JP3968918B2

JP3968918B2 - Xylitol dehydrogenase of acetic acid bacteria and its gene

Info

Publication number: JP3968918B2
Application number: JP21069699A
Authority: JP
Inventors: 雅一杉山; 尚人外内; 俊一鈴木; 健三横関
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-26
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2019-07-26
Also published as: JP2000102393A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酢酸菌の新規なキシリトールデヒドロゲナーゼ、それをコードする遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼの製造法、及びキシリトールの製造法に関する。キシリトールは、食品、医薬分野等で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低いが蔗糖に匹敵する甘味を呈し、低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料となりうる。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないために、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。そのためキシリトールの需要は今後増加することが予想される。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第4,008,825号に記載されるようなＤ−キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
しかし、植物材料を加水分解して得られるＤ−キシロースは価格が高いという問題点がある。これは、生産コストが高いことによる。例えば、植物材料の加水分解処理の収率が低いため、生成するＤ−キシリトールの純度は低くなる。このため、加水分解処理後に、イオン交換処理をして加水分解に用いた酸および色素を除去する。さらに、Ｄ−キシロースを結晶化して他のヘミセルロース性糖類を除去する。食品に適するＤ−キシロースを得るためにはさらなる精製が必要となる。これらイオン交換処理および結晶化処理が生産コストの上昇につながる。
【０００５】
そこで、出発材料が容易に手に入り、かつ生じる廃棄物の量が少ないキシリトールの製造法がいくつか開発されている。例えば、他のペンチトールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがＤ−アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて製造することができる（Can.J.Microbiol.,31,1985,467-471、J.Gen.Microbiol.,139,1993,1047-54）。
【０００６】
そこで、Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法がいくつか開発されている。Applied Microbiology., 18, 1969, 1031-1035には、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC20121を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダンス（Acetobacter suboxydance）を用いてＤ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Candida guilliermondii var. soya）をＤ−キシルロースに作用させてキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００７】
また、ヨーロッパ特許出願公開第403392号および同第421882号には、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター(Acetobacter)属細菌、グルコノバクター(Gluconobacter)属細菌またはクレブジエラ(Klebsiella)属細菌を用いてＤ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次いでＤ−キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびＤ−キシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／Ｄ−キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。また、同キシロース／Ｄ−キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００８】
しかし、上記Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法は、比較的高収率でキシリトールを生成することができるが、多段階の反応ステップを必要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかった。
【０００９】
一方、遺伝子操作技術によりキシリトール発酵菌の育種が試みられている。クレブジエラ属細菌由来のアラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびピヒア（Pichia）属由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、アラビトール発酵菌（キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属またはチゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属に属する酵母）に導入した遺伝子組換え菌を用いて、グルコースからキシリトールの発酵生産が試みられている（WO94/10325号国際公開パンフレット）。
しかし、上記のような遺伝子操作技術によるキシリトール発酵菌の育種は、実用的に完成されたものとはいえない。
【００１０】
ところで、キシリトールデヒドロゲナーゼは、キシルロースからキシリトールを生成する反応を触媒する酵素であり、多くの生物種においてその存在が知られている。例えば、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）（J. Ferment. Bioeng., 67, 25 (1989)）、パキソレン・タンノフィルス（Pachysolen tannophilus）（J. Ferment. Technol., 64, 219 (1986)）、キャンディダ・シェハタエ（Candida shehatae）（Appl. Biochem. Biotech., 26, 197 (1990)）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（Biotechnol. Bioeng., 58, 440 (1998)）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Appl. Biochem. Biotech., 56, 79 (1996)）、プルラリア・プルランス（Pullularia pullulans）（An. Acad. Brasil. Cienc., 53, 183 (1981)）等の酵母、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（Microbiology, 140, 1679 (1994)）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）（FEMS Microbiol. Lett., 146, 79 (1997)）等の糸状菌、ガルディエリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）（Planta, 202, 487, (1997)）等の藻類、モルガネラ・モルガニ（Morgannela morganii）（J. Bacteriol., 162, 845 (1985)）等の細菌等でキシリトールデヒドロゲナーゼの存在が知られている。
【００１１】
また、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子も、ピヒア・スティピティス（FEBS Lett., 324, 9 (1993)）及びモルガネラ・モルガニ（DDBJ/GenBank/EMBL accession No.L34345）由来の遺伝子の塩基配列が報告されている。
しかしながら、酢酸菌由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ及びその遺伝子は、存在自体知られていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、キシリトールを効率よく製造する技術あるいはキシリトール発酵菌の育種を確立するために、キシリトール生産能に優れた微生物のキシリトール生合成に関与する酵素及びその遺伝子、及びこれらの利用法を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、Ｄ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を有する微生物の検索を行った。その結果、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する細菌に、該能力を有する細菌が存在することを見い出した。そして、それらの細菌の一つであるグルコノバクター・オキシダンスから２種類のキシリトールデヒドロゲナーゼを精製することに成功し、さらにこれらの酵素をコードする遺伝子を単離して構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質、
（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、である。
【００１５】
また本発明は、
（３）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（４）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（５）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（３）のＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２５〜１０５３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２５〜１０５３からなる塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（５）のＤＮＡ。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（４）のＤＮＡ、
（ｃ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１０６３〜１８４８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１０６３〜１８４８からなる塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を提供する。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１６】
本発明はまた、
（９）前記（３）〜（８）のいずれかのＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするキシリトールデヒドロゲナーゼが発現可能な形態で導入された細胞を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、
（10）前記（９）の細胞を培地で培養し、キシリトールデヒドロゲナーゼを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりキシリトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするキシリトールデヒドロゲナーゼの製造法を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、
（11）前記（１）又は（２）のキシリトールデヒドロゲナーゼをＤ−キシルロースに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法、及び
（12）前記（９）の細胞をＤ−キシルロースに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法、を提供する。
【００１９】
尚、本発明のキシリトールデヒドロゲナーゼは、Ｄ−キシルロースを還元してキシリトールを生成する反応、及びキシリトールを酸化してＤ−キシルロースを生成する反応のいずれをも触媒する活性を有するが、本発明において「キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、少なくともＤ−キシルロースからキシリトールを生成する反応を触媒する活性を有することをいう。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
＜１＞本発明のキシリトールデヒドロゲナーゼ
本発明のキシリトールデヒドロゲナーゼは、グルコノバクター・オキシダンスが産生する酵素である。該酵素は２種類存在し、一方をXDH1、他方をXDH2と命名した。XDH1は配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、XDH2は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する。また、XDH1は、XDH2は、SDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）でそれぞれ約36,000〜約40,000、及び約27,000〜約30,000の分子量を示す。以下、これら２種類のキシリトールデヒドロゲナーゼ、XDH1及び／又はXDH2を、まとめて「XDH」ということがある。
【００２２】
後述の実施例５に示すように、XDH2の還元反応（D-キシルロースからキシリトールを生成する反応）における至適pHは、約５付近であった。公知のキシリトールデヒドロゲナーゼ、例えばアスペルギルス・ニガー由来のキシリトールデヒドロゲナーゼは、還元反応の至適pHが厳密に6.5であり（Cor F.B.Witteveen, et al., Microbiology, 1994, 140, 1679-1685）、本発明のグルコノバクター属細菌由来のXDH2とは反応至適pHが明らかに異なる。
【００２３】
次に、本発明のXDHの製造法の例として、グルコノバクター・オキシダンスからXDHを単離・精製する方法を説明する。
まず、グルコノバクター・オキシダンス、例えばATCC621株の菌体から、超音波処理等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。
【００２４】
上記のようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、XDHを精製することができる。
【００２５】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Q-Sepharose FF（ファルマシア社製）及びMono-Q（ファルマシア社製）等が挙げられる。XDHを含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、Q-Sepharose FFを用いた場合には、カラムに吸着したXDHは、200〜350mM程度のKClで溶出される。また、Mono-Qでは150mMから250mM程度のKClで溶出される。
【００２６】
アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、HiTrap Blue（ファルマシア社製）が挙げられる。本発明のXDHは、NAD又はNADHを補酵素とし、これらの物質に親和性を有する。担体に担体に吸着したXDHは、5mM程度のNADを含む緩衝液で溶出することができる。
【００２７】
疎水性クロマトグラフィー用担体としては、Phenyl Sepharose HP（ファルマシア社製）が挙げられる。低塩濃度で担体に吸着したXDHは200〜300mM程度の硫酸アンモニウムで溶出される。
【００２８】
上記のようにして精製されたXDHは、さらにゲル濾過クロマトグラフィーまたはSDS-PAGE等により、XDH1及びXDH2に分離、精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Sephadex 200HP（ファルマシア社製）が挙げられる。
【００２９】
上記精製操作において、XDHを含む画分は、後述の実施例に示した方法等により各画分のXDH活性を測定することにより、確認することができる。
上記のようにして精製されたXDH1及びXDH2のＮ末端のアミノ酸配列を、それぞれ配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
【００３０】
本発明のXDHは、上記のようにグルコノバクター・オキシダンスの菌体から単離・精製することによって得られるが、異種タンパク質の発酵生産に通常用いられている方法によって、後述するXDHをコードするDNAを適当な宿主に導入し、発現させることによっても製造することができる。
以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載されている。
【００３１】
XDH遺伝子を発現させるための宿主としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、グルコノバクター・オキシダンス等のグルコノバクター属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピヒア・・スティピティス（Pichia stipitis）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００３２】
XDH遺伝子を宿主に導入するのに用いる組み換えDNAは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、XDHをコードするDNAを該DNAがコードするXDHが発現可能な形態で挿入することで、調製可能である。XDH遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、XDH遺伝子固有のプロモーターが宿主細胞で機能する場合には該プロモーターを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモーターをXDHをコードするDNAに連結し、該プロモーター制御下で発現させるようにしてもよい。宿主としてエシェリヒア属細菌を用いる場合、このようなプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのP_Rプロモーター、P_Lプロモーター等が挙げられる。また、エシェリヒア属細菌用のベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。さらに、プロモーターを含み、挿入DNA配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００３３】
組換えDNAを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等が挙げられる。
【００３４】
＜２＞XDHをコードするDNA
XDHをコードするDNAは、グルコノバクター・オキシダンスのcDNAライブラリー又は染色体DNAライブラリーから、PCR（polymerase chain reacion、White,T.J. et al ;Trends Genet., 5, 185(1989)参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。PCRに用いるプライマーは、精製されたXDH1及びXDH2について決定されたＮ末端のアミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりXDH1遺伝子（配列番号３）及びXDH2遺伝子（配列番号５）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマー又はハイブリダイゼーション用のプローブを設計してもよい。PCR用のプライマーとして、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、XDHのコード領域全長を増幅することができる。具体的には、XDH2については、５’側プライマーとしては配列番号５において塩基番号1063よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３’側プライマーとしては塩基番号1851よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。XDH1については、５’側プライマーとしては配列番号３において塩基番号２５よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００３５】
プライマーの合成は、例えば、Applied Biosystems社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、例えばGene Amp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）及びTaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３６】
本発明のDNAは、コードされるXDH1またはXDH2の活性、すなわちＤ−キシルロースからキシリトールを生成する活性が損なわれない限り、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むXDH1又はXDH2をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜１０個である。
【００３７】
このようなXDH1またはXDH2と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、XDH1遺伝子またはXDH2遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたDNAは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、XDHをコードするDNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びXDHをコードするDNAを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。
上記のような変異を有するDNAを適当な細胞で発現させ、発現産物のXDH活性を調べることにより、XDH1またはXDH2と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。また、変異を有するXDH1またはXDH2をコードするDNAまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号25〜1053からなる塩基配列を有するDNAもしくは同塩基配列から調製されるプローブ、または配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号1063〜1848からなる塩基配列を有するDNAもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、XDH活性を有するタンパク質をコードするDNAを単離することによっても、XDH1またはXDH2と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。
【００３９】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、サザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物のXDH活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００４０】
本発明のXDHをコードするDNAは、前述したXDHの製造法及び後述のキシリトールの製造法に用いることができる他、キシリトール生産菌の育種に用いることができる。例えば、グルコノバクター属細菌等、Ｄ−アラビトールからキシリトールを生成する能力を有する微生物においてXDH遺伝子を増強することによって、該微生物のＤ−アラビトールからキシリトールへの変換能を高めることができる。
【００４１】
＜３＞キシリトールの製造法
本発明のXDH、またはXDHをコードするDNAが導入されXDHを発現する細胞を、Ｄ−キシルロースに作用させ、生成するキシリトールを採取することにより、キシリトールを製造することができる。
【００４２】
XDHとしては、グルコノバクター属細菌から抽出した酵素であっても、XDHをコードするDNAを用いた遺伝子組換え法によって製造した酵素であってもよい。また、XDHは、XDH1又はXDH2のいずれであってもよく、これらの任意の割合の混合物であってもよい。
【００４３】
Ｄ−キシルロースからキシリトールを生成させる反応は、通常、温度20〜60℃、望ましくは30〜40℃、pH4〜10、望ましくはpH4〜8で好結果を与える。反応には、静置反応あるいは攪拌反応のいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用するXDHの濃度、細胞の量、あるいは基質濃度によって異なるが、１〜100時間が望ましい。
【００４４】
生成したキシリトールを反応終了混合物から採取分離するには、合成吸着剤を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離法が採用できる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
【００４６】
【実施例１】
グルコノバクター・オキシダンスによるXDHの生産及び精製
＜１＞グルコノバクター・オキシダンスATCC621の培養
グルコノバクター・オキシダンスATCC621を培養し、充分にXDH活性を有する菌体を得た。培養は総てPD培地を用い、30℃で液体振盪培養にて行った。PD培地の組成は24g/L Potato dextrose（Difco）、30 g/L Yeast Extract（Difco）、5g/L肉エキス（Difco）、15 g/Lグリセロール、10 g/L D-アラビトール、10 g/L D-キシロース、10 g/Lキシリトール、20 g/L炭酸カルシウム（関東化学）、pH7.0である。
【００４７】
まず、種培養として、ATCC621株をPD培地を40ml含む坂口フラスコに接種し、30℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を同じくPD培地を40ml含む坂口フラスコに40連で１％接種し、30℃で3日間振盪培養した（本培養）。遠心分離により炭酸カルシウムを除いた後、遠心分離にて集菌し、当該菌体を得た。こうして得られた菌体を、XDHを精製するための材料として用いた。
【００４８】
なお、XDH活性は、以下の酵素活性測定法により行った。酵素液30μlを100mM（終濃度）キシリトール、2mM NAD、及び100mM CAPS（pH10.0）を含む反応溶液570μlに添加して30℃にて酵素反応を行い、反応に伴い生じるNADHの増加を分光光度計（DU 640 Spectrometer、BECKMAN社製）を使用して340nmの吸光度を測定することにより決定した。一分間に1μmolのNADHを生じる活性を1Uとした。なおNADHの340nmにおける分子吸光係数はε=6.3×10³として算出した。
【００４９】
＜２＞XDHの精製
（１）菌体抽出液の調製
上記で得られた菌体を、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に懸濁し、5000×gで１０分間遠心し、沈澱画分に再度集菌した。この菌体の懸濁及び遠心の作業を２回繰り返して菌体を洗浄した。
【００５０】
洗浄した菌体約10gを、50mlの緩衝液１（20mM Tris-HCl(pH 7.6)、0.5mM EDTA、1mM MgCl₂、1mM DTT）に懸濁し、４℃で20分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（8000rpm、10分間)して菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（56000rpm、30分間）して不溶性画分を除いて可溶性画分を得た。
【００５１】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記可溶性画分を緩衝液１で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose FF（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。
【００５２】
次に、担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を緩衝液１を用いて洗い流した後、KClを含む緩衝液を溶出液として用いて、吸着したタンパク質の溶出を行った。このとき、緩衝液中のKCl濃度を0Mから0.5Ｍまで直線的に変化させた。このとき得られた各溶出画分についてXDH活性を測定したところ、KCl濃度がおよそ200〜350mMの溶出位置にXDH活性が認められた。
【００５３】
（３）NADアフィニティークロマトグラフィー
上記で得られたXDH活性を含む画分を集めて、緩衝液１に対して透析した。透析後の溶液を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、緩衝液１で平衡化されたNADアフィニティーカラムHiTrap Blue 5ml（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。
【００５４】
次に、担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を緩衝液１を用いて洗い流した後、NADを含む緩衝液２（20mM Tris-HCl(pH 7.6)、0.5mM EDTA、1mM MgCl₂、1mM DTT、5mM NAD）を溶出液として用いて、吸着したタンパク質の溶出を行った。このときXDHは溶出画分に検出された。
【００５５】
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記のXDH活性を含む溶出画分を0.45μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、緩衝液１で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラムMono-Q（ファルマシア社製）に供した。この操作により、XDHは担体に吸着した。
【００５６】
次に、緩衝液１により非吸着タンパク質を洗い流した後、KClを含む緩衝液を溶出液として用いて、吸着されたタンパク質の溶出をおこなった。このとき、緩衝液中のKCl濃度を直線的に0mMから500mMへ変化させるという溶出方法を用いた。このとき得られた各溶出画分についてXDH活性を測定したところ、KCl濃度がおよそ150mMから250mMの溶出位置に活性が認められた。
【００５７】
（５）疎水性クロマトグラフィー
活性が検出された溶出画分を緩衝液３（50mMリン酸カリウム緩衝液、1M硫酸アンモニウム、pH 7.0）に対して透析した。透析後に得られた溶液を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、緩衝液３で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。
【００５８】
次に、担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を緩衝液３を用いて洗い流した後、緩衝液４（50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0）を溶出液として用いて、吸着したタンパク質の溶出を行った。このとき、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を1Mから0Mまで直線的変化させた。このとき得られた各溶出画分についてXDH活性を測定したところ、硫酸アンモニウム濃度がおよそ200〜300mMの溶出位置にXDH活性が認められた。
【００５９】
（６）精製画分の分析
上記精製操作で得られたXDH活性画分をSDS-PAGEに付し、クマジーブリリアントブルー染色したところ、XDHは２本のバンドになるまでに精製されていることが確認され、その分子量はそれぞれ約27,000〜約30,000及び、約36,000〜約40,000と見積もられた（図１参照）。以後、分子量約36,000〜約40,000のバンドに相当する蛋白質をXDH1、分子量約27,000〜約30,000のバンドに相当する蛋白質をXDH2と称することとする。
【００６０】
また、得られた活性画分をNative-PAGE（非変性-PAGE）に供して、クマジーブリリアントブルー染色したところ100kDa以上に対応する２本のバンドが確認され、さらにNative-PAGE後のゲルを活性染色溶液（25mMグリシン緩衝液、2.5mM NAD、50mMキシリトール、0.2mM フェナジンメトサルフェート(phenazine methosulfate)、0.2mM 塩化テトラニトロブルーテトラゾリウム(tetranitro blue tetrazolium chloride)）に供して活性染色したところ、対応する２本のバンドの両方からXDH活性が検出され、SDS-PAGEでの２本のバンドに対応する蛋白はいずれもXDH活性を有していることを確認した（図１）。以下、このXDH1及びXDH2を含む精製画分を単にXDHと称することがある。
【００６１】
上記精製を行った結果のXDH比活性の上昇を測定した。前出の菌体抽出液、及び精製により得られた活性画分のXDH活性を測定した結果、この一連の精製操作により、単位タンパク質重量あたりの比活性は約550倍に上昇したことがわかった。なお、今回用いた活性測定法においては、精製したXDHの比活性は、約130U/mg（30℃、pH10）と見積もられた。
【００６２】
（７）XDHのＮ末端付近のアミノ酸配列の決定
上記のように精製されたXDHのＮ末端付近の配列を以下のようにして決定した。即ち、精製されたXDH画分のうち、タンパク質量約10μg分をSDS存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ゲル中のXDHを膜フィルターに転写し、プロテインシーケンサーによってアミノ酸配列をＮ末端から解析した。具体的には、ミリポア社ミリブロットを用い、セミドライ方式（タンパク質構造解析、平野久著、東京化学同人）によって電気泳動後のゲルからポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に目的酵素を転写した。続いて、PVDF膜上の目的酵素（XDH1及びXDH2）をプロテインシーケンサー（ABI社製、モデル476A）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った。
【００６３】
その結果、XDH1についてはＮ末端から27残基のアミノ酸配列が、XDH2についてはＮ末端から2５残基のアミノ酸配列が決定した。決定されたXDH1のＮ末端付近のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、XDH2のＮ末端付近のアミノ酸配列を配列表の配列番号２にそれぞれ示した。
【００６４】
【実施例２】
XDHによるD-キシルロースのキシリトールへの変換
実施例１で得られた精製XDH（XDH1及びXDH2）を用いて、D-キシルロースからのキシリトールへの変換を行った。21mM D-キシルロース、20mM NADH、100mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）を含む反応溶液0.25mlに0.2Uの精製XDHを添加し、30℃で一時間インキュベートすることにより反応を行った。反応後の溶液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、下記の条件にて生成したキシリトールを分析した。
【００６５】
カラム：Shodex SC1211〔昭和電工社製品〕
移動層：50％アセトニトリル/50％ 50ppm Ca-EDTA水溶液
流速：0.8 ml/分、
温度：60℃、
検出：RI検出器
【００６６】
その結果、反応後の溶液に18mMのキシリトールの生成が認められ、該精製XDHを用いてD-キシルロースからキシリトールが生産可能であることが示された。
【００６７】
【実施例３】
グルコノバクター属由来のXDH遺伝子の単離
＜１＞PCRによるXDH遺伝子断片の増幅
（１）XDHのＮ末端アミノ酸配列に基づいたPCRプライマーの作製
前述のグルコノバクター・オキシダンスATCC621由来XDH（XDH1、XDH2）のそれぞれのN末端アミノ酸配列（配列番号１及び２）をもとに、配列番号７〜１０にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【００６８】
（２）グルコノバクター・オキシダンスATCC621の染色体DNAの調製
グルコノバクター・オキシダンスATCC621株を以下の条件で培養した。まず、種培養として、ATCC621株を20mlのYPG培地（3%グルコース、0.5% Bacto Yeast Extract、0.3% Bacto Peptone、pH6.5）を用いて一晩培養した。この培養液5mlを種菌として、100mlのYPG培地を用いて本培養を行った。培養は、30℃で振盪培養にて行った。
【００６９】
上記条件下で対数増殖後期まで培養した後、培養液100mlを遠心分離操作（12000×g、４℃、15分間）に供し、集菌した。この菌体を10mlの50:20TE（50mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM EDTA）に懸濁し、遠心分離操作により菌体を洗浄、回収した。再び、この菌体を10ml 50:20 TEに懸濁した。さらに、この懸濁液に、0.5mlの20 mg/mlリゾチーム溶液、１mlの10%SDS溶液を加えた後、55℃で20分間インキュベートした。インキュベート後、１倍容の10:1 TE飽和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えて、DNAを沈澱させ、回収した。沈澱したDNAを0.5ml 50:20 TEに溶解した後、5μlの10mg/ml RNase、5μlの10mg/ml Proteinase Kを加えて、55℃で２時間反応させた。反応後、１倍容の10:1 TE飽和のフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の24:1クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度0.4Mとなるように3M酢酸ナトリウム溶液（pH 5.2）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたDNAを回収し、70%エタノールで洗浄した後、乾燥させ、1mlの10:1 TEに溶解させた。
【００７０】
（３）PCR法によるDNA断片の取得
グルコノバクター属細菌由来のXDHをコードする遺伝子を含むDNA分子を、TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用いたPCRにより増幅、単離した。以下、断わりの無い限り、キットの説明書の方法に基づき実験を行った。
【００７１】
上記（２）のようにして調製した染色体DNA 5μgを、制限酵素Pst I又はHindIIIでそれぞれ消化した。次に、エタノール沈澱操作により回収したDNA断片に、PstIカセット、又はHindIIIカセットを連結した。さらにエタノール沈澱操作を行った後、回収したDNAに対してプライマーC1と以下に示す組合せのプライマーを使用して１回目のPCRを行った。即ちXDH1のアミノ酸配列に基づいたプライマーXDH1-S1には鋳型DNAとしてはPstIカセットを連結したDNAを使用して、XDH2の配列に基づいたプライマーXDH2-S1には鋳型DNAとしてHindIIIカセットを連結したDNAをそれぞれ使用した。プライマーC1の塩基配列を配列表の配列番号１１に示し、プライマーXDH1-S1の塩基配列を配列表の配列番号７に示し、プライマーXDH2-S1の塩基配列を配列表の配列番号９に示した。プライマーC1はTaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kitに含まれており、PstIカセット内及びHindIIIカセット内の配列に対応する。PCR反応は、Gene Amp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて行い、以下の条件の反応を30サイクル行った。
【００７２】
94℃ 30秒
55℃ 2分
72℃ 1分
【００７３】
次にこの反応液を100倍に希釈して、プライマーC2及びプライマーXDH1-S2もしくはプライマーXDH2-S2を新たに加えて２回目のPCRを行った。条件は１回目と同じである。プライマーC2の塩基配列を配列表の配列番号１２に示し、プライマーXDH1-S2の塩基配列を配列表の配列番号８に示し、プライマーXDH2-S2の塩基配列を配列表の配列番号１０に示した。プライマーC2はTaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kitに含まれており、PstIカセット内及びHindIIIカセット内の配列に相当する配列を含む。プライマーXDH1-S2およびプライマーXDH2-S2は、それぞれ決定したアミノ酸配列に基づいて設計した配列、及びEcoRI部位に対応する配列、及びEcoRI部位を含んでいる。
【００７４】
反応後、反応液3μlを0.8%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、プライマーXDH1-S2を使用した場合には約1kbのDNA断片が、プライマー XDH2-S2を使用した場合には約1.7kbのDNA断片が増幅されていることが確認された。
【００７５】
（４）PCRで増幅されたDNA断片のpUC19へのクローニング
PCRで増幅された約1kbp (XDH1)と約1.7kbp (XDH2)のDNA断片をpUC19と連結してクローニングを行った。連結は、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて行った。以下、断わりの無い限り、キットの説明書の方法に基づき実験を行った。
【００７６】
プライマーXDH1-S2により増幅された約1kbのDNA断片400ngをPstI及びEcoRIによって消化後に、該DNA断片を精製し、PstI及びEcoRIによって消化されたpUC19と連結した。このライゲーション反応液を用いてエシェリヒア・コリJM109を形質転換した。
【００７７】
また、プライマーXDH2-S2により増幅された約1.7kbpのDNA断片400ngをHindIII及びEcoRIによって消化後に、該DNA断片を精製し、HindIII及びEcoRIによって消化されたpUC19と連結した。このライゲーション反応液を用いて大腸菌エシェリヒア・コリJM109を形質転換した。
【００７８】
得られたそれぞれの形質転換体より、目的とする約1kbp(XDH1)及び約1.7kbp(XDH2)のDNA断片を含むpUC19で形質転換されたJM109を数株づつ選抜した。選抜の方法は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載されている。
【００７９】
（５）XDH2遺伝子断片の塩基配列決定
約1.7kbp(XDH2)のDNA断片を含むpUC19で形質転換されたJM109が保有するプラスミドを、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載される方法に従って調製し、挿入DNA断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応は、 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動は、DNA Sequencer 373（ABI社製）を用いて行った。
【００８０】
その結果、PCRで増幅されたDNA断片は、配列表配列番号５に示される塩基配列のうち、1116番目のチミジン残基から2774番目のチミジン残基に至る配列を有することが解った。
【００８１】
（６）PCR法によるXDH2遺伝子の上流領域のDNA断片の取得
XDH2遺伝子およびXDH2遺伝子の上流領域のDNA断片を、上記で決定された塩基配列を利用してPCRにより増幅、単離した。、PCR反応は、TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用いて行った。以下、断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。
【００８２】
上記（２）のようにして調製した染色体DNA 5μgを制限酵素SalIで消化した。次に、エタノール沈澱操作により回収したDNA断片にSalI Cassetteを連結した。さらにエタノール沈澱操作を行った後、回収したDNAに対して、プライマーC1及びプライマーXDH2UP-S1を用いて１回目のPCRを行った。プライマーC1の塩基配列を配列表の配列番号１１に示し、プライマーXDH2UP-S1の塩基配列を配列表の配列番号１３に示した。プライマーXDH2UP-S1は、配列番号５に示すグルコノバクターのXDH2をコードする遺伝子群の塩基配列中1317番目のシトシン残基から1283番目のシトシン残基までの領域に相補する配列である。
【００８３】
PCR反応は、Gene Amp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて行い、以下の条件の反応を30サイクル行った。
94℃ 30秒
55℃ 2分
72℃ 1分
【００８４】
次にこの反応液を100倍に希釈して、プライマーC2及びプライマーXDH2UP-S2を新たに加えて２回目のPCRを行った。条件は１回目と同じである。プライマーC2及びプライマーXDH2UP-S2の配列をそれぞれ配列表配列番号１２と配列番号１４に示す。プライマーXDH2UP-S2は、配列番号５に示すグルコノバクターのXDH2をコードする遺伝子の塩基配列中1255番目のグアノシン残基から1225番目のグアノシン残基までの領域に相補する配列である。反応後、反応液３μｌを0.8％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、約1.3kbのDNA断片が増幅されていることが確認された。
【００８５】
（７）XDH2遺伝子及びその上流領域を含むDNA断片の塩基配列決定
上記のPCRで増幅された約1.3kbpのDNA断片を精製し、塩基配列を決定した。シーケンス反応は、 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動は、DNA Sequencer 373（ABI社製）を用いて行った。
【００８６】
その結果、（６）で増幅されたDNA断片は配列表配列番号５に示される塩基配列のうち、1番目のグアノシン残基から1224番目のグアノシン残基に至る配列を有することが解った。配列番号５に示す塩基配列は、この塩基配列と、前記（５）で決定した塩基配列を併せたものである。ユニバーサル・コドンに基づいて該塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号５に併記するとともに配列番号６に示す。該アミノ酸配列の２番目からから26番目までの配列は、配列番号２に示したXDH2のＮ末端アミノ酸配列の１番目から25番目の配列と完全に一致していた。このことから、PCRで増幅されたDNA断片は、目的のグルコノバクター属細菌由来のXDH2遺伝子及びその上流領域であることが確認された。
【００８７】
（８）XDH2遺伝子コード領域全長を有するDNA断片のクローニング
XDH2遺伝子のコード領域全長を有するDNA断片をPCR法により増幅し、pUC18と連結してクローニングを行った。PCR反応は、TaKaRa LA PCR kit（宝酒造社製）を用いて行った。以下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。
【００８８】
前記（２）のようにして調製したグルコノバクター・オキシダンス ATCC621株の染色体DNA 1μgを鋳型として、プライマーXDH2-5'及びプライマーXDH2-3'を用いてPCRを行った。プライマーXDH2-5'の塩基配列を配列表の配列番号１５に示し、プライマーXDH2-3'の塩基配列を配列表の配列番号１６に示した。プライマーXDH2-5'は配列番号５に示されるXDH2遺伝子を含む塩基配列のうち1043番目のシトシン残基から1063番目のアデノシン残基までの領域に相当する配列を含み、プライマーXDH2-3'は、1957番目のグアノシン残基から1978残基のシトシン残基までの領域に相補する配列を含む配列である。
【００８９】
PCR反応は、GeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて行い、以下の条件の反応を30サイクル行った。
【００９０】
94℃ 30秒
55℃ 2分
72℃ 1分
【００９１】
反応後、反応液3μlを0.8%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、約1kbpのDNA断片が増幅されていることが確認された。
上記のPCRで増幅された約1kbpのDNA断片をpUC18と連結してクローニングを行った。クローニングは DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて行った。以下、断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。増幅された約1kbのDNA断片400ngを、BamHI及びEcoRIによって消化後に、該DNA断片を精製し、BamHI及びEcoRIによって消化されたpUC18と連結した。このライゲーション反応液を用いてエシェリヒア・コリJM109を形質転換した。
【００９２】
得られた形質転換体より、目的とする約1kbpのDNA断片を含むpUC18で形質転換されたJM109を数株選抜した。選抜の方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載されている。
【００９３】
上記のようにしてグルコノバクター・オキシダンス由来XDH2遺伝子をクローニングすることができた。上記方法により得られた目的とするXDH2遺伝子断片を有するプラスミドをpUCXDH2とする。
【００９４】
（９）XDH1遺伝子断片の塩基配列の決定
前記（４）で選抜された、約1kbp(XDH1)のDNA断片を含むpUC19で形質転換されたJM109が保有するプラスミドを、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載される方法に従って調製し、挿入DNA断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応は、 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動は、DNA Sequencer 373（ABI社製）を用いて行った。
【００９５】
その結果、PCRで増幅されたDNA断片は、配列表配列番号３に示される塩基配列のうち、52番目のグアノシン残基から1011番目のグアノシン残基に至る配列を有することが解った。
【００９６】
（10）染色体DNAライブラリーからのXDH1遺伝子のクローニング
i)染色体DNAライブラリーの作製
前記（２）で調製した染色体DNA 1μgをHindIIIで完全に消化した。エタノール沈澱によってDNAを回収した後、10μlの10:1 TEに溶解した。このうちの5μlと、HindIIIで消化されてさらにBAP（bacterial alkaline phosphatase）による脱リン酸化処理を受けたpUC19（宝酒造製）1ngとを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液3μlとエシェリヒア・コリJM109株のコンピテント・セル（宝酒造製）100μlとを混合して、エシェリヒア・コリJM109株を形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体DNAライブラリーを作製した。
【００９７】
ii)プローブの作成
プローブには、（３）で取得したXDH1遺伝子の一部を用いることにした。（３）で取得したプライマーC2及びプライマーXDH1-S2により増幅された約1kbのDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、Gene Clean II Kit（フナコシ社製）を用いてDNAを精製した。最終的に50ng/μlのDNA溶液16μlを得た。このDNA断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書通りにプローブのジゴキシゲニンによる標識を行った。
【００９８】
iii)コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニング
XDH1遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体DNAライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に説明されている。
【００９９】
染色体DNAライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルター（Hybond-N、アマシャム社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションは、EASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを該バッファー（EASY HYB）中に浸し、42℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上記で作製した標識プローブを添加し、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを0.1% SDSを含む2×SSCで室温、20分間洗浄した。さらに0.1% SDSを含む0.1×SSCで65℃、15分間洗浄を２回行った。
【０１００】
プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書通りに行った。その結果、プローブとハイブリダイズするコロニーを４株確認できた。
【０１０１】
（11）XDH1遺伝子のDNAシーケンス
前記（５）と同様にして、pUC19に挿入されたDNA断片の塩基配列を決定した。その結果を、配列表配列番号３に示す。ユニバーサル・コドンに基づいて該塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号３に併記するとともに配列番号４に示す。該アミノ酸配列の2番目からから28番目までの配列は、配列番号１において開示した27残基からなるアミノ酸配列の1番目から27番目の配列と完全に一致していた。このことから取得したDNA断片は、目的のグルコノバクター属細菌由来のXDH1遺伝子及びその周辺領域であることが確認された。
【０１０２】
【実施例４】
グルコノバクター属細菌由来のXDH2遺伝子の大腸菌における発現及び精製
＜１＞組換えXDH2遺伝子を有する大腸菌の培養及び発現誘導
実施例３で取得したpUCXDH2では、グルコノバクター属細菌由来のXDH2遺伝子をコードするDNAがlacZプロモーターの下流に接続されており、lacZプロモーターから発現するようにデザインされていた。
【０１０３】
pUCXDH2によって形質転換された大腸菌JM109と、コントロールとして、pUC18によって形質転換された大腸菌JM109を、アンピシリン100μg/mlを含むLB培地50mlを用いて、37℃で一晩振盪培養した。これを種培養とした。pUCXDH2によって形質転換された大腸菌JM109の種培養を、新しい培地を入れたフラスコに1％植菌し、これを実験区１とした。一方、pUC18によって形質転換された大腸菌JM109の種培養も同様にフラスコに1％植菌し、実験区２とした（コントロール）。各実験区の培養を行い、610nmの波長を有する光の吸光度が約0.7になったところで、IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度1mMとなるよう添加した。その後、４時間経過したところで培養を終了した。
【０１０４】
＜２＞誘導発現した蛋白質の確認
培養終了後、培養液10mlを遠心分離（12,000×g、15分間）し、菌体を回収した。この菌体を2mlの10mM Tris-HCl、pH 7.5に懸濁し、遠心分離により菌体を洗浄、回収した。この菌体を1mlの同バッファーに懸濁した後、マルチビーズショッカー（安井機械（株）製）を用いて、0.1mmジルコニアビーズで３分間振盪破砕した。この菌体破砕懸濁液をSDS-PAGEに供し、CBB（クマジーブリリアントブルー）染色した。その結果、実験区１（pUCXDH2によって形質転換されたJM109）にのみにおいて観察される分子量約27,000〜30,000のバンドが確認された。この分子量から推定して、期待したXDH2蛋白質が発現したものと考えられた。
【０１０５】
＜３＞XDH活性の確認
発現された蛋白質のXDH活性を測定した。上記菌体破砕懸濁液を使用して実施例１に記載した方法によりXDH活性を測定した。その結果、コントロールのpUC18により形質転換された大腸菌JM109ではXDH活性が検出されなかったの対して、pUCXDH2により形質転換された大腸菌JM109では、14U/mgのXDH活性が検出された。この結果より、pUCXDH2により形質転換された大腸菌JM109では、XDH活性が確認された。
【０１０６】
＜４＞組換え大腸菌JM109からのXDH2の精製
上記＜２＞で培養した、pUCXDH2によって形質転換された大腸菌JM109を遠心分離にて集菌し、当該菌体を得た。こうして得られた菌体をXDHを精製するための材料として用いた。なお、XDH活性は、実施例１に記載した方法により測定した。
【０１０７】
（１）菌体抽出液の調製
上記菌体を、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7）に懸濁し、5000×gで10分間遠心し、沈澱画分に再度集菌した。この懸濁及び遠心の作業を、菌体の洗浄とした。この菌体の洗浄を２回繰り返した。
【０１０８】
洗浄菌体約3gを20mlの緩衝液１（20mM Tris-HCl(pH 7.6)、0.5mM EDTA、1mM MgCl₂、1mM DTT）に懸濁し、４℃で20分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（8000rpm、10分間)して菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（56000rpm、30分間）して不溶性画分を除いて可溶性画分を得た。
【０１０９】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた可溶性画分を緩衝液１で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose FF（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。
【０１１０】
次に、担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を緩衝液１を用いて洗い流した後、KClを含む緩衝液を溶出液として用いて、吸着したタンパク質の溶出を行った。このとき、緩衝液中のKCl濃度を0Mから0.5Ｍまで直線的に変化させた。このとき得られた各溶出画分についてXDH活性を測定したところ、KCl濃度がおよそ200〜350ｍＭの溶出位置にXDH活性が認められた。
【０１１１】
（３）NADアフィニティークロマトグラフィー
XDH活性を含む画分を集めて、緩衝液１に対して透析した。透析後の溶液を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、緩衝液１で平衡化されたNADアフィニティーカラムHiTrap Blue 5ml（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。次に、担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を緩衝液１を用いて洗い流した後、NADを含む緩衝液２（20mM Tris-HCl(pH 7.6)、0.5mM EDTA、1mM MgCl₂、1mM DTT、5mM NAD）を溶出液として用いて、担体に吸着したタンパク質の溶出を行った。このときXDHは溶出画分に検出された。
【０１１２】
（４）疎水性クロマトグラフィー
活性が検出された溶液を緩衝液３（50mMリン酸カリウム緩衝溶液、1M硫酸アンモニウム、pH 7.0）に対して透析した。透析後に得られた溶液を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、緩衝液３で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP（ファルマシア社製）に供した。この操作によりXDHは担体に吸着した。
【０１１３】
次に、担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を緩衝液３を用いて洗い流した後、緩衝液４（50mMリン酸カリウム緩衝溶液、pH7.0）を溶出液として用いて、吸着したタンパク質の溶出を行った。このとき、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を1Mから0Mまで直線的変化させた。このとき得られた各溶出画分についてXDH活性を測定したところ、硫酸アンモニウム濃度がおよそ200〜300mMの溶出位置にXDH活性が認められた。
【０１１４】
得られた活性画分をSDS-PAGEに付し、クマジーブリリアントブルー染色したところ、XDH2は１本のバンドになるまでに精製されていることが確認され、その分子量は約27,000〜約30,000と見積もられた。即ち、大腸菌JM109で発現させたXDH2を単一になるまで精製することができた。
【０１１５】
【実施例５】
XDHの至適pHの決定
実施例４にて取得したXDH2酵素を用いて、反応pHによる酵素活性の変化を以下の方法で測定し、至適pHを決定した。
【０１１６】
酵素反応緩衝液には酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.3、4、4.5、5及び6）、Tris-HCl(pH7及び8)、Glycine-NaOH(pH9)、CAPS-NaOH(pH10)緩衝液を用いた。XDH活性の還元反応の測定は、以下の方法で行った。酵素液30μｌを100mM（終濃度）D-キシルロース、0.2mM NADH、及び100mM緩衝溶液を含む反応溶液570μｌに添加して30℃にて酵素反応を行い、反応に伴うNADHの減少を分光光度計（DU 640 Spectrometer, BECKMAN社製 )を使用して340nmの吸光度を測定することにより決定した。一分間に1μmolのNADHを減少させる活性を1Uとした。なおNADHの340nmにおける分子吸光係数はε=6.3×10³として算出した。それぞれの緩衝液は反応溶液中で100ｍＭの濃度となるように添加した。酵素源として、上述の精製したXDH画分を用い,反応は30℃において行った。測定結果は、それぞれの反応溶液のpHの実測値に対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、pH 5における酸化反応の活性の活性を100とした。測定結果は図２に示した。
【０１１７】
本発明のXDH2の還元反応（D-キシルロースからキシリトールを生成する反応）の至適pHは約５付近であることが分かった（図２参照）。ところで、Cor F.B.Witteveenらが報告した（Microbiology, 1994, 140, 1679-1685）アスペルギルス・ニガー由来のXDHは、その還元反応の至適pHが厳密に6.5であるので、本発明のグルコノバクター属細菌由来のXDH2は既知のXDHはその至適pHが明らかに異なるものである。即ち、本発明で見出したグルコノバクター属細菌由来XDHのうち少なくともXDH2は、還元反応の至適pHが低いという特徴があることが示された。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明により、新規なキシリトールデヒドロゲナーゼ、該酵素をコードするDNA、該DNAを利用してキシリトールデヒドロゲナーゼを製造することができる。また、前記キシリトールデヒドロゲナーゼ、又は該酵素をコードするDNAを導入した細胞を用いて、キシリトールを製造することができる。
さらに、本発明のDNAは、キシリトール生産菌の育種に利用することができる。
【０１１９】
【配列表】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【０１２８】

【０１２９】

【０１３０】

【０１３１】

【０１３２】

【０１３３】

【０１３４】

【０１３５】

【０１３６】

【図面の簡単な説明】
【図１】精製されたXDHのポリアクリルアミドゲル電気泳動写真。ａ）は、SDS-PAGE後にCBB染色したもの。ｂ）は、Native-PAGE後にCBB染色したもの。ｃ）は、Native-PAGE後に活性染色したもの。
【図２】 XDH2の酵素活性のpH依存性を示すグラフ図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel xylitol dehydrogenase of acetic acid bacteria, a gene encoding the same, a method for producing xylitol dehydrogenase, and a method for producing xylitol. Xylitol is useful in the food and pharmaceutical fields.
[0002]
[Prior art]
Xylitol, a naturally occurring sugar alcohol, has a lower calorie than sucrose but exhibits a sweetness comparable to sucrose and is promising as a low calorie sweetener in the future. In addition, it has anti-cariogenic properties and can be a caries preventive sweetener. Furthermore, xylitol is used as an infusion for the treatment of diabetes in order not to raise the blood glucose level. Therefore, the demand for xylitol is expected to increase in the future.
[0003]
Currently, xylitol is industrially produced mainly by hydrogenation of D-xylose as described in US Pat. No. 4,008,825. D-xylose as a raw material can be obtained by hydrolysis using hardwood, straw, corn cobs, oat hulls, and other plant materials rich in xylan as starting materials.
[0004]
However, there is a problem that D-xylose obtained by hydrolyzing plant material is expensive. This is due to the high production cost. For example, since the yield of hydrolysis treatment of plant material is low, the purity of the produced D-xylitol is low. For this reason, after the hydrolysis treatment, an ion exchange treatment is performed to remove the acid and dye used for the hydrolysis. Further, D-xylose is crystallized to remove other hemicellulosic sugars. Further purification is required to obtain D-xylose suitable for food. These ion exchange treatment and crystallization treatment lead to an increase in production cost.
[0005]
Thus, several methods for producing xylitol have been developed that are readily available for starting materials and that produce less waste. For example, methods for producing xylitol using other pentitols as starting materials have been developed. One readily available pentitol is D-arabitol, which can be produced using yeast (Can. J. Microbiol., 31, 1985, 467-471, J. Gen. Microbiol). ., 139,1993,1047-54).
[0006]
Therefore, several methods for producing xylitol using D-arabitol as a raw material have been developed. Applied Microbiology., 18, 1969, 1031-1035, uses Debaryomyces hansenii ATCC20121 to produce D-arabitol from glucose by fermentation, followed by Acetobacter suboxydance Is used to convert D-arabitol into D-xylulose, and Candida Gilliermondi Vali. A method for converting soya (Candida guilliermondii var. Soya) into xylitol by acting on D-xylulose has been reported.
[0007]
In addition, in European Patent Application Publication Nos. 403392 and 421882, D-arabitol is fermented and produced using osmotic-resistant yeast, and then bacteria of the genus Acetobacter, bacteria of the genus Gluconobacter Alternatively, D-arabitol is converted to D-xylulose using a bacterium belonging to the genus Klebsiella, and then glucose (xylose) isomerase is allowed to act on D-xylulose to produce a mixture of xylose and D-xylulose. A method of hydrogenating D-xylulose to convert it to xylitol is disclosed. In addition, a method is disclosed in which xylose in the xylose / D-xylulose mixture is pre-concentrated and hydrogenated to convert it to xylitol.
[0008]
However, the xylitol production method using D-arabitol as a raw material can produce xylitol in a relatively high yield, but it requires a multi-step reaction step, which makes the process complicated. Therefore, it was not satisfactory economically.
[0009]
On the other hand, breeding of xylitol-fermenting bacteria has been attempted by genetic manipulation techniques. The arabitol dehydrogenase gene from Klebsiella spp. And the xylitol dehydrogenase gene from Pichia spp. Can be transferred to arabitol fermenting bacteria (yeast belonging to the genus Candida, Torulopsis or Zygosaccharomyces). An attempt has been made to fermentatively produce xylitol from glucose using the introduced genetically modified bacteria (WO94 / 10325 international publication pamphlet).
However, breeding of xylitol-fermenting bacteria by the above-described gene manipulation technique cannot be said to be practically completed.
[0010]
By the way, xylitol dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction for producing xylitol from xylulose, and its existence is known in many biological species. For example, Pichia stipitis (J. Ferment. Bioeng., 67, 25 (1989)), Pachysolen tannophilus (J. Ferment. Technol., 64, 219 (1986)), Candida・ Candida shehatae (Appl. Biochem. Biotech., 26, 197 (1990)), Candida parapsilosis (Biotechnol. Bioeng., 58, 440 (1998)), Debariomyces Hansenii (Appl. Biochem. Biotech., 56, 79 (1996)), Pullularia pullulans (An. Acad. Brasil. Cienc., 53, 183 (1981)), yeasts such as Aspergillus niger (Microbiology) , 140, 1679 (1994)), filamentous fungi such as Neurospora crassa (FEMS Microbiol. Lett., 146, 79 (1997)), Galdieria sulphuraria (Planta, 202, 487 , (1997)) Algae such as Morganella mol Two (Morgannela morganii) (J. Bacteriol., 162, 845 (1985)) the presence of xylitol dehydrogenase are known in bacteria such as.
[0011]
In addition, the base sequence of the gene derived from Pichia stipitis (FEBS Lett., 324, 9 (1993)) and Morganella morgani (DDBJ / GenBank / EMBL accession No. L34345) has also been reported for the xylitol dehydrogenase gene.
However, the existence of xylitol dehydrogenase derived from acetic acid bacteria and its gene are not known.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides an enzyme and its gene involved in xylitol biosynthesis of a microorganism excellent in xylitol-producing ability, and a method of using these in order to establish a technique for efficiently producing xylitol or breeding of xylitol-fermenting bacteria. This is the issue.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors searched for microorganisms having the ability to directly convert D-arabitol into xylitol. As a result, it was found that bacteria having the ability exist in bacteria belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter. They succeeded in purifying two types of xylitol dehydrogenase from one of those bacteria, Gluconobacter oxydans, and succeeded in isolating the genes encoding these enzymes and determining their structures. The present invention has been completed.
[0014]
That is, the present invention
(1) The protein shown in the following (A) or (B),
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(2) a protein shown in (C) or (D) below,
(C) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
(D) a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
[0015]
The present invention also provides
(3) DNA encoding the protein shown in (A) or (B) below,
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(4) DNA encoding the protein shown in (C) or (D) below,
(C) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
(D) a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity ,
(5) DNA of (3) which is DNA shown in the following (a) or (b)
(A) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 25 to 1053 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
(B) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least base numbers 25 to 1053 or a probe prepared from the base sequence, and xylitol DNA encoding a protein having dehydrogenase activity.
(6) The DNA according to (5), wherein the stringent conditions are conditions in which washing is performed at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS at 60 ° C.
(7) DNA of (4) which is DNA shown in the following (c) or (d),
(C) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 1063 to 1848 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(D) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least base numbers 1063 to 1848 or a probe prepared from the base sequence, and xylitol DNA encoding a protein having dehydrogenase activity is provided.
(8) The DNA according to (7), wherein the stringent conditions are conditions in which washing is performed at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS at 60 ° C.
[0016]
The present invention also provides
(9) Provided is a cell into which the DNA of any one of (3) to (8) has been introduced in a form in which xylitol dehydrogenase encoded by the DNA can be expressed.
[0017]
The present invention further includes
(10) A method for producing xylitol dehydrogenase, comprising culturing the cells of (9) above in a medium, causing xylitol dehydrogenase to be produced and accumulated in the culture, and collecting xylitol dehydrogenase from the culture.
[0018]
Furthermore, the present invention provides
(11) A method for producing xylitol, which comprises reacting the xylitol dehydrogenase of (1) or (2) with D-xylulose to collect the produced xylitol, and
(12) Provided is a method for producing xylitol, which comprises collecting the xylitol produced by allowing the cells of (9) to act on D-xylulose.
[0019]
The xylitol dehydrogenase of the present invention has an activity of catalyzing both the reaction of reducing D-xylulose to produce xylitol and the reaction of oxidizing xylitol to produce D-xylulose. “Having xylitol dehydrogenase activity” means having at least an activity of catalyzing a reaction for producing xylitol from D-xylulose.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0021]
<1> Xylitol dehydrogenase of the present invention
The xylitol dehydrogenase of the present invention is an enzyme produced by Gluconobacter oxydans. There were two kinds of the enzymes, one of which was named XDH1 and the other was XDH2. XDH1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and XDH2 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. XDH1 and XDH2 have molecular weights of about 36,000 to about 40,000 and about 27,000 to about 30,000, respectively, by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis). Hereinafter, these two types of xylitol dehydrogenase, XDH1 and / or XDH2, may be collectively referred to as “XDH”.
[0022]
As shown in Example 5 described later, the optimum pH in the reduction reaction of XDH2 (reaction for producing xylitol from D-xylulose) was about 5 or so. Known xylitol dehydrogenases, for example, xylitol dehydrogenase from Aspergillus niger, have an optimal pH of strictly 6.5 (Cor FB Witteveen, et al., Microbiology, 1994, 140, 1679-1685), and the glucos of the present invention The optimum pH of the reaction is clearly different from XDH2 derived from Novacter bacteria.
[0023]
Next, as an example of the method for producing XDH of the present invention, a method for isolating and purifying XDH from Gluconobacter oxydans will be described.
First, gluconobacter oxydans, for example, ATCC621 strain cells are disrupted by sonication or other physical methods, or enzymatic methods using cell wall lysing enzymes, etc. Prepare a cell extract by removing the minute.
[0024]
The cell extract obtained as described above is fractionated by combining the usual protein purification methods, anion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, etc. Can be purified.
[0025]
Examples of the carrier for anion exchange chromatography include Q-Sepharose FF (Pharmacia) and Mono-Q (Pharmacia). An extract containing XDH is passed through a column packed with these carriers to adsorb the enzyme to the column, the column is washed, and then the enzyme is eluted using a buffer solution with a high salt concentration. At that time, the salt concentration may be increased stepwise, or a concentration gradient may be applied. For example, when Q-Sepharose FF is used, XDH adsorbed on the column is eluted with about 200 to 350 mM KCl. Mono-Q is eluted with about 150 to 250 mM KCl.
[0026]
Examples of the affinity chromatography carrier include HiTrap Blue (Pharmacia). The XDH of the present invention uses NAD or NADH as a coenzyme and has affinity for these substances. XDH adsorbed on the carrier can be eluted with a buffer containing about 5 mM NAD.
[0027]
Examples of the carrier for hydrophobic chromatography include Phenyl Sepharose HP (manufactured by Pharmacia). XDH adsorbed on the carrier at a low salt concentration is eluted with about 200 to 300 mM ammonium sulfate.
[0028]
XDH purified as described above can be further separated and purified into XDH1 and XDH2 by gel filtration chromatography or SDS-PAGE. Examples of the carrier for gel filtration chromatography include Sephadex 200HP (manufactured by Pharmacia).
[0029]
In the above purification operation, the fraction containing XDH can be confirmed by measuring the XDH activity of each fraction by the method shown in the Examples described later.
The N-terminal amino acid sequences of XDH1 and XDH2 purified as described above are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
[0030]
The XDH of the present invention is obtained by isolating and purifying from the cells of Gluconobacter oxydans as described above, and encodes XDH, which will be described later, by a method usually used for the fermentation production of heterologous proteins. It can also be produced by introducing the DNA into a suitable host and expressing it.
Various gene recombination techniques listed below are described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989).
[0031]
Hosts for expressing the XDH gene include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Gluconobacter bacteria such as Gluconobacter oxydans, and Bacillus subtilis. Various prokaryotic cells such as various prokaryotic cells, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Aspergillus oryzae can be used.
[0032]
Recombinant DNA used to introduce the XDH gene into the host can be obtained by inserting the DNA encoding XDH into a vector corresponding to the type of host to be expressed in a form that allows expression of the XDH encoded by the DNA. Can be prepared. As a promoter for expressing the XDH gene, when a promoter specific to the XDH gene functions in a host cell, the promoter can be used. Further, if necessary, another promoter that works in the host cell may be linked to DNA encoding XDH and expressed under the control of the promoter. When Escherichia bacteria are used as the host, such promoters include lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage P _R Promoter, P _L Examples include promoters. Examples of the vector for Escherichia bacteria include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 and the like. In addition, phage DNA vectors can be used. Furthermore, an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence can also be used.
[0033]
Transformation methods for introducing recombinant DNA into host cells include DM Morrison's method (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or a method in which recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability ( Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
[0034]
<2> DNA encoding XDH
DNA encoding XDH can be obtained by PCR (polymerase chain reacion, White, TJ et al; Trends Genet., 5, 185 (1989)) or high from a Gluconobacter oxydans cDNA library or chromosomal DNA library. It can be obtained by hybridization. Primers used for PCR can be designed based on the N-terminal amino acid sequence determined for purified XDH1 and XDH2. Further, since the base sequences of the XDH1 gene (SEQ ID NO: 3) and XDH2 gene (SEQ ID NO: 5) have been clarified by the present invention, primers or probes for hybridization may be designed based on these base sequences. . When a primer having a sequence corresponding to the 5 ′ untranslated region and the 3 ′ untranslated region is used as a primer for PCR, the entire length of the XDH coding region can be amplified. Specifically, for XDH2, a primer having a base sequence in a region upstream of base number 1063 in SEQ ID NO: 5 is used as a 5 ′ side primer, and a region downstream of base number 1851 is used as a 3 ′ side primer. Examples include primers having a sequence complementary to the base sequence. For XDH1, examples of the 5 ′ primer include a primer having a base sequence in a region upstream of base number 25 in SEQ ID NO: 3.
[0035]
The primer can be synthesized according to a conventional method using, for example, a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems and using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). The PCR reaction can be performed, for example, using Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER) and TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Shuzo) according to the method specified by the supplier.
[0036]
As long as the activity of the encoded XDH1 or XDH2, ie, the activity of producing xylitol from D-xylulose is not impaired, the DNA of the present invention , It may encode XDH1 or XDH2 containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions. Here, “several” differs depending on the position and type of protein in the three-dimensional structure of amino acid residues. , 2 to 10 pieces.
[0037]
Such DNA encoding a protein substantially identical to XDH1 or XDH2 may be substituted, deleted, inserted, or added at a specific site in the XDH1 gene or XDH2 gene by, for example, site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes in vitro treatment of DNA encoding XDH with hydroxylamine and the like, and Escherichia bacteria carrying DNA encoding XDH by irradiation with ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro-N-nitroso. Examples include treatment with a mutating agent that is usually used for artificial mutation such as guanidine (NTG) or nitrous acid.
[0038]
Moreover, naturally occurring mutations such as differences between microorganism species or strains are included in the above-mentioned base substitution, deletion, insertion, addition, or inversion.
By expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the XDH activity of the expression product, DNA encoding a protein substantially identical to XDH1 or XDH2 can be obtained. Further, from DNA encoding XDH1 or XDH2 having a mutation or a cell holding the same, for example, DNA having the base sequence consisting of base numbers 25 to 1053 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing or the same bases It hybridizes under stringent conditions with a probe prepared from the sequence or a DNA prepared from the base sequence consisting of base numbers 1063 to 1848 or a probe prepared from the base sequence of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5. Moreover, DNA encoding a protein substantially identical to XDH1 or XDH2 can also be obtained by isolating DNA encoding a protein having XDH activity.
[0039]
The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to clearly quantify this condition, , Southern hybridization wash conditions Ru Examples include conditions for hybridization at a salt concentration corresponding to 0.1 × SSC and 0.1% SDS. The genes that hybridize under these conditions include those that have generated stop codons in the middle and those that have lost activity due to mutations in the active center. It can be easily removed by expressing in an appropriate host and measuring the XDH activity of the expression product by the method described below.
[0040]
The DNA encoding the XDH of the present invention can be used for the above-described XDH production method and the later-described xylitol production method, as well as for breeding xylitol-producing bacteria. For example, by enhancing the XDH gene in a microorganism having the ability to produce xylitol from D-arabitol, such as Gluconobacter bacteria, the ability of the microorganism to convert from D-arabitol to xylitol can be enhanced.
[0041]
<3> Method for producing xylitol
Xylitol can be produced by allowing XDH of the present invention or a cell expressing XDH introduced therein to act on D-xylulose and collecting the resulting xylitol.
[0042]
XDH may be an enzyme extracted from Gluconobacter bacteria or an enzyme produced by a genetic recombination method using DNA encoding XDH. XDH may be either XDH1 or XDH2, and may be a mixture of these in any ratio.
[0043]
The reaction for producing xylitol from D-xylulose usually gives good results at a temperature of 20-60 ° C., desirably 30-40 ° C., pH 4-10, desirably pH 4-8. For the reaction, either a stationary reaction or a stirring reaction can be employed. The reaction time varies depending on the concentration of XDH used, the amount of cells, or the substrate concentration, but is preferably 1 to 100 hours.
[0044]
In order to collect and separate the produced xylitol from the reaction-terminated mixture, a method using a synthetic adsorbent, a method using a precipitating agent, or other ordinary collection and separation methods can be employed.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. In addition, this invention is not limited to description of an Example.
[0046]
[Example 1]
Production and purification of XDH by Gluconobacter oxydans
<1> Culture of Gluconobacter oxydans ATCC621
Gluconobacter oxydans ATCC621 was cultured to obtain bacterial cells having sufficient XDH activity. All the cultures were carried out by liquid shaking culture at 30 ° C. using PD medium. The composition of PD medium is 24 g / L Potato dextrose (Difco), 30 g / L Yeast Extract (Difco), 5 g / L meat extract (Difco), 15 g / L glycerol, 10 g / L D-arabitol, 10 g / L D-xylose, 10 g / L xylitol, 20 g / L calcium carbonate (Kanto Chemical), pH 7.0.
[0047]
First, as a seed culture, ATCC621 strain was inoculated into a Sakaguchi flask containing 40 ml of PD medium and cultured overnight at 30 ° C. with shaking. The obtained culture solution was similarly inoculated into 40% of a Sakaguchi flask containing 40 ml of PD medium at 40% and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days (main culture). After removing calcium carbonate by centrifugation, the cells were collected by centrifugation to obtain the cells. The bacterial cells thus obtained were used as a material for purifying XDH.
[0048]
XDH activity was measured by the following enzyme activity measurement method. Add 30 μl of enzyme solution to 570 μl of reaction solution containing 100 mM (final concentration) xylitol, 2 mM NAD, and 100 mM CAPS (pH 10.0) and perform enzyme reaction at 30 ° C. It was determined by measuring the absorbance at 340 nm using a meter (DU 640 Spectrometer, manufactured by BECKMAN). The activity that generates 1 μmol of NADH per minute was defined as 1 U. The molecular absorption coefficient of NADH at 340 nm is ε = 6.3 × 10 ^Three Calculated as
[0049]
<2> Purification of XDH
(1) Preparation of bacterial cell extract
The bacterial cells obtained above were suspended in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7), centrifuged at 5000 × g for 10 minutes, and collected again in the precipitated fraction. This cell suspension and centrifugation were repeated twice to wash the cells.
[0050]
About 10 g of the washed cells are mixed with 50 ml of Buffer 1 (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5 mM EDTA, 1 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT) and sonicated at 4 ° C. for 20 minutes. The disrupted solution was centrifuged (8000 rpm, 10 minutes) to remove the cell residue, and ultracentrifuged (56000 rpm, 30 minutes) to remove the insoluble fraction to obtain a soluble fraction.
[0051]
(2) Anion exchange chromatography
The soluble fraction was applied to an anion exchange chromatography column Q-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrated with buffer 1. By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0052]
Next, the protein that had not been adsorbed on the carrier (non-adsorbed protein) was washed away using buffer solution 1, and then the adsorbed protein was eluted using a buffer solution containing KCl as an eluent. At this time, the KCl concentration in the buffer was linearly changed from 0M to 0.5M. When XDH activity was measured for each of the elution fractions obtained at this time, XDH activity was observed at the elution position where the KCl concentration was approximately 200 to 350 mM.
[0053]
(3) NAD affinity chromatography
The fractions containing XDH activity obtained above were collected and dialyzed against buffer solution 1. The solution after dialysis was filtered with a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to 5 ml of NAD affinity column HiTrap Blue equilibrated with Buffer 1 (Pharmacia). By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0054]
Next, after washing away the protein not adsorbed on the carrier (non-adsorbed protein) with the buffer 1, the buffer 2 containing NAD (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5 mM EDTA, 1 mM MgCl). ₂ , 1 mM DTT, 5 mM NAD) were used as eluents to elute the adsorbed proteins. At this time, XDH was detected in the eluted fraction.
[0055]
(4) Anion exchange chromatography
The elution fraction containing the above XDH activity was filtered with a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to an anion exchange chromatography column Mono-Q (manufactured by Pharmacia) equilibrated with buffer solution 1. By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0056]
Next, the non-adsorbed protein was washed away with the buffer solution 1, and then the adsorbed protein was eluted using a buffer solution containing KCl as an eluent. At this time, an elution method was used in which the KCl concentration in the buffer solution was linearly changed from 0 mM to 500 mM. When XDH activity was measured for each of the elution fractions obtained at this time, activity was observed at the elution position where the KCl concentration was approximately 150 mM to 250 mM.
[0057]
(5) Hydrophobic chromatography
The eluted fraction in which the activity was detected was dialyzed against buffer 3 (50 mM potassium phosphate buffer, 1M ammonium sulfate, pH 7.0). The solution obtained after dialysis was filtered through a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to a hydrophobic chromatography column Phenyl Sepharose HP (Pharmacia) equilibrated with buffer 3. By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0058]
Next, the non-adsorbed protein that was not adsorbed on the carrier was washed away using buffer solution 3, and then the adsorbed protein was eluted using buffer solution 4 (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0) as the eluent. Went. At this time, the ammonium sulfate concentration in the buffer was linearly changed from 1M to 0M. When XDH activity was measured for each of the elution fractions obtained at this time, XDH activity was observed at the elution position where the ammonium sulfate concentration was approximately 200 to 300 mM.
[0059]
(6) Analysis of purified fraction
The XDH active fraction obtained by the above purification operation was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue. As a result, it was confirmed that XDH was purified to two bands, and the molecular weights were It was estimated to be about 27,000 to about 30,000 and about 36,000 to about 40,000 (see FIG. 1). Hereinafter, a protein corresponding to a band with a molecular weight of about 36,000 to about 40,000 will be referred to as XDH1, and a protein corresponding to a band with a molecular weight of about 27,000 to about 30,000 will be referred to as XDH2.
[0060]
In addition, the obtained active fraction was subjected to Native-PAGE (non-denaturing-PAGE) and stained with Coomassie brilliant blue, and two bands corresponding to 100 kDa or more were confirmed. Corresponding to activity staining with active staining solution (25 mM glycine buffer, 2.5 mM NAD, 50 mM xylitol, 0.2 mM phenazine methosulfate, 0.2 mM tetranitro blue tetrazolium chloride) XDH activity was detected from both of the two bands, and it was confirmed that both proteins corresponding to the two bands on SDS-PAGE had XDH activity (FIG. 1). Hereinafter, the purified fraction containing XDH1 and XDH2 may be simply referred to as XDH.
[0061]
The increase in XDH specific activity as a result of the above purification was measured. As a result of measuring the XDH activity of the above-mentioned bacterial cell extract and the active fraction obtained by purification, it was found that the specific activity per unit protein weight increased by about 550 times by this series of purification operations. . In the activity measurement method used this time, the specific activity of purified XDH was estimated to be about 130 U / mg (30 ° C., pH 10).
[0062]
(7) Determination of amino acid sequence near the N-terminus of XDH
The sequence near the N-terminus of XDH purified as described above was determined as follows. That is, of the purified XDH fraction, a protein amount of about 10 μg was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS, the XDH in the gel was transferred to a membrane filter, and the amino acid sequence was analyzed from the N-terminus by a protein sequencer. . Specifically, the target enzyme was transferred from the gel after electrophoresis to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by a semi-dry method (protein structure analysis, Hisashi Hirano, Tokyo Kagaku Dojin) using Millipore MilliBlot. Subsequently, the target enzymes (XDH1 and XDH2) on the PVDF membrane were subjected to a protein sequencer (ABI, model 476A), and N-terminal amino acid sequence analysis was performed.
[0063]
As a result, the amino acid sequence of 27 residues from the N terminus was determined for XDH1, and the amino acid sequence of 25 residues from the N terminus was determined for XDH2. The determined amino acid sequence near the N-terminus of XDH1 is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, and the amino acid sequence near the N-terminus of XDH2 is shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
[0064]
[Example 2]
Conversion of D-xylulose to xylitol by XDH
Using the purified XDH (XDH1 and XDH2) obtained in Example 1, D-xylulose was converted to xylitol. The reaction was performed by adding 0.2 U of purified XDH to 0.25 ml of a reaction solution containing 21 mM D-xylulose, 20 mM NADH, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and incubating at 30 ° C. for 1 hour. The solution after the reaction was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), and xylitol produced under the following conditions was analyzed.
[0065]
Column: Shodex SC1211 [Showa Denko product]
Moving bed: 50% acetonitrile / 50% 50ppm Ca-EDTA aqueous solution
Flow rate: 0.8 ml / min,
Temperature: 60 ° C
Detection: RI detector
[0066]
As a result, production of 18 mM xylitol was observed in the solution after the reaction, indicating that xylitol can be produced from D-xylulose using the purified XDH.
[0067]
[Example 3]
Isolation of XDH gene from Gluconobacter
<1> Amplification of XDH gene fragment by PCR
(1) Preparation of PCR primers based on the N-terminal amino acid sequence of XDH
Based on the respective N-terminal amino acid sequences (SEQ ID NOs: 1 and 2) of XDH (XDH1, XDH2) derived from the aforementioned Gluconobacter oxydans ATCC621, mixed primers having base sequences shown in SEQ ID NOs: 7-10 Created.
[0068]
(2) Preparation of chromosomal DNA of Gluconobacter oxydans ATCC621
Gluconobacter oxydans strain ATCC621 was cultured under the following conditions. First, as a seed culture, ATCC621 strain was cultured overnight using 20 ml of YPG medium (3% glucose, 0.5% Bacto Yeast Extract, 0.3% Bacto Peptone, pH 6.5). Using 5 ml of this culture as an inoculum, main culture was performed using 100 ml of YPG medium. The culture was performed at 30 ° C. with shaking culture.
[0069]
After culturing to the late stage of logarithmic growth under the above conditions, 100 ml of the culture solution was subjected to centrifugation (12000 × g, 4 ° C., 15 minutes) and collected. The cells were suspended in 10 ml of 50:20 TE (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA), and the cells were washed and collected by centrifugation. Again, the cells were suspended in 10 ml 50:20 TE. Further, 0.5 ml of a 20 mg / ml lysozyme solution and 1 ml of a 10% SDS solution were added to this suspension, followed by incubation at 55 ° C. for 20 minutes. After incubation, protein removal was performed by adding 1 volume of 10: 1 TE saturated phenol. One volume of 2-propanol was added to the separated aqueous layer to precipitate and collect DNA. After the precipitated DNA was dissolved in 0.5 ml 50:20 TE, 5 μl of 10 mg / ml RNase and 5 μl of 10 mg / ml proteinase K were added and reacted at 55 ° C. for 2 hours. After the reaction, deproteinization was performed with 1 volume of 10: 1 TE saturated phenol. Further, 1 volume of 24: 1 chloroform / isoamyl alcohol was added to the separated aqueous layer and stirred to recover the aqueous layer. A 3M sodium acetate solution (pH 5.2) was added to the aqueous layer obtained after performing this operation two more times to a final concentration of 0.4M, and further 2 volumes of ethanol were added. The resulting DNA was collected, washed with 70% ethanol, dried and dissolved in 1 ml of 10: 1 TE.
[0070]
(3) DNA fragment acquisition by PCR
A DNA molecule containing a gene encoding XDH derived from Gluconobacter bacteria was amplified and isolated by PCR using TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Shuzo). Unless otherwise stated, experiments were conducted based on the method described in the kit instructions.
[0071]
Chromosomal DNA (5 μg) prepared as described in (2) above was digested with restriction enzymes Pst I or HindIII, respectively. Next, a PstI cassette or HindIII cassette was ligated to the DNA fragment recovered by the ethanol precipitation operation. After further ethanol precipitation, the first PCR was performed on the recovered DNA using the primer C1 and the following combination of primers. In other words, the primer XDH1-S1 based on the amino acid sequence of XDH1 uses DNA linked to the PstI cassette as the template DNA, and the primer XDH2-S1 based on the sequence of XDH2 uses DNA linked to the HindIII cassette as the template DNA. Were used respectively. The base sequence of primer C1 is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, the base sequence of primer XDH1-S1 is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and the base sequence of primer XDH2-S1 is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. Primer C1 is included in the TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit and corresponds to sequences in the PstI cassette and HindIII cassette. PCR reaction was performed using Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER), and the reaction under the following conditions was performed for 30 cycles.
[0072]
94 ℃ 30 seconds
55 ° C 2 minutes
72 ° C for 1 minute
[0073]
Next, this reaction solution was diluted 100-fold, primer C2 and primer XDH1-S2 or primer XDH2-S2 were newly added, and a second PCR was performed. The conditions are the same as the first time. The base sequence of primer C2 is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing, the base sequence of primer XDH1-S2 is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, and the base sequence of primer XDH2-S2 is shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. Primer C2 is included in the TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit and contains sequences corresponding to the sequences in the PstI cassette and HindIII cassette. Primer XDH1-S2 and primer XDH2-S2 each contain a sequence designed based on the determined amino acid sequence, a sequence corresponding to the EcoRI site, and an EcoRI site.
[0074]
After the reaction, 3 μl of the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that when the primer XDH1-S2 was used, an approximately 1 kb DNA fragment was amplified, and when the primer XDH2-S2 was used, an approximately 1.7 kb DNA fragment was amplified.
[0075]
(4) Cloning of DNA fragment amplified by PCR into pUC19
Cloning was performed by ligating the DNA fragments of about 1 kbp (XDH1) and about 1.7 kbp (XDH2) amplified by PCR with pUC19. Ligation was performed using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo). Unless otherwise stated, experiments were conducted based on the method described in the kit instructions.
[0076]
After digesting 400 ng of a DNA fragment of about 1 kb amplified by the primer XDH1-S2 with PstI and EcoRI, the DNA fragment was purified and ligated with pUC19 digested with PstI and EcoRI. Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation reaction solution.
[0077]
Further, after digesting 400 ng of a DNA fragment of about 1.7 kbp amplified by the primer XDH2-S2 with HindIII and EcoRI, the DNA fragment was purified and ligated with pUC19 digested with HindIII and EcoRI. Escherichia coli Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation reaction solution.
[0078]
From each of the obtained transformants, several strains of JM109 transformed with pUC19 containing the target DNA fragments of about 1 kbp (XDH1) and about 1.7 kbp (XDH2) were selected. The selection method is described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989).
[0079]
(5) Determination of nucleotide sequence of XDH2 gene fragment
A plasmid possessed by JM109 transformed with pUC19 containing a DNA fragment of about 1.7 kbp (XDH2) was prepared according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989). The base sequence was determined. The sequencing reaction was performed according to the instructions using a Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI). Electrophoresis was performed using DNA Sequencer 373 (ABI).
[0080]
As a result, it was found that the DNA fragment amplified by PCR had a sequence from the 1116th thymidine residue to the 2774th thymidine residue in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing.
[0081]
(6) Acquisition of DNA fragments in the upstream region of the XDH2 gene by PCR
The XDH2 gene and the DNA fragment in the upstream region of the XDH2 gene were amplified and isolated by PCR using the base sequence determined above. The PCR reaction was performed using TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Shuzo). Hereinafter, unless otherwise noted, experiments were performed based on the instructions.
[0082]
Chromosomal DNA (5 μg) prepared as described in (2) above was digested with the restriction enzyme SalI. Next, SalI Cassette was ligated to the DNA fragment recovered by the ethanol precipitation operation. After further ethanol precipitation, the first PCR was performed on the recovered DNA using the primer C1 and the primer XDH2UP-S1. The base sequence of primer C1 is shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing, and the base sequence of primer XDH2UP-S1 is shown in SEQ ID NO: 13 of the sequence listing. Primer XDH2UP-S1 is a sequence that is complementary to the region from the 1317th cytosine residue to the 1283th cytosine residue in the base sequence of the gene group encoding Gluconobacter XDH2 shown in SEQ ID NO: 5.
[0083]
PCR reaction was performed using Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER), and the reaction under the following conditions was performed for 30 cycles.
94 ℃ 30 seconds
55 ° C 2 minutes
72 ° C for 1 minute
[0084]
Next, this reaction solution was diluted 100 times, and primer C2 and primer XDH2UP-S2 were newly added to perform the second PCR. The conditions are the same as the first time. The sequences of primer C2 and primer XDH2UP-S2 are shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14, respectively. Primer XDH2UP-S2 is a sequence that is complementary to the region from the 1255th guanosine residue to the 1225th guanosine residue in the base sequence of the gene encoding Gluconobacter XDH2 shown in SEQ ID NO: 5. After the reaction, 3 μl of the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 1.3 kb was amplified.
[0085]
(7) Determination of the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the XDH2 gene and its upstream region
The DNA fragment of about 1.3 kbp amplified by the above PCR was purified and the nucleotide sequence was determined. The sequencing reaction was performed according to the instructions using a Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI). Electrophoresis was performed using DNA Sequencer 373 (ABI).
[0086]
As a result, it was found that the DNA fragment amplified in (6) had a sequence extending from the first guanosine residue to the 1224th guanosine residue in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in Sequence Listing. The base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is a combination of this base sequence and the base sequence determined in (5) above. The amino acid sequence that can be encoded by the base sequence based on the universal codon is shown in SEQ ID NO: 5 and shown in SEQ ID NO: 6. The second to 26th amino acid sequences of the amino acid sequence were completely identical to the first to 25th sequences of the N-terminal amino acid sequence of XDH2 shown in SEQ ID NO: 2. From this, it was confirmed that the DNA fragment amplified by PCR is the XDH2 gene derived from the target Gluconobacter bacterium and its upstream region.
[0087]
(8) Cloning of DNA fragment having the full length of XDH2 gene coding region
A DNA fragment having the entire coding region of the XDH2 gene was amplified by PCR and cloned by ligation with pUC18. PCR reaction was performed using TaKaRa LA PCR kit (Takara Shuzo). Unless otherwise stated, experiments were conducted based on the instructions.
[0088]
PCR was performed using primer XDH2-5 ′ and primer XDH2-3 ′ using 1 μg of chromosomal DNA of Gluconobacter oxydans ATCC621 strain prepared as described in (2) above as a template. The base sequence of primer XDH2-5 ′ is shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, and the base sequence of primer XDH2-3 ′ is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing. Primer XDH2-5 ′ includes a sequence corresponding to the region from the 1043rd cytosine residue to the 1063rd adenosine residue in the base sequence containing the XDH2 gene shown in SEQ ID NO: 5, This is a sequence comprising a sequence complementary to the region from the 1957th guanosine residue to the 1978 cytosine residue.
[0089]
PCR reaction was performed using GeneAmp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER), and the reaction under the following conditions was performed for 30 cycles.
[0090]
94 ℃ 30 seconds
55 ° C 2 minutes
72 ° C for 1 minute
[0091]
After the reaction, 3 μl of the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 1 kbp was amplified.
The approximately 1 kbp DNA fragment amplified by the above PCR was ligated with pUC18 for cloning. Cloning was performed using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo). Hereinafter, unless otherwise noted, experiments were performed based on the instructions. After digesting 400 ng of the amplified DNA fragment of about 1 kb with BamHI and EcoRI, the DNA fragment was purified and ligated with pUC18 digested with BamHI and EcoRI. Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation reaction solution.
[0092]
Several strains of JM109 transformed with pUC18 containing the target DNA fragment of about 1 kbp were selected from the obtained transformants. The selection method is described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989).
[0093]
As described above, the XDH2 gene derived from Gluconobacter oxydans could be cloned. The plasmid having the target XDH2 gene fragment obtained by the above method is designated as pUCXDH2.
[0094]
(9) Determination of base sequence of XDH1 gene fragment
A method described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989), which comprises a plasmid carried by JM109 transformed with pUC19 containing a DNA fragment of about 1 kbp (XDH1) selected in (4). And the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined. The sequencing reaction was performed according to the instructions using a Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI). Electrophoresis was performed using DNA Sequencer 373 (ABI).
[0095]
As a result, it was found that the DNA fragment amplified by PCR had a sequence from the 52nd guanosine residue to the 1011th guanosine residue in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
[0096]
(10) Cloning of XDH1 gene from chromosomal DNA library
i) Preparation of chromosomal DNA library
1 μg of the chromosomal DNA prepared in (2) was completely digested with HindIII. DNA was recovered by ethanol precipitation and then dissolved in 10 μl of 10: 1 TE. 5 μl of this was mixed with 1 ng of pUC19 (Takara Shuzo) that had been digested with HindIII and dephosphorylated with BAP (bacterial alkaline phosphatase), and then used with DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) A ligation reaction was performed. 3 μl of this ligation reaction solution and 100 μl of Escherichia coli JM109 strain competent cell (Takara Shuzo) were mixed to transform Escherichia coli JM109 strain. This was applied to an appropriate solid medium to prepare a chromosomal DNA library.
[0097]
ii) Probe creation
A part of the XDH1 gene obtained in (3) was used as the probe. The approximately 1 kb DNA fragment amplified by the primer C2 and the primer XDH1-S2 obtained in (3) was separated by 1% agarose gel electrophoresis. The target band was cut out and DNA was purified using Gene Clean II Kit (Funakoshi). Finally, 16 μl of a 50 ng / μl DNA solution was obtained. This DNA fragment was labeled with digoxigenin as described in the instructions using DIG High Prime (manufactured by Boehringer Mannheim).
[0098]
iii) Screening by colony hybridization
In order to obtain the full length of the XDH1 gene, a chromosomal DNA library was screened by colony hybridization using the above probe. The operation of colony hybridization is described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989).
[0099]
The colonies of the chromosomal DNA library were transferred to a nylon membrane filter (Hybond-N, Amersham) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using EASY HYB (Boehringer Mannheim). The filter was immersed in the buffer (EASY HYB) and prehybridization was performed at 42 ° C. for 1 hour. Thereafter, the labeled probe prepared above was added, and hybridization was performed at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the filter was washed with 2 × SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 20 minutes. Further, washing was performed twice with 0.1 × SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 15 minutes.
[0100]
Colonies that hybridize with the probe were detected using the DIG Nucleotide Detection Kit (Boehringer Mannheim) according to the instructions. As a result, four colonies that hybridize with the probe were confirmed.
[0101]
(11) DNA sequence of XDH1 gene
The base sequence of the DNA fragment inserted into pUC19 was determined in the same manner as (5) above. The results are shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. The amino acid sequence that can be encoded by the base sequence based on the universal codon is shown together with SEQ ID NO: 3 and shown in SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence from the 2nd to the 28th amino acid sequence was completely identical to the 1st to 27th amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1. From this, it was confirmed that the DNA fragment obtained was the XDH1 gene derived from the target Gluconobacter bacterium and its peripheral region.
[0102]
[Example 4]
Expression and purification of XDH2 gene from Gluconobacter bacteria in Escherichia coli
<1> Cultivation and expression induction of E. coli containing recombinant XDH2 gene
In pUCXDH2 obtained in Example 3, the DNA encoding the XDH2 gene derived from Gluconobacter bacteria was connected downstream of the lacZ promoter and designed to be expressed from the lacZ promoter.
[0103]
E. coli JM109 transformed with pUCXDH2 and E. coli JM109 transformed with pUC18 as a control were cultured overnight at 37 ° C. in 50 ml of LB medium containing 100 μg / ml of ampicillin. This was used as seed culture. 1% of the seed culture of E. coli JM109 transformed with pUCXDH2 was inoculated into a flask containing a new medium. On the other hand, the seed culture of E. coli JM109 transformed with pUC18 was similarly inoculated into a flask at 1% to obtain experimental group 2 (control). Culture of each experimental group was carried out, and when the absorbance of light having a wavelength of 610 nm reached about 0.7, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM. Thereafter, the culture was terminated after 4 hours.
[0104]
<2> Confirmation of inducible protein expression
After completion of the culture, 10 ml of the culture solution was centrifuged (12,000 × g, 15 minutes), and the cells were collected. The cells were suspended in 2 ml of 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, and the cells were washed and collected by centrifugation. The cells were suspended in 1 ml of the same buffer, and then shaken and crushed with 0.1 mm zirconia beads for 3 minutes using a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Machine Co., Ltd.). This cell disruption suspension was subjected to SDS-PAGE and stained with CBB (Coomsey Brilliant Blue). As a result, a band having a molecular weight of about 27,000 to 30,000 observed only in the experimental group 1 (JM109 transformed with pUCXDH2) was confirmed. From this molecular weight, it was considered that the expected XDH2 protein was expressed.
[0105]
<3> Confirmation of XDH activity
The XDH activity of the expressed protein was measured. XDH activity was measured by the method described in Example 1 using the above-mentioned disrupted cell suspension. As a result, XDH activity was not detected in E. coli JM109 transformed with control pUC18, whereas 14 U / mg XDH activity was detected in E. coli JM109 transformed with pUCXDH2. From this result, XDH activity was confirmed in E. coli JM109 transformed with pUCXDH2.
[0106]
<4> Purification of XDH2 from recombinant E. coli JM109
E. coli JM109 transformed with pUCXDH2 cultured in <2> above was collected by centrifugation to obtain the cells. The bacterial cells thus obtained were used as a material for purifying XDH. XDH activity was measured by the method described in Example 1.
[0107]
(1) Preparation of bacterial cell extract
The cells were suspended in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7), centrifuged at 5000 × g for 10 minutes, and collected again in the precipitated fraction. The suspension and centrifugation operations were used to wash the cells. This washing of the cells was repeated twice.
[0108]
About 3 g of washed cells was added to 20 ml of Buffer 1 (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5 mM EDTA, 1 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT) and sonicated at 4 ° C. for 20 minutes. The disrupted solution was centrifuged (8000 rpm, 10 minutes) to remove the cell residue, and ultracentrifuged (56000 rpm, 30 minutes) to remove the insoluble fraction to obtain a soluble fraction.
[0109]
(2) Anion exchange chromatography
The obtained soluble fraction was applied to an anion exchange chromatography column Q-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrated with buffer 1. By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0110]
Next, the protein that had not been adsorbed on the carrier (non-adsorbed protein) was washed away using buffer solution 1, and then the adsorbed protein was eluted using a buffer solution containing KCl as an eluent. At this time, the KCl concentration in the buffer was linearly changed from 0M to 0.5M. When XDH activity was measured for each of the elution fractions obtained at this time, XDH activity was observed at the elution position where the KCl concentration was approximately 200 to 350 mM.
[0111]
(3) NAD affinity chromatography
Fractions containing XDH activity were collected and dialyzed against buffer 1. The solution after dialysis was filtered with a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to 5 ml of NAD affinity column HiTrap Blue equilibrated with Buffer 1 (Pharmacia). By this operation, XDH was adsorbed on the carrier. Next, after washing away the protein not adsorbed on the carrier (non-adsorbed protein) with the buffer 1, the buffer 2 containing NAD (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5 mM EDTA, 1 mM MgCl). ₂ , 1 mM DTT, 5 mM NAD) was used as an eluate to elute the protein adsorbed on the carrier. At this time, XDH was detected in the eluted fraction.
[0112]
(4) Hydrophobic chromatography
The solution in which the activity was detected was dialyzed against buffer 3 (50 mM potassium phosphate buffer solution, 1M ammonium sulfate, pH 7.0). The solution obtained after dialysis was filtered through a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to a hydrophobic chromatography column Phenyl Sepharose HP (Pharmacia) equilibrated with buffer 3. By this operation, XDH was adsorbed on the carrier.
[0113]
Next, the non-adsorbed protein that was not adsorbed on the carrier was washed away using buffer solution 3, and then the adsorbed protein was eluted using buffer solution 4 (50 mM potassium phosphate buffer solution, pH 7.0) as the eluent. Went. At this time, the ammonium sulfate concentration in the buffer was linearly changed from 1M to 0M. When XDH activity was measured for each of the elution fractions obtained at this time, XDH activity was observed at the elution position where the ammonium sulfate concentration was approximately 200 to 300 mM.
[0114]
The obtained active fraction was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue. As a result, it was confirmed that XDH2 was purified to a single band, and its molecular weight was about 27,000 to about 30,000. Estimated. That is, XDH2 expressed in E. coli JM109 could be purified to single.
[0115]
[Example 5]
Determination of the optimum pH of XDH
Using the XDH2 enzyme obtained in Example 4, the change in enzyme activity due to reaction pH was measured by the following method to determine the optimum pH.
[0116]
For the enzyme reaction buffer, use sodium acetate buffer (pH 3.3, 4, 4.5, 5 and 6), Tris-HCl (pH 7 and 8), Glycine-NaOH (pH 9), CAPS-NaOH (pH 10). It was. The reduction reaction of XDH activity was measured by the following method. 30 μl of enzyme solution was added to 570 μl of a reaction solution containing 100 mM (final concentration) D-xylulose, 0.2 mM NADH, and 100 mM buffer solution, and the enzyme reaction was performed at 30 ° C., and the decrease in NADH accompanying the reaction was measured with a spectrophotometer ( It was determined by measuring the absorbance at 340 nm using a DU 640 Spectrometer (manufactured by BECKMAN). The activity to decrease 1 μmol of NADH per minute was defined as 1U. The molecular absorption coefficient of NADH at 340 nm is ε = 6.3 × 10 ^Three Calculated as Each buffer was added to a concentration of 100 mM in the reaction solution. The above purified XDH fraction was used as the enzyme source, and the reaction was carried out at 30 ° C. The measurement result was shown in the form of the relative value of the enzyme activity with respect to the actual measured value of the pH of each reaction solution. For convenience, the activity of the oxidation reaction at pH 5 is defined as 100. The measurement results are shown in FIG.
[0117]
It was found that the optimum pH of the reduction reaction of XDH2 of the present invention (reaction for producing xylitol from D-xylulose) was about 5 (see FIG. 2). By the way, Corphb Witteveen et al. (Microbiology, 1994, 140, 1679-1685) Aspergillus niger-derived XDH has an optimum pH for the reduction reaction of strictly 6.5, so that the gluconobacter bacterium of the present invention The derived XDH2 is clearly different from the known XDH in its optimum pH. That is, it was shown that at least XDH2 among the XDH derived from Gluconobacter bacteria found in the present invention has a characteristic that the optimum pH for the reduction reaction is low.
[0118]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel xylitol dehydrogenase, DNA encoding the enzyme, and xylitol dehydrogenase can be produced using the DNA. In addition, xylitol can be produced using a cell into which the xylitol dehydrogenase or DNA encoding the enzyme has been introduced.
Furthermore, the DNA of the present invention can be used for breeding xylitol-producing bacteria.
[0119]
[Sequence Listing]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133]

[0134]

[0135]

[0136]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a polyacrylamide gel electrophoresis photograph of purified XDH. a) CBB-stained after SDS-PAGE. b) CBB-stained after Native-PAGE. c) Activity stained after Native-PAGE.
FIG. 2 is a graph showing the pH dependence of XDH2 enzyme activity.

Claims

The protein shown in the following (A) or (B).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(B) A protein comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having xylitol dehydrogenase activity in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.

The protein shown in the following (C) or (D).
(C) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(D) A protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having xylitol dehydrogenase activity in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing.

DNA encoding the protein shown in (A) or (B) below.
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(B) A protein comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having xylitol dehydrogenase activity in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.

DNA encoding the protein shown in (C) or (D) below.
(C) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and having xylitol dehydrogenase activity .
(D) A protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having xylitol dehydrogenase activity in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing.

The DNA according to claim 3, which is the DNA shown in (a) or (b) below.
(A) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 25 to 1053 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
(B) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least base numbers 25 to 1053 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and encodes a protein having xylitol dehydrogenase activity .

The DNA according to claim 4, which is the DNA shown in (c) or (d) below.
(C) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 1063 to 1848 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(D) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least base numbers 1063 to 1848 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and encodes a protein having xylitol dehydrogenase activity .

A cell into which the DNA according to any one of claims 3 to 6 is introduced in a form capable of expressing xylitol dehydrogenase encoded by the DNA.

A method for producing xylitol dehydrogenase, comprising culturing the cells according to claim 7 in a medium, causing xylitol dehydrogenase to be produced and accumulated in the culture, and collecting xylitol dehydrogenase from the culture.

A method for producing xylitol, which comprises reacting the xylitol dehydrogenase according to claim 1 or 2 with D-xylulose to collect the produced xylitol.

A method for producing xylitol, wherein the cell according to claim 7 is allowed to act on D-xylulose to collect the produced xylitol.