no problem in practical use.
[0059]
By introducing a linker site, interference between individual functional sites and base sequence recognition regions can be prevented, and the function of the molecule can be made more reliable. As used herein, the terms PNA, PNA monomer and PNA oligomer also include those containing linker sites at the ends and / or within.
As a site for preventing mutual interference between these sites or regions, not only the linker site but also f to h in the general formula (I) can be selected as desired.
Examples of the group constituting the linker moiety include linear or branched hydrocarbons and ethers thereof, but the linear hydrocarbon group is preferable from the viewpoint of ease of introduction and cost. In particular, a linear hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms is preferred. The ether form is suitable for its versatility.
[0060]
The compound having a plurality of functional molecules introduced therein is, for example, Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; Orum, HJ Peptide Res. 1997, 49 , 80-88.
The base sequence recognition site can be oligomerized by solid phase synthesis using various commercially available PNA monomers. Commercially available Boc-7-aminoheptanoic acid, Boc-6-aminocaproic acid and the like can be used for the linker site.
[0061]
When a photofunctional molecule is introduced as one functional molecule, a compound that can be fluorescently labeled and has other functions can be synthesized. As such a fluorescent labeling site, it is possible to select various fluorescent emission wavelengths using a commercially available active ester type fluorescent labeling compound such as FITC, ROX, TAMRA or Dabcyl. The labeling compound is not limited to these.
[0062]
Examples of other functionalities that can be introduced into the compounds of the present invention include membrane permeability functions. Such a membrane-permeable functional site can be similarly introduced by using the compound represented by the general formula (I) in the previous patent. Arginine is mentioned as a functional molecule that can improve membrane permeability, but other water-soluble amino acids such as lysine and serine can also be suitably used.
[0063]
It is also possible to introduce a plurality of amino acids by using the Fmoc amino acid unit. Examples of the synthesis are also shown in Examples 20 and 21. However, the above two compounds are model compounds of a fluorescent PNA probe having a membrane permeability function according to the present invention, and the present invention is not limited to these.
[0064]
The characteristic of these probes is "because they are all PNA type and have complete enzyme resistance". In other words, the conventional probes having a membrane permeability function are mainly those in which PNA and a peptide chain or phospholipid having a membrane permeability function are covalently bonded, but these known probes have excellent membrane permeability. Although it has a sexual function, once it enters the cell, it is expected that the peptide chain or phospholipid is degraded by the enzyme group. Therefore, they have the disadvantage that the probe that has undergone degradation that does not recognize the target cannot be completely removed in the washing process.
[0065]
On the other hand, the probe designed this time is not subject to enzymatic degradation even in the cell, and the probe that does not recognize the target is completely removed in the washing process, enabling accurate quantification of gene expression level. Is.
In addition to these functional compounds, organ-selective functional molecules such as lactose and tris-x, bactericidal functional molecules such as tanatine and cecropin, and molecular recognition functional molecules such as viologen, etc. For example, such a compound can be practically used in large quantities at low cost.
[0066]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
Example 1 Fmoc-Gly- ^Boc Synthesis of PNA-OH (1)
DCC (845 mg, 4.5 mmol) was added to a DMF solution (12 mL) of Fmoc-Gly-OH (891 mg, 3.0 mmol) and PfpOH (754 mg, 4.5 mmol) under ice-cooling, and the reaction solution was added at 0 ° C for 30 minutes. The mixture was then stirred at room temperature for 15 hours. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure. ^Boc To a DMF solution (16 mL) of PNA-OH (436 mg, 2.0 mmol) was added diisopropylethylamine (445 μL, 2.6 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. This was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (0-50% MeOH / CH ₂ Cl ₂ Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH (121 mg, 12%) was obtained. ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 7.88 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.62 (brt) and 7.56 (brt) (1 H), 7.41 (t, J = 7.0 Hz) , 2 H), 7.33 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.85 (brt) and 6.79 (brt) (1 H), 4.35-4.15 (m, 3 H), 4.05-3.85 (m, 3 H), 3.77 (m, 1 H), 3.40-3.25 (m, 2 H), 3.10 (m) and 3.03 (s) (2 H), 1.37 (brs, 9 H); ¹³ C NMR (DMSO-d ₆ ) δ172.2 (d), 169.10 (d), 156.34 (d), 155.58 (d), 143.83, 140.66, 127.58, 127.04, 125.24, 120.04, 77.77 (d), 65.71, 47.34 (d), 46.72, 46.65 (d), 29.23 (d), 28.14 (d); FABMS m / z 498 [(M + H) ⁺ ].
[0067]
(Example 2) Fmoc-C ₇ -OPfp composition
Fmoc-C ₇ DCC (392.0 mg, 1.9 mmol) was added to a DMF solution (2.5 mL) of -OH (381.9 mg, 1.0 mmol) and PfpOH (349.7 mg, 1.9 mmol) under ice cooling, and the reaction solution was added at 0 ° C. for 30 minutes. It was then stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, DCUrea was filtered off, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (CH ₂ Cl ₂ ) And then recrystallized with Hexane to give Fmoc-C as a white powder. ₇ -OPfp (537.5 mg, 98%) was obtained. ¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz) , 2 H), 4.70-4.73 (brt, 1 H), 4.47-4.40 (brd, 2 H), 4.22 (t, J = 6.42 Hz, 1 H), 3.20 (q, J = 5.94 Hz, 2 H) , 2.66 (t, J = 7.38 Hz, 2 H), 1.80-1.75 (m, 2 H), 1.55-1.50 (m, 2 H), 1.45-1.34 (m, 6 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ 169.44, 156.43, 143.98, 141.96 (m), 141.29, 140.23, 138.67 (m), 136.99 (m), 127.60, 126.96, 124.97, 119.91, 66.49, 55.73,47.29, 41.34 (d), 34.89, 33.22, 29.85, 28.70, 26.42, 25.43, 24.60; HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₂₉ H ₂₇ F _Five NO _Four [(M + H) ⁺ ] 547.5131 observed 548.1861.
[0068]
Example 3 Fmoc-Gly- ^Boc Synthesis of PNA-OH (2)
To a mixed solution of acetone (6.0 mL) and water (1.0 mL) was added NaHCO 3. _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) and Fmoc-Gly-OPfp (240.9 mg, 0.52 mmol) ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 6 hours. The reaction solution cooled with ice-cooled 1N hydrochloric acid was adjusted to pH 3.0, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated, and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ) And LH-20 (MeOH). After this, dissolve in methylene chloride and concentrate under reduced pressure to form Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH (157.3 mg, 80%) was obtained.
[0069]
Example 4 Fmoc-β-Ala- ^Boc Synthesis of PNA-OH (1)
DCC (288 mg, 1.4 mmol) was added to a DMF solution (2.5 mL) of Fmoc-β-Ala-OH (311 mg, 1.0 mmol) and PfpOH (334 mg, 1.75 mmol) under ice-cooling, and the reaction mixture was added to 0 mL. Stir for 30 minutes at ° C and then for 15 hours at room temperature. The reaction solution was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (CH ₂ Cl ₂ ). Hexane and CH ₂ Cl ₂ And Fmoc-β-Ala-OPfp (429 mg, 90%) was obtained as a white powder. Fmoc-β-Ala-OPfp (100 mg, 0.21 mmol) and ^Boc To a DMF solution (2 mL) of PNA-OH (41 mg, 0.19 mmol) was added diisopropylethylamine (36 μL, 0.21 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. This was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (0-10% MeOH / CH ₂ Cl ₂ Fmoc-β-Ala- ^Boc PNA-OH (41 mg, 42%) was obtained. ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.41 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.83 (brt) and 6.72 (brt) (2 H), 4.3-4.2 (m, 4 H), 4.05-3.9 (m, 3 H), 3.33 (brt ) and 3.29 (brt) (2 H), 3.19 (m, 2 H), 3.07 (brq) and 3.02 (brq) (2 H), 1.36 (brs, 9 H); ¹³ C NMR (DMSO-d ₆ ) δ171.20 (d), 170.85 (d), 155.93, 155.56, 143.87, 140.69, 127.55, 127.01, 125.09, 120.05, 77.73 (d), 65.30 (d), 59.69, 47.35 (d), 46.68, 46.49 ( d), 37.99 (d), 36.72 (d), 28.14 (d).
[0070]
(Example 5) Fmoc-β-Ala- ^Boc Synthesis of PNA-OH (2)
To a mixed solution of acetone (1.25 mL) and water (1.25 mL) _Three (92.4 mg, 1.1 mmol) and Fmoc-β-Ala-OPfp (476.0 mg, 1.0 mmol) ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.55 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 6 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1 N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated, and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). After this, dissolve in methylene chloride and concentrate under reduced pressure to form Fmoc-β-Ala- ^Boc PNA-OH (225.9 mg, 80%) was obtained.
[0071]
(Example 6) Fmoc-GABA- ^Boc Synthesis of PNA-OH (1)
Fmoc-GABA-OPfp (100 mg, 0.20 mmol) and ^Boc To a DMF solution (2 mL) of PNA-OH (40 mg, 0.18 mmol) was added diisopropylethylamine (34 μL, 0.20 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. This was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (0-20% MeOH / CH ₂ Cl ₂ Fmoc-GABA- ^Boc PNA-OH (43 mg, 45%) was obtained. ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.29 (m, 1 H), 6.82 (brt) and 6.71 (brt) (1 H), 4.3-4.2 (m, 4 H), 4.05-3.9 (m, 3 H), 3.35-3.25 ( m, 2 H), 3.1-2.95 (m, 4 H), 1.36 (brs, 9 H); ¹³ C NMR (DMSO-d ₆ ) δ172.2 (d), 171.5 (d), 156.03, 155.60 (d), 143.89, 140.68, 127.54, 127.00, 125.50, 120.04, 77.70 (d), 65.19, 54.84, 47.89 (d), 46.97 (d) , 46.72, 38.20 (d), 29.23 (d), 28.14 (d), 24.98 (d).
[0072]
Example 7 Synthesis of Fmoc-GABA-OPfp
DCC (248 mg, 1.2 mmol) was added to a DMF solution (2.5 mL) of Fmoc-GABA-OH (325 mg, 1.0 mmol) and PfpOH (221 mg, 1.2 mmol) under ice-cooling, and the reaction solution was added at 0 ° C. Stir for 30 minutes and then at room temperature for 15 hours. The reaction solution was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (CH ₂ Cl ₂ ) To obtain Fmoc-GABA-OPfp (463 mg, 94%) as a white powder. ¹ H NMR (CDCl _Three ) δ7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.31 (t, J = 7.5 Hz , 2 H), 4.85 (brs, 1 H), 4.45 (d, J = 6.3 Hz, 2 H), 4.21 (t, J = 6.3 Hz, 2 H), 3.32 (d, J = 6.5 Hz, 2 H ), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 1.98 (t, J = 6.5 Hz, 2H); ¹³ C NMR (CDCl _Three ) 169.02, 156.49, 143.83, 141.87 (m), 141.28, 140.23 (m), 138.61 (m), 136.94 (m), 127.62, 127.46, 124.89, 119.88, 66.52, 47.25, 39.92, 30.42, 25.03.
[0073]
(Example 8) Fmoc-GABA- ^Boc Synthesis of PNA-OH (2)
To a mixed solution of acetone (5.0 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) and Fmoc-GABA-OPfp (255.5 mg, 0.52 mmol) ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 8 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1 N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated, and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-GABA- as amorphous powder after dissolving in methylene chloride and concentrating under reduced pressure ^Boc PNA-OH (175.9 mg, 84%) was obtained.
[0074]
Example 9 Fmoc-C _Four - ^Boc Synthesis of PNA-OH
To a mixed solution of acetone (4.0 mL) and water (1.0 mL) was added NaHCO 3. _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C _Four -OPfp (323.5 mg, 0.64 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 12 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C as an amorphous powder after dissolving in methylene chloride and concentrating under reduced pressure _Four - ^Boc PNA-OH (190.7 mg, 88%) was obtained. ¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ7.76 (d, J = 6.7 Hz, 2 H), 6.96 (mi) and 6.66 (ma) (brd, J = 6.7 Hz, 2 H), 7.41-7.37 (m, 2 H), 7.32-7.28 (m, 2 H), 7.14 (ma) and 6.68 (mi) (m, 1 H), 5.54 (ma) and 5.43 (mi) (brt, 1 H), 4.45 (mi) and 4.37 (ma) (m , 2 H), 4.24-4.21 (m, 1 H), 4.08-3.95 (m, 2 H), 3.54-3.48 (m, 2 H), 3.29-3.11 (m, 4 H), 2.43-2.25 (m , 2 H), 1.70-1.29 (m, 13 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ 174.39, 173.07, 171.95, 157.51, 156.79 (d), 156.11, 144.06 (d), 141.16, 127.46 (d), 126.90 (d), 119.77 (d), 81.42, 79.67, 66.39 (d), 53.35, 49.46 (d), 49.17, 48.60, 47.15 (d), 40.89, 40.32 (d), 38.68, 31.87, 31.41, 29.59, 29.11 (d), 28.28, 21.77 (d); HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₂₉ H ₃₇ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 539.2632 observed 540.2707.
[0075]
(Example 10) Fmoc-C _Five - ^Boc Synthesis of PNA-OH
To a mixed solution of acetone (7.5 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C _Five -OPfp (311.0 mg, 0.6 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 24 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated, and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C is dissolved in methylene chloride and concentrated under reduced pressure as a white amorphous powder. _Five - ^Boc PNA-OH (198.0 mg, 90%) was obtained. ¹ H-NMR (DMSO-d ₆ ) δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.22 (brt, 1 H), 6.81 (ma) and 6.67 (mi) (brt, 1 H), 4.33 (mi) and 4.29 (ma) (brd, 2 H), 4.20 (t, J = 7.1 Hz, 1 H), 4.08 (mi) and 3.90 (ma) (brs, 2H), 3.09-2.94 (m, 4 H), 2.30 (ma) and 2.14 (mi) (brt, 2 H), 1.51 -1.45 (m, 2 H), 1.41-1.31 (brs, 11 H), 1.29-1.21 (m, 8 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ 175.1 (d), 172.77 (d), 157.20 (t), 156.63, 144.43 (d), 141.69, 128.07, 127.45, 125.40 (d), 120.35, 81.71, 80.00, 67.36 (d), 50.42, 49.81 (d), 48.90 (d), 47.82 (d), 41.77, 41.16, 40.64, 39.19, 33.12, 32.75, 29.45 (d), 28.81, 26.59, 24.97, 24.70; HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₃₀ H ₃₉ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 553.2788observed 554.2873.
[0076]
(Example 11) Fmoc-C ₆ - ^Boc Synthesis of PNA-OH
To a mixed solution of acetone (6.0 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C ₆ -OPfp (331.9 mg, 0.6 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 24 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution was concentrated and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C is dissolved in methylene chloride and concentrated under reduced pressure as a white amorphous powder. ₆ - ^Boc PNA-OH (197.0 mg, 87%) was obtained. ¹ H-NMR (DMSO-d ₆ ) δ 7.88 (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.22 (brt, 1 H), 6.79 (ma) and 6.66 (mi) (brt, 1 H), 4.39 (mi) and 4.29 (ma) (brt, 2 H), 4.20 (t, J = 6.7 Hz, 1 H) 4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs, 2 H), 3.10-2.97 (m, 4 H), 2.31 (ma) and 2.15 (mi) (brt, 2 H), 1.50-1.47 (m, 2 H), 1.41-1.36 (m, 11 H), 1.28-1.24 (brd, 6 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ175.23 (d), 172.41 (d), 157.11 (d), 156.60, 144.34 (d), 141.69, 128.07, 127.45, 125.40 (d), 120.35, 81.68, 80.00 (d), 67.72, 67.50 (d ), 53.87, 50.77, 50.14 (d), 48.90, 47.82 (d), 41.29 (d), 41.36, 40.69, 39.18, 33.19, 32.96, 30.00, 29.11, 28.81, 26.75 (d), 25.27 (d), 24.80 (d); HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₂₉ H ₄₁ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 567.2945 observed 568.3027.
[0077]
(Example 12) Fmoc-C ₇ - ^Boc Synthesis of PNA-OH
To a mixed solution of acetone (7.0 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C ₇ -OPfp (328.5 mg, 0.6 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 24 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution was concentrated and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C is dissolved in methylene chloride and concentrated under reduced pressure as a white amorphous powder. ₇ - ^Boc PNA-OH (196.1 mg, 84%) was obtained. ¹ H-NMR (DMSO-d ₆ ); δ7.88 (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2 H) , 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.22 (brt, 1 H), 6.79 (ma) and 6.79 (mi) (brt, 1 H), 4.39 (mi) and 4.29 (ma) (brd, J = 6.9 Hz, 2 H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 1 H), 4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs, 2 H), 3.12-2.95 (m, 4 H), 2.31 ( mi) and 2.15 (ma) (brt, 2 H), 1.50-1.47 (m, 2 H), 1.42-1.34 (m, 11 H), 1.25 (brd, 2 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ 174.72, 172.19, 156.52, 156.05, 143.78 (d), 141.14, 127.51, 126.89, 124.86 (d), 119.79, 79.43 (d), 66.80 (d), 53.33, 50.19, 49.20, 48.50, 47.14 (d) , 41.18 (d), 38.60, 32.28 (d), 29.60, 28.83, 28.26, 26.27 (d), 24.68 (d), 21.77 (d); HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₃₂ H ₄₃ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 581.3101 observed 582.3171.
[0078]
(Example 13) Fmoc-C _Ten - ^Boc PNA-OH
To a mixed solution of acetone (7.0 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C _Ten -OPfp (353.7 mg, 0.6 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 24 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C is dissolved in methylene chloride and concentrated under reduced pressure as a white amorphous powder. _Ten - ^Boc PNA-OH (218.5 mg, 88%) was obtained. ¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ9.60 (brs, 1 H), 7.73 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.58 (d, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.37 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.29 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 5.52 (ma) and 5.35 (mi) (brd, 1 H), 5.00 (s, 1 H), 4.45 (mi) and 4.40 (ma) (brd, J = 6.4 Hz, 2 H), 4.23-4.22 (m, 1 H), 4.09 (mi) and 4.04 (ma) (brs, 2 H), 3.57-3.46 (m, 2 H), 3.29-3.03 (m, 4 H), 1.66-1.58 (brs, 2 H), 1.52-1.37 (m, 11 H), 1.33-1.20 (brs, 12 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ 174.5 (d), 172.43 (d), 171.64 (d), 157.83 (d), 156.98, 156.03, 143.78 (d), 141.17, 127.52, 126.90, 124.86 (d), 119.70 (d), 81.08, 79.43 (d), 67.26, 66.43, 50.14, 49.29, 48.145 (d), 47.17 (t), 41.47, 40.99, 40.16, 38.63, 32.90, 32.43 (d), 29.55 (d), 29.22 (m), 28.28, 26.56 (d), 24.98, 24.75; HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₃₅ H ₄₉ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 623.3571 observed 624.3643.
[0079]
(Example 14) Fmoc-C ₁₁ -OPfp composition
Fmoc-C ₁₁ DCC (309.5 mg, 3.0 mmol) was added to a DMF solution (2.5 mL) of -OH (437.5 mg, 2.0 mmol) and PfpOH (276.6 mg, 3.0 mmol) under ice-cooling, and the reaction solution was added at 0 ° C for 30 minutes. Subsequently, it stirred at room temperature for 18 hours. After completion of the reaction, DCUrea was filtered off, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was subjected to silica gel column chromatography (CH ₂ Cl ₂ ) And then recrystallized with Hexane to give Fmoc-C as a white powder. ₁₁ -OPfp (575.6 mg, 96%) was obtained. ¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ 7.79 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.63 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.43 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.34 (t, J = 7.2 Hz) , 2 H), 4.86 (brt, 1 H), 4.47 (mi) and 4.44 (ma) (brd, 2 H), 4.25 (t, 1 H), 3.22 (q, J = 6.1 Hz, 2 H), 2.68 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.80 (m, 2 H), 1.56-1.52 (m, 2 H), 1.47-1.42 (m, 2 H), 1.39-1.30 (m, 12 H) ; HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₃₃ H ₃₄ F _Five NO _Four [(M + H) ⁺ ] 603.6194 observed 604.2490.
[0080]
(Example 15) Fmoc-C ₁₁ - ^Boc PNA-OH
To a mixed solution of acetone (10 mL) and water (1.0 mL) in NaHCO _Three (67.2 mg, 0.8 mmol) was added and Fmoc-C ₁₁ -OPfp (362.2 mg, 0.6 mmol) and ^Boc PNA-OH (87.3 mg, 0.4 mmol) was dissolved and stirred at room temperature for 48 hours. The solution (0 ° C.) was adjusted to pH 3.0 with ice-cooled 1N hydrochloric acid, 1% aqueous citric acid solution was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. The organic layer is dried over anhydrous magnesium sulfate, the solution is concentrated and silica gel column chromatography (1-5% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ). Fmoc-C is dissolved in methylene chloride and concentrated under reduced pressure as a white amorphous powder. ₁₁ - ^Boc PNA-OH (227.6 mg, 89%) was obtained. ¹ H-NMR (CDCl _Three ); δ9.62 (brs, 1 H), 7.74 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.57 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.37 (t, J = 7.1 Hz, 2 H) , 7.28 (t, J = 6.8Hz, 2 H), 5.53 (ma) and 5.35 (mi) (brs, H), 5.00 (brt, 1 H), 4.43 (mi) and 4.37 (ma) (brd, J = 6.4 Hz, 2 H), 4.22-4.19 (m, 1 H), 4.06 (mi) and 4.01 (ma) (brs, 2 H), 3.51-3.44 (m, 2 H), 3.23-3.08 (m, 4 H), 2.36 (ma) and 2.21 (mi) (brt, J = 7.0 Hz, 2 H), 1.69-1.58 (brs, 2 H), 1.52-1.40 (m, 11 H), 1.29-1.25 (brd , 14 H); ¹³ C-NMR (CDCl _Three ) δ175.45 (d), 172.428 (d), 157.91 (d), 157.01, 156.57, 144.33 (d), 141.72, 128.05, 127.43, 125.40 (d), 120.35, 81.63, 80.00 (d), 67.77, 66.97 , 50.67, 49.84, 49.20 (d), 47.72 (t), 42.10, 41.53, 40.70, 39.18, 33.51, 33.07, 30.032, 29.83 (m), 28.82, 27.00 (d), 25.44, 25.35; HRMS (FAB ⁺ ) calcd. for C ₃₆ H ₅₁ N _Three O ₇ [(M + H) ⁺ ] 637.3727 observed 638.3794.
[0081]
(Example 16) PNA oligo 1 (H ₂ NGAT-pMR-GACGC-CONH ₂ ) Synthesis (first method)
According to the tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; φrum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) Solid phase carrier MBHA (50 mg) and various PNA monomer units (thymine 7.7 mg, cytosine 10.1 mg, adenine 10.6 mg, guanine 10.9 mg, Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH 10.0 mg; 20 mmol each), a condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (7.0 μL, 20 mmol) were used for sequential extension reaction. During this time, Fmoc-Gly- ^Boc When condensing PNA-OH, before condensing with the next thymidine PNA monomer unit, first piperidine treatment (20% piperidine in DMF 3 mL, room temperature 30 minutes) to deprotect the Fmoc group, then light P-Methyl Red-OH (10.8 mg, 40 mmol) as a functional molecule carboxylic acid derivative is condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (13.9 μL, 40 mmol) to the desired position. Introduced. After that, PNA monomer units of thymidine, adenine, and guanine were condensed sequentially, followed by excision from the solid support and removal of the Z group by conventional methods (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10). Protection was performed at the same time and post-treatment to obtain the target PNA oligo 1. UV λmax (H ₂ O) 303, 548 (nm).
[0082]
(Example 17) Synthesis of PNA oligo 1 (second method)
According to the tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; φrum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) Solid phase carrier MBHA (50 mg) and various PNA monomer units (thymine 7.7 mg, cytosine 10.1 mg, adenine 10.6 mg, guanine 10.9 mg, Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH 10.0 mg; 20 mmol each), a condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (7.0 μL, 20 mmol) were used for sequential extension reaction. After sequentially condensing all the monomer units, piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 30 minutes) deprotects the Fmoc-Gly residue, and then p-Methyl Red as a carboxylic acid derivative of a photofunctional molecule. -OH (10.8 mg, 40 mmol) was condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (13.9 μL, 40 mmol) and introduced at the target position. After that, by the usual method (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10), cutting out from the solid support and deprotection of the Z group at the same time, post-processing, the target PNA oligo Got one. UV λmax (H ₂ O) 302, 550 (nm).
[0083]
(Example 18) PNA oligo 2 (H ₂ NGAT-mMR-GACGC-CONH ₂ ) Synthesis (second method)
According to the tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; φrum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) Solid phase carrier MBHA (50 mg) and various PNA monomer units (thymine 7.7 mg, cytosine 10.1 mg, adenine 10.6 mg, guanine 10.9 mg, Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH 10.0 mg; 20 mmol each), a condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (7.0 μL, 20 mmol) were used for sequential extension reaction. After sequentially condensing all the monomer units, piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 30 minutes) is used to deprotect the Fmoc-Gly residue, and then to m-Methyl Red as a carboxylic acid derivative of a photofunctional molecule. -OH (10.8 mg, 40 mmol) was condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (13.9 μL, 40 mmol) and introduced at the target position. After that, by the usual method (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10), cutting out from the solid support and deprotection of the Z group at the same time, post-processing, the target PNA oligo 2 got. UVλmax (H ₂ O) 308, 570 (nm).
[0084]
(Example 19) PNA oligo 3 (H ₂ NGAT-oMR-GACGC-CONH ₂ ) Synthesis (second method)
According to the tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; φrum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) Solid phase carrier MBHA (50 mg) and various PNA monomer units (thymine 7.7 mg, cytosine 10.1 mg, adenine 10.6 mg, guanine 10.9 mg, Fmoc-Gly- ^Boc PNA-OH 10.0 mg; 20 mmol each), a condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (7.0 μL, 20 mmol) were used for sequential extension reaction. After sequentially condensing all the monomer units, piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 30 minutes) deprotects the Fmoc-Gly residue, and then o-Methyl Red as a carboxylic acid derivative of a photofunctional molecule. -OH (10.8 mg, 40 mmol) was condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (13.9 μL, 40 mmol) and introduced at the target position. After that, by the usual method (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10), cutting out from the solid support and deprotection of the Z group at the same time, post-processing, the target PNA oligo Got one. UV λmax (H ₂ O) 302, 561 (nm).
[0085]
(Example 20) Synthesis of fluorescent PNA probe (1) having membrane permeability function
Embedded image

The second method was used.
Standard tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; Orum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) First, sequential extension reaction using solid phase carrier MBHA (50 mg) with thymine PNA monomer unit (7.7 mg, 20 mmol), condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (3.5 mL, 20 mmol) (Design of base sequence recognition region).
Next, ω-amino acid Boc-7-aminoheptanoic acid (5.2 mg, 20 mmol) for linker, Fmoc-Ahx- ^Boc PNA-OH (10.0 mg, 20 mmol) and Boc-7-aminoheptanoic acid were again condensed sequentially using the condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (3.5 mL, 20 mmol) (linker site and Design of membrane permeable functional area).
After all the units were sequentially condensed, the Fmoc group was deprotected by piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 3 minutes). Next, Fmoc-Arg (Mts) -OH (23.1 mg, 40 mmol) as a functional carboxylic acid derivative is condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (7.0 mL, 40 mmol). Functional molecules were introduced at the position (introduction of membrane permeability function).
After deprotection of Boc group by TFA treatment (95% TFA / 5% m-cresol), FITC (9.3 mg, 25 mmol) was shaken at room temperature for 12 hours in the presence of DIEA (17.4 mL, 100 mmol) and fluorescently labeled (Design of fluorescent labeling site).
Finally, piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 3 minutes) deprotects the remaining Fmoc group, and then solid-phased by conventional methods (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10) The target product was obtained by cutting out from the carrier and post-processing. MALDI-TOF MS: calcd. 2096.26 (M + H ⁺ ), found 2096.36.
[0086]
(Example 21) Synthesis of fluorescent PNA probe (2) having membrane permeability function
Embedded image

Standard tBoc method (cf. Koch, T .; Hansen, HF; Andersen, P .; Larsen, T .; Batz, HG; Otteson, K .; Orum, HJ Peptide Res. 1997, 49, 80-88.) First, sequential extension reaction using solid phase carrier MBHA (50 mg) with thymine PNA monomer unit (7.7 mg, 20 mmol), condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (3.5 mL, 20 mmol) (Design of base sequence recognition region).
Next, ω-amino acid Boc-7-aminoheptanoic acid (5.2 mg, 20 mmol) for linker, Fmoc-Ahx- ^Boc PNA-OH (10.0 mg, 20 mmol) and Boc-7-aminoheptanoic acid were again condensed sequentially using the condensing agent HBTU (7.6 mg, 20 mmol) and DIEA (3.5 mL, 20 mmol) (linker site and Design of membrane permeable functional area).
After all the units were sequentially condensed, the Fmoc group was deprotected by piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 3 minutes). Next, Fmoc-Arg (Mts) -OH (23.1 mg, 40 mmol) as a functional carboxylic acid derivative is condensed using the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol) and DIEA (7.0 mL, 40 mmol). Functional molecules were introduced at the position (introduction of membrane permeability function).
This was treated with piperidine (20% piperidine in DMF, room temperature for 3 minutes) to deprotect the Fmoc group, and again Fmoc-Arg (Mts) -OH (23.1 mg, 40 mmol) was added to the condensing agent HBTU (15.2 mg, 40 mmol). mmol) and DIEA (7.0 mL, 40 mmol) were used to condense the functional molecule at the desired position (addition of membrane permeability function).
After deprotection of Boc group by TFA treatment (95% TFA / 5% m-cresol), FITC (9.3 mg, 25 mmol) was shaken at room temperature for 12 hours in the presence of DIEA (17.4 mL, 100 mmol) and fluorescently labeled (Design of fluorescent labeling site).
Finally, piperidine treatment (20% piperidine in DMF, room temperature for 3 minutes) deprotects the remaining Fmoc group, and then solid-phased by conventional methods (TFA / TFMSA / p-cresol / thioanisol = 60/25/10/10) The target product was obtained by cutting out from the carrier and post-processing. MALDI-TOF MS: calcd. 2252.44 (M + H ⁺ ), found 2252.33.
[0087]
【The invention's effect】
According to the present invention, a wide variety of functional molecules that are not limited to photofunctional molecules can be easily introduced into the PNA, and a wide variety of functional molecules can be easily and efficiently introduced into the PNA. This makes it possible to construct various PNAs used for gene therapy and the like.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the difference in structure and charge status between DNA and PNA.
FIG. 2 is a diagram showing the structures of two types of PNA monomer units.

Claims (15)

A method for producing a functional PNA oligomer, wherein a PNA monomer unit having adenine, guanine, cytosine or thymine protected by a protecting group is reacted with Fmoc-ω-amino acid- ^Boc PNA-OH to synthesize a PNA oligomer Then, a functional molecule having a free carboxylic acid is introduced into the secondary amino group (—NH—) bonded to the Fmoc group and / or the Boc group in the PNA oligomer, and the protecting group is removed. Said method comprising providing protection. The process according to claim 1, characterized in that Fmoc-ω-amino acid- ^Boc PNA-OH is produced by reaction of Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester with ^Boc PNA-OH.   The method according to claim 2, characterized in that the Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester is produced by the reaction of Fmoc-ω-amino acid with pentafluorophenol.   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein another functional molecule is further introduced after the functional molecule is introduced.   The functional molecule to be introduced is selected from a photofunctional molecule, a membrane-permeable functional molecule, an organ-selective functional molecule, a bactericidal functional molecule, and a molecule-recognizing functional molecule. The method in any one of.   The method according to claim 4 or 5, wherein the functional molecules to be introduced include a photofunctional molecule and a membrane-permeable functional molecule.   The method according to claim 6, wherein the photofunctional molecule is FITC, ROX, TAMRA or Dabcyl, and the membrane-permeable functional molecule is a water-soluble amino acid.   The method according to claim 1, wherein the protecting group for protecting adenine, guanine, cytosine or thymine is a Z group.   The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the synthesis of the PNA oligomer includes condensation / elongation in a PNA chain using a solid phase carrier for tBoc method.   10. The method according to claim 1, wherein the tBoc method solid phase carrier is MBHA.   The introduction of a functional molecule having a free carboxylic acid is carried out by dehydration condensation with a primary amino group obtained by selectively deprotecting the Fmoc group by piperidine treatment. The method in any one of. Fmoc-ω-amino acid- ^Boc PNA-OH is represented by the following general formula (I)

The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the compound is represented by the formula (wherein n represents an integer of 1 to 15). A) to d) below:
a) reacting Fmoc-ω-amino acid with pentafluorophenol in the step of producing Fmoc-ω-amino acid pentafluorophenyl ester;
b) Fmoc-.omega. amino ^- in the step of producing a Boc PNA-OH, introducing Fmoc-.omega.-amino group to ^Boc PNA-OH by reacting Fmoc-.omega. amino pentafluorophenyl ester ^Boc PNA-OH To do;
c) Fmoc-.omega. amino ^- from Boc PNA-OH in the step of producing a PNA oligomer, a PNA monomer units, Fmoc-.omega. amino ^- it reacted with Boc PNA-OH to produce a PNA oligomer; and d) In the step of producing a functional PNA oligomer from the PNA oligomer, the functional molecule is introduced into the PNA oligomer by dehydration condensation with a primary amino group obtained by selectively deprotecting the Fmoc group by piperidine treatment. What happens,
4. The method of claim 3, comprising one or more of: The following general formula (I)

(Wherein n represents an integer of 1 to 15). Formula (I)

(Wherein n represents an integer of 1 to 15), wherein Fmoc-ω-amino acid is reacted with pentafluorophenol, and the reaction product is converted to ^Boc PNA-OH. The method as described above, wherein the Fmoc-ω-amino group is introduced by reacting.

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