JP3967516B2

JP3967516B2 - DNA electrophoresis

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Publication number: JP3967516B2
Application number: JP2000054166A
Authority: JP
Inventors: 美香鈴木
Original assignee: Hymo Corp
Current assignee: Hymo Corp
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2020-02-29
Also published as: JP2001242139A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、生化学、医学の分野におけるＤＮＡの分離分析に利用されるＤＮＡの電気泳動法に関する。更に詳しくは、この発明は、保存安定性の良いポリアクリルアミドゲルを用いて分析精度の高いＤＮＡ分析法に適用することができると共に、電気泳動用プレキャストゲルの利用分野に広く応用することができるＤＮＡの電気泳動法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動法は主としてタンパク質の分析方法として発展してきたが、分子生物学が進展するに従ってＤＮＡやＲＮＡの分析調製が必要とされるようになってきた。ＤＮＡやＲＮＡのような核酸の分析には、アガロース電気泳動法及びポリアクリルアミドゲル電気泳動法が繁用されている。核酸は中性緩衝液中では強い陰性荷電を示し、その移動度は支持体としてのゲルの分子篩効果によるため、対象とする核酸の大きさにより０．３％〜２％程度のアガロースゲル又は３．５％〜２０％程度のポリアクリルアミドゲルが繁用されている。
【０００３】
アガロースゲルは、比較的大きな孔径を有しているため、高分子の核酸の分離分析を対象とする場合に用いられている。アガロースには、電気浸透の強弱、ゲル強度、融点等の性質の異なる多くの種類がある。また、アガロースは天然物であるため、同一会社の同一製品であってもロットによりしばしば性状に差が見られる。更に、アガロースゲル電気泳動法を調製に用いてＤＮＡを精製する場合、しばしばアガロース中の不純物が混入し、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等の酵素の活性を阻害する。このため、アガロースゲルを用いたＤＮＡの精製には、フェノール抽出などによる精製法を加味する必要がある。
【０００４】
一方、ポリアクリルアミドゲルは、比較的小さな孔径を有しているため、中分子〜低分子の核酸の分離分析を対象とする場合に用いられている。ポリアクリルアミドゲルは、合成品であるために化学的に高純度であり、アガロースゲルに見られるような性状の不均一の問題点はない。また、処方を変えることによって、分離特性の異なるポリアクリルアミドゲルを容易に調製することができる。そのため、様々な分離能を持つように量産されたプレキャストゲルを予め用意しておき、その中から適切なプレキャストゲルを選択して用いることにより、分析の手間を大幅に省くことができる。ポリアクリルアミドゲルは、均一で再現性の良いことから当該分野における生産及び品質管理に貢献するところが大である。量産されたポリアクリルアミドゲルを供給するに際しては、保存安定性が良好であることが期待される。
【０００５】
アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルと共にＤＮＡの電気泳動に使用する緩衝液は、主にｐＨ７．８〜８．３のエチレンジアミン四酢酸( 以下ＥＤＴＡと称す) 又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム( 以下ＥＴＡと称す) を含むトリス( ヒドロキシメチル) アミノメタン（以下トリスと称す）−酢酸緩衝液( 以下ＴＡＥと称す) 、トリス−硼酸緩衝液( 以下ＴＢＥと称す) 、又はトリス−リン酸緩衝液( 以下ＴＰＥと称す) であり、ゲル緩衝液と泳動用緩衝液の組成が等しい連続緩衝液系である。
【０００６】
一方、タンパク質の分離分析で汎用されている、オルンスタイン（Ｌ．Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，３２１−３４９（１９６４））とデービス( Ｂ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，４０４−４２７（１９６４）) によって提案された方法によって、ＤＮＡの分離分析を行うことも可能である。この方法は、ゲル緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液（オルンスタイン−デービスのゲル緩衝液）、泳動用緩衝液としてトリスーグリシン緩衝液( オルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液) を使用しており、ゲル緩衝液と泳動用緩衝液の組成の異なる不連続緩衝液系である。不連続緩衝液系は、連続緩衝液系に比べ少量の試料添加で良好な解像力をもたらすことが特徴である。
【０００７】
しかし、公知の電気泳動システムにおいては、通常、ポリアクリルアミドゲルの内包するゲル緩衝液のｐＨは７．８〜８．８であり、ポリアクリルアミド中のアミド基は経時的に加水分解反応を受ける。加水分解反応は、低温条件下でも進行して部分的にアニオン基を有するゲルを生る。その結果、ＤＮＡの泳動距離が短くなり、分離像が不鮮明になる。従って、ポリアクリルアミドゲルは、時間が経過するほど加水分解反応が進行するため、長期間に渡って保存して使用することが困難である。ポリアクリルアミドの加水分解を抑制するために、ゲル緩衝液中のトリス中和率を高めてｐＨを下げると、連続緩衝液系の場合、泳動時間が非常に長くなり分析の効率が低下する。不連続緩衝液系の場合、ゲル緩衝液中のトリスの中和率を高めると、泳動時間が長くなるだけでなく分離能も劣り、使用に耐えないものとなる。
【０００８】
ポリアクリルアミドゲルの安定性を改善する方法として、トリス、両性電解質及び酸から成るゲル緩衝液を内包した、長期保存安定性に優れ且つ測定可能な分子量範囲を著しく拡大したポリアクリルアミドゲルの製造方法が、特開平４−１８４１６３号公報に開示されている。この製造方法によって製造されたポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、オルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液又はレムリー( Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０（１９７０）) によって提案された泳動用緩衝液( レムリーの泳動用緩衝液) を使用して分析に供することができる。このポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、両性電解質を含有するｐＨ４．０〜７．５のゲル緩衝液を内包することを特徴とし、その実施例においてｐＨが６．９〜７．４のゲルの製造が例示され、冷蔵保存で４ヶ月はタンパク質の移動度に変化なく安定であるとされている。レムリーの泳動用緩衝液とは、トリス、グリシン及びドデシル硫酸ナトリウム( 以下ＳＤＳと称す) を含有する緩衝液である。このポリアクリルアミドゲルは、タンパク質の分離分析を対象としているが、オルンスタイン- デービスの泳動用緩衝液を使用してＤＮＡの分離分析も可能である。特開平４−１８４１６３号公報に実施例として記載されている条件で製造したゲルは、ＤＮＡの分離分析に使用するに当たり、移動度、染色状態の観点から見て、冷蔵保存で2 ヶ月間安定である。
【０００９】
しかし、量産されたポリアクリルアミドゲルを供給するに際しては、２ヶ月の保存有効期限では不十分である。そこで、特開平４−１８４１６３号公報に開示されている方法で製造したポリアクリルアミドゲルのゲル緩衝液のｐＨを６．５以下とし、ポリアクリルアミドゲルの加水分解を抑制して更に安定性の良い電気泳動ゲルでのＤＮＡの分析が必須となる。ところが、上記のｐＨが低いポリアクリルアミドゲルとオルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液でのＤＮＡ分析では鮮明な泳動像を得ることができなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの加水分解をある程度抑制し、核酸の分離分析に汎用されている泳動用緩衝液とを使用して、長期間に渡って保存可能な電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを用いてＤＮＡの鮮明な分離分析を可能にする点について解決すべき課題がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明の目的は、上記の課題を解決することであり、保存安定性に優れ、保管有効期限が長い電気泳動ポリアクリルアミドゲルと、核酸の分析方法として汎用されている泳動用緩衝液を使用して行い、予め様々な分離特性を持つようにプレキャストゲルを量産することを可能にし、泳動時間が長期化せず且つ鮮明な泳動像を得ることが可能なＤＮＡの電気泳動法を提供することである。
【００１２】
この発明は、上記の目的を達成するため、以下のように構成されている。即ち、この発明は、下記特徴をそれぞれ有するポリアクリルアミドプレキャストゲルと泳動用緩衝液とを用いたＤＮＡの電気泳動方法に関する。
１）前記ポリアクリルアミドプレキャストゲルに含まれるゲル緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシンを必須とした一種以上の両性電解質、及び一価の酸を含有し、ｐＨが６．０〜７．５の範囲に調整されている。
２）前記泳動用緩衝液は、トリス( ヒドロキシメチル) アミノメタン、キレート剤、並びに酢酸、燐酸及び硼酸のいずれか一つの酸を含有し、ｐＨが７．８〜８．３の範囲に調整されている。
【００１３】
このＤＮＡの電気泳動法において、ゲル緩衝液中にトリス、グリシンを含む一種又は二種以上の両性電解質及び一価の酸を含有し、ゲル緩衝液のｐＨが特定範囲である水溶液を用いて調製されたポリアクリルアミドゲルと、泳動用緩衝液中にトリス、キレート剤及び酸を含有し、泳動用緩衝液のｐＨが特定範囲である水溶液を用いており、ゲルｐＨが酸性領域に設定されるので、ポリアクリルアミドゲルの加水分解をある程度抑制することが可能であり、冷蔵保存で６ヶ月以上安定であるという保存安定性が良好な電気泳動ゲルとなる。単に、ゲルｐＨを低下させただけでは、泳動時間が長くなったり、泳動像が不鮮明になるので、グリシンを必須とした一種以上の両性電解質を含有することにより、泳動時間の短縮が図られ、泳動像が鮮明になる。また、予め様々な分離特性を持つプレキャストゲルを量産することができる。更に、核酸の電気泳動法として汎用されている泳動用緩衝液が使用される。
【００１４】
このＤＮＡの電気泳動方法において、前記ゲル緩衝液に含有される前記両性電解質は、塩基解離定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６である分子内にカチオン性基とアニオン性基を同数有するアミノ酸を含有している。また、前記ゲル緩衝液は、前記一価の酸として塩酸又は酢酸の少なくとも一つを含有し、長期保存安定性を目的としてｐＨが６．０〜６．５の範囲に調整されている。ゲル緩衝液のｐＨをこの範囲に設定することにより、一層の長期保存安定性が得られる。更にまた、このＤＮＡの電気泳動法において、前記泳動用緩衝液は、前記キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含有し、前記酸として硼酸を含有している。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この発明によるＤＮＡの電気泳動法は、次に述べる特徴をそれぞれ有するポリアクリルアミドプレキャストゲルと泳動用緩衝液とを用いることを特徴としている。ゲル緩衝液は、トリス、グリシンを含む一種又は二種以上の両性電解質及び一価の酸を含有しており、好ましくは、ゲル緩衝液は、トリス、グリシン、塩基解離定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６である分子内にカチオン性基とアニオン性基を同数有するアミノ酸及び一価の酸として塩酸及び酢酸を含有している。
【００１６】
グリシンを含む一種又は二種以上の両性電解質を含有していなければ、ゲル緩衝液のｐＨを酸性側に設定することでトリスの中和率が高まり、泳動ゲル中のトリス強酸部分とトリス弱酸部分の境界付近で電位勾配の変化が非常に大きくなる。このため、境界付近に分離対象が収斂しやすくなり、分画分子量範囲が非常に狭くなる。また、泳動時間が非常に長くなるため、作業効率上も好ましくない。
【００１７】
グリシンは、ゲル緩衝液のｐＨを下げても、泳動ゲル中のトリス強酸部分とトリス弱酸部分の境界付近における電位勾配の変化を緩やかにするので、ＴＢＥやオルンスタイン- デービスのゲル緩衝液を使用したゲルと同様の分画分子量範囲を持たせることができる。しかし、ゲル緩衝液のｐＨを酸性側にするほど、グリシン単独では電位勾配の変化を調節する力が十分でなくなる。そこで、ゲル緩衝液中に、グリシンと塩基解離定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６である分子内にカチオン性基とアニオン性基を同数有するアミノ酸を共存させることにより、より泳動ゲル中の電位勾配を緩やかにすることが可能となる。
【００１８】
グリシンと共存させるアミノ酸のｐＫｂの範囲は、８．３＜ｐＫｂ＜９．６であり、好ましくは９．０＜ｐＫｂ＜９．６である。アミノ酸のｐＫｂの範囲がｐＫｂ＜８．３である場合、ｐＫｂがトリスよりも低いことになるため、ゲル緩衝液のｐＨが変化し、また分画分子量範囲が大幅に広くなってしまう。ｐＫｂ＞９．６の場合、アミノ酸のｐＫｂがグリシンよりも高くなってしまうため、ゲル内の電位勾配の変化を緩やかにする作用に寄与しない。９．０＜ｐＫｂ＜９．６であるアミノ酸を使用すると、ｐＫｂの低いものから順に陽極側に移動し、泳動ゲル内の電位勾配は緩やかなものとなる。９．０＜ｐＫｂ＜９．６であるアミノ酸としては、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン等があるが、好ましくはセリンである。
【００１９】
更に、グリシンと共存させるアミノ酸は、分子内にアニオン性基とカチオン性基を同数有するものが望ましい。ｐＫｂよりやや低いｐＨでは、全てのアニオン性基と全てのカチオン性基とが解離して電気的に中性となり、ｐＫｂより高いｐＨでは、アニオン性基のみが解離しカチオン性基の解離が抑制されるため、負に帯電する。このため、上記アミノ酸は、実質的に一価の弱酸としての挙動を示し、疑似弱酸として使用することができる。予めゲル緩衝液中に疑似弱酸を添加しておくことにより、泳動ゲル中のトリス弱酸部分の電気抵抗値が低下し、更に強酸根の存在下ではｐＨが低いため、電気的に中性であり電気伝導に寄与しない。
【００２０】
また、ゲル緩衝液のｐＨは、６．０〜７．５、好ましくは６．０〜６．５である。ゲル緩衝液のｐＨが７．５より高い場合、ポリアクリルアミドゲルは経時的に加水分解を受け、プレキャストゲルとしての保管有効期限を長くもたせることができない。ゲル緩衝液のｐＨが６．０より低い場合、ポリアクリルアミドゲルとしての安定性は良好となるが、トリスの中和率が上がりすぎて緩衝液としての機能が損なわれる。ゲル緩衝液のｐＨは、プレキャストゲルに長期保存安定性を持たせるためアクリルアミド自体のｐＨに近づけることが望ましい。
【００２１】
また、泳動用緩衝液は、トリス、キレート剤と酢酸、燐酸及び硼酸のいずれか一つの酸を含有しており、含有する酸としては好ましくは硼酸である。ゲル緩衝液のｐＨを６．０〜６．５の範囲に設定した場合、オルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液を使用すると泳動像が不鮮明となり、ＤＮＡの分離分析を行うことができない。本発明で使用するＴＢＥの組成は、０．０８９２ｍｏｌ／ｌトリス、０．０８９０ｍｏｌ／ｌ硼酸、そして０．００２５ｍｏｌ／ｌＥＴＡであり、ｐＨは８．３であることが望ましい。上記組成の緩衝液は核酸の分離分析において広く使用されているＴＢＥであるため、作業者が効率よく分析を行うことができ、短時間で泳動が完了し、更に非常に鮮明な泳動像を得ることができる。ＴＡＥ又はＴＰＥを使用してもＤＮＡの分離分析は可能であるが、泳動時間がかかりＴＢＥに比べ分析効率が悪くなる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
横幅１２ｃｍ、縦１０ｃｍの長方形のガラス板と上部に凹状の切り込みの入った同寸法のガラス板の間に、厚さ1 ｍｍのスペーサを挟んでガラスプレートを組み立てる。アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（以下ＢＩＳと称す）濃度５％（％Ｃ）、並びに表１に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液に対し、過硫酸アンモニウム( 以下ＡＰＳと称す) ４００ｐｐｍ及びテトラメチルエチレンジアミン（以下ＴＥＭＥＤと称す）４００ｐｐｍを添加混合後、プレート内に注入し、常法で重合させ、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを得た。
【００２３】
このポリアクリルアミドゲルを用いて分子量既知の市販マーカーＤＮＡを電気泳動し、移動距離とバンドの鮮明さを確認した。マーカーＤＮＡは、３０％（ｗ／ｖ）ショ糖、着色する程度のブロムフェノールブルー（以下ＢＰＢと称す）を含んだ１０ｍｍｏｌ／ｌトリス、1 ｍｍｏｌ／ｌＥＴＡ、２０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液を塩酸でｐＨ７．９に調整した緩衝液で１００倍希釈して試験に使用した。泳動用緩衝液の組成は、０．０８９２ｍｏｌ／ｌトリス、０．０８９０ｍｏｌ／ｌ硼酸、２．５ｍｍｏｌ／ｌＥＴＡである。
【００２４】
電気泳動は２００Ｖ定電圧で行い、上部電極槽にＢＰＢで着色した電極液を入れた。ＢＰＢの泳動末端がスペーサの下端に来た時点で通電を中止した。染色には、銀染色法が用いられた。泳動後のゲルを５０％（ｖ／ｖ）メタノール、５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、３．５％（ｗ／ｖ）スルホサリチル酸水溶液中で２０分間浸透させてＤＮＡを固定し、その後、精製水で１５分間の水洗を２回行った。その後、８％炭酸ナトリウム水溶液と１％（ｗ／ｖ）けいタングステン酸、０．０２％（ｗ／ｖ）硝酸銀、０．０２％（ｗ／ｖ）硝酸アンモニウム、０．２８％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド水溶液を１：１の割合で混合させた液に浸透させ、染色した。７分後にバンドが出現したため染色液を捨て、１％（ｖ／ｖ）酢酸に１５分浸して停止させた。その結果、鮮明なＤＮＡのバンドが検出された。
【００２５】
ＢＰＢ泳動距離に対する各ＤＮＡフラグメントの泳動距離の相対位置を移動度（下記の式で定義される）として表２に記載する。
移動度（％）＝（ウェル下端から各バンドの位置までの距離）／（ウェル下端からＢＰＢの泳動末端までの距離）×１００
また、各ゲルの泳動時間を表３に記載する。
【表１】

【表２】

【表３】

【００２６】
表１、表２、表３に示したように、ゲル緩衝液のｐＨが６．３、６．８、７．５である各ポリアクリルアミドゲルをＴＢＥで泳動した場合、いずれも鮮明な泳動像が得られ、ＤＮＡフラグメントの移動度や、泳動時間もほぼ同じであった。
【００２７】
比較例１
実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに表４に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造した。このポリアクリルアミドゲルを用いて分子量既知の市販マーカーＤＮＡを電気泳動し、移動距離とバンドの鮮明さを確認した。泳動用緩衝液の組成は０．０２５ｍｏｌ／ｌトリス、０．１９２ｍｏｌ／ｌグリシンであるオルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液を使用した。ＢＰＢ泳動距離に対する各ＤＮＡフラグメントの泳動距離の比を移動度として表５に示す。また泳動時間を表６に示す。
【表４】

【表５】

【表６】

【００２８】
表４、表５及び表６に示したように、ゲル緩衝液のｐＨが６．３のポリアクリルアミドゲルをオルンスタイン- デービスの泳動用緩衝液を用いて泳動を行うと、ＤＮＡのバンドが不鮮明で検出不可能であった。そのため、本発明では、硼酸バッファ等が使用される。
【００２９】
実施例２
実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに表７に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造した。このポリアクリルアミドゲルを５℃下に保管し、一定期間ごとに取り出して、実施例１と同じＴＢＥを使用してＤＮＡの電気泳動を行った。電気泳動は２００Ｖ定電圧で行ない、５０分経過した時点で泳動を停止し、移動距離とバンドの鮮明さを確認した。その結果を表８、表９及び表１０に示す。
【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【００３０】
表８に示したようにゲル緩衝液のｐＨが７．５のポリアクリルアミドゲルは、５℃下でも経時的に加水分解を起こし、発生するアニオン基によってＤＮＡの移動速度も遅くなる。６ヶ月以上経過したものに、低分子のフラグメントが検出不可能となるものが現れた。また、表９に示したようにゲル緩衝液のｐＨが６．８であるポリアクリルアミドゲルは、ｐＨ７．５の時に比べて加水分解速度は低下するが、やはり５℃下で６ヶ月も経過すると、ＤＮＡの移動速度に大きな変化が見られた。それに比べて、表１０に示したように、ゲル緩衝液のｐＨが６．３であるポリアクリルアミドゲルは、５℃下で７ヶ月経過してもＤＮＡの移動度、泳動像に変化が見られず安定であった。
【００３１】
実施例３
実施例２で作成した電気泳動ゲルについて、５℃下で一定期間保存後、テンシロン万能試験機（株式会社オリエンテック、型式Ｕ−２１２９) でガラスプレートを上下に引っ張り、その引っ張り強度を測定した結果を表１１に示す。
【表１１】

【００３２】
表１１に示したように、ゲル緩衝液のｐＨを下げることで、ＤＮＡの移動度や泳動像のみならず、泳動ゲルの形状も安定に保つことができる。ポリアクリルアミドゲルは加水分解すると膨潤し易くなりガラスプレートがずれ易くなる。ゲル緩衝液のｐＨが７．５の泳動ゲル( 試料Ｅ) はガラスプレートをずらすのに必要な力( 引っ張り強度) が５℃下２ヶ月後に約１／３となった。それに対し，ゲル緩衝液のｐＨが６．８の泳動ゲル( 試料Ｆ) は、５℃下６ヶ月後まで製造直後と同等の引っ張り強度を示していた。それに対し、ゲル緩衝液のｐＨが６．３の泳動ゲル( 試料Ｇ) は、５℃下で１２ヶ月後も製造直後と同等の引っ張り強度を示していた。ゲル緩衝液のｐＨが６．３の場合、アクリルアミド自体のｐＨに近いためｐＨ６．８の時に比べて著しく加水分解速度が減少する。その結果、５℃下で１年もの長期間泳動ゲルの形状が安定に保たれる。
【００３３】
比較例２
実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに表１２に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造した。製造した電気泳動ゲルについて、５℃下で一定期間保存後、テンシロン万能試験機でガラスプレートを上下に引っ張り、その引っ張り強度を測定した結果を表１３に示す。
【表１２】

【表１３】

【００３４】
表１２に示したように、ゲル緩衝液のｐＨが８．８である泳動ゲルは、５℃下で１ケ月経過すると、ガラスプレートをずらすのに必要な力が製造直後に比べて１／２以下となった。ゲル緩衝液のｐＨが高いと泳動ゲルの形状も安定に保つことができなかった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によるＤＮＡの電気泳動法は、長期保存安定性を持つ電気泳動ポリアクリルアミドゲルと核酸の電気泳動に汎用されている泳動用緩衝液を使用してＤＮＡの鮮明な分離分析を行う方法に関するものである。ゲルｐＨを酸性〜中性領域に設定すればポリアクリルアミドゲルの加水分解をある程度抑制することが可能であり、保存安定性が良好な電気泳動ゲルとなる。従って、保管有効期限を長く設定することが可能となり、プレキャストゲルとして予め様々な分離特性を持つように量産し、広範囲に供給することが可能となる。このような電気泳動ポリアクリルアミドゲルと、核酸の電気泳動法として公知であるＴＢＥを使用してＤＮＡの鮮明な分離分析が可能であることから使用者が経済的かつ効率的に分析を遂行することができる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a DNA electrophoresis method used for separation and analysis of DNA in the fields of biochemistry and medicine. More specifically, the present invention can be applied to a DNA analysis method with high analytical accuracy using a polyacrylamide gel having good storage stability and can be widely applied to the field of application of precast gel for electrophoresis. The electrophoresis method is provided.
[0002]
[Prior art]
Electrophoresis has been developed mainly as a protein analysis method, but analysis and preparation of DNA and RNA have come to be required as molecular biology progresses. For analysis of nucleic acids such as DNA and RNA, agarose electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis are frequently used. Nucleic acids are strongly negatively charged in a neutral buffer, and their mobility is due to the molecular sieve effect of the gel as a support. Therefore, depending on the size of the target nucleic acid, about 0.3% to 2% agarose gel or 3 A polyacrylamide gel of about 5% to 20% is frequently used.
[0003]
Since agarose gel has a relatively large pore size, it is used for separation and analysis of high molecular nucleic acids. There are many types of agarose having different properties such as electroosmotic strength, gel strength, and melting point. Moreover, since agarose is a natural product, even in the same product of the same company, there are often differences in properties depending on the lot. Furthermore, when DNA is purified by using agarose gel electrophoresis for preparation, impurities in agarose are often mixed and inhibit the activities of enzymes such as restriction enzymes, DNA polymerases and DNA ligases. For this reason, purification of DNA using an agarose gel needs to take into account a purification method such as phenol extraction.
[0004]
On the other hand, since polyacrylamide gel has a relatively small pore size, it is used for separation and analysis of medium to low molecular nucleic acids. Since polyacrylamide gel is a synthetic product, it is chemically highly pure, and there is no problem of non-uniform properties as seen in agarose gel. Moreover, polyacrylamide gels having different separation characteristics can be easily prepared by changing the formulation. Therefore, by preparing precast gels that have been mass-produced so as to have various resolutions and selecting and using appropriate precast gels, it is possible to greatly reduce the labor of analysis. Since polyacrylamide gel is uniform and reproducible, it greatly contributes to production and quality control in this field. When supplying the mass-produced polyacrylamide gel, it is expected that the storage stability is good.
[0005]
Buffers used for DNA electrophoresis together with agarose gel and polyacrylamide gel are mainly composed of ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as EDTA) or disodium ethylenediaminetetraacetate (hereinafter referred to as ETA) having a pH of 7.8 to 8.3. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (hereinafter referred to as Tris) -acetic acid buffer (hereinafter referred to as TAE), Tris-borate buffer (hereinafter referred to as TBE), or Tris-phosphate buffer (hereinafter referred to as TPE) And is a continuous buffer system in which the composition of the gel buffer and the electrophoresis buffer is the same.
[0006]
On the other hand, Ornstein (L. Orstein, Ann. NY Acad. Sci. 121, 321-349 (1964)) and Davis (B. J. Davis, Ann. N), which are widely used in protein separation analysis. Y. Acad. Sci. 121, 404-427 (1964)), it is also possible to perform DNA separation analysis. This method uses Tris-HCl buffer (Ornstein-Davis gel buffer) as the gel buffer and Tris-Glycine buffer (Ornstein-Davis electrophoresis buffer) as the electrophoresis buffer, This is a discontinuous buffer system in which the composition of the gel buffer and the buffer for electrophoresis is different. The discontinuous buffer system is characterized in that it provides good resolution with the addition of a small amount of sample compared to the continuous buffer system.
[0007]
However, in a known electrophoresis system, the pH of the gel buffer contained in the polyacrylamide gel is usually 7.8 to 8.8, and the amide group in the polyacrylamide undergoes a hydrolysis reaction over time. The hydrolysis reaction proceeds even under low temperature conditions to produce a gel partially having an anionic group. As a result, the migration distance of DNA becomes short and the separated image becomes unclear. Accordingly, since the hydrolysis reaction proceeds with time, the polyacrylamide gel is difficult to store and use for a long period of time. In order to suppress hydrolysis of polyacrylamide, if the Tris neutralization rate in the gel buffer is increased and the pH is lowered, in the case of a continuous buffer system, the migration time becomes very long and the efficiency of the analysis decreases. In the case of a discontinuous buffer system, if the neutralization rate of Tris in the gel buffer solution is increased, not only the migration time is lengthened but also the resolution is inferior, and it cannot be used.
[0008]
As a method for improving the stability of a polyacrylamide gel, there is a method for producing a polyacrylamide gel which contains a gel buffer solution composed of tris, ampholyte and acid and has an excellent long-term storage stability and a greatly expanded molecular weight range. JP-A-4-184163. The polyacrylamide electrophoresis gel produced by this production method is an electrophoresis buffer (Remley) proposed by Ornstein-Davis electrophoresis buffer or Remley (UK Laemmli, Nature 227,680 (1970)). For use in the analysis. This polyacrylamide electrophoresis gel is characterized in that it contains a gel buffer solution having a pH of 4.0 to 7.5 and containing an ampholyte. In this example, a gel having a pH of 6.9 to 7.4 can be produced. It is exemplified that the protein mobility is stable with no change in the protein mobility for 4 months. The Remley electrophoresis buffer is a buffer containing Tris, glycine and sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS). Although this polyacrylamide gel is intended for protein separation analysis, DNA separation analysis can also be performed using an Ornstein-Davis electrophoresis buffer. Gels produced under the conditions described in Examples in JP-A-4-184163 are stable for 2 months in refrigerated storage from the viewpoint of mobility and staining state when used for DNA separation analysis. is there.
[0009]
However, when supplying a mass-produced polyacrylamide gel, the shelf life of 2 months is not sufficient. Therefore, the pH of the gel buffer of the polyacrylamide gel produced by the method disclosed in JP-A-4-184163 is set to 6.5 or less, and hydrolysis of the polyacrylamide gel is suppressed to further improve the stability of the electricity. Analysis of DNA on an electrophoresis gel is essential. However, a clear electrophoretic image could not be obtained by DNA analysis using the polyacrylamide gel having a low pH and the Ornstein-Davis electrophoresis buffer.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an electrophoresis polyacrylamide gel that can be stored for a long period of time by using a electrophoresis buffer that is widely used for separation and analysis of nucleic acids while suppressing hydrolysis of the polyacrylamide gel for electrophoresis to some extent. There is a problem to be solved in terms of using it to enable clear separation analysis of DNA.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, using an electrophoretic polyacrylamide gel having excellent storage stability and a long storage expiration date, and an electrophoresis buffer that is widely used as a nucleic acid analysis method. It is possible to mass-produce precast gels with various separation characteristics in advance, and to provide a DNA electrophoresis method that can obtain a clear migration image without prolonging the migration time. is there.
[0012]
In order to achieve the above object, the present invention is configured as follows. That is, the present invention relates to a DNA electrophoresis method using a polyacrylamide precast gel having the following characteristics and a migration buffer.
1) The gel buffer solution contained in the polyacrylamide precast gel contains tris (hydroxymethyl) aminomethane, one or more ampholytes essentially containing glycine, and a monovalent acid, and has a pH of 6.0 to 7 .5 has been adjusted.
2) The electrophoresis buffer contains tris (hydroxymethyl) aminomethane, a chelating agent, and any one of acetic acid, phosphoric acid and boric acid, and the pH is adjusted to a range of 7.8 to 8.3. ing.
[0013]
In this DNA electrophoresis method, the gel buffer contains an aqueous solution containing one or more amphoteric electrolytes containing tris and glycine and a monovalent acid, and the pH of the gel buffer is in a specific range. Since the polyacrylamide gel used is an aqueous solution containing Tris, a chelating agent and an acid in the electrophoresis buffer, and the pH of the electrophoresis buffer is in a specific range, the gel pH is set in the acidic region. It is possible to suppress the hydrolysis of the polyacrylamide gel to some extent, and it becomes an electrophoresis gel with good storage stability that is stable for 6 months or more in refrigerated storage. By simply lowering the gel pH, the migration time becomes longer or the migration image becomes unclear, so the inclusion of one or more ampholytes with glycine as an essential component shortens the migration time. The electrophoretic image becomes clear. In addition, precast gels having various separation characteristics can be mass-produced in advance. Furthermore, an electrophoresis buffer that is widely used as a method for electrophoresis of nucleic acids is used.
[0014]
In this DNA electrophoresis method, the ampholyte contained in the gel buffer contains the same number of cationic groups and anionic groups in the molecule having a base dissociation constant range of 8.3 <pKb <9.6. Contains amino acids. The gel buffer contains at least one of hydrochloric acid and acetic acid as the monovalent acid, and the pH is adjusted in the range of 6.0 to 6.5 for the purpose of long-term storage stability. By setting the pH of the gel buffer within this range, further long-term storage stability can be obtained. Furthermore, in this DNA electrophoresis method, the electrophoresis buffer contains ethylenediaminetetraacetic acid disodium as the chelating agent and boric acid as the acid.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The DNA electrophoresis method according to the present invention is characterized by using a polyacrylamide precast gel having the following characteristics and a buffer for electrophoresis. The gel buffer contains one or more ampholytes including tris and glycine, and a monovalent acid. Preferably, the gel buffer has a tris, glycine, and base dissociation constant range of 8.3. <PKb <9.6 contains an amino acid having the same number of cationic groups and anionic groups in the molecule, and hydrochloric acid and acetic acid as monovalent acids.
[0016]
If one or more amphoteric electrolytes containing glycine are not included, setting the pH of the gel buffer to the acidic side increases the tris neutralization rate, and the tris strong acid portion and tris weak acid portion in the electrophoresis gel In the vicinity of the boundary, the change in the potential gradient becomes very large. For this reason, it becomes easy for the separation object to converge near the boundary and the molecular weight range is very narrow. Further, since the migration time becomes very long, it is not preferable in terms of work efficiency.
[0017]
Glycine moderates the change in potential gradient in the vicinity of the boundary between the tris strong acid portion and the tris weak acid portion in the electrophoresis gel even when the pH of the gel buffer is lowered, so the gel buffer of TBE or Ornstein-Davies is used. The same molecular weight range as that of the prepared gel can be obtained. However, the more acidic the pH of the gel buffer, the more insufficient the ability to adjust the potential gradient change with glycine alone. Therefore, in the gel buffer, the glycine and the amino acid having the same number of cationic groups and anionic groups in the molecule having a base dissociation constant range of 8.3 <pKb <9.6 can coexist. It becomes possible to moderate the potential gradient inside.
[0018]
The pKb range of the amino acid coexisting with glycine is 8.3 <pKb <9.6, and preferably 9.0 <pKb <9.6. When the pKb range of the amino acid is pKb <8.3, the pKb is lower than that of Tris, so that the pH of the gel buffer is changed and the fractional molecular weight range is greatly widened. When pKb> 9.6, the pKb of the amino acid is higher than that of glycine, so that it does not contribute to the action of slowing the change in potential gradient in the gel. When an amino acid with 9.0 <pKb <9.6 is used, the amino acid moves toward the anode in order from the lowest pKb, and the potential gradient in the electrophoresis gel becomes gentle. Examples of amino acids satisfying 9.0 <pKb <9.6 include serine, tryptophan, and phenylalanine, with serine being preferred.
[0019]
Furthermore, the amino acid that coexists with glycine preferably has the same number of anionic groups and cationic groups in the molecule. At pH slightly lower than pKb, all anionic groups and all cationic groups are dissociated and become electrically neutral, and at pH higher than pKb, only anionic groups are dissociated and the dissociation of cationic groups is suppressed. Therefore, it is negatively charged. For this reason, the said amino acid shows the behavior as a monovalent | monohydric weak acid substantially, and can be used as a pseudo weak acid. By adding a pseudo weak acid in the gel buffer in advance, the electrical resistance value of the tris weak acid portion in the electrophoresis gel is lowered, and since the pH is low in the presence of a strong acid radical, it is electrically neutral. Does not contribute to electrical conduction.
[0020]
The pH of the gel buffer is 6.0 to 7.5, preferably 6.0 to 6.5. If the pH of the gel buffer is higher than 7.5, the polyacrylamide gel undergoes hydrolysis over time, and the shelf life of the precast gel cannot be extended. When the pH of the gel buffer is lower than 6.0, the stability as a polyacrylamide gel is good, but the neutralization rate of Tris is excessively increased and the function as a buffer is impaired. The pH of the gel buffer is preferably close to the pH of acrylamide itself so that the precast gel has long-term storage stability.
[0021]
The electrophoresis buffer contains Tris, a chelating agent, and any one of acetic acid, phosphoric acid and boric acid, and the acid contained therein is preferably boric acid. When the pH of the gel buffer is set in the range of 6.0 to 6.5, if an Ornstein-Davis electrophoresis buffer is used, the migration image becomes unclear and DNA separation analysis cannot be performed. The composition of TBE used in the present invention is 0.0892 mol / l Tris, 0.0890 mol / l boric acid, and 0.0025 mol / l ETA, and the pH is preferably 8.3. Since the buffer solution having the above composition is TBE widely used in nucleic acid separation analysis, the operator can perform the analysis efficiently, complete the electrophoresis in a short time, and obtain a very clear electrophoresis image. be able to. Even if TAE or TPE is used, DNA can be separated and analyzed. However, it takes much time for electrophoresis and the analysis efficiency is worse than TBE.
[0022]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these Examples.
Example 1
A glass plate is assembled by sandwiching a 1 mm thick spacer between a rectangular glass plate having a width of 12 cm and a length of 10 cm and a glass plate of the same size with a concave cut at the top. For a monomer solution comprising an acrylamide concentration of 10% (% T), an N, N′-methylenebisacrylamide (hereinafter referred to as BIS) concentration of 5% (% C), and a buffer solution composition having the concentrations shown in Table 1, After adding 400 ppm of ammonium sulfate (hereinafter referred to as APS) and 400 ppm of tetramethylethylenediamine (hereinafter referred to as TEMED), the mixture was poured into a plate and polymerized by a conventional method to obtain a polyacrylamide gel for electrophoresis.
[0023]
Using this polyacrylamide gel, a commercially available marker DNA having a known molecular weight was electrophoresed to confirm the distance of movement and the sharpness of the band. The marker DNA is a 10 mMol / l Tris, 1 mMol / lETA, 20 mMol / l sodium chloride solution containing 30% (w / v) sucrose and a colorable bromophenol blue (hereinafter referred to as BPB). The solution was diluted 100 times with a buffer adjusted to pH 7.9 with hydrochloric acid and used for the test. The composition of the running buffer is 0.0892 mol / l Tris, 0.0890 mol / l boric acid, 2.5 mmol / l ETA.
[0024]
Electrophoresis was performed at a constant voltage of 200 V, and an electrode solution colored with BPB was placed in the upper electrode tank. The energization was stopped when the BPB migration terminal reached the lower end of the spacer. A silver staining method was used for the staining. The gel after electrophoresis was allowed to permeate in 50% (v / v) methanol, 5% (w / v) trichloroacetic acid, 3.5% (w / v) sulfosalicylic acid aqueous solution for 20 minutes, and then DNA was fixed. Washing with purified water for 15 minutes was performed twice. Then, 8% aqueous sodium carbonate solution and 1% (w / v) silicotungstic acid, 0.02% (w / v) silver nitrate, 0.02% (w / v) ammonium nitrate, 0.28% (v / v) The solution was mixed with a 1: 1 mixture of formaldehyde aqueous solution and dyed. Since a band appeared after 7 minutes, the staining solution was discarded and stopped by immersing in 1% (v / v) acetic acid for 15 minutes. As a result, a clear DNA band was detected.
[0025]
The relative position of the migration distance of each DNA fragment with respect to the BPB migration distance is shown in Table 2 as mobility (defined by the following formula).
Mobility (%) = (Distance from bottom of well to each band position) / (Distance from bottom of well to migration end of BPB) × 100
In addition, Table 3 shows the migration time of each gel.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[0026]
As shown in Table 1, Table 2, and Table 3, when each polyacrylamide gel whose gel buffer has a pH of 6.3, 6.8, and 7.5 was electrophoresed with TBE, all of them had a clear electrophoretic image. The mobility of the DNA fragment and the migration time were almost the same.
[0027]
Comparative Example 1
Using a glass plate similar to that in Example 1, an acrylamide concentration of 10% (% T), a BIS concentration of 5% (% C), and a monomer solution having a buffer composition with the concentrations shown in Table 4, Similarly, polyacrylamide gel for electrophoresis was produced. Using this polyacrylamide gel, a commercially available marker DNA having a known molecular weight was electrophoresed to confirm the distance of movement and the sharpness of the band. The composition of the electrophoresis buffer was 0.025 mol / l Tris and 0.192 mol / l glycine. The ratio of the migration distance of each DNA fragment to the BPB migration distance is shown in Table 5 as the mobility. Table 6 shows the migration time.
[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[0028]
As shown in Table 4, Table 5 and Table 6, when polyacrylamide gel with gel buffer pH of 6.3 was run using Ornstein-Davis electrophoresis buffer, DNA bands were unclear It was impossible to detect. Therefore, a boric acid buffer or the like is used in the present invention.
[0029]
Example 2
Using a glass plate similar to that in Example 1, an acrylamide concentration of 10% (% T), a BIS concentration of 5% (% C), and a monomer solution having a buffer composition with the concentrations shown in Table 7, Similarly, polyacrylamide gel for electrophoresis was produced. This polyacrylamide gel was stored at 5 ° C., taken out at regular intervals, and subjected to DNA electrophoresis using the same TBE as in Example 1. Electrophoresis was performed at a constant voltage of 200 V, and when 50 minutes had elapsed, the electrophoresis was stopped and the moving distance and the clearness of the band were confirmed. The results are shown in Table 8, Table 9, and Table 10.
[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[0030]
As shown in Table 8, the polyacrylamide gel whose gel buffer solution has a pH of 7.5 undergoes hydrolysis over time even at 5 ° C., and the rate of DNA movement is also slowed by the generated anionic groups. The thing which became unable to detect the fragment of a low molecule appeared in what passed 6 months or more. Also, as shown in Table 9, the hydrolysis rate of the polyacrylamide gel having a gel buffer pH of 6.8 is lower than that at pH 7.5, but after 6 months at 5 ° C. A large change was observed in the movement speed of DNA. In contrast, as shown in Table 10, the polyacrylamide gel whose gel buffer pH is 6.3 shows changes in DNA mobility and electrophoretic image even after 7 months at 5 ° C. It was stable.
[0031]
Example 3
About the electrophoresis gel created in Example 2, after storing for a certain period of time at 5 ° C., the glass plate was pulled up and down with a Tensilon universal testing machine (Orientec Co., Ltd., model U-2129), and the tensile strength was measured. Is shown in Table 11.
[Table 11]

[0032]
As shown in Table 11, by lowering the pH of the gel buffer, not only the mobility and migration image of DNA but also the shape of the migration gel can be kept stable. When polyacrylamide gel is hydrolyzed, it easily swells and the glass plate is easily displaced. The electrophoresis gel (sample E) having a gel buffer pH of 7.5 had a force (tensile strength) required to shift the glass plate of about 1/3 after 2 months at 5 ° C. On the other hand, the electrophoresis gel (sample F) having a pH of 6.8 in the gel buffer solution showed a tensile strength equivalent to that immediately after production until 6 months at 5 ° C. On the other hand, the electrophoresis gel (sample G) having a pH of 6.3 in the gel buffer solution showed a tensile strength equivalent to that immediately after production even after 12 months at 5 ° C. When the pH of the gel buffer is 6.3, the hydrolysis rate is remarkably reduced compared to the pH of 6.8 because it is close to the pH of acrylamide itself. As a result, the shape of the electrophoresis gel is kept stable for a long period of time at 5 ° C. for one year.
[0033]
Comparative Example 2
Using a glass plate similar to that in Example 1, an acrylamide concentration of 10% (% T), a BIS concentration of 5% (% C), and a monomer solution having a buffer composition with the concentrations shown in Table 12, Similarly, polyacrylamide gel for electrophoresis was produced. Table 13 shows the results of measuring the tensile strength of the produced electrophoresis gel after it was stored at 5 ° C. for a certain period of time and the glass plate was pulled up and down with a Tensilon universal testing machine.
[Table 12]

[Table 13]

[0034]
As shown in Table 12, in the electrophoresis gel having a gel buffer pH of 8.8, when one month has passed at 5 ° C., the force required to shift the glass plate is ½ that immediately after production. It became the following. When the pH of the gel buffer was high, the shape of the electrophoresis gel could not be kept stable.
[0035]
【The invention's effect】
The DNA electrophoresis method according to the present invention relates to a method for performing clear separation analysis of DNA using an electrophoresis polyacrylamide gel having long-term storage stability and a buffer for electrophoresis generally used for electrophoresis of nucleic acids. It is. If the gel pH is set in the acidic to neutral range, hydrolysis of the polyacrylamide gel can be suppressed to some extent, and the electrophoresis gel has good storage stability. Therefore, it is possible to set a long storage expiration date, and it is possible to mass-produce and have a wide range of separation properties as a precast gel in advance. Using this electrophoresis polyacrylamide gel and TBE, which is well-known as a method for electrophoresis of nucleic acids, enables DNA to be clearly separated and analyzed, so that users can perform analysis economically and efficiently. Can do.

Claims

A DNA electrophoresis method using a polyacrylamide precast gel having the following characteristics and a buffer for electrophoresis.
1) The gel buffer solution contained in the polyacrylamide precast gel contains tris (hydroxymethyl) aminomethane, one or more ampholytes essentially containing glycine, and a monovalent acid, and has a pH of 6.0 to 7 .5 has been adjusted.
2) The electrophoresis buffer contains tris (hydroxymethyl) aminomethane, a chelating agent, and any one of acetic acid, phosphoric acid and boric acid, and the pH is adjusted to a range of 7.8 to 8.3. ing.

The ampholyte contained in the gel buffer contains amino acids having the same number of cationic groups and anionic groups in the molecule having a base dissociation constant in the range of 8.3 <pKb <9.6. The DNA electrophoresis method according to claim 1, comprising:

The gel buffer contains at least one of hydrochloric acid and acetic acid as the monovalent acid, and has a pH adjusted to a range of 6.0 to 6.5 for long-term storage stability. Item 2. The method for electrophoresis of DNA according to Item 1.

The DNA electrophoresis method according to any one of claims 1 to 3, wherein the electrophoresis buffer contains disodium ethylenediaminetetraacetate as the chelating agent and boric acid as the acid.