JP3942547B2

JP3942547B2 - Detection or measurement method using a biosensor

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Publication number: JP3942547B2
Application number: JP2003058729A
Authority: JP
Inventors: 利昭久保; 利秀江副; 淳一山之内; 芳久塚田
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2023-03-05
Also published as: JP2004271226A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。
【０００７】
この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第２８１５１２０号
【特許文献２】
特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】
米国特許第５４３６１６１号
【特許文献４】
特開平８−１９３９４８号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、バイオセンサーを用いた生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法において被験物質中の夾雑物の非特異吸着を抑制する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基板の表面を疎水性高分子化合物でコーティングしたバイオセンサーを用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する際に、界面活性剤の存在下で検出または測定を行うことによって、被験物質中の夾雑物の非特異吸着を抑制できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサーの表面に結合した生理活性物質と相互作用する物質を検出又は測定する方法において、該検出又は測定を界面活性剤の存在下で行う上記の方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、本発明で用いるバイオセンサーは、疎水性高分子化合物でコーティングした金属表面あるいは金属膜から成るバイオセンサーである。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる。
【００１３】
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、本発明の方法においては、疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサーであって表面に生理活性物質が共有結合により結合しているバイオセンサーに対して、少なくとも被験物質と界面活性剤を含む溶液を接触させる。
好ましくは、被験物質と界面活性剤を含む溶液中における界面活性剤の濃度は０．０００１重量％以上１重量％以下である。
【００１４】
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する。
さらに好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、疎水性高分子化合物でコーティングしたバイオセンサーの表面に結合した生理活性物質と相互作用する物質を検出又は測定する方法において、該検出又は測定を界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする方法である。
【００１６】
本発明で用いる界面活性剤は、例えば、ノニオン系、アニオン系、及びカチオン系の界面活性剤である。アニオン系もしくはカチオン系の場合、界面活性剤の荷電と反対荷電に帯電した夾雑物の非特異吸着を促進する場合があるため、ノニオン系界面活性剤の使用がより好ましい。
【００１７】
具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ^TM２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ^TM８０）、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、グリセリンモノラウレート、グリセリンモノパルミテート、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレエート、ベンタエリスリトールモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノベヘネート、ソルビタンジステアレート、ジグリセリンモノオレエート、トリグリセリンジオレエート、ナトリウムラウリルサルフェート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルアミン塩酸塩、ラウリル酸ラウリルアミドエチルリン酸塩、トリエチルセチルアンモニウムイオダイド、オレイルアミノジエチルアミン塩酸塩、ドデシルピリジニウム塩酸塩等の塩基性ピリジニウム塩等が挙げられる。このうち、特に好ましいものは、炭素数が１４〜２２の脂肪酸と、ソルビタン、ソルビトール、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコールとのエステル又はそのアルキレンオキサイド付加物を主成分とする非イオン系界面活性剤等が挙げられる。
【００１８】
検出又は測定を界面活性剤の存在下で行うためには、例えば、疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサーであって表面に生理活性物質が共有結合により結合しているバイオセンサーに対して、被験物質と界面活性剤を含む溶液を接触させることができる。ここで用いる被験物質と界面活性剤を含む溶液中における界面活性剤の濃度は、被験物質中の夾雑物の非特異吸着を抑制できる限り、特に限定されないが、好ましくは、０．０００１重量％以上１重量％以下であり、さらに好ましくは、０．００１重量％以上０．１重量％以下である。
【００１９】
本発明で用いるバイオセンサーは、疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成ることを特徴とする。
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２０】
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２１】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２２】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２３】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２４】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００２５】
本発明で用いるバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２６】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２７】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２８】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２９】
本発明で用いる疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００３０】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹及びＲ²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ³ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３１】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する疎水性高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ₃基を含有する疎水性高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００３２】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３３】
本発明で用いるバイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３４】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００３５】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３６】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３７】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００３８】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００３９】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４０】
即ち、本発明においては、生理活性物質が固定化された上記のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を界面活性剤の存在下で接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定することができる。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００４１】
本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーを用いることができる。
【００４３】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４４】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４５】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４６】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４７】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００４８】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００４９】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５０】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５１】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５２】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５３】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５４】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５５】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５６】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５７】
バイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
【実施例】
実施例１：バイオセンサー用チップの作製
（１）ポリメチルメタクリレートでコーティングしたバイオセンサー用チップの作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を５０μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。
【００５９】
（２）PMMA表面へのCOOH基の導入
上記のように作成したポリメチルメタクリレートをコーティングしたカバーガラスをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。
【００６０】
（３）生理活性物質を固定化する表面の作成
上記のように作成したPMMA/COOH表面チップを市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液３００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。
その後、5-アミノ吉草酸溶液（１M、ｐH8.5）を３００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。このサンプルをPMMA/val表面チップと呼ぶ。
【００６１】
比較例１：表面コーティングを行わない金表面チップの作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した。このサンプルを金表面チップと呼ぶ。
【００６２】
比較例２：SAM化合物（7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール）で被覆処理したバイオセンサー用チップの作製（SAM：自己組織化膜）
金蒸着膜が50nmの1cm(1cmのカバーガラスをオゾンクリーナーで30分処理した後、1mMの7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（同仁化学）のエタノール溶液に浸して、25℃で18時間表面処理を行った。その後、４０℃でエタノール５回、エタノール/水混合溶媒で１回、水で５回洗浄した。このサンプルをSAM表面チップと呼ぶ。
【００６３】
実施例２：バイオセンサー用チップの性能評価：
（１）蛋白質の非特異吸着の測定
バイオセンサー表面に対する非特異的な蛋白質の吸着はノイズの原因となる為、極力少ないほうが好ましい。以下のサンプル１−１〜１−４においてBSA（シグマ製）、アビジン（ナカライテスク製）の非特異吸着性を調べた。
【００６４】
サンプル１−１：表面処理を行っていない金表面チップ（比較例１の方法で作製）
サンプル１−２：SAM表面チップ（比較例２の方法で作製）においてCOOH基をエタノールアミンでブロックしたチップ
サンプル１−３：PMMA/COOH表面チップ（実施例１の（２）の方法で作製）においてCOOH基をエタノールアミンでブロックしたチップ
サンプル１−４：PMMA/val表面（実施例１の（３）の方法で作製）においてCOOH基をエタノールアミンでブロックしたチップ
【００６５】
上記サンプル１−２〜サンプル１−４のCOOH基のエタノールアミンによるブロックは以下の方法で行った。各チップを市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液１００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。その後、エタノールアミン・HCl溶液（１M、ｐH8.5）１００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。
【００６６】
バッファーＡ：HBS-Nバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）
バッファーＢ：HBS-EPバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）
バッファーＣ：tween20（アルドリッチ社製）0.005gをHBS-Nバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）で合計１００ｍｌにしたバッファー
バッファーＤ：TRITON-X100（ICI社製）0.005gをHBS-Nバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）で合計１００ｍｌにしたバッファー
【００６７】
上記で用いたHBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/lである。また、HBS-EPバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ 0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/l、ＥＤＴＡ 0.003mol/l、ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０ 0.005重量％である。
【００６８】
上記サンプル１−１〜１−４を表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、上記バッファーＡ〜Ｄ（ｐH7.4）を１０分間流した後、BSA溶液（１ｍｇ／ｍｌ、上記バッファーＡ〜Ｄ（ｐH7.4）で溶解）あるいはアビジン溶液（１ｍｇ／ｍｌ、上記バッファーＡ〜Ｄ（ｐH7.4）で溶解）５０μｌを流速１０μｌ／ｍｉｎで測定セルに流した。BSA溶液あるいはアビジン溶液の注入終了から３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量を各蛋白質の非特異吸着量とした。
【００６９】
（２）結果
表１に蛋白質の非特異吸着の測定結果を示す。
【００７０】
【表１】

【００７１】
表１の結果から、本発明の方法により、極めて蛋白質の非特異吸着の少ない検出または測定方法を提供できることがわかる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、バイオセンサーを用いた生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法において被験物質中の夾雑物の非特異吸着を抑制した方法を提供することが可能になった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing an interaction between biomolecules using a biosensor. In particular, the present invention relates to a method for analyzing interactions between biomolecules using a biosensor for use in a surface plasmon resonance biosensor.
[0002]
[Prior art]
Currently, many measurements using intermolecular interactions such as immune reactions are performed in clinical examinations, etc., but conventional methods require complicated operations and labeling substances, so measurement without the need for labeling substances Several techniques that can detect a change in the amount of a substance bound with high sensitivity are used. For example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, and measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles. SPR measurement technology detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the metal film of the chip by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. The QCM measurement technique is a technique that can detect the adsorption / desorption mass at the ng level from the change in the oscillation frequency of the oscillator due to the adsorption / desorption of a substance on the gold electrode (device) of the crystal oscillator. In addition, by functionalizing the surface of gold ultrafine particles (nm level), immobilizing a physiologically active substance on the surface, and performing a specific recognition reaction between the physiologically active substances, it is possible to obtain a living body from the sedimentation and arrangement of gold fine particles. Related substances can be detected.
[0003]
In any of the above techniques, the surface on which the physiologically active substance is immobilized is important. Hereinafter, the surface plasmon resonance (SPR) most used in this technical field will be described as an example.
[0004]
A commonly used measurement chip is composed of a transparent substrate (eg, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, and the metal surface is interposed through the functional group. Immobilize physiologically active substances. The interaction between biomolecules is analyzed by measuring a specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance.
[0005]
As a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, a functional group capable of binding to a metal, a linker having a chain length of 10 or more atoms, and a compound having a functional group capable of binding to a physiologically active substance, A measurement chip in which an active substance is immobilized has been reported (see Patent Document 1). In addition, a measurement chip comprising a metal film and a plasma polymerization film formed on the metal film has been reported (see Patent Document 2).
[0006]
On the other hand, when measuring a specific binding reaction between a physiologically active substance and a sample substance, the sample substance is not necessarily a single component, and for example, the sample substance may be measured in a heterogeneous system such as in a cell extract. Required. In that case, when various kinds of contaminants such as proteins and lipids cause nonspecific adsorption on the detection surface, the measurement and detection sensitivity is remarkably lowered. The above detection surface has a problem that non-specific adsorption is very likely to occur.
[0007]
Several methods have been investigated to solve this problem. For example, a method of suppressing physical adsorption by immobilizing a hydrophilic hydrogel on a metal surface via a linker has been used (see Patent Document 1, Patent Document 3, and Patent Document 4). However, even with this method, the suppression of nonspecific adsorption was not at a sufficient level.
[0008]
[Patent Document 1]
Patent No. 2815120 [Patent Document 2]
JP-A-9-264843 [Patent Document 3]
US Pat. No. 5,436,161 [Patent Document 4]
JP-A-8-193948 [0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, the present invention is to solve the problem of providing a method for suppressing non-specific adsorption of contaminants in a test substance in a method for detecting or measuring a substance that interacts with a physiologically active substance using a biosensor. did.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have detected or measured a substance that interacts with a physiologically active substance using a biosensor in which the surface of a substrate is coated with a hydrophobic polymer compound. Furthermore, it was found that nonspecific adsorption of impurities in the test substance can be suppressed by performing detection or measurement in the presence of a surfactant. The present invention has been completed based on this finding.
[0011]
That is, according to the present invention, in the method for detecting or measuring a substance that interacts with a bioactive substance bound to the surface of a biosensor comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound, the detection or measurement is performed using a surfactant. There is provided a method as described above which is carried out in the presence of
[0012]
Preferably, the biosensor used in the present invention is a biosensor comprising a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound.
Preferably, the metal surface or the metal film is made of a free electron metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum or aluminum.
[0013]
Preferably, the surfactant is a nonionic surfactant.
Preferably, in the method of the present invention, at least an interface between a test substance and a biosensor comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound, wherein a bioactive substance is covalently bonded to the surface. Contact the solution containing the active agent.
Preferably, the concentration of the surfactant in the solution containing the test substance and the surfactant is 0.0001% by weight or more and 1% by weight or less.
[0014]
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method.
More preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
The present invention relates to a method for detecting or measuring a substance that interacts with a bioactive substance bound to the surface of a biosensor coated with a hydrophobic polymer compound, wherein the detection or measurement is performed in the presence of a surfactant. It is a characteristic method.
[0016]
The surfactant used in the present invention is, for example, a nonionic surfactant, an anionic surfactant, or a cationic surfactant. In the case of an anionic or cationic system, the use of a nonionic surfactant is more preferred because it may promote non-specific adsorption of impurities charged oppositely to the charge of the surfactant.
[0017]
Specifically, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween ^™ 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween ^™ 80), polyoxyethylene octyl phenyl ether ( Triton ^™ X-100), polyoxyethylene nonyl phenyl ether, polyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, glycerol monolaurate, glycerol monopalmitate, glycerol monostearate, glycerol monooleate, bentaerythritol Monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monobehenate, sorbitan distearate, diglycerin monooleate , Triglycerin dioleate, sodium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, sodium butylnaphthalenesulfonate, cetyltrimethylammonium chloride, dodecylamine hydrochloride, lauric acid laurylamide ethyl phosphate, triethylcetylammonium iodide, oleylamino Examples include basic pyridinium salts such as diethylamine hydrochloride and dodecylpyridinium hydrochloride. Among these, particularly preferred are nonionics mainly composed of esters of fatty acids having 14 to 22 carbon atoms and polyhydric alcohols such as sorbitan, sorbitol, glycerin, polyglycerin, propylene glycol, or their alkylene oxide adducts. And surface active agents.
[0018]
In order to perform detection or measurement in the presence of a surfactant, for example, a biosensor composed of a substrate coated with a hydrophobic polymer compound, wherein a bioactive substance is covalently bonded to the surface. On the other hand, a solution containing a test substance and a surfactant can be brought into contact. The concentration of the surfactant in the solution containing the test substance and the surfactant used here is not particularly limited as long as nonspecific adsorption of contaminants in the test substance can be suppressed, but preferably 0.0001% by weight or more 1% by weight or less, and more preferably 0.001% by weight or more and 0.1% by weight or less.
[0019]
The biosensor used in the present invention is characterized by comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound.
The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.
[0020]
The hydrophobic polymer compound used in the present invention is a polymer compound having no water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is 10% or less, more preferably 1% or less, most preferably 0.1% or less. It is.
[0021]
Hydrophobic monomers that form hydrophobic polymer compounds include vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. , Fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers, vinyl ketones and the like. The hydrophobic polymer compound may be a homopolymer composed of one type of monomer or a copolymer composed of two or more types of monomers.
[0022]
Examples of the hydrophobic polymer compound preferably used in the present invention include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate, polyester, and nylon.
[0023]
Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.
[0024]
The coating thickness of the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 3000 angstrom or less.
[0025]
The biosensor used in the present invention is preferably a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
[0026]
Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering the use for a surface plasmon resonance biosensor, it is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 2000 angstrom or less. If it exceeds 5000 angstroms, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 1 angstrom or more and 100 angstrom or less.
[0027]
The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
[0028]
The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
[0029]
The biosensor comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound used in the present invention preferably has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance on the outermost surface of the substrate. Here, the “outermost surface of the substrate” means “the side farthest from the substrate”, and more specifically, “the side farthest from the substrate in the hydrophobic polymer compound coated on the substrate”. Meaning.
[0030]
Preferred functional groups include —OH, —SH, —COOH, —NR ¹ R ² (wherein R ¹ and R ² independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group), —CHO, —NR ³ NR ^1. R ² (wherein R ¹ , R ² and R ³ each independently represents a hydrogen atom or a lower alkyl group), —NCO, —NCS, an epoxy group, or a vinyl group can be mentioned. Here, the number of carbon atoms in the lower alkyl group is not particularly limited, but is generally about C1 to C10, preferably C1 to C6.
[0031]
As a method for introducing these functional groups on the outermost surface, a precursor is positioned on the outermost surface by chemical treatment after coating a hydrophobic polymer containing a precursor of those functional groups on a metal surface or metal film. The method of producing | generating those functional groups from is mentioned. For example, after coating polymethyl methacrylate, which is a hydrophobic polymer compound containing —COOCH ₃ groups, on a metal film, the surface is brought into contact with an aqueous NaOH solution (1N) at 40 ° C. for 16 hours. Produces.
[0032]
On the biosensor surface obtained as described above, the physiologically active substance can be immobilized on the metal surface or metal film by covalently bonding the physiologically active substance via the functional group.
[0033]
The physiologically active substance immobilized on the biosensor surface used in the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement object, and examples thereof include immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, Non-immune proteins, immunoglobulin-binding proteins, sugar-binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, or polypeptides or oligopeptides having ligand binding ability.
[0034]
Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
[0035]
The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme and the like can be used. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
[0036]
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
[0037]
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
[0038]
When the physiologically active substance is a protein or nucleic acid such as an antibody or an enzyme, the immobilization can be performed by covalently bonding to a functional group on the metal surface using the amino group, thiol group or the like of the physiologically active substance. .
[0039]
The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
[0040]
That is, in the present invention, by using the biosensor on which a physiologically active substance is immobilized, and bringing the test substance into contact with the biosensor in the presence of a surfactant, the physiological sensor immobilized on the biosensor. Substances that interact with the active substance can be detected and / or measured.
As the test substance, for example, a sample containing a substance that interacts with the above physiologically active substance can be used.
[0041]
In the present invention, it is preferable to detect and / or measure the interaction between the physiologically active substance immobilized on the biosensor surface and the test substance by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.
[0042]
According to a preferred aspect of the present invention, for example, a surface plasmon resonance biosensor including a metal film disposed on a transparent substrate can be used.
[0043]
The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
[0044]
The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
[0045]
As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). (See the publication). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0046]
In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component that enters the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
[0047]
In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
[0048]
If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
[0049]
In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
[0050]
Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0051]
In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
[0052]
In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.
[0053]
In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.
[0054]
If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every predetermined time, and whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed is determined to determine the binding state between the subject and the sensing substance. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, a rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and a human IgG antibody can be used as a specific substance.
[0055]
Note that, in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of the total reflection attenuation angle (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application No. 2000-398309 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
[0056]
Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.
[0057]
When the biosensor is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[0058]
【Example】
Example 1: Preparation of biosensor chip (1) Preparation of biosensor chip coated with polymethylmethacrylate A 1 cm (1 cm cover glass) on which gold was deposited so that the thickness of the gold film was 500 angstroms was model- After processing with 208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, set it on a spin coater (MODEL ASS-303, manufactured by ABLE), rotate it at 1000rpm, and a methyl ethyl ketone solution of polymethyl methacrylate in the center of the gold deposited cover glass (2 mg / ml) was dropped 50 μl, and the rotation was stopped after 2 minutes.The film thickness was measured by ellipsometry (In-Situ Ellipsometer MAUS-101, manufactured by Five Lab). Was 200 angstroms, this sample is called PMMA surface chip.
[0059]
(2) Introduction of COOH group to PMMA surface The cover glass coated with polymethyl methacrylate prepared as described above was immersed in an aqueous NaOH solution (1N) at 40 ° C. for 16 hours, and then washed with water three times. This sample is called a PMMA / COOH surface chip.
[0060]
(3) Preparation of surface for immobilizing physiologically active substance The PMMA / COOH surface chip prepared as described above was placed on a cartridge block of a commercially available surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000, manufactured by Biacore), and 1-ethyl 300 μL of a mixed solution of −2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) and N-hydroxysuccinimide (100 mM) was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min.
Thereafter, 300 μL of 5-aminovaleric acid solution (1M, pH 8.5) was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min. This sample is called a PMMA / val surface chip.
[0061]
Comparative Example 1: Preparation of gold surface chip without surface coating 1 cm (1 cm cover glass with Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.)) With gold deposited so that the thickness of the gold film is 500 angstroms Treated for 30 minutes, this sample is called a gold surface chip.
[0062]
Comparative Example 2: Production of chip for biosensor coated with SAM compound (7-carboxy-1-heptanethiol) (SAM: self-assembled film)
Gold-deposited film of 1cm (1cm cover glass treated with ozone cleaner for 30 minutes, then immersed in 1mM ethanol solution of 7-carboxy-1-heptanethiol (Dojindo) for 18 hours at 25 ° C Thereafter, the sample was washed 5 times with ethanol at 40 ° C., once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water, and this sample is called a SAM surface chip.
[0063]
Example 2: Performance evaluation of biosensor chip:
(1) Measurement of non-specific protein adsorption Since non-specific protein adsorption on the biosensor surface causes noise, it is preferable that the non-specific protein adsorption is as small as possible. In the following samples 1-1 to 1-4, the nonspecific adsorption property of BSA (manufactured by Sigma) and avidin (manufactured by Nacalai Tesque) was examined.
[0064]
Sample 1-1: Gold surface chip not subjected to surface treatment (produced by the method of Comparative Example 1)
Sample 1-2: Chip in which COOH group is blocked with ethanolamine in SAM surface chip (manufactured by method of Comparative Example 2) Sample 1-3: PMMA / COOH surface chip (manufactured by method (2) of Example 1) Samples with COOH groups blocked with ethanolamine in 1-4: Chips with COOH groups blocked with ethanolamine on the PMMA / val surface (prepared by the method of (3) of Example 1)
Blocking of COOH groups of Samples 1-2 to 1-4 with ethanolamine was performed by the following method. Each chip was placed on a cartridge block of a commercially available surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000, manufactured by Biacore), and 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) and N-hydroxysuccinimide (100 mM). 100 μL of the mixed solution was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min. Thereafter, 100 μL of ethanolamine / HCl solution (1M, pH 8.5) was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min.
[0066]
Buffer A: HBS-N buffer (Biacore, pH 7.4)
Buffer B: HBS-EP buffer (Biacore, pH 7.4)
Buffer C: 0.005 g of tween20 (Aldrich) made up to 100 ml with HBS-N buffer (Biacore, pH 7.4) Buffer buffer D: 0.005 g of TRITON-X100 (ICI) HBS-N buffer ( Buffer made to a total of 100 ml with Biacore, pH 7.4)
The composition of the HBS-N buffer used above is HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic Acid) 0.01 mol / l (pH 7.4) and NaCl 0.15 mol / l. The composition of the HBS-EP buffer is HEPES 0.01 mol / l (pH 7.4), NaCl 0.15 mol / l, EDTA 0.003 mol / l, Surfactant P20 0.005% by weight.
[0068]
The samples 1-1 to 1-4 are placed on a cartridge block of a surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000, manufactured by Biacore), and the buffers A to D (pH 7.4) are allowed to flow for 10 minutes, and then a BSA solution ( 1 mg / ml, dissolved in the above buffers A to D (pH 7.4)) or avidin solution (1 mg / ml, dissolved in the above buffers A to D (pH 7.4)) 50 μl was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μl / min. . The amount of change in the resonance signal (RU value) 3 minutes after the end of the injection of the BSA solution or the avidin solution was defined as the nonspecific adsorption amount of each protein.
[0069]
(2) Results Table 1 shows the measurement results of nonspecific adsorption of proteins.
[0070]
[Table 1]

[0071]
From the results in Table 1, it can be seen that the method of the present invention can provide a detection or measurement method with very little nonspecific adsorption of proteins.
[0072]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a method in which nonspecific adsorption of contaminants in a test substance is suppressed in a method for detecting or measuring a substance that interacts with a physiologically active substance using a biosensor.

Claims

A method for detecting or measuring a substance that interacts with a physiologically active substance bound to the surface of a biosensor comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound, wherein the detection or measurement is performed in the presence of a surfactant. .

The method according to claim 1, wherein the biosensor comprises a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound.

The method according to claim 1 or 2, wherein the metal surface or the metal film is made of a free electron metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum or aluminum.

The method according to claim 1, wherein the surfactant is a nonionic surfactant.

A biosensor comprising a substrate coated with a hydrophobic polymer compound, wherein a biosensor having a bioactive substance covalently bonded to the surface is brought into contact with a solution containing at least a test substance and a surfactant. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4.

The method according to claim 5, wherein the concentration of the surfactant in the solution containing the test substance and the surfactant is 0.0001 wt% or more and 1 wt% or less.

The method according to claim 1, wherein a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method.

The method according to claim 1, wherein a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.