JP3966220B2

JP3966220B2 - Protein crystal observation device

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Publication number: JP3966220B2
Application number: JP2003124084A
Authority: JP
Inventors: 逸郎茂木; 浩文松▲崎▼; 秀吉北原; 満早塚本; 浩二下河; 正貴馬郡
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: JP2004323336A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年遺伝子情報を医療などの分野に有効に利用するための取り組みが活発化しており、その基礎技術として遺伝子を構成する蛋白質の構造を解析する努力が行われている。この蛋白質の構造解析は、蛋白質を構成するアミノ酸が３次元の線状に連なった立体構造を特定するものであり、Ｘ線結晶構造解析などの方法によって行われる。
【０００３】
このような蛋白質の構造解析を行うためには、まず解析対象の蛋白質を結晶化することが求められ、この蛋白質結晶化の方法として蒸気拡散法が知られている。この方法では、結晶化対象の蛋白質を含む蛋白質溶液から蒸発する溶媒成分を同一容器内に収容された結晶化溶液によって吸収させることにより、蛋白質溶液を過飽和状態に保って結晶を徐々に生成させる。従来より、この蒸気拡散法を用いて蛋白質の結晶化を行うための専用の容器や装置が提案されている（例えば特許文献１，２参照）。
【０００４】
しかしながら、現状では結晶化を促進させるための結晶生育条件を理論的に特定することができず、各種の条件を変えながら多数の試験を系統的に実行した結果から最良の条件を求めるスクリーニングの手法を用いざるを得ない。このため、従来より対象となる蛋白質溶液を各種の結晶生育条件、すなわち前述の結晶化溶液の種類・濃度や生育温度を変化させた幾通りもの条件下で、試験を反復実行する必要があった。
【０００５】
このような試験は、蛋白質溶液および結晶化溶液を収容した結晶化用のマイクロプレートなどの結晶化容器を特定温度に設定された恒温室内に保管し、結晶化の有無や進行度合いを時間経過に伴って観察することによって行われていた。そして蛋白質結晶検出のための観察作業は従来は専ら人手に依存しており、試験担当者が恒温室から結晶化容器を取り出して顕微鏡視野内で蛋白質溶液を目視観察することによって、結晶化の進行状況をデータ化し記録する作業を行っていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−２３３７０２号公報
【特許文献２】
特開２００２−１７９５００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところがこのような観察作業は、本来多大の手間と時間を要する煩瑣な作業であり、実験担当者に過大の作業負荷を強いるとともに、恒温室から結晶化プレートを観察の都度取り出すことに起因して、次のような課題があった。まず、恒温室から常温雰囲気中に取り出した結晶化プレートは大気中の水分によって結露し易く、この結露によって顕微鏡観察時の明瞭な視野が妨げられ、観察を不正確なものとしていた。この結露による問題は、レーザ光を照射し、その拡散状況で結晶化の判断をするような場合にも生じてしまう。
【０００８】
また結晶化プレートを恒温室から取り出すと、結晶化プレートの温度が変化し当初設定された結晶生育条件が正しく守られない。そしてこのような条件変動が反復して発生すると、結晶化条件を見い出すための試験結果そのものの信頼度を損なうこととなる。このように、従来の蛋白質結晶観察においては、観察作業を効率よく高い信頼性で行うことが困難であるという問題点があった。
【０００９】
そこで本発明は、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる蛋白質結晶観察装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の蛋白質結晶観察装置は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、複数の前記結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに撮り込むカメラと、結晶化容器を前記ストレージ部と前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、観察ステージ、カメラおよび搬送手段を前記恒温室内に配置した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の蛋白質結晶観察装置は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、この恒温室に搬入口開閉機構によって開閉自在に設けられ、結晶化容器を恒温室内に搬入する搬入口と、複数の収納部に前記結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察してその画像データを撮り込むカメラと、前記搬入口から搬入された結晶化容器を前記ストレージ部の指定された収納部に収納し、また結晶化容器を前記ストレージ部と前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、観察ステージ、カメラおよび搬送手段を前記恒温室内に配置した。
【００１２】
請求項２記載の蛋白質結晶観察装置は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液から蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、この恒温室に搬入口開閉機構によって開閉自在に設けられ、結晶化容器を恒温室内に搬入する搬入口と、複数の収納部に前記結晶化容器を収容するストレージ部と、前記結晶化容器の蛋白質溶液内で生成した蛋白質の結晶を検出する蛋白質結晶検出手段と、前記搬入口から搬入された結晶化容器を前記ストレージ部の指定された収納部に収納し、また結晶化容器を前記ストレージ部と前記蛋白質結晶検出手段との間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、前記蛋白質結晶検出手段および前記搬送手段を前記恒温室内に配置した。
【００１３】
請求項４記載の蛋白質結晶観察装置は、請求項２記載の蛋白質結晶観察装置であって、前記蛋白質結晶検出手段が、結晶化容器の蛋白質溶液に光線を照射する照射手段と、照射された光線の拡散状況を検出して蛋白質溶液内の結晶の生成状態を判断する結晶化判断部を備えた。
【００１４】
本発明によれば、複数の結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに撮り込むカメラと、結晶化容器をストレージと前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを恒温室内に配置することにより、経時的な観察作業において結晶化容器を恒温室外に取り出すことなく観察作業を行うことができ、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の斜視図、図２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の透視斜視図、図３は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の断面図、図４は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの斜視図、図５，図７は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図、図６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の観察部の部分断面図、図８は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図、図９は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の蛋白質結晶検出処理機能を示す機能ブロック図、図１０は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置における観察動作のフロー図、図１１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図，図１２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図、図１３は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における観察画像を示す図、図１４は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像を示す図，図１５は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（マスク処理）を示す図，図１６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における細線化画像を示す図，図１７は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（ノイズ除去）を示す図、図１８は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における二値化画像を示す図、図１９は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法におけるノイズ認識処理の説明図、図２０は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図である。
【００１６】
まず図１、図２，図３を参照して、蛋白質結晶観察装置の全体構造を説明する。蛋白質結晶観察装置１は、蒸気拡散法により蛋白質溶液内で生成した蛋白質結晶を検出するための観察に使用される専用の観察装置である。
【００１７】
図１、図２において、蛋白質結晶観察装置１は、箱形状の恒温室２内にストレージ部５、搬送ユニット７および観察部９を配置した構成となっている。恒温室２は内部雰囲気を設定温度に保持する温調機能を備えており、図１に示すように、恒温室２の前面には、内部アクセス用の扉３ａ、前面からの操作・点検用の小扉３ｂおよび内部点検用の窓２ｂ、表示部と操作・入力部とが一体となった制御パネル４が配設されている。そして、恒温室２の側面には観察対象を内部へ搬入するための搬入口２ａが設けられている。搬入口２ａは、搬入口開閉機構（図示省略）によって開閉自在となっている。
【００１８】
次に図２，図３を参照して、恒温室２の内部構造を説明する。恒温室２の内部には、奥側壁面に沿って縦型棚形状のストレージ部５が配置されている。ストレージ部５は棚状に仕切られた複数の収納部５ａを備えており、収納部５ａには結晶化用のマイクロプレート６（以下、単に「結晶化プレート６」と略記する）が１つだけ収納される。すなわちストレージ部５は、複数の結晶化プレート６を収容する。結晶化プレート６は、蛋白質溶液中の蛋白質を結晶化させるために用いられる結晶化容器である。
【００１９】
ストレージ部５の前面には搬送ユニット７が配置されている。搬送ユニット７は、Ｘテーブル７Ｘ、Ｙテーブル７Ｙ、Ｚテーブル７Ｚ、回転ヘッド７Ｒ、プレート保持ヘッド８を備えている。Ｘテーブル７Ｘは、床面に水平姿勢でＸ方向（ストレージ部５に平行な方向）に配設されており、Ｘテーブル７Ｘに立設されたＺテーブル７Ｚには、Ｙテーブル７Ｙが水平姿勢で装着されている。Ｙテーブル７Ｙには回転ヘッド７Ｒが装着されており、回転ヘッド７Ｒの回転軸にはプレート保持ヘッド８が装着されている。Ｘテーブル７Ｘ、Ｙテーブル７Ｙ、Ｚテーブル７Ｚを駆動することにより、プレート保持ヘッド８はストレージ部５の前面でＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動する。また、回転ヘッド７Ｒを駆動することにより、保持ヘッド８の水平方向の向きを変更することができる。
【００２０】
そしてこのＸＹＺ方向の移動により、プレート保持ヘッド８は搬入口２ａから搬入される結晶化プレート６をアーム８ａによって挟んで保持し、ストレージ部５の指定された収納部５ａに収納する。収納部５ａで所定時間保持された結晶化プレート６は、プレート保持ヘッド８によって保持され、観察部９まで搬送される。搬送ユニット７は、結晶化プレート６をストレージ部５と観察ステージ９ｂとの間で搬送する搬送手段となっている。
【００２１】
観察部９は基台９ａ上に立設されたフレーム９ｃに、観察ステージ９ｂを水平姿勢で装着し、観察ステージ９ｂの上方にカメラ１０を配置した構成となっている。観察ステージ９ｂにはプレート保持ヘッド８によって搬送された結晶化プレート６が載置され、セットされる。観察ステージ９ｂに備えられたＸＹＺ移動機構を駆動することにより、結晶化プレート６はＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動する。そしてカメラ１０は、観察ステージ９ｂにセットされた結晶化プレート６の蛋白質画像を観察して画像データに撮り込む。
【００２２】
図４，図５を参照して、結晶化プレート６について説明する。図４に示すように、結晶化プレート６には複数のウェル６ａが格子状に形成されている。ウェル６ａは、円形の凹部の中心に円柱状の液保持部６ｂが設けられたいわゆるカルデラ状の液体収納用の凹部であり、ウェル６ａ内には、結晶化の対象となる試料、すなわち結晶化対象の蛋白質を含んだ蛋白質溶液１３と、結晶化に用いられる結晶化溶液１２とが分注される。
【００２３】
図５はこれらの試料を収容した１つのウェル６ａの断面を示している。ウェル６ａ内では、液保持部６ｂの頂部に設けられたポケット内に液滴状の蛋白質溶液１３が載置状態で保持されており、液保持部６ｂを囲むリング状の貯液部６ｃには、結晶化溶液１２が貯溜されている。ウェル６ａは、結晶化の対象となる蛋白質溶液を載置状態で下方から保持する液保持部６ｂと結晶化溶液１２を貯溜する貯液部６ｃとを有する溶液収容部となっている。後述するように結晶化の開始に際しては、液保持部６ｂに保持された蛋白質溶液１３に所定量の結晶化溶液１２を貯液部６ｃから取り出して分注して混合した後、各ウェル６ａ上面に密封用のシール部材１４が貼着される（図４参照）。
【００２４】
この状態の結晶化プレート６を所定の温度雰囲気下で保管することにより、蛋白質溶液１３中の溶媒成分を蒸発させ、これにより蛋白質溶液１３の蛋白質濃度を過飽和状態にまで高めて蛋白質結晶を生成する。このとき、蛋白質溶液１３から蒸発する溶媒と結晶化溶液１２に吸収される蒸気とが平衡状態を保ちながら蛋白質溶液１３からの溶媒の蒸発が緩やかに進行することにより、安定した結晶生成が行われる。
【００２５】
観察部９はこのような結晶生成過程の結晶化プレート６を観察することにより、各ウェル６ａにおける蛋白質結晶の有無や結晶化の度合いを検出する。すなわち、図６に示すように、観察ステージ９ｂにセットされた結晶化プレート６をカメラ１０の下方に移動させ、観察対象のウェル６ａ内の液保持部６ｂをカメラ１０の撮像光軸に位置合わせする。そして下方の照明装置１１から照明光を照射した状態で、カメラ１０によって結晶化プレート６を撮像することにより、結晶化プレート６に保持された蛋白質溶液の観察画像が撮り込まれる（図１３参照）。
【００２６】
なお、図４，図５は、結晶生成過程において蛋白質溶液１３を載置状態で下方から支持するシッティングドロップ法を用いた蒸気拡散法において用いられる結晶化プレート６の例を示しているが、これ以外にも、図７に示すようなウェル形状の結晶化プレート６０を使用してもよい。この結晶化プレート６０は、蛋白質溶液１３の液滴を垂下状態で保持するハンギングドロップ法において用いられる。
【００２７】
この例では、ウェル６０Ａは結晶化溶液１２を貯溜する貯液部を有するのみで液保持部は形成されておらず、結晶化対象の蛋白質溶液１３の液滴（所定量の結晶化溶液１２が混合されたもの）は、ウェル６０Ａを閉塞するガラス板１４Ａの裏面に垂下状態で保持される。すなわち蛋白質溶液１３が滴下されたガラス板１４Ａを反転して、結晶化溶液１２が分注されたウェル６０Ａを塞ぐように貼着してウェル６０Ａを密封する。
【００２８】
次に、図８を参照して、蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を説明する。図８において、蛋白質結晶観察装置１は通信インターフェイス１７を備えており、通信インターフェイス１７はＬＡＮシステム１６を介して蛋白質結晶観察装置１内部の制御処理を行う処理部２０と上位制御部であるホストコンピュータ１５との制御信号の授受を行う。
【００２９】
処理部２０は、データ記憶部２１に記憶された各種データに基づいて、プログラム記憶部２２に記憶された各種処理プログラムを実行することにより、後述する各種動作および処理機能を実現する。ここでは、プログラム記憶部２２には、結晶検出プログラム２２ａ、観察動作プログラム２２ｂが記憶されており、これらのプログラムを実行することにより、後述する蛋白質溶液の観察動作および蛋白質溶液中の蛋白質結晶検出処理が行われる。本実施の形態では、結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０がカメラ１０で撮り込んだ蛋白質溶液の画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を構成し、カメラ１０および結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０が蛋白質結晶検出手段を構成している。
【００３０】
データ記憶部２１は、処理画像記憶部２１ａ、観察画像記憶部２１ｂ、結晶化情報記憶部２１ｃを備えており、処理画像記憶部２１ａは、蛋白質結晶検出処理において各種の処理が行われた後の処理画像を記憶する。観察画像記憶部２１ｂは、カメラ１０によって撮り込まれた蛋白質溶液１３の観察画像を記憶する（図１３参照）。
【００３１】
後述する蛋白質結晶検出処理においては、観察画像記憶部２１ｂに記憶された観察画像が処理対象となる。結晶化情報記憶部２１ｃは、結晶化情報、すなわち蛋白質結晶検出処理において結晶化が検出された観察画像の画像データや、観察画像が取得されたプレート・ウェルを特定する情報および当該プレートを観察した観察時刻などの情報を記憶する。
【００３２】
また処理部２０には、表示処理部２３、操作・入力処理部２４、カメラ１０、照明装置５、観察ステージ９ｂ、搬入口開閉機構２５，搬送ユニット７および温調ユニット２６が接続されている。温調ユニット２６は、ホストコンピュータ１５から処理部２０を経由して送られる温度指令に従って恒温室２の温度調整を行う。これにより、恒温室２内部の温度が設定温度に保たれる。
【００３３】
搬送ユニット７は、処理部２０からの制御信号に従って、恒温室２内における結晶化プレート６の搬送、すなわち恒温室２に設けられた搬入口２ａを介して搬入される結晶化プレート６をストレージ部５の所定の収納部５ａに収納する動作や、収納部５ａから結晶化プレート６を取り出して観察部９へセットする動作などの搬送動作を行う。搬入口開閉機構２５は、処理部２０からの制御信号に従って搬入口２ａの開閉を行う。
【００３４】
また処理部２０が観察ステージ９ｂ、照明装置１１、カメラ１０を制御することにより、観察ステージ９ｂに保持された結晶化プレート６の移動、照明装置１１による結晶化プレート６の照明、カメラ１０による蛋白質溶液の画像の撮り込みが実行される。表示処理部２３は、カメラ１０によって撮り込まれた観察画像や各種の処理画像を表示するほか、データ入力時の案内画像などを制御パネル４の表示部に表示させる処理を行う。操作・入力処理部２４は、制御パネル４などの入力装置を操作することにより、処理部２０に対して操作指令やデータ入力を行う。
【００３５】
次に図９の機能ブロック図を参照して、蛋白質結晶検出処理機能について説明する。図９において、微分処理部３０は、観察画像記憶部２１ｂに記憶されている観察画像（図１３参照）、すなわちカメラ１０によって撮り込まれた蛋白質溶液の画像を微分処理することにより、輝度変化の大きさを示す輝度変化情報から成る微分画像を生成する（図１４参照）。ここで輝度変化情報とは、観察画像を構成する各画素における輝度の変化率を数値（輝度変化値）で示すものである。
【００３６】
観察画像中では、背景領域や照明光が透過した部分など観察対象が存在しない領域では輝度変化は小さく、検出対象の蛋白質結晶の輪郭に該当する部分では輝度変化は大きい。したがって上述の微分画像においては、画像に撮り込まれた観察対象物の輪郭が輝度変化の大きい部分として抽出される。
【００３７】
但し、この微分画像においては、検出目標である蛋白質結晶のみにならず、蛋白質溶液内に存在する結晶以外の沈殿物などの固形異物や、ウェル６ａ内の液保持部６ｂの形状や液滴の輪郭なども同様に輝度変化の大きい部分として抽出されるため、これらの検出目標以外の輝度変化の大きい部分をノイズとして除去するノイズ除去処理（後述）が行われる。
【００３８】
微分画像記憶部３１は、微分処理部３０で生成された微分画像を記憶する。二値化処理部３２は、微分画像記憶部３１の微分画像を特徴部抽出用の閾値で二値化することにより、輝度変化情報のうち大きな輝度変化を示す輝度変化情報を特徴部分として残した二値化画像を得る（図１５参照）。そして二値化画像記憶部３３は、二値化処理部３２で得られた二値化画像を記憶する。結晶化判定部３４は、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像の特徴部分より、蛋白質結晶の有無を判断する。
【００３９】
ここで、二値化処理部３２による二値化処理の対象となる微分画像には、以下に説明するマスク処理、ノイズ除去処理が実行される。そして除去の対象となるノイズを認識することを目的として、ノイズ除去処理に先立ってノイズ抽出用の二値化処理および細線化処理が実行される。
【００４０】
まずマスク処理について説明する。マスク情報記憶部３６は、マスク情報、すなわち観察画像内において蛋白質溶液を保持する結晶化容器である結晶化プレート６の形状（液保持部６ｂの形状）に由来して微分画像に現れる輝度変化情報、すなわち本来観察対象とする蛋白質溶液の観察画像中に含まれるノイズのうち、容器である結晶化プレート６の形状に由来して現れる容器ノイズを微分画像から除去するためのマスク情報（ここでは、液保持部６ｂに設けられたポケットの径寸法）を記憶する。マスク処理部３５は、マスク情報記憶部３６に記憶されたマスク情報に基づき、微分画像から容器ノイズを除去するマスク処理を行う。これにより、容器ノイズが除去された微分画像が得られる（図１５参照）。
【００４１】
次にノイズ除去処理について説明する。ここで行われるノイズ除去処理は、上述のマスク処理では除去できないノイズ、例えば液保持部６ｂ頂部のポケット内に現れる蛋白質溶液の液滴の輪郭など、予め教示することができないノイズを対象としたものである。このため、ここでは微分画像中の情報からどの部分がノイズであるかをノイズ認識処理部３８によって認識し、このノイズ認識結果に基づきノイズ除去処理部３７が微分画像中のノイズ除去を行う。これにより、ノイズが除去された微分画像が得られる（図１７参照）。
【００４２】
ここでは、ノイズ認識の手法として、微分画像を細線化した細線化画像中の線の形状的特徴に基づき、これらの線が蛋白質結晶を示す図形の輪郭などの形状を示す形状線であるか、もしくは液滴の輪郭など明らかに蛋白質結晶を示す図形とは異なる線であるかを識別するようにしている。
【００４３】
すなわちここに示すノイズ認識においては、まず二値化処理部３９により、微分画像記憶部３１に記憶された微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化処理する。そして細線化処理部４０は、二値化処理された二値化画像を細線化処理する。すなわち、二値化画像中の各線要素を１画素幅の細い線に置き換える。これにより、微分画像中の輝度変化が大きい部分を示す範囲が細線化された複数の線から成る細線化画像が生成される（図１６参照）。
【００４４】
したがって、二値化処理部３９および細線化処理部４０は、微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化した後細線化処理することにより複数の線から成る細線化画像を得る細線化画像生成部を構成する。そして細線化画像記憶部４１は、細線化画像生成部で生成された細線化画像を記憶する。
【００４５】
ノイズ認識処理部３８は、細線化画像記憶部４１の細線化画像に含まれる複数の線の形状を個々に認識することにより、ノイズとみなす線を検出する。ノイズ除去処理部３７は、微分画像記憶部３１に記憶された微分画像から、ノイズ認識処理部３８でノイズとみなされて検出された線に該当する輝度変化情報を微分画像記憶部３１の微分画像より除去する。
【００４６】
ここで、ノイズ認識処理部３８がノイズとみなす線を検出するに際しては、後述するように複数のアルゴリズムを用いている。すなわち、線の長さおよび分岐数を求め、長さが所定値を超え且つ分岐数が少ない線をノイズとみなす第１のアルゴリズム、線の長さおよび直線性を認識し、長さが所定値を超え且つ直線性が高い線をノイズとみなす第２のアルゴリズム、さらには線の長さおよび当該線の近似直線に対する分散度合いを求め、長さが所定値を超え且つ分散度合いが小さい線をノイズとみなす第３のアルゴリズムの３つを必要に応じて使い分け、または併用するようにしている。
【００４７】
なお、マスク処理部３５による容器ノイズ除去処理、ノイズ除去処理部３７によるノイズ除去処理においては、上記例では微分画像記憶部３１に記憶された微分画像を処理対象として実行する例を示しているが、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像を対象としてマスク処理部３５による容器ノイズ除去処理、ノイズ除去処理部３７によるノイズ除去処理を実行するように構成してもよい。
【００４８】
この蛋白質結晶観察装置は上記のように構成されており、次に蛋白質結晶を検出するための観察動作について、図１０をのフローを参照して説明する。この観察動作は、処理部２０が観察動作プログラム２２ｂを実行することにより行われ、観察動作開始に際しては、上流側装置から搬入口２ａを介して搬入された結晶化プレート６は、収納部５ａに収容・保管されている。
【００４９】
まず図１０において、指定された結晶化プレート６を搬送ユニット７によって取り出して観察ステージ９ｃへ移動する（ＳＴ１）。そして先頭のウェル６ａをカメラ１０の直下の観察位置に位置決めする（ＳＴ２）。この後、照明装置１１を点灯して、カメラ１０によって画像取り込みを実行する（ＳＴ３）。そしてこの後、後述する蛋白質結晶検出処理が実行される（ＳＴ４）。
【００５０】
このウェルを対象とした蛋白質結晶検出処理が終了したならば、次のウェルの有無を判断する（ＳＴ５）。ここで次のウェルがある場合には、次のウェルを観察位置に位置決めし（ＳＴ６）、（ＳＴ３）に戻って同様の処理を反復実行する。そして（ＳＴ５）にて次のウェル無しと判断されたならば、処理が完了した結晶化プレート６を収納部５ａに返却する。そしてホストコンピュータ１５に観察動作終了を通知して、観察動作実行処理を終了する。
【００５１】
上述の観察動作において、結晶化プレート６を恒温室２から外部に持ち出すことなく全ての動作を行うことが可能となっており、観察の都度結晶化プレートを持ち出す方式と比較して、結晶化プレートの温度条件が変化することによる結晶育成条件のばらつきを排除してスクリーニング精度を向上させることができるとともに、結晶化プレートを冷却状態から室温に曝す際に生じる結露による観察視野の曇りが発生せず良好な観察結果を得ることが可能であり、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００５２】
次に、（ＳＴ３）において撮り込まれた観察画像および（ＳＴ４）にて実行される蛋白質結晶検出処理について説明する。まず観察対象の蛋白質溶液１３の経時変化について、図１２を参照して説明する。前述のように結晶化生成の開始に際しては、ウェル６ａの液保持部６ｂには、所定割合の結晶化溶液１２が加えられた蛋白質溶液１３の液滴が載置される（図５参照）。図１２（ａ）は、結晶化生成の初期における液保持部６ｂの断面を示しており、この段階では蛋白質溶液１３の液滴は液保持部６ｂのポケットをほぼ満たした状態にあり、液滴内部には未だ蛋白質結晶が見られない。
【００５３】
ここで結晶生育条件、すなわち結晶化溶液１２の組成・濃度や保管温度が望ましい条件に適っている場合には、蛋白質溶液１３内では時間の経過とともに結晶化が進行する。図１２（ｂ）は、結晶化がある程度進行した状態における液保持部６ｂの断面を示している。この状態では、蛋白質溶液１３中の溶媒成分が徐々に蒸発することにより、液保持部６ｂのポケット内で液滴が縮小するにつれて液滴の輪郭（矢印Ｂで示す）が、図１２（ａ）の状態よりもポケット内部側に移動している。そして液滴の縮小によって露呈したポケット底面には、液滴内に含まれていた蛋白質が結晶化した蛋白質結晶１３ａが残留している。さらに液滴内部においても結晶化が進行し、蛋白質結晶１３ａが生成されている。
【００５４】
図１３は、図１２（ｂ）に示す状態における観察画像を示しており、液保持部６ｂのポケット内で溶媒の蒸発がある程度進行し体積が縮小した状態の液滴を上方から撮り込んだ画像が含まれている。この観察画像中では、図１３に示すように、低輝度の背景画像（密ハッチング部で示す）中に、液保持部６ｂの頂部を示す環状部分Ａ（疎ハッチング部で示す）が比較的高い輝度で現れている。
【００５５】
そしてこの環状部分Ａの内側のポケット内には、蛋白質溶液１３の液滴が輝度が部分によって異なる画像として現れている。ここで、環状部分Ａの内側で液滴が存在しない部分は下方からの照明光（図１２（ｂ）参照）が透過することによって高輝度部分となっており、蛋白質溶液１３の液滴の輪郭Ｂはこの高輝度部分とのコントラストによって観察画像中で明瞭に現れている。また環状部分Ａの内周に沿って、部分的に線状の高輝度部分Ｃが現れている。
【００５６】
そして検出対象の蛋白質結晶１３ａは、環状部分Ａの内側の領域に存在している。すなわち、蛋白質溶液１３の液滴内部に存在する蛋白質結晶１３ａのうち、カメラ１０による合焦レベルｆ（図１２（ｂ）参照）の近傍に存在する蛋白質結晶１３ａは、図１３の観察画像中で合焦度が高く明瞭に現れ、合焦レベルｆから外れた位置にある蛋白質結晶１３ａは合焦度が低くぼやけた輪郭で現れる。またポケットの表面に残置された形で存在する液滴外の蛋白質結晶１３ａも同様に、合焦度が低くぼやけた輪郭で現れる。さらにこれ以外にも、観察画像中には結晶化に至らなかった沈殿物などの固形異物が存在する。
【００５７】
蛋白質結晶の検出において、観察画像中に現れるこれらの図形を目視観察によって正確に識別することは困難であり、検出対象の蛋白質結晶を高い信頼度で効率よく検出することができないため、本実施の形態に示す蛋白質結晶検出方法では、プログラム記憶部２２に記憶された結晶検出プログラム２２ａを処理部２０が実行することにより、観察画像に対して図１１のフローに示す蛋白質結晶検出処理を行い、蛋白質結晶の識別を自動的に行わせるようにしている。
【００５８】
まず、観察画像に対して微分処理を行う（ＳＴ１１）。すなわち、予め観察画像記憶部２１ｂに記憶された蛋白質溶液の観察画像を微分処理することにより、輝度変化の大きさを示す輝度変化情報からなる微分画像を生成する（微分処理工程）。これにより、図１４に示すように、図１３の観察画像中に現れている蛋白質結晶１３ａの外形を示す形状線や、液滴の輪郭Ｂ、環状部分Ａの内周の高輝度部分Ｃなど、輝度変化が大きい部分が高輝度で現れる。なお、微分画像は本来各画素が輝度変化値に応じた明るさで現れる多値画像であるが、図１４では図示の便宜のため白黒２値画像で表している。
【００５９】
次いで、この微分画像に対して、マスク処理を行う（ＳＴ１２）。ここでは、蛋白質溶液１３を保持している結晶化プレート６の液保持部６ｂに由来する輝度変化情報を微分画像から除去する（容器ノイズ除去工程）。容器ノイズ除去は、結晶化プレート６の液保持部６ｂの形状として予め教示されているマスク情報に基づいて、蛋白質溶液１３が保持されている可能性のない所定領域の輝度変化情報を除去することにより行われる。
【００６０】
ここでは、図１４に示す微分画像中の輝度変化情報のうち、蛋白質溶液１３が保持されている範囲以外に存在する輝度変化が大きい部分、すなわち図１３に示す環状部分Ａの内周部を含んでこれらよりも外側の領域に現れる輝度変化が大きい部分をノイズとして除去する。これにより、図１５に示すように、蛋白質結晶が存在する可能性がある領域のみを含んだ微分画像（マスク処理）が得られる。
【００６１】
このようにしてマスク処理が行われた微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化処理し、さらに細線化処理を行う（ＳＴ１３）。図１６は、この細線化処理によって得られた細線化画像を示しており、微分画像中の高輝度部分、すなわちタンパク質結晶１３ａの形状線や液滴の輪郭などは、いずれも幅が１画素の線に置き換えられている。そしてこのようにして作成された細線化画像に基づいて、ノイズ抽出を行う。すなわち、細線化画像に含まれるノイズを認識する（ＳＴ１４）。
【００６２】
ここで、ノイズ認識方法の例を図１９を参照して説明する。図１９に示す例はいずれも、上述の輪郭Ｂに該当する線など、ある程度の連続した長さを有ししかも蛋白質結晶の特徴的形状に合致しないものをノイズとみなして検出するものである。ここでは、細線化画像中の複数の線をまとまりごとにラベリングし、個々のラベルのうち、線の長さが所定値を超えるラベルについて以下に説明するアルゴリズムでノイズに該当するか否かを認識するようにしている。この場合、細線化処理された画像を対象としてラベリングを行っていることから、ラベル面積そのものが各ラベルにおける線の長さを示している。
【００６３】
図１９（ａ）はこのノイズ認識の第１のアルゴリズムを示している。まず、線の長さが所定値を超えるラベルについて、ラベルを構成する線が分岐する分岐点を求め、求められた分岐点の数に基づいてノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ａ）の（イ）に示すラベルＬ１の例では、線ｎの長さは所定値以上であるものの、分岐点Ｐが多いことからノイズとはみなされない。
【００６４】
これに対し（ロ）に示すラベルＬ２の例では、線ｎの長さは所定値以上であり、しかも分岐点Ｐが１つしかなく、「分岐数が少ない」と判断する判定値を超えていないことからノイズとみなされる。すなわち第１のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび分岐数を求め、長さが所定値を超え且つ分岐数が少ない線をノイズとみなすようにしている。なお、分岐点の数に基づいてノイズであるか否かを判断する別の方法として、線の長さを分岐数で割った値が所定の長さを超えていなければ分岐数が少ない線と判断するようにしてもよい。
【００６５】
図１９（ｂ）は第２のアルゴリズムを示している。ここでは、線の長さが所定値を超えるラベルについて、ラベルを構成する線の直線性を判定することによってノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ｂ）に示すラベルＬ３において、ラベルを構成する線ｎの探索を行い、探索起点ＰＳから探索を開始した線ｎが、探索終点ＰＥにおいて予め規定された探索許容幅Ｖの範囲内に収まっている場合に直線性が高いと判断し、この線ｎをノイズと判定する。すなわち第２のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび直線性を認識し、長さが所定値を超え且つ直線性が高い線をノイズとみなすようにしている。
【００６６】
さらに図１９（ｃ）は第３のアルゴリズムを示している。ここでは、ラベルを構成する複数の線の近似直線に対する分散度合いを求めることによってノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ｃ）の（イ）に示すラベルＬ４において、ラベルを構成する複数の線ｎ全体を近似する近似直線ＡＮを求める。そしてこの近所直線ＡＮを挟む所定枠Ｍ内において、線ｎの近似直線ＡＮに対する分散度合いを求める。この場合には、複数の線ｎが錯綜して状態にあることから分散度合いは大きく、ノイズとはみなされない。
【００６７】
これに対し、（ロ）に示すラベルＬ５の例では、線ｎは近似直線ＡＮにほぼ沿っており近似直線ＡＮに対する分散度合いが小さいことからノイズとみなされる。すなわち第３のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび当該線の近似直線に対する分散度合いを求め、長さが所定値を超え且つ分散度合いが小さい線をノイズとみなすようにしている。
【００６８】
そしてこのようにしてノイズが認識されたならば、ノイズとみなされて検出された線を二値化処理された微分画像から除去するノイズ除去処理を行う（ＳＴ１５）。すなわち、（ＳＴ１３）、（ＳＴ１４）、（ＳＴ１５）においては、微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化した後細線化処理することにより、複数の線からなる細線化画像を得る（細線化画像生成工程）。
【００６９】
そして生成された細線化画像に含まれる複数の線の形状を個々に認識することにより、ノイズとみなす線を検出し（ノイズ認識工程）、ノイズ認識工程で検出したノイズとした線に該当する輝度変化情報を微分画像より除去する（ノイズ除去工程）。図１７は、このようにしてノイズが除去された微分画像（ノイズ除去）を示している。
【００７０】
この後、蛋白質結晶に該当する可能性が高い特徴部分の抽出を行う。まず、微分画像（ノイズ除去）を特徴部分抽出用の閾値で二値化処理する（ＳＴ１６）。すなわち、微分画像を特徴部抽出用の閾値で二値化することにより、大きな輝度変化を示す輝度変化情報を特徴部分として残した二値化画像を得る（二値化処理工程）。ここで用いられる閾値は、前述のノイズ抽出用の閾値よりも高い値に設定される。
【００７１】
また、二値化処理工程においては、特徴部分についてラベリングを行い、面積が所定値よりも大きいラベルのみを残してその他を消去する処理を行う。これにより、蛋白質結晶である可能性が少ない小さな特徴部分がノイズとみなされて除去される。図１８は、このようにして得られた二値化画像を示しており、この画像中には、蛋白質結晶である可能性が高い特徴部分のみが現れている。そして得られた二値化画像記憶部３３に記憶される。
【００７２】
なお、前述の容器ノイズ除去工程、ノイズ除去工程を、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像を対象として行うようにしてもよい。この場合には、二値化画像中に残された特徴部分のうち、ノイズとみなされた検出された線に該当するものを二値化画像から除去する。
【００７３】
この後、得られた二値化画像を対象として結晶化判定を行う（ＳＴ１７）。例えば、二値化画像中の特徴部分が少ない場合には、結晶化が進行している可能性無しと判断し、特徴部分が多い場合には、結晶化が進行している可能性ありと判断する。特徴部分の多い少ないは、特徴部分に相当する面積の合計を所定値と比較することによって決定される。すなわちここでは、二値化画像の特徴部分より蛋白質結晶の有無を判断する（結晶化判定工程）。
【００７４】
そしてここで結晶化の可能性がなしと判定されたならば、処理を終了する。また（ＳＴ１８）にて結晶化の可能性ありと判定されたならば、当該処理において対象とした観察画像が得られた結晶化プレート６を示す結晶化プレート情報、ウェル情報、観察画像、観察時刻などの結晶化情報を結晶化情報記憶部２１ｃに記憶し（ＳＴ１９）、当該観察画像を対象とした蛋白質検出処理を終了する。
【００７５】
上記説明したように、本実施の形態に示す蛋白質結晶検出においては、蛋白質溶液の画像を微分処理することにより、検出対象の蛋白質結晶の輪郭に相当する部分を輝度変化が大きい部分としてとしてまず抽出する。そしてこの輝度変化が大きい部分を特徴部抽出用の閾値で切り分けることにより、大きな輝度変化を示す部分を特徴部分として残した二値化画像を求める。そして蛋白質結晶の有無の判断を、この二値化画像の特徴部分より行うようにしている。これにより、個人的な熟練度の相違による結晶検出作業の効率や検出結果の信頼性のばらつきを排除することができ、蛋白質結晶の検出を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００７６】
なお上記実施の形態では、二値化画像の特徴部分にノイズを含まないようにマスク処理部３５やノイズ除去処理部３７で処理を行っているが、容器の形状や照明の条件等によりノイズを殆ど含まない観察画像が得られる場合には、マスク処理部３５やノイズ除去処理部３７での処理を省略することができる。
【００７７】
なお、上記実施の形態では、カメラ１０および結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０で蛋白質結晶検出手段を構成する例を示したが、蛋白質結晶検出手段としては、特開平６−１１６０９８号公報に開示されているように、結晶化溶液の蛋白質溶液にレーザ光等の光線を照射する照射手段と、照射された光線の拡散状況を検出して蛋白質溶液内の結晶の生成状態を判断する結晶化判断部を備えたものでもよい。
【００７８】
また上記実施の形態では、結晶検出処理機能および結晶化情報記憶機能を蛋白質結晶観察装置１に含ませた例（図８参照）を示したが、図２０に示すような構成を採用してもよい。この例では、結晶検出処理機能および結晶化情報記憶機能は、蛋白質結晶観察装置１Ａではなく、ホストコンピュータ１５Ａが備えている。
【００７９】
すなわち、図８に示す観察画像記憶部２１ｂ、結晶検出プログラム２２ａ、処理画像記憶部２１ａ、結晶化情報記憶部２１ｃの各機能はホストコンピュータ１５Ａの機能の一部となっており、結晶検出プログラム２２ａを実行するホストコンピュータ１５Ａがカメラ１０で撮り込んだ蛋白質溶液の画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を構成する。
【００８０】
そして蛋白質結晶観察装置１Ａのデータ記憶部２１Ａからは処理画像記憶部２１ａ、結晶化情報記憶部２１ｃの機能が除外されており、プログラム記憶部２２Ａから結晶検出プログラム２２ａが除外されている。このような構成を採用することにより、恒温室２を備えた蛋白質結晶観察装置１Ａから離れた遠隔場所で結晶検出処理のみを分離して実行し、必要な結晶化情報を取得して蓄積することが可能となる。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、複数の結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに取り込むカメラと、結晶化容器をストレージ部と観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを恒温室内に配置したので、経時的な観察作業において結晶化容器を恒温室外に取り出すことなく観察作業を行うことができ、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の斜視図
【図２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の透視斜視図
【図３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の断面図
【図４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの斜視図
【図５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の観察部の部分断面図
【図７】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図８】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図
【図９】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の処理機能を示す機能ブロック図
【図１０】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置における観察動作のフロー図
【図１１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図
【図１２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図１３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における観察画像を示す図
【図１４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像を示す図
【図１５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（マスク処理）を示す図
【図１６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における細線化画像を示す図
【図１７】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（ノイズ除去）を示す図
【図１８】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における二値化画像を示す図
【図１９】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法におけるノイズ認識処理の説明図
【図２０】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図
【符号の説明】
２恒温室
５ストレージ部
６結晶化プレート
６ａウェル
６ｂ液保持部
６ｃ貯液部
７搬送ユニット
８プレート保持ヘッド
９観察部
９ｂ観察ステージ
１０カメラ
１２結晶化溶液
１３蛋白質溶液
１３ａ蛋白質結晶
２０処理部
２１ａ処理画像記憶部
２１ｂ観察画像記憶部
２１ｃ結晶化情報記憶部
２２ａ結晶検出プログラム
２２ｂ観察動作プログラム
３０微分処理部
３１微分画像記憶部
３２二値化処理部（特徴部分抽出）
３３二値化画像記憶部
３４結晶化判定部
３５マスク処理部
３７ノイズ除去処理部
３８ノイズ認識処理部
３９二値化処理部（ノイズ抽出）
４０細線化処理部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein crystal observation apparatus for observing protein crystals in a protein solution held in a crystallization vessel.
[0002]
[Prior art]
In recent years, efforts to make effective use of genetic information in fields such as medicine have become active, and efforts have been made to analyze the structure of proteins constituting genes as the basic technology. This protein structure analysis specifies a three-dimensional structure in which amino acids constituting the protein are linked in a three-dimensional line, and is performed by a method such as X-ray crystal structure analysis.
[0003]
In order to perform such a structural analysis of a protein, it is first required to crystallize the protein to be analyzed, and a vapor diffusion method is known as a protein crystallization method. In this method, the solvent component evaporated from the protein solution containing the protein to be crystallized is absorbed by the crystallization solution contained in the same container, so that the protein solution is maintained in a supersaturated state and crystals are gradually generated. Conventionally, dedicated containers and apparatuses for crystallization of proteins using this vapor diffusion method have been proposed (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
[0004]
However, at present, it is not possible to theoretically specify the crystal growth conditions for promoting crystallization, and a screening method for finding the best conditions from the results of systematic execution of many tests while changing various conditions. Must be used. For this reason, it has been necessary to repeatedly execute the test for the protein solution of interest under various crystal growth conditions, that is, various conditions in which the type, concentration and growth temperature of the crystallization solution described above are changed. .
[0005]
In such a test, a crystallization container such as a microplate for crystallization containing a protein solution and a crystallization solution is stored in a temperature-controlled room set at a specific temperature, and the presence / absence of crystallization and the degree of progress are measured over time. It was done by observing with it. In the past, the observation work for detecting protein crystals has relied solely on human labor, and the person in charge of the test took out the crystallization container from the temperature-controlled room and visually observed the protein solution in the microscope field of view, and the crystallization progressed. Work was done to record and record the situation.
[0006]
[Patent Document 1]
JP 2002-233702 A
[Patent Document 2]
JP 2002-179500 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, such observation work is originally a cumbersome work that requires a lot of labor and time, and it is caused by putting an excessive work load on the person in charge of the experiment and taking out the crystallization plate from the temperature-controlled room for each observation. There were the following problems. First, the crystallization plate taken out from the temperature-controlled room in a room temperature atmosphere is likely to be dewed by moisture in the atmosphere, and this condensation hinders a clear visual field at the time of microscopic observation, and makes the observation inaccurate. The problem due to this dew condensation also occurs when laser light is irradiated and crystallization is judged based on the diffusion state.
[0008]
When the crystallization plate is taken out of the temperature-controlled room, the temperature of the crystallization plate changes and the initially set crystal growth conditions cannot be properly observed. If such a condition variation is repeatedly generated, the reliability of the test result itself for finding the crystallization condition is impaired. Thus, in the conventional protein crystal observation, there is a problem that it is difficult to perform observation work efficiently and with high reliability.
[0009]
Therefore, an object of the present invention is to provide a protein crystal observation apparatus that can perform observation work for protein crystal detection efficiently and with high reliability.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The protein crystal observation device according to claim 1 is a protein crystal observation device for observing protein crystals in a protein solution held in a crystallization vessel, and a temperature control means for controlling the temperature in the temperature-controlled room. And a storage unit for accommodating the plurality of crystallization containers, an observation stage on which the crystallization container to be observed is set, and a protein solution in the crystallization container set on the observation stage, and taking image data. And a transporting means for transporting the crystallization container between the storage unit and the observation stage, and the storage unit, the observation stage, the camera, and the transporting unit are arranged in the temperature-controlled room.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The protein crystal observation device according to claim 1 is a protein crystal observation device for observing protein crystals in a protein solution held in a crystallization vessel, and a temperature control means for controlling a temperature in the temperature-controlled room. When, An opening / closing mechanism provided in the temperature-controlled room by an inlet opening / closing mechanism, and an inlet for bringing the crystallization container into the temperature-controlled room; plural In the storage A storage unit for storing the crystallization container; an observation stage on which the crystallization container to be observed is set; a camera for observing a protein solution in the crystallization container set on the observation stage and capturing image data thereof; , The crystallization container carried in from the carry-in entrance is stored in the designated storage section of the storage section, and The crystallization container is provided with a transport unit that transports the crystallization container between the storage unit and the observation stage, and the storage unit, the observation stage, the camera, and the transport unit are disposed in the thermostatic chamber.
[0012]
The protein crystal observation device according to claim 2 is a protein crystal observation device for detecting a protein crystal from a protein solution held in a crystallization vessel, comprising a temperature-controlled room and a temperature control means for controlling the temperature in the temperature-controlled room. , An opening / closing mechanism provided in the temperature-controlled room by an inlet opening / closing mechanism, and an inlet for bringing the crystallization container into the temperature-controlled room; plural In the storage A storage unit for storing the crystallization container; and a protein crystal detection means for detecting protein crystals generated in the protein solution in the crystallization container; The crystallization container carried in from the carry-in entrance is stored in the designated storage section of the storage section, and Conveying means for conveying the crystallization container between the storage unit and the protein crystal detecting means is provided, and the storage unit, the protein crystal detecting means and the conveying means are arranged in the temperature-controlled room.
[0013]
The protein crystal observation device according to claim 4 is the protein crystal observation device according to claim 2, wherein the protein crystal detection means includes an irradiation means for irradiating the protein solution in the crystallization container with light, and an irradiated light beam. A crystallization judgment unit is provided for detecting the diffusion state of the protein and judging the formation state of crystals in the protein solution.
[0014]
According to the present invention, a storage unit that accommodates a plurality of crystallization containers, an observation stage on which a crystallization container to be observed is set, and a protein solution in the crystallization container set on the observation stage is observed to obtain image data. By placing the camera that captures the image and the transport means for transporting the crystallization container between the storage and the observation stage in the temperature-controlled room, observation can be performed without taking the crystallization container out of the temperature-controlled room over time. The work for observing protein crystals can be performed efficiently and with high reliability.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. 1 is a perspective view of a protein crystal observation apparatus according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a perspective view of the protein crystal observation apparatus according to an embodiment of the present invention, and FIG. 3 is an embodiment of the present invention. FIG. 4 is a perspective view of a crystallization plate used in the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention, and FIGS. 5 and 7 are protein crystals of one embodiment of the present invention. FIG. 6 is a partial cross-sectional view of the crystallization plate used in the observation apparatus, FIG. 6 is a partial cross-sectional view of the observation section of the protein crystal observation apparatus according to one embodiment of the present invention, and FIG. 8 is a protein crystal according to one embodiment of the present invention. FIG. 9 is a functional block diagram showing the protein crystal detection processing function of the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention, and FIG. 10 is a block diagram of the embodiment of the present invention. FIG. 11 is a flowchart of the observation operation in the protein crystal observation apparatus. FIG. 12 is a partial cross-sectional view of a crystallization plate used in the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention, and FIG. 13 is a flowchart of the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention. The figure which shows the observation image in the protein crystal detection method of one Embodiment, FIG. 14 is the figure which shows the differential image in the protein crystal detection method of one Embodiment of this invention, FIG. 15 is the protein of one Embodiment of this invention FIG. 16 is a diagram showing a differential image (mask processing) in the crystal detection method, FIG. 16 is a diagram showing a thinned image in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention, and FIG. 17 is a protein crystal of one embodiment of the present invention. FIG. 18 is a diagram showing a differential image (noise removal) in the detection method, FIG. 18 is a diagram showing a binarized image in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention, and FIG. 19 is a protein crystal of one embodiment of the present invention. detection Illustration of a noise recognition processing in law, FIG. 20 is a block diagram showing the protein structure of the control system of the crystal observation apparatus of an embodiment of the present invention.
[0016]
First, the entire structure of the protein crystal observation device will be described with reference to FIGS. The protein crystal observation device 1 is a dedicated observation device used for observation for detecting protein crystals generated in a protein solution by a vapor diffusion method.
[0017]
1 and 2, the protein crystal observation device 1 has a configuration in which a storage unit 5, a transport unit 7 and an observation unit 9 are arranged in a box-shaped temperature-controlled room 2. The temperature-controlled room 2 has a temperature control function for maintaining the internal atmosphere at a set temperature. As shown in FIG. 1, the temperature-controlled room 2 has a door 3a for internal access on the front surface of the temperature-controlled room 2, and for operation and inspection from the front surface. A small panel 3b, an internal inspection window 2b, and a control panel 4 in which a display unit and an operation / input unit are integrated are provided. And the entrance 2a for carrying in the observation object inside is provided in the side surface of the temperature-controlled room 2. As shown in FIG. The carry-in port 2a can be freely opened and closed by a carry-in port opening / closing mechanism (not shown).
[0018]
Next, the internal structure of the temperature-controlled room 2 will be described with reference to FIGS. Inside the temperature-controlled room 2, a vertical shelf-shaped storage unit 5 is disposed along the back side wall surface. The storage unit 5 includes a plurality of storage units 5a partitioned in a shelf shape, and the storage unit 5a has only one microplate 6 for crystallization (hereinafter simply abbreviated as “crystallization plate 6”). Stored. That is, the storage unit 5 accommodates a plurality of crystallization plates 6. The crystallization plate 6 is a crystallization container used for crystallizing the protein in the protein solution.
[0019]
A transport unit 7 is disposed in front of the storage unit 5. The transport unit 7 includes an X table 7X, a Y table 7Y, a Z table 7Z, a rotating head 7R, and a plate holding head 8. The X table 7X is disposed on the floor surface in a horizontal posture in the X direction (a direction parallel to the storage unit 5). The Z table 7Z erected on the X table 7X has a Y table 7Y in a horizontal posture. It is installed. A rotary head 7R is mounted on the Y table 7Y, and a plate holding head 8 is mounted on the rotary shaft of the rotary head 7R. By driving the X table 7X, the Y table 7Y, and the Z table 7Z, the plate holding head 8 moves in the X, Y, and Z directions on the front surface of the storage unit 5. Moreover, the horizontal direction of the holding head 8 can be changed by driving the rotary head 7R.
[0020]
As a result of the movement in the XYZ directions, the plate holding head 8 holds the crystallization plate 6 carried in from the carry-in port 2 a with the arm 8 a sandwiched between them, and stores it in the designated storage unit 5 a of the storage unit 5. The crystallization plate 6 held for a predetermined time in the storage unit 5 a is held by the plate holding head 8 and conveyed to the observation unit 9. The transport unit 7 serves as a transport means for transporting the crystallization plate 6 between the storage unit 5 and the observation stage 9b.
[0021]
The observation unit 9 has a configuration in which an observation stage 9b is mounted in a horizontal posture on a frame 9c erected on a base 9a, and a camera 10 is disposed above the observation stage 9b. The crystallization plate 6 conveyed by the plate holding head 8 is placed and set on the observation stage 9b. By driving the XYZ moving mechanism provided in the observation stage 9b, the crystallization plate 6 moves in the X, Y, and Z directions. The camera 10 observes the protein image of the crystallization plate 6 set on the observation stage 9b and captures the image data.
[0022]
The crystallization plate 6 will be described with reference to FIGS. As shown in FIG. 4, the crystallization plate 6 has a plurality of wells 6a formed in a lattice shape. The well 6a is a so-called caldera-shaped recess for storing a liquid in which a cylindrical liquid holding portion 6b is provided at the center of a circular recess. In the well 6a, a sample to be crystallized, i.e., a crystallization target. A protein solution 13 containing the target protein and a crystallization solution 12 used for crystallization are dispensed.
[0023]
FIG. 5 shows a cross section of one well 6a containing these samples. In the well 6a, a droplet-like protein solution 13 is held in a pocket provided at the top of the liquid holding part 6b, and the ring-shaped liquid storage part 6c surrounding the liquid holding part 6b The crystallization solution 12 is stored. The well 6a is a solution storage section having a liquid holding section 6b for holding a protein solution to be crystallized from below in a mounted state and a liquid storage section 6c for storing the crystallization solution 12. As will be described later, at the start of crystallization, a predetermined amount of the crystallization solution 12 is taken out from the storage portion 6c, mixed and mixed with the protein solution 13 held in the liquid holding portion 6b, and then the upper surface of each well 6a. A sealing member 14 for sealing is attached to (see FIG. 4).
[0024]
By storing the crystallization plate 6 in this state under an atmosphere of a predetermined temperature, the solvent component in the protein solution 13 is evaporated, thereby increasing the protein concentration of the protein solution 13 to a supersaturated state and generating protein crystals. . At this time, the solvent evaporating from the protein solution 13 and the vapor absorbed by the crystallization solution 12 are kept in an equilibrium state while the evaporation of the solvent from the protein solution 13 proceeds slowly, so that stable crystal formation is performed. .
[0025]
The observation unit 9 detects the presence or absence of protein crystals and the degree of crystallization in each well 6a by observing the crystallization plate 6 in such a crystal formation process. That is, as shown in FIG. 6, the crystallization plate 6 set on the observation stage 9 b is moved below the camera 10, and the liquid holding part 6 b in the observation target well 6 a is aligned with the imaging optical axis of the camera 10. To do. Then, the observation image of the protein solution held on the crystallization plate 6 is taken by imaging the crystallization plate 6 with the camera 10 in a state where the illumination light is irradiated from the lower illumination device 11 (see FIG. 13). .
[0026]
4 and 5 show an example of the crystallization plate 6 used in the vapor diffusion method using the sitting drop method in which the protein solution 13 is supported from below in the crystal formation process. Besides, a well-shaped crystallization plate 60 as shown in FIG. 7 may be used. The crystallization plate 60 is used in a hanging drop method in which a droplet of the protein solution 13 is held in a suspended state.
[0027]
In this example, the well 60A has only a liquid storage part for storing the crystallization solution 12, but no liquid holding part is formed. A droplet of the protein solution 13 to be crystallized (a predetermined amount of the crystallization solution 12 is formed). The mixture) is held in a suspended state on the back surface of the glass plate 14A closing the well 60A. That is, the glass plate 14A onto which the protein solution 13 has been dropped is inverted and attached so as to close the well 60A into which the crystallization solution 12 has been dispensed, thereby sealing the well 60A.
[0028]
Next, the configuration of the control system of the protein crystal observation apparatus will be described with reference to FIG. In FIG. 8, the protein crystal observation apparatus 1 includes a communication interface 17, and the communication interface 17 performs a control process inside the protein crystal observation apparatus 1 via the LAN system 16 and a host computer that is a host control section. The control signal with 15 is exchanged.
[0029]
The processing unit 20 implements various operations and processing functions to be described later by executing various processing programs stored in the program storage unit 22 based on the various data stored in the data storage unit 21. Here, the program storage unit 22 stores a crystal detection program 22a and an observation operation program 22b. By executing these programs, an observation operation of a protein solution and a protein crystal detection process in the protein solution, which will be described later, are performed. Is done. In the present embodiment, the processing unit 20 that executes the crystal detection program 22a configures an image processing unit that processes the image data of the protein solution captured by the camera 10 to detect crystals in the protein solution. The processing unit 20 that executes the crystal detection program 22a constitutes a protein crystal detection means.
[0030]
The data storage unit 21 includes a processed image storage unit 21a, an observation image storage unit 21b, and a crystallization information storage unit 21c. The processed image storage unit 21a is subjected to various processes in the protein crystal detection process. Store the processed image. The observation image storage unit 21b stores an observation image of the protein solution 13 captured by the camera 10 (see FIG. 13).
[0031]
In the protein crystal detection process described later, an observation image stored in the observation image storage unit 21b is a processing target. The crystallization information storage unit 21c observed crystallization information, that is, image data of an observation image in which crystallization was detected in the protein crystal detection process, information specifying the plate / well from which the observation image was acquired, and the plate. Information such as observation time is stored.
[0032]
The processing unit 20 is connected to a display processing unit 23, an operation / input processing unit 24, a camera 10, an illumination device 5, an observation stage 9 b, a carry-in opening / closing mechanism 25, a transport unit 7, and a temperature control unit 26. The temperature control unit 26 adjusts the temperature of the temperature-controlled room 2 in accordance with a temperature command sent from the host computer 15 via the processing unit 20. Thereby, the temperature inside the temperature-controlled room 2 is kept at the set temperature.
[0033]
In accordance with a control signal from the processing unit 20, the transport unit 7 transports the crystallization plate 6 in the temperature-controlled room 2, that is, stores the crystallization plate 6 that is carried in through the inlet 2 a provided in the temperature-controlled room 2. 5, a conveying operation such as an operation of storing in the predetermined storage unit 5 a and an operation of taking out the crystallization plate 6 from the storage unit 5 a and setting it to the observation unit 9 is performed. The loading / unloading opening / closing mechanism 25 opens and closes the loading / unloading port 2 a according to a control signal from the processing unit 20.
[0034]
Further, the processing unit 20 controls the observation stage 9b, the illumination device 11, and the camera 10 to move the crystallization plate 6 held on the observation stage 9b, illuminate the crystallization plate 6 with the illumination device 11, and protein by the camera 10. An image of the solution is taken. The display processing unit 23 displays an observation image captured by the camera 10 and various processed images, and also performs a process of displaying a guide image at the time of data input on the display unit of the control panel 4. The operation / input processing unit 24 inputs an operation command and data to the processing unit 20 by operating an input device such as the control panel 4.
[0035]
Next, the protein crystal detection processing function will be described with reference to the functional block diagram of FIG. In FIG. 9, the differential processing unit 30 performs differential processing on the observation image (see FIG. 13) stored in the observation image storage unit 21 b, that is, the image of the protein solution captured by the camera 10, thereby changing the luminance change. A differential image composed of luminance change information indicating the size is generated (see FIG. 14). Here, the luminance change information is a numerical value (luminance change value) that indicates the rate of change in luminance at each pixel constituting the observation image.
[0036]
In the observation image, the luminance change is small in a region where an observation target does not exist, such as a background region or a portion through which illumination light is transmitted, and the luminance change is large in a portion corresponding to the contour of the protein crystal to be detected. Therefore, in the above-described differential image, the outline of the observation object captured in the image is extracted as a portion having a large luminance change.
[0037]
However, in this differential image, not only the protein crystals that are the detection target, but also solid foreign matters such as precipitates other than crystals existing in the protein solution, the shape of the liquid holding portion 6b in the well 6a, and the droplets Similarly, since the contour and the like are also extracted as a portion having a large luminance change, a noise removal process (described later) for removing a portion having a large luminance change other than the detection target as noise is performed.
[0038]
The differential image storage unit 31 stores the differential image generated by the differential processing unit 30. The binarization processing unit 32 binarizes the differential image stored in the differential image storage unit 31 with a threshold value for extracting a characteristic portion, thereby leaving luminance change information indicating a large luminance change among the luminance change information as a feature portion. A binarized image is obtained (see FIG. 15). The binarized image storage unit 33 stores the binarized image obtained by the binarization processing unit 32. The crystallization determination unit 34 determines the presence or absence of protein crystals from the characteristic part of the binarized image stored in the binarized image storage unit 33.
[0039]
Here, mask processing and noise removal processing described below are performed on the differential image that is the target of the binarization processing by the binarization processing unit 32. For the purpose of recognizing noise to be removed, binarization processing and thinning processing for noise extraction are executed prior to noise removal processing.
[0040]
First, mask processing will be described. The mask information storage unit 36 is mask information, that is, luminance change information that appears in the differential image due to the shape of the crystallization plate 6 that is a crystallization container that holds the protein solution in the observation image (the shape of the liquid holding unit 6b). That is, among the noises included in the observation image of the protein solution to be originally observed, mask information for removing the container noise that appears due to the shape of the crystallization plate 6 as a container from the differential image (here, The diameter of the pocket provided in the liquid holding part 6b) is stored. The mask processing unit 35 performs mask processing for removing container noise from the differential image based on the mask information stored in the mask information storage unit 36. Thereby, the differential image from which the container noise is removed is obtained (see FIG. 15).
[0041]
Next, noise removal processing will be described. The noise removal processing performed here targets noise that cannot be taught in advance, such as noise that cannot be removed by the mask processing described above, such as the contour of a droplet of a protein solution that appears in the pocket at the top of the liquid holding portion 6b. It is. For this reason, here, the noise recognition processing unit 38 recognizes which portion is noise from the information in the differential image, and the noise removal processing unit 37 performs noise removal in the differential image based on the noise recognition result. Thereby, a differential image from which noise is removed is obtained (see FIG. 17).
[0042]
Here, as a noise recognition technique, based on the shape characteristics of the lines in the thinned image obtained by thinning the differential image, whether these lines are shape lines indicating the shape of the contour of the figure indicating the protein crystal, or the like. Alternatively, it is possible to identify whether the line is clearly different from the figure indicating the protein crystal such as the outline of the droplet.
[0043]
That is, in the noise recognition shown here, first, the binarization processing unit 39 binarizes the differential image stored in the differential image storage unit 31 with a threshold for noise extraction. The thinning processing unit 40 thins the binarized image that has been binarized. That is, each line element in the binarized image is replaced with a thin line having a width of one pixel. As a result, a thinned image composed of a plurality of lines in which a range indicating a portion with a large luminance change in the differential image is thinned is generated (see FIG. 16).
[0044]
Accordingly, the binarization processing unit 39 and the thinning processing unit 40 generate a thinned image that obtains a thinned image composed of a plurality of lines by binarizing the differential image with a threshold for noise extraction and then performing the thinning process. Parts. The thinned image storage unit 41 stores the thinned image generated by the thinned image generation unit.
[0045]
The noise recognition processing unit 38 detects lines regarded as noise by individually recognizing the shapes of a plurality of lines included in the thinned image of the thinned image storage unit 41. The noise removal processing unit 37 uses the differential image stored in the differential image storage unit 31 to obtain the luminance change information corresponding to the line detected as noise by the noise recognition processing unit 38 and the differential image stored in the differential image storage unit 31. Remove more.
[0046]
Here, when the noise recognition processing unit 38 detects a line regarded as noise, a plurality of algorithms are used as described later. That is, the first algorithm that obtains the length of the line and the number of branches, recognizes the line having a length exceeding the predetermined value and the number of branches as noise, the line length and linearity, and the length is a predetermined value A second algorithm that considers lines with high linearity exceeding noise as noise, and further calculates the length of the line and the degree of dispersion of the line with respect to the approximate straight line, and noise with a length exceeding the predetermined value and a small degree of dispersion is determined as noise. Three of the third algorithms that are considered to be used are properly used or used together as necessary.
[0047]
Note that, in the container noise removal process by the mask processing unit 35 and the noise removal process by the noise removal processing unit 37, the above example shows an example in which the differential image stored in the differential image storage unit 31 is executed as a processing target. The binarized image stored in the binarized image storage unit 33 may be configured to execute the container noise removal processing by the mask processing unit 35 and the noise removal processing by the noise removal processing unit 37 on the target.
[0048]
This protein crystal observation apparatus is configured as described above. Next, an observation operation for detecting a protein crystal will be described with reference to the flowchart of FIG. This observation operation is performed by the processing unit 20 executing the observation operation program 22b. At the start of the observation operation, the crystallization plate 6 carried in from the upstream device via the carry-in port 2a is stored in the storage unit 5a. Contained and stored.
[0049]
First, in FIG. 10, the designated crystallization plate 6 is taken out by the transport unit 7 and moved to the observation stage 9c (ST1). Then, the top well 6a is positioned at the observation position immediately below the camera 10 (ST2). Thereafter, the lighting device 11 is turned on, and image capture is executed by the camera 10 (ST3). Thereafter, a protein crystal detection process described later is executed (ST4).
[0050]
When the protein crystal detection process for this well is completed, the presence or absence of the next well is determined (ST5). If there is a next well, the next well is positioned at the observation position (ST6), and the process returns to (ST3) to repeat the same processing. If it is determined in (ST5) that there is no next well, the crystallized plate 6 that has been processed is returned to the storage unit 5a. Then, the end of the observation operation is notified to the host computer 15, and the observation operation execution process is terminated.
[0051]
In the above-described observation operation, all operations can be performed without taking out the crystallization plate 6 from the temperature-controlled room 2 to the outside. Compared with the method of taking out the crystallization plate every time of observation, the crystallization plate The screening accuracy can be improved by eliminating variations in the crystal growth conditions due to changes in the temperature conditions of the crystal, and there is no clouding of the observation field due to condensation that occurs when the crystallization plate is exposed to room temperature from the cooled state. Good observation results can be obtained, and observation work for protein crystal detection can be performed efficiently and with high reliability.
[0052]
Next, the observation image captured in (ST3) and the protein crystal detection process executed in (ST4) will be described. First, the temporal change of the protein solution 13 to be observed will be described with reference to FIG. As described above, at the start of crystallization generation, droplets of the protein solution 13 to which a predetermined ratio of the crystallization solution 12 is added are placed on the liquid holding unit 6b of the well 6a (see FIG. 5). FIG. 12A shows a cross section of the liquid holding unit 6b at the initial stage of crystallization generation. At this stage, the droplet of the protein solution 13 is in a state of substantially filling the pocket of the liquid holding unit 6b. There are no protein crystals yet.
[0053]
Here, when the crystal growth conditions, that is, the composition / concentration of the crystallization solution 12 and the storage temperature are suitable, the crystallization proceeds in the protein solution 13 with time. FIG. 12B shows a cross section of the liquid holding portion 6b in a state where crystallization has progressed to some extent. In this state, as the solvent component in the protein solution 13 gradually evaporates, the droplet outline (indicated by the arrow B) becomes smaller as the droplet shrinks in the pocket of the liquid holding unit 6b. It moves to the inside of the pocket rather than the state. The protein crystal 13a in which the protein contained in the droplet is crystallized remains on the bottom of the pocket exposed by the reduction of the droplet. Furthermore, crystallization proceeds also inside the droplets, and protein crystals 13a are generated.
[0054]
FIG. 13 shows an observation image in the state shown in FIG. 12 (b), and is an image obtained by capturing a droplet in a state where the evaporation of the solvent has progressed to some extent in the pocket of the liquid holding unit 6b and the volume is reduced from above. It is included. In this observation image, as shown in FIG. 13, the annular portion A (indicated by the sparse hatching portion) indicating the top of the liquid holding portion 6b is relatively high in the low-luminance background image (indicated by the dense hatching portion). Appears in brightness.
[0055]
In the inner pocket of the annular portion A, a droplet of the protein solution 13 appears as an image with different brightness depending on the portion. Here, the portion where the droplet does not exist inside the annular portion A becomes a high-luminance portion by transmitting illumination light (see FIG. 12B) from below, and the contour of the droplet of the protein solution 13 B clearly appears in the observed image due to the contrast with the high-luminance portion. Further, along the inner periphery of the annular portion A, a partially linear high-intensity portion C appears.
[0056]
The protein crystal 13a to be detected exists in the region inside the annular portion A. That is, among the protein crystals 13a existing inside the droplets of the protein solution 13, the protein crystals 13a existing near the focus level f (see FIG. 12B) by the camera 10 are shown in the observation image of FIG. The focus degree is high and clearly appears, and the protein crystal 13a located at a position deviating from the focus level f has a low focus degree and appears in a blurred outline. Similarly, the protein crystal 13a outside the droplet existing in the form left on the surface of the pocket also appears with a blurred outline with a low focus degree. In addition to this, solid foreign matters such as precipitates that have not been crystallized exist in the observed image.
[0057]
In the detection of protein crystals, it is difficult to accurately identify these figures appearing in the observation image by visual observation, and the protein crystals to be detected cannot be detected efficiently with high reliability. In the protein crystal detection method shown in the embodiment, when the processing unit 20 executes the crystal detection program 22a stored in the program storage unit 22, the protein crystal detection process shown in the flow of FIG. The crystal is automatically identified.
[0058]
First, differential processing is performed on the observed image (ST11). That is, the differential image composed of the luminance change information indicating the magnitude of the luminance change is generated by differentiating the observation image of the protein solution stored in the observation image storage unit 21b in advance (differential processing step). Thereby, as shown in FIG. 14, the shape line indicating the outer shape of the protein crystal 13a appearing in the observation image of FIG. 13, the outline B of the droplet, the high brightness portion C on the inner periphery of the annular portion A, etc. The portion where the luminance change is large appears with high luminance. Note that the differential image is a multi-value image in which each pixel originally appears with brightness corresponding to the luminance change value, but in FIG. 14, it is represented as a black and white binary image for convenience of illustration.
[0059]
Next, mask processing is performed on this differential image (ST12). Here, the luminance change information derived from the liquid holding unit 6b of the crystallization plate 6 holding the protein solution 13 is removed from the differential image (container noise removing step). The container noise removal is based on mask information previously taught as the shape of the liquid holding unit 6b of the crystallization plate 6 and removing luminance change information in a predetermined area where the protein solution 13 is not likely to be held. Is done.
[0060]
Here, the luminance change information in the differential image shown in FIG. 14 includes a portion having a large luminance change outside the range where the protein solution 13 is held, that is, the inner peripheral portion of the annular portion A shown in FIG. Thus, a portion having a large luminance change appearing in the outer region is removed as noise. As a result, as shown in FIG. 15, a differential image (mask processing) including only a region where a protein crystal may exist is obtained.
[0061]
The differential image that has been masked in this way is binarized with a threshold for noise extraction, and further thinned (ST13). FIG. 16 shows a thinned image obtained by this thinning process. The high-luminance portion in the differential image, that is, the shape line of the protein crystal 13a, the outline of the droplet, and the like all have a width of one pixel. It has been replaced by a line. Then, noise extraction is performed based on the thinned image created in this way. That is, the noise included in the thinned image is recognized (ST14).
[0062]
Here, an example of a noise recognition method will be described with reference to FIG. In any of the examples shown in FIG. 19, a line having a certain continuous length, such as a line corresponding to the above-described contour B, is detected as noise that does not match the characteristic shape of the protein crystal. Here, a plurality of lines in the thinned image are labeled for each group, and among the individual labels, a label whose line length exceeds a predetermined value is recognized as to whether or not it corresponds to noise. Like to do. In this case, since labeling is performed on the thinned image, the label area itself indicates the length of the line in each label.
[0063]
FIG. 19A shows a first algorithm for this noise recognition. First, for a label whose line length exceeds a predetermined value, a branch point where the line constituting the label branches is obtained, and whether or not it is noise is determined based on the obtained number of branch points. For example, in the example of the label L1 shown in (a) of FIG. 19A, although the length of the line n is equal to or longer than a predetermined value, it is not regarded as noise because there are many branch points P.
[0064]
On the other hand, in the example of the label L2 shown in (b), the length of the line n is not less than the predetermined value, and there is only one branch point P, which exceeds the determination value for determining that “the number of branches is small”. Because it is not, it is regarded as noise. That is, in the first algorithm example, in the noise recognition step, the length of the line and the number of branches are obtained, and a line having a length exceeding a predetermined value and a small number of branches is regarded as noise. As another method for determining whether or not the noise is based on the number of branch points, if the value obtained by dividing the length of the line by the number of branches does not exceed the predetermined length, You may make it judge.
[0065]
FIG. 19B shows the second algorithm. Here, for a label whose line length exceeds a predetermined value, it is determined whether or not it is noise by determining the linearity of the line constituting the label. For example, in the label L3 shown in FIG. 19B, a search is made for the line n constituting the label, and the line n that starts the search from the search start point PS is within the range of the search allowable width V defined in advance at the search end point PE. If it is within the range, it is determined that the linearity is high, and this line n is determined as noise. That is, in the second algorithm example, in the noise recognition step, the length and linearity of the line are recognized, and a line having a length exceeding a predetermined value and high linearity is regarded as noise.
[0066]
Further, FIG. 19C shows a third algorithm. Here, it is determined whether or not it is noise by obtaining the degree of dispersion of the plurality of lines constituting the label with respect to the approximate straight line. For example, in a label L4 shown in FIG. 19C (A), an approximate straight line AN that approximates the entire plurality of lines n constituting the label is obtained. Then, the degree of dispersion of the line n with respect to the approximate straight line AN is determined within a predetermined frame M sandwiching the neighborhood straight line AN. In this case, since the plurality of lines n are in a complicated state, the degree of dispersion is large and is not regarded as noise.
[0067]
On the other hand, in the example of the label L5 shown in (b), the line n is substantially along the approximate straight line AN and is regarded as noise because the degree of dispersion with respect to the approximate straight line AN is small. That is, in the third algorithm example, in the noise recognition step, the length of the line and the degree of dispersion of the line with respect to the approximate straight line are obtained, and a line having a length exceeding a predetermined value and a small degree of dispersion is regarded as noise. Yes.
[0068]
If noise is recognized in this way, noise removal processing is performed to remove lines detected as noise from the differentiated differential image (ST15). That is, in (ST13), (ST14), and (ST15), a differential image is binarized with a threshold for noise extraction and then thinned, thereby obtaining a thinned image composed of a plurality of lines (thinning). Image generation step).
[0069]
Then, by recognizing the shape of multiple lines included in the generated thinned image individually, the line regarded as noise is detected (noise recognition process), and the luminance corresponding to the noise line detected in the noise recognition process Change information is removed from the differential image (noise removal step). FIG. 17 shows a differential image (noise removal) from which noise has been removed in this way.
[0070]
Thereafter, feature portions that are highly likely to correspond to protein crystals are extracted. First, the differential image (noise removal) is binarized with a threshold value for extracting characteristic portions (ST16). That is, by binarizing the differential image with the threshold value for extracting the feature portion, a binary image in which luminance change information indicating a large luminance change is left as a feature portion is obtained (binarization processing step). The threshold used here is set to a value higher than the above-described threshold for noise extraction.
[0071]
Further, in the binarization processing step, labeling is performed on the characteristic portion, and processing for erasing others while leaving only labels whose area is larger than a predetermined value is performed. As a result, small features that are less likely to be protein crystals are regarded as noise and removed. FIG. 18 shows the binarized image obtained in this way, and only the characteristic portion that is highly likely to be a protein crystal appears in this image. Then, it is stored in the obtained binarized image storage unit 33.
[0072]
Note that the container noise removal process and the noise removal process described above may be performed on the binarized image stored in the binarized image storage unit 33. In this case, among the characteristic portions remaining in the binarized image, those corresponding to the detected line regarded as noise are removed from the binarized image.
[0073]
Thereafter, crystallization determination is performed on the obtained binarized image (ST17). For example, when there are few feature parts in the binarized image, it is judged that there is no possibility that crystallization is progressing, and when there are many feature parts, it is judged that crystallization is likely progressing. To do. The small and large number of feature portions is determined by comparing the total area corresponding to the feature portions with a predetermined value. That is, here, the presence or absence of protein crystals is determined from the characteristic part of the binarized image (crystallization determination step).
[0074]
If it is determined that there is no possibility of crystallization, the process is terminated. If it is determined in (ST18) that there is a possibility of crystallization, crystallization plate information, well information, observation image, observation time indicating the crystallization plate 6 from which the target observation image was obtained in the processing. Is stored in the crystallization information storage unit 21c (ST19), and the protein detection process for the observed image is terminated.
[0075]
As described above, in the protein crystal detection shown in the present embodiment, the portion corresponding to the contour of the protein crystal to be detected is first extracted as a portion having a large luminance change by differentiating the image of the protein solution. To do. Then, a binarized image in which a portion showing a large luminance change is left as a feature portion is obtained by dividing the portion where the luminance change is large by a threshold value for extracting the feature portion. The presence / absence of protein crystals is determined from the characteristic portion of the binarized image. Thereby, it is possible to eliminate variations in the efficiency of the crystal detection work and the reliability of the detection results due to differences in personal skill level, and it is possible to detect protein crystals efficiently and with high reliability.
[0076]
In the embodiment described above, the mask processing unit 35 and the noise removal processing unit 37 perform processing so that no noise is included in the characteristic portion of the binarized image. However, noise may be generated depending on the shape of the container, lighting conditions, and the like. When an observation image that hardly includes is obtained, the processing in the mask processing unit 35 and the noise removal processing unit 37 can be omitted.
[0077]
In the above embodiment, an example in which the protein crystal detection unit is configured by the camera 10 and the processing unit 20 that executes the crystal detection program 22a has been described. However, as a protein crystal detection unit, Japanese Patent Laid-Open No. 6-1116098 discloses. As disclosed, irradiating means for irradiating a protein solution of a crystallization solution with a light beam such as a laser beam, and crystallization for detecting the diffusion state of the irradiated light beam and determining the crystal formation state in the protein solution What provided the judgment part may be used.
[0078]
In the above embodiment, an example (see FIG. 8) in which the crystal detection processing function and the crystallization information storage function are included in the protein crystal observation apparatus 1 has been shown, but the configuration shown in FIG. 20 may be adopted. Good. In this example, the crystal detection processing function and the crystallization information storage function are provided not in the protein crystal observation apparatus 1A but in the host computer 15A.
[0079]
That is, each function of the observation image storage unit 21b, the crystal detection program 22a, the processed image storage unit 21a, and the crystallization information storage unit 21c shown in FIG. 8 is a part of the function of the host computer 15A, and the crystal detection program 22a. The host computer 15A that executes the above processing constitutes an image processing unit that processes the image data of the protein solution captured by the camera 10 to detect crystals in the protein solution.
[0080]
The functions of the processed image storage unit 21a and the crystallization information storage unit 21c are excluded from the data storage unit 21A of the protein crystal observation apparatus 1A, and the crystal detection program 22a is excluded from the program storage unit 22A. By adopting such a configuration, only the crystal detection process is separated and executed at a remote location away from the protein crystal observation apparatus 1A provided with the temperature-controlled room 2, and necessary crystallization information is acquired and accumulated. Is possible.
[0081]
【The invention's effect】
According to the present invention, a storage unit that accommodates a plurality of crystallization containers, an observation stage on which a crystallization container to be observed is set, and a protein solution in the crystallization container set on the observation stage is observed to obtain image data. Since the camera and the transport means for transporting the crystallization container between the storage unit and the observation stage are arranged in the temperature-controlled room, the observation work can be performed without taking the crystallization container out of the temperature-controlled room over time. It is possible to perform observation work for protein crystal detection efficiently and with high reliability.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view of a protein crystal observation apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a perspective view of a protein crystal observation apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a cross-sectional view of a protein crystal observation apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a perspective view of a crystallization plate used in the protein crystal observation apparatus of one embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a partial cross-sectional view of a crystallization plate used in the protein crystal observation apparatus of one embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a partial cross-sectional view of an observation unit of the protein crystal observation device according to one embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a partial cross-sectional view of a crystallization plate used in the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a block diagram showing a configuration of a control system of the protein crystal observation apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a functional block diagram showing processing functions of the protein crystal observation apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a flow chart of an observation operation in the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a flowchart showing a protein crystal detection method according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a partial cross-sectional view of a crystallization plate used in the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a diagram showing an observation image in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 14 is a diagram showing a differential image in the protein crystal detection method according to one embodiment of the present invention.
FIG. 15 is a diagram showing a differential image (mask processing) in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 16 is a diagram showing a thinned image in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 17 is a diagram showing a differential image (noise removal) in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 18 is a diagram showing a binarized image in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 19 is an explanatory diagram of noise recognition processing in the protein crystal detection method of one embodiment of the present invention.
FIG. 20 is a block diagram showing the configuration of the control system of the protein crystal observation device of one embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
2 constant temperature room
5 Storage department
6 Crystallization plate
6a well
6b Liquid holding part
6c Liquid storage part
7 Transport unit
8 Plate holding head
9 Observation part
9b Observation stage
10 Camera
12 Crystallization solution
13 Protein solution
13a protein crystals
20 processor
21a Processed image storage unit
21b Observation image storage unit
21c Crystallization information storage unit
22a Crystal detection program
22b Observation operation program
30 Differential processing unit
31 Differential image storage unit
32 Binarization processing part (feature part extraction)
33 Binary image storage unit
34 Crystallization judgment part
35 Mask processing section
37 Noise removal processing unit
38 Noise recognition processor
39 Binarization processing unit (noise extraction)
40 Thinning processing section

Claims

A protein crystal observation device for observing protein crystals in a protein solution held in a crystallization vessel, comprising a temperature-controlled room, temperature control means for controlling the temperature in the temperature-controlled room, and a doorway opening / closing mechanism for the temperature-controlled room. A port for carrying the crystallization vessel into the temperature-controlled room, a storage unit for storing the crystallization vessel in a plurality of storage units, an observation stage on which the crystallization vessel to be observed is set, and A camera that observes the protein solution in the crystallization vessel set on the observation stage and captures the image data thereof, and the crystallization vessel carried in from the carry-in port is housed in a designated storage unit of the storage unit, and A transporting means for transporting the crystallization container between the storage unit and the observation stage, and the storage unit, the observation stage, the camera and the transporting means are arranged in the temperature-controlled room. Protein crystal observation apparatus characterized by.

A protein crystal observation device for detecting protein crystals from a protein solution held in a crystallization vessel, which is opened and closed by a temperature-controlled room for controlling the temperature in the temperature-controlled room, and a temperature control means for controlling the temperature in the temperature-controlled room Detecting protein crystals generated in the protein solution in the crystallization container, and a storage port for storing the crystallization container in a plurality of storage units, and a carry-in port for bringing the crystallization container into the temperature-controlled room. A protein crystal detection means for storing the crystallization container carried in from the carry-in entrance in a designated storage section of the storage section, and transporting the crystallization container between the storage section and the protein crystal detection means. A protein crystal observation apparatus, wherein the storage unit, the protein crystal detection means, and the transport means are arranged in the temperature-controlled room.

The protein crystal detection means includes an observation stage on which a crystallization container to be observed is set, a camera for observing a protein solution in the crystallization container set on the observation stage and capturing the image data, and the image data The protein crystal observation apparatus according to claim 2, further comprising an image processing unit that detects the crystals in the protein solution.

The protein crystal detection means includes an irradiation means for irradiating the protein solution in the crystallization container with a light beam, and a crystallization determination unit for detecting a diffusion state of the irradiated light beam and determining a crystal generation state in the protein solution. The apparatus for observing protein crystals according to claim 2.