JP3990909B2 - 化学反応用カートリッジ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構造を有する化学反応用カートリッジに関する。詳しくは、弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有する化学反応用カートリッジに関する。
【０００２】
該カートリッジは、液体状または気体状の試料や試薬、または該試料と該試薬の混合流体を、少なくとも１つのリザーバーまたは反応槽から、少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合流体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジである。カートリッジ内部の流路は、該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、及び、該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、からなる群より選択される少なくとも１つにより構成される。カートリッジ内部のリザーバーや反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝や穴により構成される。また、該カートリッジには、液体や気体用の弁を形成することができる。
【０００３】
本発明により、化学反応を行うカートリッジを作成することが容易になる。このカートリッジとカートリッジ上の反応を制御する簡単な機械を使って、医療分野における診断や、様々な分野の分析を行う為の化学反応を、簡便、迅速、安全に行うことが可能になる。
【０００４】
【従来の技術】
近年、医療における臨床検査の現場では、患者から採取した検体を、臨床の現場において迅速かつ簡便に検査し、結果を判断してすぐに診療に生かす、いわゆる”ポイント・オブ・ケアー・テスト”と呼ばれる診断法が求められている。また、河川、海洋や廃棄物中の有害物質の分析といった環境分野や、食品の細菌や毒物による汚染検査といった食品分野の分析についても、それぞれの現場、もしくは現場の近傍で分析・計測を行う”ポイント・オブ・フィールド・テスト”が注目されている。以下、これらの検査を”簡易迅速検査”と記載する。
【０００５】
簡易迅速検査においては、できるだけ短時間に、手動で行う操作を減らして行うことが要求される。すなわち、検体の処理から検出までの工程が１つの”カートリッジ”と呼ぶ装置の中で完結するのが望ましい。更に、このカートリッジは、安価に製造することができ”使い捨て”、または簡単に”再利用”ができるように設計されている事が望ましい。微細加工技術が発達して、このような医療診断等をカートリッジ上で完結させる技術が発達してきた。従来利用されてきた分析装置を小型化し、液体試薬を極微量反応させる”微細総合分析システム：μＴＡＳ（micro total analysis system）”の技術を簡易迅速検査へ応用する検討が進んできた。μＴＡＳでは、検体量を微量にするために、ガラスやシリコンの表面に溝を刻んで、その溝中に試薬溶液や検体を流して、分離、反応を行って、微量試料の分析を行っている（特開平２−２４５６５５、特開平３−２２６６６６、特開平８−２３３７７８、 Analytical Chem. 69、 2626-2630 (1997) Aclara Biosciencesなど）。本願出願人も、「分析装置」ＷＯ９９−６４８４６、「分析用カートリッジ及び送液制御装置」ＷＯ０１−１３１２７等のμＴＡＳ関係の発明を出願している。これらの出願明細書では、カートリッジとして樹脂製のマイクロチップを用いることが記載されている。
【０００６】
しかし、これらのカートリッジを作成する上で、微細に加工されている流路をふさがないように張り合わせる必要がある。この張り合わせ技術には高度な技術が要求され、カートリッジのコストをあげる一因となる。また、このような接着剤を用いた張り合わせで作成したカートリッジの場合、そのカートリッジ内部に弁を形成させることが容易ではない。更に、接着剤等を用いて張り合わせ加工した場合、このような接着は一般的に非可逆的であるため、一度加工したカートリッジは、分解する事ができない。従って、カートリッジを再利用する場合、微細流路を形成させたまま、その流路の内部まで洗浄を行わなくてはならず、実質的には不可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のような微細加工技術を利用したカートリッジで化学反応を行うシステムにおいて、簡単な構造で安価にそのカートリッジを作る技術を構築することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽、及び少なくとも１つの流路を有し、液体状または気体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合流体を、上記少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽から、上記少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合流体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジであって、弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有し、該流路は、
（i） 該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、
（ii） 該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、あるいは、
（iii）該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、
からなる群より選択される少なくとも１つにより構成され、該リザーバー及び／または反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴により構成されることを特徴とする化学反応用カートリッジ
に関する。
【０００９】
本発明の一実施形態において、上記空隙は、該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間に形成される空隙である。
【００１０】
気密用平板状部材（以下気密板と記す）に用いる弾性を有する材料としては、天然ゴム、ブタジエンゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、エチレン・プロピレンゴム、ニトリルゴム、アクリルゴム、ウレタンゴム、シリコンゴム、フッ素ゴム等のゴム類、軟質塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、フッ素樹脂、ナイロン樹脂等があげられる。
【００１１】
また、基板用平板状部材（以下基板と記す）に用いられる材料としては、硬質塩化ビニール樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、ポリウレタン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等のプラスチックや、アルミニウム、真鍮、鉄、銅、ステンレス、チタン合金、マグネシウム合金、ジュラルミン等の金属、ガラス、セラミックス、があげられる。
【００１２】
ここで、本発明においては、気密板は基板より弾性率が高く、逆に基板は気密板より硬度が高いという組合せが重要である。例えば、気密板にシリコンゴム、基板にフッ素樹脂の組合せでも、気密板にフッ素樹脂、基板にステンレスという組合せでも良い。また、気密板、基板共に、目的の化学反応を行わせる状態において、該化学反応に影響を及ぼさない材料であることが必須である。また、液体中の反応を行う場合には、反応を行う間、実質的に液体を通さない材料であることが、気体の反応を行わせる場合には、反応を行う間、実質的に気体を通さない材料である必要がある。
【００１３】
カートリッジ内の流路は、気密板を加工して作成しても、基板を加工して作成しても良い。流路の大きさとしては、該気密板と該基板を圧着しても、その圧力による該気密板と該基板の変形によって流路がふさがれない幅と深さが必要である。気密板及び基板に使用する材料の弾性率及び該気密板と該基板を積層構造にする際の圧着の力によって、作製される流路の幅と深さは変化する。実質的にはカートリッジの流路として機能を果たす為に深さ１０ミクロン、幅１０ミクロン以上の大きさの溝が必要である。一連の反応を１つのカートリッジの内部で完結させるためには、あまりにも大きな流路は、μＴＡＳの利点を失うことになる。実用的な流路の大きさの上限は、幅５ｍｍ、深さ１ｃｍ程度である。なお、カートリッジ内の反応液等を保存しておくリザーバー部分としては、これより深くて幅のある溝や穴を使うことも可能である。反応液の保存場所としてリザーバーの大きさの上限は、幅１０ｃｍ、深さ１０ｃｍ程度である。
【００１４】
本発明により溝や穴を加工した基板あるいは気密板を用いて、張り合わせ等の高度な技術を用いずに簡便に化学反応を行うカートリッジを作成することが可能になる。更に該カートリッジは、接着等の不可逆的な加工を必要としないので、一度加工したカートリッジを分解して洗浄し再利用することも可能である。本発明において、基板と気密板からなる積層構造を作るため、圧着する方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する積層構造に干渉しない必要がある。従って該方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する該積層構造に干渉しない部分において、貫通する穴を空けビスとナットで、あるいは、貫通する穴を空けリベットによって、あるいは、貫通しない穴を空けネジによって、あるいは積層構造の外側からのバネによって、あるいは積層構造の外側部分の接着によって圧着する方法等があげられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明は、（２）該流路の開閉を制御する少なくとも１つの弁を備えることを特徴とする上記（１）の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（３）該弁の少なくとも１つが、棒状部材を有し、該棒状部材は該カートリッジ上の流路に対して移動可能であり、該棒状部材は、開区間と閉区間を有し、該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造であり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路と、該棒状部材の開区間が連通することで、該弁が開となり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路が該棒状部材の閉区間によってふさがれることで、該弁が閉となり、それによって該カートリッジ上の流路の開閉を制御する弁として機能することを特徴とする、上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１６】
ここで、「該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造である」という事は、例えば、該棒状部材に切り欠き、溝、穴等の加工を加えて、これらを該棒状部材の開区間とする事である。
更に、本発明は（４）該弁の少なくとも１つが、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙の形成を制御することによって、該流路の開閉を制御する弁として機能することを特徴とする、上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１７】
上記弁は、例えば、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間の空隙により構成される流路において、該流路とは異なる該溝及び／または穴の側から該気密用平板状部材の部分に押力を与えて該空隙の形成を抑制することにより該流路を閉塞し、または該押力を減じて該抑制を解除することにより該流路を開放して、それによって該流路の開閉を制御する弁として機能するものであれば良いが、特に限定するものではない。
更に、本発明は（５）該弁の少なくとも１つの開閉をアクチュエーターにより制御する制御装置を備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１８】
上記（２）〜（５）の発明により、化学反応用カートリッジに簡便な構造の弁を取り入れることが可能になる。従って、化学反応を行わせる場合に、液体または気体の取扱いにおいて弁によって反応を避けたい物質同士の混合を防ぐことや、液体あるいは気体の逆流等を防止することが可能になり、容易にカートリッジ上での化学反応を制御することが可能になる。
【００１９】
また本発明は（６）化学反応が、核酸を含有する材料から核酸を遊離させる工程、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する工程、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる工程からなる核酸単離反応を含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２０】
更に、本発明は（７）核酸を含有する材料から核酸を遊離させる遊離液、核酸結合性担体、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２１】
更に、本発明は（８）核酸結合性担体、核酸を含有する材料から核酸を遊離させ、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる遊離吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２２】
更に、本発明は（９）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程がカオトロピックイオンを含有する溶液を用いることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１０）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２３】
更に、本発明は（１１）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１２）核酸結合性担体が、核酸結合性の磁性体含有粒子であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２４】
更に、本発明は（１３）核酸結合性担体が、シリカまたはシリカ誘導体からなる膜であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
上記（６）〜（１３）の発明によって、核酸を含有する試料から、核酸を化学反応カートリッジ上で抽出し、精製することが可能になる。すなわち、核酸の単離を容易に達成するカートリッジを作成することができる。
【００２５】
また、本発明は（１４）化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１５）化学反応が、核酸単離反応により単離した核酸を増幅する核酸増幅反応を更に含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は、（１６）核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２６】
上記（１４）〜（１６）の発明によって、化学反応カートリッジ上で、核酸の増幅反応を行うことができるようになる。更に上記（１５）の発明によって、化学反応カートリッジ上の溶出液で溶出された状態のまま、化学反応カートリッジ内で核酸の増幅反応を行うことができるようになり、より迅速に核酸を検出することが可能になる。更に上記（１６）の発明によって、溶出液で溶出された状態のまま、核酸のポリメラーゼ・チェイン反応を行うことができるようになり、より迅速に核酸を検出することが可能になる。
【００２７】
更に、本発明は（１７）上記の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも一部を加熱または冷却して温度制御することを特徴とする化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は、（１８）上記の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも２箇所をそれぞれ加熱及び／または冷却して異なる温度に制御することを特徴とする化学反応用カートリッジに関する。
温度制御のための手段は特に限定するものではなく、例えば温度を設定した水浴を行ったり、各種の加熱装置や冷却装置を用いることができる。
【００２８】
本発明の化学反応用カートリッジを用いて行う核酸単離反応や核酸増幅反応の対象となる核酸を含有する材料としては、例えば人の疾患の診断に用いる臨床検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓器、その他の体液、またはこれらの体液の分画、微生物汚染の検査に用いる食品、飲料水、土壌、排水、河川水、海水、ふき取り液、ふき取り綿などが挙げられる。また、例えば大腸菌などの細菌懸濁液を使用することができる。
【００２９】
本発明の化学反応用カートリッジに用いる核酸結合性担体としては、当分野において通常使用される担体であればいずれも好適に使用することができるが、本発明において、検体中の核酸の量に応じて担体の量を自在に変化させることができ、また少量の溶出液での溶出が可能であるために、特にシリカ粒子もしくはシリカ誘導体粒子、並びに磁性シリカ粒子もしくは磁性シリカ誘導体粒子が好ましい。本発明に使用されるシリカ粒子として、シグマ社製のＳｉＯ２、無定形酸化ケイ素、ガラス粉末等、シリカ誘導体粒子として、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、−ＮＨ２を有する活性シリカ、ラテックス粒子等が挙げられる。また本発明に使用される磁性シリカ粒子または磁性シリカ誘導体粒子として、東洋紡社製のMagExtractorTMキットに含まれる磁性ビーズ（以下MagExtractorTMと表記）、ロシュ社製のMagNA Pure LC DNA Isolation Kitに含まれる磁性体粒子等が挙げられる。核酸結合性担体として磁性シリカ粒子または磁性シリカ誘導体粒子を用いた場合には、磁石を利用して担体を簡便に回収することができる。また、核酸結合性担体として、シリカまたはシリカ誘導体からなる膜を用いても良い。
【００３０】
本発明において使用される核酸遊離吸着液としては、当分野において通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、特にカオトロピックイオンを含有する溶液が好ましい。カオトロピックイオンとしては、例えばグアニジンイオン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン等が挙げられる。
【００３１】
核酸結合性担体に核酸を吸着させる工程は、加熱して行うことができる。このとき加熱は、６０℃〜１３０℃、好ましくは８０℃〜１１０℃、さらに好ましくは９０℃〜１００℃で行う。
核酸が結合した核酸結合性担体の洗浄は、エタノールを含む溶液中で行うことが好ましく、特にエタノールを７０％以上含む溶液を用いることが好ましい。
また、洗浄後、核酸が結合した核酸結合性担体を乾燥させることで、洗浄に用いたエタノール等の、後の増幅反応に阻害影響を与える因子を除去することができる。
【００３２】
核酸の核酸結合性担体からの溶出は、当分野で通常行われるように、水や溶出用緩衝液を用いて行うことができる。
本発明の化学反応用カートリッジを用いて行うことができる核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ・チェイン反応、リガーゼ・チェイン反応（ＬＣＲ：Science、 241:1077-1080、 1988）、ＲＮＡ特異増幅法（ＮＡＳＢＡ法：Nature、 350:91-92、 1991）、ＳＤＡ法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、 89:392-396、 1992)等が挙げられるが、極微量の核酸の増幅効率に優れていること、短時間で信頼性のある結果が得られること等から、世の中で広く利用されているポリメラーゼ・チェイン反応が特に好ましい。ポリメラーゼ・チェイン反応は、当分野において通常使用される核酸増幅手段であり、その手順は例えばScience、 230:1350-1354、 1985等に記載されており、当業者であれば、上記文献の記載等に基づいて実験条件などを適宜改変して行うことができる。増幅産物の確認は、例えば増幅反応物を適当な条件下で電気泳動にかけ、例えばエチジウムブロマイド処理の後に紫外線照射により検出することができるが、検出手段は特に限定されるものではない。
【００３３】
上記発明により、化学反応カートリッジ上で、加熱や冷却を必要とする化学反応を行うことが可能となり、カートリッジ上で適応できる化学反応の範囲が広がる。なお、本発明において、加熱を行う場合には、その加熱部分が設定した温度において、機械的強度を維持し、液体及び／または気体の流路を維持できる材質でなければならない。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。尚、実施例及び図面中に記載された長さ、深さ、直径等の数値は単なる例示であって、本発明はこれらの数値に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
図１に示した基板（１）を、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社（現アマシャムバイオサイエンス社）製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（１０１）、棒状部材（５）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（１０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１０３）が加工されている。
【００３６】
図２に示した基板（２）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２に示したように、流路として基板１の６ｍｍの雌ネジ穴（１０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（２０１）、棒状部材（５）が挿入され移動が可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（２０２）、流路としてこれらの穴を結ぶ深さ１ｍｍ、幅１ｍｍの溝（２０４）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２０３）が加工されている。
【００３７】
図３に示した気密板（３）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３に示したように、流路として基板１の６ｍｍの雌ネジ穴（１０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（３０１）、棒状部材（５）が移動可能なように挿入され、かつ、棒状部材の切り欠きの無い部分が挿入された場合においては、気密性が保たれるようなクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（３０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３０３）が加工されている。
【００３８】
図４に示した気密板（４）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図４に示したように、棒状部材（５）が移動可能なように挿入され、かつ、棒状部材の切り欠きの無い部分が挿入された場合においては、気密性が保たれるようなクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（４０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４０３）が加工されている。
【００３９】
図５に示した棒状部材（５）は、直径３ｍｍ、長さ２０ｍｍのテフロン棒で作成した。該棒状部材は、図に示したように、棒の中央付近に長さ方向に幅２ｍｍ、深さ１ｍｍの切り欠き（５０１）が加工されている。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組（６）で積層状に圧着し、図６に示したカートリッジを作成した。
【００４０】
このカートリッジに、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、カートリッジの両側にそれぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）をつなげ、更に、そのチューブの１つの先端を空気ポンプにつなげた。このカートリッジに最大圧が０．１気圧に調整された空気を毎分１０ｍｌの流速で送気した。その結果、このカートリッジの流路からは、空気の漏れが確認されず、更に棒状部材（５）の移動によって、カートリッジ内の流路の開状態と閉状態が達成された。即ち、棒状部材の切り欠き部分（５０１）が、２枚の基板２と、一枚の気密板４で形成されている流路を連通するように、棒状部材が位置するように移動された場合は、該弁が開状態となり、切り欠き部分（５０１）が、２枚の基板２と、一枚の気密板４で形成されている流路を連通しないように基板１の所に移動された場合は、該弁が閉状態となった。
【００４１】
従って、このカートリッジは、開閉可能な弁を備えた流路として機能することが確認された。なお、気密板（３、４）は、基板（１、２）に比して弾性を持つため、ネジとナット(６)による圧着の力の加減により、主に気密板(３、４)が少し変形するので、気密板(３、４)と基板(１、２)の密着する程度や、棒状部材（５）と気密板（３、４）のクリアランスの程度を加減することが可能である。この加減によって、カートリッジ上の流路や弁の部分の気密性を加減することが可能である。
【００４２】
実施例２
図７に示した基板（７）を、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図７に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（７０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（７０２）が加工されている。
【００４３】
図８に示した基板（８）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図８に示したように、流路として基板９の６ｍｍの雌ネジ穴（９０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（８０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（８０２）、流路として２カ所の直径１ｍｍの穴（８０３）、及び流路として２カ所の深さ１ｍｍ、幅１ｍｍの溝（８０４）が加工されている。
【００４４】
図９に示した基板（９）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図９に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（９０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（９０２）、棒状部材（１２）が挿入され、移動可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（９０３）、この穴に連結する幅３ｍｍ、深さ２ｍｍの溝（９０４）が加工されている。
【００４５】
図１０に示した気密板（１０）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。図１０に示したように、流路として基板７の６ｍｍの雌ネジ穴（７０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（１００１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１００２）が加工されている。
【００４６】
図１１に示した気密板（１１）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１１に示したように、流路として基板９の６ｍｍの雌ネジ穴（９０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（１１０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１１０２）が加工されている。
【００４７】
図１２に示した棒状部材（１２）を、直径３ｍｍ、長さ２０ｍｍのテフロン棒で作成した。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組（１３）で積層状に圧着し、図１３に示したカートリッジを作成した。このカートリッジに、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、カートリッジの両側にそれぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）をつなげ、更に、そのチューブの１つの先端を空気ポンプにつなげた。このカートリッジに最大圧が０．１気圧に調整された空気を毎分１０ｍｌの流速で送気した。その結果、このカートリッジの流路は、空気の漏れが確認されず、更に棒状部材（１２）を流路方向へ押す力の有無によって、カートリッジ内の流路の開状態と閉状態が達成された。従って、このカートリッジは、開閉可能な弁を備えた流路として機能することが確認された。即ち、この弁は、棒状部材に対して押す力の無い場合は、流路に流れる空気の圧力によって、気密板１１において、基板９の溝（９０４）に接している部分が、該溝の方向に変形することで流路が確保されることで開状態となり、棒状部材が流路方向に押されている場合は、気密板１１が、基板８に押しつけられている為に、流路が確保されないので閉状態となった。また、気密板（１０、１１）は、基板（７、８、９）に比して弾性を持つため、ネジとナット（１３）による圧着の力の加減により、主に気密板（１０、１１）が少し変形するので、気密板（１０、１１）と基板（７、８、９）の密着する程度を加減することが可能である。この加減によって、カートリッジ上の流路や弁の部分の気密性を加減することが可能である。
【００４８】
実施例３
図１４に示した基板（１４）を、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１４に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（１４０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１４０２）、プラスチック製注射筒（テルモ製）が挿入できるような直径４ｍｍの穴（１４０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１４０４）、トラップ用の直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状の磁石を２個並べて挿入できる楕円状の穴（１４０５）が加工されている。
【００４９】
図１５に示した基板（１５）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１５に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できる直径２ｍｍの穴（１５０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１５０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１５０３）、流路として直径２ｍｍの穴（１５０１）、トラップ部分として深さ１ｍｍの楕円状の溝（１５０５）が加工されている。
【００５０】
図１６に示した基板（１６）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１０ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１６に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１６０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１６０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１６０３）、流路として直径２ｍｍの穴（１６０１）、反応漕として機能する五角形状の穴（１６０６）、該反応漕への試料導入口として直径５ｍｍの穴（１６０７）が加工されている。更に、該試料導入口の開放部は６ｍｍの雌ネジが加工されている。
【００５１】
図１７に示した基板（１７）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１７に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１７０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１７０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１７０３）が加工されている。
【００５２】
図１８に示した気密板（１８）は、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１８に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（１８０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１８０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（１８０４）、トラップ用の直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状の磁石を２個並べて挿入できる楕円状の穴（１８０５）が加工されている。
【００５３】
図１９に示した気密板（１９）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１９に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（１９０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１９０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（１９０４）、トラップ部分として基板１５の楕円状の溝（１５０５）の位置に対応する位置に楕円状の穴（１９０５）、反応漕として機能する五角形状の穴（１９０６）が加工されている。
【００５４】
図２０に示した気密板（２０）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図２０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２００２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（２００４）、反応漕として機能する五角形状の穴（２００６）が加工されている。
【００５５】
図２１に示した棒状部材（２１）は、直径２ｍｍ、長さ２７ｍｍのステンレス棒で作成した。該棒状部材は、図に示したように、棒の中央部分（２１０１）が、長さ方向に幅２ｍｍに渡って、直径１ｍｍとなるように加工されている。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組で積層状に圧着し、図２２に示したカートリッジを作成した。
【００５６】
上記カートリッジに、リザーバー１（Ｒ１）として９００μｌの遊離吸着液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー２（Ｒ２）として１０００μｌの洗浄液（７０％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー３（Ｒ３）として１０００μｌの洗浄液（９９％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー４（Ｒ４）として５００μｌの溶出液（蒸留水）を注入したプラスチック製注射筒を、それぞれ取り付けた。カートリッジは、外部からの押す力によって、各バルブ（Ｖ１〜Ｖ１１）に設置された棒状部材（２１）が移動し、バルブ部分の流路の開閉操作が可能となっている。また、トラップ部（Ｍ１〜Ｍ３）へ磁石（直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状磁石が２個）の設置と除去が可能になっている。またポンプ部との接合口（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、それぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）が接合され、更にその先にシリンジポンプ（ファルマシア社、Ｐ−６０００）を利用した空気ポンプが接合され、この空気送気による送液が可能になっている。更に、遊離吸着反応槽（Ｒ５）を含むカートリッジ下部は、湯浴による加熱装置（Ｈ１）で加熱することが可能になっている。
【００５７】
本カートリッジを用いて、以下の手順で、大腸菌から菌の核酸を抽出精製した。まず、すべてのバルブ（Ｖ１〜Ｖ１１）を閉にし、トラップ部分（Ｍ１〜Ｍ３）に磁石を設置した。次に、遊離吸着反応槽（Ｒ５）に、菌体の個数として１０７個の大腸菌（Escherichia coli）と、磁性シリカ粒子（東洋紡製）の懸濁液４０μｌを入れた。菌体導入後、遊離吸着反応槽（Ｒ５）の上部の試料導入口（Ｓ１）を、一端を閉じた液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社）を用いて閉じた。遊離吸着反応槽（Ｒ５）を含むカートリッジの下部（Ｈ１）を湯浴中で９８℃に加熱した。バルブ３（Ｖ３）を開にした後、リザーバー１（Ｒ１）の遊離吸着液を反応槽（Ｒ５）の部分に導いた。３分後、バルブ１、４、６（Ｖ１、Ｖ４、Ｖ６）を開け、バルブ３（Ｖ３）を閉じ、ポンプとの接合口１（Ｐ１）から空気を送気して、遊離吸着反応槽（Ｒ５）の液体を廃液口１（Ｗ１）に廃液した。この段階でトラップ１（Ｍ１）の部分に磁性シリカ粒子が集積された。バルブ１（Ｖ１）、バルブ６（Ｖ６）を閉じ、バルブ２（Ｖ２）、バルブ７（Ｖ７）、バルブ８（Ｖ８）、バルブ１０（Ｖ１０）を開にして、トラップ１（Ｍ１）部分の磁石を取り除いたあと、リザーバー２（Ｒ２）の洗浄液を流した。更に、バルブ２（Ｖ２）を開け、ポンプとの接合口２（Ｐ２）から空気を送気して、遊離吸着反応槽（Ｒ５）に残っている液体を廃液口２（Ｗ２）に廃液すると同時に、磁性シリカ粒子を分散させ洗浄してトラップ２（Ｍ２）の部分に再度集積させた。バルブ４（Ｖ４）を閉じ、トラップ２（Ｍ２）の部分の磁石を取り除いた。リザーバー３（Ｒ３）の洗浄液を流して廃液口２（Ｗ２）に廃液すると同時に、磁性シリカ粒子を分散させ洗浄してトラップ３（Ｍ３）の部分に再度集積させた。バルブ８（Ｖ８）を閉じ、バルブ５（Ｖ５）を開け、１０分間、空気ポンプ接合口（Ｐ３）から５０ｍｌ／分の空気を送気して、磁性シリカ粒子上に残っているエタノールを乾燥した。バルブ５（Ｖ５）、バルブ１０（Ｖ１０）を閉じ、バルブ９（Ｖ９）、バルブ１１（Ｖ１１）を開にし、トラップ３（Ｍ３）部分の磁石を取り除いた。リザーバー４（Ｒ４）の溶出液を流して、磁性シリカ粒子を分散させながら、回収口３（Ｗ３）から溶出液を回収した。
【００５８】
次に、回収した溶出液中に大腸菌由来のＤＮＡが精製されていることを、以下の方法で確認した。回収した溶出液の５μｌをポリメラーゼ・チェイン反応用マイクロチューブ（Multi Ultra PCR Tube、Sorenson BioScience製）に入れ、２種類のオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）と、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）について２０μＭの溶液を各１μｌ、基質（ｄＮＴＰ mixture：TAKARA社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ、TAKARA社製）０．５μｌ、緩衝液（３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。上記配列番号１及び配列番号２のオリゴ核酸をプライマーとしたポリメラーゼ・チェイン反応を行った場合、精製された大腸菌由来のDNAが存在している試料では、約２００ｂｐの増幅産物が得られることになる。
【００５９】
鉱物油（シグマ社製）２０μｌを重層して、サーモサイクラー（RoboCycler：ストラタジーン製）で、９８℃を２０秒と６５℃を３０秒の４０サイクルのポリメラーゼ・チェイン反応を行った。その後、ポリメラーゼ・チェイン反応液１０μｌにサンプル処理液（１０× Loading Buffer：TAKARA製）１μｌを添加し、それを、３％アガロースゲル（NuSieve3:1 agaroseをＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し固めたもの）で電気泳動（Mupid：ADVANCE社製）した。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド水溶液（１μｇ／ｍｌ）に１５分間浸した。次にアガロースゲルを取り出し紫外線を当てて、電気泳動されたＤＮＡを検出した。その結果、図２３に示したように、マーカーのＤＮＡ（２２）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（２３）として検出された。従って本発明のカートリッジによって、大腸菌のＤＮＡが単離された事が示された。
【００６０】
実施例４
図２４に示した基板（２４）を、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２４に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（２４０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２４０２）、プラスチック製注射筒（テルモ製）が挿入できるような直径４ｍｍの穴（２４０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２４０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（２４０５）が加工されている。
【００６１】
図２５に示した基板（２５）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２５に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２５０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２５０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２５０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２５０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（２５０５）が加工されている。
【００６２】
図２６に示した基板（２６）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１０ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２６に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２６０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２６０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２６０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２６０４）、反応漕として機能する五角形状の穴（２６０６）、該反応漕への試料導入口として直径５ｍｍの穴（２６０７）が加工されている。更に、該試料導入口の開放部は６ｍｍの雌ネジが加工されている。
【００６３】
図２７に示した基板（２７）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２７に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２７０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２７０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２７０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２７０４）が加工されている。
【００６４】
図２８に示した基板（２８）を、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２８に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２８０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２８０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２８０３）が加工されている。
【００６５】
図２９に示した基板（２９）は、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２９に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２９０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２９０１）、トラップ部分としてシリカ膜が設置できる直径８ｍｍの穴（２９０５）が加工されている。
【００６６】
図３０に示した気密板（３０）は、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３００２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３００４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（３００５）、流路として直径２ｍｍの穴（３００１）が加工されている。
【００６７】
図３１に示した気密板（３１）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３１に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３１０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３１０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（３１０５）、反応漕として機能する五角形状の穴（３１０６）、流路として直径２ｍｍの穴（３１０１）が加工されている。
【００６８】
図３２に示した気密板（３２）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３２に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３２０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３２０４）、反応漕として機能する五角形状の穴（３２０６）、流路として直径２ｍｍの穴（３２０１）が加工されている。
【００６９】
図３３に示した気密板（３３）は、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３３に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３３０２）、流路として直径２ｍｍの穴（３３０１）が加工されている。
【００７０】
図３４に示した気密板（３４）を、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３４に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３４０２）、流路として直径２ｍｍの穴（３４０１）、トラップ部分としてシリカ膜が設置でき、その流路の機密性を保てるような直径６ｍｍの穴（３４０５）が加工されている。
これらの部品及び実施例３で用いたものと同じ棒状部材（２１）と、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２５ｍｍ）とナットの組で、図３５に示したカートリッジに組み立てた。
【００７１】
上記カートリッジに、リザーバー１１（Ｒ１１）として９００μｌの遊離吸着液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー１２（Ｒ１２）として１０００μｌの洗浄液（７０％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー１３（Ｒ１３）として１０００μｌの洗浄液（９９％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒をリザーバー１４（Ｒ１４）として５００μｌの溶出液（蒸留水）を注入したプラスチック製注射筒を、それぞれ取り付けた。更に、トラップ（Ｍ１１）の部分に、シリカ膜（キアゲン社製、ＤＮｅａｓｙＲ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔから取り出して使用、直径約８ｍｍ、厚さ約２ｍｍ）を設置した。カートリッジは、外部からの押す力によって、各バルブ（Ｖ２１〜Ｖ３２）に設置された棒状部材（２１）が移動し、バルブ部分の流路の開閉操作が可能となっている。またポンプ部との接合口（Ｐ１１、Ｐ１２）に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、それぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）が接合され、更にその先にシリンジポンプ（ファルマシア社、Ｐ−６０００）を利用した空気ポンプが接合され、この空気送気による送液が可能になっている。更に、遊離吸着反応槽（Ｒ１５）を含むカートリッジ下部は、湯浴による加熱装置（Ｈ１１）で加熱することが可能になっている。
【００７２】
本カートリッジを用いて、以下の手順で、大腸菌から菌の核酸を抽出精製した。まず、すべてのバルブ（Ｖ２１〜Ｖ３２）を閉にした。次に、遊離吸着反応槽（Ｒ１５）に、菌体の個数として１０７個の大腸菌（Escherichia coli）を入れ、遊離吸着反応槽の上部の試料導入口（Ｓ１１）を、直径６ｍｍ、長さ１０ｍｍのナットを用いて閉じた。遊離吸着反応槽（Ｒ１５）を含むカートリッジの下部（Ｈ１１）を湯浴中で９８℃に加熱した。バルブ２２、２６（Ｖ２２、２６）を開にした後、リザーバー１１（Ｒ１１）の遊離吸着液を反応槽（Ｒ１５）の部分に導いた。３分後、バルブ２１、２７、３２（Ｖ２１、Ｖ２７、Ｖ３２）を開け、バルブ２６（Ｖ２６）を閉じ、ポンプとの接合口１１（Ｐ１１）から空気を送気して、反応槽（Ｒ１５）の液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。この段階で、大腸菌から遊離した核酸をトラップ（Ｍ１１）のシリカ膜に吸着させた。バルブ２２（Ｖ２２）を閉じ、バルブ２４（Ｖ２４）を開にして、リザーバー１２（Ｒ１２）の洗浄液を流した。更に、バルブ２３（Ｖ２３）を開け、Ｐ１１から空気を送気して、反応槽（Ｒ１５）に残っている液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。バルブ２７（Ｖ２７）を閉じ、バルブ２８（Ｖ２８）を開け、リザーバー１３（Ｒ１３）の洗浄液を流した。更に、バルブ２５（Ｖ２５）を開け、Ｐ１１から空気を送気して流路内の液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。バルブ２８（Ｖ２８）を閉じ、バルブ３０（Ｖ３０）を開け、空気ポンプ接合口１２（Ｐ１２）から５０ｍｌ／分の空気を１０分間送気して、シリカ膜上に残っているエタノールを乾燥した。バルブ３０、３２（Ｖ３０、３２）を閉じ、バルブ２９、３１（Ｖ２９、３１）を開けリザーバー１４（Ｒ１４）の溶出液を流して、回収口１２（Ｗ１２）から溶出液を回収した。
【００７３】
次に、回収した溶出液中に大腸菌由来のＤＮＡが精製されていることを、実施例３と同一の方法で確認した。その結果、図３６に示したように、マーカーのＤＮＡ（３５）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（３６）として検出された。従って本発明のカートリッジによって、大腸菌のＤＮＡが単離された事が示された。
【００７４】
実施例５
図３７に示した基板（３７）を、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３７に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（３７０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３７０２）が加工されている。
【００７５】
図３８に示した基板（３８）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３８に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３８０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（３８０３）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（３８０４）、流路として直径１ｍｍの穴（３８０５）が加工されている。
【００７６】
図３９に示した基板（３９）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３９に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３９０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（３９０３）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（３９０４）、流路として直径１ｍｍの穴（３９０５）が加工されている。
【００７７】
図４０に示した気密板（４０）は、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図４０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４００２）、流路として直径２ｍｍの穴（４００１）が加工されている。
【００７８】
図４１に示した気密板（４１）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は図４１に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４１０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（４１０３）、流路として直径１ｍｍの穴（４１０１）が加工されている。
【００７９】
これらの部品とビス（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ及び直径１．６ｍｍ、長さ８ｍｍ）とナット（Ｍ２、Ｍ１．６）の各組を用いて図４２に示したカートリッジを組み立てた。次に、ポリメラーゼ・チェイン反応における２温度間の往復反応が４０回できるように、図４２に示したカートリッジを２枚組合せ、更に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）（４２）、テフロンチューブ（内径０．５ｍｍ、外径１．７ｍｍ）（４３）、２方向変換バルブ（ファルマシア社製）（４４）、ポンプ（Ｐ−５００、ファルマシア社製）（４５）、注射筒（４６）を接合して、図４３に示した装置を作成した。カートリッジ部分は、加熱装置（４７、４８）によって、９２℃と６５℃の２つの温度に加熱されるようになっている。
【００８０】
大腸菌由来核酸を、実施例４に従って精製した試料のうち、５０μｌに、２種類の２０μＭのオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）各１０μｌ、基質（ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＴＡＫＡＲＡ社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ、ＴＡＫＡＲＡ社製）２５μｌ、緩衝液（２．５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５０μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５０μｌにした。この試料を、注射筒（４６）に注入した。
【００８１】
ポンプ（４５）を用いて、予めカートリッジの流路内に鉱物油（シグマ社製）を満たしておいた。バルブ（４４）を回転させた後、注射筒（４６）の試料をカートリッジ内に導入した後、上記配列番号１及び配列番号２のオリゴ核酸をプライマーとしたポリメラーゼ・チェイン反応を行った。反応が生じた場合には、約２００ｂｐの増幅産物が得られることになる。
【００８２】
次いでバルブ（４４）を回転させて、ポンプ（４５）から鉱物油を９ｍｌ／時の流速でカートリッジ内に送液し、回収口（４９）から反応液を回収した。実施例４に準じてアガロースゲル電気泳動を実施し、反応液中の増幅された核酸を検出した。その結果、図４４に示したように、マーカーのＤＮＡ（５０）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（５１）として検出された。従って、本発明のカートリッジによって、核酸の増幅反応が達成されたことがわかった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明による化学反応用カートリッジは、安価に製造することが可能である。また、その中で化学反応を行わせることが可能であり、医療診断、化学分析、食品分析、等が容易に達成できる。特に医療診断分野においては、カートリッジの中で迅速、簡便に化学反応を達成することが可能で、医療検体中に存在する可能性のある危険物質を、通常の診断のように人手を使って行う必要が無くなり、感染の危険性が減少するので有用である。また、接着による非可逆的な加工を避けることができ、分解して洗浄することで、再利用が可能であり、廃棄物を減少させることもできる。
【００８４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカートリッジを構成する基板（１）の平面図及び断面図を示す。
【図２】本発明のカートリッジを構成する基板（２）の平面図及び断面図を示す。
【図３】本発明のカートリッジを構成する気密板（３）の平面図及び断面図を示す。
【図４】本発明のカートリッジを構成する気密板（４）の平面図及び断面図を示す。
【図５】本発明のカートリッジを構成する棒状部材（５）の平面図及び断面図を示す。
【図６】本発明のカートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図７】本発明のカートリッジを構成する基板（７）の平面図及び断面図を示す。
【図８】本発明のカートリッジを構成する基板（８）の平面図及び断面図を示す。
【図９】本発明のカートリッジを構成する基板（９）の平面図及び断面図を示す。
【図１０】本発明のカートリッジを構成する気密板（１０）の平面図及び断面図を示す。
【図１１】本発明のカートリッジを構成する気密板（１１）の平面図及び断面図を示す。
【図１２】本発明のカートリッジを構成する棒状部材（１２）の平面図及び断面図を示す。
【図１３】本発明のカートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図１４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１４）の平面図及び断面図を示す。
【図１５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１５）の平面図及び断面図を示す。
【図１６】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１６）の平面図及び断面図を示す。
【図１７】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１７）の平面図及び断面図を示す。
【図１８】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１８）の平面図及び断面図を示す。
【図１９】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１９）の平面図及び断面図を示す。
【図２０】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（２０）の平面図及び断面図を示す。
【図２１】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する棒状部材（２１）の平面図及び側面図を示す。
【図２２】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図２３】実施例３の結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真印刷を示す。
【図２４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２４）の平面図及び断面図を示す。
【図２５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２５）の平面図及び断面図を示す。
【図２６】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２６）の平面図及び断面図を示す。
【図２７】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２７）の平面図及び断面図を示す。
【図２８】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２８）の平面図及び断面図を示す。
【図２９】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２９）の平面図及び断面図を示す。
【図３０】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３０）の平面図及び断面図を示す。
【図３１】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３１）の平面図及び断面図を示す。
【図３２】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３２）の平面図及び断面図を示す。
【図３３】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３３）の平面図及び断面図を示す。
【図３４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３４）の平面図及び断面図を示す。
【図３５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図３６】実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図３７】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３７）の平面図及び断面図を示す。
【図３８】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３８）の平面図及び断面図を示す。
【図３９】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３９）の平面図及び断面図を示す。
【図４０】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（４０）の平面図及び断面図を示す。
【図４１】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（４１）の平面図及び断面図を示す。
【図４２】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図４３】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを用いた増幅反応を行う装置の構成を示す概念図を示す。
【図４４】実施例５におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【符号の説明】
１：基板、２：基板、３：気密板、４：気密板、５：棒状部材、
６：ネジとナットの組
７：基板、８：基板、９：基板、１０：気密板、１１：気密板、
１２：棒状部材、１３：ネジとナットの組
１４：基板、１５：基板、１６：基板、１７：基板、
１８：気密板、１９：気密板、２０：気密板、２１：棒状部材、
２２：ＤＮＡ分子量マーカー、２３：増幅されたＤＮＡ断片、
２４：基板、２５：基板、２６：基板、２７：基板、２８：基板、
２９：基板、
３０：気密板、３１：気密板、３２：気密板、３３：気密板、
３４：気密板、
３５：ＤＮＡ分子量マーカー、３６：増幅されたＤＮＡ断片、
３７：基板、３８：基板、３９：基板、
４０：気密板、４１：気密板、
４２：接合部品、４３：テフロンチューブ、４４：バルブ、４５：ポンプ、
４６：注射筒、４７：加温装置、４８：加温装置、４９：回収口、
５０：ＤＮＡ分子量マーカー、５１：増幅されたＤＮＡ断片、
１０１：雌ネジ、１０２：穴、１０３：穴、
２０１：穴、２０２：穴、２０３：穴、２０４：溝、
３０１：穴、３０２：穴、３０３：穴、
４０２：穴、４０３：穴、
５０１：切り欠き、
７０１：雌ネジ、７０２：穴、
８０１：穴、８０２：穴、８０３：穴、８０４：溝、
９０１：雌ネジ、９０２：穴、９０３：穴、９０４：溝、
１００１：穴、１００２：穴、
１１０１：穴、１１０２：穴、
１４０１：雌ネジ、１４０２：穴、１４０３：穴、１４０４：穴、１４０５：穴、
１５０１：穴、１５０２：穴、１５０３：溝、１５０４：穴、１５０５：溝、
１６０１：穴、１６０２：穴、１６０３：溝、１６０４：穴、１６０６：穴、１６０７：穴、
１７０２：穴、１７０３：溝、１７０４：穴、
１８０１：穴、１８０２：穴、１８０４：穴、１８０５：穴、
１９０１：穴、１９０２：穴、１９０４：穴、１９０５：穴、１９０６：穴、
２００２：穴、２００４：穴、２００６：穴、
２１０１：中央部分、
２４０１：雌ネジ、２４０２：穴、２４０３：穴、２４０４：穴、２４０５：穴、
２５０１：穴、２５０２：穴、２５０３：溝、２５０４：穴、２５０５：穴、
２６０１：穴、２６０２：穴、２６０３：溝、２６０４：穴、２６０６：穴、２６０７：穴、
２７０１：穴、２７０２：穴、２７０３：溝、２７０４：穴、
２８０１：穴、２８０２：穴、２８０３：溝、
２９０１：穴、２９０２：穴、２９０５：穴、
３００１：穴、３００２：穴、３００４：穴、３００５：穴、
３１０１：穴、３１０２：穴、３１０４：穴、３１０５：穴、３１０６：穴、
３２０１：穴、３２０２：穴、３２０４：穴、３２０６：穴、
３３０１：穴、３３０２：穴、
３４０１：穴、３４０２：穴、３４０５：穴、
３７０１：雌ネジ、３７０２：穴、
３８０２：穴、３８０３：穴、３８０４：溝、３８０５：穴、
３９０２：穴、３９０３：穴、３９０４：溝、３９０５：穴、
４００１：穴、４００２：穴、
４１０１：穴、４１０２：穴、４１０３：穴、
Ｖ１：バルブ１、Ｖ２：バルブ２、Ｖ３：バルブ３、Ｖ４：バルブ４、
Ｖ５：バルブ５、Ｖ６：バルブ６、Ｖ７：バルブ７、Ｖ８：バルブ８、
Ｖ９：バルブ９、Ｖ１０：バルブ１０、Ｖ１１：バルブ１１、
Ｍ１：トラップ１、Ｍ２：トラップ２、Ｍ３：トラップ３、
Ｐ１：ポンプ接合口１、Ｐ２：ポンプ接合口２、Ｐ３：ポンプ接合口３、
Ｒ１：リザーバー１、Ｒ２：リザーバー２、Ｒ３：リザーバー３、
Ｒ４：リザーバー４、
Ｒ５：遊離吸着反応槽、
Ｗ１：排出口１、Ｗ２：排出口２、Ｗ３：回収口３、
Ｓ１：試料導入口、Ｈ１：加熱装置
Ｖ２１：バルブ２１、Ｖ２２：バルブ２２、Ｖ２３：バルブ２３、
Ｖ２４：バルブ２４、Ｖ２５：バルブ２５、Ｖ２６：バルブ２６、
Ｖ２７：バルブ２７、Ｖ２８：バルブ２８、Ｖ２９：バルブ２９、
Ｖ３０：バルブ３０、Ｖ３１：バルブ３１、Ｖ３２：バルブ３２、
Ｍ１１：トラップ、
Ｐ１１：空気ポンプ接合口１１、Ｐ１２：空気ポンプ接合口１２、
Ｒ１１：リザーバー１１、Ｒ１２：リザーバー１２、
Ｒ１３：リザーバー１３、Ｒ１４：リザーバー１４、
Ｒ１５：遊離吸着反応槽、
Ｗ１１：排出口１１、Ｗ１２：回収口１２、
Ｓ１１：試料導入口、
Ｈ１１：加熱装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構造を有する化学反応用カートリッジに関する。詳しくは、弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有する化学反応用カートリッジに関する。
【０００２】
該カートリッジは、液体状または気体状の試料や試薬、または該試料と該試薬の混合流体を、少なくとも１つのリザーバーまたは反応槽から、少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合流体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジである。カートリッジ内部の流路は、該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、及び、該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、からなる群より選択される少なくとも１つにより構成される。カートリッジ内部のリザーバーや反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝や穴により構成される。また、該カートリッジには、液体や気体用の弁を形成することができる。
【０００３】
本発明により、化学反応を行うカートリッジを作成することが容易になる。このカートリッジとカートリッジ上の反応を制御する簡単な機械を使って、医療分野における診断や、様々な分野の分析を行う為の化学反応を、簡便、迅速、安全に行うことが可能になる。
【０００４】
【従来の技術】
近年、医療における臨床検査の現場では、患者から採取した検体を、臨床の現場において迅速かつ簡便に検査し、結果を判断してすぐに診療に生かす、いわゆる”ポイント・オブ・ケアー・テスト”と呼ばれる診断法が求められている。また、河川、海洋や廃棄物中の有害物質の分析といった環境分野や、食品の細菌や毒物による汚染検査といった食品分野の分析についても、それぞれの現場、もしくは現場の近傍で分析・計測を行う”ポイント・オブ・フィールド・テスト”が注目されている。以下、これらの検査を”簡易迅速検査”と記載する。
【０００５】
簡易迅速検査においては、できるだけ短時間に、手動で行う操作を減らして行うことが要求される。すなわち、検体の処理から検出までの工程が１つの”カートリッジ”と呼ぶ装置の中で完結するのが望ましい。更に、このカートリッジは、安価に製造することができ”使い捨て”、または簡単に”再利用”ができるように設計されている事が望ましい。微細加工技術が発達して、このような医療診断等をカートリッジ上で完結させる技術が発達してきた。従来利用されてきた分析装置を小型化し、液体試薬を極微量反応させる”微細総合分析システム：μＴＡＳ（micro total analysis system）”の技術を簡易迅速検査へ応用する検討が進んできた。μＴＡＳでは、検体量を微量にするために、ガラスやシリコンの表面に溝を刻んで、その溝中に試薬溶液や検体を流して、分離、反応を行って、微量試料の分析を行っている（特開平２−２４５６５５、特開平３−２２６６６６、特開平８−２３３７７８、 Analytical Chem. 69、 2626-2630 (1997) Aclara Biosciencesなど）。本願出願人も、「分析装置」ＷＯ９９−６４８４６、「分析用カートリッジ及び送液制御装置」ＷＯ０１−１３１２７等のμＴＡＳ関係の発明を出願している。これらの出願明細書では、カートリッジとして樹脂製のマイクロチップを用いることが記載されている。
【０００６】
しかし、これらのカートリッジを作成する上で、微細に加工されている流路をふさがないように張り合わせる必要がある。この張り合わせ技術には高度な技術が要求され、カートリッジのコストをあげる一因となる。また、このような接着剤を用いた張り合わせで作成したカートリッジの場合、そのカートリッジ内部に弁を形成させることが容易ではない。更に、接着剤等を用いて張り合わせ加工した場合、このような接着は一般的に非可逆的であるため、一度加工したカートリッジは、分解する事ができない。従って、カートリッジを再利用する場合、微細流路を形成させたまま、その流路の内部まで洗浄を行わなくてはならず、実質的には不可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のような微細加工技術を利用したカートリッジで化学反応を行うシステムにおいて、簡単な構造で安価にそのカートリッジを作る技術を構築することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽、及び少なくとも１つの流路を有し、液体状または気体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合流体を、上記少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽から、上記少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合流体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジであって、弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有し、該流路は、
（i） 該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、
（ii） 該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、あるいは、
（iii）該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、
からなる群より選択される少なくとも１つにより構成され、該リザーバー及び／または反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴により構成されることを特徴とする化学反応用カートリッジ
に関する。
【０００９】
本発明の一実施形態において、上記空隙は、該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間に形成される空隙である。
【００１０】
気密用平板状部材（以下気密板と記す）に用いる弾性を有する材料としては、天然ゴム、ブタジエンゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、エチレン・プロピレンゴム、ニトリルゴム、アクリルゴム、ウレタンゴム、シリコンゴム、フッ素ゴム等のゴム類、軟質塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、フッ素樹脂、ナイロン樹脂等があげられる。
【００１１】
また、基板用平板状部材（以下基板と記す）に用いられる材料としては、硬質塩化ビニール樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、ポリウレタン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等のプラスチックや、アルミニウム、真鍮、鉄、銅、ステンレス、チタン合金、マグネシウム合金、ジュラルミン等の金属、ガラス、セラミックス、があげられる。
【００１２】
ここで、本発明においては、気密板は基板より弾性率が高く、逆に基板は気密板より硬度が高いという組合せが重要である。例えば、気密板にシリコンゴム、基板にフッ素樹脂の組合せでも、気密板にフッ素樹脂、基板にステンレスという組合せでも良い。また、気密板、基板共に、目的の化学反応を行わせる状態において、該化学反応に影響を及ぼさない材料であることが必須である。また、液体中の反応を行う場合には、反応を行う間、実質的に液体を通さない材料であることが、気体の反応を行わせる場合には、反応を行う間、実質的に気体を通さない材料である必要がある。
【００１３】
カートリッジ内の流路は、気密板を加工して作成しても、基板を加工して作成しても良い。流路の大きさとしては、該気密板と該基板を圧着しても、その圧力による該気密板と該基板の変形によって流路がふさがれない幅と深さが必要である。気密板及び基板に使用する材料の弾性率及び該気密板と該基板を積層構造にする際の圧着の力によって、作製される流路の幅と深さは変化する。実質的にはカートリッジの流路として機能を果たす為に深さ１０ミクロン、幅１０ミクロン以上の大きさの溝が必要である。一連の反応を１つのカートリッジの内部で完結させるためには、あまりにも大きな流路は、μＴＡＳの利点を失うことになる。実用的な流路の大きさの上限は、幅５ｍｍ、深さ１ｃｍ程度である。なお、カートリッジ内の反応液等を保存しておくリザーバー部分としては、これより深くて幅のある溝や穴を使うことも可能である。反応液の保存場所としてリザーバーの大きさの上限は、幅１０ｃｍ、深さ１０ｃｍ程度である。
【００１４】
本発明により溝や穴を加工した基板あるいは気密板を用いて、張り合わせ等の高度な技術を用いずに簡便に化学反応を行うカートリッジを作成することが可能になる。更に該カートリッジは、接着等の不可逆的な加工を必要としないので、一度加工したカートリッジを分解して洗浄し再利用することも可能である。本発明において、基板と気密板からなる積層構造を作るため、圧着する方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する積層構造に干渉しない必要がある。従って該方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する該積層構造に干渉しない部分において、貫通する穴を空けビスとナットで、あるいは、貫通する穴を空けリベットによって、あるいは、貫通しない穴を空けネジによって、あるいは積層構造の外側からのバネによって、あるいは積層構造の外側部分の接着によって圧着する方法等があげられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明は、（２）該流路の開閉を制御する少なくとも１つの弁を備えることを特徴とする上記（１）の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（３）該弁の少なくとも１つが、棒状部材を有し、該棒状部材は該カートリッジ上の流路に対して移動可能であり、該棒状部材は、開区間と閉区間を有し、該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造であり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路と、該棒状部材の開区間が連通することで、該弁が開となり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路が該棒状部材の閉区間によってふさがれることで、該弁が閉となり、それによって該カートリッジ上の流路の開閉を制御する弁として機能することを特徴とする、上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１６】
ここで、「該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造である」という事は、例えば、該棒状部材に切り欠き、溝、穴等の加工を加えて、これらを該棒状部材の開区間とする事である。
更に、本発明は（４）該弁の少なくとも１つが、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙の形成を制御することによって、該流路の開閉を制御する弁として機能することを特徴とする、上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１７】
上記弁は、例えば、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間の空隙により構成される流路において、該流路とは異なる該溝及び／または穴の側から該気密用平板状部材の部分に押力を与えて該空隙の形成を抑制することにより該流路を閉塞し、または該押力を減じて該抑制を解除することにより該流路を開放して、それによって該流路の開閉を制御する弁として機能するものであれば良いが、特に限定するものではない。
更に、本発明は（５）該弁の少なくとも１つの開閉をアクチュエーターにより制御する制御装置を備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００１８】
上記（２）〜（５）の発明により、化学反応用カートリッジに簡便な構造の弁を取り入れることが可能になる。従って、化学反応を行わせる場合に、液体または気体の取扱いにおいて弁によって反応を避けたい物質同士の混合を防ぐことや、液体あるいは気体の逆流等を防止することが可能になり、容易にカートリッジ上での化学反応を制御することが可能になる。
【００１９】
また本発明は（６）化学反応が、核酸を含有する材料から核酸を遊離させる工程、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する工程、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる工程からなる核酸単離反応を含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２０】
更に、本発明は（７）核酸を含有する材料から核酸を遊離させる遊離液、核酸結合性担体、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２１】
更に、本発明は（８）核酸結合性担体、核酸を含有する材料から核酸を遊離させ、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる遊離吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２２】
更に、本発明は（９）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程がカオトロピックイオンを含有する溶液を用いることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１０）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２３】
更に、本発明は（１１）核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１２）核酸結合性担体が、核酸結合性の磁性体含有粒子であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２４】
更に、本発明は（１３）核酸結合性担体が、シリカまたはシリカ誘導体からなる膜であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
上記（６）〜（１３）の発明によって、核酸を含有する試料から、核酸を化学反応カートリッジ上で抽出し、精製することが可能になる。すなわち、核酸の単離を容易に達成するカートリッジを作成することができる。
【００２５】
また、本発明は（１４）化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は（１５）化学反応が、核酸単離反応により単離した核酸を増幅する核酸増幅反応を更に含むことを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は、（１６）核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする上記の化学反応用カートリッジに関する。
【００２６】
上記（１４）〜（１６）の発明によって、化学反応カートリッジ上で、核酸の増幅反応を行うことができるようになる。更に上記（１５）の発明によって、化学反応カートリッジ上の溶出液で溶出された状態のまま、化学反応カートリッジ内で核酸の増幅反応を行うことができるようになり、より迅速に核酸を検出することが可能になる。更に上記（１６）の発明によって、溶出液で溶出された状態のまま、核酸のポリメラーゼ・チェイン反応を行うことができるようになり、より迅速に核酸を検出することが可能になる。
【００２７】
更に、本発明は（１７）上記の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも一部を加熱または冷却して温度制御することを特徴とする化学反応用カートリッジに関する。
更に、本発明は、（１８）上記の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも２箇所をそれぞれ加熱及び／または冷却して異なる温度に制御することを特徴とする化学反応用カートリッジに関する。
温度制御のための手段は特に限定するものではなく、例えば温度を設定した水浴を行ったり、各種の加熱装置や冷却装置を用いることができる。
【００２８】
本発明の化学反応用カートリッジを用いて行う核酸単離反応や核酸増幅反応の対象となる核酸を含有する材料としては、例えば人の疾患の診断に用いる臨床検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓器、その他の体液、またはこれらの体液の分画、微生物汚染の検査に用いる食品、飲料水、土壌、排水、河川水、海水、ふき取り液、ふき取り綿などが挙げられる。また、例えば大腸菌などの細菌懸濁液を使用することができる。
【００２９】
本発明の化学反応用カートリッジに用いる核酸結合性担体としては、当分野において通常使用される担体であればいずれも好適に使用することができるが、本発明において、検体中の核酸の量に応じて担体の量を自在に変化させることができ、また少量の溶出液での溶出が可能であるために、特にシリカ粒子もしくはシリカ誘導体粒子、並びに磁性シリカ粒子もしくは磁性シリカ誘導体粒子が好ましい。本発明に使用されるシリカ粒子として、シグマ社製のＳｉＯ２、無定形酸化ケイ素、ガラス粉末等、シリカ誘導体粒子として、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、−ＮＨ２を有する活性シリカ、ラテックス粒子等が挙げられる。また本発明に使用される磁性シリカ粒子または磁性シリカ誘導体粒子として、東洋紡社製のMagExtractorTMキットに含まれる磁性ビーズ（以下MagExtractorTMと表記）、ロシュ社製のMagNA Pure LC DNA Isolation Kitに含まれる磁性体粒子等が挙げられる。核酸結合性担体として磁性シリカ粒子または磁性シリカ誘導体粒子を用いた場合には、磁石を利用して担体を簡便に回収することができる。また、核酸結合性担体として、シリカまたはシリカ誘導体からなる膜を用いても良い。
【００３０】
本発明において使用される核酸遊離吸着液としては、当分野において通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、特にカオトロピックイオンを含有する溶液が好ましい。カオトロピックイオンとしては、例えばグアニジンイオン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン等が挙げられる。
【００３１】
核酸結合性担体に核酸を吸着させる工程は、加熱して行うことができる。このとき加熱は、６０℃〜１３０℃、好ましくは８０℃〜１１０℃、さらに好ましくは９０℃〜１００℃で行う。
核酸が結合した核酸結合性担体の洗浄は、エタノールを含む溶液中で行うことが好ましく、特にエタノールを７０％以上含む溶液を用いることが好ましい。
また、洗浄後、核酸が結合した核酸結合性担体を乾燥させることで、洗浄に用いたエタノール等の、後の増幅反応に阻害影響を与える因子を除去することができる。
【００３２】
核酸の核酸結合性担体からの溶出は、当分野で通常行われるように、水や溶出用緩衝液を用いて行うことができる。
本発明の化学反応用カートリッジを用いて行うことができる核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ・チェイン反応、リガーゼ・チェイン反応（ＬＣＲ：Science、 241:1077-1080、 1988）、ＲＮＡ特異増幅法（ＮＡＳＢＡ法：Nature、 350:91-92、 1991）、ＳＤＡ法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、 89:392-396、 1992)等が挙げられるが、極微量の核酸の増幅効率に優れていること、短時間で信頼性のある結果が得られること等から、世の中で広く利用されているポリメラーゼ・チェイン反応が特に好ましい。ポリメラーゼ・チェイン反応は、当分野において通常使用される核酸増幅手段であり、その手順は例えばScience、 230:1350-1354、 1985等に記載されており、当業者であれば、上記文献の記載等に基づいて実験条件などを適宜改変して行うことができる。増幅産物の確認は、例えば増幅反応物を適当な条件下で電気泳動にかけ、例えばエチジウムブロマイド処理の後に紫外線照射により検出することができるが、検出手段は特に限定されるものではない。
【００３３】
上記発明により、化学反応カートリッジ上で、加熱や冷却を必要とする化学反応を行うことが可能となり、カートリッジ上で適応できる化学反応の範囲が広がる。なお、本発明において、加熱を行う場合には、その加熱部分が設定した温度において、機械的強度を維持し、液体及び／または気体の流路を維持できる材質でなければならない。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。尚、実施例及び図面中に記載された長さ、深さ、直径等の数値は単なる例示であって、本発明はこれらの数値に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
図１に示した基板（１）を、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社（現アマシャムバイオサイエンス社）製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（１０１）、棒状部材（５）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（１０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１０３）が加工されている。
【００３６】
図２に示した基板（２）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２に示したように、流路として基板１の６ｍｍの雌ネジ穴（１０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（２０１）、棒状部材（５）が挿入され移動が可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（２０２）、流路としてこれらの穴を結ぶ深さ１ｍｍ、幅１ｍｍの溝（２０４）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２０３）が加工されている。
【００３７】
図３に示した気密板（３）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３に示したように、流路として基板１の６ｍｍの雌ネジ穴（１０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（３０１）、棒状部材（５）が移動可能なように挿入され、かつ、棒状部材の切り欠きの無い部分が挿入された場合においては、気密性が保たれるようなクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（３０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３０３）が加工されている。
【００３８】
図４に示した気密板（４）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図４に示したように、棒状部材（５）が移動可能なように挿入され、かつ、棒状部材の切り欠きの無い部分が挿入された場合においては、気密性が保たれるようなクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（４０２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４０３）が加工されている。
【００３９】
図５に示した棒状部材（５）は、直径３ｍｍ、長さ２０ｍｍのテフロン棒で作成した。該棒状部材は、図に示したように、棒の中央付近に長さ方向に幅２ｍｍ、深さ１ｍｍの切り欠き（５０１）が加工されている。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組（６）で積層状に圧着し、図６に示したカートリッジを作成した。
【００４０】
このカートリッジに、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、カートリッジの両側にそれぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）をつなげ、更に、そのチューブの１つの先端を空気ポンプにつなげた。このカートリッジに最大圧が０．１気圧に調整された空気を毎分１０ｍｌの流速で送気した。その結果、このカートリッジの流路からは、空気の漏れが確認されず、更に棒状部材（５）の移動によって、カートリッジ内の流路の開状態と閉状態が達成された。即ち、棒状部材の切り欠き部分（５０１）が、２枚の基板２と、一枚の気密板４で形成されている流路を連通するように、棒状部材が位置するように移動された場合は、該弁が開状態となり、切り欠き部分（５０１）が、２枚の基板２と、一枚の気密板４で形成されている流路を連通しないように基板１の所に移動された場合は、該弁が閉状態となった。
【００４１】
従って、このカートリッジは、開閉可能な弁を備えた流路として機能することが確認された。なお、気密板（３、４）は、基板（１、２）に比して弾性を持つため、ネジとナット(６)による圧着の力の加減により、主に気密板(３、４)が少し変形するので、気密板(３、４)と基板(１、２)の密着する程度や、棒状部材（５）と気密板（３、４）のクリアランスの程度を加減することが可能である。この加減によって、カートリッジ上の流路や弁の部分の気密性を加減することが可能である。
【００４２】
実施例２
図７に示した基板（７）を、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図７に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（７０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（７０２）が加工されている。
【００４３】
図８に示した基板（８）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図８に示したように、流路として基板９の６ｍｍの雌ネジ穴（９０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（８０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（８０２）、流路として２カ所の直径１ｍｍの穴（８０３）、及び流路として２カ所の深さ１ｍｍ、幅１ｍｍの溝（８０４）が加工されている。
【００４４】
図９に示した基板（９）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図９に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（９０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（９０２）、棒状部材（１２）が挿入され、移動可能なクリアランスを持つ直径３ｍｍの穴（９０３）、この穴に連結する幅３ｍｍ、深さ２ｍｍの溝（９０４）が加工されている。
【００４５】
図１０に示した気密板（１０）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。図１０に示したように、流路として基板７の６ｍｍの雌ネジ穴（７０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（１００１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１００２）が加工されている。
【００４６】
図１１に示した気密板（１１）は、縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１１に示したように、流路として基板９の６ｍｍの雌ネジ穴（９０１）に対応する位置に直径１ｍｍの穴（１１０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１１０２）が加工されている。
【００４７】
図１２に示した棒状部材（１２）を、直径３ｍｍ、長さ２０ｍｍのテフロン棒で作成した。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組（１３）で積層状に圧着し、図１３に示したカートリッジを作成した。このカートリッジに、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、カートリッジの両側にそれぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）をつなげ、更に、そのチューブの１つの先端を空気ポンプにつなげた。このカートリッジに最大圧が０．１気圧に調整された空気を毎分１０ｍｌの流速で送気した。その結果、このカートリッジの流路は、空気の漏れが確認されず、更に棒状部材（１２）を流路方向へ押す力の有無によって、カートリッジ内の流路の開状態と閉状態が達成された。従って、このカートリッジは、開閉可能な弁を備えた流路として機能することが確認された。即ち、この弁は、棒状部材に対して押す力の無い場合は、流路に流れる空気の圧力によって、気密板１１において、基板９の溝（９０４）に接している部分が、該溝の方向に変形することで流路が確保されることで開状態となり、棒状部材が流路方向に押されている場合は、気密板１１が、基板８に押しつけられている為に、流路が確保されないので閉状態となった。また、気密板（１０、１１）は、基板（７、８、９）に比して弾性を持つため、ネジとナット（１３）による圧着の力の加減により、主に気密板（１０、１１）が少し変形するので、気密板（１０、１１）と基板（７、８、９）の密着する程度を加減することが可能である。この加減によって、カートリッジ上の流路や弁の部分の気密性を加減することが可能である。
【００４８】
実施例３
図１４に示した基板（１４）を、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１４に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（１４０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１４０２）、プラスチック製注射筒（テルモ製）が挿入できるような直径４ｍｍの穴（１４０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１４０４）、トラップ用の直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状の磁石を２個並べて挿入できる楕円状の穴（１４０５）が加工されている。
【００４９】
図１５に示した基板（１５）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１５に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できる直径２ｍｍの穴（１５０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１５０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１５０３）、流路として直径２ｍｍの穴（１５０１）、トラップ部分として深さ１ｍｍの楕円状の溝（１５０５）が加工されている。
【００５０】
図１６に示した基板（１６）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１０ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１６に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１６０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１６０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１６０３）、流路として直径２ｍｍの穴（１６０１）、反応漕として機能する五角形状の穴（１６０６）、該反応漕への試料導入口として直径５ｍｍの穴（１６０７）が加工されている。更に、該試料導入口の開放部は６ｍｍの雌ネジが加工されている。
【００５１】
図１７に示した基板（１７）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１７に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１７０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（１７０４）、流路として、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１７０３）が加工されている。
【００５２】
図１８に示した気密板（１８）は、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１８に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（１８０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１８０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（１８０４）、トラップ用の直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状の磁石を２個並べて挿入できる楕円状の穴（１８０５）が加工されている。
【００５３】
図１９に示した気密板（１９）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図１９に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（１９０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１９０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（１９０４）、トラップ部分として基板１５の楕円状の溝（１５０５）の位置に対応する位置に楕円状の穴（１９０５）、反応漕として機能する五角形状の穴（１９０６）が加工されている。
【００５４】
図２０に示した気密板（２０）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図２０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２００２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（２００４）、反応漕として機能する五角形状の穴（２００６）が加工されている。
【００５５】
図２１に示した棒状部材（２１）は、直径２ｍｍ、長さ２７ｍｍのステンレス棒で作成した。該棒状部材は、図に示したように、棒の中央部分（２１０１）が、長さ方向に幅２ｍｍに渡って、直径１ｍｍとなるように加工されている。
これらの部品を、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ）とナットの組で積層状に圧着し、図２２に示したカートリッジを作成した。
【００５６】
上記カートリッジに、リザーバー１（Ｒ１）として９００μｌの遊離吸着液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー２（Ｒ２）として１０００μｌの洗浄液（７０％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー３（Ｒ３）として１０００μｌの洗浄液（９９％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー４（Ｒ４）として５００μｌの溶出液（蒸留水）を注入したプラスチック製注射筒を、それぞれ取り付けた。カートリッジは、外部からの押す力によって、各バルブ（Ｖ１〜Ｖ１１）に設置された棒状部材（２１）が移動し、バルブ部分の流路の開閉操作が可能となっている。また、トラップ部（Ｍ１〜Ｍ３）へ磁石（直径５ｍｍ、長さ４ｍｍの円筒状磁石が２個）の設置と除去が可能になっている。またポンプ部との接合口（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、それぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）が接合され、更にその先にシリンジポンプ（ファルマシア社、Ｐ−６０００）を利用した空気ポンプが接合され、この空気送気による送液が可能になっている。更に、遊離吸着反応槽（Ｒ５）を含むカートリッジ下部は、湯浴による加熱装置（Ｈ１）で加熱することが可能になっている。
【００５７】
本カートリッジを用いて、以下の手順で、大腸菌から菌の核酸を抽出精製した。まず、すべてのバルブ（Ｖ１〜Ｖ１１）を閉にし、トラップ部分（Ｍ１〜Ｍ３）に磁石を設置した。次に、遊離吸着反応槽（Ｒ５）に、菌体の個数として１０７個の大腸菌（Escherichia coli）と、磁性シリカ粒子（東洋紡製）の懸濁液４０μｌを入れた。菌体導入後、遊離吸着反応槽（Ｒ５）の上部の試料導入口（Ｓ１）を、一端を閉じた液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社）を用いて閉じた。遊離吸着反応槽（Ｒ５）を含むカートリッジの下部（Ｈ１）を湯浴中で９８℃に加熱した。バルブ３（Ｖ３）を開にした後、リザーバー１（Ｒ１）の遊離吸着液を反応槽（Ｒ５）の部分に導いた。３分後、バルブ１、４、６（Ｖ１、Ｖ４、Ｖ６）を開け、バルブ３（Ｖ３）を閉じ、ポンプとの接合口１（Ｐ１）から空気を送気して、遊離吸着反応槽（Ｒ５）の液体を廃液口１（Ｗ１）に廃液した。この段階でトラップ１（Ｍ１）の部分に磁性シリカ粒子が集積された。バルブ１（Ｖ１）、バルブ６（Ｖ６）を閉じ、バルブ２（Ｖ２）、バルブ７（Ｖ７）、バルブ８（Ｖ８）、バルブ１０（Ｖ１０）を開にして、トラップ１（Ｍ１）部分の磁石を取り除いたあと、リザーバー２（Ｒ２）の洗浄液を流した。更に、バルブ２（Ｖ２）を開け、ポンプとの接合口２（Ｐ２）から空気を送気して、遊離吸着反応槽（Ｒ５）に残っている液体を廃液口２（Ｗ２）に廃液すると同時に、磁性シリカ粒子を分散させ洗浄してトラップ２（Ｍ２）の部分に再度集積させた。バルブ４（Ｖ４）を閉じ、トラップ２（Ｍ２）の部分の磁石を取り除いた。リザーバー３（Ｒ３）の洗浄液を流して廃液口２（Ｗ２）に廃液すると同時に、磁性シリカ粒子を分散させ洗浄してトラップ３（Ｍ３）の部分に再度集積させた。バルブ８（Ｖ８）を閉じ、バルブ５（Ｖ５）を開け、１０分間、空気ポンプ接合口（Ｐ３）から５０ｍｌ／分の空気を送気して、磁性シリカ粒子上に残っているエタノールを乾燥した。バルブ５（Ｖ５）、バルブ１０（Ｖ１０）を閉じ、バルブ９（Ｖ９）、バルブ１１（Ｖ１１）を開にし、トラップ３（Ｍ３）部分の磁石を取り除いた。リザーバー４（Ｒ４）の溶出液を流して、磁性シリカ粒子を分散させながら、回収口３（Ｗ３）から溶出液を回収した。
【００５８】
次に、回収した溶出液中に大腸菌由来のＤＮＡが精製されていることを、以下の方法で確認した。回収した溶出液の５μｌをポリメラーゼ・チェイン反応用マイクロチューブ（Multi Ultra PCR Tube、Sorenson BioScience製）に入れ、２種類のオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）と、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）について２０μＭの溶液を各１μｌ、基質（ｄＮＴＰ mixture：TAKARA社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ、TAKARA社製）０．５μｌ、緩衝液（３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。上記配列番号１及び配列番号２のオリゴ核酸をプライマーとしたポリメラーゼ・チェイン反応を行った場合、精製された大腸菌由来のDNAが存在している試料では、約２００ｂｐの増幅産物が得られることになる。
【００５９】
鉱物油（シグマ社製）２０μｌを重層して、サーモサイクラー（RoboCycler：ストラタジーン製）で、９８℃を２０秒と６５℃を３０秒の４０サイクルのポリメラーゼ・チェイン反応を行った。その後、ポリメラーゼ・チェイン反応液１０μｌにサンプル処理液（１０× Loading Buffer：TAKARA製）１μｌを添加し、それを、３％アガロースゲル（NuSieve3:1 agaroseをＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し固めたもの）で電気泳動（Mupid：ADVANCE社製）した。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド水溶液（１μｇ／ｍｌ）に１５分間浸した。次にアガロースゲルを取り出し紫外線を当てて、電気泳動されたＤＮＡを検出した。その結果、図２３に示したように、マーカーのＤＮＡ（２２）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（２３）として検出された。従って本発明のカートリッジによって、大腸菌のＤＮＡが単離された事が示された。
【００６０】
実施例４
図２４に示した基板（２４）を、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２４に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（２４０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２４０２）、プラスチック製注射筒（テルモ製）が挿入できるような直径４ｍｍの穴（２４０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２４０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（２４０５）が加工されている。
【００６１】
図２５に示した基板（２５）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２５に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２５０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２５０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２５０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２５０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（２５０５）が加工されている。
【００６２】
図２６に示した基板（２６）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１０ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２６に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２６０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２６０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２６０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２６０４）、反応漕として機能する五角形状の穴（２６０６）、該反応漕への試料導入口として直径５ｍｍの穴（２６０７）が加工されている。更に、該試料導入口の開放部は６ｍｍの雌ネジが加工されている。
【００６３】
図２７に示した基板（２７）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２７に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２７０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２７０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２７０３）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（２７０４）が加工されている。
【００６４】
図２８に示した基板（２８）を、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２８に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２８０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２８０１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（２８０３）が加工されている。
【００６５】
図２９に示した基板（２９）は、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２９に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（２９０２）、流路として直径２ｍｍの穴（２９０１）、トラップ部分としてシリカ膜が設置できる直径８ｍｍの穴（２９０５）が加工されている。
【００６６】
図３０に示した気密板（３０）は、縦７０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３００２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３００４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（３００５）、流路として直径２ｍｍの穴（３００１）が加工されている。
【００６７】
図３１に示した気密板（３１）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３１に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３１０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３１０４）、基板２８、２９、及び気密板３３、３４が挿入可能なクリアランスを持つ長方形の穴（３１０５）、反応漕として機能する五角形状の穴（３１０６）、流路として直径２ｍｍの穴（３１０１）が加工されている。
【００６８】
図３２に示した気密板（３２）は、縦１２０ｍｍ、横１５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３２に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３２０２）、棒状部材（２１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つが、棒状部材の直径２ｍｍの部分が挿入された場合には、気密性が保たれるような直径２ｍｍの穴（３２０４）、反応漕として機能する五角形状の穴（３２０６）、流路として直径２ｍｍの穴（３２０１）が加工されている。
【００６９】
図３３に示した気密板（３３）は、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３３に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３３０２）、流路として直径２ｍｍの穴（３３０１）が加工されている。
【００７０】
図３４に示した気密板（３４）を、縦２０ｍｍ、横３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴム板で作成した。該気密板は、図３４に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３４０２）、流路として直径２ｍｍの穴（３４０１）、トラップ部分としてシリカ膜が設置でき、その流路の機密性を保てるような直径６ｍｍの穴（３４０５）が加工されている。
これらの部品及び実施例３で用いたものと同じ棒状部材（２１）と、ステンレス製ナベネジ（直径２ｍｍ、長さ２５ｍｍ）とナットの組で、図３５に示したカートリッジに組み立てた。
【００７１】
上記カートリッジに、リザーバー１１（Ｒ１１）として９００μｌの遊離吸着液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー１２（Ｒ１２）として１０００μｌの洗浄液（７０％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒を、リザーバー１３（Ｒ１３）として１０００μｌの洗浄液（９９％エタノール）を注入したプラスチック製注射筒をリザーバー１４（Ｒ１４）として５００μｌの溶出液（蒸留水）を注入したプラスチック製注射筒を、それぞれ取り付けた。更に、トラップ（Ｍ１１）の部分に、シリカ膜（キアゲン社製、ＤＮｅａｓｙＲ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔから取り出して使用、直径約８ｍｍ、厚さ約２ｍｍ）を設置した。カートリッジは、外部からの押す力によって、各バルブ（Ｖ２１〜Ｖ３２）に設置された棒状部材（２１）が移動し、バルブ部分の流路の開閉操作が可能となっている。またポンプ部との接合口（Ｐ１１、Ｐ１２）に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）を用いて、それぞれテフロンチューブ（内径０．９ｍｍ、外径１．７ｍｍ）が接合され、更にその先にシリンジポンプ（ファルマシア社、Ｐ−６０００）を利用した空気ポンプが接合され、この空気送気による送液が可能になっている。更に、遊離吸着反応槽（Ｒ１５）を含むカートリッジ下部は、湯浴による加熱装置（Ｈ１１）で加熱することが可能になっている。
【００７２】
本カートリッジを用いて、以下の手順で、大腸菌から菌の核酸を抽出精製した。まず、すべてのバルブ（Ｖ２１〜Ｖ３２）を閉にした。次に、遊離吸着反応槽（Ｒ１５）に、菌体の個数として１０７個の大腸菌（Escherichia coli）を入れ、遊離吸着反応槽の上部の試料導入口（Ｓ１１）を、直径６ｍｍ、長さ１０ｍｍのナットを用いて閉じた。遊離吸着反応槽（Ｒ１５）を含むカートリッジの下部（Ｈ１１）を湯浴中で９８℃に加熱した。バルブ２２、２６（Ｖ２２、２６）を開にした後、リザーバー１１（Ｒ１１）の遊離吸着液を反応槽（Ｒ１５）の部分に導いた。３分後、バルブ２１、２７、３２（Ｖ２１、Ｖ２７、Ｖ３２）を開け、バルブ２６（Ｖ２６）を閉じ、ポンプとの接合口１１（Ｐ１１）から空気を送気して、反応槽（Ｒ１５）の液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。この段階で、大腸菌から遊離した核酸をトラップ（Ｍ１１）のシリカ膜に吸着させた。バルブ２２（Ｖ２２）を閉じ、バルブ２４（Ｖ２４）を開にして、リザーバー１２（Ｒ１２）の洗浄液を流した。更に、バルブ２３（Ｖ２３）を開け、Ｐ１１から空気を送気して、反応槽（Ｒ１５）に残っている液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。バルブ２７（Ｖ２７）を閉じ、バルブ２８（Ｖ２８）を開け、リザーバー１３（Ｒ１３）の洗浄液を流した。更に、バルブ２５（Ｖ２５）を開け、Ｐ１１から空気を送気して流路内の液体を廃液口１１（Ｗ１１）に廃液した。バルブ２８（Ｖ２８）を閉じ、バルブ３０（Ｖ３０）を開け、空気ポンプ接合口１２（Ｐ１２）から５０ｍｌ／分の空気を１０分間送気して、シリカ膜上に残っているエタノールを乾燥した。バルブ３０、３２（Ｖ３０、３２）を閉じ、バルブ２９、３１（Ｖ２９、３１）を開けリザーバー１４（Ｒ１４）の溶出液を流して、回収口１２（Ｗ１２）から溶出液を回収した。
【００７３】
次に、回収した溶出液中に大腸菌由来のＤＮＡが精製されていることを、実施例３と同一の方法で確認した。その結果、図３６に示したように、マーカーのＤＮＡ（３５）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（３６）として検出された。従って本発明のカートリッジによって、大腸菌のＤＮＡが単離された事が示された。
【００７４】
実施例５
図３７に示した基板（３７）を、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３７に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（３７０１）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３７０２）が加工されている。
【００７５】
図３８に示した基板（３８）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３８に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３８０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（３８０３）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（３８０４）、流路として直径１ｍｍの穴（３８０５）が加工されている。
【００７６】
図３９に示した基板（３９）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３９に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３９０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（３９０３）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（３９０４）、流路として直径１ｍｍの穴（３９０５）が加工されている。
【００７７】
図４０に示した気密板（４０）は、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図４０に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４００２）、流路として直径２ｍｍの穴（４００１）が加工されている。
【００７８】
図４１に示した気密板（４１）は、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は図４１に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４１０２）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（４１０３）、流路として直径１ｍｍの穴（４１０１）が加工されている。
【００７９】
これらの部品とビス（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍ及び直径１．６ｍｍ、長さ８ｍｍ）とナット（Ｍ２、Ｍ１．６）の各組を用いて図４２に示したカートリッジを組み立てた。次に、ポリメラーゼ・チェイン反応における２温度間の往復反応が４０回できるように、図４２に示したカートリッジを２枚組合せ、更に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）（４２）、テフロンチューブ（内径０．５ｍｍ、外径１．７ｍｍ）（４３）、２方向変換バルブ（ファルマシア社製）（４４）、ポンプ（Ｐ−５００、ファルマシア社製）（４５）、注射筒（４６）を接合して、図４３に示した装置を作成した。カートリッジ部分は、加熱装置（４７、４８）によって、９２℃と６５℃の２つの温度に加熱されるようになっている。
【００８０】
大腸菌由来核酸を、実施例４に従って精製した試料のうち、５０μｌに、２種類の２０μＭのオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）各１０μｌ、基質（ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＴＡＫＡＲＡ社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ、ＴＡＫＡＲＡ社製）２５μｌ、緩衝液（２．５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５０μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５０μｌにした。この試料を、注射筒（４６）に注入した。
【００８１】
ポンプ（４５）を用いて、予めカートリッジの流路内に鉱物油（シグマ社製）を満たしておいた。バルブ（４４）を回転させた後、注射筒（４６）の試料をカートリッジ内に導入した後、上記配列番号１及び配列番号２のオリゴ核酸をプライマーとしたポリメラーゼ・チェイン反応を行った。反応が生じた場合には、約２００ｂｐの増幅産物が得られることになる。
【００８２】
次いでバルブ（４４）を回転させて、ポンプ（４５）から鉱物油を９ｍｌ／時の流速でカートリッジ内に送液し、回収口（４９）から反応液を回収した。実施例４に準じてアガロースゲル電気泳動を実施し、反応液中の増幅された核酸を検出した。その結果、図４４に示したように、マーカーのＤＮＡ（５０）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（５１）として検出された。従って、本発明のカートリッジによって、核酸の増幅反応が達成されたことがわかった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明による化学反応用カートリッジは、安価に製造することが可能である。また、その中で化学反応を行わせることが可能であり、医療診断、化学分析、食品分析、等が容易に達成できる。特に医療診断分野においては、カートリッジの中で迅速、簡便に化学反応を達成することが可能で、医療検体中に存在する可能性のある危険物質を、通常の診断のように人手を使って行う必要が無くなり、感染の危険性が減少するので有用である。また、接着による非可逆的な加工を避けることができ、分解して洗浄することで、再利用が可能であり、廃棄物を減少させることもできる。
【００８４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカートリッジを構成する基板（１）の平面図及び断面図を示す。
【図２】本発明のカートリッジを構成する基板（２）の平面図及び断面図を示す。
【図３】本発明のカートリッジを構成する気密板（３）の平面図及び断面図を示す。
【図４】本発明のカートリッジを構成する気密板（４）の平面図及び断面図を示す。
【図５】本発明のカートリッジを構成する棒状部材（５）の平面図及び断面図を示す。
【図６】本発明のカートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図７】本発明のカートリッジを構成する基板（７）の平面図及び断面図を示す。
【図８】本発明のカートリッジを構成する基板（８）の平面図及び断面図を示す。
【図９】本発明のカートリッジを構成する基板（９）の平面図及び断面図を示す。
【図１０】本発明のカートリッジを構成する気密板（１０）の平面図及び断面図を示す。
【図１１】本発明のカートリッジを構成する気密板（１１）の平面図及び断面図を示す。
【図１２】本発明のカートリッジを構成する棒状部材（１２）の平面図及び断面図を示す。
【図１３】本発明のカートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図１４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１４）の平面図及び断面図を示す。
【図１５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１５）の平面図及び断面図を示す。
【図１６】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１６）の平面図及び断面図を示す。
【図１７】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１７）の平面図及び断面図を示す。
【図１８】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１８）の平面図及び断面図を示す。
【図１９】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１９）の平面図及び断面図を示す。
【図２０】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（２０）の平面図及び断面図を示す。
【図２１】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する棒状部材（２１）の平面図及び側面図を示す。
【図２２】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図２３】実施例３の結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真印刷を示す。
【図２４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２４）の平面図及び断面図を示す。
【図２５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２５）の平面図及び断面図を示す。
【図２６】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２６）の平面図及び断面図を示す。
【図２７】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２７）の平面図及び断面図を示す。
【図２８】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２８）の平面図及び断面図を示す。
【図２９】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（２９）の平面図及び断面図を示す。
【図３０】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３０）の平面図及び断面図を示す。
【図３１】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３１）の平面図及び断面図を示す。
【図３２】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３２）の平面図及び断面図を示す。
【図３３】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３３）の平面図及び断面図を示す。
【図３４】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（３４）の平面図及び断面図を示す。
【図３５】本発明の核酸単離を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図３６】実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図３７】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３７）の平面図及び断面図を示す。
【図３８】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３８）の平面図及び断面図を示す。
【図３９】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３９）の平面図及び断面図を示す。
【図４０】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（４０）の平面図及び断面図を示す。
【図４１】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（４１）の平面図及び断面図を示す。
【図４２】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図４３】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを用いた増幅反応を行う装置の構成を示す概念図を示す。
【図４４】実施例５におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【符号の説明】
１：基板、２：基板、３：気密板、４：気密板、５：棒状部材、
６：ネジとナットの組
７：基板、８：基板、９：基板、１０：気密板、１１：気密板、
１２：棒状部材、１３：ネジとナットの組
１４：基板、１５：基板、１６：基板、１７：基板、
１８：気密板、１９：気密板、２０：気密板、２１：棒状部材、
２２：ＤＮＡ分子量マーカー、２３：増幅されたＤＮＡ断片、
２４：基板、２５：基板、２６：基板、２７：基板、２８：基板、
２９：基板、
３０：気密板、３１：気密板、３２：気密板、３３：気密板、
３４：気密板、
３５：ＤＮＡ分子量マーカー、３６：増幅されたＤＮＡ断片、
３７：基板、３８：基板、３９：基板、
４０：気密板、４１：気密板、
４２：接合部品、４３：テフロンチューブ、４４：バルブ、４５：ポンプ、
４６：注射筒、４７：加温装置、４８：加温装置、４９：回収口、
５０：ＤＮＡ分子量マーカー、５１：増幅されたＤＮＡ断片、
１０１：雌ネジ、１０２：穴、１０３：穴、
２０１：穴、２０２：穴、２０３：穴、２０４：溝、
３０１：穴、３０２：穴、３０３：穴、
４０２：穴、４０３：穴、
５０１：切り欠き、
７０１：雌ネジ、７０２：穴、
８０１：穴、８０２：穴、８０３：穴、８０４：溝、
９０１：雌ネジ、９０２：穴、９０３：穴、９０４：溝、
１００１：穴、１００２：穴、
１１０１：穴、１１０２：穴、
１４０１：雌ネジ、１４０２：穴、１４０３：穴、１４０４：穴、１４０５：穴、
１５０１：穴、１５０２：穴、１５０３：溝、１５０４：穴、１５０５：溝、
１６０１：穴、１６０２：穴、１６０３：溝、１６０４：穴、１６０６：穴、１６０７：穴、
１７０２：穴、１７０３：溝、１７０４：穴、
１８０１：穴、１８０２：穴、１８０４：穴、１８０５：穴、
１９０１：穴、１９０２：穴、１９０４：穴、１９０５：穴、１９０６：穴、
２００２：穴、２００４：穴、２００６：穴、
２１０１：中央部分、
２４０１：雌ネジ、２４０２：穴、２４０３：穴、２４０４：穴、２４０５：穴、
２５０１：穴、２５０２：穴、２５０３：溝、２５０４：穴、２５０５：穴、
２６０１：穴、２６０２：穴、２６０３：溝、２６０４：穴、２６０６：穴、２６０７：穴、
２７０１：穴、２７０２：穴、２７０３：溝、２７０４：穴、
２８０１：穴、２８０２：穴、２８０３：溝、
２９０１：穴、２９０２：穴、２９０５：穴、
３００１：穴、３００２：穴、３００４：穴、３００５：穴、
３１０１：穴、３１０２：穴、３１０４：穴、３１０５：穴、３１０６：穴、
３２０１：穴、３２０２：穴、３２０４：穴、３２０６：穴、
３３０１：穴、３３０２：穴、
３４０１：穴、３４０２：穴、３４０５：穴、
３７０１：雌ネジ、３７０２：穴、
３８０２：穴、３８０３：穴、３８０４：溝、３８０５：穴、
３９０２：穴、３９０３：穴、３９０４：溝、３９０５：穴、
４００１：穴、４００２：穴、
４１０１：穴、４１０２：穴、４１０３：穴、
Ｖ１：バルブ１、Ｖ２：バルブ２、Ｖ３：バルブ３、Ｖ４：バルブ４、
Ｖ５：バルブ５、Ｖ６：バルブ６、Ｖ７：バルブ７、Ｖ８：バルブ８、
Ｖ９：バルブ９、Ｖ１０：バルブ１０、Ｖ１１：バルブ１１、
Ｍ１：トラップ１、Ｍ２：トラップ２、Ｍ３：トラップ３、
Ｐ１：ポンプ接合口１、Ｐ２：ポンプ接合口２、Ｐ３：ポンプ接合口３、
Ｒ１：リザーバー１、Ｒ２：リザーバー２、Ｒ３：リザーバー３、
Ｒ４：リザーバー４、
Ｒ５：遊離吸着反応槽、
Ｗ１：排出口１、Ｗ２：排出口２、Ｗ３：回収口３、
Ｓ１：試料導入口、Ｈ１：加熱装置
Ｖ２１：バルブ２１、Ｖ２２：バルブ２２、Ｖ２３：バルブ２３、
Ｖ２４：バルブ２４、Ｖ２５：バルブ２５、Ｖ２６：バルブ２６、
Ｖ２７：バルブ２７、Ｖ２８：バルブ２８、Ｖ２９：バルブ２９、
Ｖ３０：バルブ３０、Ｖ３１：バルブ３１、Ｖ３２：バルブ３２、
Ｍ１１：トラップ、
Ｐ１１：空気ポンプ接合口１１、Ｐ１２：空気ポンプ接合口１２、
Ｒ１１：リザーバー１１、Ｒ１２：リザーバー１２、
Ｒ１３：リザーバー１３、Ｒ１４：リザーバー１４、
Ｒ１５：遊離吸着反応槽、
Ｗ１１：排出口１１、Ｗ１２：回収口１２、
Ｓ１１：試料導入口、
Ｈ１１：加熱装置
Claims (14)
- 少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽、少なくとも１つの流路、及び該流路の開閉を制御する少なくとも１つの弁を有し、液体状または気体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合流体を、上記少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽から、上記少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合流体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジであって、
弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有し、
該流路は、該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、あるいは、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、からなる群より選択される少なくとも１つにより構成され、
該リザーバー及び／または反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴により構成され、
該弁の少なくとも１つが、棒状部材を有し、該棒状部材は該カートリッジ上の流路に対して移動が可能であり、該棒状部材は、開区間と閉区間を有し、該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造であり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路と、該棒状部材の開区間が連通することで、該弁が開となり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路が該棒状部材の閉区間によってふさがれることで、該弁が閉となり、該カートリッジ上の流路の開閉を制御することを特徴とする弁である、
ことを特徴とする化学反応用カートリッジ。 - 化学反応が、核酸を含有する材料から核酸を遊離させる工程、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する工程、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる工程からなる核酸単離反応を含むことを特徴とする、請求項１に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸を含有する材料から核酸を遊離させる遊離液、核酸結合性担体、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする請求項２に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体、核酸を含有する材料から核酸を遊離させ、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる遊離吸着液、核酸が吸着した核酸結合性担体を洗浄する洗浄液、及び核酸が吸着した核酸結合性担体から核酸を溶出させる溶出液の少なくとも１つを備えることを特徴とする請求項２に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離した核酸を核酸結合性担体に吸着させる工程がカオトロピックイオンを含有する溶液を用いることを特徴とする請求項２に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする請求項３に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体がシリカまたはシリカ誘導体からなり、遊離吸着液がカオトロピックイオンを含有することを特徴とする請求項４に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体が、核酸結合性の磁性体含有粒子であることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸結合性担体が、シリカまたはシリカ誘導体からなる膜であることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
- 化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする請求項１に記載の化学反応用カートリッジ。
- 化学反応が、核酸単離反応により単離した核酸を増幅する核酸増幅反応を更に含むことを特徴とする請求項２〜９のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
- 核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の化学反応用カートリッジ。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも一部を加熱または冷却して温度制御することを特徴とする化学反応用カートリッジ。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジであって、該カートリッジの少なくとも２箇所をそれぞれ加熱及び／または冷却して異なる温度に制御することを特徴とする化学反応用カートリッジ。
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