JP3957386B2 - Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance - Google Patents

Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance Download PDF

Info

Publication number
JP3957386B2
JP3957386B2 JP01484298A JP1484298A JP3957386B2 JP 3957386 B2 JP3957386 B2 JP 3957386B2 JP 01484298 A JP01484298 A JP 01484298A JP 1484298 A JP1484298 A JP 1484298A JP 3957386 B2 JP3957386 B2 JP 3957386B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
present
peptidoglycan
body fluid
glucan
βgrp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP01484298A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH11196895A (en
Inventor
弘志 田村
重則 田中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seikagaku Corp
Original Assignee
Seikagaku Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seikagaku Corp filed Critical Seikagaku Corp
Priority to JP01484298A priority Critical patent/JP3957386B2/en
Publication of JPH11196895A publication Critical patent/JPH11196895A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP3957386B2 publication Critical patent/JP3957386B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫体液反応性物質の特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット等に関する技術分野の発明であり、具体的には下記二つに大別される。
一方は、ペプチドグリカンの特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット及びプロフェノールオキシダーゼカスケードにおける(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。より詳細には、昆虫体液中に認められるプロフェノールオキシダーゼカスケードにおける(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を抑制して、ペプチドグリカンのみを特異的に測定することが可能なペプチドグリカンの特異的測定剤、同測定方法並びに同測定用キット及びこれらのペプチドグリカンの特異的測定剤等に用い得る(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。
本明細書中においては、これらの一方の発明を単に「ペプチドグリカン関連発明」という。
【０００２】
他方は、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット及びプロフェノールオキシダーゼカスケードにおけるペプチドグリカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。より詳細には、昆虫体液中に認められるプロフェノールオキシダーゼカスケードにおけるペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制して、(1→3)-β-D-グルカンのみを特異的に測定することが可能な(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤、同測定方法並びに同測定用キット及びこれらの(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤等に用い得るペプチドグリカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。
本明細書中においては、これらの他方の発明を単に「(1→3)-β-D-グルカン関連発明」という。
【０００３】
【従来の技術】
ペプチドグリカン（以下、ＰＧともいう）は細菌類の細胞壁構成成分で、Ｎ−アセチルムラミン酸又はＮ−グリコリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖ペプチドのポリマーで、熱に対して非常に安定な物質として知られている。ＰＧは発熱性、肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等、多くの生物活性を有しており、医学、薬学、微生物学等の分野で盛んに研究されている。
【０００４】
また、(1→3)-β-D-グルカン（以下、βＧともいう）類は、酵母、カビ、キノコ等の真菌類、植物などの細胞壁成分として、自然界に広く分布している多糖であり、構造も多様である(Aketagawa,J., Tamura,H.,and Tanaka,S., J.Antibact.Antifung.Agents, 23, 7, 413-419(1995)）。βＧはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導等を含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性等の多彩な生物活性を示す。さらに、βＧはアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、体内に入ったβＧ類がエンドトキシンの作用を増強するとの報告もあり、異物として血中に流入することは好ましいことではなく、医薬品並びに医療用具等への混入も医療上重大な問題になりつつある。
【０００５】
一方、昆虫体液には、体液のメラニン化に関与する、プロフェノールオキシダーゼ（以下、ＰｒｏＰＯともいう）カスケードと呼ばれる、一連の酵素群からなるカスケード系が存在していることが知られている。ＰＧ及びβＧがこのカスケード系の引き金となり、カスケード反応を経て、最終的にメラニンが生成する［Onishi,Annot.Zool.Jpn.,27,33-39(1954)；Ashida and Onishi,Arch.Biochem.Biophys.,122,411-416(1967)；Brunet,Insect Biochem.,10,467-500(1980)；Ashida and Yamazaki,Molting and Metamorphosis,239-265,Japan Sci.Soc.Press(1990)；Ashida and Dohke,Insect Biochem.,10,37-47(1980)］。
【０００６】
ＰｒｏＰＯカスケードを図１に示す。なお図１中の略号は以下の通りであり、本明細書中においても必要に応じて以下の略号を用いる。
ＰＧＲＰ ：ペプチドグリカン認識タンパク質（分子量約19ｋＤａ）
βＧＲＰ ：(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質（分子量約62ｋＤａ）
ＰｒｏＰＰＡＥ：プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素前駆体
ＰＰＡＥ ：プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素
ＰｒｏＰＯ ：プロフェノールオキシダーゼ
ＰＯ ：フェノールオキシダーゼ
ＤＯＰＡ ：L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン
【０００７】
ＰＧＲＰはＰＧを特異的に認識し、βＧＲＰはβＧを特異的に認識する。ＰＧＲＰやβＧＲＰによってＰＧやβＧの存在が認識されると、これらの認識タンパク質が活性化されて酵素活性が発現し、それに続くカスケードの一連の反応が開始する。なお本明細書中において、ＰＧがＰＧＲＰによって認識されることで開始されるカスケード反応をペプチドグリカン認識タンパク質系反応（以下、ＰＧＲＰ系反応ともいう）といい、βＧがβＧＲＰによって認識されることで開始されるカスケード反応を(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応（以下、βＧＲＰ系反応ともいう）という（図１参照）。
【０００８】
以下、本発明に最も近いと思われる先行技術について、ペプチドグリカン関連発明と、(1→3)-β-D-グルカン関連発明とに分けて説明する。
１．ペプチドグリカン関連発明に関する先行技術について
（１）カイコの血液中に存在するＰｒｏＰＯカスケードを利用した試薬が、和光純薬工業株式会社から「ＳＬＰ試薬」として発売されている。しかしこの試薬は、ＰＧ及びβＧのいずれにも反応するため、ＰＧを特異的に測定することができない。
【０００９】
（２）特公平７−１１４７０７号公報（特開平６３−１４１５９９号公報）には、「昆虫体液からβＧと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られる、βＧとは反応せずにＰＧと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るＰＧ測定用試薬」が開示されている。この試薬の調製方法の概略は以下の通りである：
まず、βＧＲＰを活性化して酵素活性を発現させるβＧの一種であるカードランを、種々の薬剤と器具を用い、種々の工程を経てビーズに固定化することによってカードランビーズカラムを調製する。このカードランビーズカラムに昆虫血漿を接触させて、昆虫血漿中のβＧＲＰをカードランビーズカラムに結合させ、素通り液を得る。この素通り液を飽和硫酸アンモニウム溶液中に滴下し、一晩撹拌し、遠心分離して沈殿を集め、その沈殿を緩衝液で再溶解し、その緩衝液に対して透析し、再び遠心分離して、その上清を得る。
【００１０】
このように、この試薬の調製には極めて多種類の薬剤、器具、装置を必要とし、操作も極めて煩雑であり、さらに非常に長い時間を要する。
また、(A)多種類の薬剤、器具、装置を用いるので、ＰＧ測定用試薬の調製中にＰＧやβＧが混入し、ＰｒｏＰＯカスケードが活性化されてしまう可能性が高いこと、(B)ＰＧ測定用試薬の調製の操作が煩雑なため、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下や酵素自体の損失の可能性が高いこと、(C)ＰＧ測定用試薬の調製に非常に多くの時間を費やすので、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下の可能性が高まることなど、種々の問題点を有している。
【００１１】
さらに都合の悪いことに、この試薬は、上記のように昆虫血漿をカードランビーズカラムに接触させてβＧＲＰをカードランビーズカラムに結合させ、次いで昆虫血漿からカードランビーズカラムに結合したβＧＲＰを除去することにより調製されるが、この試薬の調製過程において、カードランにβＧＲＰを結合させる際に、βＧＲＰが活性化され、これによってβＧＲＰ系反応が活性化されてしまうのである。
すなわち昆虫血漿中のＰｒｏＰＯカスケードを試薬調製の段階で進行させてしまうという点においてこの試薬は致命的であり、この試薬を用いてＰＧを測定することは極めて困難である。
このことは、後述する比較例の結果からも明らかであり、事実、このような試薬は現在に至るまで全く実用化されていない。
【００１２】
（３）ＷＯ９０／０２９５１号公報には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを有効成分とするカブトガニ・アメボサイト・ライセートＧ因子活性化阻害剤や、この特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドをカブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、ＬＡＬともいう）に添加してエンドトキシンに特異的なリムルステスト試薬を得る方法等が開示されている。
【００１３】
（４）特開平８−１２２３３４号公報には、βＧ類のポリカルボン酸誘導体またはグリセリル誘導体を有効成分とするカブトガニ・アメボサイト・ライセートＧ因子活性化阻害剤や、βＧ類のポリカルボン酸誘導体またはグリセリル誘導体をＬＡＬ試薬に共存させることを特徴とするエンドトキシンの特異的測定剤やその製造法等が開示されている。
【００１４】
（５）特開平４−１０２０６４号公報には、ＬＡＬに(1→3)-β-D-グルカン感受性因子に対する抗体を共存させてなる、エンドトキシン特異的な測定剤が開示されている。また、(1→3)-β-D-グルカン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、ＬＡＬを接触させて得た(1→3)-β-D-グルカン感受性因子不含ライセートからなる、エンドトキシン特異的な測定剤が開示されている。
【００１５】
（６）特開平６−２５８３２６号公報には、ＬＡＬにアプロチニンを共存させてなる、エンドトキシン特異的測定剤が開示されている。
（７）特開平７−１０３９８２号公報には、ＬＡＬにアルキルグルコシドを共存させてなる、エンドトキシンの特異的測定剤が開示されている。
【００１６】
（８）ＷＯ９６／０６８５８号公報には、ＬＡＬ及び／又は検体に(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質を共存させることを特徴とする、エンドトキシンの特異的測定方法が開示されている。
【００１７】
（９）特開平４−１３４２６５号公報には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、ＬＡＬを接触させることを特徴とする、エンドトキシンに特異的に反応するＬＡＬの調製法が開示されている。
【００１８】
上記（３）〜（９）の公知文献は、いずれも「エンドトキシンに特異的なＬＡＬやその調製法」に関するものであり、「ペプチドグリカンに特異的な昆虫体液由来の試薬やその調製法」等については記載もないし示唆もない。なお、ＬＡＬにもカスケード系が存在しているが、昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとは以下の点で全く異なっている。
【００１９】
(A)ＬＡＬに存在するカスケードは血液凝固に関係するものであり、ＰｒｏＰＯカスケードは体色変化に関係するものである。
(B)ＬＡＬに存在するカスケードはエンドトキシンに反応するが、ＰｒｏＰＯカスケードはエンドトキシンに反応しない。またＬＡＬに存在するカスケードはＰＧに反応しないが、ＰｒｏＰＯカスケードはＰＧに反応する。
【００２０】
(C)ＬＡＬに存在するカスケードと昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとでは、カスケードを構成する酵素（因子）が完全に異なる。
(D)ＬＡＬに存在するカスケードはその詳細が明らかにされているが、昆虫体液に存在するカスケードはその一部しか明らかにされておらず、未知の部分が多い。
【００２１】
このように、ＬＡＬに存在するカスケードと昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとでは、カスケードの存在意義、カスケードを活性化する物質、カスケードを構成する酵素（因子）等が完全に異なっている。
従って、上記（３）〜（９）に開示されている特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドやβＧの誘導体を、ＬＡＬの代わりに昆虫体液に適用してＰＧ特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することは不可能と考えられてきた。事実、昆虫体液に特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドや、βＧの誘導体等を適用してＰＧ特異的試薬を得ることについては全く報告がなく、またこのような試薬も全く知られていない。
【００２２】
２．(1→3)-β-D-グルカン関連発明に関する先行技術について
（１）カイコの血液中に存在するＰｒｏＰＯカスケードを利用した試薬が、和光純薬工業株式会社から「ＳＬＰ試薬」として発売されている。しかしこの試薬は、ＰＧ及びβＧのいずれにも反応するため、βＧを特異的に測定することができない。
【００２３】
（２）特公平７−１１４７０６号公報（特開平６３−１４１５９８号公報）には、「昆虫体液からＰＧと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られる、ＰＧとは反応せずにβＧと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るβＧ測定用試薬」が開示されている。
【００２４】
この試薬の調製方法は、上記した特公平７−１１４７０７号公報（特開平６３−１４１５９９号公報）と同様に、極めて多種類の薬剤、器具、装置を必要とし、操作も極めて煩雑であり、さらに非常に長い時間を要する。よって、(A)多種類の薬剤、器具、装置を用いるので、βＧ測定用試薬の調製中にＰＧやβＧが混入し、ＰｒｏＰＯカスケードが活性化されてしまう可能性が高いこと、(B)βＧ測定用試薬の調製の操作が煩雑なため、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下や酵素自体の損失の可能性が高いこと、(C)βＧ測定用試薬の調製に非常に多くの時間を費やすので、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下の可能性が高まることなど、種々の問題点を有している。
【００２５】
さらに都合の悪いことに、この試薬は、前記のように昆虫血漿をＰＧビーズカラムに接触させてＰＧＲＰをＰＧビーズカラムに結合させ、次いで昆虫血漿からＰＧビーズカラムに結合したＰＧＲＰを除去することにより調製されるが、この試薬の調製過程において、ＰＧにＰＧＲＰを結合させる際に、ＰＧＲＰが活性化され、これによってＰＧＲＰ系反応が活性化されてしまうのである。
【００２６】
すなわち昆虫血漿中のＰｒｏＰＯカスケードを試薬調製の段階で作用させてしまうという点において、この試薬は致命的であり、この試薬を用いてβＧを測定することは極めて困難である。
このことは、後述する比較例の結果からも明らかであり、事実、このような試薬は現在に至るまで全く実用化されていない。
【００２７】
（３）特開平４−５２５５８号公報には、ＬＡＬにエンドトキシン感受性因子に対する抗体を共存させてなる、βＧ特異的な測定剤が開示されている。また、エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、ＬＡＬを接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセートからなる、βＧ特異的な測定剤が開示されている。
【００２８】
（４）特開平７−１２８３３７号公報には、三重らせん構造を主体とするβＧを含みうる試料(検体)を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドトキシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付すことを特徴とするβＧの測定方法が開示されている。
【００２９】
上記（３）及び（４）の公知文献は、いずれもＬＡＬに関するものであり、「(1→3)-β-D-グルカンに特異的な昆虫体液由来の試薬やその調製法」については記載もないし示唆もない。なお、ＬＡＬにもカスケード系が存在しているが、上述した通り、昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとは全く異なっている。
【００３０】
従って、上記（３）における「ＬＡＬ」を「昆虫体液」に置換し、かつ「エンドトキシン感受性因子に対する抗体」を「抗ＰＧＲＰ抗体」に置換することによって、ＰｒｏＰＯカスケードを活性化することなく、βＧに特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することは不可能と考えられてきた。また上記（４）における「ＬＡＬ」を「昆虫体液」に置換することによって、ＰｒｏＰＯカスケードを活性化することなく、βＧに特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することも不可能と考えられてきた。
事実、昆虫体液に抗ＰＧＲＰ抗体やアルカリ金属水酸化物等を適用して、βＧ特異的試薬を得ることについては全く報告がなく、またこのような試薬も全く知られていない。
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、昆虫体液を用いて検体中のＰＧを測定するに際し、昆虫体液添加に伴うβＧＲＰ系反応の影響を受けずに、ＰＧＲＰ系反応のみを利用して、ＰＧを実用的で簡便、迅速、高感度かつ特異的に測定する手段を、従来技術のような不都合なしに提供することである。
【００３２】
また本発明のもう一つの目的は、昆虫体液を用いて検体中のβＧを測定するに際し、昆虫体液添加に伴うＰＧＲＰ系反応の影響を受けずに、βＧＲＰ系反応のみを利用して、βＧを実用的で簡便、迅速、高感度かつ特異的に測定する手段を、従来技術のような不都合なしに提供することである。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の目的を達成するために、鋭意検討を重ねた。その結果、これまでβＧＲＰの「活性化」にのみ関与すると考えられてきたβＧのうち、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、全く意外にもβＧＲＰを阻害する作用を示し、かつＰＧＲＰ系反応が実質的に阻害されないこと等を見出して、本発明を完成した。
【００３４】
また、特定構造を有するポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド等を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に昆虫体液を接触させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードを実質的に活性化することなく、昆虫体液中のβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を特異的に吸着除去できること等を見出して、本発明を完成した。
【００３５】
また、本発明者らは、（１）抗ＰＧＲＰ抗体が、ＰＧによるＰＧＲＰの活性化を阻害する作用を示し、かつβＧＲＰ系反応が実質的に阻害されないこと、（２）強アルカリがＰＧを特異的に不活化する作用を示し、強アルカリで不活化されたＰＧはＰＧＲＰに認識されず、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されないこと等を見出して、本発明を完成した。
【００３６】
また、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に昆虫体液を接触させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードを実質的に活性化することなく、昆虫体液中のＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を特異的に吸着除去できること等を見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明者は本願において以下の発明を提供する。
【００３７】
まず、下記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードの (1 → 3)- β -D- グルカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、 (1 → 3)- β -D- グルカン認識タンパク質系反応抑制剤（以下、本発明βＧＲＰ抑制剤ともいう）を提供する。
【化４】
【００３８】
また、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤が共存している、ペプチドグリカン特異的測定剤（以下、本発明ＰＧ測定剤 (1) ともいう）を提供する。
【００３９】
また、上記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていないペプチドグリカン特異的測定剤（以下、本発明ＰＧ測定剤 (2) ともいう）を提供する。
【００４０】
また、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のペプチドグリカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、上記本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、この検体中のペプチドグリカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法 (1) ともいう）を提供する。
【００４１】
また、検体と、上記のペプチドグリカン特異的測定剤 (1) 〜 (2) とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法 (2) ともいう）を提供する。
【００４２】
また、上記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的に (1 → 3)- β -D- グルカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法 (3) ともいう）を提供する。
【００４３】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤 (1) 〜 (2) を含む、ペプチドグリカン特異的測定用キット（以下、本発明ＰＧ測定キットともいう）を提供する。
【００４４】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤 (1) 〜 (2) を含む、細菌検出用キット（以下、本発明細菌検出キットともいう）を提供する。
【００４５】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤 (1) 〜 (2) を含む、細菌感染症診断用キット（以下、本発明細菌診断キットともいう）を提供する。
【００４６】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、又は、強アルカリ、を有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードのペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、ペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤（以下、本発明ＰＧＲＰ抑制剤ともいう）を提供する。
【００４７】
また、昆虫体液に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体が共存している、 (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤（以下、本発明βＧ測定剤 (1) ともいう）を提供する。
【００４８】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていない (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤（以下、本発明βＧ測定剤 (2) ともいう）を提供する。
【００４９】
また、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を、あるいは、検体中に強アルカリを共存させて、この検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンを測定する、 (1 → 3)- β -D- グルカンの特異的測定方法（以下、前者の抗体を用いる方法を本発明βＧ測定方法 (1) ともいい、後者の強アルカリを用いる方法を本発明βＧ測定方法 (2) ともいう）を提供する。
【００５０】
また、検体と、前記本発明βＧ測定剤 (1) 〜 (2) とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンを測定する、 (1 → 3)- β -D- グルカンの特異的測定方法（以下、本発明βＧ測定方法 (3) ともいう）を提供する。
【００５１】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にペプチドグリカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の (1 → 3)- β -D- グルカンを測定する、 (1 → 3)- β -D- グルカンの特異的測定方法（以下、本発明βＧ測定方法 (4) ともいう）を提供する。
【００５２】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤 (1) 〜 (2) を含む、 (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定用キット（以下、本発明βＧ測定キットともいう）を提供する。
【００５３】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤 (1) 〜 (2) を含む、真菌検出用キット（以下、本発明真菌検出キットともいう）を提供する。
【００５４】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤 (1) 〜 (2) を含む、真菌感染症診断用キット（以下、本発明真菌診断キットともいう）を提供する。
【００５５】
なお、本発明において「実質的に」とは、この言葉のかかる状態が、いわゆる当業者において、その状態であると認識するのに十分な実質を具えている状態を意味するものである。例えば、「実質的にＰｒｏＰＯカスケード，ＰＧＲＰ系反応又はβＧＲＰ系反応を活性化しない（若しくはされていない）」とは、これらが全く活性化しない（若しくはされていない）、又は活性化している（若しくはされている）としても、その活性化の度合いが極僅かであって、いわゆる当業者において検出できない，若しくは検出できたとしても極微量であって、測定誤差範囲内と認識される状態であることを意味するものである。
【００５７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
１．本発明測定剤について
＜１＞本発明測定剤
本発明測定剤は、第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質の両方に反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液（本明細書中において単に「昆虫体液」と称した場合、「昆虫体液及び／又はその成分」を意味する）に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードの第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、第２の昆虫体液反応性物質の特異的測定剤である。
【００５８】
第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質に反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液は、後述の＜３＞において記載される昆虫体液が挙げられる。第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質はそれぞれ異なる物質であり、具体的にはＰＧ及びβＧのいずれかである。すなわち第１の昆虫体液反応性物質がＰＧの場合は第２の昆虫体液反応性物質はβＧであり、第１の昆虫体液反応性物質がβＧの場合は第２の昆虫体液反応性物質はＰＧである。また、第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質系反応とは、第１の昆虫体液反応性物質が第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質によって認識されることで開始されるカスケード反応を意味する。
【００５９】
すなわち、本発明測定剤には下記２つの態様が包含されている。
(1)βＧ及びＰＧに反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードのβＧ認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、ＰＧの特異的測定剤。
【００６０】
(2)ＰＧ及びβＧに反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードのＰＧ認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、βＧの特異的測定剤。
本発明測定剤の実施の形態は、後述の＜３＞及び＜１２＞において述べられる測定剤の実施の形態と同様である。
【００６１】
２．ペプチドグリカン関連発明について
＜２＞本発明βＧＲＰ抑制剤
本発明βＧＲＰ抑制剤はβＧＲＰ系反応の抑制剤であり、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有する。より好ましくは、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつＰＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないβＧＲＰ抑制剤である。
【００６２】
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、βＧＲＰを活性化するβＧに競合してβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応因子に結合し、βＧＲＰ系反応を抑制し得る「競合的阻害物質」と、βＧＲＰを活性化するβＧ自体に結合してこれを失活させるか又はβＧを分解して失活させ、βＧＲＰを活性化させない「失活性阻害物質」とに大別される。
【００６３】
（１）本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる競合的阻害物質
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる競合的阻害物質は、上記の競合的な阻害作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲１▼〜▲５▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【００６４】
▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド
本明細書において「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」とは、
【化１】
【００６５】
で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位（Ｉ）が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを意味する。このポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分としては、(1→3)-β-D-グルコシド構造単位（Ｉ）が連続して３〜３１０個結合したものがより好ましく、４〜１８０個結合したものが特に好ましい。
【００６６】
なお、この特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドである限り限定されず、(1→3)-β-D-グルコシド結合のみから構成されるポリグルコシドのみならず、このポリグルコシドを主鎖とし、この主鎖中あるいは分岐構造中に(1→6)-β-D-グルコシドや(1→4)-β-D-グルコシドなどの構造を含むポリグルコシド等も含まれる。
【００６７】
これらの特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのうち、(1→6)-β-D-グルコシル分岐を有するポリグルコシドは、天然からは主に褐藻類やサルノコシカケ科等に属する担子菌類から得ることができる。具体例としてはLaminaria（コンブ属）やEisenia（アラメ属）由来のラミナリン、Sclerotinia属由来のスクレロタン、Schizophyllum属（スエヒロタケ）由来のシゾフィラン、Sclerotium属, Corticium属, Stromatinia属等に由来するスクレログルカン類、Lentinus属（シイタケ）由来のレンチナン等が挙げられる。
【００６８】
また、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのうち、(1→4)-β-D-グルコシド構造を有するポリグルコシドとしては、天然に存在するCetraria属、Usnea属、Evernia属等に由来するリケナンやオオムギ胚乳中に含まれるβ-グルカン等が挙げられる。
【００６９】
特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドとして、より具体的には下記の物質が挙げられ、かつ好ましい。
・分子量３４２〜１,６３８のラミナリオリゴ糖
・分子量１,８００〜３,２５８のラミナリデキストリン
・平均分子量２,０００〜６０,０００の(1→3)-β-D-グルカン
・平均分子量３,０００〜２３,０００のラミナリン
・平均分子量３,０００〜２０,０００のスクレロタン
・平均分子量５００,０００以下のシゾフィラン
・平均分子量１,１００,０００以下のレンチナン
・平均分子量１２,０００以下のパン酵母グルカン水可溶物
・平均分子量３３,０００以下のリヒエナン
・平均分子量２００,０００以下のオオムギβ−グルカン
【００７０】
これらの特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、その製造方法も限定されず、天然物由来のもの（これには、天然物由来の糖類から水で抽出される低分子性ポリグルコシドも含まれる）、天然物由来のポリグルコシドを酸又は酵素分解等により低分子化したもの、人工的に合成したもの等のいずれでもよい。
【００７１】
なお、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの具体的な製造方法はＷＯ９０／０２９５１号公報に開示されており、この方法に従って特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを製造することができる。
また、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」は、１種類の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」であってもよく、また２種類以上の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」の混合物であってもよい。
【００７２】
▲２▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体
本明細書において「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」とは、上記した式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドの誘導体を意味する。
【００７３】
より具体的には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのポリカルボン酸誘導体、グリセリル誘導体、グルコース残基の任意の水酸基（−ＯＨ）が、−ＯＲ〔Ｒはメチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、スルホプロピル基、硫酸基、リン酸基等又はそれらの塩（金属塩、アンモニウム塩若しくは有機アミン塩等）を表す〕としてして化学修飾されているもの等が挙げられ、かつ好ましい。
【００７４】
特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体として、より具体的には下記の物質が挙げられ、かつ好ましい。
・平均分子量４０,０００〜２４０,０００の部分カルボキシメチル化(1→3)-β-D-グルカンおよびその塩（置換度：０．００３〜１．０）
・平均分子量２３,０００以下の部分カルボキシメチル化ラミナリンおよびその塩（置換度：１．０以下）
・平均分子量８０,０００以下の部分メチル化(1→3)-β-D-グルカン（置換度：０．００３〜１．０）
・平均分子量２３,０００以下の部分硫酸化ラミナリンおよびその塩（置換度：１．０以下）
【００７５】
この「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」の具体的な製造方法は、ＷＯ９０／０２９５１号公報および特開平８−１２２３３４号公報に開示されており、これらの方法に従って特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体を製造することができる。
【００７６】
なお、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」は、１種類の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」であってもよく、また２種類以上の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」の混合物であってもよい。
【００７７】
上述した特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド及びその誘導体は、昆虫体液中に存在するβＧＲＰに対して、このβＧＲＰを活性化する物質であるβＧよりも速く強く結合して、βＧＲＰの活性型βＧＲＰへの変換を阻害する。よって、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド又はその誘導体を用いることによって、たとえβＧＲＰを活性化するβＧが混在していても、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００７８】
▲３▼抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体
抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体（以下、抗βＧＲＰ抗体ともいう）は、βＧＲＰに対する抗体であり、この抗体が昆虫体液中に存在するβＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、βＧＲＰを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗βＧＲＰ抗体は、βＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、βＧＲＰを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００７９】
ポリクローナル抗βＧＲＰ抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を、精製したβＧＲＰを抗原として免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。なお、被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので好ましい。
【００８０】
モノクローナル抗βＧＲＰ抗体は、例えば以下のようにして得られる。すなわち、▲１▼精製したβＧＲＰを抗原として、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから上記抗原に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。▲２▼こうして選別された細胞株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗βＧＲＰ抗体が得られる。
【００８１】
あるいは、マウスの腹腔等の生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗βＧＲＰ抗体を大量に製造することができる。
上記のハイブリドーマの調製を目的とした細胞融合に用いることができる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞、末梢血中のリンパ細胞等が挙げられる。またミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８２】
このようにして得られたポリクローナル抗βＧＲＰ抗体又はモノクローナル抗βＧＲＰ抗体の精製法としては、例えば硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱、ポリエチレングリコールや等電点による選択的沈澱分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法、超遠心法等の公知の手段を挙げることができる。
【００８３】
なお、抗βＧＲＰ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体の結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理して得られるＦａｂを含むフラグメントを使用することもできる。また、抗βＧＲＰ抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗βＧＲＰ抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（抗βＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することが可能であり、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
【００８４】
なお、これら抗βＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗βＧＲＰ抗体」に含まれる。
抗βＧＲＰ抗体を、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００８５】
▲４▼アプロチニン
アプロチニン(aprotinin)は、塩基性膵臓トリプシンインヒビターとも呼ばれ、ウシの肺、膵臓または耳下線から抽出されるアミノ酸５８残基の塩基性ポリペプチド(等電点10.5)で、カリクレイン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、その他各種の細胞内プロテアーゼを阻害するインヒビターであり、既に市販されている。
このアプロチニンを用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００８６】
▲５▼アルキルグルコシド
アルキルグルコシドは、特開平７−１０３９８２に記載された如く、グルコースとアルキル基がグルコシド結合によって結合したものである。本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いられ得るアルキルグルコシドは、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応の活性化阻害作用を有するものであれば特に限定されない。
【００８７】
これらのアルキルグルコシドは、α−グルコシド、β−グルコシドのいずれであってもよいが、特にβ−グルコシドが好ましい。また、グルコースとアルキル基とが酸素原子を介して結合したグルコシド(O-グルコシド)だけでなく、硫黄原子を介して結合したチオグルコシド(S-グルコシド)であってもよく、その他セレン(Se)、テルル(Te)等を介して結合したものであってもよい。グルコースと結合するアルキル基の炭素数は、アルキルグルコシドが水溶性または水分散性である限り特に限定されないが、通常炭素数１〜３０程度、特に６〜１２程度が好ましい。
【００８８】
また、還元末端がアルキルグルコシドである限り、グルコースにさらに他の糖が結合したオリゴグリコシドやポリグリコシドも、本明細書中における「アルキルグルコシド」に含まれる。
このようなオリゴグリコシドもしくはポリグリコシドとしては、ＷＯ９０／０２９５１号公報に開示された(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が特定個数結合したポリグリコシド等が例示される。特に非イオン性界面活性剤として市販されているｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド等は、入手が容易である。
【００８９】
アルキルグルコシドを用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
これらの競合的阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、昆虫体液に共存させることが、βＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
【００９０】
（２）本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる失活性阻害物質
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる失活性阻害物質は、βＧＲＰを活性化するβＧ自体に結合してこれを失活させるか又はβＧを分解して失活させ、βＧＲＰを活性化させない作用を発揮し得る物質であり、例えば下記▲６▼〜▲８▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【００９１】
▲６▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質
(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質は、ＷＯ９６／０６８５８号公報に記載されている通り、カブトガニの血球抽出液から得ることが可能であり、非還元条件下におけるゲル濾過法において分子量約５８０ｋＤａを示す塩基性タンパク質である。
【００９２】
(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質を用いることによって、このタンパク質がβＧに結合して複合体を形成し、これによってβＧのβＧＲＰ活性化能が失われ、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９３】
▲７▼抗(1→3)-β-D-グルカン抗体
抗(1→3)-β-D-グルカン抗体（以下、抗βＧ抗体ともいう）は、βＧに対する抗体であり、この抗体が検体中に存在するβＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、βＧを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗βＧ抗体は、βＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、βＧを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００９４】
ポリクローナル抗βＧ抗体及びモノクローナル抗βＧ抗体は、精製したβＧを抗原として、βＧとウシ血清アルブミン等のタンパク質との複合体を形成させて抗原として用いる等、前記▲３▼抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体の調製方法と同様の調製方法を用いて調製することができる。
【００９５】
なお、抗βＧ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、Ｆａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（Ｆａｂ部分を含むキメラ抗体等）を調製して本発明において用いることができることも、前記▲３▼と同様である。
また、これら抗βＧ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗βＧ抗体」に含まれる。
【００９６】
抗βＧ抗体を用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９７】
▲８▼(1→3)-β-D-グルカン分解酵素
(1→3)-β-D-グルカン分解酵素（以下、βＧ分解酵素ともいう）は、βＧ類を分解することができる限り特に限定されるものではないが、例えばArthrobacter luteus由来のβＧ分解酵素（Obayashi,T. et al., J.Med.Vet.Mycol., 30,275-280(1992)）等が挙げられる。
βＧ分解酵素を用いることによって、βＧが分解され、βＧのβＧＲＰ活性化能が失活し、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９８】
これらの失活性阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、検体に共存させることが、βＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
なお、共存させることができる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、後述の＜３＞に記載される方法により、いわゆる当業者が適宜決定することができる。
上記した、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、単独で有効成分とすることも可能であり、複数を組合わせて有効成分として配合することも可能である。
【００９９】
本発明βＧＲＰ抑制剤は、上記した本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分をそのまま用いることもできるが、本発明βＧＲＰ抑制剤の作用を実質的に害さない限り他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有させることもできる。また、例えば、式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して３７１個以上結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドが混在していてもよい。
【０１００】
＜３＞本発明ＰＧ測定剤(1)
本発明ＰＧ測定剤(1)は、昆虫体液に、上記＜２＞で説明した本発明βＧＲＰ抑制剤が共存している、ＰＧ特異的測定剤である。
本発明で用いることができる昆虫体液の供給源として使用され得る昆虫類は、特に限定されないが、飼育方法の確立しているものを選択することが望ましい。
【０１０１】
例えば、特開平７−１８４６９０号公報、特公平７−１１４７０７号公報等に記載された如く、カイコガ、タバコスズメガなどの鱗翅目、イエバエ、センチニクバエなどの双翅目、トノサマバッタ、エンマコウロギなどの直翅目、センノキカミキリなどの鞘翅目などが挙げられる。これらの昆虫類には、幼生、成体等を問わず、全ての形態のものが包含される。鱗翅目、双翅目及び鞘翅目などの完全変態類に属する昆虫については、取得の容易性から、成虫よりも幼虫の方が一般的に好ましい。
【０１０２】
これらの昆虫から採取する体液としては、その取得の容易性から一般に昆虫の体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。ヘモリンパの取得法は特に限定されず、好ましくは、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース、アミノ酸等からなる高分子物質）を不純物として含む庶糖、又はトウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射し、その後しばらく放置してから体腔から集める方法が挙げられる。さらに、上記のような方法で集めたヘモリンパを遠心分離にかけ、血球を除去した後、透析により得られる血漿を用いることもできる。さらに昆虫体液を原料に調製されたＰＧとβＧの両方に反応する市販の試薬（例えば、ＳＬＰ試薬（和光純薬工業（株）製））も使用することができる。なお、このような試薬は液体、粉末、固形物等のいずれの形態であってもよい。
【０１０３】
このようにして得られた昆虫体液に、上記＜２＞で述べた本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、ＰＧを特異的に測定することが可能な本発明ＰＧ測定剤(1)を得ることができる。
昆虫体液と本発明βＧＲＰ抑制剤との共存方法は、ＰＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
ここで、昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、βＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、例えば、次のようにしていわゆる当業者が適宜決定することができる。
【０１０４】
氷冷下で、一定量の昆虫体液に種々の量の本発明βＧＲＰ抑制剤（ＰＧを含有しないもの）を加えて混合する。次いでこれにβＧＲＰ系反応を充分に活性化できる一定量のβＧ（ＰＧを含有しないもの）を加えて、後述する＜５＞に記載されるインキュベート条件に準じてインキュベートし、測定する。これによってβＧによる活性化を完全に阻害する本発明βＧＲＰ抑制剤の量を求めることができる。
なお、本発明ＰＧ測定剤(1)を用いて検体中のＰＧを測定する場合、あらかじめ検体中にも本発明βＧＲＰ抑制剤を添加しておいてもよい。
【０１０５】
＜４＞本発明ＰＧ測定剤(2)
本発明ＰＧ測定剤(2)は、＜２＞で説明した「競合的阻害物質」の一部を除く物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されていないＰＧ特異的測定剤である。
【０１０６】
本発明ＰＧ測定剤(2)の調製において、＜２＞で説明した「競合的阻害物質」の一部を除く物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物を用いることによって、βＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を、前記不溶性固定化物で吸着除去することができる。
【０１０７】
本発明ＰＧ測定剤(2)において、不溶性担体への固定化に用いることができる物質は、▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド、▲２▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体又は▲３▼アルキルグルコシドであり、▲２▼および▲３▼についてはそれぞれ＜２＞において既に記載した内容（具体例，製造方法等を含む）と全く同一である。なお、ここで用いることができる▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドについては以下の通りである。
【０１０８】
・分子量３４２〜１,６３８のラミナリオリゴ糖
・分子量１,８００〜３,２５８のラミナリデキストリン
・平均分子量２,０００〜６,８００の(1→3)-β-D-グルカン
これらの▲１▼〜▲３▼の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法は、公知の方法、例えば特開平８−１２２３３４号公報記載の方法に基づいて行うことができる。
【０１０９】
例えば、水酸基やカルバモイル基などの親水性の基を有する不溶性担体であれば何れも使用できる。これらの不溶性担体として具体的には、セルロース（例えば、セルロースパウダー(アドバンテック東洋販売)、セルロファイン(生化学工業(株)販売)、アビセル(フナコシ薬品販売)、セレックス(バイオラッド販売)など）、アガロース（例えば、セファロース(ファルマシア販売)、バイオゲルＡ(バイオラッド販売)、クロマゲルＡ(同仁化学販売)、サガバック(セラバックラボラトリーズ販売)、ゲラロース(リテックス販売)、Ｐ−Ｌアガロース(Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売)など）、架橋デキストラン（例えば、セファデックスＧ、セファクリル(ファルマシア販売)、Ｐ−Ｌデックス(Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売)など）、ポリアクリルアミド（例えば、バイオゲルＰ(バイオラッド販売)、クロマゲルＰ(同仁化学販売)など）、多孔質ガラス（例えば、バイオグラス(バイオラッド販売)など）、親水性ポリビニル系合成ポリマー（例えば、トヨパール(東ソー販売)など）などが挙げられる。
【０１１０】
これらの不溶性担体に特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド又はその誘導体を固定化するためには、不溶性担体を活性化する必要がある。この方法としては種々のものがあり、例えば、水酸基を有する担体に対しては、臭化シアンによる方法（R.Axen, J.Porath and S.Ernback, Nature, 214, 1302(1967)）やオキシラン類による方法（J.Porath and N.Fornstedt, J.Chromatogr.,51, 479(1970)およびL.Sundberg and J.Porath, J.Chromatogr., 90, 87(1974)、又、カルバモイル基を有する担体に対しては、アルキルジアミンを用いてアミノアルキルアミン誘導体とする方法やヒドラジンを用いてヒドラジド誘導体とする方法（共にJ.K.Inman and H.M.Dintzis, Biochemistry, 8, 4074(1969)）などが挙げられるが、安定でかつ非特異的吸着の少ない方法としては、エピクロルヒドリンやビスオキシラン類を用いてエポキシ活性化し、得られたエポキシ活性化不溶性担体をさらに抱水ヒドラジンあるいはジヒドラジド化合物と反応させて得たヒドラジン誘導体又はヒドラジド誘導体を活性化体として用いる方法（松本勲武ら、特公平５−５３８０２号公報）が優れている。
【０１１１】
▲４▼抗βＧＲＰ抗体
ここでは、前記＜２＞で説明した「中和抗体」のみならず、βＧＲＰに結合するがβＧによるβＧＲＰの活性化を阻害しない抗体（結合抗体）も用いることができる。
【０１１２】
▲５▼アプロチニン
▲４▼及び▲５▼で述べた、抗βＧＲＰ抗体又はアプロチニンを固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法としては、例えばポリスチレン系およびポリプロピレン系等の不溶性担体に物理的に抗βＧＲＰ抗体又はアプロチニンを結合させて固定化する方法、あるいはポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートとの多孔性共重合体）等の不溶性担体に抗βＧＲＰ抗体またはアプロチニンを化学的に結合させて固定化する方法等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
この化学的な結合方法は、不溶性担体の芳香族アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化法、不溶性担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合させるＣＮＢｒ法、不溶性担体のヒドラジン誘導体等を用いてペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む不溶性担体の官能基を利用してタンパク質をアルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ基と反応する架橋試薬によって不溶性担体とタンパク質の遊離のアミノ基の間を架橋する方法、カルボジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスペーサーを介して結合させる方法等、公知の結合方法から不溶性担体の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
【０１１４】
このようにして上述の▲１▼〜▲５▼の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、昆虫体液を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、本発明ＰＧ測定剤(2)が得られる。
【０１１５】
この不溶性固定化物と昆虫体液との接触は、公知の固液接触手段により行うことが可能であり、特に限定されないが、例えば膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）の不溶性固定化物に昆虫体液を通液させる方法や、粒状の不溶性固定化物を充填したカラムに昆虫体液を通液させる方法や、ビーズ状、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形等の不溶性固定化物と昆虫体液を混合し、一定時間浸盪するか静置し、通常の固液分離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーション等）によって不溶性固定化物から分離する方法等が挙げられる。
【０１１６】
このようにして得られる本発明ＰＧ測定剤(2)は、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されておらず、ＰＧを特異的に測定することができる。
【０１１７】
＜５＞本発明ＰＧ測定方法(1)
本発明ＰＧ測定方法(1)は、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のＰＧを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に上記＜２＞において説明した本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、この検体中のＰＧによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１１８】
本発明ＰＧ測定方法(1)は、後述する実施例において実証されるように、本発明βＧＲＰ抑制剤が昆虫体液中に存在するβＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、βＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のＰＧを特異的に検出・測定し得る方法である。
【０１１９】
本発明ＰＧ測定方法(1)において、本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させる対象は、(A)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）、(B)検体、(C)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）と検体の両方、のいずれであってもよい。
【０１２０】
昆虫体液を原料として調製された試薬と本発明βＧＲＰ抑制剤との共存の態様は、ＰＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液を原料として調製された試薬に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１２１】
ここで、昆虫体液を原料として調製された試薬中及び／又は検体中に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、βＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、前記＜３＞において説明した、昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量の決定方法と同様に行うことができる。すなわち、昆虫体液を原料として調製された試薬中に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量を、前記＜３＞に記載した方法で求め、求めた本発明βＧＲＰ抑制剤の量を試薬中又は検体中に共存させることができる。あるいは、求めた本発明βＧＲＰ抑制剤の量の半分程度を試薬中及び検体中の両方に共存させてもよい。
【０１２２】
共存させる時期は、昆虫体液を原料として調製された試薬と検体とを接触させる前であることが好ましい。すなわちＰＧの測定前に、あらかじめ本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させた試薬及び／又はあらかじめ本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させた検体を用意しておき、用いることが好ましい。
【０１２３】
このようにして試薬と検体とを接触させ、好ましくはさらに混合し、一定時間インキュベートし、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することによって、この検体中のＰＧを測定することができる。インキュベートの温度と時間はいわゆる当業者が適宜決定することができる。またインキュベートは静置状態で行っても、振とう状態で行ってもよい。
【０１２４】
インキュベート中及び／又はインキュベート終了後、試薬中における昆虫体液における、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
検体中のＰＧによって惹起される変化は、発現するベンゾイルアルギニンエチルエステル分解酵素（ＢＡＥＥａｓｅ）、ＰＰＡＥ、ＰＯ、その他ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の酵素活性の有無や強度、あるいはこれらの酵素活性の発現時間として特定することができる。また、生成するドーパクロムやメラニンの色素の有無や強度として特定することもできる。
【０１２５】
具体的には、例えば特開平７−１８４６９０号公報に記載された如くＰＰＡＥ活性を測定する方法や、特開平１−１４２４６６号公報及び特公平７−１１４７０７号公報に記載された如くＰＯの活性化度を測定する方法（生成するキノリン色素を測定する方法、ＤＯＰＡの酸化によって生成するメラニン色素を測定する方法等）、ＢＡＥＥａｓｅ活性を測定する方法等によって、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することができる。
【０１２６】
このような酵素活性、酵素活性発現時間又は色素の変化は、一定時間のインキュベート後に特定してもよく、またインキュベート中の変化速度やその積分値として特定しても良く、その方法は特に限定されない。
【０１２７】
また、このような酵素活性、酵素活性発現時間又は色素の変化を特定し、この変化の有無とＰＧの存在の有無、又はこの変化の程度（強度）とＰＧ量とを関連づけることにより、検体中のＰＧを特異的に測定することができる。
例えば、上記の変化がなかった場合には検体中にＰＧが存在しない、上記の変化があった場合には検体中にＰＧが存在するといったような定性的な測定も可能である。また既知量のＰＧとそれに対応する上記変化をあらかじめ検量線等によって関連づけておき、検体を測定した時の上記変化からＰＧを特異的に定量することもできる。
【０１２８】
上記の変化は、色素の変化を利用するものであれば、肉眼的に特定してもよく、またスペクトロフォトメーターやマイクロプレートリーダーを用いて特定してもよい。また色素以外の変化を利用する場合は、それが検出できる手段を用いて特定すればよく、その手段はいわゆる当業者が適宜決定することができる。
本発明ＰＧ測定方法(1)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１２９】
＜６＞本発明ＰＧ測定方法(2)
本発明ＰＧ測定方法(2)は、検体と、本発明ＰＧ測定剤(1)又は本発明ＰＧ測定剤(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１３０】
本発明ＰＧ測定方法(2)においては、検体と、本発明ＰＧ測定剤(1)又は本発明ＰＧ測定剤(2)とを混合し、上記＜５＞に記載したと同様にインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様に、この混合した検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
【０１３１】
なお、本発明ＰＧ測定方法(2)において、検体中に本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明測定剤を共存させる方法、共存させる本発明測定剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
本発明ＰＧ測定方法(2)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１３２】
＜７＞本発明ＰＧ測定方法(3)
本発明ＰＧ測定方法(3)は、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にβＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１３３】
▲１▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質
▲２▼抗(1→3)-β-D-グルカン抗体
▲３▼(1→3)-β-D-グルカン分解酵素
上記▲１▼〜▲３▼の物質の物質についての説明は、すでに＜２＞において行った。
本発明ＰＧ測定方法(3)において用いる、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法は、前記の＜４＞において説明した抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンと同様である。
【０１３４】
このようにして上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、検体を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、実質的にβＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。なお、この不溶性固定化物と検体との接触は、前記＜４＞に記載した接触方法に準じて行うことができる。
【０１３５】
このようにして得られる検体と混合することができる、昆虫体液を原料として調製された試薬は、ＰＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞（本発明ＰＧ測定方法(1)）に記載したと同様にインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様にこの検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
【０１３６】
なお、本発明ＰＧ測定方法(3)において、検体中に本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明測定剤を共存させる方法、共存させる本発明測定剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
本発明ＰＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１３７】
上記＜２＞〜＜７＞に詳述した通り、本発明のうちペプチドグリカン関連発明においては本発明ＰＧ測定剤がその中心的な役割を果たしている。本発明ＰＧ測定剤等を用いる特に代表的な態様としては、例えば、下記(a)〜(i)等の態様を例示することができる。下記に示す態様は、本発明をさらに具体的に説明するための例示にすぎず、本発明の実施態様がこれらに限定されるものではない。
【０１３８】
(a)昆虫体液を採取する際及び／又はその体液から成分を調製する際に、本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(b)予め採取・調製された昆虫体液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(c)昆虫体液の凍結乾燥品を本発明βＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
【０１３９】
(d)昆虫体液の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解した溶液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(e)本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して採取・調製した昆虫体液、又は昆虫体液に予め必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(f)昆虫体液と合成基質の凍結乾燥品又は市販のＳＬＰ試薬を本発明βＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解するか、又は適当な溶液で溶解して調製した溶液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加する態様。
【０１４０】
(g)昆虫体液と合成基質の混合液中に予め必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解して用いる態様。
(h)必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を検体に添加する態様。
(i)測定時に、本発明βＧＲＰ抑制剤、検体、合成基質及び昆虫体液を混合する態様。
これらの実施態様は、上記＜２＞〜＜７＞に詳述した本発明のいずれかに包含される。
【０１４１】
＜８＞本発明ＰＧ測定キット
本発明ＰＧ測定キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、ＰＧ特異的測定用キットである。
本発明ＰＧ測定キットの構成成分として用いることができる本発明βＧＲＰ抑制剤、本発明ＰＧ測定剤(1)及び本発明ＰＧ測定剤(2)は、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のいずれの状態でも提供され得るが、凍結乾燥状態で提供されることが好ましい。
【０１４２】
また本発明ＰＧ測定キットには、必要に応じてさらに本発明βＧＲＰ抑制剤、本発明ＰＧ測定剤(1)及び本発明ＰＧ測定剤(2)の凍結乾燥物の溶解に用いる溶解液、酵素基質、酵素基質の溶解に用いる溶解液、標準ＰＧ、ＰＧフリーのマイクロプレート等の反応・測定容器等を構成成分として加えることもできる。なお、酵素基質は合成基質であることが好ましい。本発明ＰＧ測定キットは、上記＜５＞に記載した方法と同様の方法でＰＧの特異的測定に用いることができる。
【０１４３】
＜９＞本発明細菌検出キット
本発明細菌検出キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、細菌検出用キットである。
本発明細菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜８＞に記載したと同様であり、ＰＧを特異的に測定することによって細菌を検出することができる。
【０１４４】
これは細菌の細胞壁にＰＧが含まれていることを利用したものであり、細菌の有無を検出するという定性的な検出も可能であり、また細菌の量を検出するという定量的な検出も可能である。検出できる細菌は、ＰＧを細胞壁成分とする細菌であれば特に限定されず、例えばグラム陽性菌（例えばStaphylococcus aureus、Streptococcus pyrogenes、Micococcus lysodeikticus等）、グラム陰性菌（例えばEscherichia coli、Salmonella typhimurium、Pseudomonas aeruginosa等）等が例示される。本発明細菌検出キットでは、真菌（例えばCandida albicans、Aspergillus flavus、Cryptococcus neoformans等）は検出されないので、グラム陽性菌やグラム陰性菌を特異的に検出することができる。
【０１４５】
＜１０＞本発明細菌診断キット
本発明細菌診断キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、細菌感染症診断用キットである。
本発明細菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜９＞に記載したと同様であり、体液中のＰＧを特異的に測定することによって体液中の細菌を検出し、これにより細菌感染症を鑑別して診断することができる。本発明細菌診断キットが適用できる体液は、哺乳類の体液であることが好ましく、特に細菌感染症の治療方法が確立しているという観点からも、ヒトの体液であることが好ましい。体液として具体的には血清、血漿、全血、尿、髄液、乳汁等が好ましい。
【０１４６】
本発明細菌診断キットを用いることによって体液中の細菌の有無を検出し、細菌感染症の鑑別診断を行うことができる。すなわち本発明細菌診断キットを用いて体液中にＰＧが検出されれば、細菌感染症であると診断される。また体液中のＰＧの量を検出することにより、細菌感染症の重症度を診断することもできる。例えば体液中に検出されるＰＧ量が多ければ、重症の細菌感染症と診断される。
【０１４７】
また本発明細菌診断キットを用いて体液中のＰＧの量を検出することによって、治療に用いた薬剤の効果を判定することもできる。すなわち体液中のＰＧ量が減少すれば、治療に用いた薬剤が効果を奏していることがわかる。
本発明細菌診断キットを用いて診断できる細菌感染症は、ＰＧを細胞壁成分とする細菌の感染症であり、より具体的にはグラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症が例示される。本発明細菌診断キットでは真菌は検出されないので、グラム陽性菌感染症やグラム陰性菌感染症を鑑別診断することができる。
【０１４８】
３．(1→3)-β-D-グルカン関連発明について
＜１１＞本発明ＰＧＲＰ抑制剤
本発明ＰＧＲＰ抑制剤はＰＧＲＰ系反応の抑制剤であり、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有する。より好ましくは、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつβＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないＰＧＲＰ抑制剤である。
【０１４９】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、ＰＧＲＰを活性化するＰＧに競合してＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応因子に結合し、ＰＧＲＰ系反応を抑制し得る「競合的阻害物質」と、ＰＧＲＰを活性化するＰＧ自体に作用してこれを失活させ、ＰＧＲＰを活性化させない「失活性阻害物質」とに大別される。
【０１５０】
（１）本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる競合的阻害物質
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる競合的阻害物質は、上記の競合的な阻害作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲１▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【０１５１】
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体（以下、抗ＰＧＲＰ抗体ともいう）は、ＰＧＲＰに対する抗体であり、この抗体が昆虫体液中に存在するＰＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、ＰＧＲＰを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗ＰＧＲＰ抗体は、ＰＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、ＰＧＲＰを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【０１５２】
ポリクローナル抗ＰＧＲＰ抗体は及びモノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体は、精製したＰＧＲＰを抗原として、前記＜２＞に記載の抗βＧＲＰ抗体の調製方法と同様の方法で得ることができる。またその精製方法も、前記の抗βＧＲＰ抗体の場合と同様である。
【０１５３】
なお、抗ＰＧＲＰ抗体はそのまま使用することもできるが、前記＜２＞に記載の抗βＧＲＰ抗体と同様に、フラグメント化したものを使用することも可能であり、抗ＰＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗ＰＧＲＰ抗体」に含まれる。
【０１５４】
抗ＰＧＲＰ抗体を用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１５５】
この競合的阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、昆虫体液に共存させることが、ＰＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
なお、共存させることができる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量は、前記＜３＞に記載の方法に準じて、いわゆる当業者が適宜決定することができる。
【０１５６】
（２）本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる失活性阻害物質
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる失活性阻害物質は、ＰＧＲＰを活性化するＰＧ自体に作用してこれを失活させ、ＰＧＲＰを活性化させない作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲２▼〜▲５▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【０１５７】
▲２▼強アルカリ
強アルカリは、ＰＧに作用するがβＧにはほとんど作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、強アルカリによって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
【０１５８】
ここで用いることができる強アルカリとしては、アルカリ金属水酸化物（例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）が挙げられ、かつ好ましい。
強アルカリを検体に適量共存させることによって、強アルカリがＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。なお、強アルカリを共存させた検体は、昆虫体液を用いるβＧ測定の前に、適当な酸（例えば塩酸、硫酸、硝酸等）で中和しておくか、水や緩衝液等で希釈しておくことが好ましい。
【０１５９】
なお、中和した場合、白濁や反応阻害等が起きることもあるため、これを回避するために、必要に応じて脱塩等の塩を除去するための手段を講じることがより好ましい。
検体に強アルカリを共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６０】
▲３▼リゾチーム
リゾチームは、ＰＧに作用するがβＧには作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、リゾチームによって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
ここで用いることができるリゾチームは、ＰＧを特異的に失活できる限り特に限定されるものではなく、例えばニワトリ卵白由来のリゾチームを例示することができる。このようなリゾチームは市販されているので、それを用いることができる。
【０１６１】
リゾチームを検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に適量共存させることによって、リゾチームがＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
検体及び／又は昆虫体液にリゾチームを共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６２】
▲４▼タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素は、ＰＧに作用するがβＧには作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、タンパク質分解酵素によって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
【０１６３】
ここで用いることができるタンパク質分解酵素は、ＰＧを特異的に失活できる限り特に限定されるものではないが、エンド型のタンパク質分解酵素で、特にＬ−アラニンを分解することができるタンパク質分解酵素が好ましい、このような酵素としては、例えばStreptomyces griseus由来のプロテアーゼ，市販品として具体的にはプロテアーゼＰ（科研製薬製），Streptomyces griseusプロテアーゼ３（プロナーゼＰから精製）等を挙げることができる。
【０１６４】
タンパク質分解酵素を検体に適量共存させることによって、タンパク質分解酵素がＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
【０１６５】
なお、検体中のタンパク質分解酵素は、昆虫体液を用いるβＧ測定の前に失活させておく必要がある。タンパク質分解酵素の失活方法は、検体中のタンパク質分解酵素が失活され、かつ検体中のβＧが失活されない方法であれば特に限定されないが、例えば煮沸（例えば１００℃で数分程度）処理等が例示され、かつ好ましい。
【０１６６】
検体にタンパク質分解酵素を共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６７】
▲７▼抗ペプチドグリカン抗体
抗ペプチドグリカン抗体（以下、抗ＰＧ抗体ともいう）は、ＰＧに対する抗体であり、この抗体が検体中に存在するＰＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、ＰＧを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗ＰＧ抗体は、ＰＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、ＰＧを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【０１６８】
ポリクローナル抗ＰＧ抗体及びモノクローナル抗ＰＧ抗体は、精製したＰＧを抗原として、上記＜２＞の抗βＧＲＰ抗体と同様の方法で調製することができる。
なお、抗ＰＧ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、Ｆａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（Ｆａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することが可能であり、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
【０１６９】
また、これら抗ＰＧ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗ＰＧ抗体」に含まれる。
抗ＰＧ抗体を検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に適量共存させることによって、抗ＰＧ抗体がＰＧに結合して複合体を形成し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
【０１７０】
検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に抗ＰＧ抗体を共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
上記した、本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、単独で有効成分とすることも可能であり、複数を組合わせて有効成分として配合することも可能である。
【０１７１】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤は、上記した本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分をそのまま用いることもできるが、本発明ＰＧＲＰ抑制剤の作用を実質的に害さない限り他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有せしめることもできる。
【０１７２】
＜１２＞本発明βＧ測定剤(1)
本発明βＧ測定剤(1)は、昆虫体液に、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質が共存している、βＧ特異的測定剤である。
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
▲２▼リゾチーム
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
【０１７３】
本発明で用いることができる昆虫体液の供給源として使用され得る昆虫類、その体液の採取方法、及び昆虫体液を原料に調製されたＰＧとβＧの両方に反応する市販の試薬については、前記＜３＞において説明したと同様である。
本発明βＧ測定剤(1)において、昆虫体液に共存させることができる物質は以下の通りである。なお、それぞれの物質については、前記＜１１＞において既に説明した。
【０１７４】
昆虫体液に、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を共存させて、βＧを特異的に測定することが可能な本発明βＧ測定剤(1)を得ることができる。
昆虫体液と上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質との共存方法は、βＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液に上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１７５】
ここで、昆虫体液に共存させる上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質の量は、ＰＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、その量は上記＜３＞に記載された方法に準じて決定することができる。
【０１７６】
＜１３＞本発明βＧ測定剤(2)
本発明βＧ測定剤(2)は、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されていないβＧ特異的測定剤である。
【０１７７】
すなわち、本発明βＧ測定剤(2)の調製過程において、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物を用いることによって、ＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素を、前記不溶性固定化物で吸着除去することができる。
【０１７８】
本発明βＧ測定剤(2)において用いることができる抗ＰＧＲＰ抗体については、前記＜１１＞において既に説明した。
抗ＰＧＲＰ抗体を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化は、前記＜４＞の抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンについて述べたと同様に行うことができる。
【０１７９】
このようにして抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、昆虫体液を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、本発明βＧ測定剤(2)が得られる。
この不溶性固定化物と昆虫体液との接触方法は、前記＜４＞において説明した接触方法と同様である。
このようにして得られる本発明βＧ測定剤(2)は、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されておらず、ＰＧを特異的に測定することができる。
【０１８０】
＜１４＞本発明βＧ測定方法(1)
本発明βＧ測定方法(1)は、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のβＧを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を共存させて、この検体中のβＧによって惹起される、この試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１８１】
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
▲２▼リゾチーム
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
本発明βＧ測定方法(1)は、後述する実施例において実証されるように、上記▲１▼〜▲３▼の物質が昆虫体液中に存在するＰＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、ＰＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のβＧを特異的に検出・測定し得る方法である。
【０１８２】
本発明ＰＧ測定方法(1)において、上記▲１▼〜▲３▼の物質を共存させる対象は、(A)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）、(B)検体、(C)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）と検体の両方のいずれでもよい。
【０１８３】
昆虫体液を原料として調製された試薬及び／又は検体と、上記▲１▼〜▲３▼の物質との共存方法は、βＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、この試薬及び／又は検体に上記▲１▼〜▲３▼の物質を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１８４】
ここで、昆虫体液を原料として調製された試薬中及び／又は検体中に共存させる上記▲１▼〜▲３▼の物質の量は、ＰＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、前記＜３＞に記載した昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量の決定方法に準じて行うことができる。また、共存させる時期、インキュベート条件等は、前記＜５＞に記載したと同様である。
【０１８５】
インキュベート中及び／又はインキュベート終了後、試薬中における昆虫体液における、検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
検体中のβＧによって惹起される変化の特定方法、この変化とβＧ量との関連づけ、それによる検体中のβＧの測定方法も、前記＜５＞において記載した測定方法と同様である。
【０１８６】
本発明βＧ測定方法(1)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１８７】
＜１５＞本発明βＧ測定方法(2)
本発明βＧ測定方法(2)は、下記▲１▼〜▲４▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を検体に共存させることによって得られる実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１８８】
▲１▼強アルカリ
▲２▼リゾチーム
▲３▼タンパク質分解酵素
▲４▼抗ペプチドグリカン抗体
上記▲１▼〜▲４▼の物質の物質の詳細な説明は、上述した本発明ＰＧ抑制剤と同様である。
【０１８９】
本発明βＧ測定方法(2)は、後述する実施例において実証されるように、上記▲１▼〜▲４▼の物質が、検体中のＰＧのＰＧＲＰ活性化能を不活化することによって、昆虫体液中に存在するＰＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、ＰＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のβＧを特異的に検出・測定し得る方法である。上記▲１▼〜▲４▼の物質を検体に共存させることによって、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。
【０１９０】
なお、上記▲１▼又は▲３▼の物質を検体に共存させることによって得られる、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体は、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合する前に、上記＜１１＞において記載したと同様に、適宜煮沸、中和、希釈等の操作を行う必要がある。
【０１９１】
このようにして得られる検体と混合することができる、昆虫体液を原料として調製された試薬は、βＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
【０１９２】
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞において記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
本発明βＧ測定方法(4)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１９３】
＜１６＞本発明βＧ測定方法(3)
本発明βＧ測定方法(3)は、検体と、本発明βＧ測定剤(1)又は本発明βＧ測定剤(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１９４】
本発明βＧ測定方法(3)においては、検体と、本発明βＧ測定剤(1)又は本発明βＧ測定剤(2)とを混合し、上記＜１３＞に記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜１３＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
【０１９５】
なお、本発明βＧ測定方法(3)において、検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させる方法、共存させる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量、共存させる時期等は、前記＜５＞に記載したと同様である。
【０１９６】
本発明βＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１９７】
＜１７＞本発明βＧ測定方法(4)
本発明βＧ測定方法(4)は、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１９８】
▲１▼リゾチーム
▲２▼タンパク質分解酵素
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
上記▲１▼〜▲３▼の物質の物質の詳細な説明は、上述した本発明ＰＧ抑制剤と同様である。
【０１９９】
本発明βＧ測定方法(4)において用いる、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化は、前記＜４＞の抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンについてと同様に行うことができる。
【０２００】
このようにして上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、検体を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。なお、この不溶性固定化物と検体との接触方法は、前記＜４＞に記載した接触方法に準じて行うことができる。
【０２０１】
ここで得られる検体と混合することが可能な、昆虫体液を原料として調製された試薬は、βＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞に記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
【０２０２】
なお、本発明βＧ測定方法(4)において、検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させる方法、共存させる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
【０２０３】
本発明βＧ測定方法(4)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０２０４】
上記＜１１＞〜＜１７＞に詳述した通り、本発明のうち(1→3)-β-D-グルカン関連発明においては、本発明βＧ測定剤がその中心的な役割を果たしている。本発明βＧ測定剤等を用いる代表的な態様としては、例えば、下記(a)〜(i)等の態様を例示することができる。下記に示す態様は、本発明をさらに具体的に説明するための例示にすぎず、本発明の実施態様がこれらに限定されるものではない。
【０２０５】
(a)昆虫体液を採取する際及び／又はその体液から成分を調製する際に、本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(b)予め採取・調製された昆虫体液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(c)昆虫体液の凍結乾燥品を本発明ＰＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
【０２０６】
(d)昆虫体液の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解した溶液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(e)本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して採取・調製した昆虫体液、又は昆虫体液に予め必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(f)昆虫体液と合成基質の凍結乾燥品又は市販のＳＬＰ試薬を本発明ＰＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解するか、又は適当な溶液で溶解して調製した溶液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加する態様。
【０２０７】
(g)昆虫体液と合成基質の混合液中に予め必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解して用いる態様。
(h)必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を検体に添加する態様。
(i)測定時に、本発明ＰＧＲＰ抑制剤、検体、合成基質及び昆虫体液を混合する態様。
これらの実施態様は、上記＜１１＞〜＜１７＞に詳述した本発明のいずれかに包含される。
【０２０８】
＜１８＞本発明βＧ測定キット
本発明βＧ測定キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、βＧ特異的測定用キットである。
本発明βＧ測定キットの構成成分として用いることができる本発明ＰＧＲＰ抑制剤、本発明βＧ測定剤(1)及び本発明βＧ測定剤(2)は、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のいずれの状態でも提供され得るが、凍結乾燥状態で提供されるのが好ましい。
【０２０９】
また、本発明βＧ測定キットには、必要に応じてさらに本発明ＰＧＲＰ抑制剤、本発明βＧ測定剤(1)及び本発明βＧ測定剤(2)の凍結乾燥物の溶解に用いる溶解液、酵素基質、酵素基質の溶解に用いる溶解液、標準βＧ、βＧフリーのマイクロプレート等の反応・測定容器等を構成成分として加えることもできる。なお、酵素基質は合成基質であることが好ましい。本発明βＧ測定キットは、上記＜５＞に詳述した方法と同様にβＧの特異的測定に用いることができる。
【０２１０】
＜１９＞本発明真菌検出キット
本発明真菌検出キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、真菌検出用キットである。
本発明真菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜８＞に記載したと同様であり、βＧを特異的に測定することによって真菌を検出することができる。これは真菌の細胞壁にβＧが含まれていることを利用したものであり、真菌の有無を検出するという定性的な検出も可能であり、また真菌の量を検出するという定量的な検出も可能である。
【０２１１】
検出できる真菌は、βＧを細胞壁成分とする真菌であれば特に限定されず、例えばCandida albicans、Aspergillus flavus、Saccharomyces cerevisiae等が例示される。本発明真菌検出キットでは、細菌（例えばStaphylococcus aureus、Streptococcus pyrogenes、Micococcus lysodeikticus等のグラム陽性菌、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Pseudomonas aeruginosa等のグラム陰性菌等）は検出されないので、真菌を特異的に検出することができる。
【０２１２】
＜２０＞本発明真菌診断キット
本発明真菌診断キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、真菌感染症診断用キットである。
本発明真菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜１９＞に記載したと同様であり、体液中のβＧを特異的に測定することによって体液中の真菌を検出し、これにより真菌感染症を鑑別して診断することができる。本発明真菌診断キットが適用できる体液は、哺乳類の体液であることが好ましく、特に真菌感染症の治療方法が確立しているという観点からも、ヒトの体液であることが好ましい。体液として具体的には血清、血漿、全血、尿、髄液、乳汁等が好ましい。
【０２１３】
本発明真菌診断キットを用いることによって体液中のβＧの有無を検出し、真菌感染症の鑑別診断を行うことができる。すなわち本発明真菌診断キットを用いて体液中にβＧが検出されれば、真菌感染症であると診断される。また体液中のβＧの量を検出することにより、真菌感染症の重症度を診断することもできる。例えば体液中に検出されるβＧ量が多ければ、重症の真菌感染症と診断される。
【０２１４】
また本発明真菌診断キットを用いて体液中のβＧの量を検出することによって、治療に用いた薬剤の効果を判定することもできる。すなわち体液中のβＧ量が減少すれば、治療に用いた薬剤が効果を奏していることがわかる。
本発明真菌診断キットを用いて診断できる真菌感染症は、βＧを細胞壁成分とする真菌の感染症である。本発明細菌診断キットではグラム陽性菌やグラム陰性菌等の細菌は検出されないので、真菌感染症を鑑別診断することができる。
【０２１５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を記載し、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【０２１６】
〔実施例Ａ〕 ペプチドグリカン関連発明の実施例
〔実施例Ａ１〕βＧＲＰ系反応抑制剤をカイコ血漿に添加して調製した、本発明ＰＧ測定剤を用いるＰＧ測定方法の例
（方法）
カイコ血漿1.OmLに、本発明βＧＲＰ系反応抑制剤（ラミナリン；Laminaria digitata由来の数平均分子量(Mn)５,８５０のポリ(1→3)-β-D-グルコシド；シグマ社販売）0.5mgを添加した後、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して本発明ＰＧ測定剤を得た。
また、カイコ血漿1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して、ポリ(1→3)-β-D-グルコシドを含まない比較用の測定剤を得た。
【０２１７】
これら測定剤それぞれ50μLを、ふた付き96ウエルマイクロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ；生化学工業(株)販売）の所定のウエルに分注し、0.1Mリン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、蒸留水(ブランク)、所定濃度のＰＧ(Micrococcus luteusから、熱トリクロロ酢酸(TCA)及びトリプシン処理により調製されたＰＧ(以下、ＰＧＭＬともいう)；和光純薬工業(株)販売)または、βＧ（ＷＯ９０／０２９５１号公報記載の方法に準じ、カードランから分子篩により得たMn＝216,000のβＧ（以下、βＧ216ともいう）を別々に50μL加え、ふたをして、恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレートリーダー（ウエルリーダーＳＫ６０１；生化学工業(株)販売）にセットして、30℃で60分間、カイネティック法（反応時間法）で測定した。ＰＧ及びβＧによる活性化に伴って生じる色素量が吸光度の変化として捉えられ、測定終了後、その吸光度がしきい値に達するまでの反応時間（Ｔa）が自動的に算出され、ＰＧ及びβＧの各濃度に対するＴa値の関係が自動的に図示される。
【０２１８】
（結果）
図２及び図３に、ＰＧ濃度及びβＧ濃度とＴa値との関係を、横軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
本発明ＰＧ測定剤を用いた場合、ＰＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつβＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値（Ｔa＞６０分）と同一であった（図２）。
【０２１９】
一方、ポリ(1→3)-β-D-グルコシドを含まない比較用の測定剤では、ＰＧのみならずβＧにも反応し、ＰＧ及びβＧの濃度に依存していずれも良好な直線性が得られた（図３）。
これらの結果から、本発明ＰＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明ＰＧ測定剤によりＰＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２０】
〔実施例Ａ２〕βＧＲＰ系反応抑制剤を固定化して調製した、カイコ血漿からの本発明ＰＧ測定剤を用いるＰＧ測定方法の例
（方法）
特開平８−１２２３３４号公報に記載の方法に従ってそれぞれ調製したβＧＲＰ系反応抑制剤（WO90/02951号公報に記載の方法に従って、カードラン(和光純薬工業(株)販売)をギ酸で加水分解し、分子篩によって得たMn 5,800のポリ(1→3)-β-D-グルコシド）固定化セルロファイン（生化学工業(株)販売）を本発明例として用い、カードラン固定化セルロファインを比較例として用いた。これらをそれぞれカラム(1.2 x 3.0cm)に充填し、0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した。これらのカラムそれぞれに、カイコ血漿5.0mLを負荷して溶出させた（溶出液：0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液, pH6.5、溶出速度：9.0mL/時間）。
【０２２１】
カイコ血漿をカラムに負荷してから、最初の1.0mLの溶出液は捨て、その後の5.0mLの溶出液を集め、それぞれＰＧ測定剤を得た。
それぞれのＰＧ測定剤1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合後、それらの50μLをトキシペット９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有, pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のＰＧＭＬまたはβＧ216を別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２２２】
（結果）
図４及び図５に、ＰＧ濃度及びβＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明ＰＧ測定剤を用いた場合、ＰＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつβＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値(Ta＞６０分)と同一であった（図４）。
一方、カードラン固定化セルロファインカラム処理により得た比較用のＰＧ測定剤では、ＰＧ及びβＧのどの濃度においても、その測定値(Ta値)は５．２分で、かつブランクのTa値（５．２分）と同一であった（図５）。
【０２２３】
カードランと接触したカイコ血漿は、ProPOカスケードが活性化されてしまっているため、ＰＧやβＧを加えなくても、すなわちブランクでも反応してしまい、ＰＧやβＧを加えてもその濃度に関係なく一定の値を示し、ＰＧ量を測定することはできない。
これらの結果から、本発明ＰＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明ＰＧ測定剤によりＰＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２４】
〔実施例Ｂ〕 (1→3)-β-D-グルカン関連発明の実施例
〔実施例Ｂ１〕ＰＧＲＰ系反応抑制剤をカイコ血漿に添加して調製した、本発明βＧ測定剤を用いたβＧ測定方法の例
（方法）
カイコ血漿1.0mLに、ＰＧＲＰ系反応抑制剤（特開平４−５２５５８号公報に記載の方法に準じて調製した、ポリクローナル抗ＰＧＲＰ抗体）3.0mgを添加した後、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、よく混合して本発明βＧ測定剤を得た。またカイコ血漿1.0mLに80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して抗ＰＧＲＰ抗体を含まない比較用の測定剤を得た。それらの50μLをトキシペットプレート９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のβＧ216またはＰＧＭＬを別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２２５】
（結果）
図６及び図７に、βＧ濃度及びＰＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明βＧ測定剤を用いた場合、βＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつＰＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値（Ta＞６０分）と同一であった（図６）。一方、抗ＰＧＲＰ抗体を含まない比較用の測定剤では、βＧのみならずＰＧにも反応し、βＧ及びＰＧの濃度に依存していずれも良好な直線性が得られた（図７）。
【０２２６】
これらの結果から、本発明βＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明βＧ測定剤によりβＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２７】
〔実施例Ｂ２〕 ＰＧＲＰ系反応抑制剤を固定化して調製した、カイコ血漿からの本発明βＧ特異的測定剤を用いたβＧ測定方法の例
【０２２８】
（方法）
特公平７−１１４７０６号公報に記載の方法に従って、それぞれ調製したＰＧＲＰ系反応抑制剤（特開平４−５２５５８号公報に記載の方法に準じて調製した、モノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体）固定化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を本発明例として用い、ペプチドグリカン固定化セファロース４Ｂを比較例として用いた。
【０２２９】
これらをそれぞれカラム(1.2 x 3.0cm)に充填し、0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した。これらのカラムそれぞれに、カイコ血漿5.0mLを負荷して溶出させた（溶出液：0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液, pH6.5、溶出速度：9.0mL/時間）。
カイコ血漿をカラムに負荷してから、最初の1.0mLの溶出液は捨て、その後の5.0mLの溶出液を集め、それぞれβＧ測定剤を得た。
【０２３０】
それぞれのβＧ測定剤1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合後、それらの50μLをトキシペット９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有, pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のＰＧＭＬまたはβＧ216を別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２３１】
（結果）
図８及び図９に、βＧ濃度及びＰＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明βＧ測定剤を用いた場合、βＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつＰＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値(Ta＞６０分)と同一であった（図８）。
一方、ペプチドグリカン固定化セファロース４Ｂカラム処理により得た比較用のβＧ測定剤では、βＧ及びＰＧのどの濃度においても、その測定値(Ta値)は５．６分で、かつブランクのTa値（５．６分）と同一であった（図９）。
【０２３２】
ペプチドグリカンと接触したカイコ血漿は、ProPOカスケードが活性化されてしまっているため、βＧやＰＧを加えなくても、すなわちブランクでも反応してしまい、βＧやＰＧを加えてもその濃度に関係なく一定の値を示し、βＧ量を測定することはできない。
これらの結果から、本発明βＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明βＧ測定剤によりβＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２３３】
〔実施例Ｂ３〕検体にＰＧＲＰ系反応抑制剤を共存させることによってβＧを特異的に測定する方法の例
【０２３４】
（方法）
検体として、βＧ216(8.4ng/mL)、ＰＧＭＬ(8.4ng/mL)、及びそれぞれ２倍濃度のβＧ216とＰＧＭＬの等量混合液各々0.5mLを用意した。それらにＰＧＲＰ系反応抑制剤（0.6M 水酸化ナトリウム水溶液；強アルカリ)0.5mLを加え、10分間煮沸した。それらの50μLに0.3Mの塩酸を50μL加えて中和後、蒸留水2.0mLを加えて希釈した。それらまたは蒸留水(ブランク)をトキシペットプレート９６Ｆの所定のウエルに50μL分注し、それらに８mM 塩化カルシウムを含有するカイコ血漿50μL及び0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、ふたをして、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットし、実施例Ａ１と同様にして測定した。また検体に水酸化ナトリウム水溶液や塩酸の代わりに蒸留水を同量使用して、反応性を比較検討した。
【０２３５】
（結果）
結果を第１表に示す。
【０２３６】
この結果から、検体に強アルカリを共存させることによって検体中のＰＧは失活するがβＧは失活せず、この検体を用いると昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応は活性化されず、かつβＧＲＰ系反応には実質的に影響を及ぼさないことが示された。また本発明βＧ測定方法により、ＰＧの影響を受けずに、βＧを特異的に測定できることが示された。
【０２３７】
〔製造例１〕本発明ＰＧ測定キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明ＰＧ測定キットを製造した。
１．本発明ＰＧ測定剤(1)（(1→3)-β-D-グルカン結合性蛋白質含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
【０２３８】
〔製造例２〕本発明細菌検出キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明細菌検出キットを製造した。
１．本発明ＰＧ測定剤(1)（アプロチニン含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
４．ＰＧフリー蒸留水 １バイアル（２mL）
５．ＰＧ １バイアル
【０２３９】
〔製造例３〕本発明βＧ測定キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明βＧ測定キットを製造した。
１．本発明βＧ測定剤(1)（モノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
【０２４０】
〔製造例４〕本発明真菌検出キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明真菌検出キットを製造した。
１．本発明βＧ測定剤(1)（リゾチーム含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
４．βＧフリー蒸留水 １バイアル（２mL）
５．βＧ １バイアル
【０２４１】
【発明の効果】
本発明βＧＲＰ抑制剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつＰＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないので、本発明βＧＲＰ抑制剤を用いることによってＰＧを高感度に定量性良く、かつ再現性良く測定することができる。また、ＰＧ特異的測定剤を調製する際に本発明βＧＲＰ抑制剤を用いると、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価にＰＧ特異的測定剤を調製することができる。
【０２４２】
本発明ＰＧ測定剤(1)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。またその調製も、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価に行うことが可能であり、極めて実用的である。
【０２４３】
本発明ＰＧ測定剤(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素が除去されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４４】
本発明ＰＧ測定方法(1)及び(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素が抑制又は除去されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていない試薬を用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４５】
本発明ＰＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を実質的に活性化しない検体を用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４６】
本発明ＰＧ測定キットは、本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を構成成分として用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４７】
本発明細菌検出キットは、本発明ＰＧ測定キットをさらに細菌検出用キットとして応用したものであり、真菌は検出しないことから、グラム陽性菌やグラム陰性菌等を特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に検出することができる。例えば水質調査、環境モニタリング、衛生管理、食品管理、その他医学、薬学等の分野において利用することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２４８】
本発明細菌診断キットは、本発明細菌検出キットをさらに細菌感染症診断用キットとして応用したものであり、真菌は検出しないことから、グラム陽性菌感染症やグラム陰性菌感染症の鑑別診断を高感度に、再現性良く、簡便かつ迅速に行うことができる。これによって治療方針の決定や、治療剤の選択、治療効果の確認等にも極めて有用な情報を提供することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２４９】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつβＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないので、本発明ＰＧＲＰ抑制剤を用いることによってβＧを高感度に定量性良く、かつ再現性良く測定することができる。また、βＧ特異的測定剤を調製する際に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を用いると、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価にＰＧ特異的測定剤を調製することができる。
【０２５０】
本発明βＧ測定剤(1)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。またその調製も、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価に行うことが可能であり、極めて実用的である。
【０２５１】
本発明βＧ測定剤(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素が除去されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５２】
本発明βＧ測定方法(1)及び(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素が抑制又は除去されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていない試薬を用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５３】
本発明βＧ測定方法(3)及び(4)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を実質的に活性化しない検体を用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５４】
本発明βＧ測定キットは、本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を構成成分として用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５５】
本発明真菌検出キットは、本発明βＧ測定キットをさらに真菌検出用キットとして応用したものであり、細菌は検出しないことから、真菌を特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に検出することができる。例えば水質調査、環境モニタリング、衛生管理、食品管理、その他医学、薬学等の分野において利用することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２５６】
本発明真菌診断キットは、本発明真菌検出キットをさらに真菌感染症診断用キットとして応用したものであり、細菌は検出しないことから、真菌感染症の鑑別診断を高感度に、再現性良く、簡便かつ迅速に行うことができる。これによって治療方針の決定や、治療剤の選択、治療効果の確認等にも極めて有用な情報を提供することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２５７】
本発明は上記したような優れた効果を有するものであり、実用性が極めて高く、ＰＧ及びβＧの特異的測定、真菌及び細菌の特異的検出、細菌及び真菌感染症診断分野における有用性が極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】カイコ血液のプロフェノールオキシダーゼカスケードを示す。
【図２】実施例Ａ１において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを用いたときの結果を示す。
【図３】実施例Ａ１において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図４】実施例Ａ２において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを用いたときの結果を示す。
【図５】実施例Ａ２において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図６】実施例Ｂ１において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図７】実施例Ｂ１において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図８】実施例Ｂ２において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図９】実施例Ｂ２において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is an invention in the technical field relating to a specific measuring agent for insect body fluid-reactive substance, the same measuring method, the same measuring kit, and the like, and is specifically classified into the following two.
One is an invention relating to a peptidoglycan specific measurement agent, the same measurement method, the same measurement kit, and a reaction inhibitor of the (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein system reaction in the prophenol oxidase cascade. More specifically, a peptidoglycan capable of specifically measuring only peptidoglycan by inhibiting the (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein system reaction in the prophenol oxidase cascade found in insect body fluids. The invention relates to a reaction inhibitor for (1 → 3) -β-D-glucan-recognition protein system reaction that can be used for a specific measurement agent, the same measurement method, the same measurement kit, and a specific measurement agent for these peptidoglycans.
In the present specification, one of these inventions is simply referred to as “peptidoglycan-related invention”.
[0002]
The other is an invention relating to a specific measurement agent for (1 → 3) -β-D-glucan, the same measurement method, the same measurement kit, and a reaction inhibitor of peptidoglycan recognition protein system reaction in the prophenol oxidase cascade. More specifically, it is possible to specifically measure only (1 → 3) -β-D-glucan by suppressing the peptidoglycan recognition protein system reaction in the prophenol oxidase cascade found in insect body fluids (1 → 3) Peptidoglycan-recognizing protein system that can be used as a specific measurement agent for β-D-glucan, the same measurement method, the same measurement kit, and the specific measurement agent for (1 → 3) -β-D-glucan The invention relates to a reaction inhibitor.
In the present specification, the other invention is simply referred to as “(1 → 3) -β-D-glucan related invention”.
[0003]
[Prior art]
Peptidoglycan (hereinafter also referred to as PG) is a cell wall constituent of bacteria and is a polymer of glycopeptide containing N-acetylmuramic acid or N-glycolylmuramic acid and D-amino acid, and is very stable to heat. Known as a substance. PG has many biological activities such as pyrogenicity, liver kidney function-lowering, endotoxin activity-increasing action, adjuvant activity (immunity function enhancing effect), and is prosperous in the fields of medicine, pharmacy, microbiology, etc. It has been studied.
[0004]
In addition, (1 → 3) -β-D-glucan (hereinafter also referred to as βG) is a polysaccharide widely distributed in nature as a cell wall component of fungi such as yeast, mold, and mushroom, and plants. The structure is also diverse (Aketagawa, J., Tamura, H., and Tanaka, S., J. Antibact. Antitifung. Agents, 23, 7, 413-419 (1995)). βG exhibits various biological activities such as activation of the reticulo system including induction of production of various cytokines from macrophages, activation of the complement system, and antitumor activity. Furthermore, βG is listed as one of the causative agents of allergic respiratory diseases, and there are reports that βGs that have entered the body enhance the action of endotoxin, and it is preferable that βG flow into the blood as a foreign substance. Not only that, mixing into pharmaceuticals and medical devices is becoming a serious medical problem.
[0005]
On the other hand, it is known that an insect body fluid has a cascade system composed of a series of enzymes called a prophenol oxidase (hereinafter also referred to as ProPO) cascade involved in melanization of body fluid. PG and βG trigger this cascade system, and finally melanin is produced through a cascade reaction [Onishi, Annot. Zool. Jpn., 27, 33-39 (1954); Ashida and Onishi, Arch. Biochem. Biophys., 122, 411-416 (1967); Brunet, Insect Biochem., 10, 467-500 (1980); Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis, 239-265, Japan Sci. Soc. Press (1990); Ashida and Dohke, Insect Biochem., 10, 37-47 (1980)].
[0006]
The ProPO cascade is shown in FIG. The abbreviations in FIG. 1 are as follows, and the following abbreviations are used in this specification as needed.
PGRP: Peptidoglycan recognition protein (molecular weight about 19 kDa)
βGRP: (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein (molecular weight about 62 kDa)
ProPPAE: Prophenoloxidase activating enzyme precursor
PPAE: Prophenol oxidase activating enzyme
ProPO: Prophenol oxidase
PO: phenol oxidase
DOPA: L-3,4-dihydroxyphenylalanine
[0007]
PGRP specifically recognizes PG, and βGRP specifically recognizes βG. When the presence of PG or βG is recognized by PGRP or βGRP, these recognition proteins are activated to express enzyme activity, and a series of cascade reactions thereafter starts. In this specification, the cascade reaction that is initiated when PG is recognized by PGRP is referred to as peptidoglycan recognition protein system reaction (hereinafter also referred to as PGRP system reaction), and it is initiated when βG is recognized by βGRP. This cascade reaction is called (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein system reaction (hereinafter also referred to as βGRP system reaction) (see FIG. 1).
[0008]
Hereinafter, the prior art that seems to be closest to the present invention will be described separately for peptidoglycan-related inventions and (1 → 3) -β-D-glucan-related inventions.
1. Prior art related to peptidoglycan related inventions
(1) A reagent using a ProPO cascade existing in silkworm blood is marketed as “SLP reagent” by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. However, since this reagent reacts with both PG and βG, PG cannot be measured specifically.
[0009]
(2) In Japanese Patent Publication No. 7-114707 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-141599), “It does not react with βG, which is obtained by removing a component that reacts with βG to express enzyme activity from insect body fluid. Discloses a reagent for measuring PG comprising a component that specifically reacts with PG and expresses enzyme activity. The outline of the preparation method of this reagent is as follows:
First, curdlan bead columns are prepared by immobilizing curdlan, which is a kind of βG that activates βGRP and expresses enzyme activity, on various beads using various chemicals and instruments. Insect plasma is brought into contact with this curdlan bead column, and βGRP in the insect plasma is bound to the curdlan bead column to obtain a flow-through solution. This flow-through is dropped into saturated ammonium sulfate solution, stirred overnight, centrifuged to collect the precipitate, the precipitate is redissolved with buffer, dialyzed against the buffer, centrifuged again, The supernatant is obtained.
[0010]
As described above, the preparation of this reagent requires a very wide variety of drugs, instruments, and apparatuses, is very complicated, and requires a very long time.
(A) Since many kinds of drugs, instruments, and devices are used, it is highly possible that PG and βG are mixed during the preparation of the reagent for PG measurement, and the ProPO cascade is activated. (B) PG Since the procedure for preparing the reagent for measurement is complicated, there is a high possibility that the activity of the enzyme involved in the ProPO cascade may be reduced or the enzyme itself may be lost, and (C) a lot of time is spent on preparing the reagent for PG measurement Therefore, it has various problems such as an increased possibility of a decrease in the activity of an enzyme involved in the ProPO cascade.
[0011]
To make matters worse, this reagent contacts insect plasma with a curdlan bead column to bind βGRP to the curdlan bead column as described above, and then removes the βGRP bound to the curdlan bead column from the insect plasma. However, in the process of preparing this reagent, when βGRP is bound to curdlan, βGRP is activated, which activates the βGRP reaction.
That is, this reagent is fatal in that the ProPO cascade in insect plasma is advanced at the stage of reagent preparation, and it is extremely difficult to measure PG using this reagent.
This is clear from the results of comparative examples described later. In fact, such a reagent has not been put to practical use until now.
[0012]
(3) WO90 / 02951 discloses a horseshoe crab, amebocyte, lysate factor G activation inhibitor containing poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure as an active ingredient, and this specific structure. A method for obtaining a Limulus test reagent specific for endotoxin by adding poly (1 → 3) -β-D-glucoside to horseshoe crab, amebocyte lysate (hereinafter also referred to as LAL), and the like is disclosed.
[0013]
(4) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 8-122334 discloses a horseshoe crab, amebocyte, lysate factor G activation inhibitor containing βG polycarboxylic acid derivatives or glyceryl derivatives, and βG polycarboxylic acid derivatives or glyceryl. A specific measuring agent for endotoxin characterized by allowing a derivative to coexist with an LAL reagent, a method for producing the same, and the like are disclosed.
[0014]
(5) Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-102064 discloses an endotoxin-specific measuring agent in which an antibody against a (1 → 3) -β-D-glucan sensitive factor coexists in LAL. Further, it comprises (1 → 3) -β-D-glucan sensitive factor-free lysate obtained by contacting LAL with a carrier on which an antibody against (1 → 3) -β-D-glucan sensitive factor is immobilized, An endotoxin-specific assay is disclosed.
[0015]
(6) Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-258326 discloses an endotoxin-specific measuring agent in which aprotinin coexists with LAL.
(7) Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-103982 discloses a specific measuring agent for endotoxin in which an alkyl glucoside coexists with LAL.
[0016]
(8) WO96 / 06858 discloses a method for specific measurement of endotoxin, characterized in that (1 → 3) -β-D-glucan binding protein coexists in LAL and / or a specimen. Yes.
[0017]
(9) Japanese Patent Laid-Open No. 4-134265 is characterized in that LAL is brought into contact with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure on an insoluble carrier. A method for preparing LAL that specifically reacts with endotoxin is disclosed.
[0018]
The above-mentioned known documents (3) to (9) all relate to “LAL specific for endotoxin and its preparation method”, and “reagent derived from insect body fluid specific for peptidoglycan and its preparation method” etc. There is no description or suggestion. LAL also has a cascade system, but is completely different from the ProPO cascade present in insect body fluid in the following points.
[0019]
(A) The cascade existing in LAL is related to blood coagulation, and the ProPO cascade is related to body color change.
(B) The cascade present in LAL reacts to endotoxin, whereas the ProPO cascade does not react to endotoxin. The cascade present in LAL does not react to PG, but the ProPO cascade reacts to PG.
[0020]
(C) Enzymes (factors) constituting the cascade are completely different between the cascade present in LAL and the ProPO cascade present in insect body fluid.
The details of the cascade existing in (D) LAL have been clarified, but only a part of the cascade existing in insect body fluid has been clarified, and there are many unknown parts.
[0021]
Thus, the cascade existing in LAL and the ProPO cascade present in insect body fluids are completely different in terms of the existence of the cascade, substances that activate the cascade, enzymes (factors) constituting the cascade, and the like.
Therefore, poly (1 → 3) -β-D-glucoside and βG derivatives having the specific structures disclosed in the above (3) to (9) are applied to insect body fluids instead of LAL to produce PG-specific It has been considered impossible to prepare a simple insect body fluid-derived reagent. In fact, there has been no report on obtaining a PG-specific reagent by applying poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure to insect body fluids, βG derivatives, etc., and such a reagent. Is not known at all.
[0022]
2. Prior art related to (1 → 3) -β-D-glucan related inventions
(1) A reagent using a ProPO cascade existing in silkworm blood is marketed as “SLP reagent” by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. However, since this reagent reacts with both PG and βG, βG cannot be measured specifically.
[0023]
(2) Japanese Patent Publication No. 7-114706 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-141598) discloses that “it does not react with PG, which is obtained by removing a component that reacts with PG and expresses enzyme activity from insect body fluid. Discloses a reagent for βG measurement, which contains a component that specifically reacts with βG to express an enzyme activity.
[0024]
The method for preparing this reagent, as in the above-mentioned Japanese Patent Publication No. 7-114707 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-141599), requires a very wide variety of drugs, instruments and devices, and is very complicated. It takes a very long time. Therefore, since (A) many kinds of drugs, instruments, and devices are used, it is highly likely that PG and βG are mixed in the preparation of βG measurement reagent and the ProPO cascade is activated, and (B) βG Since the procedure for preparing the reagent for measurement is complicated, there is a high possibility that the activity of the enzyme involved in the ProPO cascade is reduced or the enzyme itself is lost, and (C) it takes a lot of time to prepare the reagent for βG measurement. Therefore, it has various problems such as an increased possibility of a decrease in the activity of an enzyme involved in the ProPO cascade.
[0025]
To make matters worse, this reagent is obtained by contacting insect plasma with a PG bead column to bind PGRP to the PG bead column and then removing the PGRP bound to the PG bead column from the insect plasma as described above. In the preparation process of this reagent, when PGRP is bound to PG, PGRP is activated, thereby activating the PGRP reaction.
[0026]
That is, this reagent is fatal in that it causes the ProPO cascade in insect plasma to act at the reagent preparation stage, and it is extremely difficult to measure βG using this reagent.
This is clear from the results of comparative examples described later. In fact, such a reagent has not been put to practical use until now.
[0027]
(3) Japanese Patent Laid-Open No. 4-52558 discloses a βG-specific measuring agent in which an antibody against an endotoxin-sensitive factor coexists with LAL. Also disclosed is a βG-specific assay agent comprising an endotoxin-sensitive factor-free lysate obtained by contacting LAL with a carrier on which an antibody against an endotoxin-sensitive factor is immobilized.
[0028]
(4) In Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-128337, a sample (specimen) that may contain βG mainly composed of a triple helix structure may be pretreated under strongly alkaline conditions and included in the sample as a reaction interference factor. A method for measuring βG, which comprises subjecting endotoxin alone or endotoxin and a factor G-based reaction interfering factor to destruction or inactivation and then subjecting to a Limulus reaction with a Limulus reagent, is disclosed.
[0029]
The above-mentioned known literatures (3) and (4) all relate to LAL, and describe “a reagent derived from an insect body fluid specific to (1 → 3) -β-D-glucan and its preparation method”. There is no suggestion. LAL also has a cascade system, but as described above, it is completely different from the ProPO cascade present in insect body fluid.
[0030]
Therefore, by replacing “LAL” in (3) above with “insect body fluid” and “antibody against endotoxin-sensitive factor” with “anti-PGRP antibody”, βG can be converted to βG without activating the ProPO cascade. It has been considered impossible to prepare specific insect body fluid-derived reagents. It has also been considered impossible to prepare insect fluid-specific reagents specific for βG without activating the ProPO cascade by substituting “insect fluid” for “LAL” in (4) above. It was.
In fact, there is no report on obtaining a βG-specific reagent by applying an anti-PGRP antibody, an alkali metal hydroxide or the like to an insect body fluid, and such a reagent is not known at all.
[0031]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to measure PG in a specimen using an insect body fluid, and to make PG practical and simple by using only the PGRP system reaction without being influenced by the βGRP system reaction accompanying the addition of the insect body fluid. It is to provide a means for rapid, sensitive and specific measurement without the disadvantages of the prior art.
[0032]
Another object of the present invention is to measure βG in a specimen using an insect body fluid, and not to be affected by the PGRP system reaction accompanying the addition of insect body fluid, It is to provide a practical, simple, rapid, highly sensitive and specific means without specific inconveniences as in the prior art.
[0033]
[Means for Solving the Problems]
  The inventors of the present invention have made extensive studies in order to achieve the above object. As a result, poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure out of βG, which has been considered to be involved only in “activation” of βGRP, has an unexpectedly surprising effect of inhibiting βGRP. And the PGRP reaction is not substantially inhibitedAs a result, the present invention was completed.
[0034]
  Also,Poly having a specific structure (1 → 3)- β -D- Glucosides etc.An enzyme (factor) involved in βGRP and / or βGRP system reaction in insect body fluid without substantially activating the ProPO cascade by contacting the insect body fluid with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing the protein on an insoluble carrier. The present invention has been completed by finding that it can be specifically adsorbed and removed.
[0035]
  In addition, the inventors(1)The anti-PGRP antibody exhibits an action of inhibiting the activation of PGRP by PG, and the βGRP system reaction is not substantially inhibited,(2)Strong alkali has the effect of specifically inactivating PG, PG inactivated with strong alkali is not recognized by PGRP, and βGRP reaction is not substantially inhibited.As a result, the present invention was completed.
[0036]
Further, by contacting the insect body fluid with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing the anti-PGRP antibody on an insoluble carrier, the PRP and / or PGRP system reaction in the insect body fluid can be performed without substantially activating the ProPO cascade. The present invention was completed by discovering that the enzyme (factor) involved can be specifically adsorbed and removed.
That is, this inventor provides the following invention in this application.
[0037]
  First,It is shown by the following formula (I) (1 → 3)- β -D- Poly having 2 to 370 consecutive glucoside structural units (1 → 3)- β -D- A polyglucoside containing at least one glucoside structure moiety as an active ingredient, and containing a prophenoloxidase cascade in insect body fluid (1 → 3)- β -D- Has the effect of suppressing the glucan recognition protein system reaction, (1 → 3)- β -D- A glucan recognition protein-based reaction inhibitor (hereinafter also referred to as the present invention βGRP inhibitor) is provided.
[Formula 4]
[0038]
  Also, the peptidoglycan-specific measuring agent (hereinafter referred to as the present invention PG measuring agent) in which the above-described βGRP inhibitor of the present invention coexists. (1) (Also called).
[0039]
  Further, it is represented by the above formula (I) (1 → 3)- β -D- Poly having 2 to 370 consecutive glucoside structural units (1 → 3)- β -D- A substantially prophenol oxidase obtained by bringing an insect body fluid or a reagent prepared from the insect body fluid into contact with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing a polyglucoside containing at least one glucoside structure moiety on an insoluble carrier. Peptidoglycan-specific measuring agent in which cascade is not activated (hereinafter referred to as PG measuring agent of the present invention) (2) (Also called).
[0040]
  Further, when peptidoglycan in a sample is measured using a reagent prepared using insect body fluid as a raw material, the βGRP inhibitor of the present invention is coexisted in the reagent and / or sample, and the peptidoglycan in the sample is used. A peptidoglycan specific measurement method (hereinafter referred to as the PG measurement method of the present invention) in which peptidoglycan in this specimen is measured by specifying the induced change in the insect body fluid contained in the coexisting reagent. (1) (Also called).
[0041]
  In addition, the specimen and the peptidoglycan-specific measuring agent (1) ~ (2) The peptidoglycan specific measurement method (hereinafter referred to as “peptidoglycan”) is measured by identifying changes induced by peptidoglycan in the mixed specimen in the insect body fluid contained in this measurement agent. , PG measurement method of the present invention (2) (Also called).
[0042]
  Further, it is represented by the above formula (I) (1 → 3)- β -D- Poly having 2 to 370 consecutive glucoside structural units (1 → 3)- β -D- Substantially obtained by contacting a specimen with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing a polyglucoside containing at least one glucoside structure moiety on an insoluble carrier. (1 → 3)- β -D- Triggered by peptidoglycan in a sample that does not activate a glucan-recognition protein-based reaction and a reagent prepared using insect body fluid as a raw material and contacted with the insoluble immobilization product in the insect body fluid contained in this reagent The peptidoglycan specific measurement method (hereinafter referred to as the PG measurement method of the present invention), wherein peptidoglycan in this sample is measured by specifying the change to be performed (3) (Also called).
[0043]
  In addition, at least the βGRP inhibitor of the present invention or the peptidoglycan-specific measuring agent described above (1) ~ (2) A kit for peptidoglycan-specific measurement (hereinafter also referred to as the PG measurement kit of the present invention).
[0044]
  In addition, at least the βGRP inhibitor of the present invention or the peptidoglycan-specific measuring agent described above (1) ~ (2) A kit for detecting bacteria (hereinafter also referred to as the present invention bacteria detection kit) is provided.
[0045]
  In addition, at least the βGRP inhibitor of the present invention or the peptidoglycan-specific measuring agent described above (1) ~ (2) A kit for diagnosing a bacterial infection (hereinafter also referred to as a bacterial diagnostic kit of the present invention).
[0046]
  In addition, a peptidoglycan recognition protein-based reaction inhibitor (hereinafter referred to as “anti-peptidoglycan recognition protein antibody” or “strong alkali”), which has an action of suppressing the peptidoglycan recognition protein system reaction of the prophenol oxidase cascade in insect body fluid. , Also referred to as a PGRP inhibitor of the present invention).
[0047]
  In addition, the anti-peptidoglycan recognition protein antibody coexists in the insect body fluid, (1 → 3)- β -D- Glucan-specific measuring agent (hereinafter referred to as βG measuring agent of the present invention) (1) (Also called).
[0048]
  In addition, the prophenoloxidase cascade obtained by bringing an insect body fluid or a reagent prepared from it into contact with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing an anti-peptidoglycan recognition protein antibody on an insoluble carrier is substantially activated. It has not been (1 → 3)- β -D- Glucan-specific measuring agent (hereinafter referred to as βG measuring agent of the present invention) (2) (Also called).
[0049]
  In addition, using reagents prepared from insect body fluids, (1 → 3)- β -D- When measuring glucan, anti-peptidoglycan recognition protein antibody in this reagent and / or sample, or strong alkali in the sample coexist in this sample. (1 → 3)- β -D- By identifying the changes in insect body fluids contained in this coexisting reagent caused by glucan, (1 → 3)- β -D- Measuring glucan, (1 → 3)- β -D- Specific measurement method of glucan (hereinafter, the former method using the antibody is the βG measurement method of the present invention) (1) The latter method using strong alkali is the βG measuring method of the present invention. (2) (Also called).
[0050]
  Further, a specimen and the βG measuring agent of the present invention (1) ~ (2) In the insect body fluid contained in this measurement agent. (1 → 3)- β -D- By identifying the changes caused by glucan, (1 → 3)- β -D- Measuring glucan, (1 → 3)- β -D- Specific measurement method for glucan (hereinafter, βG measurement method of the present invention) (3) (Also called).
[0051]
  In addition, a sample that does not substantially activate the peptidoglycan recognition protein system reaction obtained by bringing the sample into contact with an insoluble immobilized product obtained by immobilizing an anti-peptidoglycan recognition protein antibody on an insoluble carrier and an insect body fluid are prepared as raw materials. In the specimen in contact with the insoluble immobilization product in the insect body fluid contained in the reagent. (1 → 3)- β -D- By identifying the changes caused by glucan, (1 → 3)- β -D- Measuring glucan, (1 → 3)- β -D- Specific measurement method for glucan (hereinafter, βG measurement method of the present invention) (Four) (Also called).
[0052]
  Further, at least the above-described PGRP inhibitor of the present invention or the above-described βG measuring agent of the present invention. (1) ~ (2) including, (1 → 3)- β -D- A kit for glucan-specific measurement (hereinafter also referred to as the βG measurement kit of the present invention) is provided.
[0053]
  Further, at least the above-described PGRP inhibitor of the present invention or the above-described βG measuring agent of the present invention. (1) ~ (2) A fungal detection kit (hereinafter also referred to as the present invention fungal detection kit).
[0054]
  Further, at least the above-described PGRP inhibitor of the present invention or the above-described βG measuring agent of the present invention. (1) ~ (2) A kit for diagnosing a fungal infection (hereinafter also referred to as a fungal diagnostic kit of the present invention).
[0055]
  In the present invention, “substantially” means a state in which this term is sufficiently substantial for a person skilled in the art to recognize that it is the state. For example, “substantially does not activate (or does not activate) the ProPO cascade, PGRP-based reaction, or βGRP-based reaction” means that they are not activated (or not) at all or are activated (or However, the degree of activation is very small and cannot be detected by a person skilled in the art, or even if it can be detected, it is in a state where it is recognized as being within the measurement error range. Means.
[0057]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
1. About the measuring agent of the present invention
<1> Measuring agent of the present invention
The measuring agent of the present invention is an insect body fluid in which a prophenol oxidase cascade that reacts with both the first insect body fluid reactive substance and the second insect body fluid reactive substance is present (hereinafter simply referred to as “insect body fluid”). In this case, the term “insect body fluid and / or its component”) and the inhibitor of the first insect body fluid reactive substance recognition protein system reaction of this prophenol oxidase cascade coexist. It is a specific measuring agent for reactive substances.
[0058]
Examples of the insect body fluid containing the prophenol oxidase cascade that reacts with the first insect body fluid reactive substance and the second insect body fluid reactive substance include the insect body fluid described in <3> below. The first insect humor reactive substance and the second insect humor reactive substance are different from each other, specifically PG or βG. That is, when the first insect humor reactive substance is PG, the second insect humor reactive substance is βG, and when the first insect humor reactive substance is βG, the second insect humor reactive substance is PG. It is. The first insect body fluid-reactive substance recognition protein-based reaction means a cascade reaction that is initiated when the first insect body fluid-reactive substance recognition protein is recognized by the first insect body fluid-reactive substance recognition protein. .
[0059]
That is, the measuring agent of the present invention includes the following two aspects.
(1) A PG-specific measurement agent, wherein an insect body fluid containing a prophenol oxidase cascade that reacts with βG and PG coexists with an inhibitor of the βG recognition protein system reaction of the prophenol oxidase cascade.
[0060]
(2) A βG-specific measuring agent, wherein an inhibitor of a PG recognition protein system reaction of this prophenol oxidase cascade coexists in an insect body fluid in which a prophenol oxidase cascade that reacts with PG and βG exists.
The embodiment of the measuring agent of the present invention is the same as the embodiment of the measuring agent described in <3> and <12> described later.
[0061]
2. About peptidoglycan related inventions
<2> βGRP inhibitor of the present invention
The βGRP inhibitor of the present invention is an inhibitor of βGRP system reaction, and has an action of suppressing βGRP system reaction of ProPO cascade in insect body fluid. More preferably, it is a βGRP inhibitor that has the action of suppressing the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid and does not substantially inhibit the PGRP system reaction.
[0062]
A substance that can be used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention is a “competitive inhibitory substance that competes with βG that activates βGRP and binds to βGRP and / or a βGRP reaction factor to suppress the βGRP reaction. "Is inactivated by binding to βG itself that activates βGRP and deactivating it, or degrading and deactivating βG, and does not activate βGRP.
[0063]
(1) Competitive inhibitor used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention
The competitive inhibitor that can be used as the active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can exert the above-described competitive inhibitory action. For example, the following (1) to (▲) The materials shown in 5) are mentioned and preferred.
[0064]
(1) Poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure
As used herein, “poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure”
[Chemical 1]
[0065]
A poly having at least one poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure portion in which 2 to 370 consecutive (1 → 3) -β-D-glucoside structural units (I) represented by Means glucoside. The poly (1 → 3) -β-D-glucoside structural moiety is preferably one in which 3 to 310 consecutive (1 → 3) -β-D-glucoside structural units (I) are bonded. A combination of ~ 180 bonds is particularly preferred.
[0066]
In addition, the poly (1 → 3) -β-D-glucoside having this specific structure is bound by 2 to 370 consecutive (1 → 3) -β-D-glucoside structural units represented by the formula (I). It is not limited as long as it is a polyglucoside containing at least one poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure, and only a polyglucoside composed only of (1 → 3) -β-D-glucoside bonds In addition, this polyglucoside is the main chain, and the main chain or branched structure contains a structure such as (1 → 6) -β-D-glucoside or (1 → 4) -β-D-glucoside. Etc. are also included.
[0067]
Among poly (1 → 3) -β-D-glucosides having these specific structures, polyglucosides having (1 → 6) -β-D-glucosyl branch are mainly brown algae and Sarnococcidae from nature. Can be obtained from basidiomycetes belonging to Specific examples include Laminaria derived from Laminaria and Eisenia, Sclerotane from Sclerotinia, Schizophyllum from Schizophyllum, Sclerotium, Corticium, Stromatinia and other scleroglucans And lentinans derived from the genus Lentinus (Shiitake).
[0068]
Among poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure, polyglucoside having (1 → 4) -β-D-glucoside structure includes naturally occurring Cetraria genus, Usnea genus, Examples include lichenan derived from the genus Evernia and β-glucan contained in barley endosperm.
[0069]
Specific examples of poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure include and are preferably the following substances.
・ Laminary oligosaccharide having a molecular weight of 342 to 1,638
-Laminaridextrin with a molecular weight of 1,800-3,258
・ (1 → 3) -β-D-glucan having an average molecular weight of 2,000-60,000
・ Laminarin with an average molecular weight of 3,000 to 23,000
・ Screrotane with an average molecular weight of 3,000 to 20,000
・ Shizophyllan with an average molecular weight of 500,000 or less
・ Lentinan with an average molecular weight of 1,100,000 or less
・ Solubility of baker's yeast glucan water with an average molecular weight of 12,000 or less
・ Richenan with an average molecular weight of 33,000 or less
-Barley β-glucan with an average molecular weight of 200,000 or less
[0070]
Poly (1 → 3) -β-D-glucoside having these specific structures is not limited in its production method, and is derived from a natural product (for example, a low-temperature extract from a saccharide derived from a natural product with water). Molecular polyglycosides are also included), natural-derived polyglucosides that have been reduced in molecular weight by acid or enzymatic degradation, or artificially synthesized ones.
[0071]
A specific method for producing poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure is disclosed in WO 90/02951. According to this method, poly (1 → 3)- β-D-glucoside can be produced.
Further, “poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure” used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention is one kind of “poly (1 → 3) -β-D having a specific structure”. -Glucoside ", or a mixture of two or more kinds of" poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure ".
[0072]
(2) Poly (1 → 3) -β-D-glucoside derivative with specific structure
In the present specification, “a derivative of poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure” means that the (1 → 3) -β-D-glucoside structural unit represented by the above formula (I) is It means a derivative of polyglucoside containing at least one poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure part in which 2 to 370 consecutively bonded.
[0073]
More specifically, a poly (1 → 3) -β-D-glucoside polycarboxylic acid derivative having a specific structure, a glyceryl derivative, an arbitrary hydroxyl group (—OH) of a glucose residue, —OR [R is methyl Represents a group, a hydroxymethyl group, a carboxymethyl group, an acetyl group, a hydroxyethyl group, a hydroxypropyl group, a sulfopropyl group, a sulfuric acid group, a phosphoric acid group, or a salt thereof (metal salt, ammonium salt, organic amine salt, etc.) ] Which are chemically modified are mentioned and preferred.
[0074]
Specific examples of the derivative of poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure include and are preferably the following substances.
-Partial carboxymethylation (1 → 3) -β-D-glucan having an average molecular weight of 40,000 to 240,000 and a salt thereof (degree of substitution: 0.003 to 1.0)
-Partially carboxymethylated laminarin having an average molecular weight of 23,000 or less and its salt (degree of substitution: 1.0 or less)
-Partial methylation (1 → 3) -β-D-glucan having an average molecular weight of 80,000 or less (degree of substitution: 0.003 to 1.0)
-Partially sulfated laminarin having an average molecular weight of 23,000 or less and its salt (degree of substitution: 1.0 or less)
[0075]
Specific methods for producing this “derivative of poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure” are disclosed in WO90 / 02951 and JP-A-8-122334. According to the method, a derivative of poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure can be produced.
[0076]
The “poly (1 → 3) -β-D-glucoside derivative having a specific structure” used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention is a single type of “poly (1 → 3) -β having a specific structure”. -D-glucoside derivatives "or a mixture of two or more" poly (1 → 3) -β-D-glucoside derivatives having a specific structure ".
[0077]
Poly (1 → 3) -β-D-glucoside and its derivatives having the specific structure described above bind to βGRP present in insect body fluid faster and stronger than βG, which is a substance that activates βGRP. Thus, the conversion of βGRP to active βGRP is inhibited. Therefore, by using poly (1 → 3) -β-D-glucoside or a derivative thereof having a specific structure, the βGRP system reaction of the ProPO cascade is activated even if βG that activates βGRP is mixed. It is possible to inhibit the βGRP system reaction without inhibiting the PGRP system reaction.
[0078]
(3) Anti- (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein antibody
Anti- (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein antibody (hereinafter also referred to as anti-βGRP antibody) is an antibody against βGRP, and this antibody captures βGRP present in insect body fluid based on antigen-antibody reaction. It is an antibody (neutralizing antibody) that can inactivate βGRP. The anti-βGRP antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can capture βGRP based on an antigen-antibody reaction and inactivate βGRP.
[0079]
A polyclonal anti-βGRP antibody can be obtained by immunizing an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, etc. using purified βGRP as an antigen, and collecting serum from these animals. In addition, when immunizing an immunized animal, it is preferable to use an adjuvant (adjuvant) in combination because it activates antibody-producing cells.
[0080]
A monoclonal anti-βGRP antibody can be obtained, for example, as follows. (1) Using purified βGRP as an antigen, intraperitoneally, subcutaneously or footpads of immunized animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, etc., and then spleen or popliteal lymph nodes Cells extracted from these cells and myeloma cells, which are tumor cell lines, are cell-fused to establish hybridomas. The resulting hybridomas are continuously grown, and specific antibodies against the antigens are continuously generated from the resulting hybridomas. Select cell lines to produce. (2) By culturing the cell line thus selected in a suitable medium, a monoclonal anti-βGRP antibody can be obtained in the medium.
[0081]
Alternatively, a large amount of monoclonal anti-βGRP antibody can be produced by culturing the hybridoma in a living body such as the abdominal cavity of a mouse.
Examples of cells that can be used for cell fusion for the purpose of preparing the hybridoma include lymph node cells, lymphocytes in peripheral blood, and the like in addition to spleen cells. The myeloma cell line is preferably derived from the same cell line as compared to that derived from a different cell type, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
[0082]
Examples of the purification method of the polyclonal anti-βGRP antibody or the monoclonal anti-βGRP antibody thus obtained include salting out with a neutral salt such as sodium sulfate or ammonium sulfate, low-temperature alcohol precipitation, selective precipitation with polyethylene glycol or isoelectric point. Fractionation, electrophoresis, ion exchange chromatography using ion exchangers such as DEAE (diethylaminoethyl) -derivative, CM (carboxymethyl) -derivative, affinity chromatography using protein A or protein G, hydroxyapatite chromatography And known means such as chromatography, immunoadsorption chromatography with an immobilized antigen, gel filtration, and ultracentrifugation.
[0083]
The anti-βGRP antibody can be used as it is, but a fragmented antibody can also be used as long as the action as a neutralizing antibody is not lost. Preserving the antigen binding site (Fab) of the antibody during antibody fragmentation is essential for the binding between the antigen and the antibody, and therefore, proteases that do not degrade the antigen binding site (eg, plasmin, pepsin, papain, etc.) A fragment containing Fab obtained by treating an antibody can also be used. Further, if the nucleotide sequence of the gene encoding the anti-βGRP antibody or the amino acid sequence of the anti-βGRP antibody is determined, a fragment containing a Fab or a chimeric antibody (such as a chimeric antibody containing the Fab portion of the anti-βGRP antibody) is genetically engineered. Such fragments and chimeric antibodies can also be used in the present invention.
[0084]
In addition, fragments and chimeric antibodies containing the Fab portion of these anti-βGRP antibodies are also included in the “anti-βGRP antibody” in this specification.
By using an anti-βGRP antibody as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention, it is possible to inhibit the βGRP reaction without activating the βGRP reaction of the ProPO cascade, and the PGRP reaction is not inhibited.
[0085]
(4) Aprotinin
Aprotinin, also called basic pancreatic trypsin inhibitor, is a 58-amino acid basic polypeptide (isoelectric point 10.5) extracted from bovine lung, pancreas or parotid, with kallikrein, plasmin, trypsin, It is an inhibitor that inhibits chymotrypsin and other intracellular proteases, and is already commercially available.
By using this aprotinin, it is possible to inhibit the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade, and the PGRP system reaction is not inhibited.
[0086]
(5) Alkyl glucoside
As described in JP-A-7-103982, the alkyl glucoside is obtained by binding glucose and an alkyl group by a glucoside bond. The alkyl glucoside that can be used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of inhibiting the activation of βGRP system reaction of the ProPO cascade.
[0087]
These alkyl glucosides may be either α-glucoside or β-glucoside, but β-glucoside is particularly preferable. In addition, glucoside (O-glucoside) in which glucose and an alkyl group are bonded through an oxygen atom, thioglucoside (S-glucoside) bonded through a sulfur atom, and other selenium (Se) Or may be bonded via tellurium (Te) or the like. Although carbon number of the alkyl group couple | bonded with glucose is not specifically limited as long as the alkyl glucoside is water-soluble or water-dispersible, Usually, about 1-30 carbon atoms, especially about 6-12 are preferable.
[0088]
Further, as long as the reducing end is an alkyl glucoside, oligoglycosides and polyglycosides in which other sugars are further bound to glucose are also included in the “alkyl glucoside” in the present specification.
Examples of such oligoglycosides or polyglycosides include polyglycosides having a specific number of (1 → 3) -β-D-glucoside structural units disclosed in WO 90/02951. In particular, n-octyl-β-D-glucoside, n-heptyl-β-D-glucoside, n-dodecyl-β-D-glucoside, n-octyl-β-D-, which are commercially available as nonionic surfactants Thioglucoside, n-heptyl-β-D-thioglucoside and the like are easily available.
[0089]
By using alkyl glucoside, it is possible to inhibit the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade, and the PGRP system reaction is not inhibited.
These competitive inhibitors can coexist in the insect body fluid and / or specimen, but it is preferable to coexist in the insect body fluid because the βGRP reaction can be efficiently inhibited.
[0090]
(2) Deactivation inhibitor used as an active ingredient of the present invention βGRP inhibitor
The inactivation inhibitory substance that can be used as an active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention binds to βG itself that activates βGRP and deactivates it, or decomposes and deactivates βG to activate βGRP It is a substance that can exhibit the action that is not allowed to occur, and for example, the substances shown in the following (6) to (8) are mentioned and preferred.
[0091]
▲ 6 ▼ (1 → 3) -β-D-glucan binding protein
(1 → 3) -β-D-glucan-binding protein can be obtained from the blood cell extract of horseshoe crab as described in WO96 / 06858, and in gel filtration under non-reducing conditions. It is a basic protein having a molecular weight of about 580 kDa.
[0092]
By using a (1 → 3) -β-D-glucan-binding protein, this protein binds to βG to form a complex, thereby losing βGRP's ability to activate βGRP, and the βGRP system of the ProPO cascade It is possible to inhibit the βGRP system reaction without activating the reaction, and the PGRP system reaction is not inhibited.
[0093]
(7) Anti- (1 → 3) -β-D-glucan antibody
Anti- (1 → 3) -β-D-glucan antibody (hereinafter also referred to as anti-βG antibody) is an antibody against βG, and this antibody captures βG present in a specimen based on an antigen-antibody reaction. , An antibody that can inactivate βG (neutralizing antibody). The anti-βG antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can capture βG based on an antigen-antibody reaction and inactivate βG.
[0094]
The polyclonal anti-βG antibody and the monoclonal anti-βG antibody are prepared by using the purified βG as an antigen, forming a complex of βG and a protein such as bovine serum albumin as the antigen, etc. (3) Anti- (1 → 3)- The β-D-glucan recognizing protein antibody can be prepared using a preparation method similar to the preparation method.
[0095]
The anti-βG antibody can be used as it is, but as long as the neutralizing antibody is not lost, a Fab-containing fragment or a chimeric antibody (such as a chimeric antibody containing a Fab portion) is prepared and used in the present invention. This is also the same as (3) above.
In addition, fragments and chimeric antibodies containing the Fab portion of these anti-βG antibodies are also included in the “anti-βG antibody” herein.
[0096]
By using an anti-βG antibody, it is possible to inhibit the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade, and the PGRP system reaction is not inhibited.
[0097]
▲ 8 ▼ (1 → 3) -β-D-glucan degrading enzyme
(1 → 3) -β-D-glucan-degrading enzyme (hereinafter also referred to as βG-degrading enzyme) is not particularly limited as long as βGs can be degraded. For example, β-degrading enzyme derived from Arthrobacter luteus (Obayashi, T. et al., J. Med. Vet. Mycol., 30,275-280 (1992)).
By using βG-degrading enzyme, βG is decomposed, ββ activation ability of βG is inactivated, βGRP reaction can be inhibited without activating βGRP reaction of ProPO cascade, and PGRP System reactions are not inhibited.
[0098]
These deactivation inhibitors can coexist in the insect body fluid and / or the specimen, but it is preferable to coexist in the specimen because the βGRP reaction can be efficiently inhibited.
In addition, what is called a person skilled in the art can determine suitably the quantity of this invention (beta) GRP inhibitor which can be made to coexist by the method described in <3> mentioned later.
The above-described substances that can be used as the active ingredient of the βGRP inhibitor of the present invention can be used alone as an active ingredient, or a plurality can be combined as an active ingredient.
[0099]
The βGRP inhibitor of the present invention can use the above-mentioned effective component of the βGRP inhibitor of the present invention as it is, but may contain other components as long as the action of the βGRP inhibitor of the present invention is not substantially impaired. For example, excipients, buffers, stabilizers, preservatives and the like that are used in the preparation of ordinary reagents can also be included. In addition, for example, at least one poly (1 → 3) -β-D-glucoside structure portion in which 371 or more (1 → 3) -β-D-glucoside structural units represented by the formula (I) are continuously bonded is included. One polyglucoside may be mixed.
[0100]
<3> PG measuring agent of the present invention (1)
The PG measurement agent (1) of the present invention is a PG-specific measurement agent in which the βGRP inhibitor of the present invention described in <2> above coexists in an insect body fluid.
Insects that can be used as a source of insect body fluid that can be used in the present invention are not particularly limited, but it is desirable to select those that have established breeding methods.
[0101]
For example, as described in JP-A-7-184690, JP-B-7-114707, etc., Lepidoptera such as silkworm, tobacco tin mega, etc., Diptera such as house fly, Sentinium flies, etc. Examples include Coleoptera, Coleoptera, etc. These insects include all forms of larvae and adults. For insects belonging to complete metamorphosis such as Lepidoptera, Diptera and Coleoptera, larvae are generally preferred over adults because of their ease of acquisition.
[0102]
Examples of body fluids collected from these insects include hemolymph obtained from insect body cavities because of its ease of acquisition. The method for obtaining hemolymph is not particularly limited, and preferably after placing an insect on ice and stopping the movement, sugarcane containing a sugarcane factor (a high-molecular substance composed of glucose, amino acids, etc. contained in sugarcane) as an impurity, or sugarcane factor There is a method of injecting physiological saline containing itself into a body cavity and leaving it for a while and collecting it from the body cavity. Furthermore, the hemolymph collected by the above method can be centrifuged to remove blood cells, and then plasma obtained by dialysis can be used. Furthermore, a commercially available reagent (for example, SLP reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) that reacts with both PG and βG prepared using insect body fluid as a raw material can also be used. Such a reagent may be in any form such as a liquid, a powder, and a solid.
[0103]
In the insect body fluid thus obtained, the present invention PG measuring agent (1) capable of specifically measuring PG is obtained by coexisting the present invention βGRP inhibitor described in <2> above. Can do.
The coexistence method of the insect body fluid and the βGRP inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically measure PG, but the method of coexistence by adding the βGRP inhibitor of the present invention to the insect body fluid is extremely limited. It is preferable because it is simple.
Here, the amount of the βGRP inhibitor of the present invention that coexists in the insect body fluid is an amount necessary to completely inhibit the βGRP reaction, and can be appropriately determined by a person skilled in the art as follows, for example. .
[0104]
Under ice-cooling, various amounts of the βGRP inhibitor of the present invention (containing no PG) are added to a certain amount of insect body fluid and mixed. Next, a certain amount of βG (which does not contain PG) capable of sufficiently activating the βGRP system reaction is added to this, and the cells are incubated and measured according to the incubation conditions described in <5> described later. Thereby, the amount of the βGRP inhibitor of the present invention that completely inhibits the activation by βG can be determined.
In addition, when measuring PG in a sample using the PG measuring agent (1) of the present invention, the βGRP inhibitor of the present invention may be added to the sample in advance.
[0105]
<4> PG measuring agent of the present invention (2)
The PG measuring agent (2) of the present invention is prepared from an insect body fluid or a raw material thereof as an insoluble immobilization product obtained by immobilizing a substance excluding a part of the “competitive inhibitory substance” described in <2> on an insoluble carrier. It is a PG-specific measuring agent which is obtained by contacting the prepared reagent and in which the ProPO cascade is not substantially activated.
[0106]
In the preparation of the PG measuring agent (2) of the present invention, by using an insoluble immobilized product obtained by immobilizing a substance excluding a part of the “competitive inhibitory substance” described in <2> on an insoluble carrier, βGRP and / or Alternatively, the enzyme (factor) involved in the βGRP system reaction can be adsorbed and removed with the insoluble immobilization product.
[0107]
In the PG measuring agent (2) of the present invention, substances that can be used for immobilization on an insoluble carrier are: (1) poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure, and (2) a specific structure. Poly (1 → 3) -β-D-glucoside derivative or (3) alkyl glucoside, and (2) and (3) are the same as those already described in <2> (specific examples, production methods, etc.) Including). In addition, (1) poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a specific structure that can be used here is as follows.
[0108]
・ Laminary oligosaccharide having a molecular weight of 342 to 1,638
-Laminaridextrin with a molecular weight of 1,800-3,258
・ (1 → 3) -β-D-glucan having an average molecular weight of 2,000 to 6,800
The insoluble carrier and the immobilization method that can be used for immobilizing these substances (1) to (3) are carried out based on known methods, for example, the method described in JP-A-8-122334. it can.
[0109]
For example, any insoluble carrier having a hydrophilic group such as a hydroxyl group or a carbamoyl group can be used. Specific examples of these insoluble carriers include cellulose (for example, cellulose powder (advantech Toyo Sales), Cellulofine (Seikagaku Corporation Sales), Avicel (Funakoshi Pharmaceutical Sales), SELEX (BioRad Sales), etc.) Agarose (for example, Sepharose (Pharmacia sales), Biogel A (BioRad sales), Chromagel A (Dojin Chemical sales), Sagabak (Celaback Laboratories sales), Gerarose (Litex sales), P-L agarose (PL Biochemicals) Sales), etc.), cross-linked dextran (eg Sephadex G, Sephacryl (Pharmacia sales), PL Dex (PL Biochemicals sales), etc.), polyacrylamide (eg Biogel P (BioRad sales), Chromagel P (Dojin Chemical Sales)), porous glass (for example, Such Iogurasu (BioRad sold)), hydrophilic polyvinyl synthetic polymer (e.g., Toyopearl (Tosoh sold), etc.) and the like.
[0110]
In order to immobilize poly (1 → 3) -β-D-glucoside or a derivative thereof having a specific structure on these insoluble carriers, it is necessary to activate the insoluble carriers. There are various methods, for example, for a carrier having a hydroxyl group, a method using cyanogen bromide (R. Axen, J. Porath and S. Ernback, Nature, 214, 1302 (1967)) and oxirane. Method (J. Porath and N. Fornstedt, J. Chromatogr., 51, 479 (1970) and L. Sundberg and J. Porath, J. Chromatogr., 90, 87 (1974), also having a carbamoyl group Examples of the carrier include an aminoalkylamine derivative using alkyldiamine and a hydrazide derivative using hydrazine (both JKInman and HMDintzis, Biochemistry, 8, 4074 (1969)). As a method that is stable and has little nonspecific adsorption, epoxy activation using epichlorohydrin and bisoxiranes, and the resulting epoxy-activated insoluble carrier further reacted with a hydrazine hydrate or dihydrazide compound are obtained. Alternatively, a method using a hydrazide derivative as an activator (Matsumoto Isao et al., Japanese Patent Publication No. 5-53802) is excellent.
[0111]
(4) Anti-βGRP antibody
Here, not only the “neutralizing antibody” described in the above <2>, but also an antibody that binds to βGRP but does not inhibit βGRP activation by βG (binding antibody) can be used.
[0112]
▲ 5 ▼ Aprotinin
As described in (4) and (5), the insoluble carrier and the immobilization method that can be used for immobilizing the anti-βGRP antibody or aprotinin are, for example, physically resistant to insoluble carriers such as polystyrene and polypropylene. Method of binding and immobilizing βGRP antibody or aprotinin, or polyamide, cellulose, agarose, polyacrylamide, dextran, vinyl polymer (porous copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate), etc. Examples of the method include, but are not limited to, a method of chemically binding and immobilizing an anti-βGRP antibody or aprotinin to an insoluble carrier.
[0113]
This chemical conjugation method includes diazotization by diazo coupling using the aromatic amino group of the insoluble carrier, CNBr method in which the hydroxyl group of the insoluble carrier is activated with CNBr to bond the peptide, hydrazine derivative of the insoluble carrier, etc. Insoluble by acid azide method to peptide bond using, alkylation method to alkylate protein using functional group of insoluble carrier with high reactivity such as halogen, cross-linking reagent that reacts with free amino group such as glutaraldehyde Depending on the type of insoluble carrier from known binding methods such as a method of crosslinking between the carrier and the free amino group of the protein, a carbodiimide method, an epoxy activation method, and a method of binding via a spacer using these methods. Can be appropriately selected and used.
[0114]
If the insoluble immobilization product obtained by immobilizing the substances (1) to (5) described above on the insoluble carrier is brought into contact with an insect body fluid to remove the insoluble immobilization product, the PG of the present invention is obtained. A measuring agent (2) is obtained.
[0115]
The contact between the insoluble immobilization product and the insect body fluid can be performed by a known solid-liquid contact means, and is not particularly limited. For example, a membrane shape (filter shape, hollow fiber shape, tube shape, flat membrane shape, etc.) Insect immobilized material such as beads, granules, latex, chips, powders, etc. And insect body fluids are mixed, soaked for a certain period of time or allowed to stand, and then separated from the insoluble immobilizates by ordinary solid-liquid separation means (filtration, centrifugation, suction, decantation, etc.).
[0116]
The thus obtained PG measuring agent (2) of the present invention can specifically measure PG without substantially activating the ProPO cascade.
[0117]
<5> PG measurement method of the present invention (1)
The PG measurement method (1) of the present invention is a method of measuring the PG in a specimen using a reagent prepared from insect body fluid as a raw material. The βGRP of the present invention described in <2> above in the reagent and / or specimen Specific measurement of PG by measuring the PG in this sample by specifying the change of the insect body fluid contained in this coexisting reagent caused by the coexisting inhibitor and PG in this sample Is the method.
[0118]
The PG measurement method (1) of the present invention utilizes the fact that the βGRP inhibitor of the present invention has an action of potently inhibiting the activation of βGRP present in insect body fluids, as will be demonstrated in Examples described later. In this method, PG in a specimen can be specifically detected and measured without being affected by the βGRP reaction system.
[0119]
In the PG measurement method (1) of the present invention, the object of coexisting the βGRP inhibitor of the present invention is (A) a reagent prepared using insect body fluid as a raw material (for example, a commercially available reagent that reacts with both PG and βG (SLP reagent etc. )), (B) Specimens, (C) Reagents prepared from insect body fluids (for example, commercially available reagents that react with both PG and βG (SLP reagents, etc.)) and Specimens Good.
[0120]
The coexistence of the reagent prepared using insect body fluid as the raw material and the βGRP inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as PG can be specifically measured, but the reagent prepared using insect body fluid as the raw material is not limited. The method of coexisting by adding the βGRP inhibitor of the present invention is preferable because it is extremely simple.
[0121]
Here, the amount of the βGRP inhibitor of the present invention that coexists in the reagent and / or specimen prepared using insect body fluid as a raw material is an amount necessary to completely inhibit the βGRP reaction, and <3> The method for determining the amount of the βGRP inhibitor of the present invention to be coexisted with the insect body fluid can be carried out in the same manner as described above. That is, the amount of the present invention βGRP inhibitor coexisting in the reagent prepared using insect body fluid as a raw material is determined by the method described in <3> above, and the determined amount of the present invention βGRP inhibitor is obtained in the reagent or in the sample. Can coexist. Alternatively, about half of the obtained amount of the present invention βGRP inhibitor may coexist in both the reagent and the sample.
[0122]
The time of coexistence is preferably before the reagent prepared from the insect body fluid and the specimen are brought into contact with each other. That is, it is preferable to prepare and use a reagent coexisting with the βGRP inhibitor of the present invention and / or a sample coexisting with the βGRP inhibitor of the present invention in advance before measuring PG.
[0123]
In this way, the reagent and the specimen are brought into contact, preferably further mixed, incubated for a certain period of time, and the change induced by the PG in the specimen is specified, whereby the PG in the specimen can be measured. The so-called person skilled in the art can appropriately determine the incubation temperature and time. Incubation may be performed in a stationary state or in a shaking state.
[0124]
PG in this specimen can be measured by identifying the change induced by PG in the specimen in the insect body fluid in the reagent during and / or after the incubation.
Changes caused by PG in the specimen are the presence or absence of enzyme activity of benzoylarginine ethyl ester degrading enzyme (BAEEase), PPAE, PO, and other enzymes involved in the ProPO cascade, and the expression time of these enzyme activities. Can be specified as Moreover, it can also specify as the presence or absence and intensity | strength of the pigment | dye of the produced dopachrome or melanin.
[0125]
Specifically, for example, a method for measuring PPAE activity as described in JP-A-7-184690, or PO activation as described in JP-A-1-142466 and JP-B-7-114707. Identify changes induced by PG in the sample by methods such as measuring the degree of quinoline pigment produced, measuring melanin pigment produced by DOPA oxidation, and measuring BAEEase activity. can do.
[0126]
Such enzyme activity, enzyme activity expression time, or pigment change may be specified after a certain period of incubation, or may be specified as a change rate during incubation or an integral value thereof, and the method is not particularly limited. .
[0127]
In addition, by specifying such enzyme activity, enzyme activity expression time, or pigment change, and correlating the presence or absence of this change with or without PG, or the degree (intensity) of this change and the amount of PG, PG can be specifically measured.
For example, qualitative measurement can be performed such that PG is not present in the sample when the change is not present, and PG is present in the sample when the change is present. It is also possible to associate a known amount of PG with the corresponding change in advance by a calibration curve or the like, and to specifically quantify PG from the change when the sample is measured.
[0128]
The above change may be identified visually as long as it utilizes a change in the dye, or may be identified using a spectrophotometer or a microplate reader. In addition, when a change other than a dye is used, it may be specified using a means capable of detecting it, and the means can be appropriately determined by a person skilled in the art.
The specific method of the PG measurement method (1) of the present invention is limited as long as the PGRP reaction in the insect body fluid functions within the sensitivity and measurement range suitable for the purpose and qualitative or quantitative measurement of PG is possible. Is not to be done.
[0129]
<6> PG measurement method of the present invention (2)
In the PG measurement method (2) of the present invention, a sample is mixed with the PG measurement agent of the present invention (1) or the PG measurement agent of the present invention (2), and the insect body fluid contained in the measurement agent is mixed in the mixed sample. This is a PG-specific measurement method in which PG in this specimen is measured by specifying a change caused by PG.
[0130]
In the PG measurement method (2) of the present invention, the specimen and the PG measurement agent of the present invention (1) or the PG measurement agent of the present invention (2) are mixed and incubated in the same manner as described in <5> above. As described in <5> above, PG in this sample can be measured by specifying a change caused by PG in the mixed sample.
[0131]
In the PG measurement method (2) of the present invention, the βGRP inhibitor of the present invention may coexist in the sample. The method for allowing the measuring agent of the present invention to coexist in the sample, the amount of the measuring agent of the present invention to coexist, the timing of coexisting, etc. are the same as described in <5> above.
The specific method of the PG measurement method (2) of the present invention is limited as long as the PGRP reaction in the insect body fluid functions in a sensitivity and measurement range suitable for the purpose and qualitative or quantitative measurement of PG is possible. Is not to be done.
[0132]
<7> PG measurement method of the present invention (3)
The PG measurement method (3) of the present invention comprises contacting a specimen with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) below on an insoluble carrier. The obtained specimen that does not substantially activate the βGRP reaction and a reagent prepared using insect body fluid as a raw material are mixed, and the insect body fluid contained in this reagent contains the specimen in contact with the insoluble immobilization product. This is a PG-specific measurement method in which PG in this specimen is measured by specifying a change caused by PG.
[0133]
▲ 1 ▼ (1 → 3) -β-D-glucan binding protein
(2) Anti- (1 → 3) -β-D-glucan antibody
▲ 3 ▼ (1 → 3) -β-D-glucan degrading enzyme
The description of the substances (1) to (3) above has already been given in <2>.
The insoluble carrier and immobilization method that can be used for immobilizing one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) used in the PG measurement method (3) of the present invention are as described above. This is the same as the anti-βGRP antibody and aprotinin described in <4>.
[0134]
The sample is brought into contact with the insoluble immobilization product obtained by immobilizing one or two or more substances selected from the group of substances (1) to (3) on the insoluble carrier in this way, and the insoluble immobilization product is obtained. If is removed, a specimen that does not substantially activate the βGRP reaction can be obtained. The contact between the insoluble immobilized product and the specimen can be performed according to the contact method described in <4> above.
[0135]
The reagent prepared using insect body fluid as a raw material that can be mixed with the specimen thus obtained may be not only a PG-specific reagent but also a reagent that reacts with both PG and βG.
The specimen obtained as described above and a reagent prepared using insect body fluid as a raw material are mixed, incubated in the same manner as described in the above <5> (the PG measurement method of the present invention (1)), and the above < In the same manner as described in 5>, by specifying the change caused by the PG in the sample, the PG in the sample can be measured.
[0136]
In the PG measurement method (3) of the present invention, the βGRP inhibitor of the present invention may coexist in the sample. The method for allowing the measuring agent of the present invention to coexist in the sample, the amount of the measuring agent of the present invention to coexist, the timing of coexisting, etc. are the same as described in <5> above.
The specific method of the PG measurement method (3) of the present invention is limited as long as the PGRP reaction in the insect body fluid functions in a sensitivity and measurement range suitable for the purpose and qualitative or quantitative measurement of PG is possible. Is not to be done.
[0137]
As described in detail in <2> to <7> above, in the peptidoglycan-related invention of the present invention, the PG measuring agent of the present invention plays a central role. As particularly representative embodiments using the PG measuring agent of the present invention, for example, the following embodiments (a) to (i) can be exemplified. The following embodiments are merely examples for more specifically explaining the present invention, and the embodiments of the present invention are not limited to these.
[0138]
(a) An embodiment in which the PG measuring agent (1) of the present invention prepared by adding the βGRP inhibitor of the present invention is used when collecting insect body fluid and / or preparing components from the body fluid.
(b) An embodiment using the PG measuring agent (1) of the present invention obtained by adding the βGRP inhibitor of the present invention to an insect body fluid collected and prepared in advance.
(c) An embodiment using the PG measurement agent of the present invention (1) obtained by dissolving a freeze-dried product of an insect body fluid with a solution containing the βGRP inhibitor of the present invention.
[0139]
(d) A mode of using the PG measuring agent (1) of the present invention prepared by adding the βGRP inhibitor of the present invention to a solution obtained by dissolving a freeze-dried product of an insect body fluid with an appropriate lysis solution.
(e) Insect fluid collected and prepared by adding the βGRP inhibitor of the present invention, or a reagent obtained by lyophilization in the presence of the necessary amount of the βGRP inhibitor in the presence of the insect body fluid in advance dissolved in an appropriate solution An embodiment using the PG measuring agent (1) of the present invention.
(f) Lyophilized product of insect body fluid and synthetic substrate or commercially available SLP reagent is dissolved in a solution containing the βGRP inhibitor of the present invention, or the βGRP inhibitor of the present invention is added to a solution prepared by dissolving in an appropriate solution. Aspect.
[0140]
(g) An embodiment in which a reagent obtained by lyophilization in which a necessary amount of the βGRP inhibitor of the present invention coexists in a mixed solution of an insect body fluid and a synthetic substrate is dissolved in an appropriate solution and used.
(h) A mode in which a necessary amount of the βGRP inhibitor of the present invention is added to a specimen.
(i) A mode in which the βGRP inhibitor of the present invention, specimen, synthetic substrate and insect body fluid are mixed at the time of measurement.
These embodiments are included in any of the present inventions described in detail in <2> to <7> above.
[0141]
<8> PG measurement kit of the present invention
The PG measurement kit of the present invention is a PG-specific measurement kit containing at least the βGRP inhibitor of the present invention, the PG measurement agent of the present invention (1), or the PG measurement agent of the present invention (2).
The present invention βGRP inhibitor, the present PG measuring agent (1) and the present PG measuring agent (2) that can be used as a constituent of the PG measurement kit of the present invention are any of a solution state, a frozen state, and a lyophilized state. Although it can be provided in a state, it is preferably provided in a lyophilized state.
[0142]
In addition, the PG measurement kit of the present invention further includes a solution for use in dissolving a freeze-dried product of the βGRP inhibitor of the present invention, the PG measurement agent of the present invention (1) and the PG measurement agent of the present invention (2), an enzyme substrate. In addition, a reaction solution / measurement vessel such as a dissolution solution used for dissolving an enzyme substrate, standard PG, or a PG-free microplate can be added as a constituent component. The enzyme substrate is preferably a synthetic substrate. The PG measurement kit of the present invention can be used for specific measurement of PG by the same method as described in <5> above.
[0143]
<9> Bacterial detection kit of the present invention
The bacterium detection kit of the present invention is a bacterium detection kit containing at least the βGRP inhibitor of the present invention, the PG measurement agent of the present invention (1), or the PG measurement agent of the present invention (2).
The components of the bacterial detection kit of the present invention, the method of using the same, etc. are the same as those described in <8> above, and bacteria can be detected by specifically measuring PG.
[0144]
This is based on the fact that PG is contained in the cell wall of bacteria, and it is possible to qualitatively detect the presence or absence of bacteria, and to detect quantitatively that detects the amount of bacteria. It is. The bacterium that can be detected is not particularly limited as long as it has PG as a cell wall component. Etc.). Since the fungus (for example, Candida albicans, Aspergillus flavus, Cryptococcus neoformans, etc.) is not detected by the bacterial detection kit of the present invention, Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria can be specifically detected.
[0145]
<10> Bacterial diagnostic kit of the present invention
The bacterial diagnostic kit of the present invention is a kit for diagnosing bacterial infections comprising at least the βGRP inhibitor of the present invention, the PG measuring agent of the present invention (1) or the PG measuring agent of the present invention (2).
The components of the bacterial detection kit of the present invention, the method of using the same, etc. are the same as described in <9> above, and the bacteria in the body fluid are detected by specifically measuring the PG in the body fluid, whereby the bacterial infection Diagnosis can be made by differentiating the disease. The body fluid to which the bacterial diagnostic kit of the present invention can be applied is preferably a mammalian body fluid, and particularly preferably a human body fluid from the viewpoint that a method for treating a bacterial infection is established. Specifically, serum, plasma, whole blood, urine, spinal fluid, milk and the like are preferable as the body fluid.
[0146]
By using the bacterial diagnosis kit of the present invention, it is possible to detect the presence or absence of bacteria in body fluids and perform differential diagnosis of bacterial infections. That is, if PG is detected in a body fluid using the bacterial diagnosis kit of the present invention, a bacterial infection is diagnosed. Moreover, the severity of bacterial infection can be diagnosed by detecting the amount of PG in the body fluid. For example, if the amount of PG detected in body fluid is large, a severe bacterial infection is diagnosed.
[0147]
Moreover, the effect of the drug used for the treatment can be determined by detecting the amount of PG in the body fluid using the bacterial diagnostic kit of the present invention. That is, if the amount of PG in the body fluid decreases, it can be seen that the drug used for treatment is effective.
Bacterial infections that can be diagnosed using the bacterial diagnosis kit of the present invention are bacterial infections in which PG is a cell wall component, and more specifically, Gram-positive bacterial infections and Gram-negative bacterial infections. Since the fungus is not detected in the bacterial diagnosis kit of the present invention, a Gram-positive bacterial infection or a Gram-negative bacterial infection can be differentially diagnosed.
[0148]
3. (1 → 3) -β-D-glucan related invention
<11> PGRP inhibitor of the present invention
The PGRP inhibitor of the present invention is an inhibitor of the PGRP reaction and has an action of suppressing the PGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid. More preferably, the PGRP inhibitor has an action of suppressing the PGRP system reaction without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and does not substantially inhibit the βGRP system reaction.
[0149]
The substance that can be used as an active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention is a “competitive inhibitory substance that competes with PG that activates PGRP and binds to PGRP and / or a PGRP-based reaction factor to suppress the PGRP-based reaction. And “deactivation inhibitor” that does not activate PGRP by acting on PG itself, which activates PGRP.
[0150]
(1) Competitive inhibitor used as an active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention
The competitive inhibitory substance that can be used as the active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can exert the above competitive inhibitory action. For example, it is shown in (1) below. Substances are mentioned and preferred.
[0151]
(1) Anti-peptidoglycan recognition protein antibody
An anti-peptidoglycan recognition protein antibody (hereinafter also referred to as anti-PGRP antibody) is an antibody against PGRP, and this antibody can inactivate PGRP by capturing PGRP present in insect body fluid based on an antigen-antibody reaction. It is an antibody (neutralizing antibody). The anti-PGRP antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can capture PGRP based on an antigen-antibody reaction and inactivate PGRP.
[0152]
A polyclonal anti-PGRP antibody and a monoclonal anti-PGRP antibody can be obtained by the same method as the method for preparing an anti-βGRP antibody described in <2> above, using purified PGRP as an antigen. The purification method is the same as in the case of the anti-βGRP antibody.
[0153]
In addition, although the anti-PGRP antibody can be used as it is, it is also possible to use a fragmented one similar to the anti-βGRP antibody described in <2> above, and a fragment containing the Fab portion of the anti-PGRP antibody. And chimeric antibodies are also included in the “anti-PGRP antibody” herein.
[0154]
By using an anti-PGRP antibody, it is possible to inhibit the PGRP system reaction without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade, and the βGRP system reaction is not inhibited.
[0155]
The competitive inhibitor can coexist in the insect body fluid and / or specimen, but it is preferable to coexist in the insect body fluid because the PGRP reaction can be efficiently inhibited.
In addition, what is called a person skilled in the art can determine suitably the quantity of this invention PGRP inhibitor which can be made to coexist according to the method as described in said <3>.
[0156]
(2) Deactivation inhibitor used as an active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention
As long as the deactivation inhibitory substance that can be used as an active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention is a substance that acts on PG itself that activates PGRP, deactivates it, and exhibits an action that does not activate PGRP. Although not particularly limited, for example, the following substances (2) to (5) are mentioned and preferred.
[0157]
(2) Strong alkali
Strong alkali acts on PG, but hardly acts on βG, so that PG can be specifically deactivated. In addition, PG deactivated by strong alkali does not activate PGRP, but does not affect the βGRP reaction at all.
[0158]
The strong alkali that can be used here includes and is preferably an alkali metal hydroxide (for example, lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.).
When a strong alkali is allowed to coexist in the specimen in an appropriate amount, the strong alkali acts on PG, thereby deactivating the PGRP activation ability of PG and suppressing the PGRP reaction. In addition, a sample coexisting with a strong alkali should be neutralized with an appropriate acid (for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, etc.) or diluted with water or a buffer solution before βG measurement using an insect body fluid. It is preferable to keep it.
[0159]
When neutralized, white turbidity or reaction inhibition may occur. Therefore, in order to avoid this, it is more preferable to take means for removing salts such as desalting as necessary.
By coexisting a strong alkali with the specimen, it is possible to inhibit the PGRP system reaction without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade, and the βGRP system reaction is not inhibited.
[0160]
(3) Lysozyme
Since lysozyme acts on PG but not on βG, it can specifically deactivate PG. In addition, PG deactivated by lysozyme does not activate PGRP, but does not affect the βGRP reaction at all.
The lysozyme that can be used here is not particularly limited as long as PG can be specifically deactivated. For example, lysozyme derived from chicken egg white can be exemplified. Such lysozyme is commercially available and can be used.
[0161]
By allowing lysozyme to coexist in an appropriate amount with the specimen and / or insect body fluid (preferably the specimen), lysozyme acts on the PG, whereby the PGRP activation ability of PG is deactivated and the PGRP reaction is suppressed.
By allowing lysozyme to coexist in the specimen and / or insect body fluid, it is possible to inhibit the PGRP system reaction without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade, and the βGRP system reaction is not inhibited.
[0162]
(4) Proteolytic enzyme
Proteolytic enzymes act on PG but do not act on βG, and can specifically deactivate PG. Moreover, PG inactivated by proteolytic enzymes does not activate PGRP, but does not affect the βGRP reaction at all.
[0163]
The proteolytic enzyme that can be used here is not particularly limited as long as PG can be specifically inactivated, but it is an endo-type proteolytic enzyme, and in particular, a proteolytic enzyme that can degrade L-alanine. Preferred examples of such an enzyme include Streptomyces griseus-derived protease, and commercially available products such as protease P (manufactured by Kaken Pharmaceutical), Streptomyces griseus protease 3 (purified from pronase P), and the like.
[0164]
By allowing a suitable amount of proteolytic enzyme to coexist in the specimen, the proteolytic enzyme acts on PG, thereby inactivating the PGRP activation ability of PG and suppressing the PGRP reaction.
[0165]
In addition, it is necessary to inactivate the proteolytic enzyme in the specimen before the βG measurement using the insect body fluid. The method for inactivating the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as the proteolytic enzyme in the sample is inactivated and βG in the sample is not inactivated. For example, boiling (for example, about 100 ° C. for several minutes) treatment Etc. are exemplified and preferred.
[0166]
By allowing the sample to coexist with a proteolytic enzyme, the PGRP system reaction can be inhibited without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade, and the βGRP system reaction is not inhibited.
[0167]
(7) Anti-peptidoglycan antibody
An anti-peptidoglycan antibody (hereinafter also referred to as an anti-PG antibody) is an antibody against PG, and this antibody captures PG present in a specimen based on an antigen-antibody reaction, thereby inactivating the PG (medium Japanese antibody). The anti-PG antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can capture PG based on an antigen-antibody reaction and inactivate PG.
[0168]
The polyclonal anti-PG antibody and the monoclonal anti-PG antibody can be prepared in the same manner as the anti-βGRP antibody of <2> above, using purified PG as an antigen.
The anti-PG antibody can be used as it is, but as long as the action as a neutralizing antibody is not lost, it is possible to produce a Fab-containing fragment or a chimeric antibody (such as a chimeric antibody containing a Fab portion), Such fragments and chimeric antibodies can also be used in the present invention.
[0169]
In addition, fragments and chimeric antibodies containing the Fab portion of these anti-PG antibodies are also included in the “anti-PG antibody” in the present specification.
By allowing an anti-PG antibody to coexist in an appropriate amount in a specimen and / or insect body fluid (preferably a specimen), the anti-PG antibody binds to PG to form a complex, thereby deactivating the ability of PG to activate PGRP, PGRP system reaction is suppressed.
[0170]
By allowing an anti-PG antibody to coexist in a specimen and / or insect body fluid (preferably a specimen), the PGRP reaction can be inhibited without activating the PGRP reaction of the ProPO cascade, and the βGRP reaction is Not disturbed.
The above-described substances that can be used as the active ingredient of the PGRP inhibitor of the present invention can be used alone as an active ingredient, or a plurality can be combined as an active ingredient.
[0171]
The PGRP inhibitor of the present invention can use the above-mentioned effective component of the PGRP inhibitor of the present invention as it is, but may contain other components as long as the action of the PGRP inhibitor of the present invention is not substantially impaired. For example, excipients, buffers, stabilizers, preservatives and the like that are used in the preparation of ordinary reagents can be included.
[0172]
<12> βG measuring agent of the present invention (1)
The βG measuring agent (1) of the present invention is a βG-specific measuring agent in which one or two or more substances selected from the following substance groups (1) to (3) coexist in an insect body fluid.
(1) Anti-peptidoglycan recognition protein antibody
(2) Lysozyme
(3) Anti-peptidoglycan antibody
[0173]
Insects that can be used as a source of insect body fluid that can be used in the present invention, a method for collecting the body fluid, and a commercially available reagent that reacts with both PG and βG prepared using insect body fluid as a raw material This is the same as described in 3>.
In the βG measuring agent (1) of the present invention, substances that can coexist in the insect body fluid are as follows. Each substance has already been described in <11> above.
[0174]
The βG measuring agent (1) of the present invention capable of specifically measuring βG is obtained by allowing an insect body fluid to coexist with one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) above. be able to.
The coexistence method of the insect body fluid and one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) is not particularly limited as long as βG can be specifically measured. A method of coexistence by adding one or two or more substances selected from the group of substances (1) to (3) above is preferred because it is extremely simple.
[0175]
Here, the amount of one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) to be coexisted with the insect body fluid is an amount necessary for completely inhibiting the PGRP reaction, Can be determined according to the method described in <3> above.
[0176]
<13> βG measuring agent of the present invention (2)
The βG assay agent (2) of the present invention is substantially ProPO obtained by bringing an insoluble immobilized product obtained by immobilizing an anti-PGRP antibody on an insoluble carrier into contact with an insect body fluid or a reagent prepared using the insect body fluid. It is a βG-specific measuring agent in which the cascade is not activated.
[0177]
That is, in the process of preparing the βG assay agent (2) of the present invention, the insoluble immobilization product obtained by immobilizing the anti-PGRP antibody on an insoluble carrier is used, so that the enzyme involved in the PGRP and / or PGRP system reaction It can be adsorbed and removed by an immobilized product.
[0178]
The anti-PGRP antibody that can be used in the βG measuring agent (2) of the present invention has already been described in the above <11>.
The insoluble carrier that can be used for immobilizing the anti-PGRP antibody and immobilization can be performed in the same manner as described for the anti-βGRP antibody and aprotinin in <4> above.
[0179]
The βG assay agent (2) of the present invention can be obtained by contacting the insect body fluid with the insoluble immobilization product obtained by immobilizing the anti-PGRP antibody on the insoluble carrier in this manner and removing the insoluble immobilization product. .
The contact method between the insoluble immobilized product and the insect body fluid is the same as the contact method described in the above <4>.
The thus obtained βG measuring agent (2) of the present invention is capable of specifically measuring PG without substantially activating the ProPO cascade.
[0180]
<14> βG measurement method of the present invention (1)
In the βG measurement method (1) of the present invention, when βG in a specimen is measured using a reagent prepared from insect body fluid, the following substances (1) to (3) are contained in the reagent and / or the specimen. Measuring βG in this sample by coexisting with one or more substances selected from the group and identifying changes in insect body fluids contained in this reagent caused by βG in this sample; This is a specific method for measuring βG.
[0181]
(1) Anti-peptidoglycan recognition protein antibody
(2) Lysozyme
(3) Anti-peptidoglycan antibody
The βG measurement method (1) of the present invention has the effect of strongly inhibiting the activation of PGRP present in the insect body fluid, as demonstrated in the examples described later. This makes it possible to specifically detect and measure βG in a specimen without being affected by the PGRP reaction system.
[0182]
In the PG measurement method (1) of the present invention, the substances (1) to (3) mentioned above can coexist with (A) a reagent prepared from insect body fluid as a raw material (for example, a commercially available product that reacts with both PG and βG). Reagents (SLP reagents, etc.)), (B) specimens, (C) Reagents prepared from insect body fluids (for example, commercially available reagents that react with both PG and βG (SLP reagents, etc.)) and specimens But you can.
[0183]
The coexistence method of the reagent and / or specimen prepared from the insect body fluid and the above substances (1) to (3) is not particularly limited as long as βG can be specifically measured. The method of coexistence by adding the substances (1) to (3) to the reagent and / or specimen is preferable because it is extremely simple.
[0184]
Here, the amounts of the above-mentioned substances (1) to (3) that coexist in the reagent and / or sample prepared using insect body fluid are the amounts necessary to completely inhibit the PGRP reaction. The method for determining the amount of the βGRP inhibitor of the present invention to be coexisted in the insect body fluid described in the above <3> can be carried out. The coexistence time, incubation conditions, and the like are the same as described in <5> above.
[0185]
ΒG in this specimen can be measured by identifying changes induced by βG in the specimen in the insect body fluid in the reagent during and / or after incubation.
The method for specifying the change caused by βG in the sample, the correlation between this change and the amount of βG, and the method for measuring βG in the sample based on this method are the same as the measurement method described in <5> above.
[0186]
The βG measurement method (1) of the present invention is limited in its specific mode as long as the βGRP system reaction in the insect body fluid functions in a sensitivity and measurement range suitable for the purpose and βG can be qualitatively or quantitatively measured. Is not to be done.
[0187]
<15> βG measurement method of the present invention (2)
The βG measurement method (2) of the present invention is a specimen that does not substantially activate the PGRP reaction obtained by allowing a specimen to coexist with one or more substances selected from the group of substances (1) to (4) below. Is mixed with a reagent prepared using insect body fluid as a raw material, and βG in this specimen is measured by specifying the change caused by βG in the mixed specimen in the insect body fluid contained in this reagent This is a specific measurement method for βG.
[0188]
(1) Strong alkali
(2) Lysozyme
(3) Proteolytic enzyme
(4) Anti-peptidoglycan antibody
The detailed description of the substances (1) to (4) is the same as that of the PG inhibitor of the present invention described above.
[0189]
In the βG measurement method (2) of the present invention, as demonstrated in the examples described later, the substances (1) to (4) above inactivate the PGRP activation ability of PG in the specimen, This is a method that can specifically detect and measure βG in a specimen without being affected by the PGRP reaction system by utilizing the effect of strongly inhibiting the activation of PGRP present in a body fluid. By allowing the substances (1) to (4) above to coexist in the specimen, a specimen that does not substantially activate the PGRP system reaction can be obtained.
[0190]
In addition, the specimen obtained by coexisting the substance of (1) or (3) above, which does not substantially activate the PGRP system reaction, should be mixed with a reagent prepared using insect body fluid as a raw material. As described in <11> above, it is necessary to appropriately perform operations such as boiling, neutralization and dilution.
[0191]
The reagent prepared using insect body fluid as a raw material that can be mixed with the specimen thus obtained may be not only a βG-specific reagent but also a reagent that reacts with both PG and βG.
[0192]
The specimen obtained as described above and a reagent prepared using insect body fluid as a raw material are mixed, incubated in the same manner as described in <5> above, and further the same as described in <5> above By identifying changes induced by βG in the sample by the method, βG in the sample can be measured.
The βG measurement method (4) of the present invention is limited in its specific mode as long as the βGRP system reaction in the insect body fluid functions within the sensitivity and measurement range suitable for the purpose, and qualitative or quantitative measurement of βG is possible. Is not to be done.
[0193]
<16> Invention βG measurement method (3)
In the βG measurement method (3) of the present invention, a sample and the βG measurement agent (1) or βG measurement agent (2) of the present invention are mixed, and the insect body fluid contained in the measurement agent is mixed in the mixed sample. This is a βG-specific measurement method in which βG in this specimen is measured by specifying the change induced by βG.
[0194]
In the βG measurement method (3) of the present invention, the specimen and the βG measurement agent (1) or βG measurement agent (2) of the present invention are mixed and incubated in the same manner as described in <13> above. Furthermore, βG in this sample can be measured by specifying the change induced by βG in this sample by the same method as described in <13> above.
[0195]
In the βG measurement method (3) of the present invention, the PGRP inhibitor of the present invention may coexist in the sample. The method for allowing the PGRP inhibitor of the present invention to coexist in the sample, the amount of the present PGRP inhibitor to coexist, the timing of coexisting, etc. are the same as described in <5> above.
[0196]
The βG measurement method (3) of the present invention is limited in its specific mode as long as the βGRP system reaction in the insect body fluid functions within the sensitivity and measurement range suitable for the purpose and qualitative or quantitative measurement of βG is possible. Is not to be done.
[0197]
<17> βG measurement method of the present invention (4)
The βG measurement method (4) of the present invention comprises contacting a specimen with an insoluble immobilized product obtained by immobilizing one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) below on an insoluble carrier. The obtained specimen that does not substantially activate the PGRP reaction is mixed with a reagent prepared using insect body fluid as a raw material, and the insect body fluid contained in this reagent contains the specimen in contact with the insoluble immobilization product. This is a βG-specific measurement method in which βG in this specimen is measured by specifying a change induced by βG.
[0198]
▲ 1 lysozyme
(2) Proteolytic enzyme
(3) Anti-peptidoglycan antibody
The detailed description of the substances (1) to (3) is the same as that of the PG inhibitor of the present invention described above.
[0199]
The insoluble carrier and immobilization which can be used for immobilizing one or more substances selected from the group of substances (1) to (3) used in the βG measurement method (4) of the present invention are the above < It can be performed in the same manner as for the anti-βGRP antibody and aprotinin of 4>.
[0200]
The sample is brought into contact with the insoluble immobilization product obtained by immobilizing one or two or more substances selected from the group of substances (1) to (3) on the insoluble carrier in this way, and the insoluble immobilization product is obtained. If is removed, a specimen that does not substantially activate the PGRP reaction can be obtained. The contact method between the insoluble immobilized product and the specimen can be performed according to the contact method described in <4> above.
[0201]
The reagent prepared from insect body fluid that can be mixed with the specimen obtained here may be not only a βG-specific reagent but also a reagent that reacts with both PG and βG.
The specimen obtained as described above and a reagent prepared using insect body fluid as a raw material are mixed, incubated in the same manner as described in <5> above, and further the same as described in <5> above By identifying changes induced by βG in the sample by the method, βG in the sample can be measured.
[0202]
In the βG measurement method (4) of the present invention, the PGRP inhibitor of the present invention may coexist in the sample. The method for allowing the PGRP inhibitor of the present invention to coexist in the specimen, the amount of the present PGRP inhibitor to coexist, the timing of coexisting, etc. are the same as described in <5> above.
[0203]
The βG measurement method (4) of the present invention is limited in its specific mode as long as the βGRP system reaction in the insect body fluid functions within the sensitivity and measurement range suitable for the purpose, and qualitative or quantitative measurement of βG is possible. Is not to be done.
[0204]
As described in detail in <11> to <17> above, in the (1 → 3) -β-D-glucan-related invention of the present invention, the βG measuring agent of the present invention plays a central role. As typical embodiments using the βG measuring agent of the present invention, for example, the following embodiments (a) to (i) can be exemplified. The modes shown below are merely examples for more specifically explaining the present invention, and the embodiments of the present invention are not limited to these.
[0205]
(a) An embodiment in which the βG assay agent (1) of the present invention prepared by adding the PGRP inhibitor of the present invention is used when collecting insect fluid and / or preparing components from the fluid.
(b) An embodiment using the βG assay agent (1) of the present invention obtained by adding the PGRP inhibitor of the present invention to an insect body fluid collected and prepared in advance.
(c) An embodiment using the βG assay agent (1) of the present invention in which a freeze-dried product of an insect body fluid is dissolved in a solution containing the PGRP inhibitor of the present invention.
[0206]
(d) An embodiment using the βG assay agent (1) of the present invention prepared by adding the PGRP inhibitor of the present invention to a solution obtained by dissolving a freeze-dried product of an insect body fluid in an appropriate solution.
(e) An insect body fluid collected and prepared by adding the PGRP inhibitor of the present invention, or a reagent obtained by lyophilization in the presence of a necessary amount of the PGRP inhibitor of the present invention in advance and dissolved in an appropriate solution Embodiment using the βG measuring agent (1) of the present invention.
(f) Lyophilized product of insect body fluid and synthetic substrate or commercially available SLP reagent is dissolved in a solution containing the PGRP inhibitor of the present invention, or the PGRP inhibitor of the present invention is added to a solution prepared by dissolving in an appropriate solution. Aspect.
[0207]
(g) An embodiment in which a reagent obtained by lyophilization in which a necessary amount of the PGRP inhibitor of the present invention coexists in a mixed solution of an insect body fluid and a synthetic substrate is dissolved in a suitable solution.
(h) A mode in which a necessary amount of the PGRP inhibitor of the present invention is added to a specimen.
(i) A mode in which the PGRP inhibitor of the present invention, specimen, synthetic substrate and insect body fluid are mixed at the time of measurement.
These embodiments are included in any of the present inventions described in detail in <11> to <17> above.
[0208]
<18> βG measurement kit of the present invention
The βG measurement kit of the present invention is a βG-specific measurement kit containing at least the PGRP inhibitor of the present invention, the βG measurement agent of the present invention (1) or the βG measurement agent of the present invention (2).
The PGRP inhibitor of the present invention, the βG measuring agent of the present invention (1) and the βG measuring agent of the present invention (2) that can be used as components of the βG measurement kit of the present invention are any of a solution state, a frozen state, and a lyophilized state. Although it can be provided in a state, it is preferably provided in a lyophilized state.
[0209]
In addition, the βG measurement kit of the present invention further includes a lysis solution, an enzyme used for dissolving a lyophilized product of the PGRP inhibitor of the present invention, the βG measurement agent of the present invention (1) and the βG measurement agent of the present invention (2) as necessary. A reaction solution / measurement vessel such as a substrate, a dissolving solution used for dissolving an enzyme substrate, a standard βG, or a βG-free microplate can be added as a constituent component. The enzyme substrate is preferably a synthetic substrate. The βG measurement kit of the present invention can be used for βG-specific measurement in the same manner as the method described in detail in <5> above.
[0210]
<19> The fungus detection kit of the present invention
The fungal detection kit of the present invention is a fungal detection kit containing at least the PGRP inhibitor of the present invention, the βG measuring agent (1) of the present invention, or the βG measuring agent of the present invention (2).
The components of the fungus detection kit of the present invention, the method of using the same and the like are the same as those described in <8> above, and fungi can be detected by specifically measuring βG. This is based on the fact that βG is contained in the fungal cell wall, and it is possible to qualitatively detect the presence or absence of the fungus, and also to detect quantitatively that the amount of fungus is detected. It is.
[0211]
The fungus that can be detected is not particularly limited as long as βG is a cell wall component, and examples thereof include Candida albicans, Aspergillus flavus, Saccharomyces cerevisiae, and the like. The fungus detection kit of the present invention does not detect bacteria (eg, Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Micococcus lysodeikticus, Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, etc.). can do.
[0212]
<20> Fungal diagnostic kit of the present invention
The fungal diagnostic kit of the present invention is a kit for diagnosing a fungal infection comprising at least the PGRP inhibitor of the present invention, the βG measuring agent of the present invention (1) or the βG measuring agent of the present invention (2).
The components of the fungus detection kit of the present invention, the method of using the same, etc. are the same as described in <19> above, and fungi in a body fluid are detected by specifically measuring βG in the body fluid, thereby Diagnosis can be made by differentiating the disease. The body fluid to which the fungal diagnostic kit of the present invention can be applied is preferably a mammalian body fluid, and particularly preferably a human body fluid from the viewpoint that a method for treating a fungal infection is established. Specifically, serum, plasma, whole blood, urine, spinal fluid, milk and the like are preferable as the body fluid.
[0213]
By using the fungal diagnostic kit of the present invention, it is possible to detect the presence or absence of βG in a body fluid and perform a differential diagnosis of a fungal infection. That is, if βG is detected in a body fluid using the fungal diagnostic kit of the present invention, a fungal infection is diagnosed. Moreover, the severity of fungal infection can be diagnosed by detecting the amount of βG in the body fluid. For example, if the amount of βG detected in the body fluid is large, a severe fungal infection is diagnosed.
[0214]
Moreover, the effect of the drug used for treatment can also be determined by detecting the amount of βG in the body fluid using the fungal diagnostic kit of the present invention. That is, if the amount of βG in the body fluid decreases, it can be seen that the drug used for treatment is effective.
The fungal infection that can be diagnosed using the fungal diagnostic kit of the present invention is a fungal infection in which βG is a cell wall component. Since the bacteria diagnosis kit of the present invention does not detect bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, it can differentially diagnose fungal infections.
[0215]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, examples of the present invention will be described and the present invention will be described more specifically. However, these examples are not intended to limit the technical scope of the present invention.
[0216]
[Example A] Examples of peptidoglycan-related inventions
[Example A1]Example of PG measurement method using PG measurement agent of the present invention, prepared by adding βGRP reaction inhibitor to silkworm plasma
(Method)
The present invention βGRP reaction inhibitor (Laminarin; poly (1 → 3) -β-D-glucoside having a number average molecular weight (Mn) of 5,850 derived from Laminaria digitata; sold by Sigma) 0.5 mg Then, 0.1 mL of 80 mM calcium chloride solution was added and mixed to obtain the PG measuring agent of the present invention.
Further, 0.1 mL of an 80 mM calcium chloride solution was added to 1.0 mL of silkworm plasma and mixed to obtain a comparative measuring agent not containing poly (1 → 3) -β-D-glucoside.
[0217]
50 μL of each of these measuring agents was dispensed into a predetermined well of a 96-well microplate with a lid (Toxipet Plate 96F; sold by Seikagaku Corporation), and 0.1 M phosphate buffer (containing 20 mM DOPA, pH 6.0) ) 50 μL, distilled water (blank), PG of predetermined concentration (PG prepared from Micrococcus luteus by hot trichloroacetic acid (TCA) and trypsin (hereinafter also referred to as PGML); Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) Or βG (Mn = 216,000 βG obtained from a curdlan by molecular sieving according to the method described in WO90 / 02951 (hereinafter referred to as βG).216Add 50 μL separately, set the lid on the microplate reader with built-in thermostat and analysis program (Well Reader SK601; sold by Seikagaku Corporation), and kinetic at 60 ° C for 60 minutes. Measured by the method (reaction time method). The amount of dye generated with the activation by PG and βG is regarded as a change in absorbance, and after the measurement is completed, the reaction time (Ta) until the absorbance reaches a threshold value is automatically calculated. The relationship of Ta value to each concentration is automatically illustrated.
[0218]
(result)
2 and 3, the relationship between the PG concentration and βG concentration and the Ta value is shown by using the logarithmic axis for both the horizontal axis and the vertical axis.
When the PG measuring agent of the present invention is used, good linearity is obtained with PG depending on its concentration, and it does not react at all with βG, and a blank value (Ta> 60 minutes) (Fig. 2).
[0219]
On the other hand, the comparative measuring agent not containing poly (1 → 3) -β-D-glucoside reacts not only with PG but also with βG, and both have good linearity depending on the concentrations of PG and βG. Obtained (FIG. 3).
From these results, the PG measurement agent of the present invention suppresses the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the PGRP system reaction is not substantially inhibited. It was shown that. It was also shown that PG can be measured specifically, with high sensitivity and with good quantitativeness by the PG measuring agent of the present invention.
[0220]
[Example A2]Example of PG measurement method using the PG measurement agent of the present invention from silkworm plasma prepared by immobilizing βGRP reaction inhibitor
(Method)
ΒGRP reaction inhibitors prepared according to the method described in JP-A-8-122334, respectively (in accordance with the method described in WO90 / 02951, curdlan (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were hydrolyzed with formic acid. , Mn 5,800 poly (1 → 3) -β-D-glucoside) -immobilized cellulofine (sold by Seikagaku Corporation) was used as an example of the present invention, and curdlan-immobilized cellulofine was a comparative example. Used as. Each of these was packed in a column (1.2 x 3.0 cm) and equilibrated with 0.01 M Tris-malate buffer (pH 6.5). Each column was loaded with 5.0 mL of silkworm plasma for elution (eluent: 0.01 M Tris-malate buffer, pH 6.5, elution rate: 9.0 mL / hour).
[0221]
After the silkworm plasma was loaded onto the column, the first 1.0 mL of the eluate was discarded, and the subsequent 5.0 mL of the eluate was collected to obtain a PG measuring agent.
To 1.0 mL of each PG measuring agent, add 0.1 mL of 80 mM calcium chloride solution, and after mixing, dispense 50 μL of the solution into a predetermined well of Toxipet 96F, and add 0.1 M phosphate buffer (containing 20 mM DOPA, pH 6 .0) Add 50 μL, distilled water (blank), PGML or βG at the specified concentration21650 μL was added separately, the lid was set, and the well reader SK601 was set, and measurement was performed in the same manner as in Example A1.
[0222]
(result)
4 and 5 show the relationship between the PG concentration and βG concentration and the Ta value using the logarithmic axis for both the horizontal and vertical axes. When the PG measuring agent of the present invention is used, good linearity is obtained depending on its concentration with PG, and it does not react at all with βG, and blank value (Ta> 60 minutes) (FIG. 4).
On the other hand, in the PG measuring agent for comparison obtained by curdlan-immobilized cellulofine column treatment, the measured value (Ta value) is 5.2 minutes at any concentration of PG and βG, and the blank Ta value ( 5.2 minutes) (FIG. 5).
[0223]
Silkworm plasma in contact with curdlan has been activated by the ProPO cascade, so it reacts without adding PG or βG, that is, with a blank, regardless of its concentration even when PG or βG is added. It shows a constant value and cannot measure the amount of PG.
From these results, the PG measurement agent of the present invention suppresses the βGRP system reaction without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the PGRP system reaction is not substantially inhibited. It was shown that. It was also shown that PG can be measured specifically, with high sensitivity and with good quantitativeness by the PG measuring agent of the present invention.
[0224]
[Example B] (1 → 3) -β-D-glucan related invention example
[Example B1]Example of βG measurement method using βG measuring agent of the present invention prepared by adding PGRP reaction inhibitor to silkworm plasma
(Method)
After adding 3.0 mg of PGRP reaction inhibitor (polyclonal anti-PGRP antibody prepared according to the method described in JP-A-4-52558) to silkworm plasma (1.0 mL), add 80 mL of calcium chloride solution (0.1 mL). The βG measuring agent of the present invention was obtained by mixing well. Further, 0.1 mL of 80 mM calcium chloride solution was added to 1.0 mL of silkworm plasma and mixed to obtain a comparative measuring agent not containing an anti-PGRP antibody. Dispense 50 μL of the solution into a predetermined well of Toxipet plate 96F, add 50 μL of 0.1 M phosphate buffer (containing 20 mM DOPA, pH 6.0), distilled water (blank), βG with a predetermined concentration.216Alternatively, 50 μL of PGML was separately added, the lid was set, and the well reader SK601 was set, and measurement was performed in the same manner as in Example A1.
[0225]
(result)
6 and 7 show the relationship between the βG concentration and the PG concentration and the Ta value using the logarithmic axis for both the horizontal axis and the vertical axis. When the βG measuring agent of the present invention is used, good linearity is obtained with βG depending on its concentration, and it does not react with PG at any concentration, and blank value (Ta> 60 minutes) (FIG. 6). On the other hand, the comparative measurement agent containing no anti-PGRP antibody reacted not only with βG but also with PG, and good linearity was obtained depending on the concentrations of βG and PG (FIG. 7).
[0226]
From these results, in the βG measuring agent of the present invention, the PGRP reaction is suppressed without activating the PGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the βGRP reaction is not substantially inhibited. It was shown that. Further, it was shown that βG can be measured specifically, with high sensitivity and with good quantitativeness by the βG measuring agent of the present invention.
[0227]
[Example B2]Example of βG measurement method using the βG-specific measuring agent of the present invention from silkworm plasma prepared by immobilizing a PGRP reaction inhibitor
[0228]
(Method)
According to the method described in JP-B-7-114706, each prepared PGRP reaction inhibitor (monoclonal anti-PGRP antibody prepared according to the method described in JP-A-4-52558), immobilized Sepharose 4B (Pharmacia) Peptidoglycan-immobilized Sepharose 4B was used as a comparative example.
[0229]
Each of these was packed in a column (1.2 x 3.0 cm) and equilibrated with 0.01 M Tris-malate buffer (pH 6.5). Each column was loaded with 5.0 mL of silkworm plasma for elution (eluent: 0.01 M Tris-malate buffer, pH 6.5, elution rate: 9.0 mL / hour).
After the silkworm plasma was loaded onto the column, the first 1.0 mL of the eluate was discarded, and the subsequent 5.0 mL of the eluate was collected to obtain a βG measuring agent.
[0230]
Add 80 mL of calcium chloride solution (0.1 mL) to each βG measuring agent (1.0 mL), mix, and dispense 50 μL of the solution into a predetermined well of Toxipet 96F, and add 0.1 M phosphate buffer (containing 20 mM DOPA, pH 6 .0) Add 50 μL, distilled water (blank), PGML or βG at the specified concentration21650 μL was added separately, the lid was set, and the well reader SK601 was set, and measurement was performed in the same manner as in Example A1.
[0231]
(result)
8 and 9 show the relationship between the βG concentration and the PG concentration and the Ta value using the logarithmic axis for both the horizontal axis and the vertical axis. When the βG measuring agent of the present invention is used, good linearity is obtained with βG depending on its concentration, and it does not react with PG at any concentration, and blank value (Ta> 60 minutes) (FIG. 8).
On the other hand, in the comparative βG measuring agent obtained by treatment with peptidoglycan-immobilized Sepharose 4B column, the measured value (Ta value) was 5.6 minutes at any concentration of βG and PG, and the blank Ta value (5 6 minutes) (FIG. 9).
[0232]
Silkworm plasma in contact with peptidoglycan has activated the ProPO cascade, so it reacts without adding βG or PG, that is, with a blank, and it remains constant regardless of its concentration even when βG or PG is added. The βG amount cannot be measured.
From these results, in the βG measuring agent of the present invention, the PGRP reaction is suppressed without activating the PGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the βGRP reaction is not substantially inhibited. It was shown that. Further, it was shown that βG can be measured specifically, with high sensitivity and with good quantitativeness by the βG measuring agent of the present invention.
[0233]
[Example B3]An example of a method for specifically measuring βG by allowing a PGRP reaction inhibitor to coexist in a specimen
[0234]
(Method)
ΒG as a sample216(8.4 ng / mL), PGML (8.4 ng / mL), and βG at twice the concentration of each2160.5 mL each of a mixture of equal amounts of PGML and PGML was prepared. To them, 0.5 mL of a PGRP reaction inhibitor (0.6 M aqueous sodium hydroxide solution; strong alkali) was added and boiled for 10 minutes. 50 μL of 0.3 M hydrochloric acid was added to 50 μL of these to neutralize, and then 2.0 mL of distilled water was added for dilution. 50 μL of these or distilled water (blank) is dispensed into a given well of Toxipet plate 96F, and 50 μL of silkworm plasma containing 8 mM calcium chloride and 50 μL of 0.1 M phosphate buffer (containing 20 mM DOPA, pH 6.0). Was added to the well reader SK601, and measurement was performed in the same manner as in Example A1. In addition, the same amount of distilled water was used in place of sodium hydroxide aqueous solution or hydrochloric acid for the specimen, and the reactivity was compared.
[0235]
(result)
The results are shown in Table 1.
[0236]
From this result, the presence of strong alkali in the specimen inactivates PG in the specimen but βG does not inactivate, and when this specimen is used, the PGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid is not activated, In addition, it was shown that the βGRP system reaction is not substantially affected. It was also shown that βG can be specifically measured by the βG measurement method of the present invention without being affected by PG.
[0237]
[Production Example 1] Production example of the PG measurement kit of the present invention
The PG measurement kit of the present invention comprising the following constituent reagents was produced.
1. PG measuring agent of the present invention (1) (containing (1 → 3) -β-D-glucan binding protein) 1 vial (2 mL)
2. Substrate (containing 40μmol DOPA) 1 vial
3. Substrate solution (0.1M phosphate buffer, pH 6.0) (2mL)
[0238]
[Production Example 2] Production example of the bacterial detection kit of the present invention
A bacterial detection kit of the present invention comprising the following constituent reagents was produced.
1. PG measuring agent of the present invention (1) (containing aprotinin) 1 vial (2 mL)
2. Substrate (containing 40μmol DOPA) 1 vial
3. Substrate solution (0.1M phosphate buffer, pH 6.0) (2mL)
4). PG-free distilled water 1 vial (2 mL)
5. PG 1 vial
[0239]
[Production Example 3] Production example of βG measurement kit of the present invention
A βG measurement kit of the present invention comprising the following constituent reagents was produced.
1. ΒG measurement agent of the present invention (1) (containing monoclonal anti-PGRP antibody) 1 vial (2 mL)
2. Substrate (containing 40μmol DOPA) 1 vial
3. Substrate solution (0.1M phosphate buffer, pH 6.0) (2mL)
[0240]
[Production Example 4] Production example of the fungus detection kit of the present invention
The fungus detection kit of the present invention comprising the following constituent reagents was produced.
1. ΒG measuring agent of the present invention (1) (containing lysozyme) 1 vial (2 mL)
2. Substrate (containing 40μmol DOPA) 1 vial
3. Substrate solution (0.1M phosphate buffer, pH 6.0) (2mL)
4). 1 vial of βG-free distilled water (2 mL)
5. βG 1 vial
[0241]
【The invention's effect】
The βGRP inhibitor of the present invention has the action of suppressing the βGRP reaction without activating the βGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and does not substantially inhibit the PGRP reaction. By using an agent, PG can be measured with high sensitivity and good quantitativeness and with good reproducibility. In addition, when using the βGRP inhibitor of the present invention when preparing a PG-specific measuring agent, it is possible to prepare a PG-specific measuring agent very simply, quickly and inexpensively without using many chemicals, instruments, devices, etc. Can do.
[0242]
In the PG measurement agent of the present invention (1), the βGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid is not activated, and the PGRP system reaction is not substantially inhibited. PG can be measured easily and quickly specifically, with high sensitivity, good quantitativeness, good reproducibility. Also, the preparation can be carried out very simply, quickly and inexpensively without using many chemicals, instruments, devices, etc., and is extremely practical.
[0243]
In the PG measurement agent (2) of the present invention, the βGRP and / or the enzyme involved in the βGRP reaction is removed without activating the βGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the PGRP reaction is substantially Therefore, it is possible to measure PG specifically, with high sensitivity, good quantitativeness, good reproducibility, simply and quickly.
[0244]
In the PG measurement methods (1) and (2) of the present invention, the βGRP and / or the enzyme involved in the βGRP system reaction is suppressed or removed without activating the βGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, In addition, since a reagent that is not substantially inhibited in the PGRP reaction is used, it is possible to measure PG specifically, with high sensitivity, good quantitativeness, good reproducibility, and simply and rapidly.
[0245]
Since the PG measurement method (3) of the present invention uses a specimen that does not substantially activate the βGRP system reaction of the ProPO cascade in insect body fluid, PG is specifically, highly sensitive, quantitative, and reproducible. It can be measured easily and quickly.
[0246]
Since the PG measurement kit of the present invention uses the βGRP inhibitor of the present invention or the PG measurement agent of the present invention (1) or the PG measurement agent of the present invention (2) as a constituent component, PG is specifically, highly sensitive, and has good quantitativeness. It can be measured easily and quickly with good reproducibility.
[0247]
The bacterial detection kit of the present invention is a further application of the PG measurement kit of the present invention as a bacterial detection kit, and does not detect fungi. Thus, Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, etc. are specifically and highly sensitively quantified. Can be detected easily and quickly with good performance and good reproducibility. For example, it can be used in fields such as water quality surveys, environmental monitoring, hygiene management, food management, medicine, pharmacy, etc. and is extremely useful.
[0248]
The bacterial diagnostic kit of the present invention is a further application of the bacterial detection kit of the present invention as a kit for diagnosing bacterial infections. Since no fungus is detected, differential diagnosis of Gram-positive and Gram-negative bacterial infections is enhanced. It can be carried out easily and quickly with high sensitivity and reproducibility. As a result, it is possible to provide extremely useful information for determination of a treatment policy, selection of a therapeutic agent, confirmation of a therapeutic effect, and the like, which is extremely useful.
[0249]
The PGRP inhibitor of the present invention has the action of suppressing the PGRP reaction without activating the PGRP reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and does not substantially inhibit the βGRP reaction. By using the agent, βG can be measured with high sensitivity and good quantitativeness and good reproducibility. In addition, when the PGRP inhibitor of the present invention is used when preparing a βG-specific measuring agent, a PG-specific measuring agent can be prepared extremely simply, quickly and inexpensively without using many chemicals, instruments, devices, etc. Can do.
[0250]
In the βG assay agent (1) of the present invention, the PGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid is not activated, and the PGRP system reaction is not substantially inhibited. βG can be measured specifically, with high sensitivity, with good quantitativeness, with good reproducibility, and simply and quickly. Also, the preparation can be carried out very simply, quickly and inexpensively without using many chemicals, instruments, devices, etc., and is extremely practical.
[0251]
In the βG assay agent (2) of the present invention, the PGRP and / or enzyme involved in the PGRP system reaction is removed without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, and the βGRP system reaction is substantially Therefore, βG can be measured specifically, with high sensitivity, good quantitativeness, good reproducibility, and easily and quickly.
[0252]
In the βG measurement methods (1) and (2) of the present invention, the PGRP and / or enzyme involved in the PGRP system reaction is suppressed or removed without activating the PGRP system reaction of the ProPO cascade in the insect body fluid, In addition, since a reagent that is not substantially inhibited by the βGRP reaction is used, βG can be measured specifically, with high sensitivity, with good quantitativeness, with good reproducibility, and easily and rapidly.
[0253]
Since the βG measurement methods (3) and (4) of the present invention use a specimen that does not substantially activate the PGRP system reaction of the ProPO cascade in insect body fluid, βG is specifically, highly sensitive, with good quantification, It can be measured easily and quickly with good reproducibility.
[0254]
The βG measurement kit of the present invention uses the PGRP inhibitor of the present invention or the βG measurement agent of the present invention (1) or the βG measurement agent of the present invention (2) as a constituent component, so that βG is specifically, highly sensitive, and has good quantitativeness. It can be measured easily and quickly with good reproducibility.
[0255]
The fungus detection kit of the present invention is an application of the βG measurement kit of the present invention as a kit for detecting fungi, and since bacteria are not detected, the fungus is specifically detected with high sensitivity, good quantitativeness, good reproducibility, It can be detected simply and quickly. For example, it can be used in fields such as water quality surveys, environmental monitoring, hygiene management, food management, medicine, pharmacy, etc. and is extremely useful.
[0256]
The fungal diagnosis kit of the present invention is a further application of the fungus detection kit of the present invention as a kit for diagnosis of fungal infections. Since no bacteria are detected, differential diagnosis of fungal infections is highly sensitive, reproducible and simple. And can be done quickly. As a result, it is possible to provide extremely useful information for determination of a treatment policy, selection of a therapeutic agent, confirmation of a therapeutic effect, and the like, which is extremely useful.
[0257]
The present invention has excellent effects as described above, has extremely high practicality, and is extremely useful in the field of specific measurement of PG and βG, specific detection of fungi and bacteria, and diagnosis of bacterial and fungal infections. It is expensive.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the prophenoloxidase cascade in silkworm blood.
FIG. 2 shows a calibration curve obtained using the product of the present invention in Example A1. However, ● indicates the results when PG is used as a sample.
FIG. 3 shows a calibration curve obtained using a comparative product in Example A1. However, ● indicates the results when PG is used as a sample and ○ G indicates that βG is used as a sample.
FIG. 4 shows a calibration curve obtained using the product of the present invention in Example A2. However, ● indicates the results when PG is used as a sample.
FIG. 5 shows a calibration curve obtained using a comparative product in Example A2. However, ● indicates the result when PG is used as a sample, and ○ indicates the result when βG is used as a sample.
FIG. 6 shows a calibration curve obtained using the product of the present invention in Example B1. However, (circle) shows the result when (beta) G is used as a sample.
FIG. 7 shows a calibration curve obtained using a comparative product in Example B1. However, ● indicates the results when PG is used as a sample and ○ G indicates that βG is used as a sample.
FIG. 8 shows a calibration curve obtained using the product of the present invention in Example B2. However, (circle) shows the result when (beta) G is used as a sample.
FIG. 9 shows a calibration curve obtained using a comparative product in Example B2. However, ● indicates the results when PG is used as a sample and ○ G indicates that βG is used as a sample.

Claims (24)

下記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードの(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。
 Represented by the following formula (I) (1 → 3) - β -D- glucoside structural units is poly (1 → 3) and 2-370 units bound successively - a beta-D-glucoside structural portion at least One the content to polyglucoside containing as an active ingredient, having the effect of inhibiting (1 → 3) -β-D- glucan recognition protein-based reactions prophenoloxidase cascade in the body fluid of insects, (1 → 3) -β -D-glucan recognition protein type reaction inhibitor.
前記反応抑制剤において、有効成分であるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項１記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。The (1 → 3) -β-D-glucan recognizing protein-based reaction inhibitor according to claim 1 , wherein the number average molecular weight of polyglucoside as an active ingredient in the reaction inhibitor is 5800 to 5850 . 前記反応抑制剤において、有効成分であるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項１又は２記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。The (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor according to claim 1 or 2 , wherein the polyglucoside as an active ingredient in the reaction inhibitor is a polyglucoside derived from basidiomycetes . 昆虫体液に、請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤が共存している、ペプチドグリカン特異的測定剤。A peptidoglycan-specific assay agent, wherein the insect body fluid coexists with the (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor according to any one of claims 1 to 3 . 下記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていないペプチドグリカン特異的測定剤。
 Represented by the following formula (I) (1 → 3) - β -D- glucoside structural units is poly (1 → 3) and 2-370 units bound successively - a beta-D-glucoside structural portion at least The prophenol oxidase cascade obtained by contacting an insect body fluid or a reagent prepared using the same with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing a polyglucoside containing one on an insoluble carrier is substantially activated. No peptidoglycan specific assay.
前記測定剤において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項５記載のペプチドグリカン特異的測定剤。The peptidoglycan-specific measuring agent according to claim 5, wherein the number average molecular weight of the polyglucoside immobilized on the insoluble carrier in the measuring agent is 5800 to 5850 . 前記測定剤において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項５又は６記載のペプチドグリカン特異的測定剤。The peptidoglycan-specific measurement agent according to claim 5 or 6 , wherein in the measurement agent, the polyglucoside immobilized on the insoluble carrier is a polyglucoside derived from basidiomycetes . 昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のペプチドグリカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤を共存させて、この検体中のペプチドグリカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。When peptidoglycan in a specimen is measured using a reagent prepared using insect body fluid as a raw material, (1 → 3) -β- of any one of claims 1 to 3 is contained in the reagent and / or specimen. Measure peptidoglycan in this sample by identifying changes in insect body fluid contained in this coexisting reagent caused by peptidoglycan in this sample in the presence of D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor A peptidoglycan specific measurement method. 検体と、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。Mixing a specimen with the peptidoglycan-specific measuring agent according to any one of claims 4 to 7, and identifying a change caused by peptidoglycan in the mixed specimen in an insect body fluid contained in the measuring agent The peptidoglycan specific measurement method of measuring the peptidoglycan in this sample. 下記式（Ｉ）にて示される (1 → 3)- β -D- グルコシド構造単位が、連続して ２〜３７０個結合したポリ (1 → 3)- β -D- グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的に(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。
 Represented by the following formula (I) (1 → 3) - β -D- glucoside structural units is poly (1 → 3) and 2-370 units bound successively - a beta-D-glucoside structural portion at least That does not substantially activate the (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein system reaction obtained by bringing the sample into contact with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing one polyglucoside on an insoluble carrier And a reagent prepared using insect body fluid as a raw material, and the change caused by peptidoglycan in the sample contacted with the insoluble immobilization product in the insect body fluid contained in this reagent is identified. A peptidoglycan specific measurement method for measuring peptidoglycan in a specimen.
前記測定方法において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項１０記載のペプチドグリカンの特異的測定方法。The peptidoglycan specific measurement method according to claim 10, wherein in the measurement method, the number average molecular weight of the polyglucoside immobilized on the insoluble carrier is 5800 to 5850 . 前記測定方法において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項１０又は１１記載のペプチドグリカンの特異的測定方法。 12. The peptidoglycan specific measurement method according to claim 10 or 11 , wherein in the measurement method, the polyglucoside immobilized on the insoluble carrier is a polyglucoside derived from basidiomycetes . 少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、ペプチドグリカン特異的測定用キット。The (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor according to any one of claims 1 to 3 or the peptidoglycan-specific measurement agent according to any one of claims 4 to 7. A kit for peptidoglycan-specific measurement. 少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、細菌検出用キット。 It contains at least the (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor according to any one of claims 1 to 3 or the peptidoglycan-specific measurement agent according to any one of claims 4 to 7. Bacteria detection kit. 少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、細菌感染症診断用キット。The (1 → 3) -β-D-glucan recognition protein-based reaction inhibitor according to any one of claims 1 to 3 , or the peptidoglycan-specific measurement agent according to any one of claims 4 to 7. Diagnostic kit for bacterial infections. 抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、又は、強アルカリ、を有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードのペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、ペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤。 A peptidoglycan recognition protein-based reaction inhibitor containing an anti-peptidoglycan recognition protein antibody or a strong alkali as an active ingredient and having an action of suppressing a peptidoglycan recognition protein-based reaction of a prophenoloxidase cascade in an insect body fluid. 昆虫体液に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体が共存している、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤。 Anti-peptidoglycan recognition protein antibody coexists in insect body fluid, (1 → 3) -β-D-glucan specific assay. 抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていない(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤。The prophenol oxidase cascade obtained by bringing an insect body fluid or a reagent prepared from it into contact with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing an anti-peptidoglycan recognition protein antibody on an insoluble carrier is substantially activated. No (1 → 3) -β-D-glucan specific assay. 昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を、あるいは、検体中に強アルカリを共存させて、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。When measuring (1 → 3) -β-D-glucan in a sample using a reagent prepared from insect body fluid , anti-peptidoglycan recognition protein antibody in this reagent and / or sample, or By coexisting a strong alkali in the sample, this change is identified by identifying changes in the insect fluid contained in the coexisting reagent caused by (1 → 3) -β-D-glucan in the sample. A specific measurement method for (1 → 3) -β-D-glucan, wherein (1 → 3) -β-D-glucan in a sample is measured. 検体と、請求項１７又は請求項１８記載の (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。A specimen, according to claim 17 or claim 18, wherein (1 → 3) - and beta-D-glucan specific determination agent are mixed, in the body fluid of insects contained in the measurement agent, mixed in the sample of (1 → 3) Measure (1 → 3) -β-D-glucan in this sample by identifying changes induced by -β-D-glucan, (1 → 3) -β-D-glucan Specific measurement method. 抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にペプチドグリカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。Prepared by using a specimen that does not substantially activate the peptidoglycan recognition protein system reaction obtained by contacting the specimen with an insoluble immobilization product obtained by immobilizing an anti-peptidoglycan recognition protein antibody on an insoluble carrier, and an insect body fluid. By mixing the reagent and identifying the change caused by (1 → 3) -β-D-glucan in the specimen contacted with the insoluble immobilization product in the insect body fluid contained in this reagent, A specific method for measuring (1 → 3) -β-D-glucan, wherein (1 → 3) -β-D-glucan in a sample is measured. 少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤を含む、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定用キット。At least 16. peptidoglycan recognition protein-based reaction inhibitor according, or, (1 → 3) according to claim 17 or claim 18 wherein - containing beta-D-glucan specific determination agent, (1 → 3) -β -D-glucan specific measurement kit. 少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤を含む、真菌検出用キット。At least 16. peptidoglycan recognition protein-based reaction inhibitor according, or, (1 → 3) according to claim 17 or claim 18, wherein - beta-D-glucan-specific include the measurement agents, kits for detecting fungi. 少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の (1 → 3)- β -D- グルカン特異的測定剤を含む、真菌感染症診断用キット。At least 16. peptidoglycan recognition protein-based reaction inhibitor according, or, (1 → 3) according to claim 17 or claim 18, wherein - beta-D-containing glucan specific measurements agents, fungal infections diagnostic kits.
JP01484298A 1998-01-08 1998-01-08 Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance Expired - Fee Related JP3957386B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP01484298A JP3957386B2 (en) 1998-01-08 1998-01-08 Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP01484298A JP3957386B2 (en) 1998-01-08 1998-01-08 Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11196895A JPH11196895A (en) 1999-07-27
JP3957386B2 true JP3957386B2 (en) 2007-08-15

Family

ID=11872302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP01484298A Expired - Fee Related JP3957386B2 (en) 1998-01-08 1998-01-08 Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3957386B2 (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100471308B1 (en) * 2001-06-08 2005-03-08 주식회사 삼양제넥스 Composition for detecting peptidoglycan, and diagnostic kit detecting peptidoglycan
WO2002101083A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Samyang Genex Corporation Composition for detecting peptidoglycan, and diagnostic kit detecting peptidoglycan
BRPI0210681B8 (en) * 2001-06-28 2021-07-27 Biowhittaker Inc methods and reagents to detect endotoxin
JP2017512893A (en) * 2014-03-25 2017-05-25 ノースウエスタン、ユニバーシティＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ DOPA-melanin formation in high ionic strength solutions
US20210270821A1 (en) * 2018-07-27 2021-09-02 Sekisui Medical Co., Ltd. IMMUNOASSAY METHOD FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN IN BIOLOGICAL SAMPLE, ASSAY KIT FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN, AND ALKALI PRETREATMENT SOLUTION FOR BIOLOGICAL SAMPLE FOR USE IN IMMUNOASSAY METHOD FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN

Also Published As

Publication number Publication date
JPH11196895A (en) 1999-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Iwanaga et al. New types of clotting factors and defense molecules found in horseshoe crab hemolymph: their structures and functions
US5266461A (en) Method for determining (1-3)-β-D-glucan
JP2667695B2 (en) Method for determining the presence of endotoxin in a sample
JP2944721B2 (en) Agent for measuring endotoxin
Tanaka et al. [23] Limulus test for detecting bacterial endotoxins
JP3793573B2 (en) (1 → 3) -β-D-glucan binding protein, antibody recognizing it and use thereof
US8822163B2 (en) Method for measuring β-glucan, and β-glucan-binding protein for use in the method
US8835119B2 (en) Lectin pathway deficiency assay
Yamanaka et al. Development of a novel β-1, 6-glucan–specific detection system using functionally-modified recombinant endo-β-1, 6-glucanase
Hakogi et al. Endotoxin levels in milk and plasma of mastitis-affected cows measured with a chromogenic limulus test
JP3957386B2 (en) Specific measuring agent and measuring method for insect body fluid reactive substance
US6391570B1 (en) Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins
US20230312707A1 (en) Methods for detecting early damage of blood-brain barrier in ischemic stroke and application thereof
Zhang et al. Differential blocking of coagulation-activating pathways of Limulus amebocyte lysate
JPH05240862A (en) Reagent and method for detecting beta-glucans
US5605806A (en) Reagent for assaying endotoxin
US20040235195A1 (en) Methods for measuring and diagnosing endotoxin, sensor therefor, and method for producing and reusing the sensor
WO2019128758A1 (en) Antibody for use in detecting early-stage damage of blood brain barrier during cerebral ischemic stroke and application thereof
EP1710584B1 (en) Method of measuring lipoarabinomannan and application thereof
Roth et al. Lipopolysaccharide-binding proteins of Limulus amebocyte lysate
WO1988002862A1 (en) Endotoxin assay
Vanhaecke et al. Endotoxin testing
Kukreja et al. Role of glycoproteins isolated from Epicoccum purpurascens in host-pathogen interaction
KR20200049387A (en) Monoclonal antibody specifically binding to OMP28 in Brucella suis, Hybridoma cell line procuding the same and use thereof
JPH0650971A (en) Immunological measurment method for human interferon alpha and its reagent

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20041228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070202

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070402

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20070501

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20070508

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110518

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110518

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120518

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130518

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140518

Year of fee payment: 7

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees